UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Centro de … · Um dia você aprende que paciência requer ......

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Frederico Leite Gouveia

SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE DERIVADOS TIAZOLIDÍNICOS VISANDO NOVOS ANTIMICROBIANOS

Dissertação de Mestrado

Recife, PE 2008

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Frederico Leite Gouveia SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE DERIVADOS TIAZOLIDÍNICOS

VISANDO NOVOS ANTIMICROBIANOS Orientadora: Profa. Dra Julianna Ferreira Cavalcanti de Albuquerque

Recife, PE 2008

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área de Concentração: Síntese de Fármacos.

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Gouveia, Frederico Leite

Síntese e avaliação biológica de derivados tiazolidínicos visando novos antimicrobianos / Frederico Leite Gouveia. – Recife: O Autor, 2008.

xvi, 94 folhas: il., fig., tab., esquemas.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Farmácia, 2008.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Tiazolidínicos – Atividades antimicrobianas.

I.Título.

547 CDU (2.ed.) UFPE 547 CDD (22.ed.) CCS2008-048

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmácia Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Reitor

Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins

Vice-Reitor

Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

Prof. José Thadeu Pinheiro

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Prof.ª Jane Sheila Higino

Vice-chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Prof. Samuel Daniel de Souza Filho

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Prof. Pedro Rolim Neto

Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Prof.ª Beate Saegesser Santos

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DEDICATÓRIAS

Primeiramente a minha família em especial aos meus

pais, Lúcia e Ubiratan, por todo esforço em me dar as

oportunidades e incentivos para que eu chegasse até

aqui e pela compreensão nos momentos alegres e

difíceis de minha vida...

A minha namorada Renata pelo carinho

e companheirismo ao longo destes dois

anos de caminhada.

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AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida e pelo fato de ser tão generoso comigo nesta caminhada. À orientadora e amiga profa. Dra. Julianna Ferreira Cavalcanti de Albuquerque pela oportunidade concedida e conhecimento compartilhado desde o tempo de minha iniciação científica. Pela amizade, cobrança e liberdade para conduzir o projeto.

À profa. Dra. Silene Carneiro do Nascimento e a funcionária Maria do Desterro Rodrigues, do Laboratório de Cultura de Células no Departamento de Antibióticos da UFPE, pela realização dos ensaios de citotoxicidade. À profa. Kêsia Xisto F. R. Sena do Laboratório de Fármacos e Ensaios Antimicrobianos do Departamento de Antibióticos da UFPE, pelo suporte dado durante os ensaios antimicrobianos. Aos amigos do laboratório Cris, Dani, Elaíne, Monize, Noely e Renata Cláudia, pelo convívio agradável e momentos de amizade e descontração, em especial a Juan, Renata Mendes, Sandra e Tati pela grande colaboração para a realização deste trabalho. Ao amigo Diogo Rodrigo pela amizade, grande apoio e disposição para ajudar a resolver vários problemas durante o mestrado. Aos amigos da turma de pós-graduação Cleiton, Diogo, Marcos e Silvio pelos momentos divertidos e sofrimento conjunto durante a realização dos créditos e desenvolvimento dos projetos. Aos amigos de apartamento Ellison, Marcelo e Paulo, pelo convívio, resenhas, discussões e amizade. Aos técnicos da central analítica do DQF, em especial Ricardo e Eliete. A todos os professores que fazem parte do programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. A FACEPE pelo suporte financeiro. Novamente aos meus pais, que são o que eu tenho de mais precioso e confiável nesta vida e por tudo que me ensinaram e ensinam. A minha namorada Renata pelo seu apoio, ternura e participação efetiva neste trabalho.

viii

Um dia você aprende que paciência requer

muita prática...

Descobre que realmente pode suportar...

que realmente é forte,

e que pode ir muito mais longe depois de

pensar que não se pode mais.

Aprende que nossas dúvidas são traidoras

e nos fazem perder o bem que poderíamos

conquistar, se não fosse o medo de tentar.

(William Shakespeare)

ix

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 2 2. REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................... 6

2.1. Preparação de tiazolidina-2,4-dionas: ................................................................... 6 2.2. Preparação de 4-tioxo-tiazolidina-2-ona: ............................................................ 10 2.3. Reações de condensação:..................................................................................... 10 2.4. Atividades biológicas de derivados tiazolidínicos: ............................................. 14 2.5. Derivados tiazolidínicos como agentes antimicrobianos: ................................... 14 2.6. Derivados tiazolidínicos como agentes antiproliferativos contra células neoplásicas:................................................................................................................. 21

3. OBJETIVOS............................................................................................................... 24 3.1. Objetivos gerais: .................................................................................................. 24 3.2. Objetivos específicos:.......................................................................................... 24

4. ARTIGO ..................................................................................................................... 25 5. CONCLUSÕES.......................................................................................................... 44 6. PESPECTIVAS .......................................................................................................... 45 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ...................................................................... 47 8. ANEXOS.................................................................................................................... 61

8.1. Materiais e equipamentos utilizados.................................................................... 61 8.1.1. Materiais ....................................................................................................... 61 8.1.2. Equipamentos ............................................................................................... 61

8.2. Metodologias ....................................................................................................... 62 8.2.1. Preparação da Tiazolidina-2,4-diona............................................................ 62 8.2.2. Avaliação da atividade antimicrobiana ........................................................ 62 8.2.3. Avaliação da atividade citotóxica................................................................. 69

8.3. Esquema de síntese.............................................................................................. 71 8.4. Espectros selecionados ........................................................................................ 72 8.5. Resumos publicados em congressos durante o mestrado .................................... 92

x

LISTA DE SIMBOLOGIAS E ABREVIAÇÕES

AcOH ácido acético

AcONa acetato de sódio

AN ágar nutritivo

Ar aromático

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute

CMI concentração mínima inibitória

COX enzima ciclooxigenase

d dubleto

dd duplo dubleto

DAUFPE Departamento de Antibiótico da Universidade Federal de Pernambuco

DCC dicicloexilcarbodiimida

DMAD dimetil acetilenodicarboxilato

DMEM minimum essencial medium eagle modificado dulbecco’s

DMF dimetil-formamida

DMSO dimetilsulfóxido

EtOH etanol

FabH enzima β-Cetoacil-ACP-sintase III

GL glicose extrato de levedura

H.A.M. Hospital Agamenon Magalhães

H.C. Hospital das Clínicas

IC50 concentração que reduz cinqüenta por cento da proliferação celular

IV infravermelho

J constante de acoplamento

MH Müeller-Hinton

MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistente

MTT brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio

MurB enzima enolpiruvil uridina difosfato N-acetilglucosamina redutase

OMS Organização Mundial da Saúde

PBS solução tampão de fosfato padrão

PF ponto de fusão

RMN 1H ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RMN 13C ressonância magnética nuclear de carbono 13

xi

s singleto

t tripleto

UFC unidade formadora de colônia

UTI unidade de terapia intensiva

VRE Enterococcus resistente à vancomicina

� aquecimento

δ deslocamento químico

xii

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Primeira síntese do núcleo tiazolidina-2,4-diona....................................... 6

Esquema 2. Obtenção de 2,4-tiazolidinadionas a partir de tiocarbamatos.................... 6

Esquema 3. Preparação de tiazolidina-2,4-dionas pelo aquecimento da tiouréia, ácido monocloroacético e água sob refluxo..................................................... 7

Esquema 4. 5-arilideno-tiazolidinas funcionalizadas com p-fenoxifenacil substituído....................................................................................................................... 7

Esquema 5. Síntese de tiazolidina-2,4-dionas pela utilização de derivados do ácido carboxílico com cianatos.................................................................................. 7

Esquema 6. Utilização de ácido tiocianoacético e tiocianoacetato para a formação de 2,4-tiazolidinonas....................................................................................... 8

Esquema 7. Detionação da rodanina por ácido monocloroacético e água.................... 8

Esquema 8. Preparação de 5-arilideno-tiazolidina-2,4-dionas a partir de 5-arilideno-rodaninas...................................................................................................... 9

Esquema 9. Síntese de 2,4-tiazolidinadionas a partir de heterocíclicos similares......... 9

Esquema 10. Obtenção de 4-tioxo-tiazolidina-2-ona.................................................. 10

Esquema 11. Síntese de derivados tiazolidínicos benzilidênicos biologicamente ativos............................................................................................................................. 11

Esquema 12. Condensação aldólica da tiazolidina-2,4-diona com aldeídos aromáticos derivados da pirimidona............................................................................. 11

Esquema 13. Síntese de ésteres α-cianocinâmicos por condensação tipo Knoevenagel................................................................................................................. 11

Esquema 14. Formação de 5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas através da utilização de ésteres α-cianocinâmicos......................................................................... 12

Esquema 15. Condensação de tiazolidina 2,4-diona produzindo derivados 5-benzilidenos como isômeros geométricos Z.............................................................. 12

Esquema 16. Série de derivados 5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas com mistura de isômeros para dois compostos.................................................................... 13

Esquema 17. Síntese de derivados 5-(arilideno e arilglioxilideno)-3-fenacil- tiazolidina-2,4-dionas................................................................................................... 15

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Esquema 18. Obtenção de 5-arilazo-3-benzil-4-tioxo-tiazolidina-2-onas a partir de 3-benzil-4-tioxo-tiazolidina-2-onas................................................................ 15

Esquema 19. Esquema de síntese de 2-tiazolilimina-5-arilideno-4-tiazolidinonas..... 16

Esquema 20. Estruturas de compostos com propriedades antibacterianas e Antifúngicas.................................................................................................................. 17

Esquema 21. Síntese de N-substituídas-2-alquilidenos-tiazolidina-4,5-dionas como agentes antibacterianos....................................................................................... 17

Esquema 22. Nova série de tiazolil tiazolidina-2,4-dionas relatadas como agentes antimicrobianos............................................................................................... 18

Esquema 23. Tiazolidina-4-onas análogas da venlafaxina com propriedades antimicrobianas....................................................................................... 19

Esquema 24. Nova série de 1,3-tiazolidinas análogas de nucleosídeos com atividade antibacteriana................................................................................................ 19

Esquema 25. 4-tiazolidinonas 2,3,5-trissubstituídas relatadas como inibidoras da enzima MurB........................................................................................................... 20

Esquema 26. Derivados tiazolidínicos como inibidores da β-Cetoacil-ACP- sintase III (FabH).......................................................................................................... 21

Esquema 27. Derivados tiazolidínicos com efeito anti-proliferativo.......................... 22

Esquema 28. Fórmulas estruturais de moléculas dotadas de atividade contra células de câncer prostático humano............................................................................ 23

Esquema 29. Estruturas de 4-tiazolidinonas com propriedades anti-câncer............... 23

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. RMN 1H em DMSO-d6 a 300 MHz para o composto 5-(4-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3i).................................................. 70 Figura 2. RMN 1H (ampliação) em DMSO-d6 a 300 MHz para o composto 5-(4-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3i).................................................. 71 Figura 3. RMN 13C em DMSO-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(4-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3i).................................................. 72 Figura 4. RMN 13C – DEPT em DMSO-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(4-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3i).................................................. 73 Figura 5. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto 5-(4-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3i).................................................. 74 Figura 6. RMN 1H em DMSO-d6 300 MHz para o composto 5-(2,6-diclorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3l)............................................ 75 Figura 7. RMN 13C em DMSO-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(2,6-diclorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3l)............................................ 76 Figura 8. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto 5-(2,6-diclorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3l)............................................ 77 Figura 9. RMN 1H em DMSO-d6 300 MHz para o composto 5-(2-flúorbenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3a)................................................. 78 Figura 10. RMN 13C em DMSO-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(2-flúorbenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3a)................................................. 79 Figura 11. RMN 13C – DEPT em DMSO-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(4-flúorbenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3c)................................................. 80 Figura 12. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto 5-(2-flúorbenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3a)................................................. 81 Figura 13. RMN 1H em DMSO-d6 300 MHz para o composto 5-(2-bromobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3d).............................................. 82 Figura 14. RMN 13C em DMSO-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(2-bromobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3d).............................................. 83 Figura 15. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto 5-(2-bromobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3d).............................................. 84 Figura 16. RMN 1H em acetona-d6 a 300 MHz para o composto 5-(3-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3h)................................................. 85

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Figura 17. RMN 13C em acetona-d6 a 75.4 MHz para o composto 5-(3-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3h)................................................. 86 Figura 18. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto 5-(3-clorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3h)................................................. 87 Figura 19. RMN 1H em acetona-d6 a 300 MHz para o composto 5-(2,3,5-triclorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3n)....................................... 88 Figura 20. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto

5-(2,3,5-triclorobenzilideno)-4-tioxo-tiazolidina-2-ona (3n)....................................... 89

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LISTA DE TABELAS

Table 1. Inhibitory zone (diameter) mm of compounds against bacterial and yeast strains using the disk diffusion method……………………...………….... 30

Table 2. Inhibitory activity of compounds 2 and 3a-n expressed as MIC (µg/mL)................................................................................................................ 32

Table 3. Minimum inhibitory concentration (MIC) in µg/mL of synthesized compounds against clinical isolate of multidrug-resistent Gram-positive bacterial strains……….…………………………………………………………….... 32

Table 4. Growth inhibitory effects (%) of 3a-n on human carcinoma cell lines…..... 33

Tabela 5. Relação dos isolados clínicos utilizados nos testes de concentração mínima inibitória.......................................................................................................... 62

Tabela 6. Antibiograma dos isolados clínicos utilizados nos testes de concentração mínima inibitória.................................................................................... 63

Tabela 7. Esquema de preparação de diluição das substâncias a serem usadas em testes de sensibilidade por diluição em ágar............................................... 66

