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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T

DE HUMANO (HTLV) EM PACIENTES COM PARAPARESIA ESPÁSTICA

TROPICAL/MIELOPATIA (PET/MAH), PORTADORES E GESTANTES EM

ALAGOAS

ERLON OLIVEIRA DOS SANTOS

RECIFE/PE

2013


CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T

DE HUMANO (HTLV) EM PACIENTES COM PARAPARESIA ESPÁSTICA

TROPICAL/MIELOPATIA (PET/MAH), PORTADORES E GESTANTES EM

ALAGOAS.

Tese apresentada à Banca Examinadora do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Medicina Tropical. Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.

Orientadora: Prof.a Dr.a Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho

RECIFE/PE

2013



PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

REITOR

Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Francisco de Sousa Ramos

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Nicodemos Teles de Pontes Filho

COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

MEDICINA TROPICAL

Valdênia Maria Oliveira de Souza

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

MEDICINA TROPICAL

Vera Magalhães da Silveira

CORPO DOCENTE

Ana Catarina de Souza Lopes

Ana Lúcia Coutinho Domingues

Célia Maria Machado Barbosa de Castro

Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto

Fábio André Brayner dos Santos

Heloísa Ramos Lacerda de Melo

Maria Amélia Vieira Maciel

Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho

Marli Tenório Cordeiro

Ricardo Arraes de Alencar Ximenes

Valdênia Maria Oliveira de Souza

Vera Magalhães da Silveira

Vlaúdia Maria Assis Costa

CORPO DOCENTE COLABORADOR

Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque

Rejane Pereira Neves

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO (UFPE)

Pró-Reitoria para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação (PROPESQ)

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE (CCS)

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical (PPGMEDTROP)

RELATÓRIO DA BANCA EXAMINADORA DA TESE DO DOUTORANDO


No dia 13 de junho de 2013, às 08h00, na Sala Professor Murillo La Grecca, no 3º andar do

Centro de Ciências Saúde (CCS/UFPE), os Membros Doutores Profª. Drª. Vera Magalhães

da Silveira – Presidente da Banca (UFPE), Profª. D rª. Terezinha Tenório da Silva

(UFPE), Profª. Drª Líbia Cristina Rocha Vilela Moura (UFPE), Profª. Drª Ana Cecília

Cavalcanti de Albuquerque (ASCES) e Drª. Marli Tenório Cordeiro

(FIOCRUZ/CPqAM), componentes da Banca Examinadora, em sessão pública, arguiram

o doutorando ERLON OLIVEIRA DOS SANTOS sobre a sua Tese intitulada

“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO HTLV EM PACIENTES COM PARAPARESIA

ESPÁSTICA TROPICAL/MIELOPATIA (PET/MAH), PORTADORES E GESTANTES

EM ALAGOAS”, a qual foi orientada pela Profª. Drª Maria Rosângela Cunha Duarte

Coêlho (UFPE). Ao final da arguição de cada membro da Banca Examinadora e resposta do

doutorando, as seguintes menções foram publicamente

fornecidas.

Dedico esta tese

Aos meus pais, João Alves, Marina Oliveira dos Santos e Gildete Brandão

(in memoriam) e aos meus irmãos.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho

pela sua paciente orientação em todos os momentos de dúvidas e dificuldades

demonstrados ao longo desta tese.

Ao prof. Dr. Paulo Souza pelo apoio e pela valiosa contribuição na

realização dos testes moleculares.

À Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), ao Setor de virologia do

Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) e à Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por viabilizarem a

realização deste trabalho.

À Fundação HEMOPE e à Dra. Ana Cristina Souza pelo apoio técnico e

metodológico.

Ao médico infectologista Arthur Maia Paiva e à assistente social Maria

Helena Araújo, pelo grande apoio concedido no Hospital Universitário Prof.

Alberto Antunes. Desde já o meu obrigado.

À médica infectologista Margareth Mendonça, pela grande contribuição e

apoio concedidos desde o início da pesquisa no Hospital Escola Dr. Hélvio Auto.

Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em

Medicina Tropical pelos ensinamentos e apoio.

À Jupira Pinho - ex-secretária da Pós-Graduação em Medicina Tropical,

pelo apoio, dedicação e pelo carisma que tanto me cativou. A você o meu eterno

agradecimento.

Aos colegas da pós-graduação Jefférson Almeida, Viviane Morais e Deise

Vasconcelos pela ajuda e participação direta na execução deste trabalho.

A todos os profissionais do Serviço de Infectologia do Hospital Escola

Hélvio Auto e do Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes.

Por fim, agradeço a todos os pacientes que gentilmente aceitaram

participar desta pesquisa.

“O mistério é a coisa mais nobre de que podemos ter experiência.

É a emoção que se encontra no cerne da verdadeira ciência.

Aquele que não sente essa emoção e que não pode mais se maravilhar

nem se espantar, é como se já estivesse morto.”

Albert Eistein

RESUMO

Os vírus linfotrópicos de células T humana tipos 1 e 2 (HTLV-1/2) são retrovírus

associados a algumas doenças. O HTLV-1 está associado à paraparesia

espástica tropical/mielopatia (PET/MAH), enquanto o HTLV-2 tem sido

ocasionalmente associado às síndromes neurológicas semelhantes a PET/MAH

sem associação de malignidade. Os mecanismos envolvidos no surgimento das

doenças ainda não estão bem definidos. Entretanto, a carga proviral do HTLV, as

mutações e a proteína tax podem está envovolvidas no desenvolvimento da

doença. Os objetivos do presente estudo foram caracterizar o HTLV em pacientes

com PET/MAH e portadores e determinar a soroprevlência desses vírus em

gestantes durante o pré-natal. O DNA proviral foi extraído a partir de células

periféricas mononuclares, utilizando o kit comercial (QIAamp® DNA Blood Mini

Kit) e a identificação do tipo viral foi realizada através da Nested-PCR. Já a carga

proviral do HTLV-1 pela PCR quantitativa - expressas em 106/PBMC. Para

classificar a sequência tax, foi utilizada a enzima de restrição Bsh1236I (BstUI).

Na pesquisa do anti-HTLV1/2 nas gestantes foi utilizado o KIT ELISA Ab capture

ELISA Teste System (Ortho clinical Diagnostic In, Raritan, USA). Foi utilizado o

Teste de Fisher, Mann-Whitney para avaliar a média da carga proviral. A Razão

de prevalência, qui-quadrado (x2) e exato de Fischer foram utilizados para

determinar as associações entre as gestantes. O poder do teste foi de 95%, com

p<0,05 como limite para a significância. Fizeram parte do estudo 101 pacientes

infectados pelo HTLV 1/2 - sintomáticos e assintomáticos e 209 gestantes. O

HTLV-1 foi identificado em 68,3% (69/101) e o HTLV-2 em 31,7% (32/101). A

média da carga proviral do HTLV-1 nos pacientes portadores foi de 3,62 log10; DP

± 0,960; IC95% 3,31-3,93 e naqueles com PET/MAH foi de 3,18 log10; DP 1,261;

IC95% 2,68-3,68 (p = 0.0218). Em relação à sequência tax do HTLV, o subgrupo A

foi identificado em 95,7% (66/69) e o B em 4,3% (3/69). A soroprevalência do

HTLV1/2 nas gestantes foi de 8,1% (17/209). O DNA proviral do HTLV-1 foi

identificado em 64,2% (9/14), com média da carga proviral de 3,17 ± 1,87 log10.

As demais amostras foram negativas para o HTLV-1. Todas as gestantes

encontravam-se assintomáticas e nenhuma variável pesquisada apresentou

associação estatisticamente significativa. Em conclusão, não houve diferença

entre a média da carga proviral do HTLV-1 entre os pacientes com PET/MAH e

portadores. Houve uma maior frequência do subgrupo A da sequência tax nos

pacientes com PET/MAH, sem associação com o desenvolvimento da doença. Foi

elevada a prevalência da infecção pelo HTLV-2 nos portadores. A alta

soroprevalência do HTLV-1/2 nas gestantes sugere a implantação da triagem

deste vírus no pré-natal.

Palavras chaves: HTLV-1. HTLV-2. Carga viral. Proteína tax. Gestantes.

ABSTRACT

The human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus associated

myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) among other diseases. The

HTLV-2 has been occasionally associated to neurological syndromes similar to

HAM/TSP without association of hematologic malignancy. The mechanisms

involved in the onset of the disease are not well defined. The HTLV-1 proviral load,

the tax protein action and the subgroups A tax sequence of HTLV-1 are related to

the development of HAM/TSP. The study aimed: identified the HTLV type, classify

the tax sequence in subgroup A and B and quantify the HTLV-1 proviral load in

patients with HAM/TSP and asymptomatic carriers. And as a secondary objective:

to determine the frequency of HTLV-1/2 in pregnant women.This study enrolled

111 HTLV 1/2 infected patients attended in two reference centers in Infectious and

Parasitic Diseases at Maceió-AL. The proviral DNA was extracted from peripheral

blood mononuclear cells (PBMC), using a comercial kit (QIAamp® DNA Blood Mini

Kit) according to the manufacturer’s instructions. The identification of HTLV type

was realized by Nested-PCR and the HTLV-1 proviral load by quantitative PCR,

expressed in 106 PBMC. To classify the tax sequence subgroup, the restriction

enzyme Bsh1236I (BstUI) was used, AccII isoschizomer enzyme. The anti-HTLV

1/2 the patient was performed by ELISA KIT Ab capture ELISA Test System

(Ortho clinical DiagnosticIn, Raritan, USA. The HTLV-1 was identified in 68,3%

(69/101) of analyzed patients, which 42% (29/69) of HAM/TSP group and 57,9%

(40/69) of asymptomatic carriers. The HTLV-2 was identified in 31,7% (32/101) of

patients which 31,2% (10/32) with HAM/TSP and 68.75% (22/32) of asymptomatic

carriers. The prevalence of anti-HTLV 1/2 in pregnant women was 8.1% and

HTLV-1 was identified in 4.3% of them.The HTLV-1 proviral load average in

asymptomatic carriers was 3,62 log10; DP ± 0,960; CI95% 3,31-3,93 and of 3,18

log10; DP 1,261; CI95% 2,68-3,68 in patients with HAM/TSP (p = 0.0218). The

subgroup A tax sequence was identified in 41,5% (27/69) of patients with

HAM/TSP and in 56,5% (39/69) in asymptomatic carriers. And the subgroup B was

observed in only one patient with HAM/TSP and in two asymptomatic carriers.

Among the pregnant women analyzed, the anti-HTLV1/2 prevalence was 8,1%.

HTLV-1 was identified in 4,3% pregnant women seropositive, with HTLV-1 proviral

load average of 3,17 ± 1,87 log10. All pregnant women were asymptomatic. None

of the variables studied were statistically significant associated. In conclusion,

there was no difference between the mean of HTLV-1 proviral load between the

groups. There was a higher frequency of subgroup A tax sequence in patients with

HAM / TSP and a high percentage of HTLV-2 circulating in Alagoas. With regard

to pregnant women, we observed a high prevalence of HTLV-1, demonstrating the

need for implementation of serological screening for HTLV 1/2 in prenatal care.

Keywords: HTLV-1. HTLV-2. Proviral load. Tax protein. Pregnant women.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Estrutura morfológica do HTLV-1 20

Figura 02. Aspecto genômico do HTLV-1 21

Figura 03. Papel transativador da proteína tax 23

Figura 04. Ciclo de replicação do HTLV-1 25

Figura 05. Lesões dermatológicas em paciente com LLTA 30

Figura 06. Flower cells: linfócitos com alterações nucleares 31

LISTA DE QUADROS, GRÁFICOS E TABELAS

Quadros

Quadro 01. Classificação filogenética do HTLV-1 26

Quadro 02. Critérios diagnósticos para PET/MAH estabelecidos pela OMS 40

Tabela

Tabela 01. Sequência de primers usados na PCR 46

ARTIGO I

Tabela 01 - Sequência de primers utilizados na PCR 72

Figura 01. Mediana da carga proviral do HTLV-1 em pacientes com

PET/MAH e assintomáticos 74

ARTIGO II

Tabela 01. Sequência de primers utilizados na PCR 86

Tabela 02. Características sócio-demográficas das 209 gestantes assistidas pelo

programa Saúde da Família. Penedo, Alagoas, 2013 88

Tabela 03. Características relacionadas às gestantes assistidas pelo Programa

Saúde da Família, segundo a positividade para o anti-HTLV. Penedo, Alagoas,

2013 90

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

CD – Grupo de diferenciação

CTL – Linfócitos T citotóxicos

DNA – Ácido desoxirribonucleico

ELISA – Ensaio imunoenzimático

gp - glicoproteína

HEHA – Hospital escola Dr. Hélvio Auto

HIV – Vírus da imunodeficiência humana

HTLV-1 – Vírus linfotrópico de células T humana do tipo 1

HTLV-2 - Vírus linfotrópico de células T humana do tipo 2



HUPAA – Hospital Universitário prof. Alberto Antunes

IL-2 – Interleucina 2

INF- γ – Interferon gama

LCR – Líquido cefalorraquidiano

LLTA – Leucemia/Linfoma de células T do adulto

LTR – Terminações longas repetidas

mL – Mililitro

nm - Nanômetro

OMS – Organização Mundial da saúde

ORF – Fase de leitura aberta

pb – Pares de base

PBMC – Células mononucleares do sangue periférico

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

PET/MAH – Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV

RNA – Ácido ribonucléico

RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro

SNC- Sistema nervoso central

TCLE – Termo de consentimento livre e esclarecido

TNFα – Fator de necrose tumoral alfa

TR – Transcriptase reversa

UDIs – Usuário de drogas injetáveis.

UV – Ultra violeta

WB – Western Blot

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 16

2. ASPECTOS HISTÓRICOS 18

2.1 Estrutura viral e genômica do HTLV-1 19

2.2 Proteína tax e Infecção pelo HTLV-1 22

2.3 Ciclo replicativo do HTLV-1 24

2.4 Classificação filogenética do HTLV-1 26

2.5 Quantificação da carga proviral como marcador de risco na infecção

pelo HTLV-1 27

2.6 Doenças associadas ao HTLV-1 28

2.6.1 Leucemia/Linfoma de células T do Adulto (LLTA) 28

2.6.2 Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia associada ao HTLV-1 31

2.6.3 Outras doenças associadas ao HTLV-1 33

2.7 Diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 34

2.8 Aspectos epidemiológicos 35

3. OBJETIVO GERAL 38

3.1 Objetivos específicos 38

4. Desenhos dos estudos 39

4.1 Locais dos estudos 39

4.2 Populações do estudo 39

4.3 Definição dos termos 39

4.4 Definição do tamanho da amostra 41

4.5 Coleta e processamento dos dados e das amostras 41

4.6 Categorização das variáveis dependentes 42

4.6.1 Categorização das variáveis independentes 42

4.7 Critérios de inclusão 43

4.7.1 Critérios de exclusão 43

4.8 Separação dos leucócitos 43

4.9 Extração de DNA dos leucócitos 43

4.10 Nested - PCR para a sequência env-tax do HTLV-1 43

4.11 Nested – PCR para a sequência env-tax do HTLV-2 44

4.12 Determinação dos subgrupos A e B da sequência tax 44

4.13 Quantificação da carga proviral do HTLV-1 nas amostras 45

4.14 Curva-padrão para PCR em tempo real 45

4.15 Quantificação do gene de albumina nas amostras 45

5. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 47

6. ANÁLISE ESTATÍSTICA 47

7. RESULTADOS 48

8. CONCLUSÕES 49

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS 50

REFERÊNCIAS 51

APENDICES 67

A. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 67

B. Questionário 68

C. Versão em Português do artigo I 69

D. Versão em Português do artigo II 82

ANEXOS 98

A. Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNCISAL 98

B. Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNCISAL 99

C. Instruções aos autores – JCM 100

D. Instruções aos autores- IJGO 104

16

1. INTRODUÇÃO

Os vírus linfotrópicos de células T humana tipo 1 está associado à

Leucemia/Linfoma de células T do Adulto (LLTA) e à Paraparesia Espástica

Tropical/Mielopatia associada ao HTLV (PET/MAH) dentre outras doenças

(STARLING et al.,, 2013). Cerca de 3 a 5% dos indivíduos infectados pelo HTLV-1

desenvolve PET/MAH, que pode acontecer dentro de vários anos ou décadas

(SCHEINER et al., 2005, IWANAGA et al., 2010).

O HTLV-2 tem sido ocasionalmente associado a síndromes neurológicas

semelhantes a PET/MAH sem evidências de produção de malignidade

hematológica, entretanto, alguns estudos sugerem uma associação com a

PET/MAH (TREVIÑO et al., 2012).

Os fatores que contribuem para o desenvolvimento da patogênese dessas

doenças causadas pelo HTLV-1, ainda não estão bem esclarecidos. Entretanto,

sugere-se que ocorra interação vírus/hospedeiro possibilitando a mudança do

status de assintomático para sintomático. O HTLV-1 encontra-se integrado ao DNA

dos linfócitos infectados na forma proviral possibilitando a transmissão pelo contato

célula–célula (BARMARK et al., 2003).

Em relação à proteína tax, o HTLV-1 apresenta dois subtipos: tax A e tax B.

Essa classificação deve-se às substituições nucleotídicas em posições específicas

da região gênica que codifica a proteína tax. Esta é uma proteína regulatória

responsável pelo acúmulo de mutações, expressões gênicas por parte da célula,

além de contribuir para o desenvolvimento das doenças associadas como a

PET/MAH, LLTA, uveítes, dermatite infecciosa (FURUKAWA et al., 2000). Estudos

demonstram que o subtipo tax A apresenta-se com maior prevalência nos

pacientes com PET/MAH quando comparada aos portadores (KASHIMA et al.,

2006; IÑIGUEZ et al., 2007; IÑIGUEZ et al., 2010).

A carga proviral do HTLV-1 é importante por representar uma medida de

integração viral nas células hospedeiras, portanto sua quantificação constitui um

marcador de replicação viral. Alguns estudos demonstraram que a replicação do

HTLV-1 está aumentada em pacientes desenvolvendo PET/MAH, quando

comparada aos portadores (MONTANHEIRO et al., 2005; CASKEY et al., 2007).

No entanto, pouco são os estudos envolvendo essa relação do marcador viral com

17

o desenvolvimento de doenças associadas a esse vírus (LOUREIRO, 2008;

CABRAL et al., 2012).

O presente estudo teve como objetivo caracterizar o HTLV em pacientes com

PET/MAH e portadores e determinar a soroprevlência desses vírus em gestantes

durante o pré-natal.

18

2. ASPECTOS HISTÓRICOS

O HTLV-1 foi o primeiro onco-retrovírus conhecido que afeta o ser humano,

sendo este identificado, pela primeira vez nos Estados Unidos por Poiesz e

colaboradores (1980) em uma linhagem de células T (HUT 102) estabelecida de

um paciente com linfoma cutâneo, sendo incluído na família dos retrovírus devido

às suas características físico-químicas (ROMANOS et al., 2004; OLIVEIRA &

AVELINO, 2007).

Os primeiros relatos de casos de PET na América do Sul foram realizados

em 1981 na Colômbia, por Zaninovic, que denominou o quadro de “paraplegia

espástica do Pacífico”. Vinte e três anos depois, em 2004, o mesmo autor propõe

a PET como uma síndrome multifatorial no que concerne à sua gênese, porém,

sem diminuir a importância do papel que exerce o HTLV como seu agente causal

(LIMA, 2006).

Em 1985 foi possível a demonstração da correlação entre o HTLV-1 e a

PET/MAH através da detecção de anticorpos anti-HTLV-1 em soro e líquido

cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com diagnóstico de PET na Martinica e entre

jamaicanos e colombianos (GESSAIN et al., 1985; ZANINOVIC, 1987). No ano

seguinte, Osame et al. (1986) no Japão, descreveram casos de PET/MAH

relacionando-os a altas taxas de anticorpos específicos para o HTLV-1.

No Brasil, a infecção pelo HTLV-1 começou a ser reconhecida no final da

década de 1980, sendo o primeiro relato da infecção publicado por Kitagawa et al.

(1986), demonstrando a sua ocorrência entre a população japonesa residente no

Mato Grosso do Sul.

Em 1982, um segundo retrovírus, o HTLV-2, foi isolado de outra linhagem

de células T derivadas do baço de um paciente com uma forma rara de leucemia

(tricoleucemia) apresentando células pilosas (KALYANARAMAN et al., 1982;

ROMANOS et al., 2004). Ao contrário do HTLV-1, o tipo 2 não apresenta

associação definida com nenhuma doença linfoproliferativa. Alguns estudos têm

sugerido que ele possa estar associado à PET/MAH, além de outras síndromes

neurológicas, bem como no aumento da incidência de pneumonia, bronquite e

algumas condições inflamatórias como artrite (SILVA et al., 2002; NETO et al.,

2009).

19

Em 2005, CALLATINI et al. descreveram dois novos retrovírus,

denominados HTLV-3 e HTLV-4, ambos em indivíduos nativos da África Central.

O HTLV-3 foi filogeneticamente relacionado ao HTLV de símios, o STLV-3.

Enquanto, o HTLV-4 não pôde ser relacionado filogeneticamente com nenhum

STLV, porém, exibiu um padrão de Western Blot semelhante ao do HTLV 2

(WOLFE et al., 2005).

2.2 Estrutura viral e genômica do HTLV-1

O HTLV-1 pertence à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e ao

gênero Deltaretrovirus (ROMANOS et al., 2004). Trata-se de um vírus

envelopado, com aproximadamente 140 nm de diâmetro. Seu core apresenta

cerca de 100 nm e caracteriza-se por apresentar moléculas de protease em seu

core onde se encontra o nucleocapsídeo, juntamente com um genoma composto

por duas fitas simples de RNA com polaridade positiva, com aproximadamente 9

Kb, estando, cada uma delas, acompanhada de uma molécula da enzima

transcriptase reversa (LIMA, 2006).

As proteínas estruturais do core viral são as do nucleocapsídeo (p15), do

capsídeo (p24) e da matriz (p19), enquanto que no envelope se encontram as

glicoproteínas transmembrana (gp21) e aquelas de superfície (gp46) (Figura 01).

Esta última apresenta uma diferença no padrão de bandas à eletroforese, que

permite distinguir os tipos 1 e 2 do HTLV (SEGURADO, 2001).

20

Figura 01. Estrutura morfológica do HTLV.

Fonte: Santos et al., 2008.

O genoma do HTLV é constituído por 9323 nucleotídeos apresentando três

regiões (Figura 02) que são traduzidas: gag, pol e env. A região X não é

encontrada em outros retrovírus e apresenta a capacidade de codificar duas

proteínas regulatórias tax e rex. As duas extremidades do genoma são flanqueadas

por terminações longas repetidas (LTR), onde estão os promotores virais e outros

elementos regulatórios que têm como principais funções, a transcrição reversa do

RNA viral, a integração do provírus no DNA celular e a regulação de síntese do

RNA viral (CANN & CHEN, 1996).

21

Figura 02. Aspecto genômico do HTLV-1.

