UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

CÉLULAS –TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS

TIBIAIS AGUDOS EXPERIMENTAIS DE CÃO.

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

GRAZIELA KOPINITS DE OLIVEIRA

SANTA MARIA, RS, BRASIL 2008

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CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS TIBIAIS AGUDOS

EXPERIMENTAIS DE CÃO

por

Graziela Kopinits de Oliveira

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em

Cirurgia Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Medicina Veterinária

Orientador: Prof. Alceu Gaspar Raiser

Santa Maria, RS, Brasil 2008

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Rurais Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado

CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS TIBIAIS AGUDOS EXPERIMENTAIS

DE CÃO

elaborada por Graziela Kopinits de Oliveira

como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária

COMISÃO EXAMINADORA:

Alceu Gaspar Raiser, Dr. (Presidente/Orientador)

Ney Luis Pippi, Dr. (UFSM)

Emerson Antonio Contesini, Dr. (UFRGS)

Santa Maria, 07 de maio de 2008.

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Dedico esta dissertação a meus pais e irmãos que sempre foram o verdadeiro significado de

amor incondicional na minha vida.

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AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeço a Deus, que sempre iluminou meu caminho e me deu

forças mesmo nos momentos de maior dificuldade, não me deixando desistir nunca de meus

sonhos.

Agradeço a meus pais, sempre maravilhosos, e sempre do meu lado, e que mesmo

distante faziam de tudo para ficarem mais perto, e agradeço por todo orgulho que eles têm de

mim. Por tornarem a minha vida mais fácil e feliz, e por serem meus pais. Amo vocês.

A meus irmãos More e Cá, que são a melhor parte de mim, meus melhores amigos,

meus scaffolds, meus lindos que eu tanto amo, e que me fizeram tanta falta nesse tempo que

passei longe, mas que apesar da distância sempre estiveram bem juntinho de mim.

A Rapha, mais que namorado, meu melhor amigo, que apesar dos problemas sempre

esteve do meu lado, sempre me deu forças, e me fez companhia, mesmo que pela internet,

nesse tempo longe. Um menino lindo e chatinho que é uma parte boa de minha vida. Te adoro

muito.

Ao meu padrinho Gildo, e primos Gabi, Markus, Carol e Camilinha, pessoas que amo

muito.

Ao meu gato Zé, que me ensinou a amar aos gatos tanto quanto aos cães.

Ao meu orientador professor Alceu Gaspar Raiser, mais que orientador, uma pessoa

maravilhosa, que me ajudou muito durante o mestrado, e que me fez querer ser igual a ele

quando eu crescer.

Ao professor Ney Luis Pipi, um verdadeiro paizão entre os professores do LACE,

sempre disposto a proteger, mesmo os não orientados dele, que terminavam se tornando

orientados por tabela.

Ao prof. Adriano Carregaro, um orientador com cara de pós graduando, que ensinou a

cada um de nós a gostar de anestesia, como se fosse cirurgia, se é que isso é possível.

Ao professor Alexandre Mazzante, um professor excelente, que me ensinou a entender

um pouco de neurologia, e que nos proporcionou momentos bem divertidos estudando em

grupo para as provas de neuro.

Ao professor João Eduardo, um grande professor, e que apesar de não termos muita

aproximação me ajudou muito, principalmente nos deixando fazer os plantões do bloco 2,

uma forma de crescer o estudante de pós-graduação.

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À profa. Sônia Lopes e a todos os professores da pós-graduação em Medicina

Veterinária, que tornaram o meu aprendizado mais fácil, e me tornaram uma profissional

muito melhor.

À toda a minha equipe (Débora, Fabiano, Danieli, Guilherme, Josaine, Laetícia,

Eduardo, Francieli, Priscila, Tiagão, Lorenço, João Paulo e Arícia), grandes amigos que

tornaram os dias cansativos de experimento muito mais divertidos, e com a qual eu pude

contar sempre.

Ao amigo Fabiano, uma pessoa pura e divertida, com qual podemos contar sempre.

Um menino maravilhoso que gosto muito.

À amiga Débora Olsson, sempre preocupada em cuidar da gente e em nos fazer

crescer. Uma pessoa maravilhosa e explosiva, que aprendi a gostar de verdade.

À amiga Josaine, que me acompanhou desde o começo do mestrado, e que se tornou

uma grande amiga que tenho certeza que sempre vai estar do meu lado e sempre torcendo por

mim. Uma amiga que mora no meu coração.

À amiga Laetícia, que passou a fazer parte de minha vida no dia da prova de mestrado,

uma pessoa muito divertida, sempre alegre e que aturou muito maus momentos de mau

humor. Obrigada pelas conversas que sempre me animaram.

Ao amigo Guilherme, ou simplesmente Gui, outro que entrou na minha vida no dia da

prova do mestrado, e que espero que não saia mais. Agradeço por todos os momentos

divertidos com ele e Mari, pessoas mais do que especiais. Amigos que estão sempre do seu

lado.

À amiga Danieli, uma pessoa muito especial, sempre pronta para ajudar aos amigos, e

com quem eu adoro conversar.

À amiga Lisiane, que de tão maravilhosa se tornou uma irmã mais velha para mim. E a

toda família da Lisi (Pipo, Nanda e Nati), que me acolheram tão carinhosamente quando fui

visitá-los.

Aos amigos da pós-graduação Kleber, Fabrício, Eduardo, Rafael, Daniel, Charles,

Renata (virologia), Paula, Fernando, Gabrieli, Bia, Érica, Rogerião e Diego por serem

especiais e tornarem os dias longe de minha família mais fáceis.

Aos estagiários Francieli, Priscila, Tiagão, Lorenço, João Paulo, Arícia, pelo amor que

tiveram pelos meus cães, pelo carinho que me dedicaram, e por terem conquistado minha

amizade.

A todos os estagiários que passaram pelo LACE e pelo bloco 2.

Às companheiras de apartamento Deisi, Micheli e Tati, amigas muito especiais.

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À tia Menô, minha mãezona gaúcha.

A todos os funcionários do Hospital Veterinário e do LACE, pelas conversas no

banheiro e no corredor, pelo carinho e dedicação.

A meus cães, os melhores de todos, meus amiguinhos lindos, em especial ao Lost e à

Juli, que perderam a vida durante o experimento. Sem vocês nada disso seria possível.

Às empresas pedigree, JP Indústria Farmacêutica S.A , Pharmacia Brasil, Ouro fino e

technewindustria por terem contribuído com a execução de meu experimento.

À Capes pela bolsa e ao Cnpq pelo auxílio financeiro ao meu experimento.

À UFSM, que me proporcionou estrutura física para o desenvolvimento de minha

pesquisa e professores maravilhosos.

Ao LACE, laboratório de análises clínicas, e laboratório de virologia, pela estrutura

para o desenvolvimento de meu experimento.

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RESUMO

Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

Universidade Federal de Santa Maria

CÉLULAS –TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS TIBIAIS AGUDOS EXPERIMENTAIS

DE CÃO. AUTORA: GRAZIELA KOPINITS DE OLIVEIRA

ORIENTADOR: ALCEU GASPAR RAISER Santa Maria, 03 de março de 2008

Nesta pesquisa foi abordada a utilização de células-tronco mononucleares (CTM) na

cicatrização de defeito ósseo experimental, como alternativa aos métodos convencionais,

analisando-se a velocidade da cicatrização, além da presença dessas células no tecido

neoformado. Foram utilizados 18 cães, separados em três grupos de seis, e de cada animal

foram colhidas células da medula óssea (MO), contadas e analisadas para morfometria,

através da contagem manual e mielograma. Um defeito ósseo tibial foi então criado

cirurgicamente, e a lesão tratada com esponja de gelatina embebida em solução fisiológica

(G1), esponja de gelatina embebida com aspirado de medula óssea processado (G2) e esponja

de gelatina embebida com aspirado de MO processado e proteína óssea morfogenética (G3).

