Universidade Federal de Pernambuco - UFPE€¦ · in: iin:n: in: Tocando em Frente Almir Sater e...

Programa de Pós-Graduação em Genética Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Ciências Biológicas Departamento de Genética

Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio cholerae O26, Isoladas de Processos Entéricos Humanos no

Nordeste do Brasil

Francisco André Marques de Oliveira Cariri

RECIFE – PE 2008

Francisco André Marques de Oliveira Cariri

Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio cholerae O26, Isoladas de Processos Entéricos Humanos no Nordeste do Brasil

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética da Universidade Federal

de Pernambuco, como parte dos requisitos

necessários para a obtenção do grau de Mestre em

Genética.

Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Pompílio de Melo

Neto, Depto. de Microbiologia, Centro de Pesquisas

Aggeu Magalhães, CPqAM – FIOCRUZ.

Co-Orientadora: Profa. Dra. Nilma Cintra Leal ,

Depto. de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu

Magalhães, CPqAM – FIOCRUZ.

RECIFE – PE ABRIL, 2008

Cariri, Francisco André Marques de Oliveira

Caracterização molecular de cepas de Vibrio

cholerae O26, isoladas de processos entéricos

humanos no nordeste do Brasil. / Francisco André

Marques de Oliveira Cariri. – Recife: O Autor, 2008.

90 fls. .: il.

Dissertação (Mestrado em Genética) – UFPE. CCB

1. Vibrio cholerae 2. Filologia 3. Cólera

I.Título

575.86 CDU (2ª. Ed.) UFPE

576.88 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 –065

Universidade Federal de Pernambuco Programa de Pós-Graduação em Genética

PARECER DA COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE FRANCISCO ANDRÉ MARQUES DE OLIVEIRA CARIRI

“Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio cholerae O26, Isoladas de Processos Entéricos Humanos no Nordeste do

Brasil”

Área de Concentração: BIOLOGIA MOLECULAR

RECIFE - PE 2008

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Abidias e Maria, queAos meus pais, Abidias e Maria, queAos meus pais, Abidias e Maria, queAos meus pais, Abidias e Maria, que,,,,

acreditando no meu potencial, me prepararam acreditando no meu potencial, me prepararam acreditando no meu potencial, me prepararam acreditando no meu potencial, me prepararam

para a vida. Elespara a vida. Elespara a vida. Elespara a vida. Eles são exemplos e são exemplos e são exemplos e são exemplos e estímuloestímuloestímuloestímulossss

paraparaparapara a longa a longa a longa a longa e contínua e contínua e contínua e contínua caminhadacaminhadacaminhadacaminhada;;;;

E à Carol E à Carol E à Carol E à Carol por todo carinho, apoio e por todo carinho, apoio e por todo carinho, apoio e por todo carinho, apoio e

compreensãocompreensãocompreensãocompreensão, aceitando ter, aceitando ter, aceitando ter, aceitando ter----memememe pela metade pela metade pela metade pela metade

durante durante durante durante a realização deste trabalhoa realização deste trabalhoa realização deste trabalhoa realização deste trabalho....

Sonhar, Sonhar, Sonhar, Sonhar, mmmmais um sonho impossível,ais um sonho impossível,ais um sonho impossível,ais um sonho impossível, Lutar, Lutar, Lutar, Lutar, qqqquando é fácil ceder,uando é fácil ceder,uando é fácil ceder,uando é fácil ceder, Vencer, Vencer, Vencer, Vencer, oooo inimigo invencível. inimigo invencível. inimigo invencível. inimigo invencível. Negar, Negar, Negar, Negar, qqqquanuanuanuando a regra é vender...do a regra é vender...do a regra é vender...do a regra é vender... Voar, Voar, Voar, Voar, nnnno limite improvável.o limite improvável.o limite improvável.o limite improvável. Tocar o inacessível chão...Tocar o inacessível chão...Tocar o inacessível chão...Tocar o inacessível chão... E assim seja lá como for,E assim seja lá como for,E assim seja lá como for,E assim seja lá como for, Vai ter fim a infinita afliçãoVai ter fim a infinita afliçãoVai ter fim a infinita afliçãoVai ter fim a infinita aflição E o mundo vai ver uma florE o mundo vai ver uma florE o mundo vai ver uma florE o mundo vai ver uma flor BrotarBrotarBrotarBrotar d d d do impossível chão.o impossível chão.o impossível chão.o impossível chão. iiiin: n: n: n: Sonho Impossível de Chico Buarque e Rui Guerrade Chico Buarque e Rui Guerrade Chico Buarque e Rui Guerrade Chico Buarque e Rui Guerra

... ... ... ... Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabeHoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabeHoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabeHoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe Só levo a certeza de que muito pouco eu seiSó levo a certeza de que muito pouco eu seiSó levo a certeza de que muito pouco eu seiSó levo a certeza de que muito pouco eu sei Ou nada seiOu nada seiOu nada seiOu nada sei Penso que cumprir a vida seja simplesmentePenso que cumprir a vida seja simplesmentePenso que cumprir a vida seja simplesmentePenso que cumprir a vida seja simplesmente Compreender a marcha e ir tocando em frente...Compreender a marcha e ir tocando em frente...Compreender a marcha e ir tocando em frente...Compreender a marcha e ir tocando em frente... ... Cada um de nós compõe ... Cada um de nós compõe ... Cada um de nós compõe ... Cada um de nós compõe a sua históriaa sua históriaa sua históriaa sua história Cada ser em si carrega o dom de ser capazCada ser em si carrega o dom de ser capazCada ser em si carrega o dom de ser capazCada ser em si carrega o dom de ser capaz E ser felizE ser felizE ser felizE ser feliz ... É preciso amor pra poder pulsar,... É preciso amor pra poder pulsar,... É preciso amor pra poder pulsar,... É preciso amor pra poder pulsar, É preciso paz pra poder sorrir,É preciso paz pra poder sorrir,É preciso paz pra poder sorrir,É preciso paz pra poder sorrir, É preciso a chuva para florirÉ preciso a chuva para florirÉ preciso a chuva para florirÉ preciso a chuva para florir in: in: in: in: Tocando em Frente Almir Sater e Renato TeixeiraAlmir Sater e Renato TeixeiraAlmir Sater e Renato TeixeiraAlmir Sater e Renato Teixeira

“O processo criativo científico não é assim tão diferente do processo criativo das artes“O processo criativo científico não é assim tão diferente do processo criativo das artes“O processo criativo científico não é assim tão diferente do processo criativo das artes“O processo criativo científico não é assim tão diferente do processo criativo das artes, isto é, um veículo , isto é, um veículo , isto é, um veículo , isto é, um veículo de autodescoberta que se manifesta ao tentarmos capturar a nossa essência e lugar no universo.” de autodescoberta que se manifesta ao tentarmos capturar a nossa essência e lugar no universo.” de autodescoberta que se manifesta ao tentarmos capturar a nossa essência e lugar no universo.” de autodescoberta que se manifesta ao tentarmos capturar a nossa essência e lugar no universo.” in: in: in: in: A Dança do Universo Marcelo GleiserMarcelo GleiserMarcelo GleiserMarcelo Gleiser

AGRADECIMENTOS

A Deus pela minha saúde, pela minha família, pelos meus amigos e por permitir que eu realize meus sonhos;

Aos meus orientadores, Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto e Dra. Nilma Cintra Leal, pela oportunidade, pela confiaça, pela paciência, pelo incentivo, pelos ensinamentos, pelos conselhos e, sobretudo, pela amizade. Por eles tenho a mais sincera admiração pelo brilhantismo acadêmico e um profundo respeito. Serei sempre grato pelas orientações científicas criteriosas e críticas que muito contribuíram para a minha formação.

Às doutoras Alzira, Cris e Marise (mãe de Luise) pela consideração, pela amizade e pelos ensinamentos diários;

Aos colegas de bancada (Alexandra Farias, Ana Paula Campos, Betânia, Bruna Caiado, Carlos Júnior, Érika Costa, Gerlane Souza, Maria Adelaide Barbosa, Maria Paloma Barros, Mirele Araújo, Patrícia Rosa, Rosanny Benevides e especialmente à Ana Paula Costa, Camylla Melo, Carina Mendes, Christian Reis - Negão, Danielle Moura - Danona, Éden Freire, Eduardo Nunes, Dr. Franklin Magalhães, Isabelle Luz, Dr. José Ronnie Vasconcelos, Larissa Nascimento, Mariana Andrade, Mariana Marques Pereira [companheira de disciplinas do mestrado], Mariana Palma, Marília Nascimento, Patrícia Toniolo, Rafaela Andrade, Rodrigo Lima, Tamara De' Carli Lima, Vladimir Silveira Filho, Wagner Oliveira e Wellington Silva) pelas experiências trocadas e por compartilharmos o dia-a-dia. Aos amigos do Departamente de Entomologia;

À Dra. Cássia Docena pela ajuda com o seqüenciamento e pela constante troca de idéias; e ao Dr. Valdir Balbino pelas valiosas dicas de bioinformática;

Aos funcionários do Departamento de Microbiologia (Bruna Lima, Cláudio Araújo, Edson Dantas, Fernanda Melo, Isaac Martins - Martináutico, José Dantas, Kátia Farias, Marcos Marques, Nélson Santos, Patrícia Silva, Tarcísio Oliveira, Rita Silva, Silvana Santos e Yara Nakazawa) pela ajuda substancial e pela paciência. À Bruna e Raimundo pelo suporte técnico fotográfico.

Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – FIOCRUZ por ser minha segunda casa, durante esses nove anos, onde encontrei minha vocação e aprendi que vale a pena investir cada segundo naquilo que gostamos de fazer;

Aos órgãos de fomento (CNPq, CAPES, FACEPE e FIOCRUZ), pela bolsa concedida e pelo apoio financeiro para realizar os nossos experimentos;

Aos doutores Antonio Carlos e Valdir Balbino, membros da pré-banca, pelas sugestões dadas à esta dissertação;

Aos amigos do CCB, em especial, Adri, Airton, Plínio, Pabyton e Wal;

À minha família e à “Carolinda” pelo apoio incondicional, pelo incentivo e pelos conselhos, quando necessário;

E a todos que não foram citados, mas que foram igualmente importantes nesta jornada.

ÍNDICE

TABELA.....................................................................................................................VIII

LISTA DE FIGURAS................................................................................................... IX

LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................X

RESUMO GERAL ....................................................................................................XIII

ABSTRACT ............................................................................................................... XIV

1 – INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15

2 – OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 17

2.1 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................. 17

3 – REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 18

3.1 – CÓLERA............................................................................................................ 18

3.1.1 – SINTOMAS, TRANSMISSÃO E TRATAMENTO ................................ 18

3.1.2 – EPIDEMIOLOGIA DA CÓLERA............................................................ 19

3.1.3 – HISTÓRICO DA CÓLERA...................................................................... 20

3.1.4 – DIAGNÓSTICO DA CÓLERA................................................................ 23

3.2 – AGENTE ETIOLÓGICO................................................................................... 25

3.2.1 – ECOLOGIA DO Vibrio cholerae.............................................................. 25

3.2.1.1 – RESERVATÓRIO AMBIENTAL ...................................................... 26

3.2.1.2 – ESTADO VIÁVEL MAS NÃO CULTIVÁVEL................................ 27

3.2.2 - FATORES DE VIRULÊNCIA .................................................................. 29

3.2.2.1 – A VPI................................................................................................... 29

3.2.2.2 – O PROFAGO CTXφ............................................................................ 30

3.2.2.3 – OUTROS FATORES DE VIRULÊNCIA........................................... 32

3.2.3 – TAXONOMIA DO DOMÍNIO BACTÉRIA............................................ 33

3.2.3.1 – FAMÍLIA VIBRIONACEAE ............................................................. 33

3.2.3.2 – GÊNERO Vibrio.................................................................................. 34

3.2.4 – ESPÉCIE Vibrio cholerae......................................................................... 35

3.2.4.1 – CLASSIFICAÇÃO ANTIGÊNICA .................................................... 35

3.2.4.2 – Vibrio cholerae O1 .............................................................................. 37

3.2.4.3 – Vibrio cholerae O139 .......................................................................... 37

3.2.4.4 – Vibrio cholerae NÃO-O1/ NÃO-O139 ............................................... 38

3.2.4.5 – Vibrio cholerae O26 ............................................................................ 38

3.2.5 – MÉTODOS MOLECULARES USADOS NA CLASSIFICAÇÃO

BACTERIANA ......................................................................................... 39

3.2.6 – OS GENES DE rRNA COMO MARCADORES MOLECULARES....... 39

3.2.7 – REGIÃO ESPAÇADORA INTERGÊNICA DO rRNA 16S-23S ............ 41

4 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 44

5 – ARTIGO CIENTÍFICO A SER SUBMETIDO................................................... 56

RESUMO ................................................................................................................... 57

INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 58

MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 60

RESULTADOS .......................................................................................................... 63

DISCUSSÃO.............................................................................................................. 68

TABELAS .................................................................................................................. 71

FIGURAS ................................................................................................................... 72

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 79

6 – INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES........................................................... 83

7 – CONCLUSÕES....................................................................................................... 84

8 – ANEXO.................................................................................................................... 85

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... VIII

TABELA

Página

Tabela 1 – Métodos moleculares usados para classificar Vibrio cholerae............................................................................................................................... 40

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... IX

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 – Paciente apresentando sinais típicos da forma grave da cólera ......................... 18

Figura 2 – Esquema evidenciando: A - A secreção da CT no lúmen intestinal; B - O aumento da concentração intracelular de cAMP; C - A secreção de sódio, cloro e água do meio intracelular para o lúmen ....................................................................................... 19

Figura 3 – Número de casos de cólera no Mundo e taxa de mortalidade, entre 1991 e 2006 ..................................................................................................................................... 21

Figura 4 – Distribuição da cólera no Brasil, entre 1990 e 1996, evidenciando a rota da epidemia ............................................................................................................................... 22

Figura 5 – Número de casos de cólera em Brasil e taxa de mortalidade, entre 1991 e 2006 …................................................................................................................................. 23

Figura 6 – Bacias hidrográficas do Estado de Pernmbuco – Brasil ................................... 23

Figura 7 – Esquema do método tradicional de diagnóstico ............................................... 24

Figura 8 – Esquema da Ilha de Patogenicidade evidenciando o conjunto de genes TCP, responsável pela expressão do fator de colonização, e demais genes envolvidos com a regulação .............................................................................................................................. 29

Figura 9 – A - Esquema representativo da cascata regulatória que controla a expressão da toxina colérica (CT), evidenciando a ativação do gene ctxA pelo ToxT e a síntese da CT. B - Região intergênica onde se encontra as sequências repetidas de heptanucleotídeos. C - Seqüências parciais de nucleotídeo a montante do gene ctxA das cepas 0395 (Vibrio cholerae O1 Clássico) e 10259 (V. cholerae não-O1/não-O139) ........ 30

Figura 10 – Esquema do profago CTXφ evidenciando a região central e a região RS2 .... 31

Figura 11 – Fotomicrografia eletrônica evidenciando a morfologia do V. cholerae .......... 35

Figura 12 – Esquema da região intergênica do rDNA (rrn), evidenciando a região espaçadora intergênica (ISR) composta de genes de tRNA e regiões não codificadores .... 41

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... X

LISTA DE ABREVIATURAS

µm Micrômetro

°C Grau Celsius

A Adenina

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism – Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos Amplificados

Ágar TCBS Ágar Tiossulfato/Citrato/Bile

APA Água Peptonada Alcalina

ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis – Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado

C Citosina

cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate – Adenosina Monofosfato Cíclico

CT Cholera Toxin – Toxina Colérica

DNA Deoxyribonucleic Acid – Ácido Desoxirribonucléico

G Guanina

gap gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

gyrB gene da subunidade B da DNA Girase

HSP Heat Shock Protein - Proteínas de Choque Térmico

ISR Intergenic Spacer Regions – Região Espaçadora Intergênica

LPS Lipopolissacarídeo

MLEE Multilocus Enzyme Electrophoresis – Eletroforese de Enzima Multilocus

MLST Multilocus Sequence Typing – Tipagem por Seqüenciamento de Multilocus

mM Milimolar

NaCl Cloreto de Sódio

NaHCO3 Bicarbonato de Sódio

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... XI

NH4Cl Cloreto de Amônio

ORF Open reading frame – Região gênica codificadora

pb Pares de Base

PBS Phosphate Buffered Saline - Tampão Fosfato-Salino

PCR Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da Polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

PVDF Polyvinylidene Difluoride Membrane - Membranas de Polifluoreto de Vinilideno

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA – DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente

rDNA Ribosomal DNA – DNA Ribossomal

recA gene da Recombinase A

REP Repetitive Extragenic Palindromic – Palíndromos Repetitivos Extragênicos

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism – Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição

RNA Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucléico

rpoB gene da subunidade beta da RNA polimerase

rrn operon de RNA ribossomal

rRNA Ribosomal RNA – RNA Ribossomal

RS Repeats Sequences – Seqüências Repetidas

RTX Repeat in toxin – Toxina em repetição

TCA Trichloroacetic Acid - Ácido Tricloroacético

TCBS Agar Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar – Agar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose

TCP Toxin-Coregulated Pilus – Pílus Corregulador de Toxina

tRNA Transfer RNA – RNA Transportador

tRNAAla tRNA que transporta o aminoácido Alanina

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... XII

tRNAGlu tRNA que transporta o aminoácido Ácido glutâmico

tRNAIle tRNA que transporta o aminoácido Isoleucina

tRNALys tRNA que transporta o aminoácido Lisina

tRNAVal tRNA que transporta o aminoácido Valina

U Uracila

VNC Viable but Nonculturable – Viável mas não Cultivável

VPI Vibrio Pathogenicity Island – Ilha de Patogenicidade de Vibrio

VSP Vibrio seventh pandemic island – Ilha de patogenicidade do Vibrio da sétima pandemia

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... XIII

RESUMO GERAL

A emergência do Vibrio cholerae sorogrupo O139 como um segundo agente

etiológico da cólera serviu de alerta para o surgimento de outros clones epidêmicos que

possam passar despercebidos pelos métodos tradicionais de diagnóstico da cólera,

geralmente baseados no uso de antissoro contra o sorogrupo O1 tradicional. Em estudos

prévios, a partir da análise de 179 cepas de V. cholerae não-O1/não-O139 isoladas de

casos clínicos de cólera no Brasil, foram selecionadas sete cepas de V. cholerae O26, e

outra cepa de sorogrupo não tipável (17155), que possuíam genes de virulência

associados ao desenvolvimento desta enfermidade. Destas, duas cepas (4756 e 17155)

possuíam o gene rfb, específico do sorogrupo O1, sugerindo serem genotipicamente

deste sorogrupo, e também expressaram a toxina colérica (CT) em cultura. Este trabalho

buscou uma análise genética mais detalhada destas oito cepas comparando a

classificação sorológica com outros marcadores moleculares. Neste sentido foi realizada

a amplificação, clonagem e seqüenciamento da região espaçadora ribossomal 16S-23S

(ISR) de diferentes operons de V. cholerae. A partir da análise da seqüência de cinco

grupos de operons distintos (de um total de 210 clones seqüenciados), foram

construídas três árvores filogenéticas em que as cepas 4756 e 17155 ficaram agrupadas

no mesmo clado com cepas O1 controle, e as demais cepas O26 foram agrupadas

separadamente. Conclui-se, desta forma, que as cepas 4756 e 17155 são

filogeneticamente do sorogrupo O1 e a diferença nos resultados de sorologia pode ser

uma conseqüência de soroconversão provocada por mudanças em genes de biossíntese

do antígeno O.

