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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO SOLANGE MARIA MAGALHÃES DA SILVA PORTO IMPACTO DA DESNUTRIÇÃO NEONATAL E DO TREINAMENTO FÍSICO MODERADO EM MECANISMOS DE DEFESA DE RATOS ADULTOS RECIFE 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
SOLANGE MARIA MAGALHÃES DA SILVA PORTO
IMPACTO DA DESNUTRIÇÃO NEONATAL E DO
TREINAMENTO FÍSICO MODERADO EM MECANISMOS DE
DEFESA DE RATOS ADULTOS
RECIFE
2006
Livros Grátis
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SOLANGE MARIA MAGALHÃES DA SILVA PORTO
IMPACTO DA DESNUTRIÇÃO NEONATAL E DO
TREINAMENTO FÍSICO MODERADO EM MECANISMOS DE
DEFESA DE RATOS ADULTOS
Dissertação apresentada para obtenção do
grau de Mestre em Nutrição do Programa de
Pós-graduação em Nutrição da Universidade
Federal de Pernambuco. Área de
concentração bases experimentais da
nutrição.
Orientadora: Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Co-orientadora: Carol Virgínia Góis Leandro
RECIFE
2006
Porto, Solange Maria Magalhães da Silva Impacto da desnutrição neonatal e do
treinamento físico moderado em mecanismos de defesa de ratos adultos / Solange Maria Magalhães da Silva Porto. - Recife : O Autor, 2006.
99 folhas : il., fig., tab., quadros. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal
de Pernambuco. CCS. Nutrição, 2006. Inclui bibliografia e anexos. 1. Nutrição - Bases experimentais. 2. Desnutrição
neonatal - Ratos adultos - Mecanismos de defesa. 3. Treinamento físico moderado - Resposta imunológica. 4. Microbiota oral - Ratos desnutridos. 5. Células do sistema imune - Atividade e função. I. Título.
612.394 CDU (2.ed) UFPE 612.3 CDD (22.ED) BC2006-318
Este trabalho foi realizado no
Laboratório de Fisiologia da Nutrição
Naíde Teodósio (LAFINNT) do
Departamento de Nutrição do Centro de
Ciências da Saúde em colaboração com o
Laboratório de Imunopatologia Keizo
Asami (LIKA), no Setor de Microbiologia
Clínica; e recebeu apoio financeiro da
Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), do
Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e da
Fundação de Amparo à Ciência e
Tecnologia do Estado de Pernambuco
(FACEPE).
MENSAGEM
E que a felicidade não dependa do tempo,
Nem da paisagem,
Nem da sorte, nem do dinheiro.
Dependa sim da importância que você vai dedicar
Ao nosso Deus,
A sua família
Ao nosso próximo.
Que todos nós saibamos falar, calar e acima de tudo ouvir.
Que tenhamos perseverança para conquistar nossos sonhos.
Que a magia não acabe, e a esperança seja permanente.
Certamente, o futuro nos trará coisas melhores,
Afinal nosso Deus nos guiará para que acertemos mais,
Cuidemos do próximo e de nós mesmo.
Por fim que sejamos gratos àqueles que nos ouviram, nos deram carinho, nos
ampararam e nos ajudaram a realizar alguns de nossos projetos.
E se algo não deu certo, tenha calma.
Tudo no final sempre dá certo, se ainda não deu,
É porque não chegou o final.
(Autor desconhecido)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho:
Aos meus pais: Carlos e Regina (in memorian) por terem contribuído de
forma fundamental para minha formação como pessoa e como profissional.
Aos meus filhos: Vanessa e Eduardo por serem uma benção de Deus e
por me impulsionarem a ter coragem de enfrentar os grandes obstáculos.
A mim mesma por todo esforço desprendido, pelos caminhos que trilhei
e por todo aprendizado que adquiri, sobretudo, com as pessoas que tive o prazer de
conhecer e de conviver, as quais contribuíram para o meu crescimento pessoal e
profissional, e por sempre acreditar no meu sonho.
AGRADECIMENTOS
Em especial, a minha orientadora e amiga Profa. Célia Maria Machado
Barbosa de Castro que aceitou o desafio da realização deste trabalho, com a qual
aprendi a me interessar por Imunologia e que me conduziu nessa jornada fascinante com
dedicação, paciência, persistência, compreensão, sutileza e sabedoria, mostrando-me os
caminhos a serem seguidos até a conclusão deste estudo.
À Profa. Carol Virgínia Góis Leandro, minha co-orientadora e amiga,
pelo incentivo, paciência e dedicação, com quem aprendi como se deve trabalhar em um
laboratório.
Ao Profo Raul Manhães-de-Castro, coordenador da pós-graduação de
Nutrição, por seu comprometimento, por sua compreensão, ética e profissionalismo, e
por ter oportunizado momentos de grande aprendizado.
Aos colegas de turma: Marco, Lisiane e Cristiane, com os quais
compartilhei momentos alegres, tristes, difíceis, prazerosos e importantes na minha
vida.
Aos colegas, estagiários e todo o pessoal dos laboratórios (LIKA e
LAFINNT) que sempre colaboraram com muita dedicação, sobrepujando alguns
contratempos, mas sem os quais seria impossível a realização deste estudo: Michelle,
Rebecca, Karla, Fátima, Juliana, Rosângela, Natália, Marcela, Rodrigo, Maiara,
Francisco, Marcelo, Bruno, Wylla Tatiana, Karla Mônica, Roberta, Rogério,
Sandra Lopes, Fernanda, Elizabeth, Sônia Marinho, Márcia, Vanuza.
Aos funcionários e professores do Departamento e da Pós-Graduação em
Nutrição da UFPE, que contribuíram das mais diversas formas na trilha deste caminho,
especialmente: Neci Nascimento, Dr. Edeones França, José Paulino, Lucia Pires,
Profa Débora, Roberto, D. Sônia e D. Lourdes, o que seria de mim sem vocês.
A todos os meus amigos que de forma direta ou indireta sempre me
deram força, torcendo e apoiando meu sucesso, dentre eles: Émerson de Melo, Betânia
Maciel, Luciana Máximo, Maria de Jesus Araújo, Gilson Falcão e Carmelo Pina.
E, acima de tudo e de todos, a Deus, por me dar condições de enfrentar
os diversos desafios que a vida nos reserva, iluminando, guiando meu caminho e
protegendo-me.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), por ter financiado este trabalho no âmbito do projeto: “Impacto da
desnutrição e/ou do treinamento físico moderado em mecanismos de defesa de ratos”.
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE QUADROS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
ABREVIATURAS E SIGLAS
1. INTRODUÇÃO
19
2. HIPÓTESES
26
3. OBJETIVOS
27
3.1. Geral
27
3.2. Específicos
27
4. MÉTODOS
28
4.1. Animais, estado nutricional e peso corporal
28
4.2. Treinamento físico moderado
32
4.3. Microbiota oral
36
4.3.1. Coleta de material para cultura microbiológica
36
4.3.2. Bacterioscopia, semeio, isolamento e identificação bacteriana
36
4.4. Análise da série branca do sangue periférico
37
4.4.1. Obtenção das células do sangue
37
4.4.2. Leucograma
37
4.4.3. Contagem total de leucócitos
38
4.4.4. Contagem diferencial de leucócitos
39
4.5. Análise da atividade de macrófagos 40
4.5.1. Obtenção dos macrófagos do lavado bronco-alveolar
40
4.5.2. Obtenção da cultura de macrófagos alveolares
41
4.5.3. Taxa de fagocitose de macrófagos alveolares
41
4.5.4. Produção de óxido nítrico por macrófagos alveolares
42
4.5.4.1. Construção da curva padrão
42
4.5.4.2 Processo de revelação da curva padrão e das amostras
43
4.6. Análise estatística
44
5. RESULTADOS
45
5.1. Peso corporal durante a desnutrição e a recuperação nutricional
45
5.2. Flora oral
47
5.3. Leucograma
49
5.3.1. Contagem total de leucócitos (número de células x 103/mm3)
49
5.3.2. Contagem diferencial relativa dos leucócitos ao longo do treinamento (T0 a T6)
51
5.3.3. Análise de neutrófilos e linfócitos entre os grupos N e NT
54
5.3.4. Análise de neutrófilos e linfócitos entre os grupos N e D
55
5.3.5. Contagem de neutrófilos e linfócitos entre os grupos D e DT
55
5.3.6. Contagem de neutrófilos e linfócitos do grupo N
57
5.3.7. Contagem de neutrófilos e linfócitos do grupo NT
57
5.4. Estudo da função de macrófagos alveolares
59
5.4.1. Taxa de fagocitose de macrófagos do lavado broncoalveolar (LBA)
59
5.4.2. Produção de Óxido Nítrico (NO) por macrófagos alveolares
60
6. DISCUSSÃO
63
7. CONCLUSÕES
72
8. PERSPECTIVAS
74
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
10. ANEXOS
81
Publicações e trabalhos desenvolvidos durante o curso
RESUMO
O objetivo desse estudo foi avaliar o impacto da desnutrição e do treinamento físico
moderado nos mecanismos de defesa de ratos adultos. Ratos machos Wistar foram
amamentados por mães que receberam dieta experimental durante a lactação, contendo
17% de proteína grupo nutrido ou 8% de proteína grupo desnutrido. Após o desmame,
todos foram recuperados com dieta normoprotéica, Labina, durante toda a vida. Os
animais foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12/12 h. Aos 60 dias, metade dos
animais de cada grupo foi submetida a treinamento físico, constituindo-se os grupos:
Nutrido(N); Nutrido Treino (NT); Desnutrido (D) e Desnutrido Treino (DT). Os
animais treinados foram submetidos a programa de natação (6 semanas/5dias/semana;45
min/dia), com aumento progressivo da carga conforme o peso corporal, até atingir um
máximo de 3%. Vinte e quatro horas após o último treino, realizaram-se coletas de
sangue para contagem total e diferencial de leucócitos e, na sexta semana, realizou-se
lavado broncoalveolar no pulmão dos ratos para o isolamento de macrófagos,
empregados para avaliação da taxa de fagocitose e da produção de óxido nítrico. A
desnutrição acarretou déficit ponderal que persistiu até a idade adulta, alterou o
crescimento bacteriano, reduziu a contagem total de leucócitos, alterou a proporção
neutrófilos/linfócitos elevando o número de monócitos e alterou função macrofágica
reduzindo a taxa de fagocitose e a produção de óxido nítrico. O treinamento físico
moderado atenuou essas alterações. Estes resultados indicam que a desnutrição precoce,
por ocorrer em período crítico da formação dos sistemas de homeostase, como o imune,
mesmo após recuperação, pode alterar a resposta do hospedeiro frente aos estímulos
nocivos. Assim, o treinamento físico moderado fortalece o sistema imune, promovendo
benefícios à saúde.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the impact of malnutrition and of moderate
physical training on the mechanisms of defense of adult rats. Male Wistar rats were
breastfed by dams that received experimental diet during the nursing, containing 17% of
protein for nourished group or 8% of protein for undernourished group. After, all were
recovered with normoproteic diet, Labina, during the whole lifetime. The animals were
maintained in 12/12h dark/light cycle. By 60 days of life, half of the animals of each
group was submitted to physical training, being constituted the groups: Nourished (N);
Nourished Training (NT); Undernourished (D) and Undernourished Training (DT). The
animals of training groups were submitted to swimming program (6 weeks; 5days/week;
45min/day), with progressive increase of the load according to the corporal weight, until
reaching a maximum of 3%. Twenty-four hours after the last training, blood collections
for total and differential leukocytes counting took place and, in the sixth week,
bronchoalveolar lavage was accomplished in the rats lung for the macrophages
isolation, employed for the evaluation of phagocytosis rate and of nitric oxide
production. The malnutrition carted weight deficit that persisted until the adult age, it
alter the bacterial growth, it reduced the total counting of leukocytes, it altered the
proportion neutrophils/lymphocytes, increasing the monocytes number and it altered the
macrophagical function, reducing the phagocytosis rate and the production of nitric
oxide. The moderate physical training lessened those alterations. These results indicate
that the precocious malnutrition, for happening in critical period of the formation of the
homeostasis systems, as the immune system, even after recovery, may alter the response
of the host in face of noxious incentives. Thus, the moderate physical training
strengthens the immune system, promoting benefits to the health.