RESUMO: Síntese e avaliação biológica de derivados tiazolidínicos visando novos antimicrobianos As doenças infecciosas são responsáveis por número apreciável de óbitos da população mundial. A resistência de microrganismos a antibióticos existentes tem aumentado dramaticamente nos últimos anos. Neoplasias também são fonte de grande preocupação, visto que o câncer permanece como a segunda causa de morte, depois das desordens do coração, tanto em países avançados como em desenvolvimento. Longe de ser apenas uma curiosidade científica o surgimento de microrganismos resistentes a múltiplas drogas e o grande número de casos de câncer na população mundial, têm exigido o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Diversas publicações têm se referido às tiazolidinas, heterocíclicos pentagonais contendo átomos de nitrogênio e enxofre em seu núcleo, como potenciais agentes antimicrobianos e antiproliferativos. Em um estudo de relação estrutura-atividade preliminar, são descritos neste trabalho a síntese e a avaliação das atividades antimicrobiana e citotóxica de compostos do tipo 5- benzilideno-4-tioxo-tiazolidina-2-onas. Os derivados tiazolidínicos foram obtidos através da tiocarbonilação na posição 4 da tiazolidina-2,4-diona, seguido de condensação tipo Knoevenagel com os respectivos aldeídos aromáticos. Os produtos sintetizados foram purificados por cristalização, lavagem e coluna cromatográfica em solventes apropriados, obtendo-se rendimentos entre 15 e 70% e caracterizados estruturalmente por métodos espectroscópicos convencionais (RMN 1H, RMN 13C e IV). A avaliação antimicrobiana foi realizada in vitro, utilizando os métodos de difusão em disco (determinação do halo de inibição) e concentração mínima inibitória (CMI), frente a bactérias e levedura da coleção de microrganismos do Departamento de Antibióticos da UFPE e frente a isolados clínicos de bactérias Gram-positivas resistentes a múltiplas drogas, obtidas e identificadas nos Setores de Bacteriologia das Unidades Laboratoriais do hospital das Clínicas da UFPE e do Hospital Agamenon Magalhães, de diversos sítios de infecção e setores hospitalares. Os ensaios citotóxicos foram realizados in vitro frente a células NCI-H292 e HEp-2 (derivadas de carcinoma epidermóide de pulmão e laringe respectivamente) cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz. Os resultados mostraram significativa atividade contra bactérias Gram-positivas, incluindo contra os isolados clínicos resistentes a múltiplas drogas, destacando-se a importância da 4-tiocarbonila e do substituinte 5-benzilideno para o aumento da atividade antibacteriana dessa classe de compostos. Nenhum dos derivados testados exibiu atividade antiproliferativa significante contra as linhagens celulares de carcinoma humano. Palavras-chave: Derivados tiazolidínicos; atividade antimicrobiana; Atividade citotóxica

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ABSTRACT: Synthesis and biological evaluation of thiazolidinic derivatives targeting new Antimicrobials Infectious diseases are responsible for a great number of deaths in the world’s population. The resistance of microorganisms to antibiotics in current use has been increasing dramatically in recent years. Neoplasms are also a source of great concern, since cancer remains the second cause of death, after the disorders of the heart, both in developed and developing countries. Far from being just a scientific curiosity, the appearance of microorganisms resistant to various drugs and the elevated number of cases of cancer in the world’s population, requires the development of new alternative therapeutics. Several publications have refered to thiazolidines, pentagonal heterocycles which contain atoms of nitrogen and sulfur in the nucleus, as potential antimicrobial and antiproliferative agents. In a preliminary study of structure-activity relationship, this paper describes the synthesis and evaluation of antimicrobial and cytotoxic activity of compounds of the type 5-arylidene-4-thioxo-thiazolidine-2-ones. The thiazolidinic derivatives were obtained through thiocarbonylation in position 4 of the thiazolidine- 2,4-dione, followed by Knoevenagel condensation with the appropriate aromatic aldehydes. The synthesized products were purified by crystallization, washing and column chromatography in appropriate solvents, obtaining yields between 15 and 70% and structurally characterized by conventional spectroscopic methods (NMR 1H, NMR 13C and IR). The in vitro antimicrobial activity was performed using the disk diffusion method (inhibition halo determination) and the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), against bacteria and yeast from the microorganism collection of the Antibiotics Department of the UFPE and against a clinical isolate of multidrug resistant Gram positive bacterial strains, obtained from Bacteriology Sectors of laboratory units of the Clinical Hospital of the UFPE and of the Agamenon Magalhães Hospital. The clinical isolates were collected from various sites of infection and hospital sectors. The in vitro cytotoxic tests were performed against cells NCI-H292 and HEp-2 (derived from epidermoid carcinoma of lung and larynx respectively) provided by the Adolfo Lutz Institute. The results showed significant activities against Gram positive bacteria, including the multidrug resistant clinical isolates, evidencing the importance of 4- thiocarbonyl and the 5-benzylidene substituted in the increase of the antibacterial activity of compounds in this class. None of the derivatives tested exhibited significant antiproliferative activity against human carcinoma cell lines. Key-words: Thiazolidinic derivatives; antimicrobial activity; citotoxic activity

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INTRODUÇÃO

Síntese e avaliação biológica de derivados tiazolidínicos visando novos antimicrobianos. Frederico Leite Gouveia

2

1. INTRODUÇÃO

Um dos principais objetivos da química medicinal é o desenvolvimento, síntese

e produção de moléculas como potenciais agentes terapêuticos (VERMA; SARAF,

2007). No passado o desenvolvimento de fármacos foi principalmente baseado no

empiritismo, porém nos últimos anos, tem sido dada grande ênfase ao planejamento

racional de fármacos.

Entre os métodos de produção de drogas na terapêutica o bioisosterismo têm

sido largamente utilizados pelos químicos medicinais para síntese de moléculas

potencialmente bioativas, constituindo uma ferramenta na busca da potencialização de

efeitos farmacológicos e simultânea redução de efeitos colaterais indesejáveis

(THOMAS, 2003). O bioisosterismo é utilizado para modificar a estrutura dos

compostos bioativos mediante a substituição de grupos químicos, conferindo a estes

compostos atividades biológicas semelhantes a do composto matriz, porém com

propriedades físico-químicas ou biológicas vantajosas (KOROLKOVAS;

BURCKHALTER, 1982). Como exemplo, a inserção de grupos benzilidenos em

compostos bioativos, constitui uma estratégia usual para obter ou induzir antagonismo

para algumas propriedades biológicas, bem como para realizar modificações estruturais

como ferramenta para estabelecer relações estrutura-atividade. A diversidade estrutural

e terapêutica acoplada com viabilidade comercial de pequenas moléculas, tem fascinado

pesquisadores das áreas de química orgânica e medicinal (KAVITHA et al., 2006).

Estruturas heterocíclicas vêm recebendo atenção especial, pois pertencem a uma classe

de compostos com utilidade farmacológica comprovada.

Tiazolidinas são compostos heteterocíclicos contendo átomos de nitrogênio e

enxofre em seu núcleo, e seus derivados atraem constante interesse há vários anos,

devido as suas diversas propriedades biológicas (VERMA; SARAF, 2007; SINGH et

al., 1981).

A atividade antimicrobiana é uma das propriedades mais investigadas dos

derivados tiazolidínicos. A necessidade de novas drogas para a terapia de infecções

bacterianas vem crescendo nos últimos anos, pois este tipo de infecção tem aumentado

dramaticamente nas últimas décadas. Com a introdução dos antibióticos nos anos 40, foi

esperada a eliminação de todas as doenças infecciosas, entretanto devido ao amplo

emprego e ao mau uso dos antibióticos, a resistência bacteriana tem se tornado um sério

problema de saúde pública. A diminuição da sensibilidade aos agentes antimicrobianos


3

vem se elevando para uma ampla variedade de patógenos e a resistência a múltiplas

drogas já é comum em muitos microrganismos como Staphylococcus aureus

(HIRAMATSU et al., 1997), Enterococcus faecium (MONTECALVO et al., 1994),

Streptococcus pneumoniae (BUTLER et al., 1996), Acinetobacter species

(LYYTIKAINEN et al., 1995) e Salmonella typhimurium (THRELFALL et al., 1996).

Enterococcus fornece um excelente exemplo de organismos que podem

acumular genes de resistência e transformarem-se em patógenos resistentes a múltiplas

drogas. O primeiro Enterococcus resistente a vancomicina (VRE) foi relatado nos

Estados Unidos em 1989, a maioria em pacientes na Unidade de Terapia Intensiva

(UTI) (onde o uso de antibióticos é maior). Em 1996, a porcentagem de isolados de

VRE dentro de UTIs era de aproximadamente 14% (CENTERS FOR DISEASE

CONTROL AND PREVENTION, 1997), onde muitos eram resistentes a ampicilina,

gentamicina e estreptomicina, deixando poucas opções terapêuticas. As infecções por

VRE já são identificadas em várias partes do mundo como América do Sul, Europa,

África e Oceania. No Brasil o primeiro caso foi confirmado em 1999 (ZANELLA et al.,

1999).

Cepas de S. aureus também têm apresentado diminuição de sua susceptibilidade

a vancomicina, a maior freqüência destas cepas tem sido identificada no Japão

(HIRAMATSU et al., 1997) e nos Estados Unidos (SMITH et al., 1999). Bactérias que

apresentam uma elevada virulência, também são fonte de preocupação. Um exemplo de

clone resistente a múltiplas drogas e altamente virulento, pode ser dado pela propagação

em diferentes regiões do Canadá de uma única cepa de S. aureus resistente à meticilina

(MRSA), que foi introduzida em um hospital através de um paciente vindo da Índia com

dermatite (ROMAN et al., 1997). Embora o paciente tenha passado apenas quatro horas

no hospital, foram identificadas nessa instituição, 4 casos de infecções por MRSA

ligados ao paciente. Cerca de 21 casos adicionais foram observados em um hospital de

Vancouver, ao qual o paciente foi transferido e 26 casos foram constatados em um outro

hospital para o qual o enfermo também foi admitido.

Longe de ser apenas uma curiosidade científica, o aparecimento de cepas

multiresistentes e altamente virulentas tem exigido o desenvolvimento de novas

alternativas terapêuticas. Os derivados tiazolidínicos, através de suas propriedades

antimicrobianas, mostram-se como potenciais candidatos a suprir parte desta

necessidade.


4

Nos últimos anos tem sido muito investigada uma nova aplicação para as

tiazolidinas, a atividade antiproliferativa frente a células neoplásicas. Várias estratégias

têm sido empregadas para combater neoplasias, como o desenvolvimento de drogas

anti-angiogênesis, terapias imunomoduladoras, uso de regimes terapêuticos baseados

em múltiplas drogas (com diferentes mecanismos de ação), uso de pró-drogas, dentre

outros. Entretanto, apesar dos imensos avanços clínicos e no campo da pesquisa básica,

os quais têm resultado no aumento das taxas de cura de algumas malignidades, o câncer

permanece como a segunda causa de morte depois das desordens do coração, tanto em

países avançados como em desenvolvimento (ROSTOM, 2006).

No Brasil, em 2005, a doença matou cerca de 190 000 pessoas (15 % do total de

mortes daquele ano), onde 113 000 vítimas estavam com idade inferior a 70 anos. Sendo

assim, a contínua e árdua tarefa de descobrir novos agentes com potencial

antiproliferativo contra células neoplásicas permanece extremamente importante,

principalmente para casos de neoplasias refratárias, bem como para o tratamento de

cânceres mais ofensivos, tais como o mieloma múltiplo e leucemias.

REVISÃO DA LITERATURA

&

OBJETIVOS


6

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Preparação de tiazolidina-2,4-dionas:

O primeiro núcleo da tiazolidina-2,4-diona foi preparado a partir da

isomerização do ácido tiocianoacético em meio ácido (Heintz, 1865) (Esquema 1).

N

S O

O H

CN S CH2CO

OH

H+

H2O

Esquema 1. Primeira síntese do núcleo tiazolidina-2,4-diona.

Diversos derivados de ácidos α-halogenocarboxílicos, derivados de ácidos

maléicos e ácidos arilacrílico têm sido usados em reações com N,S-nucleófilos.

Tiocarbamatos como precursores de tiazolidina-2,4-dionas representam uma variação

deste método. (Esquema 2, equação – a) Da mesma forma, a reação do derivado do

ácido maléico, dimetil acetilenodicarboxilato (DMAD), com alquilamônio N-

alquiltiocarbamatos em metanol à temperatura ambiente, para a obtenção de 3,5-

dissubstituída-tiazolidina-2,4-diona. (Esquema 2, equação – b). (LESYK;

ZIMENKOVSKY, 2004).

a)

b)

RNH2 RNHCOS -

RNHCOSCH2CO2 -ClCH2CO2 -

R

MeO2C

O

N

S

O

R

COS

B:

MeO2C

CO2Me

H+

O

N

S

O

Esquema 2. Obtenção de 2,4-tiazolidinadionas a partir de tiocarbamatos.

Um dos métodos mais clássicos de obtenção de tiazolidina-2,4-diona foi

desenvolvido por Libermann; Himbert e Hengl (1948) usando tiouréia com

subseqüente hidrólise ácida. (Esquema 3).


7

H2OClCH2CO2H SC(NH2)2+

N

S O

O H

Esquema 3. Preparação de tiazolidina-2,4-dionas pelo aquecimento da tiouréia, ácido monocloroacético e

água sob refluxo.

Koyama et al. (2003), na busca de compostos com atividade anti-

hiperglicemiante, sintetizaram 5-aril tiazolidinadionas, através da ciclização in situ do

anel tiazolidínico a partir de diversos derivados do ácido fenilacético (Esquema 4).