Fonte: Romanos et al, 2004.

A região gag compreende os nucleotídeos 802 à 2019 que quando

codificada, dá origem à proteína da matriz de 19 kDa (p19), à proteína do capsídeo

de 24 kDa (p24) e à proteína do nucleocapsídeo de 15 kDa (p15). Essas proteínas

são rearranjadas para formar os componentes principais da estrutura do vírion. A

p24 tem alta similaridade na sequência de aminoácidos, resultando em pouca

reatividade cruzada entre HTLV-1 e HTLV-2 (GOON, 2003).

A região pol, localiza-se na posição 3’ do gene gag, entre os nucleotídeos

2497 à 5187, codifica uma proteína de 296 nucleotídeos, a transcriptase reversa,

fundamental para a transcrição do RNA viral em DNA e sua incorporação no

genoma da célula hospedeira, além de codificar a RNAse, a endonuclease e a

protease. Esta por sua vez é responsável pelo processamento dos produtos gag e

pela sua própria clivagem, para gerar a molécula de protease madura (CANN &

CHEN, 1996).

A região env, localiza-se entre os nucleotídeos 5180 à 6647 sendo

responsável pela codificação das glicoproteínas externas do envelope. Um

domínio amino terminal corresponde a uma glicoproteína externa gp21, que é

22

clivada na região carboxi-terminal, resultando em uma proteína transmembrana

com 21 kDa (ROMANOS et al., 2004).

A região pX codifica as proteínas tax e rex com funções regulatórias. A

sequência tax regula, indiretamente, a transcrição do genoma proviral, ao interagir

com fatores de transcrição celular e induz sua ligação a sítios específicos na LTR

do HTLV-1, ativando sua transcrição. Ao interagir com proteínas regulatórias

celulares, a tax pode induzir a expressão de genes celulares (FRANCHINI et al.,

1995). A sequencia rex é responsável pela codificação da proteína p27rex, que é

reguladora pós-transcripcional da síntese de proteínas estruturais do vírus e de

outra proteína e não apresenta função definida (ROMANOS et al., 2004).

2.3 Proteína tax e infecção pelo HTLV-1

A tax é uma fosfoproteína nuclear de 40 kDa com 353 resíduos de

aminoácidos, localizada na região U e LTR (BEILMLING & MOELLING, 1992;

PACA-UCCARALERTKUN et al., 1999). O gene tax codifica a proteína p40tax,

transativadora da região U3 do segmento LTR do genoma viral e também de

genes da célula eucariótica infectada, tais como os que codificam a cadeia α do

receptor da IL-2 (CD25), a própria IL-2, a IL-1, a IL-3, a IL-6, a TGF-beta, fator de

crescimento de granulócitos dentre outros (BALLARD et al., 1988; GREENE et al.,

1989).

A atividade transativadora (Figura 03) de genes celulares, da proteína

p40tax, dá-se por vias intracelulares que envolvem fatores de transcrição como NF-

kB e SRF (LANOIX et al., 1994; SUZUKI et al., 1993). O único gene, até então

descrito como tendo a sua transcrição inibida pela tax é o gene que codifica a

cadeia da polimerase β, uma enzima envolvida no reparo do DNA (FRANCHINI et

al., 1995; JOHNSON et al., 2001).

23

Figura 03. Fluxograma descrevendo o papel transativador da proteína tax.

Fonte: Cabral et al, 2012

A tax favorece a sinapse neurológica de célula a célula, e a sua expressão

proporciona um sinal intracelular sinérgico com ICAM-1 causando polarização dos

microtúbulos das células T, demonstrando que não está presente apenas no

núcleo da célula infectada, além disso, a proteína tax apresenta papel central na

transformação dos linfócitos, devido ao seu efeito pleiotrópico (NEJMEDDINE et

al.,2005).

A tax (p40) pode também ser responsável pelo acúmulo de mutações e

contribuir para o desenvolvimento das doenças associadas. Nas duas últimas

décadas muito se tem descoberto sobre o papel desta proteína regulatória não

estrutural codificada na região pX, que é oncogênica in vivo (HIGUCHI & FUJII,

2009).

Baseada na sua constituição genética tem sido descritos dois subtipos de

HTLV-1. Essa classificação baseia-se nas substituições encontradas em posições

específicas da sequência tax, ou seja: tax A e tax B. O subtipo tax A apresenta

24

maior incidência nos pacientes com PET/MAH do que em portadores

assintomáticos, embora a sua associação com o desenvolvimento da doença

ainda seja discutida (LIBERTO et al., 2002).

Na Argentina, estudos realizados por Iñiguez et al. (2010) demonstraram a

presença da tax A em 79,2% dos indivíduos assintomáticos e 62,5% daqueles

com PET/MAH.

Em São Paulo, Casseb et al. (2006) demostraram a presença da tax A nos

pacientes com PET/MAH (9/48) e nos portadores (5/28). Não foi observado

nenhuma associação significativa da proteína tax e o desenvolvimento da

PET/MAH.

Por outro lado, Furukawa et al. (2000) demonstraram a presença do

subgrupo tax A em 15,5% (30/192) dos pacientes com PET/MAH e em 7%

(14/200) daqueles portadores.

Em Pernambuco, Bezerra (2011) identificou o subgrupo tax A em todos os

indivíduos pesquisados – sintomáticos e assintomáticos. Entretanto, dois

doadores de sangue foram do subgrupo tax B.

2. 4 Ciclo replicativo do HTLV-1

A primeira fase do ciclo inclui a adesão do vírus à membrana da célula

hospedeira através de receptores específicos. A penetração na célula é feita

através da integração da proteína de superfície gp46. Estudos têm sugerido que

molécula transportadora da glicose 1 (GLUT-1) atue como receptor celular

(TAKENOUCHE et al., 2011). Em seguida ocorre a liberação do genoma viral e

transcrição reversa do RNA viral em DNA de fita dupla e sua integração no núcleo

da célula na forma de provírus. Ocorre a formação do RNA mensageiro capaz de

codificar a síntese de proteínas regulatórias da replicação viral, as proteínas tax e

rex (OLIVEIRA SANTOS et al., 2008), conforme figura 04.

25

Figura 04. Ciclo de replicação do HTLV-1.

Fonte: Castro et al., 2010

O organismo identifica a partícula viral como estranha iniciando a produção

de anticorpos (Resposta imune humoral). Durante a divisão mitótica, o provírus

inserido no DNA de células infectadas é replicado pela DNA polimerase e o índice

de mutações é consideravelmente baixo, resultando na grande estabilidade

genética apresentada pelos HTLV-1/2 (MURPHY et al., 2004).

A proporção do provírus inserido em células mononucleares periféricas

varia de 0,1% e 10% e esta porcentagem pode chegar até 20% em pacientes com

PET/MAH (BANGHAM et al., 2003). Após o período inicial de replicação viral

ativa, a infecção de novas células é mantida através da divisão celular normal

(mitose), pelo contato entre células infectadas e não infectadas (sinapse

virológica) e pela expansão clonal ocasionada pela transformação celular induzida

pelo vírus (KATRI et al., 2004; KANNAGI, 2004; UENO et al., 2012).

26

2.5 Classificação Filogenética do HTLV-1

Os HTLV 1/2 infectam populações humanas há milhares de anos e, por

terem estabilidade genômica elevada, são considerados excelentes marcadores

para traçar as migrações destas populações. Esta instabilidade genômica

possibilitou o estabelecimento da associação entre polimorfismo genético viral e a

origem geográfica (GALVÃO-CASTRO et al., 2009).

A classificação filogenética do HTLV no Brasil tem importância por

identificar, através das análises comparativas com outros isolados descritos

mundialmente, a origem e o tipo de população atingida. As análises filogenéticas

(Quadro 01), baseadas no gene LTR, classificam o HTLV-1 em sete diferentes

subtipos (1a - Cosmopolita), com distribuição mundial, que por sua vez, divide-se

em cinco sub-grupos. Os subtipos A e C prevalecem nas Américas.

Quadro 01. Classificação filogenética do HTLV-1.

HTLV-1

1a Cosmopolita

Sub grupos: A-Transcontinental, B-Japonês,

C-Oeste da África, D-Norte da África, E-

Negros (Peru)

1b África central

1c Melanésia

1d Camarões/Gabão

1e Congo

1f Gabão

1g África Central

Fontes: ISHAK et al., 2003; WOLFE et al., 2005.

27

2.6 Quantificação da carga proviral como marcador de risco na infecção

pelo HTLV-1

O genoma do HTLV é integrado, aleatoriamente, ao material genético

celular (IWANAGA et al., 2010). Na infecção pelo HTLV há pouco ou nenhum

vírion no plasma do indivíduo infectado, refletindo a principal via de replicação

viral, a sinapse viral (IGAKURA et al., 2003). Desta forma, a medida da carga

proviral é mensurada pelo número de cópias de DNA proviral inserido em um

determinado conjunto de células (MARTINS & BARBOSA- STANCIOLI, 2006).

A detecção da carga proviral através da PCR em tempo real é considerada

relevante para o monitoramento do número de células sanguíneas periféricas

infectadas, podendo atuar como um indicador na predisposição às patologias a

ele associadas. Além disso, atua como ferramenta para o monitoramento

biológico da eficácia de quimioterápicos e/ou antiretrovirais no caso de pacientes

em tratamento da LLTA (MACHUCA et al., 2000; DEHÉE et al., 2002;

MONTANHEIRO et al., 2007; UENO et al., 2012). Diversos grupos, de portadores

e/ou indivíduos com manifestações clínicas associadas aos HTLV são alvos

destes estudos.

A alta carga proviral do HTLV-1 em células sanguíneas periféricas tem sido

associada ao alto risco para o desenvolvimento das doenças de cunho

neurológico (MONTANHEIRO et al., 2007). Em portadores, como doadores de

sangue, a carga proviral pode ser um bom indicador de curso da infecção nestes

indivíduos (MACHUCA et al., 2000). Estudo demonstrou que a carga proviral é 10

a 100 vezes maior nos indivíduos com PET/MAH quando comparado àqueles

assintomáticos (STARLING et al., 2013).

Com base na importância da carga proviral em algumas viroses, estudos

estão sendo realizados sobre a importância da carga proviral na infecção pelo

HTLV-1 e sua progressão para a PET/MAH (CABRAL et al., 2012). Porém a maior

dificuldade ocorre pelo longo período de incubação do vírus e pela baixa

incidência do desenvolvimento da doença (<5%) (KAPLAN et al., 1990).

Normalmente a carga proviral é baixa nos indivíduos assintomáticos do que

nos pacientes com doenças relacionadas ao HTLV-1, sugerindo a existência da

28

associação entre carga proviral e o desenvolvimento da doença (MURPHY et al.,

2004; IWANAGA et al., 2010).

Em Pernambuco, Bezerra (2011) demonstrou uma maior carga proviral

entre os pacientes com PET/MAH. Resultado semelhante foi encontrado por

Loureiro (2008), onde os pacientes com PET/MAH tinham carga proviral 2,1 vezes

maior. Resultado semelhante foi encontrado por Montanheiro et al. (2005).

Kashima et al. (2005) encontraram maior carga proviral do HTLV-1 nos

pacientes com PET/MAH. Scheiner et al. (2005) também encontraram uma

maior carga proviral nos indivíduos com PET/MAH.

Por outro lado, Martins et al. (2005) encontraram uma maior carga proviral

nos pacientes assintomáticos quando comparado àqueles com PET/MAH.

2.7 Doenças associadas ao HTLV-1

O HTLV-1 é o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T do adulto

e de uma doença neurológica degenerativa denominada paraparesia espástica

tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH), além de estar associada à

uveíte, dermatite infecciosa dentre outras manifestações. Existem vários indícios

de acometimento de múltiplos órgãos sugerindo um amplo espectro de

morbidades ligadas ao HTLV-1 (CARNEIRO-PROIETTI et al., 2002; NETO et al.,

2009).

2.7.1 Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (LLTA)

A LLTA predomina no sexo feminino numa razão de 1,4:1 (BORDUCCHI et

al., 1999). Estudos demonstram que linfócitos T CD4+ infectados pelo HTLV-1

persistem durante cerca de 7 anos no mesmo indivíduo, sugerindo que o vírus

participe no processo de transformação e imortalização destes linfócitos

(BANGHAM et al., 2003). Após a infecção pelo HTLV-1, o período de latência é

longo (cerca de 50 anos), indicando que no desenvolvimento da LLTA são

necessários múltiplos passos, acumulando-se mutações genéticas nas células

infectadas (BANGHAM et al., 2003).

29

No primeiro estágio da LLTA, a expressão da tax tem um papel crítico na

promoção do ciclo celular e na inibição da apoptose das células infectadas. Já no

estágio mais avançado, mudanças adquiridas pelo genoma do hospedeiro podem

substituir a função da tax. Como a sequência tax é o principal alvo citotóxico dos

linfócitos T, a perda desta impede as células infectadas de escaparem à resposta

imunológica do hospedeiro (BANGHAM et al., 2003).

A probabilidade de um portador do HTLV-1 desenvolver LLTA no decorrer

de uma latência prolongada mostra que o processo de transformação celular e de

leucemogênese devem envolver muitos eventos complexos dentro da célula T do

hospedeiro (SHUH & BEILKE, 2005).

As formas clínicas desta doença são classificadas em 4 grupos: forma

aguda, crônica, linfomatosa e smoldering. Em geral um estágio intermediário entre

portador sadio e doente com monoclonalidade, passa a ser denominada como

LLTA do tipo Smoldering. Esta forma pode evoluir para as formas crônica ou

aguda em tempo variado de 10 a 15 anos. A forma crônica caracteriza-se por

linfocitose absoluta (células T CD4+) e a presença de lesões de pele, episódios de

infecções oportunistas e infiltrado pulmonar intersticial (BRITO MELO, 2002).

A forma Smoldering é caracterizada pela contagem normal de linfócitos

(<4x106) e pela presença de 5% ou mais de linfócitos anômalos no sangue

periférico. Crônico: Caracteriza-se pelo aumento no número absoluto de linfócitos

e presença de 5% ou mais de linfócitos anômalos no sangue periférico. Ocorre

comprometimento do fígado, baço, pele, pulmões e alterações histológicas em

linfonodos. Linfomatosa: Neste subtipo não há linfocitose e apenas 1% ou menos

dos linfócitos são anômalos. A forma aguda é a forma mais comum de

apresentação, onde a doença é muito agressiva e manifesta-se sob a forma

leucêmica com lesões tumorais. O envolvimento da pele é característico (Figura

05), sendo as formas papular e micropapular as manifestações cutâneas mais

frequentes. A forma aguda compreende 55-75% dos casos e a forma crônica e

cutânea cerca de 25% (HANCHARD et al., 1990; YAMAGUCHI et al., 1990).

30

Figura 05 – Lesões dermatológicas desenvolvidas em pacientes com LLTA. A) Forma

indolente de ATL com eritrodermia e acentuada descamação. B) Forma Tumoral primária de pele

com múltiplos tumores.

Fonte: Bittencourt et al, 2008.

No decorrer da doença, ocorre uma proliferação desordenada clonal de

linfócitos T helper ativados com supressão da atividade normal, e com fenótipo

CD3+, CD4+, CD-, CD25+, CD7-, HLA DR+. Em alguns casos raros, as células da

LLTA podem expressar CD4 e CD8, somente CD8 ou não expressar CD4 e CD8

(BORDUCCHI et al., 1999).

O aspecto morfológico dos linfócitos pode ser o primeiro sinal para o

diagnóstico da LLTA. No sangue periférico observam-se linfócitos atípicos,

pleomórficos, lobulados, com anormalidade nuclear significativa - flower cells

(Figura 06) (SHUH & BEILKE, 2005).

31

Figura 06. Lâmina contendo células T anormais em sangue de paciente com LLTA.

Fonte: o autor

Quanto às alterações na biologia molecular do hospedeiro são observadas

mutações ou deleções de genes supressores de tumor, como o p53 ou p15/16,

assim como alterações no genoma do vírus, também estão associadas com o

prognóstico e o subtipo clínico da LLTA (GOSH et al., 1994).

O tempo de sobrevida para os subtipos agressivos varia de semana a mais

de um ano. O início da doença e a transformação em doença maligna varia de 18

à 30 anos (OLIVEIRA, 2000). Complicações pulmonares, incluindo infecção pelo

Pneumocystis jiroveci, hipercalcemia, herpes zoster disseminado e infecção por

citomegalovírus são as causas mais frequentes de morte (SHUH & BEILKE,

2005).

2.7.2 Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia associada ao HTLV-1

(PET/MAH)

A PET/MAH é uma doença inflamatória, desmielinizante do sistema

nervoso central (SNC) que se caracteriza pelo acometimento da medula espinhal

de predomínio toráxico, evoluindo para fraqueza progressiva associada à

32

dormência dos membros inferiores, dor lombar e retenção ou incontinência

urinária (GESSAIN, 1985; GONÇALVES, 2009). É uma doença lentamente

progressiva e de baixa letalidade (IWASAKI, 1993; GONÇALVES et al., 2009).

Geralmente evolui de forma insidiosa, mas progressiva provocando danos

significativos ao sistema nervoso central (SNC), e mais da metade destes

indivíduos tornam-se cadeirantes, ou dependentes do uso de próteses ou

bengalas (TAYLOR, 1998).

A idade de início dos sintomas pode influir na velocidade de progressão da

doença. Os pacientes com início dos sintomas antes dos 15 anos de idade

apresentam progressão mais lenta em contraposição àqueles com início após 60

anos, cuja evolução é mais rápida (NAKAGAWA et al., 1995).

O comprometimento medular é a característica mais marcante da

PET/MAH, sensibilidade vibratória, hiperreflexia dos membros superiores e os

sinais de Hoffmann e de Trömner, fraqueza dos membros inferiores, sintomas

sensitivos tais como: formigamento, agulhadas, queimação e, reflexo mandibular

exaltado em alguns pacientes; são tidos como critérios de diagnóstico de

PET/MAH para a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2008).

As queixas mais comuns nos estágios iniciais incluem: baixa dor nas

costas e parestesias, entretanto o diagnóstico só é possível quando o paciente

desenvolve uma mudança na marcha associada à fraqueza e o enrijecimento dos

membros inferiores (espasticidade). A disfunção erétil, distúrbios do esfíncter, e

queixas urinárias também fazem parte do quadro clínico, sendo que nas fases

iniciais do envolvimento da bexiga, os sintomas de armazenamento, como

noctúria, urgência e incontinência são os mais freqüentes (CASTRO et al., 2005).

Relata-se que esta doença afete entre 0,2 e 5% dos indivíduos infectados

na quarta década de vida. Acredita-se que é imunologicamente mediada, e

freqüentemente afeta mais as mulheres que os homens (SOUZA, 2006). O

período de latência para PET/MAH é mais curto quando comparado com o

período de latência para LLTA. O risco de desenvolver a PET/MAH é variável nos

diferentes grupos étnicos, variando entre 0.25% a 4% (PROIETTI et al., 2005).

33

A resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL) contra o HTLV-1 em pacientes

com PET/MAH é vigorosa, cronicamente ativada e, predominantemente, voltada

para a proteína tax (VINE et al., 2005).

2.7.3 Outras doenças associadas ao HTLV-1

A uveíte é a terceira entidade clínica relacionada com o HTLV-1

(MOCHIZUKI et al., 1992a) e, tanto pode estar associada a portadores de

PET/MAH, como se apresentar isolada em portadores assintomáticos do vírus

(PINHEIRO, 1994). Esta doença pode se apresentar como uma uveíte anterior,

intermediária, posterior e panuveíte com lesões retinocoroidianas (MOCHIZUKI et

al., 1992b; 1996). Um achado típico da uveíte é uma infiltração dos tecidos

oculares, olhos geralmente brancos e sem dor.

A dermatite infecciosa caracteriza-se por um eczema agudo na infância

sem episódio anterior de eczema infantil, predominando no vestíbulo nasal, couro

cabeludo e pescoço. Em indivíduos com LLTA, é comum a presença de pápulas e

nódulos generalizados. Em portadores assintomáticos são observadas lesões

dermatológicas do tipo: xerose, ictiose, dermatite seborréica, vitiligo, escabiose,

dermatofitoses (NOBRE et al., 2005).

Estudos de virologia molecular e imunologia do HTLV-1 mostram a

importância da resposta imune do hospedeiro na evolução clínica de doenças

associadas à infecção pelo HTLV-1. Carvalho et al. (2001) demonstraram que

células portadoras do HTLV-1 sem manifestações neurológicas secretam altos

níveis de IFN-α, TNF-α, IL-5 e IL-10. Tem-se aventado a possibilidade de que

doenças auto-imunes sejam mais frequentes nestes indivíduos (RIBAS & MELO

et al., 2002).

Um amplo espectro de síndromes reumatológicas tem sido descritas

associando epidemiologicamente o HTLV-1. Com exceção da uveíte, não existem

provas epidemiológicas suficientemente fortes associando a infecção pelo HTLV-1

e outras doenças autoimunes (PINHEIRO et al., 1995).

A alta expressão de MHC e consequente aumento na apresentação de

antígenos na sinóvia, além de alta produção de citocinas pró-inflamatórias,

induzidas pelo HTLV-1, sugere a participação do vírus no desenvolvimento de

34

auto-imunidade e artropatia em indivíduos infectados por este vírus (IWAKURA et

al., 1995).

Foi demonstrado que o gene regulatório tax do HTLV-1 pode ativar muitos

genes relacionados à resposta imune, tais como, os genes da IL-1, IL-2, do

receptor de IL-1 e da IL-6. O aumento desta última pelas células sinoviais tem

contribuído para a fisiopatologia da artrite relacionada ao HTLV-1 (SAIJO et al.,

2002).

2.8 Diagnóstico da infecção pelo HTLV-1

O diagnóstico sorológico rotineiro é baseado na presença de anticorpos,

anti-HTLV contra constituintes antigênicos de diferentes porções do vírus no soro

do indivíduo. Entretanto, os testes de triagem não discriminam a infecção pelo

HTLV-1 ou HTLV-2. As metodologias mais empregadas são o ELISA e a

confirmação pelo Western Blot. Os testes sorológicos nem sempre conseguem

definir o estado infeccioso do indivíduo, acontecendo assim, casos de sorologias

falso-negativas e falso-positivas (SHARMA et al., 2003).

O Western Blot (WB) é um teste confirmatório e discriminatório usado para

a confirmação da infecção pelo HTLV, através da incorporação de proteínas

recombinantes como a GD21, proteína transmembrana e as gpR46-1 e a gpR46-2

do envelope (RUDOLPH et al., 1993; KLEINMAN et al., 1994).

Metodologias moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR), são usadas para detectar a presença do HTLV-1 e 2 e distinguir os tipos,

em um amplo espectro de portadores e de pacientes com variadas patologias. É

considerado um teste conclusivo para o diagnóstico dos HTLV, a qual detecta o

genoma viral, mesmo em pequenas quantidades (ARRUDA et al., 2008).

