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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA

BUXIFOLIA REISSEK.

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aline Augusti Boligon

Santa Maria, RS, Brasil. 2010

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BUXIFOLIA REISSEK.

por


Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de

Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Controle e Avaliação de Insumos e Produtos Farmacêuticos, da

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profª. Drª. Margareth Linde Athayde

Santa Maria, RS, Brasil

2010

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado


BUXIFOLIA REISSEK.

elaborada por


como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

COMISSÃO EXAMINADORA:

Margareth Linde Athayde, Drª. (Presidente/Orientador)

Eloir Paulo Schenkel, Dr. (UFSC)

Adair Roberto Soares dos Santos, Dr. (UFSC)

Santa Maria, 30 de março de 2010

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AGRADECIMENTOS

A Deus por ter estado sempre presente na minha vida.

A Universidade Federal de Santa Maria pelas oportunidades oferecidas.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela

oportunidade e por oferecer subsídios necessários para o desenvolvimento dos

experimentos.

A CAPES pela bolsa concedida.

A Professora Doutora Margareth Linde Athayde, pela orientação, apoio e

amizade, de maneira indispensável, durante todos os passos para a realização

dessa dissertação, dedico meu carinho e admiração.

Aos professores do Curso de Pós-Graduação pelos conhecimentos

compartilhados durante minha formação, disponibilidade e atenção, mas

principalmente pela constante amizade e incentivo de todos, meus mais sinceros

agradecimentos.

Aos professores João Batista Teixeira da Rocha, Sydney Hartz Alves, Marli

Matiko Anraku de Campos, Ademir Farias Morel e Adair Roberto dos Santos pelo

auxílio na realização das análises.

A Bióloga Mestre em Botânica Nelci Rolim Basto Zacchia, pela identificação

do material vegetal.

A todos os alunos, graduação e pós-graduação, do Laboratório de

Fitoquímica, pelo convívio, amizade, colaboração e aprendizado.

Aos meus pais Glória Maria e Sérgio, exemplos de vida, pelo amor, dedicação

e por me ensinarem a ter caráter e a lutar.

Aos meus irmãos e suas famílias pela amizade e pelos bons momentos de

convivência.

Ao meu noivo Giancarlo, por estar ao meu lado, me ouvir e me apoiar nos

momentos difíceis e compartilhar comigo as vitórias.

A todos aqueles, citados ou não, que contribuíram direta ou indiretamente

para a realização dessa dissertação os mais sinceros agradecimentos.

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RESUMO

Dissertação de Mestrado

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Universidade Federal de Santa Maria


BUXIFOLIA REISSEK.

AUTORA: ALINE AUGUSTI BOLIGON

ORIENTADORA: MARGARETH LINDE ATHAYDE

Data e Local da Defesa: Santa Maria, 30 de março de 2010.

A família Rhamnaceae é composta por cerca de 58 gêneros e aproximadamente 900 espécies. A espécie Scutia buxifolia Reissek, é conhecida popularmente como coronilha, é uma planta nativa da América do Sul, com uma dispersão que compõe o estado do Rio Grande do Sul no Brasil, Argentina e Uruguai. A decocção das cascas do tronco e folhas é utilizada popularmente como cardiotônica, hipotensora e diurética. O presente trabalho objetivou isolar e identificar flavonóides e triterpenos presentes em S. buxifolia bem como analisar a capacidade de capturar radicais livres. As cascas do tronco e as folhas de S. buxifolia foram coletadas em outubro de 2007 no município de Dom Pedrito–RS. O material está depositado no herbário do Departamento de Biologia da UFSM catalogado sob o número de registro SMBD 10919. O material vegetal foi seco, moído e macerado utilizando como solvente etanol:água (70:30, v/v). Fez-se fracionamento do extrato bruto com solventes orgânicos de polaridades crescentes (CH2Cl2, AcOEt, n-BuOH). Na fração AcOEt das folhas caracterizou-se os flavonóides quercetina, quercetina 3-0-rhamnosídeo, quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo e rutina. Da fração CH2Cl2 das cascas do tronco, os esteróides β-sitosterol e estigmasterol, e o triterpeno lupeol. Os compostos isolados foram analisados por 1H-RMN e 13C-RMN e seus dados espectroscópicos foram comparados com os obtidos da literatura. Os compostos isolados foram quantificados por CLAE. O extrato bruto e as frações de S. buxifolia foram investigadas quanto a peroxidação lipídica, atividade antioxidante e conteúdo de fenóis totais. O conteúdo de fenólicos totais variou de 141,09 ± 0,71 a 323,47 ± 2,62 mg/g para as cascas do tronco e de 72,09 ± 0,50 a 383,34 ± 2,31 mg/g para as folhas de S. buxifolia. O extrato bruto e as frações provocaram uma queda acentuada na produção de TBARS com IC50 de 2,93 ± 2,17 a 40,46 ± 2,51 µg/mL para as folhas e 0,66 ± 0,17 a 27,3 ± 1,23 µg/mL para a cascas do tronco. Para o ensaio do DPPH a ordem de captação de radicais livres foi: AcOEt > n-BuOH > CH2Cl2 > extrato bruto, para as duas partes da planta. Palavras – chave: Scutia buxifolia; Rhamnaceae; flavonóides; DPPH; TBARS; CLAE.

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ABSTRACT

Master’s Degree Dissertation

Postgraduate Program in Pharmaceutical Sciences

Federal University of Santa Maria

ANTIOXIDANT ACTIVITY OF FLAVONOIDS AND TERPENOIDS OBTAINED FROM THE LEAVES AND STEM BARK OF SCUTIA

BUXIFOLIA REISSEK.

AUTHOR: ALINE AUGUSTI BOLIGON

ADVISER: MARGARETH LINDE ATHAYDE

Date and Place of the Defense: Santa Maria, March 30th, 2010.

The Rhamnaceae family is composed of some 58 genera and about 900 species. Scutia buxifolia Reissek species, popularly known as coronilha, is a local plant from South America, with a dispersion that comprise Rio Grande do Sul state in Brazil, Argentina and Uruguay. The stem bark and leaves decoction are popularly used as cardiotonic, antihypertensive and diuretic. This work aims to isolate and identify flavonoids and triterpenes present in Scutia buxifolia and analyze ability to capture free radicals. Stem bark and leaves of S. buxifolia were collected in October 2007 in Dom Pedrito-RS (coordinates 30º 59'09''S and 54º27'44''W). The material is deposited in the herbarium of the Department of Biology UFSM cataloged under the registration number SMBD 10919. The dried plant material was ground and macerated using ethanol: water (70:30, v/v) as solvent. The crude extract was fractionated with solvents of increasing polarity (CH2Cl2, AcOEt, n-BuOH). In AcOEt fraction of the leaves was characterized quercetin, quercetin 3-0-rhamnosíde, quercetin 3-0-β-D-glucopyranoside and rutin, and the CH2Cl2 fraction of stem bark the steroids β-sitosterol and stigmasterol, and the triterpene lupeol. The compounds were analyzed by 1H-NMR and 13C-NMR and spectroscopic data were compared with those obtained from the literature. The compounds were quantified by HPLC in the fraction used for insolation. The crude extract and fractions of S. buxifolia were investigated for lipid peroxidation, antioxidant activity and total content of phenols. The total phenolic content ranged from 141.09 ± 0.71 to 323.47 ± 2.62 mg/g for stem bark and 72.09 ± 0.50 to 383.34 ± 2.31 mg/g for leaves of S. buxifolia. Crude extract and fractions caused a sharp fall in TBARS production with IC50 from 2.93 ± 2.17 to 40.46 ± 2.51 µg/mL for the leaves and 0.66 ± 0.17 to 27.3 ± 1.23 µg/mL for the stem bark. The order of capture of free radicals was: AcOEt > n-BuOH > CH2Cl2 > crude extract, for the two parts of the plant.