OHMeO

O

R2

O O( )n

O

R1

R3O O( )

n

O

R1

R3

R2N

S

O

O

Ha, b, c

(a) SOCl2, piridina, temp. amb.; (b) tiouréia, NaOAc, EtOH, ; (c) aq-HCl, EtOH, .

Esquema 4. 5-arilideno-tiazolidinas funcionalizadas com p-fenoxifenacil substituído.

Outra metodologia útil para a síntese de tiazolidinas-2,4-dionas é a condensação

de ácidos α-mercaptocarboxílicos com cianatos (OMAR; EL-AASAR; SAIED, 2001)

(Esquema 5, equação – a) ou reação de ácido tioglicólico com fenil isocianato

(DOLLING et al., 1991) (Esquema 5, equação – b).

- +

a)

b) HSCH2CO2H ArOCN+

N

S O

O

- H2O

KOCN H+HN

S O

ON

S O

OKHS CO2H

R

Ar

Esquema 5. Síntese de tiazolidina-2,4-dionas pela utilização de derivados do ácido carboxílico com

cianatos.


8

Ácidos tiocianoacéticos e seus derivados podem ser utilizados para a obtenção

de tiazolidinonas (Esquema 6, equação – a), através de ciclização utilizando ácido

clorídrico diluído ou em etapa única por hidrólise na presença de aldeídos aromáticos

(LESYK; ZIMENKOVSKY, 2004) (Esquema 6, equação – b).

R = H

a)

b)H2O, ArCHO

H2O

HCl

CO2R

SCO2NH2 O

N

S

O H

O

N

S

O H

Ar

NCO2R

S

Esquema 6. Utilização de ácido tiocianoacético e tiocianoacetato para a formação de 2,4-tiazolidinonas.

Um método de ampla aplicação para a síntese de tiazolidina-2,4-dionas é a partir

de heterocíclicos similares, um exemplo é dado pela detionação da rodanina (2-tioxo-

tiazolidina-4-ona) e seus derivados. Esta metodologia foi utilizada por Croxall; Lo e

Shropshire (1953) através do tratamento de rodanina com ácido cloroacético e água sob

refluxo. (Esquema 7).

S

N

S

O HN

S SH

ON

S SCH2CO2H

O

ClCH2CO2HH2O N

S O

O HN

S OH

O

Rodanina

Esquema 7. Detionação da rodanina por ácido monocloroacético e água.

O aquecimento de 5-arilideno-rodaninas com dimetil sulfato sem solvente,

seguido de hidrólise, constitui uma maneira alternativa para a preparação de 5-arilideno-

2,4-tiazolidinadionas (VLADZIMIRSKAYA 1959) (Esquema 8).


9

*MeOSO3-

+N

S

O

Ar

S

R

N

S

O

Ar

R

SMe

SMe

N

S

O

Ar

O

R

N

S

O

SMe

Me2SO4 H2O

EtOH,

R

Ar

120 - 140 0C

Esquema 8. Preparação de 5-arilideno-tiazolidina-2,4-dionas a partir de 5-arilideno-rodaninas.

Um outro exemplo de anel heterocíclico capaz de originar 3,5-dissubstituídas-

tiazolidina-2,4-dionas é a partir de ciclotiocarbonatos, através da condensação com

isotiocianatos (GULBINS; ROTH; HAMANN, 1961) (Esquema 9, equação – a). Estes

pesquisadores também propuseram a transformação do anel de 1,3,4-oxadiazol-2(H)-

tionas pela reação com ácidos α-cloro (bromo) acéticos, como uma rota para a obtenção

de 3-acilamina-2,4-tiazolidinonas (Esquema 9, equação – b).

a)

b)

R = CH2Ar, CH2OAr

+

N

S

O

Ar

O

HN

R

O

S

XCH2COOH

X = Cl, Br

O

S O

O

N

NN

O

H

R

R

N

S

O

O

R'

RO

R'

Esquema 9. Síntese de 2,4-tiazolidinadionas a partir de heterocíclicos similares.


10

2.2. Preparação de 4-tioxo-tiazolidina-2-ona:

Reações usualmente utilizadas para a tiocarbonilação na posição 4 da

tiazolidina-2,4-diona são realizadas em dioxano seco na presença de P2S5

(GRISHCHUK et al., 1967) ou do reagente de Lawesson (ANDRADE et al., 2002)

(Esquema 10).

P2S5 ou

Reagente deLawesson

N

S O

O HN

S O

S H

P

S

S

P

S

S

CH3O OCH3Reagente de Lawesson:

Esquema 10. Obtenção de 4-tioxo-tiazolidina-2-ona.

2.3. Reações de condensação:

As 2,4-tiazolidinonas podem sofrer reações de condensação do tipo aldólica

envolvendo o grupo metileno na posição 5 do anel, devido ao caráter nucleofílico do

átomo de carbono metilênico. A redução do caráter nucleofílico e a formação do ânion

em presença de uma base são dependentes do efeito retirador de elétrons da carbonila

adjacente, bem como da presença de outros grupos retiradores de elétrons, na posição 2

do anel. É notório que a condensação de Knoevenagel do C-5 metileno ativo de 4-

tiazolidinonas para fornecer os derivados 5-arilidenos, constitui um meio eficiente para

a obtenção de substâncias biologicamente ativas, quando é bem descrito que 5-

arilidenos-4-tiazolidinonas apresentam um amplo espectro de propriedades

farmacológicas (SINGH et al., 1981).


11

Um método bastante utilizado para promover esse tipo de reação é realizado

com o uso de aldeídos aromáticos em presença de ácido acético glacial e acetato de

sódio anidro (SHVAIKA et al., 1983). Bondock; Khalifa e Fadda (2007) utilizaram este

processo condensando 4-tiazolidinonas-2,3-dissubstituídas e obtendo derivados 5-

arilidenos com atividade antimicrobiana (Esquema 11).

Ar

N

N

O

Cl

Cl

N

N

O

Cl

AcOH/ AcONa

N

SN

S

Cl CHO

Ar

Esquema 11. Síntese de derivados tiazolidínicos benzilidênicos biologicamente ativos.

Madhavan et al. (2002) reagiram aldeídos derivados da pirimidinona com

tiazolidina-2,4-dionas, utilizando piperidina e tolueno. O produto condensado foi obtido

com bons rendimentos (variando de 31 a 95%) (Esquema 12).

O

CHO

N

N

R1 R2

OO

S

NO

H

NH

, Tolueno

O

H

N

N

R1 R2O

S

NO

O

Esquema 12. Condensação aldólica da tiazolidina-2,4-diona com aldeídos aromáticos derivados da

pirimidona.

Outra forma de condensação na posição 5 do anel tiazolidínico ocorre pela

utilização de ésteres α-cianocinâmicos substituídos (ésteres de Cope). Estes ésteres

podem ser preparados através de reação de condensação tipo Knoevenagel, entre

aldeídos e cianoacetato de etila (molécula com grupo metileno ativo) em solução

benzênica, na presença de acetato de amônio e ácido acético (COPE et al., 1941)

(Esquema 13).

Benzeno

+

R

CHO H2C

CN

CO2C2H5

CCH3CO2NH4

CH3CO2HCH

CN

CO2C2H5RÉster de Cope

Esquema 13. Síntese de ésteres α-cianocinâmicos por condensação tipo Knoevenagel.


12

5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas foram sintetizadas por Guarda et al. (1997)

através da condensação da 2,4-tiazolidinadiona com ésteres 2-cianocinamatos de

alquila, via adição de Michael, em presença de piperidina e etanol, com rendimentos

variando de 20 a 80% (Esquema 14).

+

N

S O

O H

C

H

O

N

S

O

EtOHCH

CN

CO2C2H5

CH

N

H

R R

Esquema 14. Formação de 5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas através da utilização de ésteres α-

cianocinâmicos.

A condensação de 4-tiazolidinonas leva aos derivados 5-arilidenos que,

teoricamente, podem existir como isômeros geométricos Z e E. A configuração é

denominada Z quando os dois substituintes prioritários (enxofre e fenil) encontram-se

do mesmo lado e denominada E quando em lados opostos. Entretanto foi relatado na

literatura, que as reações entre imidazolidinas e benzaldeídos em meio ácido, o principal

produto é o isômero Z (TAN; ANG; FONG, 1986). Além disso, o estudo de RMN 13C

acoplado, que fornece a constante de acoplamento vicinal do próton etilênico e do grupo

carbonila adjacente, mostraram que em arilidenos tiazolidinas e imidazolidinas a

configuração Z foi formada (TAN; ANG; FONG, 1986; ALBUQUERQUE et al., 1995).

Bruno et al. (2002) determinaram a configuração Z de derivados 5-arilideno-

tiazolidina-2,4-dionas (Esquema 15) através de cristalografia por raios-X e análise de

RMN 1H. O isômero E não foi obtido mesmo em diferentes condições experimentais,

como: condensação utilizando ácido acético na presença de acetato de sódio, tolueno

com piperidina ou temperatura ambiente.

+

N

S O

O H

EtOH

PiperidinaCHO

R

R

C

H

H

O

N

S

O

Configuração Z(única formada)

Esquema 15. Condensação de tiazolidina 2,4-diona produzindo derivados 5-benzilidenos como isômeros

geométricos Z.


13

A configuração Z de derivados 5-arilideno-4-tiazolidinonas também foi

observada através de dados de RMN 1H, pela verificação da influência magnética da

carbonila adjacente sobre o deslocamento químico do hidrogênio etilênico, que aparece

como um singleto entre 7,97 – 7,63 ppm. Devido a menor influência magnética do

átomo de enxofre no isômero E, este singleto aparece com deslocamento químico (δ)

inferior a 7,63 ppm. (OTTANÀ et al., 2005; VICINI et al., 2006).

Entretanto, Dündar et al. (2007) obtiveram mistura de isômeros para apenas dois

compostos (VIc e VIe – esquema 16) de uma série de doze derivados 5-arilidenos-2,4-

tiazolidinadionas. Os isômeros foram separados por coluna cromatográfica de sílica gel

onde seus espectros de RMN 1H foram muito similares, exceto para o sinal do próton 5-

metilideno. Os singletos relativos aos hidrogênios 5-metilideno dos isômeros Z (VIc-1 e

VIe-1), desblindados pela carbonila adjacente, foram detectados a 8,05-8,04 ppm. Em se

tratando dos isômeros E (VIc-2 e VIe-2), os singletos ocorreram em deslocamento

químico menor (7,34-7,33 ppm). A configuração Z do composto VIc-1 foi confirmada

através de cristalografia por raios-X.

S

N

O

O

Cl

Cl

N

SXR

R1

Cl

Cl

N

S

HS

N

O

O

CR'

Cl

Cl

N

S

S

N

O

O

CR'

H

Configuração Z

Configuração E

X = COCH2, CH2

R = H, F, Cl, Br, NO2

R1 = H, Cl

VIc-1 - X = CO, R = Cl, R1 = HVIc-2 - X = CO, R = Cl, R1 = H

VIe-2 - X = CO, R = Cl, R1 = ClVIe-1 - X = CO, R = Cl, R1 = Cl

Esquema 16. Série de derivados 5-benzilideno-tiazolidina-2,4-dionas com mistura de isômeros para dois

compostos.


14

2.4. Atividades biológicas de derivados tiazolidínicos:

A literatura tem relatado várias aplicações dos compostos tiazolidínicos no

desenvolvimento de substâncias para o tratamento de infecções virais (RAWAL et al.,

2007), mal de alzheimer (CHANDRA et al., 2007), tuberculose (KÜÇÜKGÜZEL et al.,

2002), infecções fúngicas (SIDDIQUI et al., 2003), inflamação (OTANNÀ et al., 2005),

hipertensão (PATT et al., 1992), esquizofrenia (JAEN et al., 1990), parasitoses

(TENÓRIO et al., 2005), diabetes (YANAGISAWA et al., 2000), dor (CARTER et al.,

1999), dentre outras (SINGH et al., 1981).

2.5. Derivados tiazolidínicos como agentes antimicrobianos:

As penicilinas são tiazóis acoplados com o anel β-lactâmico, de acordo com esta

analogia, a aplicação de tiazolidinonas como agentes tóxicos a microrganismos

patogênicos tem evocado considerável atenção durante os últimos 20 anos (SIDDIQUI

et al., 2003).

Diversas 2-[(diclorofenil)imina]-4-tiazolidinonas, 2-(arilidrazina)-4-

tiazolidinonas e seus derivados 5-arilidenos correspondentes foram testados contra

Staphylococcus aureus. A atividade antibacteriana dos derivados 5-arilidenos de ambos

2-[(diclorofenil)imina] / 2-(arilidrazina)-4-tiazolidinonas foram melhores que os

compostos de partida (Mandlik et al., 1966). Os dados de uma análise de mais de 50

derivados tiazóis e tiazolidinonas contra bactérias, revelaram que as tiazolidinonas

foram mais ativas que os tiazóis (VERMA; SARAF, 2007).


15

Salama; Labouta e Moustafa (1990) prepararam derivados 5-(arilideno e

arilglioxilideno)-3-fenacil-tiazolidina-2,4-dionas (Esquema 17), os compostos

apresentaram moderada atividade frente a S. aureus e Candida albicans, não exibindo

ação contra Escherichia coli.