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 Organograma geral da distribuição dos grupos 33
QUADRO 2 Protocolo de natação 35
QUADRO 3 Construção de curva padrão para dosagem de óxido nítrico 43
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 (A) Tanque de natação (visão externa) 34
(B) Tanque de natação (visão interna) 34
FIGURA 2 Colocação de peso na cauda 34
FIGURA 3 Rato em treinamento de natação 34
FIGURA 4 Rato em controle de estresse aquático 34
FIGURA 5 Ratos em aquecimento pós-treino 34
FIGURA 6 Coleta de sangue para contagem total e diferencial de
leucócitos 24 horas seguintes a cada semana de treino 37
FIGURA 7 Hemocitômetro para contagem de leucócitos totais 38
FIGURA 8 Traqueostomia 40
FIGURA 9 Lavado coletado 40
FIGURA 10 Lavado centrifugado 40
FIGURA 11 Curva padrão 43
FIGURA 12 Efeito da desnutrição neonatal no peso corporal de rato (à
direita) após aleitamento
45
FIGURA 13 Peso corporal durante a desnutrição 46
FIGURA 14 Peso corporal durante a recuperação nutricional 47
FIGURA 15 Crescimento bacteriano segundo estado nutricional e
treinamento físico
48
FIGURA 16 Evolução da contagem total de leucócitos em ratos adultos 50
FIGURA 17 Análise de Neutrófilos e Linfócitos entre os grupos N e NT 54
FIGURA 18 Análise de Neutrófilos e Linfócitos entre os grupos N e D 55
FIGURA 19 Análise de Neutrófilos e Linfócitos entre os grupos D e DT 56
FIGURA 20 Análise de neutrófilos e linfócitos do grupo N 57
FIGURA 21 Análise de neutrófilos e linfócitos do grupo NT 58
FIGURA 22 Análise de neutrófilos e linfócitos do grupo D 58
FIGURA 23 Análise de neutrófilos e linfócitos do grupo DT 59
FIGURA 24 Efeito da desnutrição e do treino sobre a taxa de fagocitose
em macrófagos alveolares de ratos adultos
60
FIGURA 25 Produção de óxido nítrico de macrófagos alveolares segundo
a desnutrição e o treinamento físico 61
FIGURA 26 Produção de óxido nítrico sem LPS 62
FIGURA 27 Produção de óxido nítrico com LPS 62
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Composição das dietas experimentais de caseína a 8% e a 17%, utilizada na
alimentação dos animais.
30
TABELA 2 Composição da dieta padrão LABINA (Purina do Brasil) utilizada na
alimentação dos animais.
31
TABELA 3 Total de colônias em valores absolutos. 49
TABELA 4 Efeito da desnutrição/treino na contagem diferencial dos leucócitos (%) em
ratos adultos.
53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACTH Hormônio Adrenocorticotrófico
ANOVA Análise de variância
Cs Citocinas
CD4+; CD8+ Linfócitos imaturos duplamente marcados
CRH Corticotrofina
D Desnutrido (controle)
DT Desnutrido Treino
DT Desnutrido Treinado
GH Hormônio do crescimento
HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal
IL Interleucinas
LBA Lavado broncoalveolar
Lc Leucócitos
LPS Lipopolissacarídio
NK Natural Killer
N Nutrido (controle)
NT Nutrido Treino
PC Peso Corporal
PMN
RPMI
Polimorfonucleares
Meio de cultura do Roswell Park Memorial Institute
SF Soro fisiológico (NaCl a 0,9%)
SI Sistema Imune
SN Sistema Nervoso
SNS Sistema Nervoso Simpático
SST Solução Salina Tamponada
TNF Fator de Necrose Tumoral
19
1. INTRODUCAO
A enorme variedade de organismos que causam doenças infecciosas
pode ser agrupada em seis categorias principais: vírus, bactérias, fungos, protozoários,
helmintos e artrópodes. Cada uma destas categorias apresenta características distintas
que determinam maneiras de interação com os hospedeiros e, portanto, contribuem para
as características das doenças que os organismos causam. Entre estas propriedades estão
a constituição estrutural e molecular, as estratégias metabólicas e os processos
reprodutivos. Algumas espécies, entretanto, são positivamente benéficas à saúde do
hospedeiro. A microbiota normal, os organismos que vivem no nosso corpo sem causar
doença, é imprescindível para a proteção contra o estabelecimento de micróbios
patogênicos (MANDEL GL, DOUGLAS RG, BENNETT JE, 2005).
A microbiota endógena inclui todos os microrganismos (bactérias,
fungos, protozoários e vírus) que residem no interior ou na superfície corporal dos seres
sadios (PASTER et al, 2000). Quando o número habitual de microrganismos residentes
está muito reduzido, os invasores oportunistas podem então, se estabelecer mais
facilmente (BURTON et al, 2005).
A cavidade oral, por exemplo, apresenta uma das mais concentradas e
variadas populações microbianas, cuja localização principal está no dorso da língua, no
sulco gengival e na placa dental coronariana (LINDHE, 1992). Estima-se que a saliva
contém 108 bactérias/mL e as placas dentais, 1011 bactérias/mL (GUTIÉRREZ-PÉREZ
et al., 2004). Participam desta flora numerosos gêneros, como: Staphilococcus,
Streptococcus, Neisseria, Bacteróides, Actinomyces, Treponema, Mycoplasma e outros
(TORTORA, FUNKE, CASE, 2000; TRABULSI, 1986). Isogai et al (1985) isolaram
mais de 15 bactérias na cavidade oral de ratos, dentre estas os tipos predominantemente
20
isolados na saliva, dorso da língua, mucosa bucal e sulco gengival foram: Streptococcus
ssp., Lactobacillus ssp., Veillonella ssp e Neisseria ssp.
Quando o organismo é invadido por um agente infeccioso, o sistema de
defesa local pode ser suficiente para impedir a replicação e a disseminação do agente
infeccioso, impedindo, portanto, o desenvolvimento da doença. Este mecanismo de
defesa orgânico estabelecido denomina-se de resposta imune e inclui a imunidade
natural e a imunidade adaptativa (UTHAISANGSOOK et al, 2002). Esta resposta é um
processo complexo de defesa efetivo no controle da expansão da infecção e da
erradicação do organismo invasor (PEAKMAN e VERGANI, 1997; CHANDRA,
1997).
A imunidade natural é constituída por barreiras físico-químicas (pele e
membranas mucosas); moléculas circulantes (complemento); células fagocíticas
(macrófagos e neutrófilos); célula Natural Killer (NK) e citosinas (Cs) derivadas de
macrófagos (fator de necrose tumoral (TNF), interferon-alfa, interferon-beta). Esses
elementos inatos atuam como a primeira linha de proteção e retardam o estabelecimento
da manifestação infecciosa (CHANDRA, 1997).
Os componentes da imunidade natural são inatos e não são influenciados
por contato prévio com o agente infeccioso, no entanto, a imunidade específica é
adquirida, e apresenta especificidade e memória, sendo chamada de adaptativa, por
direcionar os mecanismos da imunidade natural para as vias de entrada dos agentes
agressores, tornando-os mais capazes de eliminá-los (PEAKMAN e VERGANI, 1999).
A imunidade adaptativa acrescenta aos elementos da imunidade natural, os linfócitos B,
responsáveis pela produção de anticorpos, relacionados à imunidade humoral e os
linfócitos T, que medeiam a imunidade celular.
No sistema imune há células de altíssimo poder fagocitário, destacando-
21
se os macrófagos, derivados da migração dos monócitos sanguíneos para o tecido, que
aparecem no tecido conjuntivo ou no parênquima de algum órgão, e atuam
principalmente na fagocitose (SIBILLE e REYNOLDS, 1990). Os macrófagos têm um
papel central no sistema imune, sobretudo como reguladores da homeostase e efetores
nas infecções, tumores e ferimentos, antes da ação da imunidade mediada pelas células
T e B (CELADA e NATHAN, 1994). Agem como células processadoras e
apresentadoras de antígenos sendo importantes na fase de indução de inflamação,
reorganização e reparo dos tecidos (SIBILLE e REYNOLDS, 1990).
O exercício físico, a depender de sua magnitude, parece alterar a resposta
imunológica (DRELA et al., 2004), se esta atuação é benéfica ou deletéria, poderá
depender da intensidade, da freqüência e da duração do esforço. Particularmente o
treinamento físico de intensidade moderada está associado a benefícios para a saúde
(NIEMAN, 2000) e a melhoria de muitas funções imunes, parecendo retardar ou
prevenir a incidência e a progressão de alguns tumores (SMITH et al., 1996). Há
também relatos de uma baixa incidência de infecções do trato respiratório superior em
indivíduos que se exercitavam regularmente (HEATH et al., 1991). A relação entre
exercício físico e saúde vem se consolidando nos últimos anos. Encontra-se na literatura
diversos trabalhos relacionando os efeitos do exercício físico com as funções do sistema
imunológico (NIEMAN et al, 1990a; NIEMAN et al., 1990b; FITZGERALD, 1991;
HEATH et al., 1991; BLANNING et al., 1998). Ferry et al (1993) obsevaram um
aumento no percentual de linfócitos TCD4+ em animais treinados quando comparados
aos seus pares sedentários. Em animais treinados e posteriormente inoculados com o
tumor de Walker-256, foi observado um aumento da função linfocitária e da atividade
fagocítica de macrófagos (BACURAU et al, 2000). Nascimento et al (2004) observaram
em ratos treinados (6 semanas de natação), um aumento na taxa de fagocitose de
22
macrófagos. Assim, o treinamento físico de intensidade moderada parece promover
adaptações fisiológicas e imunológicas que repercutem de forma positiva no organismo,
enquanto que o treino intenso parece enfraquecê-lo (NEHLSEN – CANARELLA, 1998;
PYNE e GLEESON, 1998; PEDERSEN E HOFFMAN-GOETZ, 2000).
Há relatos sobre a influência do treinamento físico no sistema
imunológico ativado (NIEMAN, 2000). Por exemplo, Nascimento et al (2004)
observaram que a leucopenia em resposta a um estresse agudo foi atenuada em ratos
treinados (60 minutos p/dia, 5 dias/semana, durante 8 semanas). Leandro (2005)
observou também, atenuação na diminuição do percentual de linfócitos de órgãos
linfóides em resposta à contenção aguda, em ratos treinados. Os mecanismos
subjacentes parecem estar associados à adaptação de células do sistema imune
decorrente do exercício físico regular (BACURAU, 2000). As alterações ocorridas na
concentração e nas funções das células do sistema imune, não devem ser vistas
isoladamente, e sim como parte da integração entre o sistema nervoso, endócrino e
imune (PEDERSEN e HOFFMAN-GOETZ, 2000). Durante o exercício verifica-se um
aumento nas concentrações de dopamina e noradrenalina em nível cerebral. Em
conseqüência, há secreção de hormônio liberador de corticotrofina (CRH) em nível
hipotalâmico. A corticotrofina (ACTh) e as β-endorfinas são então liberadas pela
pituitária anterior. A descarga de ACTh estimula o córtex adrenal a produzir
glicocorticóides e aminas biogênicas (BRENNER et al., 1998). A ativação do Sistema
Nervoso Simpático (SNS) e os eventos seqüenciais do eixo HPA parecem possuir uma
relação intrínseca com os componentes do sistema imune, não só pela presença de
receptores hormonais em leucócitos, mas também pela relação anatômica observada
entre os três sistemas (OTTAVIANI e FRANCESCHI, 1996). As células do sistema
imune parecem possuir receptores para as β-endorfinas, catecolaminas, cortisol,
23
hormônio do crescimento (GH) e diversos outros mediadores envolvidos na reação ao
estresse (GAILLARD, 1994).