A cicatrização foi então avaliada por estudos radiográficos e a presença de CTM foi

identificada através de marcadores nanocristais Qtracker em microscopia com luz

fluorescente uma semana após a intervenção cirúrgica. Entre as células identificadas pelo

marcador, foram encontradas células da linhagem óssea. As avaliações radiográficas

demonstram crescimento ósseo acelerado nos grupos G2 e G3, e estatisticamente houve

diferenças significativas entre o G1 e G3 em todos os tempos estudados e entre G1 e G2 nos

tempos de 30 e 45 dias. A utilização de células-tronco mononucleares adultas suplementadas

ou não com rhBMP-2 são alternativas favoráveis ao crescimento ósseo em defeitos

experimentais agudos de tíbia de cães.

Palavras-chave: Células-tronco, proteína óssea morfogenética, osso, tíbia, cães.

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ABSTRACT

Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

Universidade Federal de Santa Maria

AUTOLOGOUS MONONUCLEAR STEM CELLS IN DOGS: EXPERIMENTAL ACUTE TIBIAL DEFECT HEALING.

AUTORA: GRAZIELA KOPINITS DE OLIVEIRA

ORIENTADOR: ALCEU GASPAR RAISER Santa Maria, 03 de março de 2008.

This research was aimed at evaluating the mononuclear stem cells (MSC) use in

experimental bone defect healing, as an alternative to the conventional methods, analyzing the

healing speed, and the presence of these cells in the new-born tissue. The bone marrow (BM)

was collected from 18 dogs, counted and morphometrically analyzed, through manual count

and myelogram. The dogs were separated in three groups (G1, G2, G3) of six animals. A

surgical tibial bone defect was made then, in each dog and the wound was treated with gelatin

sponge and physiologic solution (G1), gelatin sponge and processed bone marrow (G2) and

gelatin sponge, processed BM and morphogenetic bone protein (G3). The healing was then

evaluated through radiographic study and the presence of MSC was identified through

Qtracker nanocrystal labeler and fluorescent light microscopy one week after the surgery.

Cells from the bone lineage were found among the labeled cells. The radiographic evaluations

demonstrate speeding in bone growth in the groups G2 and G3, and were significant

statistically differences between the G1 and G3 in all studied periods and between G1 and G2

at the 30 and 45 days period. The supplemented or not-supplemented with rhBMP-2 adult

mononuclear stem cells use are favorable alternatives to the speed the healing process of acute

dog tibial experimental defects.

Key words: stem cells, Bone Morfogenetic Protein, bone, tibia, dogs

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Níveis de hemoglobina medidos antes do início da colheita de medula óssea,

imediatamente antes do início e após o término da autotransfusão

sanguínea...................................................................................................................................36

TABELA 2 – Número de células e viabilidade celular obtida no botão celular dos cães dos

grupos G2 e G3.........................................................................................................................37

TABELA 3 – Resultados da Imunofluorescência e da biopsia óssea para identificação das

células marcadas com nanocristais Q-tracker...........................................................................38

TABELA 4 – Taxa de crescimento ósseo, observada através de radiografias. Comparação de

cada tempo com o exame radiográfico pós-operatório imediato..............................................40

TABELA 5: resultados do teste t de studente na comparação entre o crescimento ósseo entre

os grupos aos 15, 30 e 45 dias...................................................................................................42

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1 - Condições de alojamento dos animais em boxes individuais de aço inoxidável

no Biotério de Experimentação Animal da Universidade Federal de Santa

Maria.........................................................................................................................................24

FIGURA 2 - A. Animal posicionado em decúbito lateral, com panos de campo já

posicionados, para ser submetido à colheita de medula óssea. B. Posicionamento da agulha de

Steis na fossa trocantérica do fêmur para coleta de medula......................................................26

FIGURA 3 - Colheita de medula óssea no acesso pela fossa trocantérica (A) e pela asa do íleo

(B) através de pressão negativa em seringa previamente heparinizada em um cão..................27

FIGURA 4 - Apresentação da medula óssea sendo colhida para a bolsa coletora (A) e

filtragem da mesma através de filtros de 200µ contidos no kit bone marrow

(B).............................................................................................................................................27

FIGURA 5 - Colheita de uma alíquota de 3ml de medula óssea da bolsa de infusão, usada

para contagem da porcentagem de células nucleadas e teste de viabilidade

celular........................................................................................................................................28

FIGURA 6 - (A) Colocação de Histopaque (B) em tubos falcon de 50ml, para posterior

adição de sangue de medula óssea............................................................................................29

FIGURA 7 - A. Nuvem de células mononucleares (seta), isolada em gradiente de densidade,

após centrifugação do sangue de medula óssea. B. Botão celular, contendo células

mononucleares, obtido após centrifugação para marcação com nanocristais...........................30

FIGURA 8 - A. Nanocristais Q-tracker. B. Células mononucleares marcadas com de

nanocristais Q-tracker, vista através de microscopia fluorescente (ampliação da objetiva:

40X)..........................................................................................................................................30

FIGURA 9 - A e B. Defeito monocortical sendo confeccionado com uma broca de desgaste

sobre a região medial proximal da tíbia. C Defeito ósseo monocortical sobre a região medial

12

da tíbia. D. Aprofundamento do defeito ósseo monocortical sobre a região proximal da

tíbia............................................................................................................................................31

FIGURA 10 - A. Apresentação comercial da esponja de colágeno. B. Esponja de colágeno

medindo 2,5 x 2,0cm, para utilização como carreador de células-tronco mononucleares........32

FIGURA 11 - A. Esponja de colágeno sendo embebida em solução salina. B. Esponja de

colágeno sendo embebida com o botão celular de células-tronco mononucleares...................33

FIGURA 12 - A. Esponja de gelatina embebida com células-tronco mononucleares. B.

Esponja de colágeno sendo colocada no defeito ósseo tibial de cão........................................33

FIGURA 13 - Raspagem óssea com bisturi, lâmina n. 10, nas adjacências do defeito tibial

para confecção de lâminas de leitura para identificação de células-tronco

marcadas....................................................................................................................................34

FIGURA 14 - Tecido ósseo colhido através de biopsia, positivo (verdes) à leitura de

microscópio fluorescente. (ampliação da objetiva: 40X)..........................................................39

FIGURA 15 - Tecido ósseo colhido através de biopsia à leitura do microscópio óptico A.

Osteoclastos. B. Osteócito. (ampliação da objetiva 100x)........................................................39

FIGURA 16 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes tempos

avaliados em um cão do grupo 1. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D -

45 dias de pós-operatório (Animal 5).......................................................................................41

FIGURA 17 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes tempos

avaliados em um cão do grupo 2. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D -

45 dias de pós-operatório. (Animal 10)....................................................................................41

FIGURA 18 - Radiografia mostrando ao aumento da densidade óssea nos diferentes tempos

avaliados em um cão do grupo 3. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D -

45 dias de pós-operatório. (Animal 17)....................................................................................42

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LISTA DE ABREVIATURAS

CTM – Células-tronco mononucleares BMP – Proteína óssea morfogenética rhBMP-2 - Proteína óssea morfogenética recombinante humana CT – Células-tronco CTA – Células-tronco adultas CP – Células progenitoras QDs – Pontos quânticos COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal UFSM – Universidade Federal de Santa Maria MO – Medula óssea MPA – Medicação pré-anestésica LACE – Laboratório de cirurgia experimental FTCM – Fração total de células mononucleares DMEM – Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................15

2 DESENVOLVIMENTO........................................................................................................17

2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................17

2.1.1 Osso e cicatrização óssea.................................................................................................17

2.1.2 Proteína óssea morfogenética (BMP)..............................................................................18

2.1.3 Células-tronco..................................................................................................................19