Key words: Scutia buxifolia; Rhamnaceae; flavonoids; DPPH; TBARS; HPLC.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Núcleo fundamental dos flavonóides .....................................................20

FIGURA 2 - Scutia buxifolia Reissek (coronilha) – Aspecto geral da

planta..........................................................................................................................22

FIGURA 3 - Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (1) scutianina

A, (2) scutianina B, (3) scutianina C, (4) scutianina D, (5) scutianina E, (6) scutianina

H.................................................................................................................................24

FIGURA 4 - Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (7) scutianina

I, (8) scutianina F, (9) scutianina J, (10) scutianina K, (11) scutianina L, (12)

scutianina M...............................................................................................................25

PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA 4.1

FIGURE 1 - Antioxidant activities of crude extract and dichloromethane, ethyl acetate

and butanolic fractions from the stem bark of Scutia

buxifolia…………………………………………………………………....……………...…31

FIGURE 2 - Antioxidant activities of crude extract and dichloromethane, ethyl acetate

and butanolic fractions from the leaves of Scutia

buxifolia.…………………………………………………..…………………………………31

FIGURE 3 - Effects of different concentrations of crude extract, ethyl acetate,

dichloromethane, and butanolic fractions from the stem bark on Scutia buxifolia on

Fe (II) (10µM)-induced TBARS production in brain homogenates. The samples were

incubated for 1h with Fe (II) and the plant extracts or without (basal). Data show

means ± SEM values average from 3 to 4 independent experiments performed in

duplicate……………………………………………………………………………………..32

8

FIGURE 4 - Effects of different concentrations of crude extract (A), ethyl acetate (B),

dichloromethane (C), and butanolic (D) fractions from the leaves on Scutia buxifolia

on Fe (II) (10µM)-induced TBARS production in brain homogenates. The samples

were incubated for 1h with Fe (II) and the plant extracts or without (basal). Data show

means ± SEM values average from 3 to 4 independent experiments performed in

duplicate……………………………………………………………………………………..32

FIGURE 5 - Flavonol compounds isolated from Scutia buxifolia. 1 R = OH; 2 R = 3-O-

Rha; 3 R = 3-O-Glc; 4 R = 3-O-Glc (6”→1”’)-Rha......................................................32

FIGURE 6 - High performance liquid chromatography phenolic profile of ethyl acetate

fraction from the leaves: 1 – quercetin, 2 – quercitrin, 3 – isquercitrin, and 4 – rutin.

…………………………………………………………….................................................33


FIGURA 1 - Cromatograma das cascas do tronco (A), das folhas (B) e das soluções

de referência (C). .......................................................................................................38

FIGURA 2 - Compostos isolados da fração em diclorometano das cascas do tronco

de S. buxifolia.............................................................................................................38

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LISTA DE TABELAS


TABLE 1 – Total phenolics (TP) contents and antioxidant activities (IC50/DPPH) for

the stem bark and leaves...........................................................................................31

TABLE 2 – Tested concentrations in the TBARS assay and IC50 (µg/mL) values for

crude extract and fractions from the leaves and stem bark of Scutia buxifolia….…..32

TABLE 3 – Flavonols composition of Scutia buxifolia leaf ethyl acetate fraction…....32


TABELA 1 - Quantificação de esteróides na fração em diclorometano das cascas do

tronco e folhas de S. buxifolia. *Resultados expressos na média ± D.P. de três

determinações............................................................................................................38

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LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

1H-RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

13C-RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

Abs – Absorbância

AcOEt – Acetato de etila

ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

BuOH – n-Butanol

CC – Cromatografia em coluna

CCD – Cromatografia em camada delgada

CG-MS – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

CH2Cl2 – Diclorometano

DPPH – 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazyl

EB – Extrato bruto

EtOH – Etanol

Fig. – Figura

GF254 – Gel de sílica com indicador de fluorescência para λ 254 nm

HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência

MeOH – Metanol

min. – Minutos

OMS – Organização Mundial da Saúde

TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

UV – Ultravioleta

λ – Comprimento de onda

11

LISTA DE ANEXOS

Anexo 01: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina..............................58 Anexo 02: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina..................................................................................................................59 Anexo 03: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina-3-0-ramnosídeo.................................................................................................................60 Anexo 04: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina-3-0-ramnosídeo.................................................................................................................61 Anexo 05: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina 3-0-β-D-glicopiranosideo..........................................................................................................62 Anexo 06: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina 3-0-β-D-glicopiranosideo..........................................................................................................63 Anexo 07: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): rutina......................................64 Anexo 08: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): rutina.......................................65 Anexo 09: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol + estigmasterol..............................................................................................................66 Anexo 10: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol + estigmasterol..............................................................................................................57

Anexo 11: Artigo publicado: Revista Saúde..............................................................68 Anexo 12: Artigo aceito para publicação: Revista Saúde.........................................73

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................13

2 OBJETIVOS ........................................................................................................16

2.1 Objetivo geral ....................................................................................................16

2.2 Objetivos específicos........................................................................................16

3 REVISÃO DA LITERATURA...............................................................................17

3.1 Importância das plantas para o desenvolvimento de fitoterápicos..............17

3.2 Espécies reativas de oxigênio e Estresse Oxidativo .....................................18

3.3 Metabólitos secundários ..................................................................................19

3.3.1 Definição ..........................................................................................................19

3.3.2 Função e Importância.......................................................................................19

3.4 Descrição da planta ..........................................................................................21

3.4.1 Descrição da família Rhamnaceae...................................................................21

3.4.2 Descrição da espécie Scutia buxifolia Reissek ................................................21

3.4.3 Compostos isolados de Scutia buxifolia ...........................................................22

3.4.4 Atividades biológicas descritas para Scutia buxifolia .......................................26

4 PUBLICAÇÕES CIENTÍFICAS ...........................................................................27

5 DISCUSSÃO GERAL ..........................................................................................40

6 CONCLUSÕES....................................................................................................47

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................48

13

1 INTRODUÇÃO

O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas é tão antigo quanto

a civilização humana e, por um longo tempo, compostos de origem mineral, vegetal

e animal foram as principais fontes de drogas para a população. Foi a partir de

estudos clínicos, farmacológicos e químicos das plantas, baseados na medicina

tradicional, que surgiram os primeiros fármacos utilizados pelo homem, como o ácido

acetilsalicílico, digitoxina, morfina, quinina e pilocarpina (BUSS et al., 2003; MANN,

2000; NEWMAN et al., 2000; SNEADER, 1996).