A vantagem do uso da PCR consiste em não depender da produção de

anticorpos contra o vírus, uma vez que se detecta diretamente o material genético

do mesmo (DNA proviral). Por sua alta sensibilidade e especificidade, a PCR é

um método capaz de esclarecer estados sorológicos indeterminados, distinguir

uma infecção pelo tipo 1 ou pelo tipo 2 do HTLV (CARNEIRO-PROIETTI et al.,

2002), subtipar o HTLV -1 e útil também para investigar a transmissão mãe-filho

do HTLV-1 precocemente (TEIXEIRA SANTOS et al., 2003; TAMEGÃO-LOPES et

al., 2006; SOUZA, 2006).

35

A técnica baseia-se na amplificação exponencial de uma sequência

específica do DNA do provírus, denominada de DNA alvo, na presença de uma

enzima, a DNA polimerase, dos iniciadores e dos nucleotídeos.

As regiões mais usadas para diagnosticar e estudar a presença do HTLV-1

e HTLV-2 são a tax, pol e env (HEREINE et al.,1992).

2.9 Aspectos Epidemiológicos

A infecção pelo HTLV 1/2 caracteriza-se por agrupamento da infecção em

áreas geográficas definidas no mundo (PROIETTI, 2000). O número exato de

infectados pelo HTLV no mundo não é conhecido, porém estima-se que 15 a 20

milhões de pessoas estejam infectados (COLIN et al., 2003; PROIETTI, 2005).

A distribuição geográfica do HTLV-1 no mundo já está bem estabelecida,

ou seja: Japão, África, Caribe, sul dos Estados Unidos e América do Sul

apresentam as maiores prevalências (PROIETTI et al., 2005). No Japão as taxas

são consideradas altas variando de 6 a 37%. Já nas Ilhas e países do Caribe a

prevalência encontrada fica em torno de 6%. Nos países da África Equatorial, os

estudos apontam uma prevalência entre 1 e 10% (FERREIRA et al., 1997; LOPES

et al., 2008).

Na América do Sul e Central destacam-se: Argentina, Bolívia, Brasil, Chile,

Colômbia, Peru, Venezuela, Honduras e Panamá (GALVÃO-CASTRO et al.,

2009). O Brasil é o país com o maior número de pessoas infectadas com cerca de

2,5 milhões de indivíduos, o que torna o país com maior número absoluto de

casos de HTLV-1 (MOXOTÓ et al., 2007).

A soroprevalência para HTLV-1/2 tem variado de 0,3% a 1,8%,

dependendo do Estado brasileiro, tipo e tamanho da amostra estudada. A

infecção encontra-se presente em todos os estados apresentando-se endêmica

na Região Nordeste, destacando-se o estado da Bahia, com uma prevalência de

1,7% na população geral (CARNEIRO-PROIETTI et al., 2002). Os dados

epidemiológicos da infecção no Brasil referem-se à prevalência em grupos

populacionais específicos, como pacientes com PET/MAH, LLTA, usuários de

drogas endovenosas (UDIs) e a maioria em doadores de sangue (ROMANELLI et

al., 2010).

36

Entre os doadores de sangue de algumas capitais brasileiras, diferentes

prevalências foram encontradas: Manaus e Rio de Janeiro, 0,33%

(MONTANHEIRO, 2005; Florianópolis, 0,08% (CARNEIRO-PROIETTI et al.,

2002), Minas Gerais 0,7% (OLBRICH NETO et al., 2004); em Pernambuco

Loureiro et al. (1994) encontraram uma prevalência de 0,8%. Ainda em

Pernambuco, Bezerra et al. (1996) mostraram uma prevalência de 0,3%.

A transmissão do HTLV-1 ocorre através de sangue e/ou seus produtos

contaminados. A via sanguínea é, provavelmente, o modo mais eficiente de

transmissão do vírus. A via parenteral tem sido considerada relevante na

disseminação do HTLV-1 e 2 em áreas urbanas, principalmente entre os usuários

de drogas injetáveis (TAMEGÃO-LOPEZ, 2006; LOPES et al., 2008). A

transmissão do HTLV ocorre em menor incidência quando comparado ao HIV.

Isso se deve à baixa carga proviral e ao fato de ser dependente do contato célula-

célula (IGAKURA et al., 2003; SANTOS, 2005).

A transmissão do HTLV-1 é mais freqüente do homem para a mulher,

sugerindo que a infecção seja consequente dos linfócitos infectados presentes no

sêmem e na secreção vaginal (CARNEIRO-PROIETTI et al., 2002). Estima-se

que esta eficiência seja de cerca de 60% nas mulheres e de 0,4% no sentido

inverso (GALVÃO-CASTRO et al., 2009).

Na infância, a soropositividade para o HTLV-1 é muito baixa e aumenta a

partir da adolescência e início da idade adulta. Nas mulheres esse aumento é

mais acentuado e continua após os 40 anos, enquanto que nos homens a

positividade é menor e atinge um platô após os 40 anos (ROMANELLI et al.,

2010).

A transmissão vertical depende da prevalência da infecção entre mulheres

em idade reprodutiva, além da carga proviral do HTLV-1, e apresenta resultados

distintos nas diferentes regiões geográficas e nos diversos grupos étnicos e de

risco. É rara a contaminação por via transplacentária ou contaminação durante o

momento do parto (KOMURO et al., 1983; HINO et al., 1994; OLIVEIRA &

AVELINO, 2007; MORIUCHI et al., 2013).

37

Por outro lado, o aleitamento materno constitui uma importante via de

transmissão, uma vez que há passagem dos linfócitos maternos infectados para a

criança (ROMANELLI et al., 2010).

Estudos mostram que quanto maior a carga proviral da mãe e maior tempo

de aleitamento, maior é a chance de ocorrer a infecção, cerca de 18% a 30%.

Crianças amamentadas por mães infectadas, por um período superior a seis

meses, apresentam um risco de 20% de infecção, comparadas às amamentadas

por um período inferior a 2 meses (OLIVEIRA, 2000). Além disso, 1 a 5%

desenvolvem LLT e 0,25% a 3,0% a PET/MAH. A amamentação durante um curto

período de tempo diminui o risco de transmissão. Porém, a amamentação por

mães soropositivas não é recomendada, visando eliminar uma via importante de

transmissão do HTLV-1 e 2 (BITTENCOURT et al., 1998).

Em áreas endêmicas são importantes os estudos epidemiológicos

avaliando a transmissão vertical em gestantes (BITTENCOURT et al., 1998;

KAKUDA et al., 2002).

No Japão, Goto et al. (1997) ao avaliarem a infecção pelo HTLV em 2683

gestantes voluntárias encontraram uma prevalência de 0,6%. Já em Taiwan, o

percentual foi de 0,87% (CHEN et al., 1996) e em Papua Nova Guiné, a

prevalência foi de 14%, YANAGIHARA (1990).

No Brasil, poucos são os trabalhos que relatam a prevalência da infecção

pelo HTLV em gestantes. Na região Sul, as prevalências encontradas foram de

0,08% e 0,05% em Florianópolis e Maringá, respectivamente (CATALAN-

SOARES et al., 2005).

No Centro Oeste, em Goiânia a prevalência foi de 0,2%, (CATALAN-

SOARES, 2001) e 0,5% em Cuiabá (YDY et al., 2009). Entretanto, em Campo

Grande, DIAS-BASTOS (2010) encontrou 0,13% de infecção pelo HTLV.

No Amazonas, numa comunidade japonesa e em seus descendentes, foi

identificada a infecção em 10% dos pesquisados (BITTENCOURT, 2008). Em

Alagoas não há relato da prevalência do HTLV-1 em gestantes.

38

3. OBJETIVO GERAL

Caracterizar o HTLV em pacientes com PET/MAH e portadores e determinar a

soroprevalência desse vírus em gestantes durante o pré-natal em Alagoas.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

♦ Identificar o tipo de HTLV (tipo 1 ou 2) e determinar as respectivas

frequências nos pacientes com PET/MAH e portadores;

♦ Classificar a sequência tax do HTLV-1 e verificar sua associação com a

presença da PET/MAH;

♦ Quantificar a carga proviral do HTLV-1 e verificar sua associação com a

presença da PET/MAH;

♦ Determinar a prevalência e os fatores de risco para a infecção pelo HTLV 1/2

e quantificar a carga proviral do HTLV-1 nas gestantes do Programa Saúde da

Família em Penedo-AL.

39

4. Desenhos dos estudos

Foi realizado um estudo do tipo caso-controle, sendo considerados como

casos os pacientes com PET/MAH e como controles os assintomáticos.

Entre a população das gestantes foi realizado um estudo transversal. Esse

tipo de estudo apresenta como vantagens o custo reduzido, a simplicidade,

rapidez de sua realização, a possibilidade da identificação de casos na população

carcerária e a detecção de grupos de alto risco a fim de tratar e prevenir.

4.1 Locais dos estudos

O estudo foi realizado em dois Centros de Referência em Doenças

Infecciosas e Parasitárias em Maceió-Al, Hospital Universitário Prof. Alberto

Antunes (HUPAA) e Hospital Escola Dr. Hélvio Auto (HEHA), e nas 22 unidades

do Programa Saúde da Família em Penedo-AL, no período de novembro de 2011

a novembro de 2012. Os hospitais atuam como Escola para formação e

treinamento de estudantes de medicina, psicologia, enfermagem, fisioterapia,

terapia ocupacional e nutrição da Universidade Federal de Alagoas e da

Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas.

4.2 Populações do estudo

A população de estudo foi constituída por pacientes infectados pelo HTLV-

1/2, acompanhados no ambulatório de Doenças Infecciosas e Parasitárias do

HUPAA e do HEHA e de gestantes acompanhadas no Programa Saúde da

Família em Penedo-AL.

4.3 Definição dos termos

CASOS: Foram considerados casos os pacientes infectados pelo HTLV-

1/2, que apresentavam manifestações clínicas características da PET/MAH de

acordo com os critérios estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde

(OMS), descritos no quadro 02.

40

Quadro 02. Critérios diagnósticos para PET/MAH estabelecidos pela OMS.

I. Diagnóstico Clínico

Um único sintoma ou um sinal físico podem ser evidências de PET/MAH adiantado.

A. Incidência da idade e do sexo

Na maior parte, esporádico e adulto, mas às vezes familial; visto ocasionalmente na infância;

sexo feminino predominante.

B. Início

É geralmente insidioso, mas pode ser repentino.

C. Manifestações neurológicas principais

1. A PET crônica, que progride geralmente lentamente, permanece, às vezes, estática após a

progressão inicial.

2. Fraqueza dos membros inferiores.

3. Distúrbio da bexiga geralmente é uma característica avançada. A constipação ocorre

geralmente mais tarde; impotência ou libido diminuídas são comuns.

4. Os sintomas sensoriais, tais como formigamento, queimores, etc., são mais proeminentes do

que sinais físicos objetivos.

5. A baixa dor lombar com irradiação para os pés é comum.

6. O sentido da vibração é danificado freqüentemente.

7. Hiperreflexia dos membros inferiores, freqüentemente com clônus e sinal de Babinski.

8. Hiperreflexia dos membros superiores; sinais positivos de Hoffmann e de Tromner

freqüentes; a fraqueza pode ser ausente.

D. Resultados neurológicos menos freqüentes. Sinais cerebelares, atrofia ótica, surdez,

nistagmo, tremor da mão. Convulsões, prejuízo cognitivo, demência ou consciência danificada é

raro.

E. Outras manifestações neurológicas que podem ser associadas com a PET/MAH: atrofia

muscular, fasciculações (raras), polimiosite, neuropatia periférica, meningite, encefalopatia.

F. Manifestações não neurológicas sistemáticas que podem ser associadas com a PET/MAH:

alveolite pulmonar, uveíte, síndrome de Sjögren, artropatia, vasculite, ictiose,

crioglobulinemia, LLTA.

II. Diagnóstico laboratorial

A. Presença dos anticorpos HTLV-1 ou dos antígenos no sangue e no líquido cerebrospinal

(LCR).

B. LCR pode mostrar a pleocitose suave do linfócito.

C. Os linfócitos lobulados podem estar no sangue e/ou no LCR.

41

D. Aumento moderado das proteínas no LCR.

E. Isolamento viral, quando possível, do sangue e/ou do LCR.

Fonte: Loureiro (2009).

CONTROLES: Foram considerados controles os pacientes infectados pelo

HTLV-1/2 e que não apresentavam sinais e sintomas da doença.

Para identificação dos pacientes como casos e controles foram avaliadas

as fichas de dados preenchidas no atendimento ambulatorial desses pacientes,

por dois médicos infectologistas envolvidos no estudo.

4.4 Definição do tamanho da amostra

Por tratar-se do primeiro estudo em Alagoas, tomamos como base o

trabalho desenvolvido por Bezerra (2011) em Recife-PE, que identificou em 55

pacientes com PET/MAH e 55 pacientes assintomáticos, o tipo e a sequência tax

do HTLV-1.

4.5 Coleta e processamento dos dados e das amostras

O projeto foi apresentado aos pacientes e as gestantes, no qual foram

convidados a participar da pesquisa. Aqueles que aceitaram foram direcionados a

uma sala individualizada e assinaram o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido, sendo aplicado um questionário criado para a pesquisa (apêndice B).

Todas as informações obtidas foram armazenadas num banco de dados, em

planilha Excel.

Em seguida, os pacientes foram submetidos à coleta de sangue (10mL) em

tubo do tipo vacutainner com o anticoagulante EDTA. A coleta de sangue também

foi realizada nas gestantes, entretanto, sem anticoagulante. As amostras

sanguíneas foram devidamente identificadas e levadas para o Laboratório de

Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal de Alagoas (UFAL). Após

separação, o anel leucocitário foi acondicionado em tubos do tipo eppendorf. Nas

amostras coletadas das gestantes foi feita a separação do soro. Todas as

amostras processadas foram devidamente enviadas ao Setor de Virologia do

Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) da Universidade Federal de

Pernambuco (UFPE) em Recife-PE, para realização dos testes sorológico e

molecular.

42

4.6 Categorização das variáveis dependentes

PET/MAH: definida pelas características da Paraparesia Espástica Tropical de

acordo com os critérios estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde

(OMS). Variável dicotômica categorizada como presente ou ausente.

Infecção pelo HTLV 1/2 comprovada por meio de teste imunoenzimático –

ELISA, WB.

4.6.1 Categorização das variáveis independentes

Gênero: definido pelo sexo apresentado pelo paciente. Variável nominal

dicotômica categorizada como feminino ou masculino.

Idade: definida pelo intervalo de tempo entre a data de nascimento e dia do seu

registro na pesquisa.

Região de procedência: definida pela cidade de procedência do paciente.

Variável nominal dicotômica categorizada como capital ou interior.

Raça: 1. Branca 2. Preta 3. Parda 4. Amarela 5. Índígena

Grau de escolaridade: 1. Superior 2. Ensino médio completo 3. Ensino médio

incompleto 4. Ensino fundamental completo 5. Ensino fundamental incompleto 6.

Analfabeto

Estado civil: Variável definida como: 1. Solteira(o), 2. Casada(o) 3. Viúva(o)

4. União consensual 5. Divorciada(o)

Renda: (em salário mínimo): Variável categorizada como 1. <SM 2. 1SM

3. 1-5SM 4. 5-10SM 5. >10 SM

Amamentou: Variável categorizada como 1. Sim 2. Não 3. Não se aplica

Foi amamentado(a): Variável categorizada como 1. Sim 2. Não 3. Não lembro

Mãe de leite: Variável categorizada como 1. Sim 2.Não 3. Não lembro

Etilismo: Variável dicotômica 1. Sim 2.Não

Tabagismo Variável dicotômica 1. Sim 2.Não

Drogas injetáveis: Variável dicotômica 1. Sim 2.Não

Uso de preservativo: Variável categorizada como 1- sim 2. não 3- às vezes

Orientação sexual: Variável categorizada como 1. Homossexual 2. Bissexual 3.

Heterossexual

Carga proviral do HTLV-1: definida pelo número de cópias do DNA proviral do

HTLV-I. Variável quantitativa expressa em unidades de 106 células/mL de sangue.

43

4.7 Critérios de inclusão

♦ Ter diagnóstico sorológico e clínico da infecção pelo HTLV-1/2.

♦ Estar em acompanhamento médico no Setor de Doenças Infecciosas e

Parasitárias do HUPAA ou do HEHA.

♦ Gestantes acompanhadas nas unidades dos PSFs.

4.7.1 Critério de exclusão

♦ Apresentar-se co-infectados pelo HBV, HCV, HIV.

4.8 Separação dos leucócitos

A separação dos leucócitos foi realizada utilizando Histopaque® -1077

(Sigma Diagnostics) como separador de células, obtendo após trinta minutos de

centrifugação a 2000 rpm, o anel leucocitário, adicionado RPMI até completar

8mL. Em seguinte procedeu-se uma primeira centrifugação por 3 minutos 2000

rpm, retirou-se 4mL do sobrenadante e adicionou-se 4 mL do RPMI (LGC

Biotecnologia), com posterior centrifugação nas mesmas condições da anterior. O

sobrenadante foi descartado permanecendo no tubo 2 mL da solução e realizada

a contagem eletrônica de leucócitos (ELX 300, Roche) antes da etapa de extração

de DNA genômico. Em seguida ajustou-se a solução para 1x106 células/mL e o

pellet foi armazenado a –80°C.

4.9 Extração do DNA dos leucócitos

O DNA proviral foi extraído a partir de leucócitos do sangue periférico,

utilizando o kit comercial (QIAamp® DNA Blood Mini Kit).

4.10 Nested – PCR para a sequência env-tax do HTLV-1

1ª PCR - A reação foi padronizada para um volume final de 20l contendo

2l de DNA genômico, 2mM de cada dNTP. Foi usado o kit PCR Master Mix 2X

(Promega Corporation®). Os primers utilizados foram SK44 e SK110

a 10 pmol. A reação foi processada utilizando o termociclador (Flexigene 2.0,

Techne), apresentando uma ciclagem de 7min a 95°C, seguida de 35 ciclos de

95°c por 1 min, 55°C por 1 min e 30s 72º C por 2min e extensão final de 10min a

72°C.

44

2ª PCR - Foi usada 2μL da segunda reação, como template (diluído 1:10

com água destilada Ultrapure Invitrogen) da primeira reação, para um volume final

de 20μL. Os primers usados foram SK248 e SK249 a 10 pmol/μL. A reação foi

processada no termociclador da Flexigene 2.0, Techne por 5min a 94°C, seguida

de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 58°C por 1 min e 72ºC por 2min e extensão final

de 10min a 72°C. Foi feita uma diluição (8μL do produto amplificado com 2μL do

tampão da amostra - Blue Green loading dye - LGC Biotecnologia), sendo

posteriormente aplicado em gel de agarose a 1,8%. Os fragmentos de DNA foram

analisados em Gel-Pro Imager CooISNAP – MediaCybernetcs. Quando

observado um fragmento de 466 pb correspondente à sequência env-tax do

HTLV-1, era feita a confirmação para o tipo 1 (Lee et al., 2004).

4.11 Nested – PCR para a sequência env-tax do HTLV-2

Para identificar o DNA proviral do HTLV-2 foi realizada uma Nested-PCR.

1ª PCR. Foi padronizado um volume final de 10µL. Os primers utilizados foram

SK44 e ET 401 a 10pmol. A reação foi processada utilizando o termociclador

(Flexigene 2.0, Techne), apresentando uma ciclagem de 5 min a 95°C, seguida de

35 ciclos de 95°c por 1 min, 63°C por 1 min e 72º C por 1min e extensão final de 5

min a 72°C.

2ª PCR. Foi usado 1μL da primeira reação, como template para um volume final

de 10μL. Os primers usados foram ET403 e ET404 a 10 pmol/µL. A reação e a

termociclagem foi realizada da mesma forma que a primeira PCR. Foi feita uma

diluição (8μL do produto amplificado com 2μL do tampão da amostra - Blue Green

loading dye - LGC Biotecnologia). Foi amplificado um fragmento de 429pb

visualizado em transiluminador sob fonte de luz UV, após eletroforese em gel de

agarose a 1,8%.

4.12 Determinação dos subgrupos A e B da sequência tax

Para a identificação do polimorfismo na região do gene tax, nos pacientes

com HTLV-1, foi utilizada a enzima de restrição Bsh1236I (BstUI), isoesquisômero

da enzima AccII, na qual as variantes polimórficas apresentam um sitio de

restrição na região 8344 do gene tax (Furukawa et al., 2000). Para a formação do

amplicon, a ser digerido, foi realizada duas reações de PCR. A primeira reação de

45

PCR apresentou 2μL de DNA, 0,25pmol/μL de cada primer PXO+ e PXO- e 1x

master mix (Promega®), sob a ciclagem de 94ºC/5min, 35 ciclos de 94ºC/1min,

53ºC/15s, 72ºC/1min30 e extensão final de 72ºC/10min. Na segunda reação foi

utilizado com template para a segunda reação, a qual continha 2μL

do templete 0,83pmol/μL de cada primer PXI3+ e PXI3- e 1x master mix

(Promega®), com ciclagem de 50ºC/2min, 95ºC/13min, 35 ciclos de 95ºC/30s,

72ºC/1min, 55ºC/30s e extensão final de 72ºC/9min. Na digestão utilizou-se 8μL

do produto de PCR (primers PXI3+ e PXI3-), 2U da enzima Bsh1236I e 1x tampão-

R por 16h/37ºC. As análises dos comprimentos dos polimorfismos em relação aos

fragmentos de restrição (RFLP) foi utilizada a eletroforese em gel de agarose a

2%.

4.13 Quantificação da carga proviral do HTLV-1 nas amostras

Foi realizada uma quantificação relativa, baseada em uma proporção que

derivou da relação quantitativa entre alvo e o controle endógeno: “Proporção do

HTLV-1 inserido no Genoma” (PHG). A quantificação da carga proviral foi

realizada de acordo com a expressão 2 – Ct (HTLV I) / 2 – Ct (Albumina) x leucócitos.106 x

2 = cópias de HTLV-1 cel/mm3, segundo de Arruda et al. (2008), utilizando o kit

SYBR Green I Master Mix 2x (LGC Biotecnologia®). As amostras quantificadas

foram amplificadas em duplicata, utilizando-se os seguintes primers (DEHEE et

al., 2002): SK110 e SK111.

4.14 Curva-padrão para a PCR em tempo real

O plasmídeo para construção da curva-padrão utilizada no experimento foi

gentilmente cedido pelo Laboratório Avançado de Saúde Pública (Lasp) do

Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz, na Bahia. Trata-se de um clone com dupla

inserção, contendo uma porção do íntron 12 do gene da albumina e a região pol

do genoma do HTLV-1, contida entre as posições 4.708 e 4.953 (DEHEE et al.,

2002).