CHCO

R3

R2

R3COCHO

ArCHO

CH3CO2H

CH3CO2Na

O

N

S

O

N

S O

O

O

CCH2 R1

O

CCH2 R1

CH O

N

S

O

O

CCH2 R1

R1 = H, CH3, Cl, Br, NO2

R3 = H, Cl

R2 = H, CH3, Cl, Br, C6H5

Esquema 17. Síntese de derivados 5-(arilideno e arilglioxilideno)-3-fenacil-tiazolidina-2,4-dionas.

Várias 5-arilazo-3-benzil-4-tioxo-tiazolidina-2-onas foram preparadas, com

sucesso, através da reação entre 3-benzil-4-tioxo-tiazolidina-2-onas e sais de diazônio,

em presença de dioxano, à temperatura entre 0 a 5°C, com rendimentos variando de 49 a

100% (Esquema 18). Os derivados obtidos foram ativos frente a C. albicans e S. aureus

(LABOUTA et al., 1987).

Esquema 18. Obtenção de 5-arilazo-3-benzil-4-tioxo-tiazolidina-2-onas a partir de 3-benzil-4-tioxo-

tiazolidina-2-onas.

N

S O

S CH2

O

N

SN N

CH2

R

R

N NAc+ -

Dioxano

S


16

Recentemente Vicini et al. (2006) desenvolveram a síntese de dez novas 2-

tiazolilimina-5-arilideno-4-tiazolidinonas (Esquema 19) e avaliaram, juntamente com o

intermediário 2-(tiazol-2-ilimina)-tiazolidina-4-ona, suas propriedades antimicrobianas

contra fungos, levedura, bactérias Gram-negativas e um grande número de bactérias

Gram-positivas, incluindo isolados clínicos de S. aureus e S. epidermidis penicilina-

resistentes. A variação estrutural foi selecionada pela introdução, na posição 5 do anel

tiazolidínico, de diferentes substituintes arilidenos, que foram explorados como grupos

bioativos no núcleo heterocíclico. Estes grupos são úteis por abranger determinadas

propriedades físico-químicas como hidrofobicidade e impedimento estérico (VICINI et

al., 2002; ZANI; VICINI; INCERTI, 2004). Moléculas com grupos volumosos e

afinidade por um receptor biológico, podem ocupar o sítio ativo do receptor e produzir

diferentes respostas biológicas, como por exemplo, a indução de antagonismo

(BARREIRO; FRAGA, 2001). Foram obtidas notáveis inibições do crescimento de um

amplo espectro de bactérias Gram-positivas e Gram-negativa (Haemophilus influenzae),

entretanto E. coli e fungos não foram susceptíveis. Os derivados 5-substituídos

apresentaram uma eficácia antimicrobiana maior que a do composto intermediário, 2-

(tiazol-2-ilimina)-tiazolidina-4-one, sugerindo o importante papel do anel arilideno no

aumento da atividade antimicrobiana desta classe de compostos. É importante ressaltar

o fato de que grupos arilidenos, contendo átomos de cloro, foram mais efetivos contra

todos os microrganismos testados.

Esquema 19. Esquema de síntese de 2-tiazolilimina-5-arilideno-4-tiazolidinonas. Reagentes e condições:

(a) ClCOCH2Cl, DMF, temp. amb., 2h; (b) NH4SCN, EtOH, refluxo, 1 h; (c) RC6H4CHO, CH3CO2H,

CH3CO2Na, refluxo, 2-4 h.

a b

1 2 3

CH2Cl

N

SNH

O

C

ON

SN

HN

S

N

SNH2

cCH

R

ON

SN

HN

S

4b: R = 4-OH4c: R = 4-OCH3

4d: R = 3-OCH3, 4-OH 4e: R = 2-NO2

4f: R = 3-NO24g: R = 4-NO24h: R = 2-Cl4i: R = 3-Cl4j: R = 4-Cl

4a: R = H

4


17

Tunçbilek e Altanlar (1999) sintetizaram uma série de compostos (Esquema 20)

contendo o anel tiazolidínico e um grupo flavonóide, através de condensação de

Knoevenagel de derivados N-alquilados da tiazolidina-2,4-diona, com o 4’-flavona-

carboxaldeído. Foram obtidos compostos com ação moderada para S. aureus e

derivados que mostraram uma atividade comparável ao padrão fluconazol contra C.

albicans. Estes pesquisadores verificaram que substituintes aromáticos contendo Cl e

NO2 promovem uma maior ação antimicrobiana.

R = 4-Cl, 4-NO2, 4-OCH3, 3-OCH3

R

O

O

CCH2N

S

OO

O

Esquema 20. Estruturas de compostos com propriedades antibacterianas e antifúngicas.

Relação estrutura-atividade semelhante foi verificada por Albrecht et al. (2005)

onde a halogenação de um substituinte fenil (em R1) mostrou um aumento da atividade

contra S.aureus, em contraste com a atividade antibiótica diminuída obtida pela

introdução de metil ou metóxi a este grupo. Estes pesquisadores relataram uma nova e

eficiente síntese de novas N-substituídas-2-alquilidenos-tiazolidina-4,5-dionas, baseada

na ciclização “one-pot” de nitrilas com N-substituídos-iso-tiocianatos e etil 2-cloro-2-

oxoacetato (Esquema 21). Alguns dos compostos testados mostraram atividade

antibiótica contra B. subtilis e S. aureus. Nenhuma inibição de crescimento foi

observada para bactérias Gram-negativas e levedura. É importante destacar que o grupo

arila no nitrogênio do anel não foi necessário, visto que derivados alifáticos também

mostraram efeitos antimicrobianos.

+

CN R1

R2N

SN

O On-BuLi

CN R1R2

O

O

Cl

OEtSC

Esquema 21. Síntese de N-substituídas-2-alquilidenos-tiazolidina-4,5-dionas como agentes

antibacterianos


18

Dündar et al. (2007) sintetizaram uma nova série de tiazolil tiazolidina-2,4-diona

(Esquema 22) e constataram que a introdução de grupos benzila ou fenacila, na posição

3 do anel tiazolidínico, não demonstrou função notável para o aumento da atividade

antimicrobiana. Seus novos derivados apresentaram-se ativos contra S. aureus,

incluindo cepas meticilina resistentes, e C. albicans, exibindo para esta, efeito maior

que o padrão miconazol.

X = COCH2, CH2

R = H, F, Cl, Br, NO2

R1 = H, Cl

S

N

O

O

Cl

Cl

N

SXR

R1

Esquema 22. Nova série de tiazolil tiazolidina-2,4-dionas relatadas como agentes antimicrobianos.

Uma estratégia para a obtenção de substâncias bioativas bastante utilizada, é o

acoplamento de moléculas com propriedades já estudadas. Essa hibridação molecular

tem o intuito de potencializar uma determinada ação biológica ou fornecer propriedades

físico-químicas convenientes aos novos derivados. Vários pesquisadores têm

incorporado diversos núcleos às tiazolidinas (BONDE; GAIKWAD, 2004;

KÜÇÜKGÜZEL et al., 2006; TUNÇBILEK; ALTANLAR, 1999; SIDDIQUI et al.,

2003).

Kavitha et al. (2006) conhecendo as atividades farmacológicas das tiazolidinas-

4-onas, obtiveram novos derivados tiazolidínicos como antimicrobianos, a partir de um

grupo derivado da venlafaxina (1-[2-dimetilamino-1-(4-metoxi-fenil)-etil]-cicloexan-1-

ol) (Esquema 23, figura a), uma nova classe de antidepressivos que mostrou profunda

biodisponibilidade. Os novos compostos foram obtidos de duas maneiras (Esquema 23,

figura b), a primeira por um método convencional envolvendo a reação de condesação

“one-pot” de três componentes: 1-[2-amino-1-(4-metoxi-fenil)-etil]-cicloexanol,

diferentes aldeídos aromáticos e heterocíclicos e ácido tioglicólico, usando DCC como

promotor de ciclização. O segundo método foi realizado pela técnica de irradiação de

microondas sem o uso de agente ciclizante, sendo este mais vantajoso por exibir menor

custo, grande redução do tempo reacional, redução de poluentes e rendimentos mais

elevados.


19

Alguns dos análogos da venlafaxina com o anel tiazolidin-4-ona, mostraram potente

atividade inibitória para bactérias e fungos, quando comparados aos padrões utilizados

(estreptomicina, tetraciclina e nistatina).

a)

b)

Venlafaxina

R = Fenil, 4-clorofenila, 2,6-difluorfenila, 4-hidroxifenila, 4-metilfenila, 2-nitrofenila, 3,4-dihidroxifenila,

4-metoxifenila, furfurila, 2-butil-4-cloro-imidazol-5-ila.

NH2

+ R-CHODCC, THF ou

Irr. M.O.

OHMeO

OHMeO

CO2HHS

S

N

O

OHO

N

R

Esquema 23. Tiazolidinna-4-onas análogas da venlafaxina com propriedades antimicrobianas.

Significante atividade antibacteriana foi exibida por uma nova série de 1,3-

tiazolidinas análogas de nucleosídeos (SRIHARSHA et al., 2006). Nesta nova geração

de análogos nucleosídeos a porção ribose foi substituída pelo anel 1,3-tiazolidina. À

posição 2 deste anel heterocíclico, foi acoplada a base pirimidina (Esquema 24). Os

compostos cuja porção pirimidina recebeu halogênios como substituintes, foram

responsáveis pelos melhores resultados, exibindo atividades contra bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas, melhores que os antibióticos padrões utilizados.

OH

R = HR = CH3

R = SHR = BrR = Cl

HN

NO

R

S

NH

O

Esquema 24. Nova série de 1,3-tiazolidinas análogas de nucleosídeos com atividade antibacteriana.


20

Várias pesquisas têm sido realizadas para elucidar os mecanismos pelos quais os

derivados tiazolidínicos exercem suas propriedades antimicrobianas (BABAOGLU et

al., 2003; BROOKE et al., 2003).

Recentemente Sriharsha et al. (2006) demonstraram as 1,3-tiazolidinas como

potenciais inibidores do crescimento bacteriano através de sua ligação à subunidade 50S

ribossomal da bactéria, inibindo assim a formação do complexo 70S, com conseqüente

inibição da síntese protéica bacteriana.

A potencial inibição da enzima MurB por 4-tiazolidinonas 2,3,5-trissubstituídas

(Esquema 25), contendo um grupo ácido acético α-substituído em N-3 foi demonstrada

por Andres et al. (2000). Esta enzima tem papel fundamental na biossíntese do polímero

peptidoglicano, o qual é essencial para a manutenção da integridade osmótica da parede

celular bacteriana, estando presente em microganismos Gram-positivos e Gram-

negativos, mas ausente em células de mamíferos. Os resultados foram obtidos utilizando

dados a partir de testes in vitro, IC50 (concentração em que 50% da atividade enzimática

é reduzida) e recursos de química computacional, como docagem de substratos, tendo

como base os dados de cristalografia de raios-X da enzima MurB.

R1 = n-butila

R2 = H, Me, CONHNHAr

R2

R1

O

ON

S

O

HO

Esquema 25. 4-tiazolidinonas 2,3,5-trissubstituídas relatadas como inibidoras da enzima MurB.

Inibidores da enzima β-Cetoacil-ACP-sintase III (FabH) (Esquema 26) foram

obtidos por Alhamadsheh et al. (2007). A enzima FabH é muito importante no

metabolismo dos ácidos graxos, estando presente em vários microrganismos. Sendo

assim, inibidores da FabH têm potencial como agentes antimicrobianos, antiparasitários

e antimicobacterianos. Estes pesquisadores sintetizaram derivados da tiazolidina-2-ona

com um bom efeito inibitório sobre a enzima β-Cetoacil-ACP-sintase III (FabH).


21

N

SOO

O

R

N

S

O

R

R = Ar-CH2

R = Ar-CH2-CH2

R = CH3 R = CH3-CH2-CH2R = 3-piridil-CH2

R = Ar-O-Ar-CH2

R = C5H9-Ar-O-Ar-CH2

Esquema 26. Derivados tiazolidínicos como inibidores da β-Cetoacil-ACP-sintase III (FabH).

2.6. Derivados tiazolidínicos como agentes antiproliferativos contra células neoplásicas:

Estudos recentes revelaram que apesar da troglitazona (Esquema 27, figura a)

(um derivado da tiazolidina) ser um agente antidiabético oral efetivo, apresenta efeito

apoptótico (morte celular programada) em hepatoma (o mais freqüente câncer originado

no fígado humano). O uso clínico de troglitazona tem sido restringido nos EUA e Japão

por causa da indução severa de lesão hepática (YAMAMOTO et al., 2001). Além da

investigação da atividade antiproliferativa da troglitazona (BURNSTEIN et al., 2003;

PALAKURTHI et al., 2001), um grande número de derivados tiazolidínicos têm tido

suas propriedades anti-câncer investigadas (TSUJIE et al., 2003; CHEN et al., 2004;

HERRERA et al., 2004; ROSTOM, 2006).

Li et al. (2007) sintetizaram e testaram in vitro a atividade antiproliferativa de

análogos tiazolidínicos contra melanoma, a mais agressiva forma de câncer de pele. Os

testes foram conduzidos contra duas linhagens celulares de melanoma humano e contra

células fibroblásticas, estas últimas para determinar a seletividade dos compostos. Os

resultados revelaram que análogos tiazolidínicos possuem atividade contra melanoma

metastático, onde o composto mais ativo revelou maior potência e seletividade que o

sorafenibe (droga padrão utilizada) (Esquema 27, figura b). Uma das importantes

relações estrutura-atividade encontrada, mostrou a relevância do grupo amina no anel

tiazolidínico, pois derivados 3-substituídos ou com nitrogênio insaturado, mostraram-se

inativos.