O cortisol, em pequenas quantidades, melhora a função imune, visto que
um dos papéis deste hormônio no sistema imune é o de estimular a migração de células
da medula para a circulação, assim como, dos linfonodos para os tecidos lesionados
(BRENNER et al, 1998). Entretanto, o aumento da concentração de cortisol no sangue
pode causar linfocitopenia, monocitopenia e neutrofilia em humanos (PEDERSEN e
HOFFMAN-GOETZ, 2000). Este hormônio inibe a migração de células inflamatórias
para locais lesionados, a proliferação de linfócitos, a função de macrófagos e limita a
atividade das células NK (WOODS, 1999). Além disso, parece induzir baixa na
regulação de receptores de linfócitos T e aumentar a taxa de catabolismo, reduzindo as
reservas de aminoácidos que são necessários para proliferação de linfócitos B e síntese
de imunoglobulinas (NASCIMENTO et al, 2001).
As células imunocompetentes parecem possuir não só receptores
hormonais, mas também a capacidade para produzir e secretar alguns hormônios e
neuropeptídeos (GAILLARD, 1994). A relação bidirecional entre os sistemas
neuroendócrino e imune é constituída por mensageiros liberados das células imunes
ativadas, chamados citocinas (MOLDEVEANU et al, 2001). As citocinas são pequenas
proteínas solúveis secretadas por leucócitos, e outras células, e que têm por função
mediar a resposta imune (DE CASTRO et al, 2000). A resposta local para uma infecção
ou tecido lesionado envolve a produção dessas citocinas que vão facilitar o influxo dos
vários tipos de leucócitos para a região atingida (MOLDEVEANU et al, 2001). As
citocinas têm ação mediadora no sistema imune, e no sistema neuroendócrino atuam
modificando suas funções (DE CASTRO et al, 2000). Assim, o estímulo induz as
células do sistema imune a produzirem citocinas que, em resposta, parecem atuar nos
24
três níveis: hipotalâmico, pituitário e adrenal (MOLDEVEANU et al, 2000). De forma
idêntica, os diferentes tipos de células do SN (neurônios, astrócitos e microgliócitos)
também sintetizam citocinas e/ou respondem a elas (GAILLARD, 1994).
Além da atividade física, outros fatores parecem influenciar diretamente
na atuação dos componentes do sistema imune. Dentre estes, destaca-se o papel dos
nutrientes. Alguns nutrientes são necessários tanto para a função dos leucócitos como
para o fornecimento de energia para o metabolismo. Por exemplo, a glutamina e a
arginina são aminoácidos utilizados por linfócitos, macrófagos e neutrófilos, uma vez
que a metabolização desses aminoácidos pelas células imunes fornece substratos
fundamentais na formação de proteínas, purinas, pirimidinas, glicosamina e NAD+
(CURI et al, 1999). Assim, os nutrientes exercem influência sobre os diversos
componentes do sistema imunológico.
A desnutrição parece alterar alguns aspectos da resposta imunológica
(REVILLARD, 1990). Chandra (1997) aponta a desnutrição como uma das principais
causas de deficiência secundária na resposta do organismo aos agentes infecciosos. Da
mesma forma, indivíduos severamente desnutridos apresentam redução em parâmetros
da imunidade inespecífica e adaptativa (LESOURD, 1998).
A desnutrição ocorrida nos primeiros anos de vida pode gerar
conseqüências severas para o organismo (BROWN E POLLITT, 1996). Em humanos,
eventos importantes para a imunocompetência são iniciados ainda no embrião e
continuam na primeira semana de vida (GOBEL, 1996). Em ratos, a competência
imunológica também é adquirida gradualmente após o nascimento (GOBEL, 1996). Ferreira e Silva (2002) observou uma redução no recrutamento de neutrófilos para os
pulmões durante processo inflamatório em ratos adultos, submetidos à desnutrição
neonatal. Queirós-Santos (2000) observou que a desnutrição neonatal provoca na vida
25
adulta, uma redução da liberação de radicais superóxido por macrófagos e deficiência
na resposta imunitária humoral. Assim, estas evidências sugerem que a desnutrição
neonatal, mesmo após um longo período de recuperação, pode comprometer os
mecanismos imunitários do organismo. Se estas alterações podem ser modificadas por
fatores ambientais, como por exemplo, a prática do exercício físico, é uma questão de
interesse.
A desnutrição no período de aleitamento pode ser um agente estressor
indutor de alterações tardias na resposta imunológica (QUEIRÓS-SANTOS, 2000).
Exercício físico pode influenciar positivamente sobre o sistema imunológico (DRELA
et al, 2004). Assim, o presente estudo pretende avaliar o impacto da desnutrição no
período de aleitamento e, posteriormente, do treinamento físico moderado nos
mecanismos de defesa após recuperação nutricional em ratos adultos. O estudo destes
aspectos em animais tem importância do ponto de vista experimental e clínico, devido à
diversidade de reações do organismo, particularmente, às eventuais seqüelas, sobre o
sistema imune, ocasionada por agressões nutricionais sofridas no período neonatal, por
ser um período de grande vulnerabilidade em decorrência da formação dos diversos
sistemas orgânicos. Este estudo em animais precocemente desnutridos permitirá
evidenciar se a prática regular de exercício físico moderado está associada à melhoria
dos mecanismos de defesa do hospedeiro, podendo retardar ou prevenir a incidência e a
progressão de doenças infecciosas.
26
2. HIPÓTESES
O treinamento físico moderado contribui para a manutenção do padrão
e do crescimento bacteriano normal na cavidade oral, permite adaptações progressivas
na contagem total e diferencial de leucócitos do sangue periférico e melhora a função
de macrófagos.
A desnutrição imposta no período de aleitamento provoca no animal
adulto, modificação do padrão e do crescimento bacteriano da flora, diminuição na
concentração de leucócitos do sangue periférico e das funções das células
macrofágicas.
Em animais sedentários e submetidos à desnutrição imposta no período
de aleitamento, o treinamento físico moderado na idade adulta recupera o padrão de
normalidade da flora bacteriana, mantém a concentração de leucócitos do sangue
periférico dentro de valores de normalidade e melhora a função de macrófagos.
27
3. OBETIVOS
3.1. Geral
Estudar o impacto da desnutrição neonatal e do treinamento físico moderado em
mecanismos de defesa de ratos adultos
3.2. Específicos
1. Avaliar a repercussão das dietas aplicadas sobre a evolução ponderal no
período neonatal;
2. Estudar o padrão e o crescimento das bactérias aeróbicas da microbiota normal
da cavidade oral;
3. Avaliar a evolução quantitativa e diferencial de leucócitos do sangue
periférico durante e imediatamente após o programa de treinamento físico
moderado inter e intragrupos.
4. Analisar o efeito da desnutrição e/ou do treinamento físico moderado sobre a
taxa de fagocitose e a produção de óxido nítrico de macrófagos alveolares.
28
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais, estado nutricional e peso corporal
Foram utilizados 36 ratos machos, albinos, da linhagem Wistar,
provenientes da colônia do Departamento de Nutrição, da Universidade Federal de
Pernambuco. Os animais foram mantidos em biotério em gaiolas de propileno, com
tampa de arame zincado, contendo um máximo de três animais por gaiola, a uma
temperatura de 23±1oC, em ciclo claro/escuro invertido de 12 h (claro-21 a 9 h;
escuro-9 às 21h), onde tiveram acesso livre à água e à ração.
Os animais foram obtidos acasalando-se machos e fêmeas, com idade
entre 90 e 120 dias, na proporção de um macho para três fêmeas, por um período de
16 dias (HARKNESS, 1993). O diagnóstico da prenhez foi feito pela observação do
crescimento do ventre. Um dia após o nascimento, a ninhada foi padronizada em seis
filhotes machos por mãe. Este número parece conferir maior potencial lactotrófico
(FISHBECK E RASMUSSEN, 1987). Neste mesmo dia, adotado como primeiro dia
de vida do animal, as ninhadas foram divididas em dois grupos:
1) Nutrido (N) - constituído por 18 filhotes amamentados por mães
submetidas à dieta contendo 17% de proteína à base de caseína
utilizada como fonte protéica (TABELA 1);
2) Desnutrido (D) - constituído por 18 filhotes amamentados por mães
submetidas à dieta contendo 8% de proteína à base de caseína
utilizada como fonte protéica (TABELA 1).
Os animais dos dois grupos foram amamentados durante os primeiros
21 dias após o nascimento - período de aleitamento (HARKNESS, 1993). Nesse
29
período foram registrados diariamente (em balança eletrônica digital – Marte, modelo
S-4000-com sensibilidade de 0,1g) os pesos corporais (PC) de cada animal, a fim de
acompanhar o peso corporal durante a manipulação nutricional. A partir do 22o dia de
vida até o final do experimento, o peso corporal era aferido uma vez por semana,
objetivando acompanhar a recuperação nutricional dos animais. Após o desmame, no
22o dia de vida, os animais foram separados de suas mães, mantidos em gaiolas
coletivas contendo 3 ratos em cada gaiola, e passaram a receber Labina (TABELA 2),
dieta adotada como padrão no Biotério, contendo 23% de proteínas mistas até o final
do experimento.
30
TABELA 1. Composição da dieta Caseína a 8% e a 17%, utilizada na alimentação dos
animais
INGREDIENTES CASEÍNA A 8% CASEÍNA A 17%
Caseína 79,3g 179,3g
Mix Vitamínico 10g 10g
Mix Mineral 35g 35g
Celulose 50g 50g
Bitartarato de |Colina 2,5g 2,5g
DL-Metionina 3,0g 3,0g
Óleo de Soja 70mL 70mL
Amido de Milho 750,2g 650,2g
*Composição das dietas segundo a AIN-93G
31
TABELA 2. Composição da dieta padrão LABINA (Purina do Brasil) utilizada na
alimentação dos animais.
ENRIQUECIMENTO*
(kg de ração)
ENRIQUECIMENTO*
(kg de ração)
NÍVEIS DE GARANTIA*
(%)
Vitamina A 20000UI Piridoxina 6mg Umidade
(máx)
13
Vitamina D3 6000UI Biotina 0,1mg Proteína
(min)
23
Vitamina E 30UI Colina 2000mg Extrato
Etéreo
2,5%
Vitamina K 6mg Manganês 50mg Matéria
Fibrosa
(máx)
9,0
Vitamina
B12
10mg Iodo 2mg Matéria
Mineral
(máx)
8,0
Vitamina B2 8mg Ferro 65mg Cálcio (máx) 1.8
Pantetonato
de Cálcio
24 mg Zinco 35mg Fósforo
(min)
Niacina 95mg Cobre 26mg
Tiamina 4mg Antioxidante 100mg
Ácido Fólico 0,5mg
*Composição da dieta segundo Purina do Brasil
32
4.2. Treinamento físico moderado
Aos 60 dias de vida, os animais nutridos e desnutridos foram
subdivididos nos grupos: Nutrido (N); Nutrido Treino (NT); Desnutrido (D),
Desnutrido Treino (DT) (QUADRO 1). Os animais de cada grupo treino foram
submetidos a um programa de treinamento físico moderado com natação (45 min/dia,
5 dias/semana, durante 6 semanas) de acordo com o protocolo experimental de
Nascimento et al (2004) (QUADRO 2), baseado no estudo:“Efeito da L-Glutamina ou
do treinamento físico moderado sobre parâmetros imunológicos em ratos submetidos
ou não a estresse agudo”, realizado em animais com as mesmas características.