Palavras-chaves: Vibrio cholerae não-O1/ não-O139, conversão sorológica, região

espaçadora intergênica rRNA16S-23S, sistemática molecular

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... XIV

ABSTRACT

The emergence of the Vibrio cholerae O139 serogroup as a second ethiologic

agent for cholera served as an alert to the rise of other epidemic strains that may pass

unnoticed by traditional methods of diagnosis, usually based on the use of antiserum

directed against the traditional O1 serogroup. In previous studies, out of 179 non-O1/

non-O139 V. cholerae strains isolated from clinical cases during the cholera outbreak in

Brazil, seven strains classified as V. cholerae O26 and one strain defined as not-typable

(17155) were selected which contained virulence genes associated with the development

of this disease. Two strains (4756 and 17155) contained the gene rfbN specific to the

O1 serogroup, suggesting that genotypically they belonged to this serogroup, and were

also able to express the cholera toxin in culture. Here a more detailed genetic analysis of

these eight strains was carried out comparing the serological classification with other

molecular markers. In this respect the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions (ISRs)

from the various V. cholerae operons were amplified, cloned and sequenced from each

strain. From the analysis of the sequence of five operons (totalizing 210 sequenced

clones), three phylogenetic trees were built in which strains 4756 and 17155 always

clustered with control O1 strains, whilst the remaining O26 strains clustered separately.

Thus, the two strains 4756 and 17155 phylogenetically belong to the O1 serogroup and

the difference in the serological results may be a consequence of seroconversion caused

by changes in the genes required for the biosynthesis of the antigen O.

Keywords: Vibrio cholerae non-O1/ non-O139, serological conversion, 16S/23S rRNA intergenic spacer regions, Molecular systematic

CARIRI, F.A.M.O. Caracterização Molecular de Cepas de Vibrio... 15

1 – INTRODUÇÃO

A cólera é uma doença infecciosa intestinal exclusiva dos seres humanos (Kaper

et al., 1995). O seu agente etiológico é o Vibrio cholerae, que foi identificado por Koch,

a partir da correlação entre a etiologia e a transmissão da doença (Sack et al., 2004).

A espécie Vibrio cholerae Pacini, 1854 utiliza a glicose, sacarose e manitol nas

suas vias metabólicas anaeróbicas. A base da identificação e da classificação sorológica

desta espécie é o antígeno “O”, um polissacarídeo termoestável integrante do

lipopolissacarídeo (LPS) de superfície que apresenta uma enorme diversidade (Yamai et

al., 1997). Os determinantes antigênicos do LPS são aglutinados com antissoro para o

antígeno “O” específico. Desta forma, mais de 200 sorogrupos de V. cholerae foram

identificados (Sack et al., 2004) e o primeiro deles foi denominado de V. cholerae

sorogrupo O1.

Os genes de biossíntese do antígeno O estão localizados no conjunto de genes

wbe, que apresenta entre outras características, regiões conservadas nas suas

extremidades. Isso permite que cepas de diferentes sorogrupos possam ser

soroconvertidas em outro sorogrupo após a recombinação homóloga desta região,

aglutinando assim com o mesmo antissoro O (Colwell, 1996). Desta forma, é destacado

o caráter falho da classificação sorológica, que não é coerente com aspectos

filogenéticos.

Historicamente, as cepas de V. cholerae O1 têm sido responsabilizadas pelas

sete pandemias ocorridas (Karaolis et al., 1995). No entanto, em 1992, com a

emergência do novo clone epidêmico, o V. cholerae O139, surgiu um novo modelo de

classificação epidemiológica: V. cholerae O1, V. cholerae O139 e V. cholerae não-

O1/não-O139 (Nair, 1994). O interesse na estrutura patogênica dos sorogrupos de V.

cholerae não-O1/não-O139 só foi concretizado com a emergência deste novo

sorogrupo, que funcionou como um alerta para o surgimento de outros clones

epidêmicos.

A patogenicidade de V. cholerae, em nível molecular, é um processo

multifatorial, que envolve diversos genes que codificam os fatores de virulência,

permitindo sua colonização no intestino (gene tcpA), a expressão coordenada destes

fatores e a secreção da toxina colérica - CT (genes ctxAB). Os principais genes de

virulência estão localizados em duas regiões distintas do cromossomo maior do V.

cholerae: a Ilha de Patogenicidade de Vibrio (VPI - Vibrio Pathogenicity Island) e o


profago CTXφ. Tais regiões podem propagar-se horizontalmente e dispersar-se entre

diferentes cepas (Waldor e Mekalanos, 1996), permitindo, assim, que cepas de V.

cholerae não-O1/ não-O139 possuam genes de virulência.

Theophilo e colaboradores (2006), a partir da análise de 179 amostras de V.

cholerae não-O1/não-O139, isoladas de casos clínicos e ambientais durante surto de

cólera ocorrido no Brasil (entre 1991 a 2000), destacam 14 cepas de V. cholerae do

sorogrupo O26 e uma cepa de V. cholerae não-O1/não-O139 por possuirem genes do

profago CTXφ. Destas, oito cepas que apresentaram o profago completo foram

selecionadas para o presente trabalho.

Uma vez que a classificação sorológica, utilizada como um importante critério

epidemiológico, não permite a inferência do grau de parentesco entre diferentes

sorogrupos, este trabalho buscou uma análise genética mais detalhada de cepas de V.

cholerae não-O1/não-O139, abordando a região espaçadora intergênica 16S-23S (ISR)

presente nos operons de rRNA. Neste contexto, a região espaçadora se enquadra por ser

um marcador filogenético robusto, diante da possibilidade de soroconversão de uma

cepa de sorogrupo O1 em outro sorogrupo, mantendo, contudo, o potencial de

virulência do V. cholerae O1.

Este trabalho teve então como objetivo principal analisar região espaçadora

intergênica 16S-23S do rDNA, a fim de estabelecer uma relação de parentesco entre as

cepas de V. cholerae O26 e compará-las com o sorogrupo O1.


2 – OBJETIVO GERAL

Analisar região espaçadora intergênica 16S-23S do rDNA, a fim de estabelecer

uma relação de parentesco entre as cepas de V. cholerae O26 e compará-las com o

sorogrupo O1.

2.1 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Amplificar as oito regiões espaçadoras 16S-23S de cepas de V. cholerae não-

O1/não-O139 e V. cholerae O1;

� Clonar e sequenciar os fragmentos amplificados.

� Analisar as seqüências obtidas, comparando-as com aquelas disponíveis de

genomas seqüenciados de V. cholerae e outras bactérias;

� Correlacionar os resultados obtidos com a presença ou não de fatores de

virulência e a proximidade destas cepas com o sorogrupo O1.


3 – REFERENCIAL TEÓRICO 3.1 – CÓLERA 3.1.1 – SINTOMAS, TRANSMISSÃO E TRATAMENTO

A cólera é uma doença infecciosa intestinal aguda de transmissão fecal-oral, que

acomete os seres humanos (Kaper et al., 1995). Essa infecção é causada pela

enterotoxina do Vibrio cholerae dos sorogrupos O1 e O139, podendo apresentar

manifestações clínicas diversas, que variam da forma branda, que se manifesta com

diarréia leve, à forma grave com diarréia aquosa e profusa, com ou sem vômitos, dor

abdominal e câimbras, que pode evoluir para desidratação, podendo levar a morte em

horas (Nitrini et al., 1997; Fundação Nacional de Saúde, 2002) (Figura 1).

Figura 1 – Paciente apresentando sinais típicos da forma grave da cólera com severa desidratação. Adaptado de Sack et al., 2004.

A infecção começa com a ingestão de água ou alimentos contaminados com o V.

cholerae. Após atravessar a barreira ácida do estômago, o V. cholerae coloniza o

epitélio do intestino delgado, por meio do Pílus Corregulador de Toxina (TCP) e outros

fatores de colonização, que ainda não estão bem conhecidos, multiplica-se no intestino

delgado proximal e produz enterotoxina. A Toxina Colérica (CT) secretada age sobre o

mecanismo fisiológico de transporte de íons nas células do epitélio intestinal, elevando

a concentração intracelular de cAMP, o qual aumenta a secreção do íon cloro (Cl-) e

diminui a absorção do íon sódio (Na+) pelas células das vilosidades (Field, 1980),

formando um gradiente osmótico que contribui para perda de água intracelular e resulta

na diarréia característica (Figura 2). O vibrião não é invasivo e permanece no lúmen do

intestino durante toda a progressão da doença.


AA B

C

Figura 2 – Esquema do mecanismo de ação da toxina colérica (CT) nos enterócitos: A - Secreção da CT no lúmen intestinal; B - Aumento da concentração intracelular de cAMP; C - Secreção de sódio, cloro e água do meio intracelular para o lúmen. Adaptado do site , acesso 28 abr 2008.