A biodiversidade dos vegetais constitui uma grande riqueza em potencial para a

saúde humana. As plantas são fontes de produtos naturais biologicamente ativos,

muitos dos quais são utilizados para síntese de inúmeros fármacos. Embora cerca

de 100.000 compostos oriundos de plantas tenham sido identificados, as fontes de

metabólitos secundários parecem ser inesgotáveis em relação às possibilidades de

se encontrar novas e diferentes estruturas com atividades importantes à terapêutica

e à agricultura (YUNES, CALIXTO, 2001), uma vez que, apenas 15 a 17% das

plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal e somente para algum

efeito especifico (FERREIRA, 1998).

Aproximadamente 25% de todos os fármacos prescritos mundialmente foram

originários de plantas, sendo que 121 destes compostos continuam em corrente uso

(LOZOYA, 1997). Além disso, dos 252 fármacos considerados como essenciais pela

Organização Mundial da Saúde (OMS), 11% são exclusivamente originados de

plantas. Compostos naturais também são passíveis de sofrerem modificações

estruturais, possibilitando o planejamento racional de novas moléculas e obtenção

de estruturas mais eficazes e seguras, ou mesmo com outras propriedades

farmacológicas até então não esperadas (RATES, 2001).

O Brasil possui a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com

mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000

(DIAS, 1996), porém apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foram

estudadas em busca de compostos bioativos e 1100 espécies foram avaliadas em

suas propriedades medicinais. Destas, 590 plantas foram registradas no Ministério

14

da Saúde para a comercialização (ORTEGA et al., 1989). Devido a grande

diversidade de espécies, aumentam-se as chances de identificação de substâncias

do metabolismo vegetal com atividades farmacológicas e descobrimento de novos

alvos biológicos. Portanto, muitas patologias que hoje permanecem sem um

tratamento adequado, poderão vir a ser tratadas de forma mais eficiente, a partir de

novos e potentes fármacos de origem vegetal (SIMÕES et al., 2004).

Nos últimos anos cresceu consideravelmente o interesse por terapias

alternativas e pelo uso terapêutico de produtos naturais, principalmente aqueles

obtidos de plantas (YUNES, CALIXTO, 2001). Este comportamento pode ser

explicado pelo fato de que grande parcela da população não tem acesso aos

tratamentos convencionais e, na crença errônea de que os produtos naturais não

produzem efeitos colaterais.

A OMS estima que no ano de 2020 a população mundial chegará a 7,5 bilhões

de pessoas e que destas 75% viverão em paises em desenvolvimento, os quais

consomem hoje menos de 15% do mercado total de medicamentos. Essas

observações indicam que, no futuro, esta população dependerá ainda mais das

plantas medicinais. Visando diminuir o número de excluídos dos sistemas

governamentais de saúde, a OMS recomenda aos órgãos responsáveis pela saúde

pública de cada país, que realizem levantamentos regionais das plantas utilizadas

na medicina popular tradicional estimulando o uso daquelas que tiverem

comprovado sua eficácia e segurança terapêutica (LORENZI, MATOS, 2002).

As plantas da família Rhamnaceae apresentam uma variada classe de

constituintes químicos, como alcalóides ciclopeptídicos (MOREL et al., 1995;

MARCHAND et al., 1968), flavonóides, antocianinas, taninos, esteróides e

triterpenos (SHAH et al., 1985). Os alcalóides ciclopeptídicos são bastante

difundidos na medicina popular no tratamento de várias moléstias, tais como:

disenteria, hipertensão arterial (KLEIN, RAPOPORT, 1968) e vários tipos de

infecções (SHAH et al., 1985). Por exemplo, as cascas do tronco da planta Scutia

buxifolia, conhecida popularmente como coronilha, contém matéria tintorial e serve

para a preparação de uma tintura utilizada como tônico do coração (WASICKY et al.,

1964).

Esta dissertação apresenta seus resultados na forma de artigos científicos,

sendo formatada de acordo com os periódicos onde os artigos foram publicados.

Contempla também, um item de discussão geral, no qual os resultados são

15

interpretados em conjunto, além das conclusões, referências bibliográficas e dos

anexos, onde são apresentados os espectros de ressonância magnética dos

compostos isolados e demais artigos publicados sobre o tema.

16

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O objetivo principal desta dissertação foi estudar quimicamente a espécie

Scutia buxifolia Reissek (folhas, talos e cascas do tronco).

2.2 Objetivos específicos

� Realizar doseamento de compostos fenólicos no extrato bruto e frações da planta;

� Avaliar a capacidade captadora de radicais livres pelo método colorimétrico do

DPPH;

� Avaliar a peroxidação lipídica pelo método do TBARS;

� Isolar metabólitos secundários da planta;

� Identificar quimicamente o (s) composto (s) isolado (s);

� Quantificar os compostos isolados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE).

17

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Importância das plantas para o desenvolvimento de fitoterápicos

O conhecimento empírico relacionado às plantas medicinais faz com que estas

sejam amplamente utilizadas na medicina popular e, sendo o Brasil detentor de uma

das floras mais ricas do mundo em matéria prima para fitoterápicos, é indispensável

o estabelecimento de bases científicas para o emprego destes vegetais na

terapêutica (SIMÕES et al., 2004).

Segundo Ferreira (1998) há alguns anos o Brasil já se encontra entre os dez

maiores consumidores de medicamentos do mundo, entretanto, a lei das patentes

enfraqueceu as perspectivas das indústrias químicas brasileiras. Isto impôs a

necessidade de diversificação fazendo com que o segmento de fitoterápicos se torne

muito atraente, onde o mercado brasileiro, referente a plantas medicinais, tem

movimentado recursos na ordem de 0,7 a 1,0 bilhão de dólares/ano.

A transformação de plantas em medicamentos deve visar à preservação da

integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a ação farmacológica e

segurança de utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico, requerendo

assim, estudos prévios de modo a desenvolver metodologias analíticas e

tecnológicas (MIGUEL, MIGUEL, 1999).

As plantas, assim como os animais, têm em substâncias do metabolismo

especial, como terpenos oxidados, taninos, fenóis, alcalóides, lignanas, cafeína e

aminas, seus principais sistemas antioxidantes (LARSON, 1988; COTELLE, 1996;

OKADA et al., 1996). Essas substâncias também contribuem com diversas funções

ecológicas de extrema importância nas relações de competição nos ecossistemas

terrestres, como polinização, alelopatia, defesa contra herbívoros e patógenos

(GOTTLIEB 1989; LANGENHEIN, 1994).

18

3.2 Espécies reativas de oxigênio e Estresse Oxidativo

As células estão continuamente produzindo radicais livres e espécies reativas

de oxigênio (EROs) como parte do processo metabólico. As principais EROs

relacionadas ao estresse oxidativo são o ânion superóxido (O2-), o peróxido de

hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (HO•). As espécies reativas são moléculas que

apresentam um elétron desemparelhado na sua órbita externa. Estas moléculas se

caracterizam por ser altamente instáveis e por ter um tempo de vida muito curto.