2.1.4 Carreadores (Scaffold)......................................................................................................22

2.2 METODOLOGIA...............................................................................................................23

2.2.1 Comitê de ética em pesquisas com animais.....................................................................23

2.2.2 Animais............................................................................................................................23

2.2.3 Separação dos animais.....................................................................................................24

2.2.4 Colheita de material para transfusão autóloga.................................................................25

2.2.5 Pré-operatório e protocolo anestésico..............................................................................25

2.2.6 Colheita das Células.........................................................................................................25

2.2.7 Processamento do sangue da medula óssea para obtenção de CTMs..............................28

2.2.8 Procedimento cirúrgico....................................................................................................31

2.2.9 Cuidados Pós-operatórios................................................................................................33

2.2.10 Avaliação radiográfica...................................................................................................34

2.2.11 Avaliação das amostras através da fluoroscopia............................................................34

2.2.12 Análise estatística...........................................................................................................34

2.2.13 Doação de animais.........................................................................................................35

2.3 RESULTADOS...................................................................................................................35

2.4 DISCUSSÃO......................................................................................................................42

3 CONCLUSÃO.......................................................................................................................46

4 REFERÊNCIAS.....................................................................................................................47

15

1 INTRODUÇÃO A atual condição socioeconômica tem favorecido a prevalência dos traumatismos em

pequenos animais devido ao aumento da convivência destes com os seres humanos, seja

perambulando pelas ruas, ou mesmo como animais de estimação. Eles estão sujeitos aos mais

diversos tipos de agressões, como atropelamentos, quedas de grandes alturas, chutes, coices e

ferimentos por armas de fogo. Na maioria das vezes, esses traumatismos vêm acompanhados

de fraturas.

Além disso, a melhora da qualidade de vida dos animais domésticos acarreta em um

aumento da idade média, trazendo uma maior incidência de doenças sistêmicas que atrasam a

cicatrização dos tecidos, incluindo o tecido ósseo. Por isso, novas alternativas têm sido

estudadas para diminuir o tempo de cicatrização dos tecidos e para aumentar a qualidade

dessa cicatrização.

Nos últimos anos, uma nova área da medicina vem sendo desenvolvida, que abre

perspectivas inovadoras para o tratamento de doenças crônico-degenerativas. É a chamada

medicina regenerativa que consiste na utilização de células, fatores de proliferação e

diferenciação celulares e biomateriais que permitem ao próprio organismo reparar tecidos e

órgãos lesados. Alguns dos alvos terapêuticos são órgãos considerados por muito tempo como

incapazes de desenvolver quaisquer processos de regeneração, como o cérebro e o coração.

O princípio da terapia celular consiste em restaurar a função de um órgão ou tecido com a

substituição das células perdidas por uma doença ou substituir células que não funcionam

adequadamente devido a um defeito genético, vascular ou iatrogênico.

As células tronco mesenquimais (CTMs) estão sendo estudadas amplamente, para tentar

melhorar o tempo e a qualidade cicatricial de diversos tecidos, tanto em animais, quanto em

humanos. As células-tronco da medula óssea são pluripotentes, ou seja, têm capacidade de se

diferenciar em diversos tipos de tecido, dependendo do ambiente no qual se encontram. Este

tipo celular tem sido bastante estudado, com pesquisas sendo desenvolvidas nas áreas de

cardiologia, oftalmologia, ortopedia, neurologia, entre outras, e obtendo resultados positivos.

Em vista disso, pretende-se nesta pesquisa:

- Verificar a atuação das CTMs no mecanismo cicatricial de falhas experimentais em osso

tibial de cães e eventuais complicações do procedimento.

Mais especificamente, objetiva-se:

- Avaliar a atuação das CTMs suplementadas ou não com rhBMP-2, no tempo de

cicatrização de defeito de tíbia de cães;

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- Verificar a eficiência de nanocristais Q-tracker na marcação e confirmação de CTMs

uma semana após serem implantadas nos defeitos ósseos e o tipo celular encontrado entre as

células marcadas;

- Comparar a osteogênese entre os grupos controle, suplementados com CTMs e dos que

receberam CTMs com rhBMP-2 através de ensaios radiográficos.

17

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 Revisão Bibliográfica

2.1.1 Osso e cicatrização óssea:

O osso é o elemento estrutural primário do corpo. Ele serve para proteger órgãos

internos vitais e dar suporte aos músculos que permitem o movimento do esqueleto (LIRANI,

2004). Pode ser considerado tecido ou órgão. Como tecido, caracteriza-se por um tipo

especializado de conjuntivo, cuja principal característica é a rigidez, devido ao elevado

conteúdo de minerais. Como órgão é uma estrutura composta por vasos, cartilagem, tecido

conjuntivo fibroso, tecido adiposo e tecido hematopoético (WASSERMAN et al., 1993).

O osso é um dos tecidos mais rígidos e resistentes do corpo, contudo, é

freqüentemente lesionado, ocorrendo fraturas completas ou incompletas (DOUAT, 2004).

Fratura do sistema esquelético constitui lesão consumada do osso, consistindo de todos os

aspectos de lesão física e circulatória do conteúdo celular viável e da integridade estrutural

óssea (LIRANI, 2004).

A cicatrização óssea corresponde ao processo biológico que ocorre após uma

destruição cartilaginosa e óssea, que restaura a continuidade tecidual necessária para a função

(FOSSUM, 2005). É processo fisiológico complexo. Para que ocorra a consolidação ótima,

haverá necessidade de boa irrigação sanguínea, redução adequada dos fragmentos da fratura,

estabilização e fixação apropriadas da fratura e animal sadio. O comprometimento de

qualquer destes fatores poderá resultar em consolidação retardada da fratura e, potencialmente

numa não-união (MILLIS; PROBST, 1996). Segundo Piermattei; Flo (1999) o tempo

necessário para união clínica em caso de fraturas típicas, não complicadas, é em torno de sete

semanas em animais adultos, mas há variações dependendo do método de fixação utilizado.

O mecanismo de formação embriológica do osso requer uma orquestração de fatores

celular, humoral e mecânicos, resultando na formação do esqueleto ósseo e fatores mecânicos

resultam na formação de tecidos esqueletais ósseos capazes de crescimento controlado,

resposta estrutural ao estresse, e reparo da ferida, unicamente sem cicatriz. O reparo ósseo se

compara à formação embriológica, pois envolve a integração celular, humoral e mecânica. A

base do osso em formação e em reparo são as células-tronco mesenquimais, as quais

respondem e produzem citocinas regenerativas, replicam e se diferenciam, formam a matriz

estrutural e respondem à demanda mecânica para restaurar as funções do esqueleto (KRAUS;

KIRKER-HEAD, 2006).

18

A cicatrização óssea é influenciada pelos fatores de crescimento ósseo, peptídeo ou

glicoproteínas, que organizam e coordenam a mitose celular, quimiotaxia, diferenciação e

crescimento das células produtoras de matriz óssea. (HERNDON et al., 1992).

Os fatores de crescimento são secretados pelos osteoblastos e estão presentes em

quantidades muito pequenas. Os três principais componentes ósseos são o mineral, a matriz

orgânica e células osteogênicas: mineral, sendo responsável por dois terços do volume ósseo e

composto por cristais de fosfato de cálcio depositado como hidroxiapatita; matriz orgânica,

correspondendo a um terço da massa óssea e composta por colágeno, proteínas não colágenas

e água. Incluídas dentro das proteínas não colágenas estão as proteínas ósseas morfogenéticas,

as quais são responsáveis pela morfogênese óssea e regulação da atividade celular osteogênica

(MASTROCINQUE. et al., 2004).