Conforme o protocolo, uma sobrecarga de peso era aplicada no animal, presa por uma
liga à sua cauda (FIGURA 2). Os animais do grupo treinado foram adaptados ao
exercício. Essa adaptação incluiu aumento progressivo do tempo de treino, ou seja,
permanência na água (1o dia = 10 minutos, 2o dia = 20 minutos, 3o dia = 30 minutos,
4o dia = 40 minutos e 5o dia = 45 minutos). Após o término da adaptação (1a semana),
os animais foram submetidos ao treinamento (FIGURA 3), no horário entre 12:00 e
14:00 horas, sendo 45 minutos por dia, 5 dias por semana, durante 6 semanas, com
incremento da intensidade do esforço (sobrecarga progressiva segundo o peso
corporal – 2a semana = 1%; 3a e 4a semanas = 2%; 5a e 6a = 3%) (QUADRO 2). Para a
natação, utilizou-se um tanque com capacidade para 100 L e sistema de aquecimento
dotado de termostato para manter a temperatura da água entre 30o e 32oC (FIGURA 1-
A e B). Para controle, no mesmo período, os animais não treinados foram mantidos
numa caixa plástica, contendo água suficiente para manter apenas as patas imersas,
durante o mesmo período do grupo treinado (FIGURA 4). Todos os animais, após
saírem da água, permaneciam por 5 minutos em câmara de aquecimento (FIGURA 5).
33
A manipulação dos animais em relação à dieta e ao protocolo de treinamento foi
conduzida pelo mesmo investigador.
QUADRO 1. Organograma geral da distribuição dos grupos
GRUPOS
NUTRIDO n = 18
DESNUTRIDO n = 18
NUTRIDO NÃO TREINADO
n = 9
NUTRIDOTREINADO
n = 9
DESNUTRIDONÃO TREINADO
n = 9
DESNUTRIDO TREINADO
n = 9
34
FIGURA 1A Tanque de natação (visão externa)
FIGURA 1B Tanque de natação (visão interna)
FIGURA 2 Colocação de peso na cauda
FIGURA 3 Rato em treinamento de natação
FIGURA 4 Rato em controle de estresse aquático
FIGURA 5 Rato em aquecimento pós-treino
Fotografias: Barros, 2000
35
QUADRO 2. Protocolo de Natação – (6 semanas, 5 dias/semana, 45 min/dia)
(Nascimento et al, 2000).
PERÍODO
DE TREINO
DIAS TEMPO
(min)
SOBRECARGA
(% PESO CORPORAL)
SEMANA 1 1o DIA 10
2o DIA 20
3o DIA 30
4o DIA 40
5o DIA 45
SEMANA 2 TODOS 45 1
SEMANA 3 TODOS 45 2
SEMANA 4 TODOS 45 2
SEMANA 5 TODOS 45 3
SEMANA 6 TODOS 45 3
(Nascimento et al, 2000)
Assim, formaram-se os grupos:
1. Nutrido não treinado (N);
2. Nutrido treinado (NT);
3. Desnutrido não treinado (D);
4. Desnutrido treinado (DT).
36
4.3. Microbiota oral
4.3.1. Coleta de material para cultura
Antes de iniciar o primeiro treino, realizou-se a coleta da cavidade
oral. Cada animal era segurado na posição vertical, de modo que suas patas fossem
imobilizadas. Em seguida, coletava-se a flora bacteriana oral através de swabs
embebidos em 40 µL de solução salina de NaCl 0,9%. Este procedimento foi repetido
após o último treino.
4.3.2. Bacterioscopia, semeio, isolamento e identificação bacteriana.
Após a coleta, cada swab era colocado num tubo estéril contendo
960µl de BHI (Brain Heart Infusion), meio líquido enriquecido que permite o
crescimento bacteriano. Posteriormente, fazia-se a homogeneização de cada uma
destas amostras. Então, destes 1.000µL retirava-se, com o auxílio de alça calibrada,
1µL. Este 1µL era semeado em placas de Petri contendo Agar-sangue e Agar-Levine,
para isolamento e identificação das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
respectivamente. Estas placas eram incubadas em estufa bacteriológica a 37oC por 48
horas e as unidades formadoras de colônias (UFC) que cresceram foram contadas e
seus percentuais calculados. Além disso, foram confeccionadas lâminas para a
realização da coloração de Gram.
37
4.4. Análise da série branca do sangue periférico
4.4.1. Obtenção das células do sangue
A cada semana (24 horas após a última sessão de treino), coletou-se
uma pequena alíquota de sangue (0,5 mL) da cauda dos animais para contagem total e
diferencial de leucócitos do sangue (FIGURA 6). No final do período de treinamento
(24 horas a seguir a última sessão de exercício), todos os animais foram anestesiados
(uretana a 10,5% e cloralose a 0,5%) e sacrificados para coleta de macrófagos
alveolares.
FIGURA 6. Coleta de sangue para contagem total e diferencial de leucócitos 24 horas seguintes a cada semana de treino.
4.4.2. Leucograma
As amostras de sangue coletadas de todos os grupos foram distribuídas
em tubos. Para realização do leucograma (contagens total e diferencial de leucócitos).
Extraiu-se 0,5 mL de sangue sendo depositado em tubo de 5 mL, previamente acrescido
de 20µL de anticoagulante (EDTA - ácido etileno diaminotetracético a 3%).
Fotografia: Barros, 2000
38
4.4.3. Contagem total de leucócitos
Para contagem dos leucócitos, foi utilizada uma solução diluidora de
leucócitos, solução de TURK (ácido acético a 3%). A solução de TURK possui a
propriedade de destruir os eritrócitos e corar o núcleo dos leucócitos. Os leucócitos
foram contados em uma câmara de volume conhecido (hemocitômetro ou Câmara de
Neubauer – FIGURA 7) com auxílio do microscópio óptico (sob lente 40x de aumento).
Em seguida, realizou-se a contagem de todos os leucócitos encontrados nos quadros
marcados nas extremidades (L).
O resultado obtido utilizou a seguinte fórmula:
Leucócitos / mm3 de sangue = Lc x 20 x 10
4
Onde:
Lc = número total de leucócitos contados em 4 de mm2
4 = fator de conversão para 1 mm3
20 = fator de conversão da diluição utilizada
10 = fator de conversão para 1mm3 (profundidade da lâmina).
FIGURA 7 – Hemocitômetro para contagem de leucócitos totais
39
4.4.4. Contagem diferencial de leucócitos
A contagem diferencial de leucócitos foi realizada, utilizando-se a
técnica do esfregaço sangüíneo. Esta técnica permite que os elementos celulares do
sangue, espalhados em camada única sobre a superfície de uma lâmina, quando fixados
e tratados por corantes especiais, adquiram morfologia e coloração adequadas para o
estudo microscópico detalhado e preciso. Para isto, espalha-se uma pequena gota de
sangue colocada sobre a superfície de uma das extremidades de uma lâmina e com o
auxílio de uma outra, inclinada a 45o em relação à primeira, obtém-se o esfregaço
sanguíneo.
Para a coloração utilizou-se o kit Panótico Rápido LB – Laborclin Ltda.
Este constitui um sistema de coloração diferencial dos elementos figurados do sangue,
onde as estruturas celulares são coradas nos mais diversos nuances entre o vermelho e o
azul, permitindo a identificação e a diferenciação entre elas. O kit consiste de uma
solução fixadora e duas soluções corantes.
Depois de seca, a lâmina foi examinada ao Microscópio óptico com
objetiva de 100x por imersão. A leitura foi realizada no esfregaço sanguíneo pela
contagem de 100 células. Os diferentes elementos foram contabilizados através da
utilização de um contador eletrônico da marca Kacil com teclas correspondentes a cada
tipo de célula. A partir dos dados obtidos foram calculados os valores absolutos e
relativos para cada tipo de célula.
40
FIGURA 8 Traqueostomia
FIGURA 9 Lavado coletado
FIGURA 10 Lavado centrifugado
4.5. Análise da atividade de macrófagos
4.5.1. Obtenção dos macrófagos do lavado broncoalveolar (LBA)
O LBA foi obtido de acordo com a técnica usada por De Castro et al
(1995) e Bureau et al, (1997). Sob anestesia, o animal foi submetido à cirurgia para
exposição da traquéia (FIGURA 8). O LBA foi realizado, por injeção de soro
fisiológico (SF) à temperatura ambiente, através de cânula plástica inserida na traquéia.
Pela traquéia, várias alíquotas de 2 mL de SF foram injetadas e imediatamente coletadas
(FIGURA 9). Ao final, obteve-se um volume de 20 mL de LBA por cada animal.
Fotografias: Barros, 2000
41
4.5.2. Obtenção da cultura de macrófagos alveolares
O LBA foi centrifugado (10 min, a 470 x g) e as células recuperadas do
precipitado (FIGURA 10, página 40). O precipitado de células obtido após
centrifugação do LBA foi ressuspendido em meio de cultura (RPMI 1640, CULTILAB)
suplementado com soro fetal bovino inativado a 3% (CULTILAB), penicilina-
100U/mL, estreptomicina-100 µg/mL e anfotericina B-0.25 µg/mL (SIGMA) em uma
densidade de 1x106 células/mL. As células, 1x106 células/mL/poço foram colocadas em
placa, com 6 poços de 35 mm de diâmetro cada, para cultura de tecido (Placas tipo
Falcon). Para adesão, as células foram mantidas na placa por 1h a 37oC em atmosfera
úmida contendo 5% CO2. As células não aderentes foram descartadas. Posteriormente,
estas células foram incubadas por mais 1 h em meio de cultura (RPMI 1640,
CULTILAB) com antibióticos e sem soro fetal bovino.
4.5.3. Taxa de fagocitose de macrófagos alveolares
Para avaliar a taxa de fagocitose foram utilizados fungos Saccharomyces sp. Os
fungos foram lavados 3 vezes com Solução Salina Tamponada (SST), contados 107
células e em seguida, os fungos foram misturados na suspensão de macrófagos (1 X
106/1 mL de meio de cultura RPMI 1640 completo) recuperados do LBA. As células
(macrófagos e fungos) foram distribuídas em lâminas para microscopia óptica e
incubados a 37ºC, em atmosfera úmida por um período de 1 hora. Após este período as
lâminas foram lavadas com SST e secadas a temperatura ambiente. Para a coloração, foi
utilizado o kit Panótico Rápido. Depois de coradas e secas a temperatura ambiente, as
lâminas foram levadas para leitura ao microscópio óptico, lidos com objetiva de 100 sob
42
imersão. A taxa de fagocitose foi obtida como percentual de macrófagos que
englobaram fungo em uma contagem total de 200 células.