Estas espécies reativas são normalmente neutralizadas pelos sistemas

antioxidantes presentes nos organismos. Assim o estado de estresse oxidativo pode

resultar tanto de um aumento na produção de EROs quanto da redução da

capacidade antioxidante celular total. Ou seja, a ocorrência de um dano oxidativo

depende de um desequilíbrio entre a produção de EROs e a atividade das defesas

antioxidantes (HALLIWEL, 1992; MEAGHER, FITZGERALD, 2000; PENG et al.,

2000; SILVA et al., 2005).

O estresse oxidativo é uma condição celular ou fisiológica de elevada

concentrações de ERO que causa danos moleculares às estruturas celulares, tem

sido relacionado à instalação e progressão de diversas doenças degenerativas,

através de mutação do DNA, oxidação protéica e peroxidação lipídica (VALKO et al.,

2006; VALKO, et al., 2007) com conseqüente alteração funcional e prejuízo das

funções vitais em diversos tecidos ou órgãos (HALLIWELL, 1992). No entanto, o

efeito deletério do estresse oxidativo varia consideravelmente de um ser vivo para o

outro, de acordo com a idade, o estado fisiológico e a dieta (HARMAN, 1992; SIES,

1997).

Os organismos aeróbicos são protegidos contra as EROs por um complexo

sistema antioxidante endógeno. Além desse sistema de defesa, produtos naturais

com atividade antioxidante são importantes para atenuar o dano oxidativo, desta

maneira complementando estas defesas (KANTER, 1998; VALKO et al., 2006;

VALKO, et al., 2007). Neste sentido, há um interesse crescente pelos efeitos

antioxidantes de produtos naturais e do seu papel na saúde e na doença.

19

3.3 Metabólitos secundários

3.3.1 Definição

O conjunto de reações que continuamente ocorrem em uma célula chama-se

metabolismo. Portanto, os compostos químicos formados, degradados e

transformados são chamados de metabólitos.

Os constituintes químicos celulares, ou seja, as macromoléculas (lipídeos,

proteínas, carboidratos e ácidos nucléicos) são as mesmas para um organismo

vegetal e animal. São definidos como integrantes do metabolismo primário, o qual

compreende varias reações químicas envolvida na transformação de moléculas de

nutrientes em unidades essenciais as células (SANTOS, 1999).

Metabólitos secundários são compostos químicos distintos dos intermediários e

dos produtos do metabolismo primário. Eles variam de acordo com a espécie e a

família e alguns são restritos a determinada família, gênero ou espécie,

possibilitando o emprego como marcador taxonômico (BENETT, WALLSGROVE,

1994).

Segundo Santos (1999), o metabolismo secundário garante vantagem para a

sobrevivência do organismo produtor e permutação da espécie, embora não seja

necessariamente essencial. É um metabolismo diferenciado (organelas, enzimas e

coenzimas) capaz de produzir, transformar e acumular substâncias não relacionadas

de forma direta a manutenção da vida do organismo produtor.

3.3.2 Função e Importância

Durante muito tempo os metabólitos secundários foram considerados produtos

de excreção dos vegetais. No entanto, hoje sabe-se que esta classe de metabólitos

possui diversas funções, tais como: proteção contra raios UV; atração de

polinizadores e de animais, dispersores de sementes, entre outras (SANTOS, 1999).

Segundo o mesmo autor, os metabólitos secundários apresentam atividades

biológicas interessantes. Muitos são usados comercialmente na área farmacêutica,

20

perfumaria, agronômica, alimentar, entre outras. Pelo elevado número e grande

diversidade destes metabólitos vegetais eles despertam interesse de pesquisadores

de vários campos da ciência que vêem neles uma promissora fonte de novas

moléculas potencialmente úteis ao homem.

Os flavonóides compõem uma ampla classe de substâncias de origem natural.

Tais compostos possuem uma série de propriedades farmacológicas que os fazem

atuar sobre os diversos sistemas biológicos. As propriedades antioxidantes dos

flavonóides podem ser benéficas à saúde, por prevenirem a oxidação de

lipoproteínas de baixa densidade, por exemplo (ARAÚJO et al., 2005).

Pode-se encontrar flavonóides em diversas formas estruturais. Entretanto, a

maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbono em seu

núcleo fundamental, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três

átomos de carbono entre elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são

chamadas núcleos A, B e C, e os átomos de carbono recebem a numeração com

números ordinários para os núcleos A e C e os mesmos números seguidos de uma

linha (‘) para o núcleo B, como mostra a figura 1 (ZUANAZZI, MONTANHA, 2004).

Figura 1 - Núcleo fundamental dos flavonóides

(adaptado de Zuanazzi, Montanha, 2004)

Os fitoesteróides, esteróides das plantas, são semelhantes ao colesterol do

ponto de vista estrutural, têm um núcleo esteroidal, um grupo hidroxilo na posição 3-

beta, e uma dupla ligação na posição 5-6. Contudo, enquanto que no colesterol a

cadeia lateral é formada por 8 átomos de carbono, nos fitoesteróides pode conter 9

ou 10 átomos de carbono. Os esteróides mais abundantes das plantas são o β-

sitosterol, o campesterol e o estigmasterol (ALASALVAR et al., 2003).

O

O

A C

105

6

7

8

9

3

2

6'

5'

4'

3'

2'

B

21

Os esteróides possuem uma grande variedade de benefícios reconhecidos

cientificamente para várias doenças físicas, aterosclerose, câncer de próstata e de

cólon (RAO, JANEZIC, 1992; NAIR et al., 2006).

3.4 Descrição da planta

3.4.1 Descrição da família Rhamnaceae

A família Rhamnaceae abrange plantas com os mais variados hábitos, desde

erva até árvores, ocorrendo em florestas tropicais ou subtropicais de todo o mundo

(LIMA, 2000). Esta família abrange 58 gêneros com aproximadamente 900 espécies

(HEYWOOD, 1993). As folhas são simples, alternadas e normalmente estipuladas.

As flores são actinomorficas, bissexual e pentâmeras. O androceu é formado por

cinco estames opostos, as pétalas, e revestem o receptáculo floral. O gineceu é

composto por pistilo de usualmente 2-4 carpelos e os frutos são drupas.

No noroeste da Europa ocorrem dois gêneros com quatro espécies. Todos são

arbustos dos quais dois são comuns nessa área, Frangula alnus e Rhamnus

catharticus; R. alaternus e R. saxatilis ocorrem, geralmente, no sul e centro da

Europa (KUPRIANOVA, ALYOSHINA, 1972; VALDÉS et al., 1987; ERDTMAN et al.,

1961).

3.4.2 Descrição da espécie Scutia buxifolia Reissek

A espécie Scutia buxifolia (Figura 2), conhecida popularmente como coronilha,

é uma planta nativa da América do Sul, ocorrendo principalmente no Rio Grande do

Sul, Argentina e Uruguai (WASICKY et al., 1964).

É uma pequena árvore ou arbusto de até seis metros de altura, com espinhos.

Folhas opostas até alternas, inteiras ou com poucos dentes, lustrosas.

Inflorescências em fascículos axilares com flores pequenas e verdes. Floresce entre

outubro e janeiro e dá frutos no mês de março.

22

Scutia buxifolia, pertencente à família Rhamnaceae, é usada popularmente

como cardiotônica, hipotensora e diurética através da infusão em água da casca do

tronco e folhas (WASICKY et al., 1964).