Modelamento e remodelamento ósseo podem ser incitados por microlesões, estímulos

mecânicos, estímulos combinados ou por mecanismos desconhecidos. No entanto, em alguns

casos clínicos, regeneração óssea ou aumento de massa óssea não ocorre da forma esperada, o

que torna necessário o implemento de métodos coadjuvantes para a obtenção dos resultados

esperados (CARVALHO et al., 2004).

Apesar dos crescentes avanços em algumas áreas sobre os procedimentos nas fraturas, o

ortopedista pouco pode fazer para aumentar a velocidade de consolidação da mesma. Assim,

terapias alternativas, que possam auxiliar na recuperação de fraturas são muito importantes,

pois podem minimizar o tempo de tratamento e os custos, garantindo o retorno mais rápido às

atividades normais (DOUAT, 2004).

2.1.2 Proteína óssea morfogenética

As pesquisas biomoleculares sobre o desenvolvimento e a reparação óssea permitiram a

descoberta de uma nova família de proteínas reguladoras da formação óssea e cartilaginosa in

vivo. Capazes de iniciar a neoformação óssea quando implantadas em sítios extra-ósseos,

estas proteínas são denominadas de proteínas ósseas morfogenéticas ou BMPs. A purificação

e a caracterização das BMPs contribuíram para a fundamentação do conhecimento molecular

e celular do processo de reparo ósseo. A resposta tecidual ao implante de BMPs ocorre de

modo similar ao desenvolvimento ósseo embriológico, possibilitando a formação e o

desenvolvimento da reparação na osteogênese pós-natal (GONÇALVES et al., 1998).

A história da identificação e purificação da BMP iniciou-se em 1965, quando Urist

induziu a neoformação óssea em sítios ectópicos (tecido subcutâneo e intramuscular),

implantados com fragmentos de osso desmineralizado, no período de duas semanas. Embora

19

não fosse possível determinar se o componente ativo no extrato ósseo era composto por uma

ou mais moléculas, este foi identificado como sendo de origem protéica e denominado por

Urist (1965) de proteína morfogenética óssea (GONÇALVES et al., 1998.).

BMPs de 2 a 9 (BMP-2 a BMP-9) constituem membros da família de fator de crescimento

transformador beta (TGF- β) (SANTOS et al., 2005), e estão envolvidas em uma grande

variedade de processos biológicos, incluindo diferenciação osteoblástica e cicatrização óssea

(SINGHATANADGIT et al., 2006). São consideradas osteoindutores, ou seja, têm a

capacidade de induzir formação óssea quando colocados em um local onde nenhuma

formação óssea iria ocorrer (KRAUS; KIRKER-HEAD, 2006).

As BMPs 2, 4, 5, 6 e 7 possuem importância fundamental na regulação da formação de

tecido esquelético e reparação, sendo que estas proteínas têm diferentes potenciais

osteoindutores. As proteínas morfogenéticas ósseas 4 ou 5, por exemplo, precisam estar

presentes em grandes quantidades para induzir a mesma quantidade de tecido ósseo que seria

induzido pela BMP 2 (WOZNEY; ROSEN, 1998).

Em termos de fator de crescimento osteoindutivo, a maior parte se focou no uso da

BMP-2, uma proteína de matriz óssea que estimula a quimiotaxia e a ploriferação da célula

mesequimal, e promove a diferenciação dessas células em condrócitos e osteoblastos (CHU et

al., 2007).

Ferrigno et al. (2007) relataram o uso de BMP em cães com fraturas distais de rádio e

ulna. Neste trabalho foram utilizados 33 cães com peso abaixo de 6kg, sendo 17 animais

alocados no grupo controle (osteossíntese com placa e parafuso) e 16 no grupo tratado

(osteossíntese com placa e parafuso com adição de BMP). Esses autores compararam o tempo

de cicatrização entre os grupos e observaram que o grupo tratado com BMP teve uma redução

significativa no tempo da mesma. Em relação ao tempo de união óssea, o grupo controle

apresentou 12% de animais cujo tempo de união óssea foi de 90 dias, 47% de união óssea aos

120 dias, 6% em 180 dias, 6% em 210 dias e 29% dos animais não apresentaram união óssea

até o final do experimento. No grupo BMP os resultados quanto ao tempo de união óssea

foram: 81% dos animais apresentaram consolidação óssea com 30 dias de pós-operatório e em

6% dos animais o tempo de união óssea encontrado foi de 60 dias e 13% não apresentaram

união óssea.

2.1.3 Células-tronco:

Sabe-se que vários tipos celulares estão em investigação em experimentos animais, porém,

o maior potencial terapêutico está nas células tronco. A CT é um tipo especial de célula, que

20

possui as seguintes características: capacidade de proliferação indefinida, auto-renovação,

produção de diferentes linhagens celulares e regeneração de tecidos. Estão presentes

principalmente em embriões (CT embrionárias), no cordão umbilical e na medula óssea, que

são chamadas de CT adultas (SILVEIRA et al., 2006).

Segundo Mota et al., (2005), por não envolver as mesmas questões filosóficas, éticas e

religiosas observadas com a utilização de células-tronco embrionárias, a utilização de células

de medula óssea de indivíduos adultos abriu um novo horizonte na medicina reparadora, ou

regenerativa, onde não há possibilidade de rejeição imunológica (já que as células são

autólogas) nem a necessidade de estoque de células em bancos de tecidos (já que o estoque

aparentemente é inesgotável).

As células da medula óssea são pluripotentes e com capacidade de se diferenciarem

dependendo do meio no qual se encontram. As células da medula óssea podem sofrer dois

processos de diferenciação: as células mononucleares (indiferenciadas) e as multinucleares.

Dentre as células mononucleares, existe a hematopoiética, que originará células do sangue

(linfócitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, células vermelhas e plaquetas) e a

mesenquimal, que poderá originar células musculares, hepatócitos, osteócito, tecido adiposo,

condrócitos e estroma (SOUZA et al., 2005).

A vantagem mais óbvia no uso de células-tronco não expandidas é a simplicidade do

procedimento em que células extraídas da medula óssea podem ser imediatamente

introduzidas no sítio do defeito ósseo. Este procedimento é o mais usado, não somente porque

é barato e não requer a instrumentação extra, mas também porque pode ser considerado como

um procedimento invasivo mínimo e não requer que o paciente seja imunossuprimido

(LUCARELLI et al., 2004).

A terapia celular e gênica tem-se mostrado muito promissora como opção de tratamento.

Reside aqui, provavelmente, a maior perspectiva de uso clínico desta moderna tecnologia,

surgindo como alternativa de solução para o paciente de enfermidade sem solução.

Obviamente, ainda está em fase inicial de investigação e pesquisa, e os resultados obtidos no

mundo ainda são preliminares (LEITE; DOHMANN, 2004).

Em diversos estudos, a proporção de CT transplantadas, que foram incorporadas pelo

tecido lesado e que se diferenciaram, não explica a melhora funcional observada. Assim, uma

explicação relevante para a regeneração tecidual após aplicação de CT é a liberação de

citocinas e fatores tróficos no local da lesão. Como a maioria das CT é capaz de identificar e

migrar até o local lesionado, é clara sua capacidade de responder a fatores quimiotáticos

21

(liberados pelo tecido lesionado). Há ainda evidências de que estas células, por sua vez,

podem ser capazes de liberar outras moléculas em resposta aos estímulos quimiotáticos

recebidos. Há várias hipóteses quanto às supostas funções de tais fatores na lesão, dentre elas:

liberação de moléculas que previnem a morte celular, recrutamento de CT adjacentes do

próprio tecido (com subseqüente diferenciação), interferência na inflamação provocada pelo

dano tecidual (modulando a resposta do sistema imune), suporte de moléculas ou enzimas que

suprem defeitos metabólicos (SCHWINDT et al., 2005).