3.1.2 – EPIDEMIOLOGIA DA CÓLERA

A cólera, sendo uma doença de veiculação hídrica, apresenta uma disseminação

influenciada pelos aspectos climáticos que afetam a disponibilidade de água. Nas áreas

endêmicas, as taxas anuais de indivíduos com cólera variam de acordo com as

mudanças ambientais e climáticas (Pascual et al., 2000). Tal comportamento sazonal

pode ser observado em Bangladesh, local endêmico, em que ocorrem anualmente dois

surtos de cólera: um registrado antes da estação quente e o outro depois das monções

chuvosas (Siddique et al., 1992; Sack et al., 2003). No Peru, as epidemias de cólera são

restritas às estações quentes (Tauxe et al., 1995). Esta sazonalidade pode estar

relacionada à habilidade do gênero Vibrio em crescer rapidamente sob elevadas

temperaturas ambientais (Faruque et al., 1998a; Pascual et al., 2000). O registro de

casos de cólera, no Brasil, foi maior nos períodos mais secos do ano, quando registrado


um baixo volume de água nos reservatórios e mananciais, proporcionando a

concentração de vibriões. A elevação da temperatura da água neste período favorece o

rápido crescimento da população de V. cholerae (Sack et al., 2004).

Em algumas áreas, as condições sócio-econômicas e ambientais favorecem a

instalação e rápida disseminação do V. cholerae. Assim, a deficiência do abastecimento

de água tratada, destino inadequado dos dejetos, alta densidade populacional, carências

de habitação, higiene, alimentação e educação, favorecem a ocorrência da doença

(Fundação Nacional de Saúde, 2002; Gonçalves e Hofer, 2005). Outro aspecto que

favorece a disseminação da doença é a forma atenuada da virulência do V. cholerae O1

biotipo El Tor, que apresenta um elevado número de portadores assintomáticos. O

quadro clínico da cólera provocada pelo V. cholerae O1, biotipo El Tor, responsável

pela pandemia atual, é uma síndrome diarréica mais branda do que a provocada pelo

biotipo Clássico, responsável pelas outras seis pandemias (Kaper et al., 1995).

Para causar a cólera em voluntários saudáveis é necessária a ingestão de uma

elevada dose infecciosa (108 bactérias), porém uma dose baixa (105) pode ser suficiente

para causar os mesmos sintomas, se for associada com antiácido ou bicarbonato de

sódio (NaHCO3), que neutralizaram a acidez gástrica dos indivíduos. Logo, a

suscetibilidade do indivíduo aumenta elevando-se o pH gástrico. Ainda assim, sob

circunstâncias naturais, um inóculo menor que 108 bactérias pode causar a doença, visto

que outros fatores interferem na infecção (Sack et al., 1998; Fundação Nacional de

Saúde, 2002).

3.1.3 – HISTÓRICO DA CÓLERA

As seis primeiras pandemias da cólera se originaram na Índia, considerada o

“Berço da cólera”, tendo como agente etiológico o V. cholerae O1 biotipo Clássico. A

disseminação destas pandemias foi associada às peregrinações, às guerras e às rotas

comerciais e migratórias entre os continentes europeu, asiático e americano (Lacey,

1995). Já a atual pandemia, a sétima, com quase cinco décadas de duração, atingiu mais

de 130 países, tendo como agente etiológico o V. cholerae O1 biotipo El Tor (Kaper et

al., 1995; Karaolis et al., 1995). Esta pandemia, originária da Indonésia em 1961,

atingiu a Ásia em 1964, a África e o sul da Europa em 1970, e América do Sul em 1991.

A doença tornou-se agora endêmica em muitos destes lugares, particularmente no sul da

Ásia e na África (Shears, 1994; Faruque et al., 1998a; Sack et al., 2004).


Em janeiro de 1991, após uma ausência de quase 70 anos na América Latina,

uma grande epidemia de cólera desenvolveu-se no Peru, caracterizada por elevados

números de casos e rápida disseminação, nunca vista igual nas outras epidemias (Nitrini

et al., 1997). Estima-se que, no período de 1991 até 1999, o continente americano

notificou 44% dos casos ocorridos mundialmente e no período de 2000 até 2003, apenas

0,65% dos casos (Griffith et al., 2006; World Health Organization, 1992, 1993, 1994,

1995).

Griffith e colaboradores (2006) constataram que, entre o período de 1995 a

2005, 66% dos casos de cólera tiveram origem na África subsaariana, seguido pelos

16,8% originados do sudeste asiático. Os casos de cólera notificados na África tendem a

apresentar grandes proporções, devido às precárias condições sócio-econômicas da

população. O número de casos notificados de cólera em 2006 aumentou

consideravelmente, assumindo proporções típicas de surto da doença (Figura 3). Foram

notificados na África aproximadamente 99% dos casos mundiais. Os três países

africanos mais atingidos não tiveram casos de cólera registrados em 2005 (World Health

Organization, 2007).

Figura 3 – Número de casos de cólera no Mundo e taxa de mortalidade, entre 1991 e 2006. Adaptado da

World Health Organization, 1993 – 1995, 2007 e de Griffith et al., 2006.

A re-introdução da cólera no Brasil, em 1991, aconteceu pela selva amazônica,

na fronteira com o Peru e a Colômbia. A partir daí, alastrou-se progressivamente pela

região Norte, seguindo o curso do Rio Solimões/Amazonas e seus afluentes, principal

via de deslocamento de pessoas na região; e para as regiões Nordeste em 1992 e Sudeste

e Sul em 1993, através dos principais eixos rodoviários (Figura 4). Na região Nordeste,

216.

555

143.

349

137.

071 1

84.3

11

142.

311

111.

575

101.

383

131.

943

236.

896

208.

755

172.

790

277.

056

180.

348

293.

121

254.

310

147.

425

0

50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

Ano

Núm

ero

de c

asos

0

3.000

6.000

9.000

12.000

15.000

18.000

21.000

24.000

27.000

30.000

Núm

ero

de ó

bito

sNº de Casos

Nº de Óbitos


a epidemia assumiu um caráter acelerado disseminando-se por todos os estados da

região até o fim de 1993 (Hofer, 1993; Toledo, 1993). A chegada desta doença em áreas

indenes e com precárias condições de vida, teve quase sempre características

explosivas, o que justifica esse rápido avanço da cólera no Nordeste.

Figura 4 – Distribuição da cólera no Brasil, entre 1990 e 1996, evidenciando a rota da epidemia. Adaptado da World Health Organization (1993 - 1997).

A epidemia atingiu o ápice em 1993 com 60.340 casos notificados (Figura 5).

Foi desenvolvida uma campanha nacional de combate à cólera e, em 1994, a doença

começou a retroceder (Guthmann, 1995; Nitrini et al., 1997). A partir de 1995 reduziu-

se significativamente, tendendo a limitar-se às regiões Nordeste e Norte, onde

prevalecem condições sócio-econômicas menos satisfatórias, sugerindo a tendência de

endemização da doença (Brasil, 2000). Em 1998 e 1999, a seca no Nordeste provocou

uma severa crise de abastecimento de água, favorecendo ao aumento de número de

casos (Figura 5). Em 2004, ocorreu um pequeno surto em Pernambuco, no município de

São Bento do Una, onde foram notificados 21 casos; e no ano seguinte, foram

confirmados mais quatro no mesmo município e um caso no município de Recife

(Figura 6) (Brasil, 2005).

A doença, atualmente, está sendo detectada pela presença do V. cholerae em

águas ambientais em localidades do estado de Pernambuco monitoradas pela Secretaria

estatual de Saúde. Este monitoramento isolou em 2006 uma cepa ambiental toxigênica e

em 2007, quatro cepas de V. cholerae O1 biotipo El Tor (uma no rio Una, duas no rio

Ipojuca e outra no rio Bituri, afluente do rio Ipojuca) (Figura 6). É sempre preocupante

a possibilidade de recrudescimento da epidemia, já que as dimensões continentais do

país, as deficiências de saneamento básico e a precária situação sócio-econômica de

grande parcela da população constituem-se elementos propícios à disseminação e à

persistência da cólera (Brasil, 1992; Gonçalves e Hofer, 2005).


37.5

72

60.3

40

51.3

24

15.9

15

4.63

4

2.88

1

2.57

1

3.23

3

715

7 0 0 21 5 0

2.10

3

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

ano

Núm

ero

de c

asos

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Núm

ero

de ó

bito

sNº de CasosNº de Óbitos

Figura 5 – Número de casos de cólera em Brasil e taxa de mortalidade, entre 1991 e 2006. Adaptado da

World Health Organization, 1993 – 1995; 2007 e de Griffith et al., 2006.

Figura 6 – Bacias hidrográficas do Estado de Pernmbuco – Brasil. Adaptado de Leal et al., 2008.

3.1.4 – DIAGNÓSTICO DA CÓLERA

O diagnóstico da cólera é a peça fundamental para o êxito das atividades de

prevenção e controle da doença. O diagnóstico laboratorial é o mais indicado para a

identificação do V. cholerae O1, El Tor, responsável pelos casos de cólera branda. Os

países recém-afetados pela doença, quando não estabelecem o diagnóstico laboratorial

nos primeiros casos, prejudicam consideravelmente a implantação de medidas sanitárias

indispensáveis ao controle da doença (Brasil, 1992). Portanto, este diagnóstico deve ser

utilizado para investigação de todos os casos suspeitos, principalmente, quando a área é

considerada livre de circulação do V. cholerae (Fundação Nacional de Saúde, 2002).