22

A partir da observação de que a enzima COX-2 é superexpressada em vários

tumores humanos e de que antinflamatórios não-esteroidais diminuem a incidência de

adenocarcinoma em pessoas com polipose adenomatosa familiar, Ottanà et al. (2005)

decidiram investigar a atividade antiproliferativa de 4-tiazolidinonas inibidoras e não

inibidoras da enzima COX-2. As propriedades antiproliferativas foram verificadas em

cinco linhagen celulares de câncer de colo uterino humano. Interessantemente,

moléculas inibidoras da enzima COX-2 mostraram-se totalmente inativas, porém o

composto 5-(3-trifluormetilbenzilideno)-2,4-tiazolidinadiona (Esquema 27, figura c), a

qual não exerce efeito inibitório sobre a COX-2, apresentou o melhor perfil anti-

proliferativo em todas as linhagens celulares.

CH O

N

S

O H

CF3c)S

NH

CH3OCHN

CONHR

R = n-C16H33

b)

a)O

O

HO N

SO

O HTroglitazona

Esquema 27. Derivados tiazolidínicos com efeito antiproliferativo.

Uma nova série de 2-aril-4-oxo-tiazolidina-3-il-amidas e derivados foram

sintetizados e avaliados na sua capacidade de inibir o crescimento de células de câncer

prostático (GUDUDURU et al., 2004). A partir de dados da literatura (ANDRES et al.,

2000) o núcleo 4-tiazolidinona foi utilizado como um substituinte biomimético para o

grupo fosfato de uma série de biomoléculas fosfatídicas (Esquema 28, figura a)

dotadas de atividade contra células de câncer prostático humano. Os efeitos anti-

proliferativos dos compostos sintetizados foram examinados em cinco linhagens

celulares de câncer de próstata humano (DU-145, PC-3, LNCaP, PPC-1 e TSU) e em

células RH7777 (controle negativo). Os resultados revelaram moléculas com forte

atividade citotóxica (Esquema 28, figuras b, c, d) capazes de inibir o crescimento de

todas as linhagens de células cancerosas, com seletividades de 2 a 5 vezes maiores para

as células neoplásicas em comparação com as células utilizadas como controle negativo

(células Rh 7777).


23

O

+NH3

NH

(CH2)nCH3

O

HO O

O-

Pa) S N

O

NH

O

C18H37

b)

S N

O

NH

O

C18H37Oc) S N

O

NH

O

C18H37O

Od)

Esquema 28. Fórmulas estruturais de moléculas dotadas de atividade contra células de câncer prostático

humano.

Durante ensaios biológicos anticancerígenos no Instituto Nacional de Câncer

(Bethesda, Maryland, USA) de uma quimioteca de 4-tiazolidinonas e heterocíclicos

análogos, um grupo de compostos ativos com baixa citotoxicidade foi encontrado.

Destes ensaios foram identificadas potentes 4-tiazolidinonas anti-câncer

(ZIMENKOVSKY; LESYK, 2003; LESYK et al., 2003) (Esquema 29).

O

S

R3S

NR1R2

R1 = R2 = H; R1 = NO2, R2 = ClR3 = Ar, Alquila, Het

S

N

O

O

NH

OR

R = 3-OH, 4-SO2NH2

S

N

O

N OH

Cl

S

N

O

Cl N

+N

O-O

OH

R

R = H, CH3

N

S

S

O

MeO

O

H

H

S

N

O

NH

OH

X = F, ClX

Esquema 29. Estruturas de 4-tiazolidinonas com propriedades anti-câncer.

Através dessa revisão, foi observada a importância da síntese de derivados

tiazolidínicos, devido as suas diversas propriedades biológicas amplamente relatadas

pela literatura.


24

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivos gerais:

Síntese de derivados tiazolidínicos e avaliação das atividades antimicrobiana e

citotóxica.

3.2. Objetivos específicos:

• Síntese de derivados tiazolidínicos a partir de substituições nas posições 4 e 5 do

anel heterocíclico.

• Caracterização estrutural dos compostos sintetizados, utilizando métodos

espectroscópicos convencionais (RMN 1H, RMN 13C e IV).

• Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana pelos métodos de difusão em

disco (determinação do halo de inibição) e concentração mínima inibitória

(CMI), frente a bactérias e levedura da coleção de microrganismos do

Departamento de Antibióticos da UFPE e frente a isolados clínicos de bactérias

Gram-positivas resistentes a múltiplas drogas, obtidas e identificadas no Setor de

Bacteriologia da Unidade Laboratorial do hospital das Clínicas da UFPE (H.C.)

e no Setor de Bacteriologia do Hospital Agamenon Magalhães (H.A.M.), de

diversos sítios de infecção e setores hospitalares.

• Avaliação in vitro da atividade citotóxica frente a células NCI-H292 (obtidas de

carcinoma mucoepidermóide de pulmão) e HEp-2 (derivadas de carcinoma

epidermóide de laringe), cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz.

4. ARTIGO

Synthesis, antimicrobial and cytotoxic activities of some 5-arylidene-4-thioxo-

thiazolidine-2-ones

(Submetido ao periódico European Journal of Medicinal Chemistry)

Carta de submissão:

Assunto: Confirmation of Submission De: "European Journal of Medicinal Chemistry"

<[email protected]> Data: Qui, Fevereiro 7, 2008 8:00 pm Para: [email protected]

Prioridade: Normal

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Dear Julianna,

Your submission, entitled "Synthesis, antimicrobial and cytotoxic

activities of some

5-arylidene-4-thioxo-thiazolidine-2-ones", has been received by the

European Journal of Medicinal Chemistry

You may check on the progress of your manuscript by logging on to

the Elsevier

Editorial System as an author.

http://ees.elsevier.com/ejmech/

Your manuscript will be given a reference number by the Editor and

you will be notified by e-mail.

Thank you for submitting your work to this journal.

Kind regards,

European Journal of Medicinal Chemistry


27

Synthesis, antimicrobial and cytotoxic activities of some 5-arylidene-4-

thioxo-thiazolidine-2-ones

Frederico L. Gouveiaa, Renata M. B. de Oliveiraa, Ivanildo M. da Silvab, Tatiane B. de

Oliveirab, Silene C. do Nascimentob, Kêsia X. F. R. de Sennab and Julianna F. C. de

Albuquerqueb*

a Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife 50670-901, Brazil. b Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife 50670-901, Brazil.

Abstract – Several derivatives of 5-aryldene-4-thioxo-thiazolidine-2-ones (3a-n) were synthesized and

evaluated as antimicrobial agents, including multidrug resistant strains of clinical isolates. The

synthesized compounds had their antiproliferative activities evaluated against two human carcinoma cell

lines. The 5-arylidene derivatives presented significant activities against Gram positive bacteria, including

the multidrug resistant clinical isolates, evidencing the potential to substitute 4-thiocarbonyl and for the 5-

benzylidene substituted in the increase of the antibacterial activity of compounds in this class. None of the

derivatives tested exhibited significant antiproliferative activity against the human carcinoma cell lines.

Keywords: 4-thioxothiazolinones; Benzylidene derivatives; Antimicrobial activity; Cytotoxic activity.

*Corresponding author: Profa. Dra. Julianna Ferreira Cavalcanti de Albuquerque. Phone/Fax: (+55) 81 2126 8347 e-mail address: [email protected] Postal address: Av. Professor Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária, CEP 50670-901, Recife-Pernambuco, Brazil.


28

1. Introduction

Infectious diseases are responsible for great number of deaths in the world’s

population. The reduction of sensibility to antimicrobial agents in current use has been

increasing for a great variety of pathogens and the resistance to multiple drugs is

common for several microorganisms, especially for Gram positive bacteria.

Infection by multidrug resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and

vancomicin-resistant Enterococcus (VRE) presents a difficult problem for medicine.

This is because of the capacity of some strains to survive most antibiotics used today [1-

4].

In addition, the treatment of infectious diseases is more complicated in immuno

suppressed patients, such as those infected with the HIV virus, undergoing anticancer

therapy or transplants. Far from being just a scientific curiosity, the increase of bacterial

infections and the elevated number of strains resistant to various drugs has required the

development of new alternatives therapeutics.

Thiazolidinics derivatives show remarkable antimicrobial activity [5,6], in

addition to various biological properties, such as antiproliferative [7,8], antituberculosis

[9], antihyperglycemic [10], anti-inflammatory [11], among others [12].

Concurring with previous reports in the literature, illustrating various

thiazolidinone derivatives, 5-arylidene-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3a-n) has a number

of structural contributors which enable antimicrobial activity with the arylidene group

in position 5 on the ring [13,14], halogenations of the arylidene group [13,15,16] and

irreplacable N-3. This is why, in many cases, the introduction of groups in this position

has not contributed to increasing the antimicrobial properties [16,17].

In view of the facts mentioned above and as part of our initial efforts to identify

potentially active new agents, thirteen thiazolidinic derivatives (3a-n) were synthesized

and selected for evaluation of antimicrobial activity, including against multidrug

resistant clinical isolates. In addition, the cytotoxic activities of these compounds were

tested also against two human carcinoma cell lines.


29

2. Results and discussion

2.1. Chemistry

Thiazolidine-2,4-dione (1) [18] was dissolved in dioxane anhydrous, added to

Lawesson’s reagent and heated to reflux for formation of 4-thioxo-thiazolidine-2-one

(2) [19]. The product was condensed with different benzaldehydes in acetic acid and

sodium acetate using the Knoevenagel reaction, which yielded 5-arylidene-4-thioxo-

thiazolidine-2-one (3a-n) (scheme 1) [19]. The structures of the compounds were

determined by NMR 1H, NMR 13C and IR.

3b: R = 3-F3c: R = 4-F

3a: R = 2-F3e: R = 3-Br3f: R = 4-Br

3d: R = 2-Br3h: R = 3-Cl3i: R = 4-Cl

3g: R = 2-Cl

3l: R = 2,6-Cl23m: R = 3,4-Cl23n: R = 2,3,5-Cl3

3j: R = 2,4-Cl2

Lawesson'sReagent

dioxanereflux

( 2)

N

S O

S H

acetic acidsodium acetatereflux

R

CHO

( 3a-n )

R

H

O

N

S

S

CH

( 1)

N

S O

O H

Yield (15-70%)

Scheme 1. Synthesis of 5-arylidene-4-thioxo-thiazolidine-2-ones (3a-n).

All the synthesized compounds exhibited the configuration Z for the double

liaison exocyclic linkage, as expected from the literature and verified by the 1H NMR

spectra. The condensation of imidazolidine-2,4-dione, unsubstituted in the 1-position,

with aromatic aldehydes in acid medium, consistently led to the Z isomer [20]. The

coupled 13C NMR spectra also indicated that 5-benzilydenes thiazolidines and

imidazolidines exhibit the configuration Z [19,21,22]. X-ray diffractrometric also

confirmed these results [23]. 1H NMR spectra of the compounds (3a-n) showed only a

sinus 7.91-8.29 ppm, correspondent to the hydrogen metilydene in position 5 of the

thiazolidinic ring due to the deshielding effect of the liaison C=S adjacent. The

literature shows that the proton in E isomers is detected at lower chemical shift values,

due to the lesser deshielding effect of 1-S of the thiazolidinic ring [17,24].


30

3. Phamacology

3.1. Antimicrobial activity

The in vitro antimicrobial activity was performed using the disk diffusion

method and the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) with different strains,

including strains of the multidrug resistant clinical isolates. Ampicillin and Kanamicin

were used as positive control for bacteria and Ketoconazole against yeast.

In a preliminary assay (Table 1) derived from the type 5-arylidene-4-thioxo-

thiazolidine-2-one (3a-n) and the intermediate (2) showed activity against Gram

positive and Candida albicans strains, but not exhibited activity against Gram negative

strains. Thiazolidine-2,4-dione (1) was inactive for all microorganisms tested,

demonstrating that the substitution of the carbonyl in the 4 position by sulfur, increases

the antimicrobial activity for this class of compounds.

Table 1. Inhibitory zone (diameter) mm of compounds against bacterial and yeast strains using the disk diffusion method.

Ampicillin (10 µg/disc), Kanamycin (30 µg/ disc) and Ketoconazole (25 µg/ disc) were used as positive reference; synthesized compounds (300 µg/ disc). --, indicates no sensitivity or mean zone inhibition lower that 7 mm. NT, not tested. Sa, S. aureus; Bs, B. subtilis; Ml, M. luteus; Ef, E. faecalis; Pa, P. aeruginosa; Ec, E. coli; Sm, S.

marcescens; Ms, M. smegmatis; Ca, C. albicans. a Values are mean (n = 3). b Solubility problems were observed at higher doses.

Mean zone inhibitiona

Compound Sa Bs Ml Ef Pa Ec Sm Ms Ca

1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- 2 19 21 26 22 -- -- -- 18 19 3a 24 23 25 20 -- -- -- 20 16 3b 28 20 27 22 -- -- -- 20 16 3c 29 26 29 24 -- -- -- 25 17 3d 25 19 18 19 -- -- -- 21 13 3e 28 26 29 25 -- -- -- 25 14 3f 23 18 21 17 -- -- -- 17 15 3g 25 17 18 16 -- -- -- 20 12 3h 31 25 29 22 -- -- -- 24 13 3i 27 22 25 17 -- -- -- 20 12 3j 23 24 24 18 -- -- -- 19 15 3l 20 20 18 -- -- -- -- 17 15 3m 25 27 27 20 -- -- -- 20 14 3nb 16 -- 21 19 -- -- -- -- -- Ampicillin 38 28 45 24 NT 20 NT NT NT Kanamycin NT NT NT NT 20 15 45 40 NT Ketoconazole NT NT NT NT NT NT NT NT 28


31

The values of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) against the

microorganism susceptible in the preliminary test are reported in Table 2. The results

showed significant inhibitory effects, with the majority of the compounds tested with

MIC values of 2-16 µg/mL. This class of compounds presented high activity against S.

aureus, especially the 5-substituted compounds, where 3h and 3j derivatives were as

active as the standard ampicillin, but less active than cefalexin, the second standard

used. Activity compared to ampicillin was also encountered for 3f, 3j and 3n against

Bacillus subtilis and for 3n derivative against Enterococcus faecalis, with an inhibition

degree superior to cefalexin.