Supõe-se que as CTA permaneçam quiescentes (sem se dividirem) nos tecidos que

constituem seu habitat, até que sejam ativadas por doenças, inclusive tumores ou traumatismo,

e também para fazer a reposição de células “gastas” no organismo ao longo da vida, através

da liberação, no sangue circulante, de células progenitoras (CP), que seriam mobilizadas para

os locais onde se fizessem necessárias. Essa mobilização seria feita por substâncias liberadas

no local da lesão (ASAHSRA et al., 1999).

Kitoh et al. (2004), utilizaram CTMs, expandidas em cultura, associadas à plasma rico em

plaquetas e fixador externo, para alongamento ósseo em humanos, e obtiveram uma

diminuição no tempo de osteogênese, diminuindo com isso as complicações decorrentes do

prolongado tempo de manutenção de implantes no osso.

Modelos experimentais de defeitos ósseos tratados com CTMs têm demonstrado que

ambientes biológicos e mecânicos favoráveis resultam em proliferação e diferenciação de

CTM em osteoblastos e condrócitos, e que a presença de células-tronco em defeitos ósseos

experimentais diminui o tempo de cicatrização do defeito (KRAUS; KIRKER-HEAD, 2006)

Foram desenvolvidos modelos animais para testar o reparo ósseo através da engenharia de

tecidos. Os estudos diferem com relação aos animais (ovelhas, cães, cabras), osso tratado

(fêmur, tíbia, mandíbula) e quanto á estrutura e química dos carreadores (ZHU et al., 2006).

Kon et al. (2000) Avaliaram o potencial de reparo de CTMs em defeitos ósseos in vivo em

ovelhas. Eles criaram um defeito crítico na tíbia de ovelhas e reconstruíram o segmento

perdido com a implantação de um adequado andaime poroso projetado (100% hidroxiapatita).

A cerâmina foi semeada com CTM ou utilizada vazia. Os animais foram sacrificados dois

meses após a cirurgia. Embora formação óssea tenha sido histologicamente verificada nos

dois grupos, nos cilindros semeados, a formação óssea ocorreu dentro dos microporos da

cerâmica, enquanto nos não semeados, a formação se restringiu ao espaço externo ao cilindro.

Kraus; Kirker-Head (2006) utilizaram cães como modelo animal para avaliar a

cicatrização de defeitos segmentários em fêmur; estes autores criaram um defeito com 21mm

e fixaram o mesmo com placas de alongamento, com intuito de criar uma não-união atrófica.

22

Após 16 dias da criação do defeito, CTMs foram então colhidas desses cães, isoladas e

cultivadas. Após cultura, estas células eram colocadas em cilindros de hidroxipatita e

implantadas no fêmur dos cães dos quais elas haviam sido colhidas. A adição de CTMs

resultou em estímulo para neoformação óssea em áreas adjacentes ao implante, sugerindo que

estas estavam se infiltrando no osso hospedeiro, ou estimulando o mesmo a formar novo osso.

Células-tronco são identificadas principalmente através de marcadores de superfície

(KIRSCHSTEIN, 2001). Ferramentas novas de diagnóstico celular incluem pontos quânticos

(QDs) que são nanocristais semicondutores caracterizados por alta fotoestabilidade e

excitação de um único comprimento de onda (HASSAN et al., 2006).

Fundamentalmente nanocristais são substâncias fluoróforas que absorvem fótons de luz e

reemitem com um comprimento de onda diferente. Essas partículas provêem luminosidade e

fluorescência fotoestável que podem ser observadas por horas e tecidos marcados com

nanocristais podem ser arquivados permanentemente. Os nanocristais são capazes de marcar

quase todos os tipos de material de interesse (INVITROGEN, 2007). Segundo Garon et al.

(2007) nanocristais fluorescentes podem ser localizados por pelo menos quatro gerações

celulares, e algumas células permanecem marcadas por até duas semanas.

2.1.4 Carreadores (Scaffold)

A presença de um material de suporte é indispensável quando se necessita reconstituir um

tecido ósseo adulto. Macroscopicamente ele vai permitir a manutenção de volume ósseo

perdido e prevenir a invaginação de massa muscular circunvizinha no defeito ósseo. Do ponto

de vista tecidual, este material vai fazer o papel de vigamento, no qual novo tecido será

formado. Em nível celular obtém-se uma superfície na qual as células-tronco poderão se

aderir, proliferar e diferenciar (POTIER; PETITE, 2005).

Engenharia de tecido para o osso envolve tipicamente células osteogênicas e/ou fator de

crescimento osteoindutivo com scaffolds osteocondutivos. Em termos de fator de crescimento,

a maior parte se focou no uso de proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) e, em particular,

BMP-2. BMP-2 é uma proteína de matriz óssea que estimula a quimiotaxia e a ploriferação da

célula mesequimal, e promove a diferenciação dessas células em condrócitos e osteoblastos

(CHU et al., 2007).

Segundo Potier; Petite (2005) As especificações destes materiais de apoio ideais, para

formação de tecido ósseo, são contraditórias. Porém, geralmente considera-se que este

material deva ser: biocompatível, pois uma reação inflamatória intensa poderia resultar na

modificação do potencial osteogênico, ou mesmo na destruição celular; osteocondutor, para

23

permitir a deposição de tecido ósseo em contato direto com o material, sem interposição

fibrosa; resistente, para sustentar cargas de apoio; reabsorvível, para permitir sua substituição

progressiva por tecido ósseo neoformado; porosos, com porosidade interconectada

compreendida entre 100 e 500 micrômetros, para dar espaço para as células e vasos

sanguíneos; radiotransparente, para permitir ao cirurgião o acompanhamento do crescimento

ósseo ao longo do tempo; maleável, para ser moldado e adaptado ao defeito no qual ele se faz

necessário.

Atualmente muitos materiais têm sido testados em terapia celular, porém nenhum deles

demonstrou possuir todas as características almejadas para esta função.

Segundo a bula do fabricante da esponja de colágeno Gelfoam®, este material é uma

esponja cirúrgica, dobrável e esterilizada, que quando implantada em tecidos é completamente

absorvida dentro de quatro a seis semanas, sem acarretar formação excessiva de tecido

cicatricial ou reação celular. Além disso, é uma matriz dobrável, porosa, moldável e cortável.

Este produto é indicado como hemostático em cirurgias ósseas, pois não interfere no processo

cicatricial.

2.2 Metodologia

2.2.1 Comitê de ética em pesquisas com animais

Este estudo foi submetido à aprovação do Comitê em Ética em Pesquisa com animais

da Universidade Federal de Santa Maria, sob o no 23081.017095/2006-47 e seguiu os

princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Somou-se a

preocupação de bem estar dos animais de acordo com a Lei no. 5.517 de 23 de outubro de

1968, artigo 5o; Lei no. 6.638 de 08 de maio de 1979; à resolução no. 592 de 26 de junho de

1992 e Projeto de Lei no. 9.605/1998 e no. 1. 691/2003.

O Comitê de Ética em Experimentação em Pesquisas com Animais da Universidade

Federal de Santa Maria - UFSM segue as propostas legais do COBEA, que é uma Sociedade

Civil, de caráter científico-cultural, sem fins lucrativos, de duração indeterminada, com sede e

foro na cidade de São Paulo, constituída por pesquisadores e técnicos interessados em

experimentação animal.

2.2.2 Animais

Foram utilizados 18 cães adultos, hígidos, machos ou fêmeas, com peso em torno de

8,5kg (5 a 12kg), obtidos no Biotério Central da UFSM. Os animais passaram por um período

24

de adaptação de 20 dias durante os quais receberam tratamento anti-helmíntico à base de

prazinquantel e pamoato de pirantel. Foi realizada uma avaliação clínica e laboratorial

(urinálise, hemograma e perfil bioquímico) em todos os animais.

Durante todo o experimento, os animais foram mantidos em boxes individuais

medindo 70cm de largura, 100cm de profundidade e 80cm de altura (Figura 1), recebendo

ração Pedigree High Performance e água ad libitum.