Brasil


O V. cholerae pode ser isolado, a partir da cultura de amostras de fezes ou

vômito de doentes, de fezes de portadores e da cultura de amostras ambientais. Os

métodos tradicionais de diagnóstico da cólera, tanto em fezes, quanto em material

proveniente do ambiente (água do mar, de rios e alimentos) consistem em análises

bacteriológicas que visam isolar e identificar o V. cholerae, baseado nas características

fenotípicas (Brasil, 1998). As amostras analisadas pelo método tradicional passam por

dois enriquecimentos sucessivos do vibrião em água peptonada alcalina (APA) e semeio

em meio seletivo indicador (ágar TCBS - ágar tiossulfato/citrato/bile), conforme a

Figura 7. Posteriormente, são realizados testes bioquímicos, confirmando a presença de

características metabólicas e a capacidade de produzir a toxina colérica, e sorológicos,

soroaglutinações frente aos antissoros polivalentes (O1) e monovalentes (Inaba e

Ogawa) (Brasil, 1998).

Figura 7 – Esquema do método tradicional de diagnóstico. Adaptado do Ministério da Saúde (Brasil, 1998).


3.2 – AGENTE ETIOLÓGICO

Em 1883, durante a quinta pandemia, o V. cholerae foi identificado como agente

etiológico da cólera por Koch, a partir da correlação entre a etiologia e a transmissão da

doença (Sack et al., 2004). O V. cholerae O1, biotipos Clássico ou El Tor (sorotipos

Inaba, Ogawa ou Hikojima) e o V. cholerae O139 são os agentes etiológicos de cólera

epidêmica.

3.2.1 – ECOLOGIA DO Vibrio cholerae O ciclo de vida do V. cholerae consiste em duas fases: uma fase no hospedeiro

humano e outra, no ambiente aquático, onde o V. cholerae pode ser encontrado como

célula de vida livre ou associado ecologicamente com fanerógamas aquáticas, algas,

zoobentos, fungos, zoo e fitoplânctons (principalmente copépodes, cladóceros, rotíferos,

clorófitas e cianobactérias), insetos, entre outros organismos (Huq et al., 1984; Islam et

al., 1990; Tamplin et al., 1990; Islam et al., 1993; Colwell, 1996).

Acreditou-se por muito tempo que a distribuição global do V. cholerae estivesse

exclusivamente relacionada à rota da cólera. No entanto, estudos sugerem que o

deslocamento destas bactérias em associação com plânctons é o principal fator de

distribuição global (McCarthy e Khambaty, 1994). Assim, o V. cholerae ambiental

sobrevive e se multiplica em associações ecológicas independentemente do início das

infecções humanas (Sanyal, 2000; Bartlett e Azam, 2005).

Estudos do ambiente aquático mostraram que o V. cholerae, incluindo os

sorogrupos O1 e O139, habita ecossistemas aquáticos, contribuindo para a flora

bacteriana de vida livre em rios e estuários (Colwell e Spira, 1992). Enquanto que as

cepas de V. cholerae toxigênicas podem também habitar o trato gastrointestinal, pois

produzem fatores de colonização que permitem tal feito, as cepas não-O1/não-O139 são

mais freqüentemente isoladas em habitats ambientais. A maioria das cepas toxigênicas

ambientais é isolada em regiões que foram contaminados por indivíduos infectados. Já

as cepas isoladas de ambientes distantes das regiões com casos notificados, geralmente

não possuem os genes da toxina colérica.

O V. cholerae ambiental pode formar biofilme (Watnick et al., 2001) e pode se

apresentar no estado viável mas não-cultivável (VNC), em resposta a um estresse físico

ou nutricional (Colwell, 2000), facilitando a persistência do V. cholerae, em habitats

aquáticos durante períodos interepidêmicos (Reidl e Klose, 2002). Islam e


colaboradores (1993) verificaram que as cepas de V. cholerae epidêmicas, durante

períodos interepidêmicos, fazem associações ecológicas com organismos aquáticos, na

forma VNC, até o próximo período epidêmico, quando os fatores ambientais estimulam

a multiplicação bacteriana, resultando em um novo surto de cólera.

Embora não se conheça o que determina a sazonalidade da cólera, acredita-se

que a sua presença endêmica no subcontinente indiano e sua re-emergência em outros

continentes pode estar relacionada a fatores ambientais (Pascual et al., 2000; Colwell,

1996). Estudos associam períodos interepidêmicos à alta concentração de bacteriófagos

no ambiente aquático. Tais fagos, além de possuírem importantes genes de virulência da

cólera, como as subunidades da toxina colérica, atuam no controle populacional do V.

cholerae (Faruque et al., 1998b). Assim, a ausência de fagos no ambiente aquático

potencializará a cólera epidêmica, em especial, quando o V. cholerae é introduzido pela

primeira vez em uma dada região. Isso justifica o caráter explosivo das epidemias de

cólera quando o agente etiológico foi recém introduzido em áreas livre da doença, como

ocorreu na América Latina e, mais recentemente, na África (Faruque et al., 2005). O

ciclo de vida do fago pode explicar grande parte da enigmática sazonalidade da cólera

endêmica.

Duas hipóteses são sugeridas para justificar a sazonalidade dos surtos em áreas

endêmicas: seja pelo surgimento periódico das mesmas cepas de V. cholerae, seja pela

emergência contínua de novos clones toxigênicos (Faruque et al., 1997).

3.2.1.1 – RESERVATÓRIO AMBIENTAL

As associações ecológicas prolongam a sobrevivência do V. cholerae, pois são

importantes fontes de nutrientes para o vibrião. No entanto, ainda não se sabe se tais

associações são fenômenos gerais para todos os sorogrupos ou são específicas para os

sorogrupos epidêmicos, tratando-se de um mecanismo seletivo (Bartlett e Azam, 2005).

A infecção do V. cholerae provocada pelo consumo de frutos do mar, crus ou

mal cozidos, é um indício do quão diversificados são os reservatórios ambientais deste

organismo. A ingestão de peixes, ostras, camarões e caranguejos constituem fontes de

infecção, sendo identificados como causa de epidemias ou casos isolados de cólera nos

Estados Unidos, Itália, Portugal e Austrália, entre outros países (Feachem, 1982; Lowry

et al., 1989).


O V. cholerae possui vários reservatórios ambientais porque desenvolveu ao

longo da evolução mecanismos que o permitem sobreviver no ambiente. Pode-se citar

como exemplo, a produção de quitinase, que permite o uso da quitina como fonte de

carbono bastante abundante no exoesqueleto dos crustáceos (Colwell e Spira, 1992). A

adesão direta de V. cholerae a superfícies contendo quitina permite a formação de

biofilmes favorecendo sua proteção contra os efeitos do pH ácido encontrado

ocasionalmente no ambiente (Nalim et al., 1979; Faruque et al., 2006).

É relatado que existe uma seletiva especificidade da quitinase extracelular do V.

cholerae, contribuindo para a formação preferencial de biofilmes em copépodes (Huq et

al., 1990). Assim, a produção desta enzima permite a relação ecológica entre o V.

cholerae e os crustáceos. Estudos mostram que copépodes marinhos albergam uma flora

bacteriana em seu exoesqueleto e que esta interação pode ser decisiva na sobrevivência

ambiental do V. cholerae por longo período, visto que o mesmo é transportado para o

sedimento, sempre que a coluna de água apresenta grande concentração de matéria

orgânica (Huq et al., 1983; 1984; Araújo et al., 1996; Tamplin et al., 1990). Os víbrios,

quando associados à copépodes vivos em laboratório, sobreviveram por mais tempo e

permaneceram cultiváveis (Huq et al., 1983). A concentração de bactérias do gênero

Vibrio dissolvidas na água estuarina cai consideravelmente na presença de quitina

particulada (Kaneko e Colwell, 1975), demonstrando o quão benéfica é esta associação

para o V. cholerae.

A alta adaptabilidade às variações de temperatura e salinidade favorece a

ocorrência de elevadas concentrações de víbrios em águas com características estuarinas

(Colwell, 1996). Outro mecanismo de persistência desta espécie no ambiente é a sua

capacidade de assumir formas de sobrevivência, como a forma rugosa e o estado viável

mas não-cultivável.

3.2.1.2 – ESTADO VIÁVEL MAS NÃO CULTIVÁVEL

Investigando as condições físico-químicas das regiões estuarinas, verificou-se

que esses ambientes apresentam características que tornam possível a sobrevivência do

V. cholerae O1 (Colwell e Spira, 1992; Colwell e Huq, 1994). A forma como irá

sobreviver pode diferir e a persistência dos fatores envolvidos na conservação dos genes

de virulência não é certa. A sobrevivência depende de diversos fatores, tais como as


propriedades físico-químicas do ambiente e as associações ecológicas específicas das

bactérias, envolvendo diversos componentes do ambiente aquático. Fatores ambientais,

como pH, temperatura, salinidade e concentração de nutrientes, exercem importante

influência nas interações ecológicas do V. cholerae, principalmente se tais condições

ambientais forem parecidas com as encontradas no estuário (Huq et al., 1984; Patel et

al., 1995).

Os vibriões coléricos sob circunstâncias de estresse (falta de nutrientes, elevação

da salinidade ou redução de temperatura) assumem como estratégia de sobrevivência

um estado de latência. Esta estratégia é conhecida como estado viável mas não

cultivável (VNC) nos meios de culturas convencionais, impossibilitando seu isolamento

por técnicas microbiológicas, embora ainda causem a infecção colérica (Colwell e Huq,

1994). Trata-se, portanto, de uma estratégia da resistência à ambientes aquáticos

oligotróficos, em que a bactéria reduz de tamanho, torna-se ovóide e entra no estado de

dormência permitindo a sua sobrevivência nas condições ambientais adversas por

períodos prolongados (Colwell, 1996). Existe uma hipótese de que o V. cholerae

sobreviveria no meio ambiente durante períodos interepidêmicos no estado VNC. No

entanto, como já foi discutido, a sua interação com o plâncton desempenha um papel

importante na ecologia do microrganismo e facilita a sobrevivência (Lobitz et al.,

2000).