4.15 Quantificação do gene da albumina nas amostras

Todas as amostras foram amplificadas em duplicata, utilizando-se os

seguintes primers (DEHEE et al., 2002): Alb-S e Alb-AS. A mistura da reação

usada nas duas reações utilizou 2μL do DNA, 10 μM de cada primer e SYBR

46

Green Master Mix®, em um total de 25μL de reação. Tanto o HTLV-1 quanto a

albumina seguiram o seguinte protocolo de amplificação: 2 minutos a 50°C, 10

minutos a 95°C; 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 65°C (45 ciclos) e foram

amplificados paralelamente no Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science), no

Laboratório de Virologia do LIKA/UFPE (ARRUDA et al., 2008).

A carga proviral de HTLV-1 foi determinada utilizando a seguinte fórmula:

(média do número de cópias de HTLV-1/106 células mononucleares do sangue

periférico (PBMC) da albumina) x 2 x 106 e expressa em número de cópias/106

células PBMC, ou seja:

média do número de cópias de HTLV-I

_______________________________ x 2 x 106 = número de cópias /106 PBMC

106 Células Monucleares da albumina

Todos os primers utilizados nos testes moleculares encontram-se na tabela 01.

Tabela 01. Sequência de primers utilizados na PCR.

Primer Identificação Sequências

SK44 PCR HTLV I GAGCCGATAACGCGTCCATCG

SK110 PCR HTLV I CCCTACAATCCAACCAGCTCAG

SK248 Nested HTLV I CTAGTCGACGTCCCAGGATATGACC

SK249

SK44

ET401

ET403

ET404

Nested HTLV I

PCR HTLV II

PCR HTLV II

Nested HTLV II

Nested HTLV II

CAGACCGCCACCGGTACCGCTCGGC

GAGCCGATAACGCGTCCATCG

CTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTT

GGCTGGGGACTAAACTGGGATCCTGG

CCAAACACGTAGACGGGGGATCC

SK43 Sequência tax CGGATACCCAGTCTACGTGT

SK44 Sequência tax GAGCCGATAACGCGTCCATCG

SK110 Quantificação da carga proviral CCCTACAATCCAACCAGCTCAG

SK111 Quantificação da carga proviral GTGGTGAAGCTGCCATCGGGTTTT

Alb-S Quantificação do gene de albumina GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT

Alb-AS Quantificação do gene de albumina AAACTCATGGGAGCTGCTGGTT

PXO+ Gene tax TCGAAACAGCCCTGCAGATA

PXO- TGAGCTTATGATTTGTCTTCA

PXI3+ Gene tax TTCCGTTCCACTCAACCCTC

PXI3- AGACGTCAGAGCCTTAGTCT’

47

5. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas – UNCISAL

sob o registro nº 1610 e 1875 (ANEXOS A e B). Todos os participantes do estudo

assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE.

6. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

A relação entre a carga proviral e as variaveis foram calculadas usando o

Teste de Fisher. O Teste Mann-Whitney foi aplicado para avaliar as diferenças

entre a carga viral mediana do HTLV-1. O intervalo de confiança foi de 95%, com

p<0,05 como limite para a significância.

O Software GraphPrism 5.0 foi utilizado. A Razão de prevalência, qui-

quadrado (x2) e exato de Fischer foram utilizados para determinar as associações

entre as gestantes.

48

7. RESULTADOS

Os resultados da tese encontram-se nos apêndices e serão apresentados em

forma de artigos intitulados:

Artigo I – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO HTLV EM PACIENTES COM

PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL E PORTADORES

Este artigo foi submetido ao The Journal of Clinical Microbiology (qualis

A1).

Artigo II – PREVALÊNCIA E FATORES DE RISCO PARA INFECÇÃO PELO

HTLV-1/2 EM GESTANTES ASSISTIDAS PELO PROGRAMA DE SAÚDE EM

ALAGOAS, NORDESTE DO BRASIL

Este artigo foi submetido ao International Journal of Obstetrics and

Gynaecology Research (qualis B1).

49

8. CONCLUSÕES

♦ A pesquisa identificou pela primeira vez, entre os pacientes com PET/MAH, os

HTLV-1 e 2 circulantes em Alagoas. O HTLV-2 apresentou-se em níveis elevados;

♦ O HTLV-1 assim como o HTLV-2 foi identificado nos pacientes com PET/MAH e

portadores assintomáticos;

♦ Houve predomínio do subgrupo A da tax entre os pacientes com HTLV-1.

Apenas três apresentaram o subgrupo B;

♦ A média da carga proviral do HTLV-1 foi discretamente mais elevada nos

pacientes assintomáticos em relação à média nos pacientes com PET/MAH;

♦ A prevalência do anti-HTLV1/2 foi de 8,1% entre as gestantes estudadas;

♦ O HTLV-1 foi identificado em 4,3% das gestantes soropositivas, com a média da

carga proviral de 3,17 ± 1,87 log10.

50

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS

♦ A alta frequência do HTLV-2 foi um dado inesperado que deve ser investigado;

♦ A alta frequência do HTLV-1/2 entre as gestantes ressalta a necessidade de

instituir-se a triagem sorológico do vírus no pré-natal.

51

REFERÊNCIAS

ARRUDA, B.C. et al. Evaluation of real time PCR technique to diagnosis of human

T-lymphotropic virus type I (HTLV-I) in patients in the Hematologia da Fundação

Hemope Hospital, in Northeastern Brazil. Revista Brasileira de Hematologia e

Hemoterapia, v. 30, n. 5, p. 384-389, 2008.

BALLARD, D.W. et al. HTLV -1 tax induces cellular proteins that activate the kB

element in the IL-2 receptor alfa gene. Science, v. 241, p. 1652-1655, 1988.

BANGHAM, C.R.M et al. Spread of HTLV-I between lymphocytes by virus-induced

polarization of the cytoskeleton. Science, 2003.

BARMAK, K. et al. Human T cell leukemia virus type I –induced disease: pathways

to cancer and neurodegeneration, Virology, v. 308, p. 1-12, 2003.

BEIMLING, P.; MOELLING, K. Direct interaction of CREB protein with 21 bp tax –

response of HTLV I LTR. Oncogene, v. 7, p. 257-262, 1992.

BEZERRA ACS. (2011) Identificação do provirus defective e classificação da

sequência tax do HTLV-1 em doadores de sangue e pacientes com paraparesia

espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1. Tese de doutorado.

Universidade Federal de Pernambuco.

52

BITTENCOURT, A.L.; OLIVEIRA, M.F. Dermatite infecciosa associada ao HTLV-1

(DIH) infanto-juvenil e do adulto. Anais Brasileiros de Dermatologia. v. 83, n. 4,

p. 351-359, 2008.

BITTENCOURT, A.L. Vertical Transmission of HTLV-I/II: A Review. Revista do

Instituto de Medicina Tropical, v. 40, n. 4, p. 245-251, 1998.

BORDUCCHI, D.M.M. et al. Linfoma/Leucemia de células T do adulto. Revista da

Associação Médica do Brasil, v. 1, n.45, p. 63-70, 1999.

BRITO-MELO, G.E.A. et al. Phenotypic Study of Peripheral Blood Leucocytes in

HTLV-I-Infected Individuals from Minas Gerais, Brazil. Scandinavian Journal of

Immunology, v. 55, n.6, p. 621-628, 2002.

CABRAL, F. et al. Detection of human T-cell lymphotropic vírus type 1 in plasma

samples. Virus Research, v. 163, n.1, p. 87-89, 2012.

CALLATINI, S. et al. Discovery of a new human T-cell lymphotropic virus (HTLV-3)

in Central Africa. Retrovirology, v. 2, n. 30, 2005.

CANN, A. J.; CHEN, I. S. Y. Human T-cell leukemia virus type I and II. In: Fields

virology (ed. BN Fields, Knipe DM, Howley PM, Chanock RM, Melnick JL, Monath

TP, Roizman B, Straus SE) eds. Fields Virology. v. 59, p. 1939, 1996.

53

CARNEIRO-PROIETTI, A.B.F. et al. Infecção e doença pelos vírus linfotrópicos

humanos de células T (HTLV-I/II) no Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical, v. 35, p. 499-508, 2002.

CASTRO, N.M. et al. Bexiga neurogênica associada ao HTLV-I: Duas fases de

uma mesma doença. Urología Panamericana, v. 17, p. 17-9, 2005.

CASSEB, J.; FUKUMORI, L.M.I.; VERGARA, M.P.P. Lack of tax diversity for

tropical spastic paraparesis/human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-I)

associated myelopathy development in HTLV-I-infected subjects in São Paulo,

Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 101, n. 3, p. 273-276, 2006.

CASKEY, M.F. et al. Clinical manifestations associated with HTLV type I infection:

a cross-sectional study. AIDS Research and Human Retroviruses, v. 23, p. 365-

371, 2007.

CARVALHO, E.M. et al. Cytokine profile e imunomodulação em humanos

assintomáticos T-vírus linfotrópico 1-doadores de sangue infectado. Journal

Acquirred Immune Deficency Syndrome. v. 27, p. 1-6, 2001.

CATALAN-SOARES, B.C. et al. Heterogeneous geographic distribution of human

T-cell lymphotropic viruses I and II (HTLV-I/II): Serological screening prevalence

rates in blood donors from large urban areas in Brazil. Cadernos de Saúde

Pública, v. 21, n.3, p. 926-931, 2005.

54

CHEN, Y.A. et al. Sexual transmission of human T-cell leukemia virus T

associated of anti-tax antibody. Proceedings of the National Academy of

Science of the United America. Ewashington, v. 88, n. 4, p. 1182-1186, 1991.

COLIN, D.D. et al. Seroprevalence of human T cell lymphotropic vírus infection

and associated factors of risk in blood donors of rio Branco city, AC, Brazil (1998-

2001). Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, n. 6, p.

677-83, 2003.

DEHÉE, A. et al. Quantitation of HTLV-I proviral load by a TaqMan real-time PCR

assay. Journal of Virological Methods, v. 102, n.1/2, p. 37–51, 2002.

FERREIRA JR, O.C. Human T cell leukemia viruses: epidemiology, biology, and

pathogenesis. Blood Rewies, v. 11, p. 91-104, 1997.

FURUKAWA, Y. et al. Phylogenetic subgroups of human T cell lymphotropic virus

(HTLV) type I in the tax gene and their association with different risks for HTLV-I–

associated myelopathy/tropical spastic paraparesis, Journal of Infectious

Diseases, v. 182, n. 5, p, 1343–1349, 2000.

FRANCHINI, G. Molecular mechanisms of human T-cell leukemia/lymphotropic

virus type I infection. Blood, v. 86, p. 3619-3639, 1995.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=

55

GALVÃO-CASTRO, B. et al. HTLV-I Epidemiology and origin in Salvador, state of

Bahia: the city with the highest prevalence of this infection in Brazil. Gazeta

Médica, v. 79, n. 1, p. 3-10, 2009.

GESSAIN, A. et al. Antibodies to human T-lymphotropic virus type-I in patients

with tropical spastic paraparesis. Lancet, v. 326, n. 8452, p. 407-410, 1995.

GOON, P.K. et al. High circulating frequencies of tumor necrosis alpha and

interleukin-2-secreting human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) specific CDS+

T cells in patients with HTLV-1 associated neurological disease. Journal of

virology, v. 77, p. 9716-9722, 2003.

GONÇALVES, C.C.A. et al. Diagnóstico laboratorial da mielopatia associada ao

HTLV-1: Métodos para análise do líquido cefalorraquidiano. Jornal Brasileiro de

Patologia Medica e Laboratorial, v. 45, n. 2, p. 99-110, 2009.

GREENE, W.C.; BOHNLEIN, E; BALLARD, D.W. HIV-1, HTLV-1 and T-cell growth

transcriptional stratategies and surprises. Immunology Today, v. 10, p. 272-277,

1989.

HANCHARD, B. et al. Human Retrovirology: HTLV. (Blattner WA (ed).) Raven

Press: New York, p. 173–183, 1990.

56

HEREINE, W.; WOODS, T.; GREEN, D. et al. Detection of human T-cell leukemia/

lymphoma virus type I in breast milk of human T-cell leukemia/ lymphoma type I

and II infected mothers. Lancet, v. 340, p. 1157-1158, 1992.

HINO, S. et al. Intervention of maternal transmission of HTLV-1 in Nagasaki,

Japan. New Jersey, v. 8, p. S68-S70, 1994.

HENEINE, W; KHABBAZ, R.F.; LAL, R.B.; KAPLAN, J.E. Sensitive and specific

polymerase chain reaction assays for diagnosis of human T-cell lymphotropic virus

type I (HTLV-I) and HTLV-II infections in HTLV-I/II-seropositive individuals.

Journal Clininical Microbiology, v. 30, p. 1605-7, 1992.

HIGUCHI, M.; FUJII, M. Distincts functions of HTLV-1 Tax1 from HTLV-2 Tax2

contribute key roles to viral pathogenesis. Retrovirology, v. 6, p. 117, 2009.

IGAKURA, T. et al. Spread of HTLV-I Between Lymphocytes by Virus-Induced

Polarization of the Cytoskeleton. Science, v. 299, p. 1713-1716, 2003.

IÑIGUEZ, A.M. et al. Correlation of HTLV-1 tax genetic diversity with HTLV-1

associeted Myelopathy/tropical spastic paraparesis progression and HTLV-1a

gentypes in na HTLV-1 endemic region in Argentina. Journal of Medical

Virology, v. 82, p. 1438-1441, 2010.

IÑIGUEZ, A.M. et al. HTLV-1a tax Gene and Long Terminal Repeat Sequences

from Argentinean Strains Reveal Disagreement with tax Restriction Fragment

57

Length Polymorphism Subtyping. AIDS Research and Human Retroviruses, v.

23, n. 9, p. 1127–1130, 2007.

ISHAK, R. et al. Epidemiological aspects of retrovirus (HTLV) infection among

Indian populations in the Amazon Region of Brazil. Cadernos de Saúde Pública,

v. 19, p. 109-118, 2003.

IWAKURA, Y. Mouse models for rheumatoid arthritis and their use in drug

development. Nippon Yakurigaku Zasshi, v. 120, p. 303-313, 2002.

IWANAGA, M. et al. Human T-cell leukemia virus type I (HTLV-1) proviral load and

disease progression in asymptomatic HTLV-1 carriers: a nationwide prospective

study in Japan. BLOOD, v. 116, n. 8, 2010.

JOHSON, J.M.; HARROD, R.; FRANCHINI, G. Molecular biology and

pathogenesis of the Human T-cell leukaemia/lymphotropic virus type 1 (HTLV1).

Journal of Experimental Pathology, v. 82, p. 135-147, 2001.

KALYANARAMAN, V.S. et. al. A New subtype of human T-cell leukemia virus

(HTLV-II) associeted with variant of hairy cell leukemia. Science, v. 218, p. 571-

573, 1982.

KANNAGI, M. et al. Immunological risks of adult T-cell leukemia at primary HTLV-

I infection. Trends Microbiology, v. 12, n. 7; p. 346-52, 2004.

58

KAPLAN, J.E. et al. The risk of development of HTLV-I associated

myelopathy/tropical spastic paraparesis among persons infected with HTLV-I.

Journal of Acquired Immune deficiency syndromes and Human Retrovilogy,

v. 3, p. 1096-1101, 1990.

KASHIMA, S. et al. Distribution of Human T Cell Lymphotropic Virus Type 1

(HTLV-1) subtypes in Brazil: genetic characterization of LTR and Tax Region.

AIDS Research and Human Retroviruses, v. 22, n. 10, p. 953-959, 2006.

KASHIMA, S. et al. HTLV-1 Proviral load by Real Time PCR. VII International

Symposium About HTLV in Brazil. Brazilian Journal Infectious Disease, n. 9,

2009.

KATRI, P.; RUAN, S. Dynamics of human T-cell lymphotropic virus I (HTLV-I)

infection of CD4+ T-cells. C. R. Biology, v. 327, n. 11, p. 1009-16, 2004.

KITAGAWA, T. et al. Antibodies to HTLV I in Japonese immigrants in Brazil.

Journal of the American Medical Association, v. 256, p. 2342, 1996.

.

KOMURO, A. et al. Vertical transmission of adult T-cell leukemia virus. Lancet 1:

v. 1, p. 240, 1983.

KAKUDA, K. et al. Molecular epidemiology of human T lymphotropic virus type 1

transmission in Okinawa, Japan. American Journal of Tropical Medical and

Hygiene, v. 66, n. 44, p. 404-8, 2002.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Katri%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15628223

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ruan%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15628223

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15628223

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kakuda%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12164296



59

LANOIX, T. et al. Over production of NF-kB2 (lyt-10) and c-Rel: a mechanism for

HTLV-1 tax mediated trans-activation via the NF-kB signaling pathway.

Oncogene, v. 9, p. 841, 1994.

LOPES, M.S.S.N.; CARNEIRO-PROIETTI, A.B.F. HTLV 1/2 transfusional e

hemovigilância: a contribuição dos estudos de look-back. Revista Brasileira de

Hematologia e Hemoterapia, v. 30, n. 3, p. 229-40, 2008.

LIMA, T.V.R. Caracterização sorológica e detecção molecular do HTLV em

amostras de pacientes com distúrbios neurológicos no estado do Pará, Brasil

(1996 – 2005). Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade do Pará, 2006.

LOUREIRO, P. Infecção pelo HTLV I: diagnóstico e determinação da carga

proviral em indivíduos assintomáticos e com enfermidades associadas em serviço

de referência no nordeste. Tese de doutorado em Saúde Pública apresentada ao

centro de Pesquisa Aggeu Magalhães – FIOCRUZ. Recife-PE, 2008.

MACHUCA, A.; SORIANO, V. In vivo fluctuation of HTLV-I and HTLV-II Proviral

Load in Patients Receiving Antiretroviral Drugs. Journal of Acquired Immune

Deficiency Syndromes, v. 24, p.189-193, 2000.

MARTINS, O.A. et al. Parâmetros da resposta imune anti-HTLV –I como

indicadores laboratoriais de estadiamento clínico. VIII International Symposium

About HTLV in Brazil. Brazilian Journal Infectius Disease, 9, 2005.

60

MOCHIZUKI, M. et al. Uveitis associated with human T-cell lymphotropic virus

type I. American Journal Ophthalmology, v. 114, p. 123-129, 1992.

MONTANHEIRO, P.A. Quantificação da carga proviral do Vírus Linfotrópico de

Céulas T Humanas Tipo 1 (HTLV-1) e marcadores imunológicos em indivíduos

portadores e TSP/HAM. Tese de doutorado. Universidade Federal de São Paulo,

2007.

MONTANHEIRO, P.A. et al. HTLV-1 proviral DNA viral load among

assymptomatic patients with TSP/HAM. Brazilian Journal and Medical Biology

Research, v. 38, p. 1643-7, 2005.

MORIUCHI, H. et al. Mother-to-child Transmission of Human T-cell Lymphotropic

Virus Type 1. The Pediatric Infectious Disease Journal, v. 32, p. 175-177, 2013.

MOXOTO, I. et al. Perfil sociodemográfico, epidemiológico e comportamental de

mulheres infectadas pelo HTLV-1 em Salvador-Bahia, uma área endêmica para o

HTLV. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 40, p. 37-41,

2007.

MURPHY, E.L. et al. Higher Human T Lymphotropic Virus (HTLV) Provirus Load Is

Associated with HTLV-I versus HTLV-II, with HTLV-II Subtype A versus B, and

with Male Sex and a History of Blood Transfusion. The Journal of Infectious

Diseases, v. 190, p. 504-510, 2004.

61

NAKAGAWA, M. et al. HTLV-1 associated myelopathy: analyses of 213 patients

based on clinical features and laboratory findings. Journal of Neurovirology, v. 1,

p. 50-61, 1995.

NEJMEDDINE, M. et al. HTLV-1 tax protein triggers microtubule reorientation in

the virological synapse. The Journal of biological Chemistry, v. 1, p. 10, 2005.

NETO, W.K. et al. Prevalence, risk factors and genetic characterization of human

T-cell lymphotropic virus types 1 and 2 in patients infected with human

immunodeficiency virus type 1 in the cities of Ribeirão Preto and São Paulo.

Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 42, n. 3, p. 3, 2009.

NOBRE, V. et al. Dermatologic lesions in patients infected with the human T-cell

lymphotropic virus type 1 (HTLV-1). Revista da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical, v. 38, n. 1, p. 43-52, 2005.

OLIVEIRA, S.R.; AVELINO, M.M. Importância da infecção pelo vírus linfotrópico

de células T humana tipo 1 (HTL V-1), síndromes clínicas associadas e

transmissão vertical. Revista de Patologia Tropical, v. 36, n. 1, p. 17-34, 2007.

OSAME, M. et al. HTLV-I ssociated myelopathy, a new clinical antity. Lancet. 1:

p. 1031-32, 1986.

OLBRICH NETO, J.O.; MEIRA, D.A. Soroprevalência de vírus linfotrópico de

células T humanas, vírus da imunodeficiência humana, sífilis e toxoplasmose em

gestantes de Botucatu – São Paulo – Brasil. Fatores de risco para vírus

62

linfotrópico de células T humanas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina

Tropical, v. 37, p. 28-32, 2004.

PACA-UCCARALERTKUN, S. et al. In vitro selection of DNA elements hight

responsive to the human T-cell lymphocitic virus type I transcriptional activador

tax. Molecular and cellular biology, v. 14, p. 456-462, 1999.

PINHEIRO, S.R. et al. HTLV-I associated uveitis, myelopathy, rheumatoid arthritis

and Sjögren's syndrome. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, v. 53, p. 777-781, 1995.

POIESZ, B.J. et al. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh

and cultured lymphocytes of a pacient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc

National Academy Science (USA), v. 77, p. 7415-7419, 1980.

PROIETTI, F.A. et al. Global epidemiology of HTLV-I infection and associated

diseases. Oncogene, v. 24, p. 6058-6068, 2005.

RIBAS, J.G.R.; DE MELO, G.C.N. Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-

1)-associated myelopathy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina

Tropical, v. 35, n. 4, p. 377-384, 2002.

ROMANELLI, L.C.F.; CARAMELLI, P.; CARNEIRO-PROIETTI, A.B.F. O vírus

linfotrópico de células T humanos tipo 1 (HTLV-1): QUANDO SUSPEITAR DA

INFECÇÃO? Revista da Associação Médica Brasileira, v. 56, n. 3, p. 340-347,

2010.

63

ROMANOS, M.T.V. et al. Viroses oncogênicas. In: SANTOS, NOS; ROMANOS,

MTV; WIGG, MD. Introdução à Virologia Humana. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, cap. 15, p. 448-455, 2004.

RUDHOLF, D.L. et al. Detection of human Tlymphotropic virus type I/II env

antibodies by immunoassays using recombinant fusion proteins. Diagnostic

Microbiology and Infectious Disease, v. 17, p. 35-39, 1993.

SANTOS, F.L.N.; LIMA, F.W.M. Epidemiology physiopathogenesis and

laboratorial diagnosis of the HTLV-I infection. Jornal Brasileiro de Patologia e

Medicina Laboratorial, v. 45, n. 2, p. 05-116, 2005.

SAITO, S; FURUKI, K; ANDO, Y; TANIGAWA, T; KAKIMOTO, K; MORIYAMA, I;

ICHIJO, M. Identification of HTLV-I sequence in cord blood mononuclear cells of

neonates born to HTLV-I antigen/antibody-positive mothers by polymerase chain

reaction. Japanese Journal of Cancer Research, v.81, n.9, p.890-5, 1990.