Figura 2 - Scutia buxifolia Reissek (Coronilha) – Aspecto geral da planta.

Disponível em: <http://www.brazilian-plants.com/brsearch.cfm>. Acesso em 10/08/2009.

3.4.3 Compostos isolados de Scutia buxifolia

Os primeiros relatos sobre a presença de alcalóides na espécie S. buxifolia

ocorreram em 1964, quando Wasicky et al. observaram a presença de alcalóides

ciclopeptídicos nesta planta. Porém, um estudo mais aprofundado com esta espécie

foi realizado em 1967 por um grupo da Universidade de Bonn (TSCHESCHE et al.,

1970), que, trabalhando com a raiz da planta coletada em Santa Catarina, isolou um

alcalóide peptídico, scutianina A (Figura 3). Além desse alcalóide detectaram a

presença de outras bases, o que serviu de incentivo para novas tentativas de

isolamento. Mais tarde, pesquisadores da Universidade de Buenos Aires (SIERRA et

23

al., 1974), determinaram todos os centros quirais da scutianina A, com exceção da

unidade β-hidroxileucina.

Tschesche e colaboradores (1974) isolaram da raiz da mesma planta três

alcalóides denominados como: scutianina C, scutianinas D e E, estes dois últimos

são diasteroisomeros. Morel e colaboradores, em 1979, isolaram do extrato

metanólico da casca da raiz da espécie S. buxifolia os alcalóides scutianinas B, C, D

e E, todos conhecidos, e dois alcalóides novos, scutianinas H e I. As estruturas

destes alcalóides foram propostas com base, principalmente, nas fragmentações de

seus espectros de massas (Figura 3).

N

O

H

HN

H

O

O

N

O

N

Me2N (1)

H

HN

H

O

O

N

O

N

O

Me2N (2)

H

HN

H

O

O

N

O

N

O

Me2N

(3)

Me2N

N

O

O

N

O

HO

O

H

NH

HR

S

SS

(4)

24

Me2N

N

O

O

N

O

HO

O

H

NH

HR

S

R

R

(5)

H

HN

H

O

O

N

O

HO

N

O

Me2N

(6)

Figura 3 – Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (1) scutianina

A, (2) scutianina B, (3) scutianina C, (4) scutianina D, (5) scutianina E, (6) scutianina

H.

Em 1977, Tschesche e colaboradores isolaram dois novos alcalóides da

mesma planta: scutianina G, diasteroisômero das scutianinas D e E. Também foi

isolado um dimetil derivado da scutianina A denominado scutianina F. A casca do

tronco da S. buxifolia também contém substâncias que pertencem ao grupo dos

alcalóides peptídicos. Menezes e colaboradores (1995) isolaram do extrato

metabólico das cascas de S. buxifolia, coletada em Santana do Livramento em

março de 1993, as scutianinas B, C, D, E, H e um novo alcalóide, a scutianina J. Em

continuação ao estudo de MENEZES et al. (1995), foram isolados dois novos

alcalóides ciclopeptídicos: scutianina K, com fórmula molecular C34H40N4O5, que

possui estrutura similar as scutianinas D, E e G; além desta, foi isolada a scutianina

L com fórmula molecular C34H40N4O4 (MOREL et al., 1998) (Figura 4).

Em 2005, Morel e colaboradores isolaram um novo alcalóide, a scutianina M

(Figura 4) com formula molecular C33H38N4O4; a espectroscopia de 1H e 13C e a

rotação ótica deste novo composto sugerem que seja esteroisômero da Condalina-

A, isolada como maior alcalóide da Condalia buxifolia (MOREL et al., 2002) e da

Araliolina-B, isolada como menor alcalóide das folhas de Araliorhamnus vaginatus

(TSCHECHE et al., 1970). Cinco alcalóides conhecidos também foram encontrados,

as scutianinas B, C, D, E e F. O material para este estudo foi coletado em São Sepé

no ano de 2003.

25

H

HN

H

O

O

N

O

HO

N

O

Me2N

(7)

H

HN

O

O

N

O

O

N

N

M e 2N

O

(8)

H

HN

H

O

O

N

O

HO

Me2N

N

OHO

(9)

O

N

O

OHN

O

Me2N

O

H

NH

HR

S

S

S

(10)

H

HN

H

O

Me2N

N

O

O

N

O

(11)

H

HN

H

O

Me2N

N

O

O

N

O

(12)

Figura 4 – Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (7) scutianina I,

(8) scutianina F, (9) scutianina J, (10) scutianina K, (11) scutianina L, (12) scutianina

M.

26

3.4.4 Atividades biológicas descritas para Scutia buxifolia

A atividade antimicrobiana de alguns alcalóides ciclopeptídicos isolados da

casca da raiz de S. buxifolia foi relatada por Morel et al. (2005), utilizando o método

de bioautografia. O composto com o mais amplo espectro de atividade foi a

scutianina E, sendo efetiva contra Staphylococcus aureus ATCC 6538 (25 µg);

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (6,25 µg); Micrococcus luteus ATCC 9341

(6,25 µg); Escherichia coli ATCC 25792 (6,25 µg) e Klebsiella pneumoniae ATCC

10031 (12,5 µg). Scutianina D apresentou modesta atividade antibacteriana contra

M. luteus (25 µg); S. epidermidis (50 µg) e E. coli (50 µg), enquanto a scutianina B

só foi ativa contra a E. coli (6,25 µg) e a scutianina M foi inativa contra todas as

cepas testadas.

Trevisan et al. (2009) investigaram o potencial analgésico das scutianinas B,

C e D através do teste de retirada da cauda (tail-flick), as scutianinas foram

administradas via intratecal em ratos. A scutianina B (10nmol) induziu efeito

antinoceptivo em 15 e 60 minutos após a administração, a scutianina C (10nmol)

produziu hiperalgesia em 15 e 60 minutos após a injeção e a scutianina D não

apresentou alterações.

27

4 PUBLICAÇÕES CIENTÍFICAS

4.1 – BOLIGON, A. A.; PEREIRA, R. P.; FELTRIN, A. C.; MACHADO, M. M.;

JANOVIK, V.; ROCHA, J. B. T.; ATHAYDE, M. L. Antioxidant activities of flavonol

derivatives from the leaves and stem bark of Scutia buxifolia Reiss. Bioresource

Technology, v. 100, p. 6592-6598, 2009.

35

4.2 – BOLIGON, A. A.; JANOVIK, V.; FELTRIN, A. C.; MACHADO, M. M.;

FROHLICH, J. K.; ATHAYDE, M. L. Fitoconstituintes isolados da fração em

diclorometano das cascas do tronco de Scutia buxifolia Reissek.

Artigo aceito para publicação: Latin American Journal of Pharmacy

40

5 DISCUSSÃO GERAL

O estudo de plantas medicinais como alternativa na procura de novos agentes

terapêuticos tem se tornado uma ferramenta útil, principalmente nos países que

possuem uma grande diversidade vegetal. Os produtos de origem natural

contribuem decisivamente para o desenvolvimento da terapia moderna, como

exemplo podemos citar os investimentos das indústrias brasileiras e mundiais em

pesquisas de novos medicamentos obtidos de plantas.