O estado viável mas não cultivável pode ser induzido em laboratório, incubando

a cultura de V. cholerae sob condições de estresse salino a 48 °C, por vários dias.

Segundo estudos preliminares, estas células podem se tornar viáveis quando ingeridas

por voluntários humanos (Colwell e Spira, 1992). A manutenção do potencial infeccioso

da bactéria nessa condição, o torna de grande importância epidemiológica (Colwell,

1996; Binsztein et al., 2004). O emprego da imunofluorescência indireta para a

demonstração da bactéria em amostras de água e, posteriormente, a associação com a

contagem direta de células viáveis permitiu a detecção de formas VNC do vibrião

colérico em ambientes aquáticos (Colwell et al., 1985; Xu et al., 1984).


3.2.2 - FATORES DE VIRULÊNCIA

No V. cholerae, os principais genes de virulência requeridos para a

patogenicidade estão agrupados e podem aparentemente propagar-se horizontalmente e

dispersar-se entre diferentes cepas. Análises genéticas revelaram a presença de duas

regiões principais que participam diretamente dos mecanismos de virulência: a Ilha de

Patogenicidade de Vibrio (VPI) e o profago CTXφ (Waldor e Mekalanos, 1996).

3.2.2.1 – A VPI A VPI (Figura 8) é uma região do DNA adquirida, apresentando o conjunto de

genes tcpAHP (toxin-coregulated pilus), que codificam o fator de colonização; e genes

de regulação que atuam em cascata, como o toxR, acfABCD, toxT, aldA e tagAB. A

expressão de genes de virulência em V. cholerae envolve um grande número de etapas

que culminam na ativação do promotor do toxR (Skorupski e Taylor, 1997). O ToxR

liga-se a um motivo de DNA repetido em tandem (TTTTGAT) (Figura 9), localizado

entre os genes zot e ctxA do profago CTXφ para ativar a transcrição dos genes ctxAB

(Withey e Dirita, 2006). Cepas epidêmicas dos sorogrupos O1 e O139 possuem três ou

mais cópias do heptanucleotídeo nessa região. Cepas de V. cholerae que possuem

apenas duas cópias do heptanucleotídeo não são capazes de expressar a CT (Sarkar et

al., 2002).

Figura 8 – Esquema da Ilha de Patogenicidade do Vibrio, evidenciando o conjunto de genes TCP, responsável pela expressão do fator de colonização, e demais genes envolvidos com a regulação. Adaptado de Zhang et al. (2003).


Figura 9 – A - Esquema representativo da cascata regulatória que controla a expressão da toxina colérica (CT), evidenciando a ativação do gene ctxA pelo ToxT e a síntese da CT. RNAP, a RNA polimerase. Pequenas setas abaixo das caixas indicam promotores, assim como a direção da transcrição. A linha ondulada grossa indica mRNA. B - Região intergênica onde se encontra as sequências repetidas de heptanucleotídeos. C - Seqüências parciais de nucleotídeo a montante do gene ctxA das cepas 0395 (Vibrio cholerae O1 Clássico) e 10259 (V. cholerae não-O1/não-O139), evidenciando o número de cópias do heptanucleotídeo nessa região presente em cada uma destas. Adaptado de Sarkar et al. (2002) e de Sanchez et al. (2004).

3.2.2.2 – O PROFAGO CTXφφφφ Os genes ctxAB, que codificam a CT, principal fator de virulência do V.

cholerae, estão localizados em um bacteriófago lisogênico conhecido como CTXφ ou

elemento genético CTX (Figura 10). Esse bacteriófago possui uma região central (core),

que é flanqueada por uma ou múltiplas cópias das seqüências repetidas – RS (Pearson et

al., 1993). O profago CTXφ compreende a região do core e a do RS presente antes do

core, denominada RS2. A região central (core) codifica a CT, que não contribui para a

manuntenção do profago, e outros genes que codificam proteínas, como psh, cep, orfU e

ace, que atuam no empacotamento e na liberação do fago (Waldor e Mekalanos, 1996).

C

A


Figura 10 – Esquema do profago CTXφ evidenciando a região central e a região RS2. A região núcleo apresenta genes ctxAB, codificadores da toxina colérica, e outros genes de virulência. A região RS2 codifica proteínas estruturais do profago. Já região RS1, embora não faça parte do profago, o flanqueia nas duas estremidades e possui o gene rstC, que traduz uma proteína anti-repressora do profago. Adaptado de Nandi et al. (2003) e de Maiti et al. (2006).

A molécula da CT é constituída por cinco subunidades B (codificado pelo gene

ctxB) e uma subunidade A (ctxA). A subunidade B é responsável pela ligação da toxina

a um receptor da célula intestinal e a subunidade A é a parte enzimaticamente ativa que

atua sobre as células da mucosa intestinal provocando desequilíbrio hidroeletrolítico,

resultando na secreção abundante de líquido isotônico. Outros peptídeos codificados

pelos genes zot e ace, presentes na região core do CTXφ, também apresentam atividade

enterotóxica (Fasano et al., 1991). Já a região RS2 codifica proteínas que estão

envolvidas na regulação (gene rstR), na replicação (gene rstA) e na integração (gene

rstB) de CTXφ no genoma de V. cholerae (Waldor et al., 1997). A RS1 flanqueia as

extremidades do profago.

Embora a forma lisogênica do profago CTXφ seja mantida pela proteína

repressora fágica RstR, a proteína anti-repressora RstC, que influencia a replicação e

transmissão do CTXφ, é codificada na RS1, região adjacente ao seu genoma (Davis et

al., 2002). Por outro lado, a região RS1 necessita de cópias dos genes de manuntenção

do CTXφ (rstR, rstA e rstB) para produzir partículas RS1 (Figura 10), demonstrando

que existe uma interação simbiótica e parasitária entre o fago e a região RS1 (Faruque et

al., 2002). Portanto, a interação entre o profago CTXφ e RS1 promove a eficiente

propagação dos genes produtores da CT, intensificando a virulência e as relações

evolutivas das cepas de V. cholerae.

São relatados diferentes alelos para o gene rstR, estando cada alelo associado a

um tipo distinto de profago CTXφ. O profago que apresenta o alelo rstR El Tor, típico

do V. cholerae O1 El Tor, é denominado CTXETφ. Assim, o CTXclassφ é típico do V.

cholerae O1 Clássico; o CTXCalcφ do V. cholerae O139 (Davis et al., 1999); o CTXEnvφ

Central

Profago CTX


do V. cholerae não-O1/ não-O139 (Mukhopadhyay et al., 2001); e o CTXvarφ presentes

nos isolados de V. cholerae El Tor pré-O139 (Nandi et al., 2003).

O profago CTXφ pode ser encontrado intracelularmente como um plasmídeo ou

incorporado a um dos cromossomos do V. cholerae. Sob condições apropriadas, as

cepas toxigênicas do V. cholerae podem ser induzidas a produzir várias partículas do

CTXφ (Waldor e Mekalanos, 1996; Faruque et al., 1998b). Nas culturas de V. cholerae,

que apresentam o CTXφ na fase de replicação, são encontradas elevadas concentrações

deste fago no sobrenadante. As cepas ambientais não toxigênicas podem ser convertidas

por transdução, surgindo assim novas cepas toxigênicas (Reidl e Klose, 2002).

3.2.2.3 – OUTROS FATORES DE VIRULÊNCIA

É evidente o papel crucial desempenhado pelos fagos filamentosos na

transferência horizontal de genes entre cepas de V. cholerae. Isto não ocorre apenas

porque alguns fagos possuem em seu genoma grupos gênicos associados à virulência,

mas também porque a estrutura flexível do capsídeo permite transferir DNA heterólogo

(Faruque e Mekalanos, 2003).

Os clones de V. cholerae patogênicos evoluíram, provavelmente, de clones

aquáticos de vida livre que adquiriram a capacidade de colonizar o intestino humano

pela aquisição de novas informações genéticas (Colwell e Spira, 1992). A ausência de

conjuntos de genes associados à virulência nas cepas não patogênicas é uma evidência

que corrobora a hipótese evolutiva acima. De fato, a análise da estrutura, do conteúdo

GC e da freqüência de códons (codon usage) da VPI sugere que esta região foi

recentemente adquirida pelo V. cholerae. O CTXφ, que codifica CT, utiliza a TCP como

sua receptora para infectar novas cepas (Waldor e Mekalanos, 1996), e, portanto, estes

dois elementos adquiridos horizontalmente estão ligados evolutivamente.

Outros conjuntos de genes que têm papéis adicionais hipotéticos na patogênese

do V. cholerae também foram relatados, e segundo alguns indícios, foram também

recentemente adquiridos. Estes incluem o conjunto de genes RTX (toxina em repeat)

(Lin et al., 1999), o novo conjunto de genes pílus tipo IV (Fullner e Mekalanos, 1999) e

as Ilhas do Vibrio da sétima pandemia (VSP-1 e VPS-2) (O’Shea et al., 2004).


3.2.3 – TAXONOMIA DO DOMÍNIO BACTÉRIA

O Manual de Sistemática Bacteriológica de Bergey descreve 32 agrupamentos

de bactérias pertencentes ao domínio Bactéria (Eubactéria), compreendendo 384

gêneros. Segundo Woese (1987), a análise de seqüências de rDNA 16S de organismos

cultivados permite descrever 12 divisões para o domínio Bactéria. O termo divisão é

aplicado para um grupo filogenético contendo duas ou mais seqüências de rDNA 16S

monofiléticas e não similar a outros grupos filogenéticos que integram o domínio.