4.5.4. Produção de óxido nítrico por macrófagos alveolares
Uma vez a adesão celular ocorrida na placa de cultivo, cada poço foi
aspirado e lavado com 1mL de solução salina a 0,9%. Neste momento as células foram
estimuladas com LPS na dose de 10 µg/mL. As placas de cultura retornaram à estufa
para posteriores leituras em espectrofotômetro, com 24 e 48 horas.
4.5.4.1. Construção da curva padrão
Para efetuar a dosagem de óxido nítrico através da quantificação dos
níveis de nitrito e nitrato das amostras foi necessário realizar uma curva padrão
(QUADRO 3). Para a construção desta foram utilizados reagentes a base da solução de
Nitrato de sódio (NaNO2) 1mM (Solução padrão), meio de cultura RPMI 1640 e
reagente de Griess (Solução de revelação) em volumes pré-estabelecidos conforme
descrição a seguir.
Quantidades crescentes da solução padrão foram adicionadas ao RPMI
1640 para se obter oito (08) soluções de diferentes concentrações. Abaixo as
quantidades pré-estabelecidas foram:
43
QUADRO 3 – Construção de curva padrão para dosagem de óxido nítrico
Solução padrão de nitrito de sódio a 1mM (µL)
Meio de cultura RPMI 1640 (µL)
0 1000 2 998 5 995 10 990 25 975 50 950 75 925 100 900
4.5.4.2. Processo de revelação da curva padrão e das amostras
A confecção da curva padrão (FIGURA 11) ocorreu nos momentos das
coletas das amostras, e as leituras tanto das amostras quanto da curva padrão foram
efetuadas após o período de incubação, de 24 horas.
Para o procedimento das leituras, em espectrofotômetro, utilizou-se um
comprimento de onda de 550 nm. Em seguida, foram retirados 500µL de cada solução
da curva padrão e a mesma quantidade de amostras dos sobrenadantes das culturas de
células e misturados a 500µL da solução de revelação, para então, após 10 minutos ser
realizada a leitura. No grupo controle as células não receberam tratamento com o LPS.
Neste grupo havia apenas 2mL de RPMI 1640 e 500µL solução de revelação.
FIGURA 11 - Curva padrão
Fotografia: Barros, 2000
44
A determinação espectrofotométrica dos níveis de nitrito e nitrato da
curva padrão, assim como daqueles liberados nas amostras experimentais foram
registradas em absorvância. A partir da determinação dos valores da curva padrão foi
possível converter os valores de todas as amostras e assim determinar a quantidade de
nitrito e nitrato liberados pelas células dos animais dos diferentes grupos.
4.6. Análise Estatística
Para a análise estatística os dados obtidos foram classificados, através do
teste de Kolmogorov-Smirnov como de distribuição normal (dados paramétricos) e não
normal (dados não paramétricos).
Na comparação entre dois grupos (N e D) foi utilizado o teste t de
Student para os dados paramétricos.
Para a comparação entre os diferentes grupos (N, NT, D e DT), foi
empregada a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey para os dados
paramétricos. Para os dados não paramétricos, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis,
seguido do teste de Dunn.
A significância estatística foi considerada, admitindo-se um nível crítico
de 5%, em todos os casos.
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação
Animal do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco e
seguiu as normas sugeridas pelo Comitê Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA).
45
5. RESULTADOS
5.1. Peso corporal durante a desnutrição e a recuperação nutricional
Nos primeiros dias de vida, os pesos (g) corporais dos grupos Nutrido
(N) e Desnutrido (D), expressos em mediana, valores máximos e mínimos, foram,
praticamente semelhantes. A partir do 5o dia até o 21o dia pós-natal, os valores dos
pesos corporais, em gramas, do grupo Desnutrido (33,6:42,8-27,2) foram menores
(p<0,001) do que os do grupo Nutrido (52,5:56,3-24,0). (FIGURA 12).
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
N
D
PESO
Pes
o (g
)
Dias de vida
*
***************
*
FIGURA 12. Acompanhamento do peso corporal durante a desnutrição dos grupos: N e D. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. *=p<0,05
Aos 60 dias de vida, período em que os animais iniciaram o treino,
cada grupo foi subdividido em 2, constituindo-se os grupos: Nutrido (N), Nutrido
Treino (NT), Desnutrido (D) e Desnutrido Treino (DT). Essa diferença (mediana,
valores máximos e mínimos dos pesos corporais dos animais) apresentou-se reduzida
(p<0,05) nos grupos D (248,2:290,2-220,2) e DT (281,3:293,9-251,5) quando
46
comparados aos grupos N (306,2:319,4-219,5) e NT (286,7:310,4-235,3) (FIGURA
13). Contudo, o grupo D comparado ao grupo N, apresentou redução (p<0,05) do peso
corporal ate os 105 dias de vida, período que coincide com o final do treino. Os
animais dos grupos D (325,6:359,3-290,4) e DT (327,9:348,4-290,4) mantiveram o
peso menor (p<0,05) em relação àqueles dos grupos N (349,5:375,6-285,7) e NT
(347,7:398,9-316,5). (FIGURA 13)
0
100
200
300
400
21 60 105
N
NT
D
DT
PESO CORPORAL
Pes
o (g
)
Tempo (dias)
*
*
*
FIGURA 13.Acompanhamento do peso corporal durante a recuperação nutricional. Aos 60 dias os grupos N e D foram subdivididos em: N, NT, D e DT. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. *=p<0,05
FIGURA 14. Efeito da desnutrição neonatal no peso corporal de rato (à direita) após aleitamento.
Fotografia: Deiró, 2004.
47
5.2. Microbiota oral
Antes do início do treinamento, após análise do material coletado dos
ratos em todos os grupos, foi observado que a microbiota oral era composta por
menor número de bactérias no grupo N (4,2 x 106±1,0 x 106) do que no grupo D (7,4
x 106±1,2 x 106), teste t, (p=0,026).
Ao final do treinamento, após análise entre 2 grupos, utilizando o teste
t, não se observou alteração no crescimento bacteriano entre os grupos: N (3,8 x
106±2,1 x 106) e NT (2,5 x 106±1,7 x 106), p=0,193; N (3,8 x 106±2,1 x 106) e D (2,7
x 106±1,1 x 106), p=0,226 e D (2,7 x 106±1,1 x 106) e DT (1,1 x 106±1,1 x 106), p=
0,858.
Estudo pormenorizado para detectar diferenças no crescimento
bacteriano entre os grupos, apenas para os grupos de animais nutridos e desnutridos
evidenciou-se diferença no crescimento bacteriano, teste de Tukey (p<0,05). (FIGURA 15)
FIGURA 15. Crescimento bacteriano segundo estado nutricional e treinamento físico. *=p<0,05
CRESCIMENTO BACTERIANO
0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0
T0 T6
Tempo (semanas)
Nº d
e ba
ctér
ias
x 10
6 / m
L
N
NT
D
DT
*
48
Segundo a ordem das freqüências, as bactérias aeróbias encontradas
foram: Bacillus sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Staphylococcus aureus,
Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Staphylococcus
saprophyticcus, Citrobacter, Escherichia coli e Pseudomonas. (Tab. 4), destas 70%
foram bactérias gram-positivas e 30% bactérias gram-negativas. As bactérias gram-
negativas foram observadas apenas no grupo NT em T6.
Quanto ao número de eventos as bactérias mais freqüente foram o Bacillus sp
e Streptococcus viridans, que apresentaram 57 eventos e a menos freqüente foi a
Enterococcus com 4 eventos.
TABELA 3. Total de colônias em valores absolutos.
GRUPOS/TEMPO
BACTÉRIAS NUTRIDO NUTRIDO
TREINO DESNUTRIDO DESNUTRIDO
TREINO
T0 T6 T0 T6 T0 T6 T0 T6
Gram positivo
Bacillus sp 10 9 9 8 3 7 5 6
Corynebacterium sp 1 2 1 4 1 0 2 1
Enterococcus 1 1 2 0 -- -- -- --
S. aureus 3 2 6 4 5 4 3 2
S. g viridans 9 8 8 7 6 7 6 6
S.coag.neg 6 6 5 1 6 3 4 3
S.saprophyticcus 4 0 1 2 -- -- 0 1
Gram negativo
Citrobacter -- -- 0 1 -- -- -- --
E. coli -- -- 0 1 -- -- -- --
Pseudomonas -- -- 0 1 -- -- -- --
49
5.3. Leucograma
5.3.1. Contagem total de leucócitos (número de células x 103/mm3)
O número total de leucócitos, expressos em mediana, valores máximos e
mínimos foram comparados entre os grupos segundo o estado nutricional e o
treinamento, comparando-se as semanas de treino sempre ao tempo zero (T0).
No T0, o numero total de leucócitos foi similar entre os grupos N
(10,9:13,9-8,3), NT (10,4:11,8-8,8), e DT (10,7:13,9-8,9). Contudo o grupo D
(9,4:11,8-4,3) apresentou redução (p<0,001) em relação aos outros grupos.
No entanto, após a quarta semana de treino (T4), o grupo DT
(16,0:19,8-8,3) apresentou valores maiores (p=<0,05) em comparação ao grupo D
(9,4:11,8-4,3). A partir da quinta semana (T5) os grupos N (14,5:28,9-10,4), NT
(16,3:23,4-10,1) e DT (14,9:19,2-10,4) apresentaram valores mais elevados (p=<0,05)
quando comparados ao grupo D (9,4:11,8-4,3) em T0. Ao final do período de
treinamento (T6), o grupo DT (13,5:28,5-11,9) obteve maior contagem total de
leucócitos (p=<0,05) que D (9,4:11,8-4,3) em T0. (FIGURA 16).
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4 5 6
N
NT
D
DT
LEUCÓCITOS TOTAIS
No d
e cé
lula
s x
103 /
mm
3
Tempo (semanas)
***
FIGURA 16. Contagem total de leucócitos em ratos adultos nos grupos: N, NT, D e DT. O sangue foi obtido 1 hora antes do início do primeiro treino (T0), e 24 horas após o 5o dia de treino em cada semana. Os valores estão expressos em mediana, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. (p< 0,05).
50
5.3.2. Contagem diferencial relativa dos leucócitos ao longo do treinamento (T0 a
T6)
Na tabela 4, estão demonstrados os resultados da contagem diferencial
dos leucócitos (%) que foram expressos em mediana, valores máximos e mínimos,
durante o período de treino (seis semanas), para cada grupo.
Na comparação intergrupos durante o período de treino, verificou-se
que na quarta semana (T4), os valores dos neutrófilos do grupo DT (24,5:34,0-16,0)
mostraram-se mais elevados que os valores do grupo D (16,0:29,0-14,0) em T0. Na
quinta semana (T5) o grupo NT (27,5:38,0-16,0) apresentou-se com valores mais
elevados do que os do grupo N (19,0:25,0-12,0) no mesmo período. O mesmo foi
verificado entre esses grupos na sexta semana (T6), NT (27,5:36,0-10,0) e N
(13,0:24,0-6,0).
Entre os grupos, no período de treinamento, não foram observadas
diferenças nos valores de eosinófilos, exceto, na quinta semana (T5) onde o grupo NT
(5,0:7,0-3,0) mostrou valores mais elevados em relação aos demais grupos, durante a
mesma fase do treino.
Os valores dos linfócitos do grupo D (74,0:80,0-60,0) antes do treino
não diferiram em relação ao grupo N (70,0:80,0-67,0). Todavia, na segunda semana
(T2) o grupo NT (75,5:86,0-58,0) mostrou valores mais elevados que o grupo N
(68,0:76,0-56,0) sem treinamento. Na quarta semana (T4), os valores do grupo DT
(67,5:75,0-56,0) foram inferiores aos do grupo D (72,0:81,0-64,0) sem treinamento e
na sexta semana (T6), o grupo NT (62,5:81,0-53,0) obteve valores mais reduzidos que
os do grupo N (78,0:88,0-63,0). Resultados semelhantes foram obtidos também em
T6, em relação ao grupo D (67,0:74,0-59,0) em comparação ao grupo N (78,0:88,0-
63,0).