Additionally the derivatives 3f, 3j and 3l exhibited interesting values of MIC

for Mycobacterium smegmatis. Despite the fact that the compound 2 has an antifungal

activity lower than Ketoconazole (reference drug), interesting enough, it showed higher

activity than all the 5-arylidene derivatives, in this case the results were different from

those verified for bacteria, therefore the 5-substitution did not promote antifungical

activity, as in the case of bacteria.

The compounds 2 and 3a-n were also evaluated for antibacterial activity

against a large number of clinical isolates of multidrug resistant Gram positive bacteria.

The values of the MIC are given in table 3 compared with ampicillin and cefalexin,

used as standards.

All compounds showed significant inhibitory effects, especially 5-arylidene

derivatives, confirming the importance of this substitution in increasing activity to

inhibit growth of Gram positive bacteria.

The compounds 3a-n were more potent than cefalexin against most the

microorganisms tested. The very relevant results were verified for strains S. aureus III

(H.C. 21036) and VI (H.C. 20905), whose inhibitory effect was much greater than that

of ampicillin and cefalexin. It is interesting to note that the derivative 3n showed a

greater inhibitory capacity. This suggests that the introduction of three atoms of the

halogens to the arylidene group may have exercised an important role for the increase in

antibacterial properties.


32

Table 2. Inhibitory activity of compounds 2 and 3a-n expressed as MIC (µg/mL).

NT, not tested.

Table 3. Minimum inhibitory concentration (MIC) in µg/mL of synthesized compounds against clinical isolate of multidrug resistant Gram positive bacterial strains.

Staphylococcus aureus: H.C. 20981 (I), H.C. 21141 (II), H.C. 21036 (III), H.C. 20489 (IV), H.C. 20794 (V) and H.C. 20905 (VI). Enterococcus faecalis: H.C. 21752 (VII), H.C. 21944 (VIII), H.C. 24708 (IX) and H.C. 24962 (X). Coagulase-negative Staphylococcus: H.A.M. 278 (XI) and H.A.M. 338 (XII).

Microorganism Compound

S.aureus B.subtilis M.luteus E.faecalis M.smegmatis C.albicans

2 8 4 4 64 32 8 3a 8 32 32 32 32 32 3b 4 16 16 32 32 64 3c 4 16 16 32 16 32 3d 4 8 16 32 32 32 3e 4 8 8 16 16 64 3f 4 2 8 16 4 32 3g 4 16 16 16 16 32 3h 2 8 8 8 16 32 3i 4 16 32 32 32 64 3j 2 2 8 16 4 32 3l 4 8 16 16 4 32 3m 4 4 4 8 32 32 3n 4 2 4 2 32 64 Ampicillin 2 2 2 2 64 NT Cefalexin ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1 64 > 128 NT Ketoconazole NT NT NT NT NT ≤ 1

Compound Staphylococcus

aureus

Enterococcus

faecalis

Coagulase-negative S.

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII

2 32 32 32 64 32 32 32 32 32 32 64 64 3a 4 8 2 4 8 8 32 32 32 32 32 16 3b 2 16 2 2 2 2 16 8 8 8 16 16 3c 4 32 2 2 2 2 32 32 16 16 32 32 3d 4 16 4 4 4 4 8 16 16 16 2 16 3e 16 32 16 8 8 16 8 16 8 16 64 64 3f 4 4 4 4 2 4 8 8 8 8 4 4 3g 4 8 2 2 2 2 16 32 16 32 32 8 3h 2 8 2 2 2 2 4 4 4 4 16 2 3i 2 8 2 2 2 2 16 16 16 16 4 4 3j 2 4 8 2 2 2 4 4 8 8 4 2 3l 8 8 8 4 4 4 8 8 16 16 4 4 3m 2 2 4 2 2 4 8 4 16 16 4 2 3n 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 2 2 Ampicillin 2 ≤ 1 32 ≤1 2 64 2 ≤ 1 2 2 ≤ 1 ≤ 1 Cefalexin 8 2 >128 2 4 >128 64 64 64 64 128 128


33

3.2. Cytotoxic activity

The in vitro cytotoxic activity was performed by the method the MTT

[25,26] against two human carcinoma cell lines: NCI-H292 (obtained from

mucoepidermoid carcinoma of lung) and HEp-2 (derived from epidermoid carcinoma of

the larynx). The inhibitory effects of 3a-n derivatives on the growth of the two cell lines

are shown in Table 4.

All compounds showed less cytotoxicity compared to vincristine, the

standard drug used (IC50 values equal to 0.04 and 0.003 µg/mL for cell NCI-H292 and

HEp-2 respectively). Moreover, they were not able to inhibit 50% of cell proliferation

even at the highest dose used (10µg). The antiproliferative effect was at the most

45.03% for NCI-H292 cells and at the most 30.10% for HEp-2 cells. The cell line NCI-

H292 was more sensitive to synthesized compounds.

Given the cytotoxic effect observed and faced with the problem of

discovering new agents with antiproliferative activity, it is necessary to optimize

molecules in order to enhance the cytotoxic properties of this class of compounds.

Tabela 4. Growth inhibitory effects (%) of 3a-n on human carcinoma cell lines.

10 µg/mL 5 µg/mL 2,5 µg/mL 1,25 µg/mL Compound

NCI-H292 HEp-2 NCI-H292 HEp-2 NCI-H292 HEp-2 NCI-H292 HEp-2

3a 40.41 11.21 25.18 8.86 7.78 1.66 4.29 -8.34 3b 26.78 20.93 13.14 19.83 3.43 7.03 2.10 0.84 3c 38.00 30.10 31.55 20.56 17.49 -4.51 7.32 -10.82 3d 36.87 21.23 22.94 16.23 16.19 10.33 13.27 3.14 3e 42.36 23.63 22.03 -1.04 11.14 -1.82 4.67 -5.3 3f 36.45 18.23 16.61 15.43 1.19 -0.36 1.10 -3.16 3g 45.03 21.15 34.19 5.97 19.88 -11.53 10.60 -11.34 3h 30.87 18.83 21.61 17.63 11.19 5.44 3.35 -0.36 3i 41.39 22.25 35.83 16.07 28.55 3.91 10.01 0.92 3j 38.37 24.83 29.28 20.03 14.69 15.33 12.11 6.83 3l 32.80 8.73 10.34 -2.39 7.70 -4.24 4.36 -9.16 3m 43.28 16.41 35.83 11.02 19.36 5.03 9.18 -5.45 3n 40.50 23.54 39.68 22.84 33.01 21.75 14.21 12.58


34

4. Conclusion

Due to its antibacterial properties, especially against multidrug resistant

strains of clinical isolates, the derivatives 5-arylidene-4-thioxo-thiazolidine-2-one are

potential candidates which could be used in the treatment of infections caused by Gram

positive bacteria resistant to the various drugs currently in use. Further studies involving

the activity mechanisms are necessary for the complete understanding of their

antimicrobial activity. Structural modifications have been realized in our laboratory for

the purpose of increasing the antimicrobial and antiproliferative properties of this class

of compounds.

5. Experimental

5.1. Chemistry

All melting points were determined using QUIMIS (model 320.23) and are

uncorrected. IR spectra were recorded for KBr pellet on a BRUKER IFS-66 IR

spectrophotometer. NMR 1H and NMR 13C spectra were measured on VARIAN

UNITY PLUS (300 MHz for 1H and 75.4 MHz for 13C). The chemical shifts are reported

in δ units and coupling constants (J) are reported in hertz. Thin layer chromatography

was performed on silica plates pre-coated with Merck Kiesegel 60 F254 and column

chromatography with silica gel (mesh 70-230).

5.2. General procedure for the preparation of 4-thioxo-thiazolidine-2-one (2).

A mixture of thiazolidine-2,4-dione (1) (0.1 mol) and Lawesson’s reagent

(0.03 mol) in anhydrous dioxane, was heated under reflux for 24h. Part of the solvent

was evaporated and, after cooling, the precipitate was filtered, washed with hexane and

recrystallized in ethanol. Yield 68%, mp: 140-141ºC. IR (KBr, cm-1): 3115 (NH); 1710

(C=O). 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 13.54 (s, 1H, NH); 4.60 (s, 2H).


35

5.3. General procedure for the preparation of 5-arylidene-4-thioxo-thiazolidine-2-

ones (3a-n).

To a solution of compound 2 (0.01 mol) and anhydrous sodium acetate (0.01

mol) in glacial acetic acid, was added the appropriate benzaldehyde. The mixture was

stirred under reflux for 4-10 h and then poured into ice-cold water. Then, the precipitate

was filtered, washed with water and hexane, dried and purified by column

chromatography.

5.3.1. 5-(2-fluorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3a). Yield 30%, mp:

159-160ºC. IR (KBr, cm-1): 3163-3080 (NH); 1690 (C=O); 1592 (C=C). 1H NMR

(DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 13.97 (s, 1H, NH); 8.14 (s, 1H, -CH=); 7.62-7.54 (m,

2H, Ar); 7.41-7.35 (m, 2H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm, DEPT): δ

116.35 (d, JCF= 21.3), 125.53 (d, JCF= 3.0), 126.39 (d, JCF= 6.97), 128.61, 133.23 (d,

JCF= 9.0) (CH); 121.50 (d, JCF= 11.0), 131.88, 161.09 (d, JCF= 251.4) (Cq); 170.43

(CO); 195.41 (CS).

5.3.2. 5-(3-fluorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3b). Yield 20%, mp:

103-104ºC. IR (KBr, cm-1): 3080 (NH); 1700 (C=O); 1586 (C=C). 1H NMR (Acetone-

d6, 300 MHz, ppm): δ 10.53 (s, 1H, NH); 8.12 (s, 1H, -CH=); 7.66-7.16 (m, 4H, Ar).

5.3.3. 5-(4-fluorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3c). Yield 18%, mp: 126-

127ºC. IR (KBr, cm-1): 3068 (NH); 1727 (C=O); 1573 (C=C). 1H NMR (DMSO-d6, 300

MHz, ppm): δ 13.89 (s, 1H, NH); 8.06 (s, 1H, -CH=); 7.76-7.71 (m, 2H, Ar); 7.41-7.35

(m, 2H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm, DEPT): δ 116.70 (d, JCF= 22.05),

133.06 (d, JCF= 9.0), 134.73 (CH); 129.58 (d, JCF= 2.55), 130.12 (d, JCF= 3.0), 163.10

(d, JCF= 250.87) (Cq); 170.54 (CO); 195.43 (CS).

5.3.4. 5-(2-bromobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3d). Yield 39%, mp:


(DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 14.06 (s, 1H, NH); 8.25 (s, 1H, -CH=); 7.80 (d, 1H, Ar);

7.62-7.52 (m, 2H, Ar); 7.45-7.39 (m, 1H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm): δ

126.00, 128.69, 129.10, 132.38, 132.80, 133.73, 133.64, 133.73; 170.54 (CO); 195.25

(CS).


36

5.3.5. 5-(3-bromobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3e). Yield 40%, mp:


(DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 13.96 (s, 1H, NH); 8.02 (s, 1H, -CH=); 7.87 (s, 1H, Ar);

7.71-7.63 (m, 2H, Ar); 7.49 (t, 1H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm, DEPT):

δ 122.59, 128.53, 131.45, 133.09, 133.29 (CH); 131.32, 133.86, 135.82 (Cq); 170.37

(CO); 195.35 (CS).

5.3.6. 5-(4-bromobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3f). Yield 22%, mp:


(Acetone-d6, 300 MHz, ppm): δ 8.09 (s, 1H, -CH=); 7.78-7.73 (m, 2H, Ar); 7.68-7.63

(m, 2H, Ar). 13C NMR (Acetone-d6, 75.4 MHz, ppm): δ 126.15, 130.28, 132.09, 133.09,

133.62, 134.08, 134.59, 135.95; 170.83 (CO); 196.75 (CS).

5.3.7. 5-(2-chlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3g). Yield 40%, mp:


(DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 14.05 (s, 1H, NH); 8.29 (s, 1H, -CH=); 7.65-7.61 (m,

2H, Ar); 7.54-7.49 (m, 2H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm): δ 128.19,

128.93, 130.47, 130.82, 131.59, 132.21, 132.74, 135.13; 170.48 (CO); 195.31 (CS).

5.3.8. 5-(3-chlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3h). Yield 17%, mp:

112-113ºC. IR (KBr, cm-1): 3081 (NH); 1686 (C=O); 1589 (C=C). 1H NMR (Acetone-

d6, 300 MHz, ppm): δ 12.26 (s, 1H, NH); 8.08 (s, 1H, -CH=); 7.70 (s, 1H, Ar); 7.66-

7.52 (m, 3H, Ar). 13C NMR (Acetone-d6, 75.4 MHz, ppm): δ 129.77, 131.67, 131.88,

132.53, 132.79, 135.49, 136.29, 137.45; 189.88 (CO); 196.56 (CS).