Utilizando o mesmo marcador molecular, Hugenholtz e colaboradores (1998),

acrescentou ao domínio Bactéria 12 novas divisões hipotéticas, descritas em um

levantamento metagenômico do meio ambiente e outras 12 divisões descendentes

descritas em outros estudos (Maidak et al., 1999). Assim, este Domínio compreende 36

divisões.

A divisão Proteobacteria, também conhecida como bactérias púrpuras, é

merecedora de destaque por constituir o maior e mais diverso grupo de bactérias

cultivadas, com cerca de 1.600 espécies descritas (Thompson et al., 2004a). Segundo

Kersters e colaboradores (2003), a classificação das Proteobactérias na categoria

taxonômica “divisão” teria caído em desuso, sendo recomendado o uso da categoria

“filo”. De acordo com esta nova classificação, o filo Proteobacteria é dividido em 5

classes fenotipicamente indistinguíveis (Thompson et al., 2004a): Alfa (α), Beta (β),

Gama (γ), Delta (δ) e Epsilonproteobacteria (ε).

As Proteobactérias apresentam coloração Gram-negativa e uma enorme

diversidade morfológica e fisiológica (sobretudo metabólica), apesar de estarem no

mesmo clado. As estratégias para obtenção de energia são variadas, incluindo

organismos com metabolismo quimiolitotrófico, quimiorganotróficos e fototrófico, além

de outras vias metabólicas especializadas em organismos adaptados a diversos nichos

ecológicos. A classe Gamaproteobacteria compreende várias famílias, entre estas

Aeromonadaceae, Chromatiaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Pasteurellaceae,

Xanthomonadaceae e Vibrionaceae (Thompson et al., 2004a).

3.2.3.1 – FAMÍLIA VIBRIONACEAE

O V. cholerae é uma bactéria Gram-negativa toxigênica pertencente à família

Vibrionaceae. O gênero-tipo desta família é Vibrio Pacini, 1854 (Baumann e Schubert,

1984). As espécies pertencentes a esta família são bacilos retos ou curvos, móveis por


meio de flagelo polar. Quando cultivadas em meio de cultura sólido apresentam flagelos

laterais, podendo cada célula possuir até 100 flagelos. Não formam endósporos nem

microcistos. São organismos quimiorganotróficos e anaeróbios facultativos,

apresentando metabolismo oxidativo e fermentativo. O oxigênio é o aceptor universal

de elétrons durante a respiração. A maioria das espécies desta família é oxidase positiva.

Todos utilizam a D-glicose como principal fonte de carbono e energia. A maioria dos

indivíduos utiliza sais de amônio como fonte de nitrogênio.

Originalmente, são habitantes aquáticos encontrados no mar, em água doce e em

associações ecológicas com seres aquáticos. Algumas espécies são patogênicas para

vertebrados e invertebrados (Baumann e Schubert, 1984). Uma importante função

ecológica dessas bactérias é a degradação da quitina, o segundo biopolímero mais

comum no mundo e o mais abundante no ambiente aquático (Meibom et al., 2004).

Quando a família Vibrionaceae foi proposta por Véron em 1965, compreendia

vários gêneros que apresentavam indivíduos oxidase positivos e que se deslocavam por

meio de flagelo polar. Tais características sinapomórficas não implicam numa relação

evolutiva entre as espécies, mas foi proposto por conveniência para diferenciação das

espécies pertencentes à família Enterobacteriaceae, que são, por sua vez, oxidase

negativas e possuem flagelos peritriquiais. Estudos posteriores de fisiologia e genética

comparada, com membros das duas famílias, sugerem que evoluíram de um ancestral

comum próximo (Baumann e Schubert, 1984). A origem evolutiva comum foi

evidenciada a partir comparação de seqüências 5S do RNA ribossomal e hibridização do

rRNA utilizando sonda de DNA (Baumann e Baumann, 1981).

A família Vibrionaceae abriga oito gêneros (Vibrio, Allomonas, Catenococcus,

Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium e Salinivibrio), sendo o gênero

Vibrio o mais abundante (Thompson e Swings, 2006).

3.2.3.2 – GÊNERO Vibrio

A espécie-tipo deste gênero é Vibrio cholerae Pacini, 1854 (Baumann et al.,

1984). As espécies do gênero Vibrio são bacilos com 0,5-0,8 µm de diâmetro e 1,4-2,6

µm de comprimento. Algumas espécies podem crescer em meio mineral contendo

apenas D-glicose e NH4Cl. Os íons de sódio estimulam o crescimento de todas as

espécies e são de extrema importância para algumas. Algumas espécies crescem bem

em meio à base de água do mar. Todas as espécies utilizam D-glicose, D-frutose,


maltose e glicerol. A fermentação de D-glicose, geralmente, não produz gás. A maioria

das espécies cresce a 20ºC (Baumann et al., 1984).

Os membros deste gênero são encontrados em associações ecológicas com

organismos bênticos, fito e zooplâncton e em ambientes marinhos e estuarinos, com

ampla faixa de variação de salinidade. São encontradas também algumas espécies em

habitats de água doce. Algumas espécies deste gênero são patogênicas para o homem e

outras para os animais marinhos (Baumann et al., 1984).

Este gênero compreende 47 espécies (Euzéby, 1997), entre as quais se destaca o

V. cholerae por ser o agente etiológico de sete pandemias de cólera. O V. cholerae e o

V. mimicus são filogeneticamente próximos dentro do gênero Vibrio (Thompson et al.,

2004a). Estas duas espécies apresentam genomas bastante relacionados, sugerindo um

ancestral comum recente.

3.2.4 – ESPÉCIE Vibrio cholerae

O Vibrio cholerae Pacini, 1854 (Figura 11) utiliza em suas vias metabólicas

anaeróbicas glicose, sacarose e manitol e é lisina e ornitina descarboxilases positivas.

Esse organismo é classificado por testes bioquímicos e é subdividido em sorogrupos

baseados no antígeno somático “O” (Sack et al., 2004).

Figura 11 – Fotomicrografia eletrônica evidenciando a morfologia do V. cholerae. Adaptado de Albert (1994).

3.2.4.1 – CLASSIFICAÇÃO ANTIGÊNICA

O antígeno “O” é um polissacarídeo termoestável integrante do lipolissacarídeo

(LPS) da parede celular das bactérias Gram-negativas, sendo constituído de três frações

(“A”, “B” e “C”). Por apresentar uma enorme diversidade, este antígeno é a base da

identificação e da classificação sorológica da espécie V. cholerae (Yamai et al., 1997).

Os determinantes antigênicos de superfície são aglutinados com antissoro para o


antígeno “O” específico, sendo identificados mais de 200 sorogrupos de V. cholerae

(Sack et al., 2004). O primeiro a ser identificado foi denominado de V. cholerae

sorogrupo O1.

Os diferentes sorogrupos “O” de V. cholerae não podem ser distingüidos

bioquimicamente, portanto a sua identificação baseia-se no fato de que o sorogrupo O1

possui apenas um antígeno “O”, o qual reagirá especificamente aglutinando-se com o

antissoro O1. Epidemiologicamente, a espécie V. cholerae tem sido dividida em cepas

do sorogrupo O1 e de sorogrupos diversos, denominados não-O1, as quais se imaginou,

por muito tempo, que tinham diferentes capacidades patogênicas (Colwell, 1996).

Porém, em 1992, surgiu um novo clone epidêmico, o V. cholerae O139, dando origem a

um novo modelo de classificação epidemiológica: V. cholerae O1, V. cholerae O139 e

V. cholerae não-O1/ não-O139 (Nair, 1994, Sack et al., 2004).

O conjunto de genes wbe de V. cholerae O1, constituído de genes de biossíntese

do antígeno O (O-PS), está localizado no cromossomo maior, entre as ORFs VC0240

(gene gmhD) e VC0264 (gene rjg) (Heidelberg et al., 2000). Este conjunto de genes

consiste em cinco regiões: 1 – biossíntese da perosamina, compreendendo os genes

manC, manB, gmd e wbeE (Stroeher et al., 1995); 2 – transportador do antígeno O,

compreendendo os genes wbeG, wzm e wzt (Manning et al., 1994; Manning et al.,

1995); 3 – biossíntese do tetronato, compreendendo os genes wbeK, wbeL, wbeM,

wbeN e wbeO (Stroeher et al., 1998); 4 – modificador de antígeno O, compreendendo o

gene wbeT (Stroeher et al., 1992; Hisatsune et al., 1993); e 5 – genes adicionais,

compreendendo o gene wbeU, wbeV e wbeW (Fallarino et al., 1997).

A possibilidade de recombinação homóloga entre o conjunto de genes de

biossíntese do antígeno O foi testada em 300 cepas de V. cholerae não-O1 e não-O139

(Li et al., 2002). Destas, quatro cepas não-O1, sorogrupos O27, O37, O53 e O65,

apresentaram a organização genética similar à do sorogrupo O1, sugerindo a

recombinação desta região. Yamasaki e colaboradores (1999) sugerem que a

emergência do sorogrupo O139 é resultado da transferência horizontal de genes do

sorogrupo O1 e O22.

O estreito parentesco genético da linhagem ancestral do V. cholerae O1 El Tor

com o novo serogrupo O139 (Stroeher et al., 1995; Li et al., 2002), a existência de

diferentes cassetes codificadores do antígeno O presentes no mesmo locus

cromossômico (Stroeher et al., 1995; Li et al., 2002), bem como a presença de regiões

similares em ambos os lados deste cluster (Stroeher et al., 1997), apoiam firmemente a


hipótese de que algum tipo de transferência horizontal de genes teria ocorrido (Li et al.,

2002; Mooi e Bik, 1997; Faruque et al., 2003; Chatterjee e Chaudhuri, 2004). No

entanto, nem o mecanismo de transferência genética, nem o contexto ecológico em que

este ocorreu foram elucidados (Blokesch e Schoolnik, 2007).