51
Os valores dos monócitos não diferiram na comparação intergrupos,
durante as semanas de treino. Entretanto, durante a terceira semana (T3), o grupo NT
(7,0:10,0-2,0) apresentou valores mais elevados que os do grupo N (3,0:9,0-2,0) e na
quinta semana (T5), o grupo DT (8,0:10,0-4,0) apresentou valores maiores em
comparação ao grupo D (5,0:9,0-3,0) sem treinamento. (TABELA 4).
Tabela. Efeito da desnutrição/treino na contagem diferencial dos leucócitos (%) em ratos adultos, entre os grupos: Nutrido (N), Nutrido Treino (NT), Desnutrido (D) e Desnutrido Treino (DT), durante o período de treino Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Comparação entre a contagem diferencial relativa dos leucócitos, Teste de Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Dunn. * = p < 0,05.Tabela. Efeito da desnutrição/treino na contagem diferencial dos leucócitos (%) em ratos adultos, entre os grupos: Nutrido (N), Nutrido Treino (NT), Desnutrido (D) e Desnutrido Treino (DT), durante o período de treino Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Comparação entre a contagem diferencial relativa dos leucócitos, Teste de Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Dunn. * = p < 0,05.
52
TABELA 4. Efeito da desnutrição/treino na contagem diferencial dos leucócitos (%) em ratos adultos, entre os grupos: Nutrido (N), Nutrido Treino (NT), Desnutrido (D) e Desnutrido Treino (DT), durante o período de treino Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Comparação entre a contagem diferencial relativa dos leucócitos, Teste de Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Dunn. * = p < 0,05. LEUCÓCITOS DIFERENCIAIS TEMPO CÉLULAS GRUPOS T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 SEGMENTADOS N 20,0 (11 - 24) 20,0 (15 - 23) 21,0 (16 - 34) 19,0 (13 - 27) 22,0 (10 - 35) 19,0 (12 - 25) 13,0 (6 - 24)* NT 20,0 (13 - 22) 20,0 (12 - 36) 18,0 (11 - 34) 19,5 (13 - 30) 23,0 (14 - 42) 27,5 (16 - 38)* 27,5 (10 - 36)* D 16,0 (14 - 29)* 22,0 (10 - 32) 21,0 (13 - 28) 18,0 (13 - 29) 20,0 (10 - 25) 23,0 (10 - 36) 24,0 (16 - 34) DT 20,5 (10 - 27) 21,5 (15 - 28) 21,0 (12 - 29) 20,0 (15 - 30) 24,5 (16 - 34)* 23,5 (9 - 37) 22,0 (17 - 37) EOSINÓFILOS N 3,0 (2 - 6) 3,0 (2 - 6) 2,0 (1 - 7) 3,0 (2 - 7) 2,0 (2 - 8) 3,0 (2 - 6) 2,0 (1 - 6) NT 3,5 (2 - 8) 4,0 (2 - 6) 3,5 (1 - 6) 2,0 (1 - 5) 2,5 (2 - 4) 5,0 (3 - 7)* 4,0 (2 - 5) D 4,0 (2 - 6) 4,0 (1 - 6) 3,0 (2 - 8) 3,0 (2 - 7) 4,0 (2 - 8) 4,0 (2 - 7) 4,0 (3 - 6) DT 4,0 (1 - 7) 4,5 (2 - 5) 3,0 (2 - 6) 2,5 (2 - 8) 2,5 (2 - 8) 3,0 (2 - 4) 4,0 (3 - 8) LINFÓCITOS N 70,0 (67 - 80) 72,0 (67 - 75) 68,0 (56 - 76) 73,0 (62 - 79) 73,0 (54 - 83) 75,0 (65 - 80) 78,0 (63 - 88)* NT 70,0 (68 - 76) 70,5 (53 - 80) 75,5 (58 - 86)* 69,5 (62 - 80) 67,5 (52 - 81) 65,0 (54 - 75) 62,5 (53 - 81)* D 74,0 (60 - 80)* 70,0 (61 - 84) 69,0 (64 - 80) 70,0 (63 - 82) 72,0 (64 - 81) 69,0 (57 - 84) 67,0 (59 - 74) DT 70,0 (56 - 82) 68,5 (60 - 77) 71,0 (61 - 75) 68,5 (60 - 80) 67,5 (56 - 75) 67,0 (50 - 82) 69,5 (52 - 76) MONÓCITOS N 5,0 (3 - 8) 4,0 (2 - 8) 6,0 (2 - 9) 3,0 (2 - 9)* 5,0 (2 - 9) 4,0 (2 - 7) 5,0 (3 - 9) NT 5,5 (4 - 8) 6,0 (2 - 8) 3,0 (2 - 7) 7,0 (2 - 10)* 6,0 (3 - 9) 4,0 (2 - 7) 6,0 (2 - 10) D 4,0 (3 - 7) 5,0 (3 - 8) 5,0 (2 - 10) 6,0 (2 - 12) 5,0 (2 - 9) 5,0 (3 - 9) 5,0 (2 - 6) DT 4,0 (3 - 9) 5,5 (3 - 10) 6,0 (2 - 8) 6,5 (3 - 12) 4,5 (2 - 8) 8,0 (4 - 10)* 4,5 (2 - 8)
53
As Figuras 17, 18 e 19 demonstram a análise da contagem diferencial dos leucócitos
(%) de cada grupo durante todo o período de treinamento.
5.3.3. Análise percentual de neutrófilos e linfócitos entre os grupos N e NT
Na sexta semana, os valores dos neutrófilos do grupo NT (27,5:36,0-10,0)
apresentaram-se mais elevados em relação ao grupo N (13,0:24,0-6.0) e os valores dos
linfócitos do grupo NT (62,5:81,0-53,0) mostraram-se mais reduzidos quando comparados ao
grupo N (78,0:88,0-63,0). FIGURA 17.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
N/NL/NN/NTL/NT
CONTAGEM DIFERENCIAL Neutrófilos e Linfócitos
No d
e cé
lula
s co
ntad
as (%
)
Tempo (semanas)
*
*
FIGURA 17. Comparação entre Neutrófilos do grupo Nutrido (N/NT) e Neutrófilos do grupo Nutrido Treino (N/NT- T) e entre Linfócitos do grupo Nutrido (L/NT) e Linfócitos do grupo Nutrido Treino (L/NT- T). Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. (*=p<0,05).
3.4. Análise percentual de neutrófilos e linfócitos entre os grupos N e D
Os valores dos neutrófilos do grupo D (24,0:34,0-16,0), na sexta semana,
mostraram-se elevados quando comparados aos do grupo N (13,0:24,0 - 6,0). No mesmo
período, os valores dos linfócitos do grupo D (67,0:59,0-74,0) apresentaram-se reduzidos
54
em relação aos do grupo N (78,0:63,0-88,0). (FIGURA 18)
0
25
50
75
100
0 1 2 3 4 5 6
N/NL/NN/DL/D
No de
célu
las
cont
adas
(%
)CONTAGEM DIFERENCIAL
Neutrófilos e Linfócitos
Tempo (semanas)
*
*
FIGURA 18. Comparações entre os valores de neutrófilos e de linfócitos nos grupam N e D. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN.(*=p<0,05).
5.3.5. Análise percentual de neutrófilos e linfócitos entre os grupos D e DT
Na quarta semana (T4), os valores de neutrófilos do grupo DT (24,5:34,0-
16,0) apresentaram-se elevados em relação ao grupo D (20,0:25,0-10,0) 0-16,0). Nessa
mesma semana, o grupo DT (67,5:75,0-56,0) apresentou valores de linfócitos inferiores aos
do grupo D (72,0:81,0-64,0). (FIGURA. 19).
55
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
N/D
L/D
N/DT
L/DTN
o de
célu
las
cont
adas
(%)
CONTAGEM DIFERENCIAL Neutrófilos e Linfócitos
Tempo (semanas)
*
*
FIGURA 19. Comparações entre os valores de neutrófilos e de linfócitos nos grupos D e DT. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN.(*=p<0,05).
As figuras 20, 21, 22 e 23 referem-se à contagem diferencial de leucócitos (%) intragrupo: N, NT, D e DT. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos em todo o período de treino (T0-T6). Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN.(p<0,05).
5.3.6. Avaliação (intragrupo) do percentual de neutrófilos e de linfócitos do grupo N
em todo período de treino (T0-T6).
Na comparação observa-se que os valores dos neutrófilos mostraram-se
reduzidos em T6 (13,0:24,0-6,0) quando comparados ao T0 (20,0:24,0-11,0). Os valores de
linfócitos em T6 (78,0:88,0-63,0) apresentaram-se mais elevados em comparação ao T0
(70,0:80,0-67,0). (FIGURA 20)
56
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
N/N
L/N
No d
e cé
lula
s co
ntad
as
(%)
CONTAGEM DIFERENCIAL Neutrófilos e Linfócitos
Tempo (semanas)
*
*
FIGURA 20. Contagem diferencial de Neutrófilos (N) e Linfócitos (L) do grupo N. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. (*=p<0,05).
5.3.7. Avaliação (intragrupo) do percentual de neutrófilos e de linfócitos do grupo NT
em todo período de treino (T0-T6).
Os valores dos neutrófilos apresentaram-se mais elevados em T5 (27,6: 38,0-16,0) e
em T2 (18,0:34,0-11,0). Os valores dos linfócitos mostraram-se elevados em T2 (75,5:86,0-
58,0) e reduzidos em T6 (62,5:81,0-53,0). (FIGURA 21).
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
N/NT
L/NT
No d
e cé
lula
s co
ntad
as (%
)
CONTAGEM DIFERENCIAL Neutrófilos e Linfócitos
Tempo (semanas)
*
*
FIGURA 21. Análise de Neutrófilos e Linfócitos do grupo NT. Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. (*=p<0,05).
57
5.3.8. Avaliação (intragrupo) do percentual de neutrófilos e de linfócitos do grupo D
em todo período de treino (T0-T6).
Neste grupo os valores dos neutrófilos apresentaram-se elevados em T6 (24,0:34,0-
16,0) e reduzidos em T0 (16,0:29,0-14,0). Os valores de Linfócitos em T6 (67,0:74,0-59,0)
mostraram-se reduzidos e em T0 (74,0:80,0-60,0) elevados. (FIGURA 22).
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
N/D
L/D
CONTAGEM DIFERENCIALNeutrófilos e Linfócitos
Tempo (semanas)
*
*
FIGURA 22. Contagem diferencial de Neutrófilos (N) e Linfócitos (L) do grupo D. Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. (*=p<0,05).
5.3.9. Avaliação (intragrupo) do percentual de neutrófilos e de linfócitos do grupo DT
em todo período de treino (T0-T6).
Os valores dos neutrófilos apresentam-se elevados em T4 (24,5:34,0-16,0) e
reduzidos em T0 (20,5:27,0-10,0). Os linfócitos não tiveram alteração dos seus valores em
todo o período de treinamento. (FIGURA 23).