A ausência de estudos químicos sobre S. buxifolia, aliado ao fato da

importância do registro químico de espécies utilizadas para fins terapêuticos,

motivam o presente trabalho que descreve o estudo fitoquímico e algumas

atividades biológicas de Scutia buxifolia Reissek.

O screening fitoquímico qualitativo realizado no extrato hidroalcoólico das

cascas do tronco e folhas de S. buxifolia apresentaram resultado positivo para os

grupos químicos como alcalóides, flavonóides, compostos fenólicos, esteróides,

triterpenos, taninos, heterosídeos cardiotônicos e antaciânicos. Estes resultados

encontram-se em conformidade com estudos já realizados na espécie (WASICKY et

al., 1964; TSCHESCHE et al., 1977; MOREL et al., 1979; MOREL et al., 1998;

MOREL et al., 2005).

Após ter verificado os principais compostos presentes nas folhas e nas cascas

do tronco de S. buxifolia e tendo em vista a importância dos mesmos, realizou-se

algumas atividades farmacológicas e biológicas.

As plantas produzem uma variedade de antioxidantes contra danos

moleculares provenientes de espécies reativas de oxigênio (EROs), Acredita-se que

a grande concentração e a diversidade de antioxidantes presentes nas plantas deve-

se ao fato de as mesmas terem que se proteger dos radicais livres gerados pelo

estresse oxidativo imposto pelos raios solares e pela exposição ao oxigênio

(SCARTEZZINI, SPERONI, 2000).

Existem muitos dados sobre os efeitos antioxidantes de diversos grupos de

compostos polifenólicos presentes nos extratos de plantas, como flavonóides,

taninos, catequinas, proantocianidinas e alguns ácidos polifenólicos (ACKER et al.,

1996). Os polifenóis de origem natural, particularmente os flavonóides, têm uma

estrutura ideal para captação de radicais livres, como geralmente são hidroxilados,

41

os radicais livres reagem com estas hidroxilas formando radicais estáveis, dessa

forma, torna-se um grupo de grande interesse na busca de novos compostos

antioxidantes (CHOI et al., 2002; CHO et al., 2003). Os flavonóides são de particular

importância na dieta humana, pois atuam como agentes antioxidantes,

antiinflamatórios, antifúngicos e antitumorais. Estudos epidemiológicos indicaram

que o seu consumo está associado a uma redução no risco de câncer e doenças

cardiovasculares (RICE-EVANS et al., 1996; MIDDLETON et al., 2000; TRIPOLI et

al., 2007).

Os flavonóides freqüentemente ocorrem na forma glicosídica e a hidrólise do

polifenol acontece provavelmente no trato gastrointestinal. Estes compostos são

multifuncionais e podem agir como agentes redutores e doadores de hidrogênio.

Também têm sido propostas propriedades quelantes de metal, particularmente de

ferro e zinco, para este grupo de compostos (RICE-EVANS et al., 1996).

O doseamento de polifenóis foi realizado com o extrato bruto e as frações

diclorometano, acetato de etila e n-butanol das cascas do tronco e folhas de S.

buxifolia, empregando-se o reagente Folin-Ciocalteau, conforme metodologia

descrita por Chandra e Mejia (2004), o padrão de referência usado foi o ácido gálico.

A maior concentração de compostos fenólicos nas folhas de S. buxifolia foi

encontrada na fração acetato de etila, seguida pela fração n-butanol, 383,34 ± 2,31,

249,14 ± 1,53, respectivamente (concentração expressa como miligramas de

equivalentes de ácido gálico por grama de cada fração). Para a fração diclorometano

e o extrato bruto, o teor de polifenóis foi de 80,94 ± 1,20 e 72,09 ± 0,50 mg/g,

respectivamente. As frações acetato de etila e n-butanol das cascas do tronco

apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos (323,47 ± 2,62 e 322,69 ±

1,20 mg/g, respectivamente), seguidas pela fração diclorometano e extrato bruto,

166,88 ± 0,66 e 141,09 ± 0,71 mg/g, respectivamente.

Os efeitos antioxidantes in vitro dos extratos e frações de S. buxifolia foram

avaliados através do ensaio com o radical DPPH, que determina principalmente a

capacidade doadora de próton de determinado composto ou associação. O DPPH é

um composto radicalar de absorção característica que possui um próton livre, sendo

que, na presença de compostos captadores de prótons, a absorção do DPPH

diminui significativamente (CONSTANTIN et al., 1990; MENSOR et al., 2001). No

presente estudo, as frações acetato de etila e butanólica das cascas do tronco

apresentaram os melhores resultados, com IC50 de 4,32 ± 0,62 e 4,35 ± 1,30 µg/mL,

42

respectivamente (IC50 = concentração necessária para inibir a atividade oxidante em

50%). As frações acetato de etila e butanólica das folhas também apresentaram boa

atividade (6,12 ± 0,83 e 6,50 ± 0,40 µg/mL, respectivamente). As menores atividades

foram encontradas para a fração diclorometano e para o extrato bruto, sendo 28,76 ±

0,46 e 29,55 ± 0,54 µg/mL, respectivamente para as cascas do tronco e 28,25 ± 0,36

e 30,54 ± 1,14 µg/mL, respectivamente para as folhas de S. buxifolia. As boas

atividades encontradas para a fração acetato de etila podem ser explicadas pela

presença de flavonóides nessa fração (TSENG et al., 1997; MENSOR et al., 2001;

TUNG et al., 2007).

Vários autores relatam a existência de uma correlação positiva entre compostos

fenólicos e atividade antioxidante usando ensaios similares (ALONSO et al., 2002;

SHYAMALA et al., 2005; CHANDRA, MEJIA, 2004; TURKMEN et al., 2006; TUNG et

al, 2007). Porém no caso de S. buxifolia esta correlação não foi bem estabelecida,

uma explicação pode ser a presença de outros compostos que interferem no ensaio

do Folin-Ciocalteau e/ou a presença de outros compostos não fenólicos com efeitos

antioxidantes. Como exemplo, podemos citar que o conteúdo de fenólicos totais

na fração em diclorometano e no extrato bruto da casca do tronco que são quase

o dobro dos valores obtidos para as mesmas frações das folhas, mas o IC50 dessas

quatro frações foram muito semelhantes, variando de 28,25 a 30,54 µg/mL.

Vários estudos têm se centrado na utilização terapêutica de compostos

antioxidantes naturais que podem proteger uma variedade de patologias humanas,

incluindo modelo de neurotoxicidade (PATEL et al., 2007; PEREIRA et al., 2009;

WAGNER et al., 2006; WILLIAMS et al., 2004). Fe (II) pode induzir a neurotoxicidade

(BOSTANCI, BAGIRICI, 2008) e seus níveis são aumentados em algumas doenças

degenerativas (AISEN et al., 1999; QIAN et al., 1997). A eficiência antioxidante do

extrato bruto e das frações das folhas e das cascas do tronco foi testada contra Fe

(II), um conhecido pró-oxidante. O cérebro é particularmente suscetível a danos

causados por radicais livres por causa de seu alto consumo de oxigênio e sua baixa

concentração de enzimas antioxidantes e removedoras de radicais livres. Por isso,

neste estudo, foram utilizados tecido encefálico de ratos para o ensaio do TBARS.