SEGURADO et al. Identification of human T-lymphotropic virus type I (HTLV-I)

subtypes using restricted fragment lenth polymorphism in a cohort of

assymptomatic carriers and patients with HTLV-1 associated myelopathy/tropical

spastic paraparesis fron São Paulo, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo

Cruz, v. 97, n. 3, p. 329-333, 2002.

SEGURADO, A.A.C. Infecção por HTLV I e II. In: FERREIRA A.W. Diagnóstico

Laboratorial, São Paulo: Guanabara Koogan, 2001. 2.ed.

64

SCHEINER, M.A. et al. Carga proviral do HTLV I em pacientes com mielopatia

associada ao HTLV I/Paraparesia espástica tropical (PET/MAH), com outras

anormalidades neurológicas (ONA) e indivíduos assintomáticos (AC). VIII

International Symposium About HTLV in Brazil. The Brazilian Journal Infectious

Disease, 9, 2005.

SHARMA, U.K. et al. Impact of changes in viral marker screening assays.

Transfusion complications, v. 43, p. 202-214, 2003.

SHUH, S.; BEILKE, M. The Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1): new

insights into the clinical aspects and molecular pathogenesis of adult T-cell

leukemia/lymphoma (ATLL) and tropical spastic paraparesis/HTLV associated

myelopathy (TSP/HAM). Microscopy Research and Technique, v.68, p. 176-

196, 2005.

SILVA, F.A.; MEIS, E.; DOBBIN, J.A.; OLIVEIRA, M.S.P. Leucemia-linfoma de

células T do adulto no Brasil: epidemiologia, tratamento e aspectos controversos.

Revista Brasileira de Cancerologia, v. 4, n. 48, p. 585-595, 2002.

SOUZA, L.A.; LOPES, I.G.L.; MAIA, E.L. Molecular characterization of HTLV-1

among patients with tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy in

Belém, Pará. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 39, n. 5,

p. 504-506, 2006.

65

SUZUKI, T.; HIRAI, H.; FUJISAWA, J. Transactivador taxo f humam T-cell

leukemia virus type I binds to NF-kB p50 and serum response factor (SRF) and

associates with enhancer DNAs of the NF-kB site and carG-box. Oncogene, v. 8,

p. 2391, 1993.

STARLING, A.L.B. et al. Proviral load and the balance of serum cytocines in

HTLV-1-asymptomatic infection and in HTLV-1-associated myelopathy/tropical

spastic paraparesis (HAM/TSP). Acta Tropica, v. 125, p. 75– 81, 2013.

TAMEGÃO-LOPEZ, B.P. Avaliação dos fatores de risco associados à transmissão

do HTLV-1 e do HTLV- 2, em doadores de sangue, na cidade de Belém do Pará.

Dissertação de mestrado apresentada à Universidade Federal do Pará, 2006.

TAKENOUCHI, H. et al. Defective human T-lymphotropic virus Type 1 provirus in

asymptomatic carriers. International Journal of Cancer, v. 128, p. 1335–1343,

2011.

TAYLOR, G.P. Patogênese e tratamento do HTLV-I associated myelopathy.

Sexual Transmission Infection, v. 74, p. 316-22, 1998.

TREVIÑO, A. et al. On Behalf of the HTLV Spanish Study Group. Trends in the

prevalence and distribution of HTLV-1 and HTLV-2 infections in Spain. Virology

Journal, v. 9, n. 71, 2012.

66

UENO, S. et al. Proviral loads of human T-lymphotropic virus Type 1 in

asymptomatic carriers with different infection routes. International Journal of

Cancer, v. 130, p. 2318–2326, 2012.

VINE, A.M. et al. The Role of CTLs in Persistent Viral Infection: Cytolytic Gene

Expression in CD8 Lymphocytes Distinguishes between Individuals with a High or

Low Proviral Load of Human T Cell Lymphotropic Virus Type 1. The Journal of

Immunology, v. 173, p. 5121-5129, 2005.

WOLFE, et al. Emergence of unique primate T-lymphotropic viruses among

central African bushmeat hunters. PNAS, v. 102, n. 22, p. 7994-7999, 2005.

YAMAGUCHI, K. et al. Patogénesis of adult T-cell leukemia from clinical

pathologic features. Human retrovirology: HTLV, Blattner W (ed). Raven Press,

New York, p. 163-71, 1990.

YANAGIHARA, R. et al. Human T lymphotropic vírus type I infection in Papua New

Guinea: high prevalence among the Hagahai confirmed by western analysis.

Journal Infectious Disease, v. 162, p. 649-54, 1990.

YDI, R.R.A.; FERREIRA, D.; SOUTO, F.J.D.; FONTES, C.J.F. Prevalência da

infecção pelo vírus linfotrópico humano de células T- HTLV-1/2 entre puérperas

de Cuiabá, Estado de Mato Grosso, 2006. Revista da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical, v. 42, n. 1, p. 28-32, 2009.

ZANINOVIC, V. Tropical spastic paraparesis. Lancet, v. 2, n. 280, 1987.

67

APENDICES

APENDICE A

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS


TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Nome da pesquisa: Caracterização molecular do vírus linfotrópico de células T de humano (HTLV) em pacientes com paraparesia espástica tropical/mielopatia (PET/MAH), portadores e gestantes em Alagoas.

Eu, maior de 21 anos, estou sendo convidado (a) para participar de uma pesquisa que visa elucidar o perfil molecular do HTLV 1/2. Minha participação é voluntária. Eu vou está livre para não aceitar minha inclusão sem que isso altere em nada o meu tratamento ou vínculo com o meu médico ou com a instituição que eu procurei para tratar-me.

Não se trata de pesquisa para uso de medicamento. Entretanto, os resultados obtidos poderão contribuir para melhor entendimento da infecção pelo HTLV 1/2. Não haverá qualquer despesa para mim e o meu tratamento não sofrerá alterações quanto ao medicamento que eu esteja usando ou vá usar nem quanto ao médico que me atende ou virá atender. O que será feito é a coleta de sangue (10 mL) em uma veia periférica do seu braço. Esse material será analisado pelo próprio pesquisador, no Laboratório do Hospital Dr Hélvio Auto bem como no Laboratório de Imunopatologia keizo Asami – LIKA/UFPE, Recife-PE.

Os riscos que você corre ao participar deste estudo estão relacionados ao local da punção, como exemplo: dolorimento/furmigamento e mancha arroxeada que podem ser minimizados com os cuidados higiênicos tópicos, pressão local após a coleta do sangue e, se necessário, anestésico local. Raramente são observadas infecções decorrentes da punção, mas, caso haja, você será adequadamente tratado (a) sem qualquer ônus. A sua participação não implica em remuneração para você ou para os seus familiares, tratando-se de colaboração voluntária para o conhecimento científico.

Também serão feitas algumas perguntas sobre mim e minha saúde tais como: nome, idade, local de moradia. Todo material escrito e o sangue coletado serão trabalhados com o máximo rigor científico e minha identidade será mantida em sigilo. Os relatórios e publicações resultantes dessa pesquisa conterão os resultados de forma sumarizada e, portanto, não haverá forma de eu ser identificado (a). A minha participação não implica em remuneração para mim ou para os meus familiares, tratando-se de colaboração voluntária para o conhecimento científico.

O projeto dessa pesquisa foi avaliado por um Comitê de Ética em Pesquisa (CEP), segundo padrões internacionais de aprovação de estudos que envolvem seres humanos. Após ter lido este documento e tirado todas as dúvidas com o pesquisador, eu assinei este termo como prova de que, voluntariamente aceitei participar do mesmo.

Em caso de dúvidas, logo abaixo, encontram-se o respectivo endereço do pesquisador:

Erlon Oliveira dos Santos. Edf. Carmelo, 100. Rua Joaquim Antônio de Barros, APTO 101, Centro. CEP 57200-000 Maceió - Al. Fone: (82) 88248860. Maceió, ____ de ____________________de_____ ________________________________ ______________________________

Pesquisador Paciente

68

APENDICE B



( ) Não quero responder No Data:

REG. Classificação do paciente: 1. Sintomático

2. Assintomático

1. IDENTIFICAÇÃO

Idade: 1. 10-18 Anos 2. 19-49 anos 3. 50-60 anos 4. >60 anos

Sexo: 1. M 2. F Cor: 1. Branca 2.Preta 3. Parda 4. Amarela 5. Índígena

Naturalidade: Procedência:

Endereço:

Cidade: Bairro:

CEP: Tel ( ) Cel ( )

Escolaridade: 1. Superior 2. Ensino médio completo, 3. Ensino médio incompleto, 4.

Ensino fundamental completo 5. Ensino fundamental incompleto, 6.Alfabetizados,

7. Analfabetos

Estado civil: 1. Solteiro(a) 2. Solteiro sem companheira 3. Solteira com companheiro

4. Casado, 5. Viúvo 6. Divorciado.

Tempo: ......anos.......Meses

Renda: (em salário mínimo): 1. >SM 2. 1SM 3. 1-5SM 4. 5-10SM 5. <10 SM

2. MOTIVO DO ENCAMINHAMENTO

Motivo 1. Doador de sangue 2. Politransfundido 3. Parente de portador de HTLV

4.Outros

Amamentou: 1. Sim 2. Não 3. Não se

aplica

Foi amamentado(a): 1. Sim 2. Não 3. Não lembro

Mãe de leite: 1. Sim 2.Não

3. Não lembro

Portador de PET/MAH: 1. Sim 2.Não

3. ANTECEDENTES.

1º Teste HTLV-I + Outras infecções:

Doença neurológica na família: 1. Sim 2.Não

Doenças hematológicas na família: 1. Sim 2.Não

Etilismo: 1. Sim 2.Não

Banhos de rio: 1. Sim 2.Não

4. EPIDEMIOLOGIA

Drogas injetáveis:

1. Sim 2.Não

Ainda usa: 1. Sim 2.Não

Tempo de uso:......anos

.......meses

Tempo que parou: ........anos ........ meses

Número atual de parceiros:

Anteriores: Uso de preservativo: 1- SIM 2. NÃO 3- às vezes

No de filhos: Orientação sexual:1. Homossexual 2. Bissexual 3. Heterossexual

69

APENDICE C - Versão em português do artigo I

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO HTLV EM PACIENTES COM

PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL E PORTADORES

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO HTLV

Erlon Oliveira dos Santos1,4, Dayse Maria Vasconcelos de Deus 1,2, Viviane

Martha Santos de Morais1,2; Paulo Roberto Euletério de Souza6, Arthur Maia

Paiva5, Margareth Mendonça5, Maria Helena Araújo5, Ana Cristina de Souza

Bezerra7, Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho1,2,3*

Instituição onde o trabalho foi realizado: Universidade Federal de Pernambuco

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brazil1;

Divisão de Virologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade

Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil2; Departamento de Fisiologia

e Farmacologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de

Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil3; Universidade Estadual de Alagoas,

Universidade de Ciências da Saúde de Alagoas, Maceió, Alagoas, Brasil4;

Ambulatório de Doenças Infeciosas e Parasitárias – Universidade Federal de

Alagoas5; Laboratório Genoma, Universidade Federal de Pernambuco, Recife,

Pernambuco, Brasil 6,Fundação HEMOPE7.

#Autor de correspondência:


70

Rua Manuel Lubambo, 118 – Afogados, Recife, PE, Brazil. Zip Code: 50850-040

E-mail: [email protected] Phone/fax number: 55 81 2126-8527

RESUMO

O HTLV-1 foi identificado em 68,3% dos indivíduos e o HTLV-2 em 31,7%. A

carga proviral foi estatisticamente significativa em pacientes assintomáticos em

comparação com pacientes com PET/MAH. O subgrupo tax foi identificado em

95,7% dos indivíduos. A pesquisa mostrou uma alta frequência de HTLV-2 em

Maceió, Alagoas, Nordeste do Brasil.

Palavras-chaves: (HTLV-1/2), paraparesia espástica tropical, carga proviral do

HTLV-1, proteína tax.

O vírus linfotrópico de célula T humana 1 (HTLV-1) está associado a

diversas doenças entre elas a paraparesia espástica tropical/mielopatia associada

ao HTLV (PET/MAH). Por outro lado, o HTLV-2 tem sido ocasionalmente

associado a síndromes neurológicas semelhantes a PET/MAH sem evidências de

produção de malignidade hematológica (1), entretanto, alguns estudos sugerem

uma associação com a PET/MAH e com o aumento da incidência de bronquite,

pneumonia e infecção do trato urinário (2,3).

Estudo tem demonstrado que 1% a 5% dos indivíduos infectados poderão

desenvolver PET/MAH e quando infectados na infância esse percentual é de

0,25% a 4% (4). Marcadores de histocompatibilidade, resposta imunológica, carga

proviral, mutações virais e a ação da proteína tax podem estar associados ao

desenvolvimento da doença (4,5).

A detecção da carga proviral é importante para o monitoramento do

número de células infectadas, atuando como indicador na predisposição às

71

patologias a ele associadas. Esta se encontra cerca de 10 a 100 vezes mais

elevada nos pacientes com PET/MAH do que nos pacientes assintomáticos,

sugerindo a existência da associação entre carga proviral e o desenvolvimento da

doença (5,6). Entretanto, alguns autores identificaram maior carga proviral em

portadores (7,8).

A proteína tax é essencial para a expressão do vírus e desempenha papel

fundamental na ativação dos genes celulares. De acordo com as substituições

encontradas em posições específicas da sequência tax são descritos dois

subgrupos do HTLV-1: tax A e tax B. Tem sido demosntrado que o subtipo tax A

apresenta maior incidência nos pacientes com PET/MAH do que em portadores

assintomáticos (9).

O presente estudo teve como objetivo identificar o tipo de HTLV, quantificar

a carga proviral e classificar a sequência tax nos indivíduos com PET/MAH e

portadores oriundos de dois centros de referência em doenças infecciosas e

parasitárias em Maceió (Alagoas). A população de estudo foi constituída por

pacientes com diagnóstico sorológico para o HTLV-1/2 (ELISA - kit HTLV-I/HTLV-

II Ab Capture ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostic Inc, Raritan, EUA). O

DNA proviral foi extraído utilizando o kit (QIAamp® DNA Blood Mini Kit) a partir de

PBMC tratadas com Histopaque® -1077 (Sigma Diagnostics). A Nested-PCR foi

realizada com a sequência env-tax, utilizando o kit Master Mix 2X (Promega

Corporation®), com volume final de 20µL contendo 2µL de DNA genômico. Os

primers utilizados (tabela 01) foram SK44 e SK110 a 10 pmol, com ciclagem de

7min a 95°C, seguida de 35 ciclos de 95°c por 1 min, 55°C por 1 min e 30s 72º C

por 2min e extensão final de 10min a 72°C. Na segunda reação, foram usados

2μL da primeira reação para um volume final de 20μL. Os primers usados foram

72

SK248 e SK249 a 10 pmol/µL por 5min a 94°C, seguida de 30 ciclos de 94°C por

1 min, 58°C por 1 min e 72ºC por 2min e extensão final de 10min a 72°C. Um

fragmento de 466pb foi visualizado em gel de agarose a 1,8%.

Tabela 01 - Sequência de primers utilizados na PCR.

Primer Identificação Sequências

SK44 PCR HTLV I GAGCCGATAACGCGTCCATCG

SK110 PCR HTLV I CCCTACAATCCAACCAGCTCAG

SK248 Nested HTLV I CTAGTCGACGTCCCAGGATATGACC

SK249

SK44

ET401

ET403

ET404

Nested HTLV I

PCR HTLV II

PCR HTLV II

Nested HTLV II

Nested HTLV II

CAGACCGCCACCGGTACCGCTCGGC

GAGCCGATAACGCGTCCATCG

CTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTT

GGCTGGGGACTAAACTGGGATCCTGG

CCAAACACGTAGACGGGGGATCC

Na quantificação dos genes HTLV-1 e albumina foi utilizado o kit SYBR

Green I Master Mix 2x (Qiagen®) (10). Foram construídas duas curvas padrões

utilizando um plasmídeo carreador dos insertos de interesse, contendo uma

porção do íntron 12 do gene da albumina e a região pol do genoma do HTLV-1,

contida entre as posições 4.708 e 4.953 (11). A carga proviral do HTLV-1 foi

calculada utilizando o Cycle threshold (Ct) referente ao número de cópias do

HTLV-1/reação e o Ct referente ao número de cópias de albumina/reação e a

quantificação foi realizada de acordo com a expressão 2 – Ct (HTLV I) / 2 – Ct (Albumina) x

leucócitos.106 x 2 = cópias de HTLV-1 proviral / mm3.

Para a identificação do polimorfismo na região do gene tax, foi utilizada a

enzima de restrição Bsh1236I (BstUI), isoesquisômero da enzima AccII, na qual

as variantes polimórficas apresentam um sitio de restrição na região 8344 do

gene tax (9).

73

Foi realizada uma Nested-PCR para identificar o DNA proviral do HTLV-2

(Primeira reação: primers SK44 e ET 401 a 10pmol/uL e segunda reação, primers

ET403 e ET404 a 10 pmol/µL), (12). Foi amplificado um fragmento de 829pb.

Foi calculada a relação entre carga proviral e as variáveis utilizando o teste

de Fisher e Mann-Whitney. O intervalo de confiança estabelecido foi de 95%

utilizando o software GraphPrism 5.0. Foi considerado como resultado

estatisticamente significante um p<0,05. O projeto da pesquisa foi submetido e

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de

Ciências da Saúde de Alagoas sob o registro nº 1610.

O HTLV-1 esteve presente em 68,3% (69/101) dos pesquisados, com faixa

etária entre 14 e 82 anos (média de 27 anos), predominando o sexo feminino.

Destes, 42% (29/69) apresentavam PET/MAH e 58% (40/69) eram portadores. O

HTLV-2 foi identificado em 31,7% (32/101), destes 31,2% (10/32) com PET/MAH

e 68,75% (22/32) portadores. Não houve predomínio da infecção por sexo, e a

faixa etária acometida foi de 19 e 76 anos. A média da carga proviral do HTLV-1

não diferiu nos dois grupos (figura 01).

74

Figura 01. Mediana da carga proviral do HTLV-1 em pacientes com PET/MAH e

assintomáticos.

Teste Mann Whitney (IC95%)

O subgrupo A da sequência tax foi identificado em 95,7% (66/69), sendo

40,9% (27/66) nos pacientes com PET/MAH e 59,1% (39/66) nos portadores. O

subgrupo B esteve presente em 4,3% (3/69), sendo 1,5% (1/69) nos pacientes

com PET/MAH e 2,8% (2/69) nos portadores.

Na casuística estudada, o achado de maior prevalência da PET/MAH no

sexo feminino pode está relacionado com a eficiência de transmissão do HTLV-1

do homem para a mulher (13). O fluido seminal estimula a transativação da região

LTR do HTLV-1, representando um importante fator de risco para sua transmissão

(14).

Os indivíduos com PET/MAH tinham idade acima dos 30 anos, com

exceção de uma jovem de 14 anos, cujos pais eram portadores do HTLV-1. Esse

75

dado sugere que a infecção se deu pelo aleitamento, uma vez que ela foi

amamentada por um período de um ano. Estudos mostram que a doença

acomete indivíduos predominantemente na faixa etária entre 30 e 50 anos, não

sendo comum antes dos 20 anos ou após os 70 anos (15,16).

Vários mecanismos estão envolvidos no desenvolvimento da PET/MAH:

relação vírus-hospedeiro, resposta imunológica aumentada, além de elevada

carga proviral (17,18).

Os resultados mostraram uma discreta elevação da carga proviral nos

portadores comparados àqueles com PET/MAH. A quantificação da carga proviral

do HTLV-1 é um importante marcador para o desenvolvimento da PET/MAH. No

entanto, pode haver flutuações da carga proviral nos indivíduos com PET/MAH e

portadores (19,20). Esta pode ser relativamente estável em um único indivíduo ou

variar entre indivíduos, podendo ainda está relacionada com a proliferação clonal

do HTLV-1 em PBMC. Nos indivíduos com carga proviral elevada e que se

mantém assintomáticos haveria um equilíbrio na resposta Th1/Th2 (6,21,22).

A proteína tax desempenha um papel importante no desenvolvimento da

PET/MAH. Furukawa et al. (2000) (9) demonstraram associação entre a presença

da tax A nos indivíduos com PET/MAH. Entretanto, no presente estudo e

corroborando com diversos outros trabalhos (23,24, 25) esta associação não foi

encontrada. Foi encontrado um maior percentual do subgrupo A da sequência tax,

sugerindo está relacionado com a ampla distribuição do HTLV do grupo 1a

(Cosmopolita) e subgrupo A (Transcontinental) no Brasil (9).

No Brasil, a prevalência do HTLV-2 é maior em usuários de drogas

injetáveis e em populações indígenas do Norte do País (26). A alta prevalência

encontrada em Alagoas pode está associada aos fatores étnicos, uma vez que,

76

existem várias tribos indígenas no Estado. Considerando, ser a primeira pesquisa

que demonstrou a presença do HTLV-2 em nosso meio, recomenda-se que

estudos sejam realizados em comunidades indígenas para melhor caracterização

dessa população.

REFERÊNCIAS

1. Treviño A, Aguilera A, Caballero E, Benito R, Parra PM, Eiros MJ,

Hernandez A, Calderón E, Rodríguez M, Torres A, García J, Ramos JM,

Roc L, Marcaida G, Rodríguez C, Trigo M, Gomez C, Ortíz O, Mendoza

C, Soriano V. 2012. On Behalf of the HTLV Spanish Study Group. Trends

in the prevalence and distribution of HTLV-1 and HTLV-2 infections in

Spain. Virology J. 9:1-5.

2. Orland JR, Wang B, Wright DJ, Nass CC, Garratty G, Smith JW,

Newman B, Smith DM, Murphy EL. 2004. Increased mortality associated

with HTLV-II infection in blood donors: a prospective cohort study.

Retrovirology 1:1-9.

3. Posada-Vergara MP, Montanheiro P, Ligia MI, Bonasser FF, Duarte

AJS, Penalva de Oliveira AC, Casseb J. 2006. Clinical and

epidemiological aspects of HTLV-II infection in São Paulo, Brazil: presence

of tropical spastic paraparesis/htlv-associated myelopathy (TSP/HAM)

simile diagnosis in HIV-1-co-infected subjects. Rev. Inst. Med. Trop.

48:207-210.

4. Cook LB, Elemans M, Rowan AG, Asquith B. 2013. HTLV-1: Persistence

and pathogenesis. Virology. 435:131–140.

77

5. Romanelli LCF, Caramelli P, Carneiro-Proietti ABF. 2012. O vírus

linfotrópico de células T humanos tipo 1 (HTLV-1): quando suspeitar da

infecção? Rev. Ass. Med. Bras. 56:340-347.