58
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
N/DTL/DT
CONTAGEM DIFERENCIAL Neutrófilos e Linfócitos
No de
célu
las
cont
adas
(%)
Tempo (semanas)
*
FIGURA 23. Contagem diferencial de Neutrófilos (N) e Linfócitos (L) do grupo DT. Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. (*=p<0,05)
5.4. Estudo da função de macrófagos alveolares
5.4.1. Taxa de fagocitose de macrófagos do lavado broncoalveolar (LBA)
A taxa de fagocitose de macrófagos alveolares do LBA foi determinada
através do percentual de células (macrófagos) que fagocitaram os fungos (Saccharomyces
sp.). Todos os grupos: N, NT, D e DT foram comparados, durante o período de treinamento
(T0-T6). Valores expressos em medianas, valores máximos e mínimos. Teste KRUSKAL-
WALLIS, seguido de DUNN.
Os animais do grupo D (26,0:30,0-17,0) apresentaram valores menores
(p<0,005) quando comparados ao grupo N (30,0:34,0-28,0) . O treinamento promoveu
aumento (p<0,001) da taxa de fagocitose no grupo NT (38,0:48,0-29,0) em relação ao grupo
N (30,0:34,0-28,0). Este aumento também foi verificado no grupo DT (31,0:37,0-23,0) em
comparação ao D (26,0:30,0-17,0). (FIGURA 24).
59
FIGURA 24. Efeito da desnutrição neonatal e do treinamento sobre a taxa de fagocitose em macrófagos alveolares de ratos adultos. Grupos: N, NT, D e DT. Teste KRUSKAL-WALLIS, seguido de DUNN. Valores expressos em mediana, valores máximos e mínimos. (*=p<0,05).
5.4.2. Produção de Óxido Nítrico (NO) por macrófagos alveolares
Produção de NO intergrupos estimulados ou não com LPS, avaliada durante
todo o período de treino (T0-T6). Valores (µmols/mL) expressos em Média ± Erro Padrão
(EP).
Os grupos que não foram tratados com LPS, constituíram-se da seguinte
forma: Nutrido sem LPS (N S/LPS), Nutrido Treino sem LPS (NT S/LPS), Desnutrido sem
LPS (D S/LPS) e Desnutrido Treino sem LPS (DT S/LPS). Na comparação intergrupos, em
relação aos que não foram estimulados com LPS, o NT liberou uma quantidade de NO mais
elevada quando comparado ao N. Entretanto entre os grupos D e DT, a produção foi menor
em DT que em D. Contudo entre os grupos D e N, a produção de NO foi praticamente
semelhante (FIGURA 25).
Os grupos que receberam tratamento com LPS foram, assim, constituídos:
Nutrido com LPS (N C/LPS), Nutrido Treino com LPS (NT C/LPS), Desnutrido com LPS
(D C/LPS) e Desnutrido Treino com LPS (DT C/LPS). Ao se comparar esses grupos entre
0
10
20
30
40
50
NNTDDT
Grupos
FAGOCITOSE
Taxa
de
fago
cito
se (%
)
(28-
34)
(29-
48)
(17-
30)
(23-
37)
*
60
si, em relação aos que foram estimulados com LPS, o NT liberou uma quantidade de NO
maior que o N. Entretanto entre os grupos D e DT, a produção de NO não foi alterada.
Todavia, a produção nesses grupos (D e DT), foi inferior à do grupo N. (FIGURA 26).
O LPS serviu como estímulo sendo, portanto, o controle positivo. O grupo
N/LPS produziu mais (96,4±3,6) NO (p<0,001) que o grupo N S/LPS (82,4±3,4) (FIGURA
27). A produção de NO do grupo Nutrido Treino e tratado com LPS (107,5±1,9) foi maior
que no grupo Nutrido e tratado com LPS (96,4±3,6) (FIGURA 27). Ambos, mostraram-se
com produção mais elevada em relação ao grupo Nutrido e sem tratamento com LPS
(82,4±3,4). Nos animais desnutridos, o treinamento físico não alterou a produção de NO dos
macrófagos após tratamento com o LPS. Nos grupos: D (84,5±3,6) e DT (84,6±4,7) tratados
com LPS a quantidade de NO produzida foi semelhante entre os dois grupos. (FIGURA 27).
0
20
40
60
80
100
120
NNTDDT
ÓXIDO NÍTRIICO S/LPS
Prod
ução
de
óxid
o ní
tric
o (µ
mo/
mL) **
Grupos
FIGURA 25. Produção de óxido nítrico sem LPS por macrófagos alveolares. Grupos: Nutrido sem LPS (N S/LPS), Nutrido Treino sem LPS (NT S/LPS), Desnutrido sem LPS (D S/LPS) e Desnutrido Treino sem LPS (DT S/LPS). Valores expressos em média ± EP. Teste ANOVA, seguido de TUKEY (p=0,05).
61
0
20
40
60
80
100
120
NNTDDT
ÓXIDO NÍTRICO C/LPS
Prod
ução
de
óxid
o ní
tric
o (µ
mol
/mL)
**
Grupos
FIGURA 26. Produção de óxido nítrico com LPS por macrófagos alveolares. Grupos: Nutrido com LPS (N C/LPS), Nutrido Treino com LPS (NT C/LPS), Desnutrido com LPS (D C/LPS) e Desnutrido Treino com LPS (DT C/LPS). Valores expressos em média ± EP. Teste ANOVA, seguido de TUKEY (p=0,05).
0
20
40
60
80
100
120
140
N S/LPSN C/LPSNT C/LPSD C/LPSDT C/LPS
ÓXIDO NÍTRICO
Grupos
Prod
ução
de
óxid
o ní
tric
o (µ
mol
/mL)
**
FIGURA 27. Produção de óxido nítrico por macrófagos alveolares segundo a desnutrição e o treinamento físico após estímulo com LPS. Grupos: Nutrido sem LPS (N S/LPS), Nutrido com LPS (N C/LPS), Nutrido Treino com LPS (NT C/LPS), Desnutrido com LPS (D C/LPS) e Desnutrido Treino com LPS (DT C/LPS). Valores expressos em média ± EP. Teste ANOVA, seguido de TUKEY (p=0,05).
62
6. DISCUSSÃO
No presente estudo, utilizou-se modelo de desnutrição imposta no período
de aleitamento, seguida de recuperação nutricional, com todas as avaliações sendo
realizadas na vida adulta do animal. Assim, nesse estudo, a desnutrição ocorrida
precocemente causou déficit no peso corpóreo, levando ao retardo da evolução ponderal no
período de aleitamento. Estes dados corroboram com aqueles obtidos por Queirós-Santos
(2000); Wanderley (2001); Lopes (2001) e Ferreira e Silva (2002), que empregaram a dieta
básica regional (DBR), deficiente em todos os seus constituintes (TEODÓSIO et al, 1990)
como modelo experimental de desnutrição. Apesar dos diferentes modelos experimentais de
desnutrição usados, neste e nos estudos supracitados, a deficiência de proteínas (caseína)
utilizada foi suficiente para causar desnutrição. A dieta de caseína a 8% usada no presente
estudo é caracterizada como hipoprotéica, e provoca alteração no teor protéico do leite de
lactantes que a ingere. Este parece ser um fator determinante na gênese de seus efeitos
deletérios observados na prole.
A desnutrição ocorrida neste período também afetou o peso corporal dos
animais na idade adulta. Inclusive, a oferta da dieta equilibrada (Labina) a partir do
desmame, parece não ter sido eficiente em recuperar a deficiência de peso originada ainda
na amamentação. Esses resultados estão em concordância àqueles de Barreto-Medeiros
(1998); Queirós-Santos (2000); Wanderley (2001) e Ferreira e Silva (2002), os quais
verificaram a permanência do déficit ponderal em animais de até 90 dias de idade,
verificando permanência do déficit ponderal. Tais resultados ainda estão de acordo com os
de Katz e Davies (1982) e Rotta et al (1988), que também encontraram redução do peso
corporal verificada, inclusive, até a idade adulta. Portanto, o uso de dieta hipoprotéica a
base de proteína animal (caseína) na concentração de 8%, por lactantes durante o período de
63
aleitamento, modificou o teor protéico do leite materno e levou a ocorrência de déficit
ponderal dos filhotes tanto no período de lactação quanto na idade adulta após recuperação.
Os estudos relacionados à desnutrição precoce são escassos, sobretudo
aqueles que avaliam os efeitos da restrição protéica no período de lactação (PINE et al,
1994). Alguns autores relatam alteração na concentração protéica do leite por restrição do
suprimento de aminoácidos necessários para a síntese de proteína do leite (GRIGOR et al,
1987). Neste estudo, o período no qual a agressão nutricional foi conduzida é caracterizado
por um intenso processo de crescimento e desenvolvimento orgânicos, o que demanda
aumento das necessidades de calorias e proteínas. (BROW e POLLITI, 1996). Os efeitos da
restrição protéica durante o período de aleitamento foram demonstrados em ratos desde o
quarto dia de vida pós-natal (JOHNSON et al, 1991; REYNOLDS et al, 1992). De modo
similar, os resultados obtidos neste trabalho também demonstraram redução do ganho de
peso durante o aleitamento a partir do quinto dia de vida pós-natal quando as mães
receberam dieta experimental hipoprotéica.
Em relação à análise da microbiota da cavidade oral dos animais, neste estudo,
o grupo Desnutrido (D), antes do período de treinamento apresentou maior número de
bactérias quando comparado ao grupo Nutrido (N). Esta elevação pode ter sido conseqüente a
manipulação nutricional sofrida no período de aleitamento. A microbiota oral sofre alterações
significativas decorrentes de modificações sofridas nos fatores externos, ou aqueles
relacionados ao hospedeiro e ou às bactérias (LINDHE, 1992; TOTTI et al., 1996; KOLLER
et al., 2000b; DARBY e CURTIS, 2001; PASTER et al, 2001; GUTIÉRREZ-PÉREZ et al.,
2004; SOCRANSKY e HAFFAJEE, 2005).
A desnutrição precoce sofrida no grupo de animais pesquisados pode ter sido
um dos fatores que levou a alteração na composição dessa microbiota. A maioria destes
64
microrganismos que compõem a microbiota pode ser encontrada na cavidade oral de
indivíduos saudáveis.
Portanto, em conseqüência de alterações em determinados fatores, podem
ocorrer desequilíbrio entre a microbiota e o hospedeiro. Tal fato predispõe a instalação de
processos inflamatórios e/ou infecciosos (SWARTZ; GIBBONS; SOCRANSKY, 1996;
MARCOTTE; LAVOIE, 1998; TORTORA; FUNKE; CASE, 2000; RODRIGUES;
NEWMAN, 2002; YE et al., 2003). Apesar de neste trabalho ter havido manutenção
qualitativa do padrão de normalidade da microbiota em todos os grupos pesquisados,
observou-se uma maior quantidade de bactérias no grupo de animais desnutridos e isto pode
proporcionar desequilíbrio entre as bactérias da microbiota e o hospedeiro. Totti et al (1996),
Yao; Lamont; Leu (1996), Chow (2000) e Darby; Curtis (2001) afirmaram que são vários os
fatores que contribuem para mudanças na composição da microbiota como: determinadas
características genéticas e raciais, idade, maturidade do sistema imune, dieta, puberdade,
erupção dos dentes decíduos e permanentes, higiene oral, cárie, enfermidade periodontal ou
infecção, diminuição do fluxo salivar e uso de medicações. O treinamento físico moderado foi
inábil para reverter essa alteração quantitativa da microbiota.