3.2.4.2 – Vibrio cholerae O1

O V. cholerae O1 tem sido associado à cólera pandêmica. No entanto, cepas

ambientais O1, de áreas não epidêmicas, usualmente não produzem a toxina colérica

(CT), sendo, portanto, consideradas não patogênicas (Levine et al., 1982). Este

sorogrupo, a depender da constituição antigênica, pode ser subdividido em três

sorotipos: Inaba, Ogawa e Hikojima. O sorotipo Inaba possui as frações de antígeno

“A” e “C”; e o Ogawa possui as frações “A” e “B”. O Hikojima é um sorotipo muito

raro e instável, possuindo as três frações do antígeno “O”, sendo considerado como um

sorotipo de transição (Manning et al., 1994).

Além dos sorotipos, o V. cholerae O1 pode ser dividido em dois biotipos: o

Clássico e o El Tor, que são diferenciados através de características fenotípicas, como a

sensibilidade ao bacteriófago IV e a polimixina B (Kay et al., 1994). As cepas de cada

biotipo podem ser Inaba, Ogawa ou Hikojima, elaborando a mesma enterotoxina, de

forma que o quadro clínico é bastante semelhante. Em uma epidemia, tende a

predominar um único sorotipo (São Paulo, 2001).

O biotipo El Tor, isolado por Gotschlich, em 1906, que foi examinado na

estação de quarentena de El Tor, no Egito, é o agente etiológico da atual pandemia de

cólera. A virulência deste biotipo é atenuada apresentando um considerável aumento no

número de portadores sadios. Além disso, a resistência deste biotipo é maior que o

Clássico, o que lhe confere condições de sobreviver por mais tempo no meio ambiente,

crescer melhor e mais rápido em meios de cultura, ser menos susceptível aos agentes

químicos e ter maior tendência à endemização (Fundação Nacional de Saúde, 2002).

3.2.4.3 – Vibrio cholerae O139

O V. cholerae O139 foi o primeiro sorogrupo não-O1 identificado, em 1992,

como agente etiológico de uma grande epidemia no sul da Ásia, com considerável

mortalidade. Até então, acreditava-se que apenas o sorogrupo O1 era patogênico. As


enterotoxinas elaboradas pelo sorogrupo O139 são similares e ocasionam quadros

clínicos muito semelhantes aos do sorogrupo O1 (Fundação Nacional de Saúde, 2002).

O V. cholerae O139, também conhecido como Bengal, é um híbrido dos

sorogrupos O1 El Tor e O22, apresentando características importantes de virulência

típicas do V. cholerae O1 (Rhine e Taylor, 1994), como os genes da toxina colérica

(ctxAB) e do pílus corregulador da toxina (tcpA); e a capacidade de expressar um

cápsula polissacarídica, típica dos sorogrupos não-O1 (Hall et al., 1993).

3.2.4.4 – Vibrio cholerae NÃO-O1/ NÃO-O139

Embora a grande maioria das cepas de V. cholerae não-O1/não-O139 não seja

toxigênica, algumas possuem a capacidade de produzir toxinas e outros fatores

associados à virulência da espécie. Estas cepas já foram identificadas como

responsáveis por ocasionar patologias extra-intestinais, diarréias com desidratação

severa semelhante à cólera, estando associados a casos isolados ou surtos muito

limitados (Morris Jr. et al., 1990; Sack et al., 2004). A ocorrência de tantos fatores de

virulência nos diferentes sorogrupos não-O1/não-O139, sugere que a patogenicidade

destas bactérias seja multifatorial, não dependendo de um único mecanismo para causar

a doença. O interesse na estrutura patogênica V. cholerae não-O1/não-O139 só foi

concretizado com a emergência do sorogrupo O139, cuja epidemia funcionou como um

alerta para o surgimento de outros clones epidêmicos. De forma similar ao sorogrupo

O1, estas cepas não obedecem a um critério rígido de classificação quanto ao seu poder

toxigênico.

3.2.4.5 – Vibrio cholerae O26 Cepas de V. cholerae O26 representaram 7,8% das 179 amostras de V. cholerae

não O1/ não O139, isoladas de casos clínicos e do meio ambiente, durante o surto de

cólera no Brasil (1991 a 2000) (Theophilo et al., 2006). Predominantemente, nesse

sorogrupo (e em outra cepa de V. cholerae de sorogrupo não tipável) foi evidenciado o

cassete de virulência CTXφ intacto.


3.2.5 – MÉTODOS MOLECULARES USADOS NA CLASSIFICAÇÃO BACTERIANA Uma variedade de técnicas fenotípicas e genômicas tornou-se disponível para a

identificação do V. cholerae nas últimas três décadas (Thompson et al., 2004a). A

Tabela 1 apresenta algumas destas técnicas que contribuem com valiosas informações

sobre a classificação e estrutura populacional do V. cholerae. Diante destas técnicas, o

seqüenciamento da região espaçadora intergênica de rRNA 16S-23S (ISR) se destaca

por ter a capacidade discriminatória de classificar níveis taxonômicos inferiores a

espécie.

3.2.6 – OS GENES DE rRNA COMO MARCADORES MOLECULARES

As bactérias apresentam variações morfológicas simples, não sendo, portanto,

um caráter robusto para a sua classificação filogenética. A fisiologia bacteriana, embora

limitada com alguns agrupamentos artificiais, auxilia melhor esta classificação, pois

características fisiológicas são compartilhadas entre grupos próximos de espécies

bacterianas (Woese, 1987). Com o advento do seqüenciamento de ácidos nucléicos, a

sistemática molecular bacteriana ganhou a sua principal ferramenta. Na prática, todas as

relações filogenéticas puderam ser determinadas de forma mais fácil, com maior

profundidade e riqueza de detalhes (Lane et al., 1985). As moléculas mais úteis para a

medida filogenética possuem uma alta estabilidade funcional compartilhada entre

diversos grupos taxonômicos e são conhecidas como marcadores filogenéticos (Gevers

et al., 2004). Entre os marcadores mais promissores para a inferência filogenética

bacteriana destacam-se as proteínas de choque térmico HSP60 e HSP70, e os genes

rRNAs 16S e 23S, recA, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gap), rpoB e gyrB

(Byun et al., 1999).

Nas últimas duas décadas, o uso de seqüências codificadoras de rRNAs (5S, 16S

e 23S), como marcadores para identificação taxonômica, permitiu a restruturação da

filogenia bacteriana. Em muitos casos, os resultados filogenéticos obtidos pelo

seqüenciamento de genes de rRNA sugeriram que os agrupamentos de bactérias feitos

pelos critérios clássicos, aspectos morfológicos e bioquímicos, eram inconsistentes.

Nesse aspecto, o gene do rRNA 5S, apesar de sua seqüência ter sido utilizada para

reclassificar algumas espécies da família Vibrionaceae (MacDonell e Colwell, 1985), é

de uso limitado para reconstruir filogenias, provavelmente devido ao seu pequeno

tamanho (cerca de 120 pb) (Woese, 1987). Já o gene de rRNA 16S, que apresenta cerca

Tabela 1 – Métodos moleculares usados para classificar Vibrio cholerae.

Método Princípio do método Poder discriminatório Referências

Hibridação DNA-DNA A região específica do genoma ou o DNA genômico purificado da amostra a ser testada é hibridizado com DNA marcado da linhagem de referência.

De gênero a sorogrupo Pang et al., (2007)

RFLP

Fragmentos de genes amplificados por PCR (rRNA 16S, gyrB e rpoD) ou o DNA genômico é digerido com uma enzima de restrição e, posteriormente, esse material é separado por eletroforese em gel de agarose. Pode-se, hibridizar com sondas marcadas para reduzir o número de bandas.

De espécie a sorogrupo Qu et al., (2003); Nandi et al., (2003)

Amplificação de DNA

(AFLP, ARDRA, ERIC-PCR, RAPD, rep-PCR e Ribotipagem-PCR)

Amplificação do DNA por PCR, produzindo diferentes perfis associado ou não, a digestão com enzimas de restrição.

De gênero a sorogrupo

Singh et al., (2001); Theophilo et al., (2006); Leal et al., (2004); Lee et al., (2006); Chun et al., (1999); Danin-Poleg et al., (2007)

MLEE Eletroforese de enzimas constitutivas. De gênero a sorogrupo Farfan et al., (2000)

MLST PCR e seqüenciamento. De gênero a sorogrupo Rivera et al., (1995)

Seqüenciamento do gene rRNA 16S e recA

PCR e seqüenciamento. De família a espécie Thompson et al., (2004b)

Seqüenciamento da região intergênica ribossomal - ISR

PCR e seqüenciamento. De espécie a sorogrupo Chun et al., (1999); Ghatak et al., (2005)

Amplificação dos genes rfb PCR com primers específicos para a região do antígeno O1 e O139.

Sorogrupo Hoshino et al., (1998)

Micro arranjo de DNA Amplificação de 4.600 cDNA conhecidos e catalogados, posterior fixação destes numa lâmina especial e hibridação com as sondas de interesse.

De gênero a sorogrupo Pang et al., (2007)

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de 1.500 pb, inclui regiões altamente conservadas, que permitem o agrupamento em

categorias taxonômicas maiores, como classes e filos; e regiões variáveis, que podem

discriminar espécies dentro do mesmo gênero. Esta característica fez com que as

seqüências de rRNA 16S fossem amplamente utilizadas como uma ferramenta na

identificação e como um marcador filogenético (Wiik et al., 1995). Para se ter idéia foi

criado o projeto Banco de Dados Ribossomal II (Ribosomal Database

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