Para a realização do procedimento cirúrgico os animais receberam banho 24 horas

antes da intervenção e jejum alimentar de 12h e hídrico de 2h. Os animais eram pesados e

realizou-se tricotomia ampla nos membros posteriores e na região pélvica.

2.2.3 Separação dos animais

Todos os cães foram submetidos a colheita de sangue da medula óssea e intervenção

cirúrgica criando-se um defeito de forma elíptica medindo 1,5x1,0cm na tíbia proximal que

recebeu esponja de colágeno1. Eles foram separados em três grupos:

1 Gelfoam, Pharmacia brasil ltda, São paulo, SP.

Figura 1 - Condições de alojamento dos animais em boxes individuais de aço inoxidável no Biotério de Experimentação Animal da Universidade Federal de Santa Maria.

25

grupo 1 (G1) com 6 animais nos quais o defeito tibial foi preenchido com esponja de

colágeno e solução fisiológica;

grupo 2 (G2) com 6 animais nos quais o defeito tibial foi preenchido com esponja de

colágeno e medula óssea (MO) processada;

grupo 3 (G3) com 6 animais nos quais o defeito tibial foi preenchido com esponja de

colágeno, MO processada e rhBMP-2.

2.2.4 Colheita de material para transfusão autóloga

Três dias antes do procedimento cirúrgico foi colhida, em bolsa de transfusão2, uma

quantidade de 10ml kg-1 de sangue autólogo, da veia jugular de cada cão, com o intuito de

transfundir o mesmo durante a colheita de medula óssea. Este foi então armazenado sob uma

temperatura ao redor de 4°C.

2.2.5 Pré-operatório e protocolo anestésico

Imediatamente antes da aplicação da medicação pré-anestésica (MPA), foi colhida

uma alíquota de 3mlL de sangue da veia jugular de todos os cães para exame hematológico.

A medicação pré-anestésica (MPA) foi realizada com maleato de acepromazina, na

dose de 0,05mg kg-1, e cloridrato de fentanila na dose 0,002mg kg-1, por via intramuscular.

Além disto, realizou-se uma anestesia local epidural, em que se associou lidocaína 2%

(0,125mL kg-1), bupivacaína (mesma dose) e morfina (0,1mg kg-1).

Os animais eram então encaminhados para o centro cirúrgico do Laboratório de

Cirurgia Experimental (LACE) da Universidade Federal de Santa Maria, onde dentro da sala

cirúrgica foi feita a indução anestésica com propofol na dose de 6mg kg-1, intubação

orotraqueal e manutenção anestésica com Halotano.

A fluidoterapia intravenosa foi realizada com solução de Ringer com lactato, durante

todo o procedimento. Como antibioticoprofilaxia, administrou-se cefalotina, na dose de 30mg

kg-1, por via intravenosa, 10 minutos antes do procedimento cirúrgico.

2.2.6 Colheita das Células

Após anti-sepsia ampla e colocação de panos de campo (Figura 2A), os animais

anestesiados foram colocados em decúbito lateral direito e submetidos à colheita de sangue da

2 JP Indústria Farmacêutica S.A

26

MO. As amostras foram obtidas por punção rotacional e aspiração com o auxílio de agulha do

tipo Steis3 (Figura 2B). Os locais de punção foram a crista ilíaca e a fossa trocantérica

femoral. A colheita foi realizada com seringas de 20mL previamente heparinizadas com

liquemine4.

Para penetrar no espaço medular dos ossos foi aplicada uma pressão manual, moderada

à agulha, girado-a e alternando os movimentos para direita e esquerda. Por meio de uma

pressão negativa na seringa foi colhida a MO dos ossos (Figura 3 A e B), na quantidade total

necessária de 10ml kg-1.

À medida que a medula estava sendo colhida foi transferida para a bolsa de colheita de

MO, Kit Bone Marrow (Figura 4A), contendo 0,1ml de heparina para cada 100ml MO e 10ml

de solução salina 0,9% para cada 100ml de MO. O total de sangue intramedular colhido foi

filtrado pelo Kit Bone Marrow pré-filtro de 500µ e filtro de 200µ em linha, para filtragem das

espículas ósseas que foi acoplado na bolsa (Figura 4B). O total de amostra foi transferido para

uma bolsa de transporte de MO acoplada no mesmo Kit.

3 Agullha Steis - Tucumedy – Marthan- Med Tec –Popper – PBN- M.D. Tech- Porto Alegra- RS.

4 Liquemine, Roche, Rio de Janeiro, RJ

Figura 2 - A. Animal posicionado em decúbito lateral, com panos de campo já posicionados, para ser submetido à colheita de medula óssea. B. Posicionamento da agulha de Steis na fossa trocantérica do fêmur para coleta de medula.

27

No momento da colheita, uma alíquota de 3mL de MO foi obtida da bolsa de infusão

(Figura 5) e usada para contagem manual da porcentagem de células nucleadas e teste de

viabilidade celular com Azul de Trypan5 em lâmina de microscopia, sendo considerada

aceitável uma viabilidade acima de 70%. Uma outra fração de 0,5ml foi usada para 5 Trypna blue - Comercial Química Americana Ltda – Paulínia- SP.

Figura 3 - Colheita de medula óssea no acesso pela fossa trocantérica (A) e pela asa do íleo (B) através de pressão negativa em seringa previamente heparinizada em um cão.

Figura 4 – Apresentação da medula óssea sendo colhida para a bolsa coletora (A) e filtragem da mesma através de filtros de 200µ contidos no kit bone marrow (B).

28

confeccionar esfregaços em lâminas microscópicas para mielograma (osteomielograma) e

análise morfológica das células progenitoras da MO.

Após a colheita da metade do volume previsto de medula óssea, em cada paciente, foi

realizada a colheita de sangue periférico da veia jugular para exame hematológico e a

transfusão do sangue autólogo, colhido três dias antes do procedimento cirúrgico. Ao término

da transfusão sanguínea, era novamente colhida uma alíquota de sangue periférico para exame

hematológico.

2.2.7 Processamento do sangue da medula óssea para obtenção de CTMs

A MO colhida (10mL kg-1) foi centrifugada a 1800 rotações por minuto (força

centrípeta de 1,63 X g = 1,63 x 9,80665m s-2 ou 980cm s-2 = 16g) em tubos Falcon de 50ml

(Figura 6A) e isolada em gradiente de densidade Histopaque®6 1.077 (Figura 6B), de acordo

com a técnica de Boyum (BOYUM, 1968).

A nuvem de células mononucleares (Figura 7A) foi colhida por pipeta automática,

colocada em tubo Falcon de 50ml para ser lavada em solução salina 0,9% e DMEM com

glicose a 2%, estéril através de centrifugação com o intuito de remover os agregados

celulares. Após a primeira lavagem as células mononucleares depositadas no fundo do tubo

6 Histopaque- Sigma – São Paulo, SP

Figura 5 - Colheita de uma alíquota de 3mL de medula óssea da bolsa de infusão, usada para contagem da porcentagem de células nucleadas e teste de viabilidade celular.

29

foram colhidas e passadas por uma segunda lavagem, obtendo como produto final o botão

celular padronizado em 500µl (Figura 7B). Uma pequena fração (20µl) de FTCM suspensa foi

colhida com pipeta automática para contagem da porcentagem (quantificação) de células

mononucleares em câmara de Neubauer e teste de viabilidade celular com azul de Trypan 1%,

sendo considerada aceitável uma viabilidade acima de 70%.