6. Starling ALB, Martins-Filho AO, Lambertucci JR, Labanca L; Pereira

SRS, Teixeira-Carvalho A, Martins ML, Ribas JG, Carneiro-Proietti,

ABF, Goncalves DU. 2013. Proviral load and the balance of serum

cytokines in HTLV-1-asymptomatic infection and in HTLV-1-associated

myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Acta Tropica. 125:75-

81.

7. Martins AO, Brito-Melo GEA, Reis JGAC, Souza JG. 2005. Parâmetros

da resposta imune anti-HTLV–I como indicadores laboratoriais de

estadiamento clínico. VIII International Symposium About HTLV in Brazil.

Braz. J. Infect. Dis. 9:1-6.

8. Silva MT, Harab RC, Leite AC, Schor D, Araújo A, Andrada-Serpa MJ.

2007. Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) proviral load in

asymptomatic carriers, HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic

paraparesis, and other neurological abnormalities associated with HTLV-1

infection. Clin. Infect. Dis. 44:689-692.

9. Furukawa Y, Yamashita M, Usuku K, Izumo S, Nakagawa M, Osame M.

2000. Phylogenetic subgroups of human T cell lymphotropic virus (HTLV)

type I in the tax gene and their association with different risks for HTLV-I–

associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. J. Infec. Dis. 182:1343-

1349.

10. De Castro-Costa CM, Araújo AQ, Barreto MM, Takayanagui OM, Sohler

MP, da Silva EL, de Paula SM, Ishak R, Ribas JG, Rovirosa LC, Carton

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=

http://cid.oxfordjournals.org/search?author1=Ramza+Cabral+Harab&sortspec=date&submit=Submit

http://cid.oxfordjournals.org/search?author1=Ana+Cl%C3%A1udia+Leite&sortspec=date&submit=Submit

http://cid.oxfordjournals.org/search?author1=Doris+Schor&sortspec=date&submit=Submit

http://cid.oxfordjournals.org/search?author1=Abelardo+Ara%C3%BAjo&sortspec=date&submit=Submit

http://cid.oxfordjournals.org/search?author1=Maria+Jos%C3%A9+Andrada-Serpa&sortspec=date&submit=Submit

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Castro-Costa%20CM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ara%C3%BAjo%20AQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Barreto%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Takayanagui%20OM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sohler%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sohler%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=da%20Silva%20EL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Paula%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ishak%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ribas%20JG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rovirosa%20LC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Carton%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

78

H, Gotuzzo E, Hall WW, Montano S, Murphy EL, Oger J, Remondegui

C, Taylor GP. 2006. Proposal for diagnostic criteria of tropical spastic

paraparesis/HTLV-I-associated myelopathy (TSP/HAM). AIDS Res. Hum.

Retrov. 10:931-5.

11. Semmes OJ, Cazares LH, Ward MD, Qi L, Moody M, Maloney E. 2005.

Discrete serum protein signatures discriminate between human retrovirus

associated hematologic and neurologic disease. Leukemia 19:1229-38.

12. Dehée A, Cesaire R, Desire N, Nicolas JC. 2002. Quantitation of HTLV-I

proviral load by a TaqMan real-time PCR assay. J. Virol. Met. 102:37–51.

13. Lee T. 2004. Quantification of HTLV-1 and 2 proviral load using real-time

quantitative PCR with SYBR green chemistry. J. Clin. Virol. 31:275-282.

14. Takenouchi H, Umeki K, Sasaki D, Yamamoto I, Nomura H, Takajo I,

Ueno S, Umekita K, Kamihira S, Morishita K, Okayama A. 2011.

Defective human T-lymphotropic virus Type 1 provirus in asymptomatic

carriers. Int. J. Cancer 128:1335-1343.

15. Moriuchi M, Moriuchi H. 2004. Seminal fluid enhances replication of

Human T-Cell Leukemia Virus Type 1: Implications for sexual transmission.

J. Virol. 78:12709-12711.

16. Iwanaga M, Watanabe T, Utsunomiya A, Okayama A, Uchimaru K, Koh

KR, Ogata M, Kikuchi H, Sagara Y, Uozumi K, Mochizuki M, Tsukasaki

K, Saburi Y, Yamamura M, Tanaka J, Moriuchi Y, Hino S, Starling ALB,

Martins-Filho AO, Lambertucci JR, Labanca L; Pereira SRS, Teixeira-

Carvalho A, Martins ML, Ribas JG, Carneiro-Proietti, ABF, Goncalves

DU. 2013. Proviral load and the balance of serum cytokines in HTLV-1-

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gotuzzo%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hall%20WW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Montano%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Murphy%20EL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Oger%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Remondegui%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Remondegui%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Taylor%20GP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067261



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=

79

asymptomatic infection and in HTLV-1-associated myelopathy/tropical

spastic paraparesis (HAM/TSP). Acta Tropica. 125:75-81.

17. Souza LA, Lopes IGL, Maia EL. 2006. Molecular characterization of HTLV-

1 among patients with tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated

myelopathy in Belém, Pará. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 39:504-506.

18. Demontis MA, Hilburn S, Taylor GP. 2013. Human T Cell Lymphotropic

Virus Type 1 Viral Load Variability and Long-Term Trends in Asymptomatic

Carriers and in Patients with Human T Cell Lymphotropic Virus Type 1-

Related Diseases. AIDS Res. Hum. Retrov. 29:359-364.

19. Iñiguez AM, Otsuki K, Gastaldello R, Gallego S, Vicente ACP. 2007.

HTLV-1a tax Gene and Long Terminal Repeat Sequences from

Argentinean Strains Reveal Disagreement with tax Restriction Fragment

Length Polymorphism Subtyping. AIDS Res. Hum. Retrov. 23:1127-1130.

20. Furtado MSBS, Andrade RG, Romanelli LCF, Ribeiro MA, Ribas JG,

Torres EB, Barbosa-Stancioli EF, Carneiro Proietti ABF, Martins ML.

2012. Monitoring the HTLV-1 Proviral Load in the Peripheral Blood of

Asymptomatic Carriers and Patients With HTLV-Associated

Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis from a Brazilian Cohort: ROC

Curve Analysis to Establish the Threshold for Risk Disease. J. Med. Virol.

84:664-671.

21. Goon PK, Igakura T, Hanon E, Mosley AJ, Asquith B, Gould KG, GP,

Weber JN, Bangham CRM. 2003. High circulating frequencies of tumor

necrosis alpha and interleukin-2-secreting human T-lymphotropic virus type

http://jvi.asm.org/search?author1=Tadahiko+Igakura&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Emmanuel+Hanon&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Angelina+J.+Mosley&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Becca+Asquith&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Keith+G.+Gould&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Jonathan+N.+Weber&sortspec=date&submit=Submit

http://jvi.asm.org/search?author1=Charles+R.+M.+Bangham&sortspec=date&submit=Submit

80

1 (HTLV-1) specific CDS+ T cells in patients with HTLV-1 associated

neurological disease. J. Virol. 77:9716-9722.

22. Cook LB, Rowan GA, Melamed A, Bangham CRM. 2012. HTLV-1–

infected T cells contain a single integrated provirus in natural infection.

Blood 120:34-90.

23. Gillet NA, Malani N, Melamed A, Gormley N, Carter R, Bentley D, Berry

C, Bushman FD, Taylor GP, Bangham CRM. 2011. The host genomic

environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1–infected

T-cell clones. Blood. 117:3113-3122.

24. Iñiguez AM, Gastaldello R, Otsuki K, Balangero M, Costa FC,

Remondegui C, Vicente ACP, Gallego S. 2010. Correlation of HTLV-1 tax

genetic diversity with HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic

paraparesis progression and HTLV-1a genotypes in an HTLV-1 endemic

region in Argentina. J. Med. Virol. 82:1438-1441.

25. Kashima S, Alcantara LC, Takayanagui OM, Cunha MAV, Galvão-

Castro B, Pombo-de-Oliveira MS, Zago MA. 2006. Distribution of Human

T Cell Lymphotropic Virus Type 1 (HTLV-1) subtypes in Brazil: genetic

characterization of LTR and Tax Region. AIDS Res. Hum. Retrov. 22:953-

959.

26. Casseb J, Fukumori LMI, Vergara MPP. 2006. Lack of tax diversity for

tropical spastic paraparesis/human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-

I) associated myelopathy development in HTLV-I-infected subjects in São

Paulo, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101:273-276.

81

27. Mota-Miranda AC, Araújo SP, Dias JP, Colin DD, Kashima S, Covas DT,

Tavares-Neto J, Galvão-Castro B, Alcantara LC 2008. HTLV-1 infection

in blood donors from the Western Brazilian Amazon region: seroprevalence

and molecular study of viral isolates. J Med Virol 80: 1966-1971.

28. Ishak R, Vallinoto ACR, Azevedo VC, Vicente ACP, Hall WW, Ishak

MOG. 2007. Molecular evidence for infection by HTLV-2 among individuals

with negative serological screening tests for HTLV antibodies. Epidemiol

Infect. 135:604-609.

1

82

APENDICE D - Versão em português do artigo II PREVALÊNCIA E FATORES DE RISCO PARA INFECÇÃO PELO HTLV-1/2 EM

GESTANTES ASSISTIDAS PELO PROGRAMA DE SAÚDE EM ALAGOAS,

NORDESTE DO BRASIL.

INFECÇÃO PELO HTLV EM GESTANTES

Erlon Oliveira dos Santos1,2,6, Jéfferson Luis de Almeida Silva1,2 Viviane Martha

Santos de Morais1,2, Georgea Gertrudes de Oliveira Mendes Cahú1,2, Dayse Maria

Vasconcelos de Deus1,2, Mariana Peixoto de Andrade2; Carlos Winícius Moreira

Silva6, Camilla Karen Costa Silva6,Terezinha Tenório da Silva5; Maria Rosângela

Cunha Duarte Coêlho1,2,3

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Centro de Ciências da Saúde

(CCS) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco,

Brasil1; Setor de Virologia, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami

(LIKA/UFPE)2; Departamento de Fisiologia e Farmacologia, do Centro de Ciências

Biológicas (CCB/UFPE)4; Departamento de Materno Infantil, Centro de Ciências

da Saúde (CCS/UFPE)5; Universidade de Alagoas (UNEAL), Arapiraca, Alagoas,

Brasil6.

Autor para correspondência:


Av. Prof. Moraes Rego, 1235 - Cidade Universitária, Recife - PE - CEP: 50670-

901, Brazil. E-mail: [email protected], Telefone: (+55 81) 2126-8527

83

RESUMO

Avaliar a frequência e descrever os fatores de risco da infecção pelo HTLV-1,

além de quantificar a carga proviral deste vírus em gestantes assistidas pelo

Programa Saúde da Família em Penedo, Alagoas, Brasil. A triagem sorológica foi

realizada utilizando-se o kit comercial (HTLV-I/HTLV-II Ab Capture ELISA Test

System, Ortho-Clinical Diagnostic Inc, Raritan, EUA). Foi realizada a Nested-PCR

para identificar o tipo de HTLV e a PCR em tempo real para a quantificação da

carga proviral do HTLV-1. Das gestantes analisadas 8,1% (17/209) apresentaram-

se reagentes ao ELISA, destas 15 foram testadas pela PCR “in house”, sendo

60% (09/15) positivas para o HTLV-1, todas apresentaram carga proviral

quantificável com média de 3,17 ± 1,87 log10. Eram gestantes com faixa etária

entre 16 e 41 anos, 34,9% eram mães solteiras e 36,8% tinham estudado até o 9o

ano. Das gestantes pesquisadas, 85,2% foram amamentadas, 17,2% relataram

ter tido mãe de leite, 88,5% tiveram mais de uma gestação e 59,3% afirmaram já

ter amamentado. Os dados obtidos demonstram que a triagem sorológica para

HTLV 1/2 constitui uma importante ferramenta para confirmação posterior da

infecção e controle da disseminação do vírus nas gestantes, prevenindo a

transmissão vertical.

Palavras-chaves: Vírus linfotrópico de células T humana tipo 1 e 2 (HTLV-1/2),

gestantes, fatores de risco, carga proviral.

84

1. INTRODUÇÃO

É de extrema importância à identificação da infecção pelo Vírus linfotrópico

de células T de humano tipo 1 (HTLV-1) em gestantes, uma vez que 5% dos

bebês que nascem de mães portadoras do vírus poderão desenvolver a

Leucemia/Linfoma de células T do Adulto (LLTA)1.

Trata-se de uma doença grave que se desenvolve num longo período de

incubação, com um risco de vida estimado em cerca de 3-8% em indivíduos

infectados antes dos 20 anos de idade. O prognóstico é ruim, com sobrevida

média de 6 meses após o diagnóstico da doença2.

A transmissão do vírus ocorre pelas vias sexual, parenteral, vertical e

principalmente pela amamentação em cerca de 20% dos casos3. A contaminação

intrauterina ou durante o parto é pouco eficiente2.

Embora seja grande o número de mulheres infectadas pelo HTLV-1, a

grande maioria permanece assintomática, mesmo durante a gestação. Após o

parto, há o risco de transmissão viral para o filho durante o aleitamento materno.

Os dados que sustentam a importância do leite materno na transmissão do HTLV-

1 baseiam-se na presença de peptídeos antigênicos do vírus no leite de mães

infectadas, o aumento significativo da infecção por esse vírus em crianças

amamentadas em comparação àquelas alimentadas com uso de mamadeiras².

Um estudo mostrou que 32% das crianças amamentadas por 2 anos ou mais se

tornaram portadoras do vírus, contra 9% daquelas amamentadas por tempo

inferior a seis meses4. Há maior risco de transmissão do vírus quando a mãe

apresenta carga proviral e títulos de anticorpos elevados2,5,6. Já foi demonstrado

carga proviral mais elevada no leite materno quando comparada àquela

encontrada em células sanguíneas periféricas5.

85

A prevalência da infecção pelo HTLV-1 em gestantes apresenta variação,

dependendo da região geográfica analisada, ficando entre 0,6 a 20%7,8,9,10. No

Brasil, a prevalência apresenta oscilação na diferentes regiões, variando de 0,01

a 2,4%11,12,14,15.

2. MATERIAS E MÉTODOS

População de estudo

Foi constituída pelas Gestantes atendidas durante o pré-natal pelo

Programa de Assistência às Gestantes em Penedo, Alagoas, Brasil, no período

compreendido entre setembro e novembro de 2012.

Sorologia

A pesquisa do anti-HTLV-1/2 foi realizada utilizando-se o kit comercial Ab

Capture ELISA Test System (Ortho-Clinical Diagnostic Inc, Raritan, EUA),

seguindo as instruções do fabricante.

Separação das células periféricas mononucleares e extração do DNA

As células periféricas mononucleares (PBMC) foram separadas de

amostras de sangue total, colhidas com EDTA usando o Histopaque® -1077

(Sigma Diagnostics), com solução final ajustada para 1x106 células/mL

armazenadas em meio RPMI a - 80ºC. Para a extração de DNA genômico utilizou-

se o Mini Kit (QIAamp® DNA Blood, Quiagen, Hilden, Germany).

Detecção do DNA proviral

Na pesquisa do DNA proviral do HTLV-1, a primeira reação da nested-PCR

para a detecção da sequência env-tax do HTLV-1 foi padronizada para um

volume final de 20µL contendo 2µL de DNA genômico, 2mM de cada dNTP, 10

pmol de cada um dos primers SK44 e SK110 (tabela 01), utilizando o kit Master

Mix 2X (Promega Corporation®). A reação foi processada com uma ciclagem de

86

7min a 95°C, seguida de 35 ciclos de 95°c por 1 min, 55°C por 1 min e 30s 72º C

por 2min e extensão final de 10min a 72°C. Na segunda reação foram usados 2μL

do produto amplificado (diluído 1:10 com água destilada; Ultrapure Invitrogen) e a

mesma preparação do mix da reação anterior, exceto pela utilização dos primers

SK248 e SK249, com ciclagem por 5min a 94°C, seguida de 30 ciclos de 94°C por

1 min, 58°C por 1 min e 72ºC por 2min e extensão final de 10min a 72°C. O

produto amplificado de 466pb foi visualizado por eletroforese em gel de agarose a

1,8% corado com Blue Green Loading Dye (LGC Biotecnologia)9.

Tabela 01. Sequência de primers utilizados na PCR.

Primer Identificação Sequências (5’-3’)

SK44 PCR HTLV 1 GAGCCGATAACGCGTCCATCG

SK110 PCR HTLV-1 CCCTACAATCCAACCAGCTCAG

SK248 Nested HTLV-1 CTAGTCGACGTCCCAGGATATGACC

SK249 Nested HTLV-1 CAGACCGCCACCGGTACCGCTCGGC

SK110 Quantificação da carga

proviral

CCCTACAATCCAACCAGCTCAG

SK111 Quantificação da carga

proviral

GTGGTGAAGCTGCCATCGGGTTTT

Alb-S Quantificação do gene de

albumina

GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT

Alb-AS Quantificação do gene de

albumina

AAACTCATGGGAGCTGCTGGTT

Quantificação da carga proviral

A carga proviral foi quantificada utilizando o kit SYBR Green I Master Mix

2x® (Quiagen, Hilden, Germany)32. Para cada paciente foram realizadas duas

reações (HTLV-1 e Albumina) contendo1μL do DNA genômico (90 ng/μL), 0,6

pmol/μL de cada primer (10 pmol/μL) SK110, SK111, Alb-S e Abl-AS e 1x SYBR

Green I Master Mix. Ambas as reações seguiram a mesma ciclagem: 50°C por 2

87

min, 95°C a 10 min; seguida de 45 ciclos de 95°C 10 seg e 60°C por 1 min. Em

seguida de um aquecimento gradativo (de 60ºC até 95ºC, com aumentos de 0,2ºC

a cada 8s) das amostras amplificadas foi utilizado para verificar a especificidade

dos primers. Posteriormente foram construídas duas curvas padrões utilizando

uma solução diluída em série, contendo 106 cópias de plasmídeo carreador dos

insertos de interesse, com uma porção do íntron 12 do gene da albumina e a

região pol do genoma do HTLV-1, contida entre as posições 4.708 e 4.953, com

limites de quantificação entre 105 a 106 cópias16.

A carga proviral do HTLV-1 foi calculada utilizando o Cycle threshold (Ct) e

resultado da carga proviral foi convertido em log10 para melhor apresentação dos

resultados.

Análises estatísticas

Os dados das gestantes foram armazenados e analisados pelo programa

Epi Info v.3.5.4, onde os testes de associação entre a positividade do anti-HTLV-1

e as variáveis do estudo foram calculados através da razão de prevalência (RP) e

seu intervalo de confiança de 95%. O teste do qui-quadrado (χ2) e o teste exato

de Fischer foram utilizados quando apropriado para determinar se as associações

eram estatisticamente significantes, sendo considerado o valor de p < 0,05 como

resultado significativo.

Ética

O projeto da pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas (UNCISAL) sob o

registro nº 1875. Todos os participantes do estudo assinaram o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido.

88

3. RESULTADOS

As gestantes tinham a faixa etária entre 16 e 41 anos, 34,9% eram mães

solteiras e 36,8% do 5º a 9º ano. Quanto à idade gestacional, 47,8%

encontravam-se entre 16 a 24 semanas de gravidez. As características

epidemiológicas e comportamentais das gestantes pesquisadas estão descritas

na Tabela 02.

Tabela 02. Características sócio-demográficas das 209 gestantes assistidas pelo programa Saúde da Família. Penedo, Alagoas, 2013.

Variáveis

N %

Faixa etária < 18 anos 20 9,6 18 a 28 anos 118 56,5 29 a 39 anos 68 32,5 > 40 anos 3 1,4

Grau de escolaridade

Analfabeto 25 12,0 1º a 4º ano 41 19,6 5º a 9º ano 77 36,8 Ensino médio completo 29 13,9 Ensino médio incompleto 33 15,8 Superior completo 4 1,9

Estado civil

Solteira 73 34,9 Casada 49 23,4 União Consensual 78 37,3 Separada 9 4,3

Transfusão de sangue

Não 191 91,4 Sim 18 8,6

Transplante de órgãos

Não 207 99 Sim 2 1

Foi amamentada

Não 31 14,8 Sim 178 85,2

Teve mãe de leite

Não 173 82,8 Sim 36 17,2

Amamenta ou já amamentou

Não 85 40,7 Sim 124 59,3

N0 de parceiros nos últimos seis meses

89

1 203 97,2 2 a 4 6 2,8

Histórico de sexo com usuários de drogas

Não 166 79,4 Sim 43 20,6

Histórico de sexo com usuários de tatuagem/piercing

Não 168 80,4 Sim 41 19,6

Histórico de DST

Não 195 93,3 Sim 14 6,7

Uso de drogas injetáveis

Não1 209 100

Sim 0 0

Compartilhamento de seringas/agulhas

Não 209 100 Sim 0 0

Compartilhou utensílios como alicate de unha

Não 130 62,2 Sim 79 37,8

Uso de tatuagem/piercing

Não 172 82,3 Sim 37 17,7

A prevalência do anti-HTLV-1/2 encontrada na população de gestantes foi

8,1% (17/209). Das 17 gestantes com sorologia reagente, apenas 15 retornaram

para a realização da pesquisa do DNA viral pela PCR “in house”. Foram positivas

para o HTLV-1 60% (09/15) e todas apresentaram carga proviral quantificável

com média de 3,17 ± 1,87 log10. Não foi possível observar nenhum achado clínico

compatível com PET/MAH – todas as gestantes encontravam-se assintomáticas,

conforme a tabela 03.