Neste estudo, a ordem das freqüências das bactérias aeróbias encontradas foi:
Bacillus sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, Streptococcus
viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Staphylococcus saprophyticcus, Citrobacter,
Escherichia coli e Pseudomonas. Destas, 70% foram de bactérias gram-positivas e 30% de
bactérias gram-negativas. Tais percentuais indicam que a prevalência encontrada para as
bactérias foi a mesma encontrada na microbiota normal para todos os grupos. Estes dados são
concordantes com outros estudos (KOLLER ET AL., 2000) que referem até 80% de bactérias
gram-positivas na microbiota normal da cavidade oral. Quanto ao número de eventos a
bactéria mais freqüente foi o Bacillus sp. e Streptococcus viridans que apresentaram 57
65
eventos e a menos freqüente foi a Enterococcus com 4 eventos. Estes dados são semelhantes
aos observados em outros trabalhos (RODRIGUES e NEWMAN, 2002; SOCRANSKY e
HAFFAJEE; 2005; TORTORA et al, 2000; PASTER et al, 2001; YE et al, 2003). De acordo
com Trabulsi (1986) a microbiota da cavidade oral é muito diversificada e estima-se que a
saliva contém em torno de 108 bactérias/mL. Neste estudo, os resultados encontrados sobre o
crescimento bacteriano foram menores, na ordem de 106/mL e este achado, provavelmente,
pode ser explicado pelo fato de não ter sido incluída a pesquisa de bactérias anaeróbias.
Eventos importantes para a imunocompetência são iniciados ainda no embrião
e continuam durante a primeira semana de vida (GOBEL, 1996). Esse período é marcado pela
rápida expansão da população de leucócitos e formação de órgãos linfóides (KLASING,
1998). Do ponto de vista experimental, a desnutrição provoca alterações estruturais e
funcionais no sistema nervoso (PICANÇO-DINIZ, et al, 1998) podendo alterar os elementos
que estruturam o eixo HPA participantes da resposta imune (BOXWELL et al, 1995).
O sistema imune é o sistema de defesa orgânico e os leucócitos são as suas
células efetoras. A contagem total e diferencial dessas células no sangue periférico pode
demonstrar, de forma indireta, o seu estado de ativação. No presente estudo, o número total de
leucócitos foi comparado entre os grupos e intragrupo, segundo o estado nutricional e o
treinamento físico. Antes de iniciar o treino, o número total de leucócitos apresentou redução
apenas no grupo de animais que sofreram de desnutrição no período neonatal. O treinamento
na idade adulta foi benéfico uma vez que, proporcionou aumento na contagem total de
leucócitos tanto para os animais do grupo nutridos como para os animais do grupo
desnutridos.
Quanto à contagem diferencial dos leucócitos antes de iniciar o treinamento, os
animais do grupo submetido à desnutrição neonatal tinham os valores de neutrófilos reduzidos
66
e houve aumento do número destas células após o treinamento, aproximando-se de valores
mais compatíveis com a condição de animais nutridos ao longo da vida. (TABELA 4)
Para os linfócitos, antes do treino, os valores no grupo de animais desnutridos
foram maiores em relação aos demais grupos. Porém, na quarta, quinta e sexta semanas, após
o início do treinamento físico, o grupo de animais desnutridos e submetidos ao treinamento
tinham valores reduzidos e esta condição é condizente com a de animais nutridos. Antes do
inicio do treinamento os valores dos monócitos foram semelhantes entre todos os grupos.
Após o treinamento, os valores dessas células mostraram-se mais elevados no grupo de
animais desnutridos em relação aos outros grupos.
A desnutrição precoce mesmo seguida de um longo período de recuperação
nutricional provoca na vida adulta, alteração no número e os tipos das células de defesa do
organismo. Este dado pode contribuir para uma falha na resposta de defesa. Segundo Chandra
(1997), a desnutrição deixa ineficaz a resposta do hospedeiro no combate aos agentes
infecciosos. O treinamento protegeu os animais dessas alterações demonstrando valores
compatíveis aos do padrão de normalidade ao final do período de treino. Nos animais
treinados ocorreram alterações adicionais no percentual de leucócitos do sangue. Essa
modificação do número total de leucócitos em resposta ao treino, corrobora com os estudos de
Kim et al (2003) com ratos submetidos ao treino moderado durante 8 semanas, acarretaram
alteração na concentração de células imunes. Na contagem diferencial de
leucócitos, o treino provocou um aumento dos neutrófilos, enquanto que os valores dos
linfócitos apresentaram-se reduzidos, sobretudo após cinco semanas de treino nos grupos NT
e DT. Também neste mesmo período, os valores dos eosinófilos e dos monócitos, mostraram-
se elevados.
O impacto da desnutrição precoce revelou alterações na contagem total e
diferencial de leucócitos, assim como na atividade e função destas células. A desnutrição
67
reduz a imunidade em geral, sobretudo, provoca alterações no pulmão, comprometendo a
função dos macrófagos alveolares. Chandra (1989) observou que a desnutrição modifica
diferentes etapas do processo fagocítico (migração e aderência celular), principalmente em
neutrófilos e macrófagos ativados. Todavia, vale ressaltar que as agressões nutricionais
podem comprometer os mecanismos efetores imunes dependentes da ativação de macrófagos.
Com relação à função dos fagócitos, a deficiência nutricional imposta na
lactação reduziu a taxa de fagocitose em ratos adultos. Nesse estudo, a atividade fagocítica de
macrófagos alveolares de ratos treinados foi alterada, evidenciando-se valores mais elevados
para o grupo nutrido e treinado. Estes resultados discordam dos de Woods et al (2000) ao
realizarem um estudo com macrófagos peritoniais de ratos treinados. Por outro lado,
concordam com os achados de Bacurau et al (2000) ao verificarem aumento da atividade
fagocítica de macrófagos peritoniais de ratos após treino moderado em tapete rolante (8
semanas, 5 dias/sem, 60 min/dia a 60% do VO2 máx.). Nascimento et al (2004) utilizando
outro tipo de treinamento físico, animais submetidos à natação (45 min/dia, durante 6
semanas), também observou aumento na atividade fagocítica de macrófagos alveolares
(estimulados com fungos). Os resultados encontrados podem estar relacionados às variáveis
experimentais envolvidas no estudo, tais como: protocolo experimental de treino utilizado, ao
tipo de célula estudada, ao tipo de estímulo empregado e ao tempo de cultura dos macrófagos
(FEHR et al, 1989).
O treinamento, no entanto promoveu aumento dessa taxa nos grupos de
animais nutridos e desnutridos. Existem fortes evidências de que o exercício físico promove
melhorias nos mecanismos fisiológicos e benefícios à saúde (NIEMAN, 2000), sobretudo o
treinamento físico de intensidade moderada que induz melhora na dinâmica e na função de
células imunes (NEHLSEN – CANARELLA, 1998; PYNE E GLEESON, 1998; PEDERSEN
e HOFFMAN-GOETZ, 2000). O exercício físico pode promover alterações transitórias e
68
persistentes nos sistemas fisiológicos dependentes da intensidade, duração, freqüência e
esforço realizado (PEDERSEN e HOFFMAN-GOETZ, 2000), essas alterações quando
transitórias, retornam aos valores basais em 24h após o esforço.
No sistema imune, dois mecanismos parecem estar associados ao exercício
físico regular: alteração nas populações e alteração na função de células imunocompetentes
(PEDERSEN e HOFFMAN-GOETZ, 2000). Segundo Nieman (2000), os efeitos positivos do
exercício físico crônico moderado no sistema imune são apenas percebidos quando este
sistema é ativado. Contudo, em longo prazo, considera-se proteção a infecções,
imunodepressão induzida por estresse e por doenças crônico-degenerativas (PEDERSEN e
HOFFMAN-GOETZ, 2000). Bacurau et al (2000) demonstraram que o treinamento físico
pode retardar a proliferação de tumores induzidos quimicamente, tumores implantados e
tumores espontâneos.
Avaliando-se a função dos fagócitos através de um outro parâmetro, produção
de óxido nítrico por células estimuladas com LPS, uma vez que o LPS é uma endotoxina
liberada a partir da parede de bactérias gram-negativas e ótimo estimulador de macrófagos,
neste estudo, observou-se que o grupo de animais nutridos produziu mais óxido nítrico
quando comparado a produção das células dos animais desnutridos. O treinamento físico
aumentou a produção de óxido nítrico no grupo de nutridos tratados com LPS. Porém, nos
animais desnutridos, o treinamento físico não alterou a produção de óxido nítrico dos
macrófagos após tratamento com o LPS.
Vale salientar a importância da adequação nutricional durante os períodos
críticos do desenvolvimento às necessidades dos sistemas que interagem mutuamente como o
sistema imune, o sistema nervoso e o sistema endócrino. Todos estes são muito susceptíveis à
deficiência de nutrientes.
69
As conseqüências da desnutrição são diversas e multifatoriais, sendo assim, os
mecanismos que influenciam o sistema imune implicam numa tarefa complexa e bastante
discutível (Queirós-Santos, 2000). De acordo com Scrimshaw e Sangiovanni (1997) a
imunidade inespecífica e a mediada por células são sensíveis à deficiência de nutrientes. É
bem conhecida a depressão da imunidade celular durante a desnutrição (CHANDRA, 1992).
Estes dados sugerem fortemente que o treinamento físico como modulador da
resposta imune atenua significativamente a intensidade das respostas orgânicas à situação de
desnutrição, uma vez que alterou os parâmetros imunes avaliados, dando algum tipo de
proteção imunitária. As células do sistema imunológico parecem apresentar mecanismos
adaptativos que permitem a melhoria da sua funcionalidade em resposta ao exercício físico
regular e de intensidade moderada.
Os estudos que relacionam o impacto da desnutrição precoce sobre os
mecanismos de defesa orgânicos são escassos, fazem-se necessários mais estudos
complementares para avaliar ou esclarecer aspectos que não foram contemplados nesta
pesquisa.
70
7. CONCLUSÕES
A desnutrição no período de lactação seguida de recuperação nutricional
acarreta na vida adulta do animal:
. Redução do peso corporal a partir do 5o dia de vida pós-natal mantendo-se
até a vida adulta.
. Alteração da microbiota oral com aumento da quantidade de bactérias,
porém, não havendo interferência no padrão de normalidade dos tipos de bactérias,
prevalecendo os eventos referentes às bactérias aeróbias gram-positivas.
. Alteração na contagem das células sanguíneas, com redução do número
total de leucócitos e neutrófilos e elevação do número de linfócitos.
. Alteração da função das células fagocitárias, com redução da atividade
fagocítica e da produção de óxido nítrico.
O treinamento físico moderado:
. Não teve efeito sobre a microbiota dos animais nutridos.
. Promoveu recuperação nutricional mais rápida nos animais desnutridos.
. Elevou o número total de leucócitos tanto nos animais nutridos quanto nos
animais desnutridos precocemente.
. Nos desnutridos, aumentou neutrófilos mais tardiamente e esse aumento foi
mais intenso. Nos nutridos, houve elevação do número de eosinófilos e de monócitos,
porém, essa situação não foi encontrada na desnutrição.
. Melhorou a função dos macrófagos com normalização da atividade
fagocítica, porém, não da produção de óxido nítrico.
71
PERSPECTIVAS
O presente estudo suscitou o interesse para investigações adicionais sobre a
desnutrição precoce e o exercício físico leve, intenso, agudo e crônico.
Estas situações poderão ser estudadas avaliando-se:
Produção de superóxido pelas células fagocitárias;
Índice de adesividade dessas células;
Análise de subpopulações linfocitárias;
Análise da microbiota oral de ratos neonatos e idosos;
Glicogênio muscular e ácido lático nas diferentes situações de treinamento;
Analise da concentração de hormônios envolvidos no eixo HPA como
corticosterona e hormônio do crescimento.
72
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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10. ANEXOS
Publicações e trabalhos desenvolvidos
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