Também uma fração (10µl) de FTCM do botão celular foi resgatada para esfregaço e

posterior quantificação de células mononucleares ideais para serem injetadas. O restante do

botão (470µL) com FTCM foi diluído em 3mL de solução salina para transplante. As células

a serem transplantadas (botão celular) foram marcadas através de nanocristais fluorescentes

(Figura 8A). Sete dias depois, foi feita biopsia na área de implantação e exame através de

microscopia com luz fluorescente para verificar a presença das células transplantadas. Uma

alíquota do botão celular marcado foi enviada ao Laboratório de Virologia para observação

das células marcadas através de microscópio fluorescente (Figura 8B).

No grupo G3, após formar o botão celular, uma alíquota de 50ng.mL-1 de rhBMP-2 foi

incubada junto com o marcador.

Figura 6 – (A) Colocação de Histopaque (B) em tubos falcon de 50ml, para posterior adição de sangue de medula óssea.

30

Figura 8 - A. Nanocristais Q-tracker. B. Células mononucleares marcadas com nanocristais Q-tracker, vista através de microscopia fluorescente (ampliação da objetiva: 40X).

Figura 7 – A. nuvem de células mononucleares (seta), isolada em gradiente de densidade, após centrifugação do sangue de medula óssea. B. Botão celular, contendo células mononucleares, obtido por centrifugação para marcação com nanocristais Q-tracker.

31

2.2.8 Procedimento cirúrgico

Cada animal já anestesiado conforme protocolo (item 2.2.5) após o processamento das

CTMs, no mesmo dia da coleta, foi posicionado em decúbito dorsal, em uma calha na mesa

cirúrgica, submetido anti-sepsia do membro posterior direito e delimitação com panos de

campo para acesso medial proximal. Após a abordagem da tíbia, foi criado um defeito

monocortical de 1,5x1,0cm com auxílio de uma broca de desgaste sobre a região medial

proximal da mesma e sob constante irrigação (Figura 9A, B, C e D).

Figura 9 - A e B. Defeito monocortical sendo confeccionado com uma broca de desgaste sobre a região medial proximal da tíbia. C Defeito ósseo monocortical sobre a região medial da tíbia. D. Aprofundamento do defeito ósseo monocortical sobre a região proximal da tíbia.

32

O defeito, uma vez preparado foi preenchido com esponjas de colágeno7 (Figura 10A e

B) embebidas em soro fisiológico (grupo 1 - Figura 11A e Figura 12 A e B) ou com o botão

celular de células-tronco mononucleares (grupo 2 - Figura 11B) ou células-tronco

mononucleares e rhBMP-2 (grupo 3).

A reparação da abordagem foi feita com síntese da fáscia crural com fio mononáilon n.

3-0 em padrão de sutura contínuo simples, a tela subcutânea com o mesmo fio e sutura em

padrão zigue-zague modificado, e o fechamento de pele com mononáilon 4-0 em pontos

isolados simples.

7 Gelfoam, Pharmacia brasil ltda, São paulo, SP.

Figura 10 - A. Apresentação comercial da esponja de colágeno. B. Esponja de colágeno medindo 2,5 x 2,0cm, para utilização como carreador de células-tronco mononucleares.

33

2.2.9 Cuidados Pós-operatórios

No pós-operatório administrou-se meloxican como antiinflamatório, via intramuscular,

na dose de 0,2mg kg-1, uma vez ao dia, durante sete dias.

O membro no qual foi realizado o defeito foi mantido com bandagem de Robert-Jones

durante sete dias e cada cão foi mantido em um box. Além disso, foram realizadas duas

caminhadas diárias, e o cão retornava a suas atividades restritas ao box. Após sete dias os

pontos foram removidos.

Figura 11 - A. Esponja de colágeno sendo embebida em solução salina. B. Esponja de colágeno sendo embebida com o botão celular de células-tronco mononucleares.

Figura 12 - A. Esponja de gelatina embebida com células-tronco mononucleares. B. Esponja de colágeno sendo colocada no defeito ósseo tibial de cão.

34

2.2.10 Avaliação radiográfica

Exames radiográficos foram realizados imediatamente após a cirurgia e aos 15, 30 e

45 de pós-cirúrgico. Em cada exame foram realizadas sempre duas incidências ortogonais do

membro operado para uma melhor visualização da evolução do calo ósseo. Foram atribuídas

porcentagens de acordo com o aumento da densidade óssea no local do defeito.

2.2.11 Avaliação das amostras através da fluoroscopia

Na tentativa de identificar as células previamente marcadas, uma semana após a

infusão do botão celular, foi realizada biopsia, em três animais de cada grupo, que consistiu

em raspagem do osso, com lâmina de bisturi numero 10 nas adjacências do defeito (Figura

13), e confecção de lâminas para leitura em microscópio fluorescente e em microscópio

óptico. Para cada animal foram confeccionadas três lâminas para cada avaliação.

2.2.12 Análise estatística

Os resultados obtidos foram analisados pelo teste t (Student) através do programa

Statistical Package for the Social Sciences.

Figura 13 - Raspagem óssea com bisturi, lâmina n. 10, nas adjacências do defeito tibial para confecção de lâminas de leitura para identificação de células-tronco marcadas.

35

2.2.13 Doação de animais

Após o término deste experimento todos os animais foram doados.

2.3 Resultados

O apoio dos membros pélvicos ocorreu nas primeiras 24 horas de pós-operatório e,

posteriormente, não foi observada qualquer complicação referente à locomoção. As feridas

cirúrgicas cicatrizaram sem complicações.

Três animais pré-experimentais sofreram fratura, um após cinco dias e os outros dois após

sete dias do procedimento cirúrgico, o animal que fraturou com cinco dias de pós-operatório

recebeu fixação externa com pinos transfixados, e foi tratado durante a realização deste

experimento. Os outros dois animais receberam imobilização externa com bandagem de

Robert-Jones e foram encaminhados a outros projetos do mesmo grupo de pesquisa. A fratura

destes animais não interferiu nos resultados deste experimento.

Devido à ocorrência destas fraturas, houve uma mudança no manejo dos cães deste

experimento, na tentativa de prevenir que novos animais sofressem este dano. Ao invés dos

animais serem soltos no solário, após a cirurgia, optou-se pela realização de caminhadas com

guia, para evitar pulos, corridas e quedas. E foi instituído o uso de bandagem de Robert-Jones

em todos os animais.

O tempo de colheita de medula óssea variou de 10 minutos à uma hora e meia, sendo que

em dias mais frios houve maior dificuldade de colheita, devido à viscosidade aumentada do

sangue, muitas vezes ocorrendo coagulação do mesmo apesar do uso da heparina.

A tabela 1 mostra a queda dos níveis de hemoglobina em g.dL-1 durante o procedimento

de colheita de medula óssea seguida de autotransfusão sanguínea.

36

Tabela 1: Níveis de hemoglobina medidos antes da MPA realizada para colheita de medula óssea, imediatamente antes do início e após o término da autotransfusão sanguínea.

Animal

Níveis de hemoglobina (hb) em g.dL-1 antes da

MPA

Níveis de hb (g.dL-

1) medidos imediatamente

antes do início da transfusão, na

metade da colheita de medula óssea

Níveis de hb (g.dL-1) medidos após término da

transfusão realizada durante a colheita de

medula óssea

1 12,0 10,2 10,0

2 10,0 10,1 9,5

3 11,4 9,0 8,9

4 12,3 9,1 9,3

5 13,0 8,8 9,1

6 12,2 10,2 10,2

7 10,4 8,2 8,6

8 10,5 8,6 8,2

9 9,6 9,0 8,6

10 11,2 8,9 9,6

11 12,8 9,5 10,2

12 12,8 9,2 8,9

13 11,2 8,5 8,3

14 14,7 12,4 12,0

15 9,6 7,4 7,8

16 12,7 9,4 10,1

17 14,6 10,6 11,0

18 13,4 9,8 11,2

Na tabela 2 observa-se o número de células por mililitro e viabilidade celular que cada

cão, dos grupos G2 e G3, apresentou após colheita e processamento das mesmas.