5.3.9. 5-(4-chlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3i). Yield 15%, mp: 183-

184ºC. IR (KBr, cm-1): 3161-3080 (NH); 1691 (C=O); 1577 (C=C). 1H NMR (DMSO-

d6, 300 MHz, ppm): δ 13.93 (s, 1H, NH); 8.04 (s, 1H, -CH=); 7.69-7.66 (m, 2H, Ar);

7.61-7.58 (m, 2H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm, DEPT): δ 129.54,

132.07, 134.33 (CH); 130.43, 132.28, 135.50 (Cq); 170.43 (CO); 195.39 (CS).


37

5.3.10. 5-(2,4-dichlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3j). Yield 54%, mp:

162-163ºC. IR (KBr, cm-1): 3041 (NH); 1733 (C=O); 1573 (C=C). 1H NMR (DMSO-d6,

300 MHz, ppm): δ 8.22 (s, 1H, -CH=); 7.85 (d, 1H, Ar); 7.66 (m, 2H, Ar). 13C NMR

(Acetone-d6, 75.4 MHz, ppm): δ 129.73, 131.40, 131.67, 132.68, 133.46, 134.74,

137.84, 138.08; 170.87 (CO); 196.61 (CS).

5.3.11. 5-(2,6-dichlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3l). Yield 41%, mp:


(DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 7.91 (s, 1H, -CH=); 7.60-7.57 (m, 2H, Ar); 7.51-7.45 (m,

1H, Ar). 13C NMR (DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm): δ 128.58, 130.15, 131.93, 132.19,

133.04, 138.02, 168.50; 170.43 (CO); 195.39 (CS).

5.3.12. 5-(3,4-dichlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3m). Yield 55%,

mp: 183-184ºC. IR (KBr, cm-1): 3161-3080 (NH); 1685 (C=O); 1583 (C=C). 1H NMR

(DMSO-d6, 300 MHz, ppm): δ 13.99 (s, 1H, NH); 8.00 (s, 1H, -CH=); 7.94 (d, 1H, Jm=

2.1, Ar); 7.78 (d, 1H, Jo= 8.4, Ar); 7.60 (dd, 1H, Jo= 8.3, Jm= 2.1, Ar). 13C NMR

(DMSO-d6, 75.4 MHz, ppm, DEPT): δ 129.27, 131.51, 132.50, 132.77 (CH); 131.73,

132.20, 133.14, 134.11 (Cq); 168.49 (CO); 170.22 (CS).

5.3.13. 5-(2,4,5-trichlorobenzylidene)-4-thioxo-thiazolidine-2-one (3n). Yield 70%,

mp: 186-187ºC. IR (KBr, cm-1): 3103-3057 (NH); 1753 (C=O); 1600 (C=C). 1H NMR

(Acetone-d6, 300 MHz, ppm): δ 8.24 (s, 1H, -CH=); 7.82 (d, 1H, Jm= 2.4, Ar); 7.62 (d,

1H, Jm= 2.4, Ar).

5.4. In vitro assay for antimicrobial activity

The microorganisms used in this study are Staphylococcus aureus (UFPEDA

01), Bacillus subtilis (UFPEDA 16), Micrococcus luteus (UFPEDA 06), Enterococcus

faecalis (UFPEDA 138), Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA 39), Escherichia coli

(UFPEDA 224), Serratia marcescens (UFPEDA 398), Mycobacterium smegmatis

(UFPEDA 71) and Candida albicans (UFPEDA 1007) obtained from the cultures

collection of the Antibiotics Department of the Federal University of Pernambuco,

Brazil.


38

Strains of multidrug resistant clinical isolates were also used and consisted

of Staphylococcus aureus (20981, 21141, 21036, 20489, 20794 and 20905),

Enterococcus faecalis (21752, 21944, 24708 and 24962) obtained from Bacteriology

Department of University Hospital of the Federal University of Pernambuco and

Coagulase-negative Staphylococcus (278 and 338), obtained from Bacteriology

Department of the Agamenon Magalhães Hospital, Pernambuco, Brazil. The clinical

isolated were collected from various patients hospitalized in several clinics.

The antimicrobial activity was reported preliminarily using the disk diffusion

method [27]. In this method, paper disks (6mm) containing specific amounts of an

antimicrobial agent (300µg for the synthesized compounds) were placed on the surface

of an agar plate inoculated with a standardized suspension of the microorganisms

tested. The plates were incubated at 35ºC for 24 and 48 hours, respectively for bacteria

and yeast. Ketoconazole (25µg) for yeast, ampicillin (10µg) for Gram positive bacteria

and kanamicina (30µg) for Gram negative bacteria, were used as standard drugs. Paper

disks with only DMSO were utilized as negative controls.

The twofold serial dilution technique [28,29] was followed to determine the

minimum inhibitory concentration (MIC) of the compounds against the susceptible

microorganisms in the preliminary test (yeast and Gram positive bacteria) and against

strains of clinical isolates of multidrug resistant Gram positive bacteria. The test

compound was dissolved in DMSO and then diluted culture medium (Müller-Hinton

agar for bacteria and Sabouraud Liquid Medium for yeast), at to the required final

concentration with variation of 128 a 1µg/mL. A plate (tube for C. Albicans) containing

only the culture medium and DMSO, in the same dilution of our experiments, was used

as negative control.

The final amount applied was of 104 CFU/plate for bacteria and 103 CFU/tube

for yeast. The MIC values were read after incubation at 35ºC for a period of 20h

(bacteria) and 48h (yeast). The lowest concentration of the test substance that

completely inhibited the growth of the microorganism was recorded as the MIC,

expressed in µg/mL. Ampicillin, cefalexin (bacteria) and ketoconazole (yeast) were

used as standard drugs. All experiments were carried out three times.


39

5.5. In vitro assay for cytotoxicity activity

Human lung carcinoma cell line (NCI-H292) and human larynx carcinoma

cell line (HEp-2) were purchased from the Adolfo Lutz Institute, São Paulo, Brazil. A

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), enriched with 10% of fetal bovine

serum, 1% of L-glutamine and 1% of antibiotics (penicillin and streptomycin) was used

for cell cultivation and to perform the tests.

The cytotoxic activity was investigated using the MTT method (3-(4,5-dimethyltiazole-

2-yl)-2,5-diphenyltetrazolm bromide) [25,26]. Cell suspensions were diluted to 105

cells/mL, prepared in suitable way and distributed in plates of culture with 96 wells

(225 µL in each well), then incubated for 24h at 37ºC, in a humid atmosphere with 5%

of CO2. After 24h, 25µL of the synthesized compounds and the reference product

(vincristine) were added (10.0, 5.0, 2.5, and 1.25 µg/mL). The plates were incubated

again at 37ºC. At the end of this period, the culture medium with the MTT excess was

aspirated and after that, 100µL of DMSO was added to each well to dissolve the

formazan crystals. The optical density (OD) of the wells was measured at 540nm and

compared to the control (cells with medium only).

Acknowledgments

The authors acknowledge the Research Foundation of Pernambuco State

(FACEPE), the Brazilian National Research Council (CNPq) for the financial support

and Department of Fundamental Chemistry of UFPE for the spectra realized. F. L. G.

was supported by FACEPE/CNPq fellowship

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Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard M27-A2, Clinical

and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA, 2002.

CONCLUSÕES

&

PESPECTIVAS


44

5. CONCLUSÕES

• Uma série de treze derivados (Z) 5-arilideno-4-tioxo-tiazolidina-2-ona foi

sintetizada através de reações de tiocarbonilação e condensação, nas posições 4 e

5 do anel, respectivamente. Todas as reações de condensação foram

diastereoseletivas e apresentaram rendimentos satisfatórios.

• As estruturas dos compostos obtidos foram caracterizados através de métodos

espectroscópicos convencionais (RMN 1H, RMN 13C e IV).

• Os derivados do tipo 5-arilideno apresentaram significativa atividade contra

bactérias Gram-positivas, incluindo contra os isolados clínicos resistentes a

múltiplas drogas, destacando-se a importância da 4-tiocarbonila e do substituinte

5-benzilideno para o aumento da atividade antibacteriana dessa classe de

compostos. Adicionalmente o composto 3n (o qual apresenta três átomos de

cloro no grupo arilideno) mostrou elevada capacidade inibitória, indicando que a

introdução de três átomos de halogênio ao grupo benzilideno pode ter exercido

uma importante função para o aumento das propriedades antibacterianas. Os

compostos 5-substituídos apresentaram atividade contra C. albicans inferior a do

intermediário 4-tioxo-tiazolidina-2-ona, sugerindo que a 5-substituição não

favorece a atividade antifúngica.

• Nenhum dos derivados exibiu atividade citotóxica significativa contra as

linhagens celulares de carcinoma humano testadas, entretanto, apresentaram um

efeito antiproliferativo de até 45.03% para células NCI-H292 e de até 30.10%

para células HEp-2, nas concentrações de 10µg/mL.


45

6. PESPECTIVAS

• Avaliar a toxicidade aguda in vivo para os derivados 5-arilideno-4-tioxo-

tiazolidina-2-ona e comparar o perfil de toxicidade com antibióticos utilizados

atualmente.

• Modificações moleculares, como novas substituições com diferentes reagentes

nas posições 2, 3 e 5, e avaliação da influência gerada sobre as atividades

antimicrobiana e antiproliferativa.

• Realizar outros ensaios biológicos como antituberculose, antiinflamatório,

antihiperglicemiante etc, pois como já visto, a literatura relata diversas

atividades para essa classe de compostos.

• Estudos envolvendo mecanismos de ação são necessários para o completo

entendimento das atividades antimicrobianas desses compostos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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ANEXOS


61

8. ANEXOS

8.1. Materiais e equipamentos utilizados:

8.1.1. Materiais:

• Acetato de sódio – Merck

• Ácido monocloroacético – Merck

• Aldeídos aromáticos substituídos – Sigma-Aldrish ou Acros

• Placas cromatográficas – Merck Kieselgel 60 F254

• Reativo de Lawesson – Sigma-Aldrish

• Sílica gel – Merck (mesh 70-230)

• Solventes de grau analítico – Cinética, Dinâmica, Merck ou Vetec

• Tiouréia – Merck

8.1.2. Equipamentos:

• Autoclave – Fanem

• Balança analítica – E. Mettler

• Balança semi-analítica – Kern P 115

• Espectrofotômetro de infravermelho – Bruker IFS-66 IR

• Espectrofotômetro de ressonância magnética nuclear – VARIAN UNITY PLUS

(300 MHz para prótons e 75,4 MHz para carbono 13)

• Estufas modelos diversos – Fanem

• Fusiômetro – Quimis 320.23

• Lâmpada ultravioleta (254 ou 320 mm)

• Leitor automático de placas - Multiskan

• Placas de aquecimento com agitador magnético – Fanem e Farning

• Rotavaporador – Fisaton 802


62

8.2. Metodologias:

8.2.1. Preparação da Tiazolidina-2,4-diona:

A tiazolidina-2,4-diona foi obtida de acordo com o método proposto por Liberman et al.

(1948), por apresentar bons rendimentos. Quantidades equimolares de tiouréia (0.1 mol)

e ácido monocloroacético (0.1 mol) foram misturadas em meio aquoso, sob refluxo

(100oC), promovendo a ciclização da molécula.

8.2.2. Avaliação da atividade antimicrobiana:

A atividade antimicrobiana foi determinada in vitro pelos métodos de difusão em disco

(determinação do halo de inibição) e concentração mínima inibitória (CMI).

Meios de cultura:

• Mueller-Hinton agar (MH): para realização dos testes com bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas.

• Sabouraud dextrose ágar e meio líquido de sabouraud: para levedura.

• Glicose extrato de levedura ágar (GL): para bacilos álcool-ácido resistentes e

bactérias Gram-positivas exigentes (Enterococcus faecalis).

Microrganismos teste:

Para o teste de difusão em disco foram utilizados microrganismos obtidos da Coleção

do Departamento de Antibióticos da UFPE.

Bactérias Gram-positivas:

Staphylococcus aureus DAUFPE 01

Bacillus subtilis DAUFPE 16

Micrococcus luteus DAUFPE 06

Enterococcus faecalis DAUFPE 138


63

Bactérias Gram-negativas:

Pseudomonas aeruginosa DAUFPE 39

Escherichia coli DAUFPE 224

Serratia marcescens DAUFPE 398

Bactéria álcool-ácido resistente:

Mycobacterium smegmatis DAUFPE 71

Levedura:

Candida albicans DAUFPE 1007

Para a avaliação da CMI foram selecionados os microrganismos da coleção do

Departamento de Antibióticos da UFPE que se mostraram susceptíveis nos testes de

difusão em disco, sendo portanto excluídas do teste as bactérias Gram-negativas.

Também foram selecionados para essa determinação, isolados clínicos de bactérias

Gram-positivas resistentes a múltiplas drogas. Estes microrganismos foram cedidos pelo

setor de bacteriologia da unidade laboratorial do Hospital das Clínicas da UFPE e pelo

setor de bacteriologia do Hospital Agamenon Magalhães, obtidos de diversos sítios de

infecção e setores hospitalares. Foram testadas 6 cepas de Staphylococcus aureus, 4 de

Enterococcus faecalis e 2 de Staphylococcus coagulase-negativa (Tabela 5). Foram

utilizadas cepas de isolados clínicos submetidas a testes de antibiograma (SILVA, 2007)

(Tabela 6), a fim de comparar o padrão de resistência com os resultados das avaliações

de antagonismo realizados com as substâncias utilizadas. A classificação de sensível (S),

resistente (R), ou intermediário (I), foi baseada na tabela do CLSI (Clinical Laboratory

Standards Institute) (2004) de acordo com o diâmetro do halo de inibição.