As cascas do tronco causaram diminuição significativa nos níveis de TBARS

induzidos por Fe (II). A fração acetato de etila apresentou a maior atividade (IC50 =

0,66 ± 0,12 µg/mL), a fração butanólica e o extrato bruto apresentaram atividades

intermediárias (3,18 ± 1,60 µg/mL) e a fração diclorometano demonstrou a menor

43

atividade (27,3 ± 1,22 µg/mL). Para as folhas de S. buxifolia a potência inibitória foi

na seguinte ordem: acetato de etila (IC50 = 2,93 ± 2,17 µg/mL) > butanólica (4,96 ±

1,56 µg/mL) > diclorometano (8,19 ± 0,94 µg/mL) > bruto extrato (40,46 ± 2,51

µg/mL). A inibição da peroxidação lipídica pelas folhas de S. buxifolia mostrou uma

relação com conteúdo de compostos fenólicos das folhas.

Os bons resultados encontrados para S. buxifolia podem ser explicados pela

presença de flavonóides isolados e quantificados na espécie. Quercetina e suas

formas glicosiladas possuem ação antioxidante in vitro e in vivo. Os valores de IC50

de rutina, quercetina e quercitrina frente ao pró-oxidante Fe (II) foram 25,8 µg/mL,

12,2 µg/mL, e 1,4 µg/mL, respectivamente (PEREIRA et al., 2009). Estas moléculas

podem atuar diretamente incorporando as reações redox, e indiretamente, por

quelação de Fe (II).

A fração acetato de etila das folhas apresentou promissoras atividades

antioxidantes, por isso, esta fração foi priorizada para o isolamento de substâncias

responsáveis por estas atividades. Sucessivos processos cromatográficos com a

fração acetato de etila levaram ao isolamento de quatro flavonóides, cujas

estruturas foram identificadas com base nos dados espectroscópicos de

Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (1H-RMN) e de carbono (13C-RMN). e

da comparação dos dados com a literatura.

O espectro de 1H-RMN da quercetina mostrou dois picos em 6,17 (1H, d, J =

2,0 Hz) e 6,37 ppm (1H, d, J = 2,0 Hz) consistente com os hidrogênios H-6 e H-8 em

um anel e um sistema ABX em δ 7,72 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2 '), 7,62 (1H, dd, J = 8,4,

2,1 Hz, H-6 ') e 6,87 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5 ') correspondentes ao próton do anel-B.

O 13C-RMN indicou a presença de 15 átomos de carbono, o sinal em δ 177,3 foi

atribuído a uma carbonila em C-4, os outros sinais foram: 165,6 (C-7), 162,6 (C-5),

158,4 (C-9), 148,8 (C-4’), 148,1 (C-2), 146,3 (C-3’), 137,3 (C-3), 124,2 (C-1'), 121,8

(C-6 '), 116,2 (C-5 '), 116,0 (C-2'), 104,6 (C-10), 99,2 (C -6), 94,4 (C-8). Os dados

espectrais foram compatíveis com os citados na literatura para quercetina

(SLIMESTAD et al., 1995; FOSSEN et al., 1998; LIU et al., 2008).

Quercetina 3-0-ramnosídeo (quercitrina) apresentou o mesmo padrão de sinal

da aglicona da quercetina, mas a presença de uma metila em dubleto em δ 0,95 (J =

6,0 Hz), juntamente com o acoplamento do próton anomérico em δ 5,34 (J = 1,6 Hz)

é indicativo de uma ramnopiranose (MA et al., 2005). O espectro de RMN 13C

indicou a presença de 21 átomos de carbono: δ 179,5 (C-4), 165,6 (C-7), 163,3 (C-

44

5), 159,2 (C-9), 149,6 (C-4”), 158,4 (C-2), 146,2 (C-3’), 136,2 (C-3), 122,9 (C-1 '),

122,9 (C-6'), 116,3 (C-5 '), 116,3 (C-2 '), 103,4 (C-10), 99,8 (C-6), 94,7 (C-8), 105,8

(C-1 "), 71,8 (C-2"), 72,1 (C-3 "), 71,9 (C-4"), 71,5 (C-5 ") e 17,6 (C-6"). Os dados

estão de acordo com os valores da literatura relatados para a quercetina 3-0-

ramnosídeo (quercitrina) (MA et al., 2005; LAWRENCE et al., 2003).

Quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo (isoquercitrina) apresentou espectros de

RMN semelhante ao da quercetina. 1H RMN do composto mostrou sinais em δ 7,70

(1H, d, J = 2,0 Hz), 7,57 (1H, dd, J = 2,0 e 8,4 Hz) e 6,87 (1H, d, J = 8,4 Hz) atribuído

a H-2 ', H-6' e H - 5' do anel B, respectivamente. Os sinais restantes da aglicona em

δ 6,38 (d, J = 2,0 Hz) e 6,19 (d, J = 2,0) foram atribuídos, respectivamente, para

o H-8 e H-6, prótons do anel A, confirmando que esse flavonóide é derivado da

estrutura da quercetina (LIU et al., 2008). No entanto, a presença de um sinal em δ

5,23 (1H, d, J = 7,2 Hz), seguido de outros sinais adicionais indicam a presença de

uma molécula de açúcar. A hexose foi determinada como uma unidade glicopiranosil

vinculada a posição 3 da aglicona pela comparação de próton e carbono com dados

da literatura (SLIMESTAD et al., 1995; FOSSEN et al., 1998; LIU et al., 2008). O

sinal em δ 178,2 foi atribuído a uma carbonila ligada a C-4, os outros sinais foram:

164,7 (C - 7), 163,6 (C-5), 157,2 (C-9), 148,6 (C-4 '), 158,0 (C-2), 145,3 (C-3 '), 134,2

(C-3), 124,8 (C-1'), 121,8 (C-6 '), 116,2 (C-5'), 114,6 (C-2 '), 101,2 (C - 10), 98,5 (C-

6), 93,3 (C-8), 102,8 (C-1"), 76,9 (C - 2"), 76,7 (C-3"), 74,3 (C-4"), 69,8 (C-5") e 61,2

(C-6").

O 13C-RMN da rutina apresentou 27 átomos de carbono, indicando duas

unidades de açúcar ligadas a quercetina. Os dois sinais de prótons anoméricos em δ

5,75 (d, J = 8,0 Hz) e em δ 5,25 (d, J = 2,0 Hz) foram atribuíveis ao H-1 da glicose e

ao H-1 da ramnose, respectivamente. No espectro de 13C RMN da rutina, o sinal de

C-6 (δ 68,5) da glicose apresentou uma diferença de 7,3 ppm, em comparação com

o sinal em C-6 (δ 61,2) da quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo, indicando uma

ligação 1-6 entre o C3-glicose e a ramnose (RASTRELLI et al., 1995). A identidade

deste composto foi confirmada por cromatografia através da comparação com o

padrão de rutina e com dados da literatura (SLIMESTAD et al., 1995; FOSSEN et al.,

1998; LIU et al., 2008; RASTRELLI et al., 1995).