90

Tabela 03. Características relacionadas às gestantes assistidas pelo Programa Saúde da Família, segundo a positividade para o anti-HTLV. Penedo, Alagoas, 2013. Anti-HTLV 1/2

Variável Positivo Negativo RP2 IC 95%

3 P

N % N %

Faixa etária < 18 anos

1 0 0 20 100 1

De 18 a 28 anos 12 10,2 106 89,8 ----4

De 29 a 39 anos 5 7,4 63 92,6 ----4

> 40 anos 0 0 3 100 ----4

Grau de escolaridade Analfabeto

1 2 8 23 92 1

1º a 4º ano 3 7,3 38 92,7 0,91 0,11 –

8,52 1,000

5º a 9º ano 7 9,1 70 90,9 1,15 0,20 –

8,66 1,000

Ensino médio incompleto 1 3 32 97 0,36 0,01 –

5,55 0,572

Ensino médio completo 3 10,3 26 89,7 0,88 0,08 –

9,79 1,000

Superior completo 1 25 3 75 3,13 0,36 –

26,99 0,370

Estado civil Solteira

1 9 12,3 64 87,7 1

Casada 3 6,1 46 93,9 0,46 0,09 –

2,02 0,357

União Consensual 5 6,4 73 93,6 0,49 0,13 –

1,70 0,330

Separada 0 0 9 100 ----4

Foi amamentada Não

1 11 6,2 25 80,6 1

Sim

6 19,4 167 93,8 0,27 0,09 – 1,92

0,124

Teve mãe de leite Não

1 13 7,5 160 92,5 1

Sim

4 11,1 32 88,9 1,54 0,39 – 5,53

0,502

Amamenta ou já amamentou Não

1 6 7,1 79 92,9 1

Sim

11 8,9 113 91,1 1,28 0,42 – 4,09

0,831

Número de parceiros nos últimos seis meses

11 16 7.9 187 92 1

2-4 1 16,7 5 83,3 2,34 0,33 – 14,45

0,402

Histórico de sexo com usuários de drogas Não

1 13 7,8 153 92,2 1

Sim

4 9,3 39 90,7 1,21 0,31 – 4,29

0,756

Histórico de sexo com usuários de tatuagem/piercing

Não1 15 8,9 153 91,1 1

Sim

2 4,9 39 95,1 0,52 0,08 – 2,55

0,534

Compartilha utensílios como alicate de unha

91

Não1 8 6,1 123 93,9 1

Sim

9 11,5 69 88,5 2,01 0,67 – 6,03

0,259

Uso de tatuagem/piercing Não

1 13 7,6 159 92,4 1

Sim

4 10,8 23 89,2 2,13 0,53 – 7,87

0,257

1 Grupo de referência, 2 RP: Razão de prevalência, 3 IC 95%: Intervalo de confiança, 4 RP indefinido.

4. DISCUSSÃO

A soroprevalência do HTLV 1/2 encontrada neste estudo foi bem superior

aos relatos anteriores10,13,18. Este valor pode estar relacionado às características

pertinentes ao local de estudo. Penedo é uma cidade de origem quilombola,

portanto, com forte influência africana. Em afro-descendentes no Brasil Central foi

relatada prevalência de 0,5%19. Além disso, a diferença na prevalência pode ser

decorrente das condições socioeconômicas, falta de informação sobre a

transmissão viral e o não uso do preservativo.

A maior frequência de casos com sorologia positiva encontrou-se na faixa

etária com media de 23 anos, corroborando com outros trabalhos10,13, cuja media

de idade foi de 27 anos. Por outro lado, houve relato de uma maior frequência

naqueles com faixa etária superior a 50 anos20. Este dado pode ter várias

explicações como soroconversão tardia de infecção adquirida mais cedo na vida,

vida sexual mais ativa, maior exposição sexual com parceiros contaminados e

alteração no epitélio vaginal, principalmente após a menopausa21,22 e por fatores

hormonais13,23.

O baixo nível socioeconômico acompanhado do baixo grau de escolaridade

também está associado à infecção pelo HTLV13,24. Grande parte das gestantes

infectadas eram do 5º ao 9º ano, que por sua vez suporta a teoria que os

92

indivíduos não detentores do conhecimento apresentam maior grau de

vulnerabilidade às infecções, corroborando com outros autores12,13.

É indiscutível a associação existente entre aleitamento materno e infecção

pelo HTLV, esta é a principal via de transmissão. É bastante frequente, em

algumas regiões do país, a prática do aleitamento cruzado como manifestação

solidária entre as mães, fator que implica na disseminação do HTLV na

comunidade25. No presente estudo, 178 das 209 gestantes afirmaram terem sido

amamentadas, e destas, 7,3% (13/178) encontravam-se infectadas pelo vírus.

Provavelmente o aleitamento materno tenha sido a fonte de infecção nessas

gestantes, uma vez que este vírus exibe grande capacidade de instalar-se em

células glandulares, inclusive em células mamárias26. Adicionalmente, durante a

amamentação ocorre a passagem de diversas células, inclusive linfócitos

infectados. Diversos autores têm demonstrado que o período de amamentação

superior a seis meses aumenta a chance de a infecção acontecer10,27. No entanto,

em nossa pesquisa não foi possível verificar o período em que cada gestante foi

amamentada. Embora grande parte das gestantes tenha afirmado ter sido

amamentada, quando interrogadas não sabiam ou não lembravam o período de

amamentação.

O início cada vez mais precoce da vida sexual pode sugerir um risco

adicional para se adquirir doenças de transmissão sexual. Embora a literatura

aponte que ter múltiplos parceiros sexuais ao longo da vida ou ter uma relação

estável com um dos parceiros soropositivo esteja associado à transmissão do

HTLV20,24 tal fato não foi observado em nossa casuística. A maioria das gestantes

positivas se relacionou apenas com um parceiro nos últimos seis meses.

93

Portanto, a provável via de transmissão do HTLV-1/2 pode ter sido pelo

aleitamento, uma vez que todas tinham sido amamentadas.

Na população de gestantes HTLV-1/2 positivas não houve relato de:

histórico de transplante de órgãos, histórico de DSTs, uso de drogas injetáveis e

compartilhamento de agulhas contaminadas. Entretanto, as variáveis comumente

relacionadas à transmissão do HTLV como: sexo com usuário de drogas, uso de

tatuagem/piercing, histórico de transfusão de sangue, ter sido amamentada, ter

tido mãe de leite, número de parceiros e compartilhamento de alicates de unhas

não constituíram fatores de risco para infecção pelo HTLV-1/2 na população

estudada.

Embora não tenha havido associação estatisticamente significante entre as

variáveis pesquisadas, chamamos atenção para dois fatos importantes: o primeiro

pelo alto percentual de gestantes infectadas pelo HTLV; e segundo o número de

gestação de cada uma delas, ou seja : três na segunda e três na terceira

gestação.

Todas as gestantes envolvidas na pesquisa receberam as devidas

orientações sobre a infecção pelo HTLV, inclusive sobre a suspensão do

aleitamento materno no caso de infecção confirmada.

Os dados obtidos demonstram que a triagem sorológica para infecção pelo

HTLV 1/2 constitui uma importante ferramenta no controle da disseminação do

vírus entre as gestantes, alertando para a confirmação da infecção e prevenindo a

transmissão vertical pela amamentação.

Conflito de interesse

Não há conflito de interesse.

REFERÊNCIAS

94

1. Manns A HM, LA Grenade L. Human T-lymphotropic virus type I infection.

Lancet 1999;353:1951–8.

2. Moriuchi H, Masuzaki H, Doi H, Katamine H. Mother-to-child Transmission of

Human T-cell Lymphotropic Virus Type 1. Pediatric Infect Dis J

2013;32(2):175-177.

3. Ribas JGR, De Melo GCN. Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1)-

associated myelopathy. Rev Soc Bras Med Trop 2002;35(4):377-384.

4. Wiktor SZ, Jacobson S, Weiss SH et al. Spontaneous Lymphotropic

proliferation in HTLV-II infection. LACET 1993;337:327-328.

5. Li HC, Biggar RJ, Miley WJ, Maloney EM, Cranston B, Hanchard B, Hisada M.

Provirus Load in Breast Milk and Risk of Mother-to-Child Transmission of

Human T Lymphotropic Virus Type I. J Iinfec Dis 2004;190(7):1275-1278.

6. Hisada M, Maloney EM, Sawada T, Miley WJ, Palmer P, Hanchard B,

Goedert JJ, Manns A. Virus Markers Associated with Vertical Transmission of

Human T Lymphotropic Virus Type 1 in Jamaica. Risk Factors for Vertical

HTLV-1 Transmission. 2002;34(15):1551.

7. Armah HB, Edwin G, Narter-Olaga, Andrew AAdjei, Kofi Asomaning, Richard

K. Gyasi and Yao Tettey. Seroprevalence of human T-cell lymphotropic virus

type I among pregnant women in Accra, Ghana. J Med Microb 2006;55:765–

770.

8. Forbi JC, Odetunde AB. Human T-cell lymphotropic virus in a population of

pregnant women and commercial sex workers in South Western Nigeria.

African Health Sciences 2007;7(3):129-32.

9. Etenna SLD, Caron M, Besson G, Makuwa M, Gessain A, Mahe A; Kazanji,

M. New Insights into Prevalence, Genetic Diversity, and Proviral Load of

95

Human T-Cell Leukemia Virus Types 1 and 2 in Pregnant Women in Gabon in

Equatorial Central Africa. J Clin Microb, 2008;3607–3614.

10. Sequeira CG, Tamegão-Lopes BP, Santos EJM, Ventura AMR, Moraes-Pinto

MI, Succi RCM. Descriptive study of HTLV infection in a population of

pregnant women from the State of Pará, Northern Brazil. Rev Soc Bras Med

Trop 2012;45(4):453-456.

11. Loureiro P. et al. HTLV-1 antibody in blood donors and in haematological

patients in the Northeast of Brazil-State of Pernambuco. Rev Paulista Med

1994;110(5).

12. Dias-Bastos MR, Oliveira CL, Carneiro-Proiett AB. Decline in prevalence and

asymmetric distribution of human T cell lymphotropic virus 1 and 2 in blood

donors, State of Minas Gerais, Brazil, 1993 to 2007. Rev Soc Bras Med Trop

2010;43(6):615-619.

13. Dal Fabbro MMFJ, Cunha RV, Bóia MN, Portela P, Botelho CA, Freitas GMB,

Soares J, Ferri J, Lupion J. HTLV 1/2 infection: prenatal performance as a

disease control strategy in State of Mato Grosso do Sul. Rev Soc Bras Med

Trop 2008;41(2):148-151.

14. Catalan-Soares BC, Proietti FA, Carneiro-Proietti ABF. Human T-cell

lymphotropic viruses (HTLV) in the last decade (1990-2000). Epidemiological

aspects. Rev Bras Epid 2001;4(2):81-95.

15. Câmara, JC; Simonetti, JP; Rodrigues, SR; Simonetti, RSR; Costa, MCFL;

Lopes, CMB; Schatzmayr, HG; Carvalho, SMF. Human T lymphotropic virus

type I infection in pregnant women in Rio de Janeiro, Brazil. Virus reviews and

research 2010;15(1):23-34.

96

16. Olbrich-Neto JO, Meira DA. Soroprevalência de vírus linfotrópico de células T

humanas, vírus da imunodeficiência humana, sífilis e toxoplasmose em

gestantes de Botucatu – São Paulo – Brasil. Fatores de risco para vírus

linfotrópico de células T humanas. Rev Soc Bras Med Trop 2004;37:28-32.

17. Catalan-Soares, B. C.; Carneiro-Proietti, A. B. F.; Proietti F. A. Heterogeneous

geographic distribution of human T-cell lymphotropic viruses I and II (HTLV-

I/II): Serological screening prevalence rates in blood donors from large urban

areas in Brazil. Cad de Saúde Pública 2005;21(3):926-931.

18. Carles G, Tortevoye P, Tuppin P, Ureta-Vidal A, Peneau C, El Guindi W, et al.

HTLV1 infection and pregnancy. J Gynecol Obstet Biol Reprod 2004;33(1 Pt

1):14-20.

19. Nascimento LB, Carneiro MAS, Teles AS, Lopes CLR, Reis NRS, Silva AMC,

Motta-Castro ARC, Otsuki K, Vicente ACP, Martins RMB. Prevalência da

infecção pelo HTLV-1, em remanescentes de quilombos no Brasil Central.

Rev Soc Bras Med Trop 2009;42(6):657-660.

20. Moxoto I, Boa-Sorte N, Nunes C, Mota A, Dumas A, Dourado I, Galvão-Castro

B. Perfil sociodemográfico, epidemiológico e comportamental de mulheres

infectadas pelo HTLV-1 em Salvador-Bahia, uma área endêmica para o

HTLV. Rev Soc Bras Med Trop 2007;40(1):37-41.

21. Kajiyama W et al. Intrafamilial transmission of adult T-cell leukemia virus. J

Infect Dis 1986;154:851-7.

22. Stuver SO, Tachibana N, Okayama A, Shioiri S, Tsunetoshi Y, Tsuda, K,

Mueller NE. Heterosexual transmission of human T cell leukemia/lymphoma

virus type I among married couples in southwestern Japan: an initial report

from the Miyazaki Cohort Study. J Infect Dis 1993;167:57-65.

97

23. Murphy, EL; Figueroa, JP; Gibas WN et al. Sexual transmission of T-

Lymphotopic virus type I (HTLV-I). Ann Inter Med 1991;111(7):555-560.

24. Sanchez-Palacios C, Gotuzzo E, Vandammec EAM, Maldonado Y.

Seroprevalence and risk factors for human T-cell lymphotropic virus (HTLV-I)

infection among ethnically and geographically diverse Peruvian wamen. Inter

J Infect Dis 2003;7(3):132-37.

25. Andrade-Serpa MJ, Araújo AQ, Taffarel, M. et al. Detection and isolation of

human T-cell leukemia/lymphoma vírus type I (HTLV-I) from cultured

lymphocites of a Brazilian TPS/HAM patient. Braz J Biology Res

1995;28(1):165-171.

26. Cartier L, Araya F, Castillo JL, Zaninovic V, Hayami M, Miura T, Imai J,

Sonoda S, Shiraki H, Miyamoto K, Tajima K. Southernmost Carriers of HTLV-

I/II in the World 2005;84(1):1-3.

27. Etenna, SLD, Melanie Caron, Besson G, Makuwa M, Gessain A, Mahe´ A,

Kazanji M. New Insights into Prevalence, Genetic Diversity, and Proviral Load

of Human T-Cell Leukemia Virus Types 1 and 2 in Pregnant Women in Gabon

in Equatorial Central Africa. J Clinical Microbio 2008;46(11):3607–3614.

98

ANEXOS

ANEXO A

99

ANEXO B

100

ANEXO C

AIMS AND SCOPE: The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research is the official Journal of the Asia and Oceania Federation of Obstetrics and Gynaecology and of the Japan Society of Obstetrics and Gynecology. ACCEPTANCE: The acceptance criteria for all papers are the quality and originality of the research and its significance to our readership. Except where otherwise stated, manuscripts are peer reviewed by anonymous reviewers and the Editor. The Editorial Board reserves the right to refuse any material for publication and advises that authors should retain copies of submitted manuscripts and correspondence as material cannot be returned. Final acceptance or rejection rests with the Editorial Board. SUBMISSION OF MANUSCRIPTS: All articles submitted to the Journal must comply with these instructions. Failure to do so will result in return of the manuscript and possible delay in publication. Where contributions are judged as acceptable for publication on the basis of scientific content, the Editor or the Publisher reserve the right to modify typescripts to eliminate ambiguity and repetition and improve communication between author and reader. If extensive alterations are required, the manuscript will be returned to the author for revision. Manuscripts must be submitted online athttp://mc.manuscriptcentral.com/jogr. For assistance, please contact the Editorial Office of The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research at the address below: Editorial Office of The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research c/oWiley-Blackwell Frontier Koishikawa Bldg 4F, 1-28-1 Koishikawa, Bunkyo-ku, Tokyo 112-0002

Japan Email: [email protected] Tel: +81 3 3830 1264 Fax: +81 3 5689 7278 PRE-SUBMISSION ENGLISH-LANGUAGE EDITING: Authors for whom English is a second language may choose to have their manuscript professionally edited before submission to improve the English. A list of independent suppliers of editing services can be found at http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp. All services are paid for and arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or preference for publication COVERING LETTER: Papers are accepted for publication in the Journal on the understanding that the content has not been published or submitted for publication elsewhere. This must be stated in the covering letter. The covering letter must contain an acknowledgment that all authors have contributed significantly, and that all authors are in agreement with the content of the manuscript. In keeping with the latest guidelines of the International Committee of Medical Journal Editors, each author’s contribution to the paper is to be quantified. Authors must state their study does not violate the policies and/or procedures established by journal such as those described in ‘Specific Inappropriate Acts in Publication Process’ click hereand also state that the protocol for the research project has been approved by a suitably constituted Ethics Committee of the institution within which the work was undertaken and that it conforms to the provisions of the Declaration of Helsinki (as revised in Tokyo 2004), available athttp://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html. Nonetheless the research has been approved by Ethic Committee, Associate Editors may reject manuscripts when editors judge there has been a problem ethically. All investigations on human subjects must include a statement that the subject gave informed consent and patient anonymity should be preserved. In general, submission of a case report should be accompanied by the written consent of the subject (or

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101

parent/guardian) prior to publication; this is particularly important where photographs are to be used or in cases where the unique nature of the incident reported makes it possible for the patient to be identified. While the Editorial Board recognizes that it might not always be possible or appropriate to seek such consent, the onus will be on the authors to demonstrate that this exception applies in their case. Any experiments involving animals must be demonstrated to be ethically acceptable and where relevant conform to national guidelines for animal usage in research. Authors should declare any financial support or relationships that may pose potential conflict of interest. POTENTIAL CONFLICT OF INTEREST: Authors should declare any financial support or relationship that may pose conflict of interest as a Conflict of Interest Statement in the Disclosure section of your manuscript according to the new guideline and confirm that the results of this manuscript have not been distorted by research funding or conflicts of interest. Please visit this link for further details: Disclosure form click here. Completion and inclusion of Disclosure Form is obligatory with the submission of all categories of article. If the form is not included or complete, the manuscript will not be considered for peer review. COPYRIGHT: Papers accepted for publication become the exclusive licence of the Asia and Oceania Federation of Obstetrics and Gynaecology and of the Japan Society of Obstetrics and Gynecology, and authors are asked to sign a transfer of Exclusive Licence Form when submitting a manuscript. In signing the transfer of Exclusive Licence Form it is assumed that authors have obtained permission to use any copyrighted or previously published material. In principle, the corresponding author must mail or fax the Exclusive Licence Form to the Editorial office immediately; manuscripts cannot be reviewed until we receive this form from the authors. In the event that the manuscript is rejected, the form is rendered invalid. All authors must read and agree to the conditions outlined in the Exclusive Licence Form. The form, attached to the journal, is also available from http://www.blackwellpublishing.com/pdf/JOG_ELF2010.pdf. It is the responsibility of the corresponding author to ensure that every author of the paper has signed the Exclusive Licence Form. PREPARATION OF THE MANUSCRIPT: Submission should be, double-space, on one side only of A4 paper. The top bottom and side margins should be 30 mm. All the pages should be numbered consecutively in the top right-hand corner, beginning with the title page. Indent new paragraphs. Turn the hyphenation option off, including only those hyphens that are essential to the meaning. Please use Word’s ‘Save As’ option to save our document as an older (.doc) file type. After submission, authors cannot be changed or modified. Original articles: Original articles should provide full-length reports of current research in ether basic or clinical science. The length of an article (including references, tables and appendices etc.) should not exceed 5000 words. The maximum number of authors is ten (10), if you wish to include more than ten (10) authors, please explain the reason in your and describe the individual contribution of each author. PARTS OF THE MANUSCRIPT: Manuscripts should be presented in the following order: (i) title page, (ii) abstract and key words, (iii) text, (iv) acknowledgments, (v) disclosure, (vi) references, (vii) appendices, (viii) figure legends, (ix) tables (each table complete with title and footnotes) and (x) figures. Footnotes to the text are not allowed and any such material should be incorporated into the text as parenthetical matter. Title page: As articles are reviewed single-blind, material that might identify authorship of the paper should be placed on a cover sheet which will be detached before the paper is sent to referees. The title page should contain (i) the title of the paper, (ii) the full names of the authors and (iii) the addresses of the institutions at which the work was carried out together with (iv) the full postal and email address, plus facsimile and telephone numbers, of the author to whom correspondence about the manuscript, proofs and requests for offprints should be sent. The present address of any author, if different from that where the work was carried out, should be supplied in a footnote. The title should be short, informative and contain the major key words. A short running title (fewer than 40 characters, including spaces) should also be provided. Abstract and key words: All articles except case reports must have a structured abstract that states in 250 words or fewer the purpose, basic procedures, main findings and principal

http://mc.manuscriptcentral.com/societyimages/jogr/JOGR%20Disclosure%20guide%202011%20May.pdf

http://www.blackwellpublishing.com/pdf/JOG_ELF2010.pdf

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conclusions of the study. Divide the abstract with the headings Aim, Methods, Results, Conclusions. Case reports should have an unstructured abstract of 150 words or fewer. The title of the article should be described on the top of the abstract. The abstract should not contain abbreviations or references. Five key words (for the purposes of indexing) should be supplied below the abstract, in alphabetical order, and should be taken from those recommended by the US National Library of Medicine’s Medical Subject Headings (MeSH) browser list (http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html). Text: Authors should use subheadings to divide the sections of their manuscript: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgments, Disclosure, References. Acknowledgments: The source of financial grants and other funding should be acknowledged, including a frank declaration of the authors’ industrial links and affiliations. The contribution of colleagues or institutions should also be acknowledged. Thanks to anonymous reviewers are not allowed. Disclosure: At the time of submission, the Corresponding author must include a disclosure statement in the body of the manuscript. The statement will describe all of the authors' relationships with the companies that may have a financial interest in the information contained in the manuscript. This information should be provided under the heading titled 'Disclosure' which should appear after the 'Acknowledgements' section and before the 'References' section. The absence of any interest to disclose must also be stated. References: We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference management and formatting. EndNote reference styles can be searched for here: http://www. endnote.com/support/enstyles.asp Reference Manager reference styles can be searched for here: http:// www.refman.com/support/rmstyles.asp The Vancouver system of referencing should be used. In the text, references should be cited using superscript Arabic numerals in the order in which they appear. If cited only in tables or figure legends, number them according to the first identification of the table or figure in the text. In the reference list, the references should be numbered and listed in order of appearance in the text. Cite the names of all authors when there are six or fewer; when seven or more list the first three followed by et al. Names of journals should be abbreviated in the style used in Index Medicus. Reference to unpublished data and personal communications should not appear in the list but should be cited in the text only (e.g. Smith A, 2000, unpublished data). 1. Standard Journal article: Dunn JM. A large mesenteric cyst complicating pregnancy. JAMA 1967; 200: 1129–1131. 2. Standard journal article using DOI; articles published online in advance without volume, issue, or page number. The DOI will remain valid and allow an article to be tracked even after its allocation to an issue. (More information about DOIs: http://www.doi.org/faq/html): Furuya R, Takahashi R, Furuya S, et al. Is urethritis accompanied by seminal vescu-litis? Int. J. Urol. Published online: 12 May 2009;DOI:10.1111/j.1442-2042.2009.02314.x. Book: Rock JA, Thompson JD (eds) Telende’s Operative Gynecology, 8th edn. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996. Chapter in a Book: Lindheimer MD, Katz AL. Fluid and electroytes metabolism in normal and abnormal pregnancy. In: Arieff AL, DeFronzo RA (eds) Fluid, Electrolytes, and Acid Base Disorders, 2nd edn. New York: Churchill Livingstone, 1995; 839–875. Website: Morse SS. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg. Infect. Dis. (Serial online). 1995 Jan-Mar; 1(1):(24 screens). [Cited 5 Jun 1996.] Available from URL: (xxx) Appendices: These should be placed at the end of the paper, numbered in Roman numerals and referred to in the text. If written by a person other than the author of the main text, the writer’s name should be included below the title. Tables: Tables should be self-contained and complement, but not duplicate, information contained in the text. Tables should be numbered consecutively in Arabic numerals. Each table should be presented with a comprehensive but concise legend. Tables should be double-spaced and vertical lines should not be used to separate columns. Column headings should be brief, with units of measurement in parentheses; all abbreviations should be defined in footnotes. Footnote symbols: †, ‡, §, ¶, should be used (in that order) and *, **, *** should be reserved for P-values. Statistical

http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html

http://www.doi.org/faq/html

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measures such as SD or SEM should be identified in the headings. The table and its legend/ footnotes should be understandable without reference to the text. Figures: All illustrations (line drawings and photographs) are classified as figures. Figures should be cited in consecutive order in the text. Line figures should be supplied as sharp, black and white graphs or diagrams, drawn professionally or with a computer graphics package; lettering should be included. Individual images forming a composite figure should be of equal contrast, to facilitate printing, and should be accurately squared. Images need to be cropped sufficiently to prevent the subject being recognized, or an eye bar used. Magnifications should be indicated using a scale bar on the illustration. Images should be supplied as high resolution (at least 300 d.p.i.) files, saved as .eps or .tif format. Digital images supplied only as low-resolution print-outs and/or files cannot be used. Figure legends: Legends should be self-explanatory and typed on a separate page. The legend should incorporate definitions of any symbols used and all abbreviations and units of measurement should be explained so that the figure and its legend are understandable without reference to the text. (Provide a letter stating exclusive licence authorization if figures have been reproduced from another source.) DISCLOSURE: At the time of submission, the Corresponding author must include a disclosure statement in the body of the manuscript. The statement will describe all of the authors' relationships with companies that may have a financial interest in the information contained in the manuscript. This information should be provided under the heading titled 'Disclosure' which should appear after the 'Acknowledgements' section and before the 'References' section. The absence of any interest to disclose must also be stated. TRIAL AND RESEARCH GUIDELINES: The Editor recommends the following guidelines for evidence-based reporting of randomized controlled trials, systematic reviews and meta-analyses. For reporting randomized controlled trials refer to the guidelines of The CONSORT Statement: http://www.consort-statement.org. For systematic reviews and meta-analyses refer to the guidelines of The PRISMA Statement:http://www.prisma-statement.org/index.htm. ELECTRONIC FILE OF MANUSCRIPTS: The entire article (including tables) should be supplied as a single file; only electronic figures should be supplied as separate files. The following instructions should be adhered to. • It is essential that the final, revised version of the accepted manuscript and the electronic file are identical. • Do not use the carriage return (enter) at the end of lines within a paragraph. • Turn the hyphenation option off. • Specify any special characters used to represent non-keyboard characters. • Take care not to use l (ell) for 1 (one), O (capital o) for 0 (zero) or ß (German esszett) for b (Greek beta). • Use double quotation marks for citations (“”), please note that asterisks must not be used (**). • Use a tab, not spaces, to separate data points in tables. • If you use a table editor function, ensure that each data point is contained within a unique cell; i.e. do not use carriage returns within cells. • Digital figures must be supplied as .tif or .eps files at a resolution of at least 300 d.p.i. ONLINE GUIDELINES - If possible, authors should visit the Wiley-Blackwell websites for authors athttp://authorservices.wiley.com/bauthor/journal.asp which detail further information on the preparation and submission of articles and figures. PROOFS - Notification of the URL from where to download a PDF (Portable Document Format) typeset page proof, associated forms and further instructions will be sent by email to the corresponding author. Alterations to the text and figures (other than the essential correction of errors) are unacceptable at proof stage and authors may be charged for excessive alterations. The proof should be checked, and approval to publish the article should be emailed to the Publisher within 3 days of receipt. Authors should supply an email address to which the notification can be emailed. If absent, authors should arrange for a colleague to access their email, retrieve the PDF page proof and check and return them to the publisher on their behalf.