64

Tabela 5. Relação dos isolados clínicos utilizados nos testes de concentração mínima inibitória.

Microrganismo Hospital Registro Origem

(I) S. aureus (MRSA)

(II) S. aureus (MRSA)

(III) S. aureus (MRSA)

(IV) S. aureus (MRSA)

(V) S. aureus (MRSA)

(VI) S. aureus (MRSA)

(VII) E. faecalis

(VIII) E. faecalis

(IX) E. faecalis

(X) E. faecalis

(XI) S. coagulase negativa (MRS)

(XII) S. coagulase negativa (MRS)

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.C.

H.A.M.

H.A.M.

20981

21141

21036

20489

20794

20905

21752

21944

24708

24962

278

338

Secreção de ferida

Cultura de granuloma

Secreção nasal

Hemocultura

Hemocultura

Hemocultura

Secreção traqueal

Sangue

Secreção

Fragmento de tecido

Hemocultura

Trombo arterial

H.C, Hospital das Clínicas; H.A.M, Hospital Agamenon Magalhães.


65

Tabela 6. Antibiograma dos isolados clínicos utilizados nos testes de concentração mínima inibitória.

Antibiótico I II III IV V VI

VII VIII IX X

XI XII

Amicacina S R S S S R NT NT NT NT NT S

Ampicilina R R R R R R S S S S NT NT

Amp+Sulbactam NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT R S

Azitromicina NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT R S

Cefalotina R R R S S R S R NT R R S

Cefaloxitina R R R S S R NT NT NT NT NT NT

Cefepine R R R S S R NT NT NT NT NT NT

Cefotaxima R R R S S R S R NT R R S

Cefoxitina NT NT NT NT NT NT S R NT R R S

Ciprofloxacina S R S S S R S NT S I R S

Clindamicina NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT R S

Eritromicina R R R S S R S R R R NT S

Gentamicina S R S R R R R R R R R S

Imipenem S R S NT NT NT S S NT S R S

Meropenem S R S NT NT NT S NT NT S NT NT

Moxifloxacino NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT S NT

Nitrofurantoína NT NT NT S S R S S S S NT NT

Norfloxacim S R S NT NT NT NT NT NT NT R S

Oxacilina R R R S S R R NT NT NT R S

Penicilina R R R R R R NT NT NT NT R S

Penicilina G NT NT NT NT NT NT R S S S NT NT

Sulfa+trimet S R S NT NT NT NT R R R NT NT

Teicoplanina NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT S NT

Tetraciclina S R S S S I S NT R R S NT

Tobramicina S R S NT NT NT R R NT R NT NT

Vancomicina S S S S S S S S S S S S

NT, Não testado; R, Resistente; S, Sensível; I, Intermediário. Sa, S. aureus; Ef, E. faecalis; Scn, S. coagulase negativa.

Sa Ef Scn


66

Preparação dos inóculos:

Os inóculos foram obtidos a partir de culturas recentes dos microrganismos-

teste, com 18-24 horas de incubação à 35ºC em ágar nutritivo (AN) para bactérias e

Sabouraud em 24-48 horas, para Candida albicans.

As suspensões dos inóculos de bactérias foram padronizadas a uma densidade

óptica entre 0.08 e 0.1 de absorbância a 625 nm, equivalentes a uma solução padrão

McFarland de 0,5, em solução salina estéril. Essa suspensão foi diluída 1:10 em solução

salina, para obter uma concentração de 107 UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia)

para bactérias (CLSI, 2003; CLSI, 2003). Para a levedura a suspensão foi padronizada

para obter a transmitância equivalente de uma solução padrão McFarland de 0.5, em

comprimento de onda de 530 nm, resultando em uma concentração aproximada de 106

UFC/mL, obedecendo aos métodos descritos pela CLSI (2002).

Teste de difusão em disco:

Os testes foram realizados pelo método de difusão em disco de papel em meio

gelosado (CLSI, 2003). As suspensões dos microrganismos-testes foram semeadas em

placas de Petri contendo 10 mL do meio de cultura apropriado para o microrganismo,

usando um swab de algodão estéril. Discos de papel (Whatman nº 2) de 6 mm foram

impregnados com 20 µL de uma solução a 15000 µg/mL das substâncias em estudo,

dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) e colocados sobre a superfície do meio

semeado com os microrganismos-teste.

As placas foram incubadas a 35ºC durante 24 horas para bactérias e 48 horas

para levedura. Como padrões foram utilizados Cetoconazol (25µg) para levedura,

Ampicilina (10µg) para bactérias Gram-positivas e Canamicina (30µg) para bactérias

Gram-negativas.

Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em mm pela

média aritmética dos diâmetros dos halos de inibição, formados ao redor dos discos nas

3 repetições. O controle negativo foi realizado com discos embebidos em DMSO.


67

Avaliação da concentração mínima inibitória:

A concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada utilizando a técnica da

diluição seriada (CLSI, 2003).

Preparação da solução-mãe:

Os testes foram realizados com uma solução em concentração de 1280 µg/ml das

substâncias em estudo, utilizando-se DMSO como solvente.

Preparação das diluições em ágar:

Foram acrescentadas diluições apropriadas das soluções-mãe das substâncias em

estudo, a ágars derretidos, usando um esquema onde uma parte da solução é

acrescentada a nove partes de ágar fundido, conforme indicado na tabela 7 (CLSI,

2005). Sendo assim, a partir de uma solução-mãe da substância em concentração igual a

1280 µg/ml, foram realizadas diluições sucessivas a fim de se obter uma série de placas

(tubo para C. albicans) com concentrações de 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 e 1 µg/ml. Em

cada série de placas foi utilizado um controle (placa contendo apenas o meio de cultura

e DMSO na mesma diluição usada nos experimentos) para comparação do crescimento

microbiano e para confirmação da inibição do mesmo pela ação da substância.


68

Tabela 7. Esquema de preparação de diluição das substâncias a serem usadas em testes de sensibilidade por diluição em ágar.

Passo Concent. (µg/mL)

Fonte Vol. (mL)

Diluente Concentração Intermediária

(µg/mL)

Concent. final em diluição 1:10 em

ágar (µg/mL)

Log2

1280 Estoque - - 1280 128 9

1 1280 Estoque 2 2 640 64 8

2 1280 Estoque 1 3 320 32 7

3 1280 Estoque 1 7 160 16 6

4 160 Passo 3 2 2 80 8 5

5 160 Passo 3 1 3 40 4 4

6 160 Passo 3 1 7 20 2 3

7 20 Passo 6 2 2 10 1 2

Determinação da concentração mínima inibitória:

Foi aplicado 1 µL das suspensões padronizadas dos microrganismos-teste nas

placas e tubos previamente preparados, obtendo-se uma concentração aproximada de

104 UFC/placa para bactérias e 103 UFC/tubo para levedura. Em seguida as placas

foram incubadas a 35ºC por um período de 20 horas (bactérias) e os tubos por 48 horas

(levedura). Os testes foram realizados em triplicata e o resultado foi registrado como a

menor concentração da substância-teste, expressa em µg/mL, em presença da qual não

ocorre crescimento microbiano visível a olho nu. Como padrões foram utilizados

cefalexina, ampicilina (bactérias) e cetoconazol (levedura).

Solução da substância teste


69

8.2.3. Avaliação da atividade citotóxica:

Linhagens celulares:

Foram utilizadas células NCI-H292 (obtidas de carcinoma mucoepidermóide de

pulmão) e HEp-2 (derivadas de carcinoma epidermóide de laringe), cedidas pelo

Instituto Adolfo Lutz. As células foram mantidas em DMEM (Minimum Essencial

Medium Eagle modificado Dulbecco’s), suplementado com 10% de soro fetal bovino,

1% de solução de antibiótico (penicilina 1000 UI/ml + estreptomicina 250 mg/mL) e

1% de L-glutamina 200mM.

Viabilidade celular:

Para determinar a viabilidade celular, foi utilizado o corante vital Azul Tripano 0,4%

em PBS (solução tampão de fosfato padrão), o qual penetra facilmente nas células

danificadas corando-as em azul, enquanto que as células íntegras permanecem

incolores, permitindo assim determinar a porcentagem de células vivas e células mortas

(WEISENTHAL et al. 1983). A contagem das células foi realizada em microscópio

invertido Leitz, com a utilização de um hemocitômetro, preenchido com uma alíquota

da suspensão de células homogeneizadas.

Determinação da atividade citotóxica:

Para determinação da citotoxicidade uma suspensão celular de 105 células/mL, foi

preparada em meio adaptado para cada linhagem celular. A suspensão foi distribuída em

placas de cultura com 96 poços (225µL em cada poço). As placas foram incubadas a

37ºC em estufa, com atmosfera úmida enriquecida com 5% de CO2. Após 24 horas,

foram adicionados 25µL/poço de cada substância em concentrações de 10, 5, 2.5 e 1.25

µg/mL, sendo cada uma das concentrações adicionada em 4 poços diferentes. Em 16

poços não foi acrescentada nenhuma substância, servindo estes como controles (100%

de crescimento celular). Em seguida as placas foram reincubadas a 37ºC (COSTA;

AGUIAR; NASCIMENTO, 2004). O método do MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-

2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (MOSMANN, 1983; ALLEY et al., 1988), é baseado na

capacidade que as células vivas possuem de reduzir o sal tetrazólio de cor amarela, a


70

formazan insolúvel, de cor púrpura, que precipita graças à ação da enzima mitocondrial

succinil desidrogenase, ativa apenas em células vivas. Após 72h de contato das células

com o produto teste, foi adicionado a cada poço, 25µL de MTT a uma concentração de

5mg/mL em PBS. As placas foram mantidas por duas horas em estufa a 37ºC. Ao final

desse período, o meio de cultura, juntamente com o excesso de MTT foi aspirado e em

seguida 100 µL de DMSO foi adicionado a cada poço para dissolução dos cristais

Formazan. Para verificar a porcentagem de inibição e a CI50 (concentração que inibe

50% da proliferação celular) a leitura óptica foi realizada em leitor automático de placas

do tipo Multiskan a 540 nm. A densidade óptica (DO) média dos poços testes foi

comparada com a DO média dos poços controle.


71

8.3. Esquema de síntese:

ClCH2CO2H SC(NH2)2+

3b: R = 3-F3c: R = 4-F

3a: R = 2-F3e: R = 3-Br3f: R = 4-Br

3d: R = 2-Br3h: R = 3-Cl3i: R = 4-Cl

3g: R = 2-Cl

3l: R = 2,6-Cl23m: R = 3,4-Cl23n: R = 2,3,5-Cl3

3j: R = 2,4-Cl2

( 1)

N

S O

O H

( 2)

N

S O

S H

( 3a-n )

R

H

O

N

S

S

CHi ii iii

Reagentes e condições: (i) H2O, 100ºC, 24h; (ii) dioxano seco, reativo de Lawesson, 80ºC, 24h; (iii) ácido acético, acetato de sódio, RC6H4CHO, 45ºC, 4-10h.


72

8.4. Espectros selecionados:

H O

N

S

S

CH

Cl

Fig

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1. R

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73

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N

S

S

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3000

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1500

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0,6

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91

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3500

3000

2500

2000

1500

1000

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0,7

0,8

0,9

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92

8.5. Resumos publicados em congressos durante o mestrado:

Título: Síntese e elucidação estrutural de um novo derivado tiazolidínico 5-(3-

bromobenzilideno)-4-tioxo-3-(metilbenzil)-tiazolidina-2-ona

Evento: 58ª Reunião Anual da SBPC

Local: UFSC – Florianópolis/ SC

Data: 16 a 21 de julho de 2006

Título: Obtenção e avaliação microbiológica de novas tiazolidinonas

Evento: XLVI Congresso Brasileiro de Química - CBQ

Local: Fiesta Bahia Hotel – Salvador/ BA

Data: 25 a 29 de setembro de 2006

Título: Mecanismo de ação e efeito de um derivado tiazolidinônico na radiomarcação

de elementos sanguíneos com Tc – 99M




Título: Síntese de compostos tiazolidínicos substituídos por enxofre na posição 4 do

anel heterocíclico




Título: Síntese e determinação estrutural de compostos tiazolidínicos substituídos




Título: Obtenção e avaliação antimicrobiana do derivado tiazolidínico 3-(3-

clorobenzil)-5-(3-clorobenzilideno)-tiazolidina-2,4-diona

Evento: 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química

Local: Hotel Monte Real Resort - Águas de Lindóia/ SP

Data: 31 de maio a 3 de junho de 2007


93

Título: Avaliação antimicrobiana de derivado tiazolidínico substituído

Evento: XLVII Congresso Brasileiro de Química - CBQ

Local: Hotel Praia Mar – Natal/ RN


Título: Síntese e avaliação antimicrobiana do composto 3-(3-clorobenzil)-5-(4-

nitrobenzilideno)-tiazolidina-2,4-diona




Título: Síntese do derivado 3-(3-clorobenzil)-tiazolidínico substituído




Título: Síntese de um derivado tiazolidínico e estudo antimicrobiano frente a isolados

clínicos de Staphylococcus aureus




Título: Avaliação antimicrobiana de um composto 4-tioxo-tiazolidínico substituído

Evento: XV Congresso Paulista de Farmacêuticos

Local: Palácio de Convenções do Anhembi – São Paulo/ SP

Data: 20 a 23 de outubro de 2007

Título: Avaliação antifúngica de compostos 4-tioxo-tiazolidínicos substituídos

Evento: 5° Congresso Brasileiro de Micologia

Local: Mar Hotel – Recife/ PE

Data: 12 a 16 de novembro de 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO Centro de … · Um dia você aprende que paciência requer ......

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