A fração acetato de etila das folhas de S. buxifolia foi analisada por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), essa fração contém

outros compostos em menor quantidade, além de quercetina (tempo de retenção tR

45

12,4 min), quercetina-3-0-ramnosídeo (tR = 6,4 min), quercetina 3-0-β-D-

glicopiranosídeo (tR = 5,3 min) e rutina (tR = 4,8 min). Extratos de origem natural

geralmente contêm uma série de componentes químicos diversos que estão

presentes em concentrações variáveis, é importante a utilização de métodos

cromatográficos para analisar estas misturas complexas. O perfil por CLAE da fração

acetato de etila foi obtido, bem como a quantificação de rutina e quercetina baseada

nas curvas de calibração obtidas com soluções de referência. Curva de calibração

para a quercetina: Y = 30153x - 235135, r = 0,9983; e curva de calibração para

rutina: Y = 19217x - 16949, r = 1,000. Quercitrina e isoquercitrina também foram

quantificadas, mas elas foram expressas separadamente, como conteúdo em

quercetina. O componente principal foi quercitrina, seguido por rutina, quercetina e

isoquercitrina.

Os dados de isolamento dos flavonóides, sua quantificação por CLAE, a

determinação dos teores de polifenóis totais e a avaliação da atividade antioxidante

por dois métodos (DPPH e TBARS) originaram a publicação no periódico

Bioresource Technology.

Da fração em diclorometano das cascas do tronco de S. buxifolia foram

isolados o lupeol e uma mistura de esteróides contendo β-sitosterol e estigmasterol.

Extratos vegetais normalmente possuem vários triterpenos e o fracionamento por

técnicas cromatográficas convencionais dificilmente leva ao isolamento de

substâncias puras; normalmente o resultado é uma mistura de triterpenos de difícil

resolução. Dados de 13C-RMN de triterpenos registrados na literatura mostram que

os deslocamentos dos carbonos sp2, são altamente característicos de cada

esqueleto, pelo menos em triterpenos oxigenados em C-3. Isso permite que

substâncias possam ser identificadas por dados de 13C-RMN, mesmo em misturas

(OLEA, ROQUE, 1990; GALOTTA et al., 2005).

Na fração diclorometânica das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia foi

identificada a presença de β-sitosterol e estigmasterol através de CLAE e CCD. As

cascas do tronco apresentaram a maior quantidade destes triterpenos, sendo

priorizada para o isolamento da mistura. Foram isolados 48 mg de um composto

cristalino branco, a substância apresentou-se como uma mancha única (CCD), de

coloração roxa após revelação com o reagente anisaldeído-sulfúrico e aquecimento

a 100 °C. Através dos espectros de 13C-RMN e 1H-RMN (páginas 66 e 67)

atribuíram-se os deslocamentos químicos e caracterizaram-se os átomos de

46

hidrogênio e de carbono que compõem a estrutura dos compostos. Dentre os sinais

verificados no espectro de 13C-RMN, quatro deslocamentos na região de carbonos

sp2 (121,67; 129,27; 138,30; 140,47 ppm) sugerem duas ligações duplas. Segundo

dados da literatura, sinais nestes deslocamentos (121,67 e 140,74 ppm) são

característicos de esteróides com uma dupla ligação entre C-5 e C-6 (AHMAD et al.,

1992; CHAURASIA et al., 1987; DE-EKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et

al., 1993; ZANON et al., 2008) e em 129,27 e 138,30 ppm são característicos de

uma dupla ligação entre C-22 e C-23 na cadeia lateral de esteróides (DE-

EKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993). Esses deslocamentos

químicos são muito importantes na elucidação estrutural de esteróides e são

específicos de β-sitosterol e estigmasterol. Estes compostos possuem uma mesma

insaturação (∆5), portanto os sinais nos espectros de 13C-RMN irão coincidir e assim

os sinais para C-5 e C-6 estarão mais intensos quando comparados com os outros

dois sinais referentes a insaturação em ∆22 (que está presente somente no

estigmasterol) (DE-EKNAMKUL, POTDUANG, 2003). Por apresentarem

propriedades muito semelhantes, β-sitosterol e estigmasterol, geralmente são

isolados na forma de mistura (CHAVES et al., 2004; DE-EKNAMKUL, POTDUANG,

2003; GOULART et al., 1993; ZANON et al., 2008).

O triterpeno lupeol (82 mg) também foi isolado da fração em diclorometano das

cascas do tronco de S. buxifolia, esta substância foi caracterizada por cromatografia

em camada delgada como um composto cristalino branco apresentando-se como

uma manha única, de coloração violácea após revelação com o reagente

anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100 °C. O espectro de 13C-RMN mostrou

sinais característicos de uma dupla ligação de compostos com esqueletos derivados

do lupeol (109,31 e 151,29 ppm), que conjuntamente com o grupo metila em δC

20,93, são indicativos de grupo isopropenil (C-29, C-20 e C-30, respectivamente)

(ALMEIDA et al., 2003; AGUIAR, et al., 2005), permitindo identificar a substância

como lupeol.

Esses triterpenos, embora comuns no reino vegetal, ainda não haviam sido

descritos para a espécie, o que permitiu a publicação do artigo no periódico Latin

American Journal of Pharmacy.

No anexo desta dissertação, encontram-se mais dois artigos, que também

fizeram parte do estudo fitoquímico e das atividades biológicas da planta.

47

6 CONCLUSÕES

• A maior atividade antioxidante, usando o método do DPPH, foi encontrada

para a fração butanólica e acetato de etila das cascas e folhas de S. buxifolia.

• As frações e os extratos brutos das folhas e das cascas de S. buxifolia

inibiram a produção do TBARS e apresentaram atividade antioxidante, tais

efeitos podem estar relacionados com a presença de compostos fenólicos e

de flavonóides.

• A fração acetato de etila das cascas apresentou a maior inibição da produção

de TBARS.

• Quercetina, quercitrina, isoquercitrina e rutina foram isolados da fração

acetato de etila das folhas de Scutia buxifolia. Sendo quercitrina o flavonóide

majoritário (18,3%).

• Lupeol e a mistura de β-sitosterol + estigmasterol foram isolados da fração

diclorometânica das cascas de S. buxifolia.

48

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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57

ANEXOS

58

ANEXO 01: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Quercetina

59

ANEXO 2: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Quercetina

60

ANEXO 03: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Quercetina-3-0-Ramnosídeo

61

ANEXO 4: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Quercetina-3-0-Ramnosídeo

62

ANEXO 05: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Quercetina 3-0-β-D-

glicopiranosideo

63

ANEXO 6: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Quercetina 3-0-β-D-

glicopiranosideo

64

ANEXO 07: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Rutina

65

ANEXO 08: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Rutina

66

ANEXO 09: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol +

estigmasterol

67

ANEXO 10: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol +

estigmasterol

68

ANEXO 11: Artigo publicado - Revista Saúde

73

ANEXO 12: Artigo aceito para publicação - Revista Saúde

Aline Augusti Boligon, Andrieli Cassel Feltrin, Vanessa Janovik, Janaína Kieling

Frohlich, Margareth Linde Athayde. Estudo fitoquímico das cascas do tronco de

Scutia buxifolia Reissek

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