http://www.consort-statement.org.for/

http://www.prisma-statement.org/index.htm

http://authorservices.wiley.com/bauthor/journal.asp

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ANEXO D

Todas as submissões ao JCM deve ser feita por via electrónica através da apresentação e JournalPress (EJP) online e sistema de revisão por pares na seguinte URL: http://jcm.msubmit.net . (Inscrições por e-mail não será aceito.) Primeiro tempo os usuários devem criar uma conta de Autor, que pode ser usado para enviar a todos os periódicos ASM. Instruções para criar uma conta Autor estão disponíveis na URL acima através da "ajuda para os autores de" link e passo-a-passo as instruções para submeter um manuscrito através EJP também estão disponíveis através do mesmo link na tela de login ou no página titular da conta em casa. Informações sobre os tipos de arquivo aceitáveis para envio eletrônico pode ser encontrado sob os Arquivos título na ajuda para a tela autores. O estilo editorial de revistas ASM está em conformidade com o Manual de Estilo da ASM para Revistas (Sociedade Americana de Microbiologia, 2013, in-house documento) e Como Escrever e Publicar um Livro Científico , 6 ª ed.(Greenwood Press, Westport, CT, 2006), tal como interpretado e modificado pelos editores e do Departamento de Revistas ASM. Os editores e as revistas Departamento reserva o privilégio de edição de manuscritos para se conformar com as convenções estilísticas estabelecidas nas referidas publicações e nestas instruções. Após a recepção da ASM, um manuscrito aceito passa por um processo automatizado preediting, limpeza e marcação específica para o tipo de artigo específico. Para otimizar esse processo, os manuscritos devem ser fornecidos no formato correto e com as seções apropriadas e títulos. Digite cada porção do manuscrito em espaço duplo (mínimo de 6 mm entre linhas), incluindo legendas das figuras, notas de rodapé da tabela, e Referências, e número de todas as páginas em seqüência, incluindo o resumo, legendas de figuras e tabelas. Coloque os dois últimos itens após a seção de Referências. Páginas do manuscrito deve ter números de linhas contínuas e números de página. Artigos sem números de linha e de página serão devolvidos aos autores para a prestação de informações antes do processamento. O tamanho da fonte não deve ser menor do que 12 pontos. Recomenda-se que os seguintes conjuntos de caracteres ser facilmente distinguível no manuscrito: o algarismo zero (0) e a letra "oh" (O), o numeral 1 (um), a letra "el" (l), e o "olho" carta (I), e um sinal de multiplicação (×) ea letra (x) "ex.". Não criar símbolos como gráficos ou usar fontes especiais que são externos ao seu programa de processamento de texto, use o "inserir símbolo" da função. Defina o tamanho da página para 8,5 por 11 polegadas (21,6 ca. por 28 cm). Itálico todas as palavras que devem aparecer em itálico, e indicar caput-ins em negrito. Os manuscritos podem ser editorialmente rejeitados, sem revisão, com base pobres Inglês ou falta de conformidade com as normas estabelecidas nestas Instruções. Autores que estão inseguros sobre o uso adequado Inglês devem ter seus manuscritos verificados por alguém proficiente no idioma Inglês ou contratar um serviço de edição profissional idioma para ajuda. Full-length Papers

Full-length papers incluir os elementos descritos na presente secção. Título, correndo, título e assinatura . Cada manuscrito deve apresentar os resultados de um estudo independente, coesa, assim, os títulos série numerada não são permitidas. Tenha cuidado na composição de um título. Evite o arranjo título / legenda principal, frases completas, e artigos desnecessários. Na página título incluem o título, o título em execução (para não exceder 54 caracteres e espaços), o nome de cada autor, o endereço do (s) instituição (ões) em que o trabalho foi realizado, a afiliação de cada autor, e uma nota de rodapé, indicando o endereço atual (es) de qualquer autor (es) não mais na instituição onde o trabalho foi realizado. Coloque um sinal de número (#) após o nome do autor a quem perguntas sobre o papel deve ser dirigido (ver "nota Correspondente" abaixo). Nota correspondente . O endereço de e-mail para o autor correspondente deve ser incluído na página de título do manuscrito. Esta informação será publicada no artigo como uma nota de rodapé para facilitar a comunicação e vai ser usado para notificar o autor correspondente da

http://jcm.msubmit.net/

http://jcm.asm.org/site/misc/journal-ita_org.xhtml#top

http://jcm.asm.org/site/misc/journal-ita_org.xhtml#cf

http://jcm.asm.org/site/misc/journal-ita_org.xhtml#cf

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disponibilidade de provas e, mais tarde, do arquivo PDF do artigo publicado. Não mais do que dois autores pode ser designado autores correspondentes. Abstrato . Limitar o resumo de 250 palavras ou menos e concisa resumir o conteúdo básico do papel, sem apresentar extensas detalhes experimentais. Evite abreviações e referências, e não incluem diagramas. Quando é essencial incluir uma referência, use o mesmo formato como mostrado para a seção de Referências mas omitir o título do artigo. Concluir o abstrato com uma declaração sumária. Como o resumo será publicado separadamente, abstraindo serviços, deve ser completa e compreensível, sem referência ao texto. Introdução . A introdução deve fornecer informação suficiente para permitir que o leitor a compreender e avaliar os resultados do presente estudo, sem se referir a publicações anteriores sobre o tema. A introdução também deve fornecer a hipótese de que foi requerido ou a justificativa para o presente estudo. Escolha referências cuidadosamente para fornecer o fundo mais saliente do que uma revisão exaustiva do tema. Materiais e Métodos . Os Materiais e Métodos deve incluir informação técnica suficiente para permitir que as experiências de ser repetido. As fontes de todas as mídias (ou seja, nome e localização do fabricante) ou componentes de uma nova formulação deve ser fornecido. Quando as condições de centrifugação são críticos, dar informações suficientes para permitir que um outro investigador para repetir o procedimento: fazer de centrífuga, o modelo de rotor, a temperatura, o tempo a uma velocidade máxima, e a força centrífuga (x g , em vez de rotações por minuto). Para materiais comumente utilizados e métodos (por exemplo, meios de comunicação e determinações de concentração de proteína), uma referência simples ou produto especificamente recomendado ou procedimento é suficiente. Se vários métodos alternativos são geralmente usados, é útil para identificar o método resumidamente, bem como para citar a referência. Por exemplo, é preferível para o estado "As células foram desconjuntadas por tratamento de ultra-sons como descrito anteriormente (9)", em vez de para o estado "As células foram quebradas, como descrito anteriormente (9)." Isso permite que o leitor a avaliar o método sem uma constante referência às publicações anteriores. Descreva novos métodos completamente, e dar fontes de produtos químicos incomuns, reagentes, equipamentos, ou cepas microbianas. Quando um grande número de estirpes microbianas ou mutantes são utilizados em um estudo, incluem tabelas que identificam as fontes imediata (isto é, as fontes de quem as estirpes foram obtidas) e as propriedades das estirpes, mutantes, bacteriófagos, e plasmídeos, etc Um método ou deformação, etc, utilizado em apenas uma das várias experiências relatadas no papel pode ser descrito na secção de resultados ou muito rapidamente (uma ou duas frases) em nota de rodapé da tabela ou legenda da figura. Espera-se que as fontes de quem as estirpes foram obtidas serão identificados. Resultados. Na secção de resultados, incluem a razão ou desenho dos experimentos, bem como os resultados; reserva ampla interpretação dos resultados para a secção Discussão. Apresentar os resultados como concisa quanto possível em um dos seguintes: texto, uma tabela (s) ou figura (s). Evite o uso prolongado de gráficos para apresentar dados que poderia ser mais concisa apresentados no texto ou tabelas. Por exemplo, excepto em casos excepcionais, duplo-recíprocos parcelas usado para determinar aparentes K m valores não devem ser apresentados na forma de gráficos, em vez disso, os valores devem ser indicados no texto. Da mesma forma, gráficos que ilustram outros métodos comumente utilizados para obter constantes cinéticas ou física (por exemplo, viscosidade reduzida lotes e terrenos utilizados para determinar a velocidade de sedimentação) não precisam ser mostrados, exceto em circunstâncias incomuns. Todos os dados tabulares devem ser acompanhadas por qualquer desvio padrão ou erro padrão das médias. O número de determinações repetidas (ou animais) utilizados para fazer tais cálculos devem também ser incluídos. Todas as afirmações relativas a significância das diferenças observadas devem ser acompanhados de valores de probabilidade dada entre parêntesis. O procedimento estatístico utilizado deve ser declarado em Materiais e Métodos. Ilustrações de limite (particularmente fotomicrografias e micrografia eletrônica) para os que são absolutamente necessárias para mostrar os achados experimentais. Enumere as figuras e tabelas na ordem em que são citadas no texto, e não se esqueça de citar todas as figuras e tabelas. Discussão . A sessão de discussão deve fornecer uma interpretação dos resultados em relação ao trabalho publicado anteriormente e para o sistema experimental na mão. Não deve conter repetição extensa da seção de resultados ou reiteração da introdução. Em artigos curtos, os Resultados e Discussão podem ser combinados. Agradecimentos. A fonte de qualquer apoio financeiro recebido para o trabalho a ser publicado deve ser indicado na seção Agradecimentos. (Será assumido que a ausência de tal reconhecimento é uma declaração dos autores de que nenhum apoio foi recebido). O formato

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usual é a seguinte: "Este trabalho foi apoiado pelo Serviço de Saúde Pública concessão CA-01234 do Instituto Nacional do Câncer " Reconhecimento de assistência pessoal deve ser dada como um parágrafo separado, como deve quaisquer declarações negando endosso ou aprovação das opiniões refletidas no papel ou de um produto nele mencionados. Apêndices. Apêndices que contêm material adicional para auxiliar o leitor são permitidas. Títulos, autores, e seções de referência que são distintas das do artigo primário não são permitidos. Se não é praticável para listar o autor (es) do apêndice na assinatura ou indicados nesta seção do artigo primário, reescrever o apêndice de modo que ela pode ser considerada para a publicação como um artigo independente, quer de papel de comprimento completo ou de curto -Forma (anteriormente) Nota estilo. Equações, tabelas e figuras devem ser marcados com a letra "A" antes do número para distingui-las das citadas no corpo principal do texto. Referências

A partir de janeiro de 2013, ASM adotou o sistema de citação seqüência de referências em que as referências são citados em ordem numérica em que aparecem no texto (ASM não usa mais o sistema de citação de nome com uma lista de referências em ordem alfabética). Por exemplo, a primeira referência citada em um artigo é numerado 1 e listados em primeiro lugar nas Referências. Além disso, o ASM não permite mais a abreviação de linhas de autor em entradas na seção de Referências; "et al." Não pode ser usado no lugar de qualquer autor, independentemente do número. (I) Referências listados na seção de Referências. A seção Referências devem incluir todos os artigos de revistas (impressa e online), livros e capítulos de livros (impressos e online), patentes, teses e dissertações, anais de conferências publicados, reunidos resumos publicados livros de resumos ou suplementos de revistas, letras (para o editor), e da empresa de publicações, bem como artigos em revistas de imprensa, capítulos de livros e livros (título da publicação deve ser fornecido). As referências devem ser citadas em ordem numérica em que aparecem no texto (citação de seqüência do sistema). Fornecer os nomes de todos os autores para cada referência, como a linha de autor não será abreviado e "et al." não será utilizado . Todas as referências listadas devem ser citadas entre parênteses, em número no texto. Desde título e informação assinatura que é baixado da PubMed nem sempre mostra acentos, itálico, ou caracteres especiais, os autores devem consultar os arquivos PDF ou versões impressas dos artigos e incorporar as correções necessárias no manuscrito submetido. Abreviar nomes revista de acordo com o banco de dados PubMed Revistas (National Library of Medicine, National Institutes of Health), a principal fonte para o estilo ASM. Seguir os estilos mostrados nos exemplos abaixo para referências de impressão.

1. Caserta E, Haemig HAH, Manias DA, Tomsic J, Grundy FJ, Henkin TM, Dunny GM. 2012. In vivo e in vitro em análise de regulação do promotor responsivo a feromonas prgQ pela proteína de receptor PrgX pheromone. J. Bacteriol. 194:3386-3394.

2. Falagas ME, Kasiakou SK. 2006. Uso de unidades internacionais, quando a administração de colistina vai ajudar confusão relacionada à diminuição várias formulações da droga em todo o mundo. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 2274-2275. (Letter.)

3. {"Carta" ou "Carta ao Editor" é permitido, mas não obrigatório, no final de tal inscrição.}

4. Cox CS, Brown BR, Smith JC. J. Genet, no prelo * {O título do artigo é opcional; título da revista é obrigatória.}.

5. da Costa MS, Nobre MF, Rainey FA. 2001. Gênero I. Thermus Brock e Freeze 1969, 295 AL , emend. Nobre, Truper e da Costa 1996b, 605, p. 404-414. Nos Em Boone DR, RW Castenholz, GM Garrity (ed), manual de Bergey de Bacteriologia sistemática, 2 ª ed, vol 1. Springer, New York, NY.

6. Stratagene. 2006. Sistema de isolamento de ADN de levedura: manual de instruções. Stratagene, La Jolla, CA.{Use o nome da empresa como o autor se nenhum é fornecido para uma publicação da empresa.}

7. Forman MS, Valsamakis A. 2003. Coleta de amostras, transporte e processamento: virologia, p 1227-1241. NaMurray PR, Barão EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH, Yolken RH (ed), Manual de microbiologia clínica, 8 ed, Washington,

http://jcm.asm.org/site/misc/journal-ita_org.xhtml#top

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals

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DC.

8. Fitzgerald G, Shaw D. Em AE Waters (ed), Microbiologia Clínica, no prelo. EFH Publishing Co., Boston, MA. * {Título capítulo é opcional.}

9. García CO, Paira S, R Burgos, Molina J, Molina JF, Calvo C, Vega L, Jara LJ, García-Kutzbach A, Cuellar ML, Espinoza LR. 1996. Detecção de Salmonella DNA na membrana sinovial e líquido sinovial de pacientes da América Latina, utilizando a reacção em cadeia da polimerase. Rheum artrite. 39 (Suppl) : S185.{Resumo Reunião publicado em suplemento da revista.}

10. Smith D, Johnson C, Maier M, Maurer JJ. 2005. Distribuição de fimbrial, fagos e plasmídeos genes de virulência associados entre aves Salmonella enterica serovars, abstr P-038, p 445. Abstr. Conheça general 105.Sou. Soc. Microbiol. Sociedade Americana de Microbiologia, em Washington, DC. {Resumo título é opcional.}

11. Rotimi VO, Salako NÃO, EM Mohaddas, Philip LP. 2005. Abstr Antimicrob Conf 45 Intersci. Agents Chemother., Abstr D-1658. {Resumo título é opcional.}

12. Verde PN, Hood D, Dow CS. 1984. Status taxonômico de algumas bactérias metilotróficas, p 251-254. EmCrawford RL, Hanson RS (ed), o crescimento microbiano em C 1 compostos. Anais do Simpósio Internacional 4.Sociedade Americana de Microbiologia, em Washington, DC.

13. O'Malley DR. 1998. Ph.D. tese. Universidade da Califórnia, Los Angeles, CA. {Título é opcional.}

14. Odell JC. Abril de 1970. Processo para a cultura de lote. EUA patente 484363770. {Incluir o nome do item patenteado / processo, se possível, o número de patentes é obrigatória.}

15. Elder BL, Sharp SE. 2003. Cumitech 39, avaliação de competências no laboratório clínico. Coordenação ed, Sharp SE. ASM Press, Washington, DC.

* Uma referência a uma publicação em imprensa ASM deve indicar o número de controle (por exemplo, JCM00577-13) se é um artigo de jornal ou o nome da publicação, se for um livro. Somente online referências devem fornecer essencialmente a mesma informação que faz referência a impressão fazer. Para artigos de jornal online, publicar ou revisão datas podem substituir o ano de publicação; uma URL DOI (preferencial) ou é necessário para artigos com números de página não tradicionais ou identificadores de artigo eletrônico. Alguns exemplos a seguir.

1. Winnick S, Lucas do, Hartman AL, Toll D. 2005. Como melhorar o cumprimento? Pediatria 115: E718-e724.

2. Smith FX, Merianos HJ, Brunger AT, Engelman DM. 2001. Resíduos polares conduzir associação de hélices transmembranares polyleucine. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 98: 2250-2255. doi: 10.1073/pnas.041593698.

3. Dionne MS, Schneider DS. 2002. O rastreio do sistema imune fruitfly. Genome Biol. 3: REVIEWS1010.http://genomebiology.com/2002/3/4/reviews/1010.

4. Gregory ST. 2 de setembro de 2009, data de postagem. Capítulo 2.5.4, base estrutural para o mecanismo de decodificação. Na Böck A, et al (ed), ECOSAL- Escherichia coli e Salmonella : biologia celular e molecular. ASM Press, Washington, DC. http://www.ecosal.org/. {Note que cada capítulo tem sua própria data de postagem.}

5.

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Nota: a data de postagem ou de adesão é necessária para qualquer referência on-line que é periodicamente atualizado ou alterado. (Ii) As referências citadas no texto . Referências a dados inéditos, manuscritos submetidos para publicação, apresentações, conferências inéditas (por exemplo, um relatório ou cartaz que não apareceu em actas de conferências publicados), comunicações pessoais, pedidos de patentes e patentes pendentes, software de computador, bancos de dados e sites deve ser feita entre parênteses no texto da seguinte forma.

... resultados semelhantes (RB Layton e Weathers CC, dados não publicados). ... sistema foi utilizado (JL McInerney, AF Holden, e PN Brighton, submetido para publicação). ... como descrito previamente (MG Gordon e FL Rattner, apresentado no Simpósio sobre Fourth Microbiologia Alimentar, Overton, IL, 13 a 15 Junho de 1989). {Para resumos nonpublished e cartazes, etc} ... este novo processo (VR Smoll, 20 de Junho de 1999, Australian Patent Office). {Para aplicações não-americanos de patentes, dar a data da publicação do pedido.} ... disponível na base de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html). ... ABC usando software (versão 2.2; Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual [http://www.state.micro.edu]).

URLs para as empresas que produzem qualquer um dos produtos mencionados em seu estudo ou para produtos que estão sendo vendidos não podem ser incluídos no artigo. No entanto, URLs empresa que permitem o acesso a dados científicos relacionados ao estudo ou shareware utilizados no estudo são permitidos. (Iii) Referências relacionado com material suplementar . Referências que estão relacionadas apenas com material suplementar hospedado pela ASM ou publicado em um site pessoal / institucional não devem ser listados na seção de Referências de um artigo; incluí-los com o material suplementar em si. (Iv) Referenciando aceita ASM (publicar-ahead-of-print) manuscritos . Citações de ASM aceita manuscritos deve olhar como exemplo a seguir.

Wang GG, Pasillas MP, Kamps MP. 15 de maio de 2006. Transativação persistente por MEIS1 substitui Hox função em modelos leucemogênese mielóides: provas do co-ocupação de MEIS1-PBX e Hox-Pbx complexos aos promotores de leucemia genes associados. Mol. Cell. Biol. doi: 10.1128/MCB.00586-06.

Outros jornais podem usar estilos diferentes para seus publish-frente-of-print manuscritos, mas as entradas de citação deve incluir as seguintes informações: nome do autor (s), data de publicação, título, título da revista, e volume e números de página e / ou DOI. O seguinte é um exemplo:

Zhou FX, Merianos HJ, Brunger AT, Engelman DM. 13 de fevereiro de 2001, data de postagem.Resíduos polares conduzir associação de hélices transmembranares polyleucine. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA doi: 10.1073/pnas.041593698.

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