37

Tabela 2 - Número de células e viabilidade celular obtida no botão celular dos cães dos

grupos G2 e G3.

Animal Grupo Número de células-tronco

mononucleares totais por mililitros

Viabilidade (%)

7 G2 7,5 x108 96%*

8 G2 3,2 x108 90%

9 G2 1,7x108 99%

10 G2 5,2 x108 97%

11 G2 5,9 x108 95%

12 G2 4,3 x108 98%

13 G3 4,1 x108 90%

14 G3 2,2 x108 94%

15 G3 6,7 x108 99%

16 G3 5,7 x108 96%*

17 G3 6,7 x108 92%

18 G3 5,2x108 97%

*presença de aglomerados de células mortas

Na tabela 3 observa-se a marcação celular através de nanocristais e o resultado da biopsia

óssea para identificação de células marcadas dos animais dos G2 e G3.

38

Tabela 3 - Resultados da avaliação por imunofluorescência e da biopsia óssea para identificação das células marcadas com nanocristais Q-tracker

Amostra Animal

Botão de células Fragmentos de osso

7 ++ ++

8 -* N

9 - N

10 + ++

11 + +

12 ++ N

13 +++** N

14 + N

15 ++ -

16 + -

17 + +

18 ++ N

* -: não foram encontradas células fluorescentes. ** +: poucas células positivas (raras células positivas, inferior a 5% do total); ++ número médio de células positivas para IFA (aprox. 10-20%); +++: grande número de células fluorescentes (aprox. 30-50%). ***N: não foi realizada biopsia óssea com uma semana para identificação de células marcadas com nanocristais Q-tracker.

As amostras analisadas para identificação de células-tronco através de nanocristais Q-

tracker do grupo controle não apresentaram fluorescência quando examinadas através do

microscópio fluorescente, já no G2, das nove lâminas confeccionadas, todas apresentaram

fluorescência e no G3, das nove lâminas lidas, três apresentaram-se positivas (Figura 14). Já

no microscópio óptico as principais células identificadas foram osteoblastos, osteoclastos,

osteócitos e hemácias (Figura 15).

39

Em relação à avaliação radiológica a tabela 4 demonstra a taxa de crescimento ósseo

comparado ao exame radiográfico pós-operatório imediato, em cada grupo distinto (Figura 16,

Figura 17, Figura 18).

Figura 14 - Tecido ósseo colhido através de biopsia, positivo (verdes) à leitura de microscópio fluorescente. (ampliação da objetiva: 40X).

Figura 15 - Tecido ósseo colhido através de biopsia à leitura do

microscópio óptico A. Osteoclastos. B. Osteócito.

(ampliação da objetiva 100x)

40

Tabela 4 - Taxa de crescimento ósseo, observada através de radiografias. Comparação de cada tempo com o exame radiográfico pós-operatório imediato.

Animal Grupo 15 dias 30 dias 45 dias

1 G1 10% 40% 60%

2 G1 60% 90% 100%

3 G1 10% 60% 80%

4 G1 20% 60% 80%

5 G1 10% 40% 70%

6 G1 10% 60% 80%

7 G2 30% 90% 100%

8 G2 30% 60% 90%

9 G2 20% 60% 90%

10 G2 40% 90% 100%*

11 G2 30% 80% 97%

12 G2 20% 80% 97%

13 G3 50% 85% 97%

14 G3 10% 60% 80%

15 G3 80% 100%* 100%

16 G3 60% 85% 100%

17 G3 70% 80% 100%

18 G3 40% 80% 90%

* calo ósseo proeminente

O crescimento ósseo nos grupos suplementados com rhBMP-2 na dose de 50ng ml-1

mostrou evolução mais rápida aos 15 e aos 30 dias e 50% dos cães já apresentavam

cicatrização completa do defeito aos 45 dias.

41

Figura 16 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes tempos avaliados em um cão do grupo 1. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D - 45 dias de pós-operatório. (Animal 5)

Figura 17 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes tempos avaliados em um cão do grupo 2. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D - 45 dias de pós-operatório. (Animal 10)

42

A análise estatística foi realizada comparando-se a média de crescimento ósseo nos grupos

aos 15, 30 e 45 dias (Tabela 5), utilizando-se um nível de significância (P) de 0,95, no qual t

deveria ser maior que 1,812 para ser significativo estatisticamente. Aos quinze dias, o

resultado foi significativo entre os grupos G1 e G3 e G2 e G3. Aos 30 e aos 45 dias

observou-se um grau de significância entre os grupos G1 e G2 e G1 e G3, não havendo

diferença significativa quando se comparou G2 e G3.

TABELA 5 - resultados do teste t de student na comparação entre o crescimento

ósseo entre os grupos aos 15, 30 e 45 dias.

Grupos 15 dias 30 dias 45 dias

G1 e G2 0,955 1,963 3,019

G1 e G3 2,433 2,548 2,545

G2 e G3 2,203 0,652 0,307

2.4 Discussão

O modelo experimental utilizado demonstrou ser satisfatório para avaliar a cicatrização

óssea sob influência de adjuvantes, uma vez que a ausência de fixadores e materiais metálicos

não influenciaram sobre a mesma. Segundo Prado et al. (2006) o reparo de defeitos

preparados sem necessidade de osteossíntese é um bom modelo para o estudo da regeneração

do osso e possui grande semelhança com o reparo primário ou direto de fraturas. Ao contrário

Figura 18 - Radiografia mostrando ao aumento da densidade óssea nos diferentes tempos avaliados em um cão do grupo 3. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D - 45 dias de pós-operatório. (Animal 17)

43

destas últimas, os defeitos são menos sujeitos a fatores mecânicos e a obstruções do aporte

sangüíneo. Este modelo tem sido utilizado em muitos experimentos clássicos que analisam a

influência de medidas cirúrgicas e farmacológicas para melhorar a regeneração óssea.

Defeitos tibiais monocorticais estão bem fundamentados na literatura, (ARISAWA et al.,

2000; BORGES et al., 2000; PRADO et al., 2006) e apesar da ocorrência de fratura em alguns

animais deste presente experimento, acredita-se que este fato se deveu ao manejo destes

animais, uma vez que o passeio livre pelo solário foi substituído por passeio com coleira, o

que impediu que eles ficassem pulando e preveniu a incidência desse tipo de complicação.

Fatores de crescimento influenciam quimiotaxia, diferenciação, proliferação e atividade

sintética de células ósseas, desta forma regulam fisiologicamente o remodelamento e a

cicatrização da fratura. Numerosos fatores de crescimento, como proteína morfogenética

óssea, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento transformador beta, e

fator de crescimento tipo insulina têm um efeito estimulante sobre a cicatrização de um

defeito ósseo, induzindo quimiotaxia, proliferação e diferenciação de osteoblastos e seus

precursores (SARKARA et al., 2006). Neste estudo, o fator de crescimento escolhido como

adjuvante na diferenciação das células tronco mononucleares em osteoblastos, foi a proteína

óssea morfogenética, uma vez que esta já é comprovadamente uma substância osteoindutora

segundo publicações de Gonçalves et al. (1998), Kraus; Kirker-Head (2006), Roostaeian et al.

(2006), Singhatanadgit et al. (2006), Chu et al. (2007) e Ferrigno et al. (2007).

A dose utilizada da rhBMP-2 foi escolhida baseando-se no trabalho de Roostaeian et al.

(2006), os quais verificaram que a máxima resposta de atividade de fosfatase alcalina em

células tronco estromais cultivadas em presença de rhBMP-2 foi obtida quando utilizaram

uma dose de 50ng ml-1. Uma vez que a fosfatase alcalina é um marcador de diferenciação

osteoblástica. Estes autores, porém, utilizaram esta dose em cultura destas células, o uso desta

mesma dose em células-tronco mononucleares não-expandidas, mostrou-se adequada neste

presente trabalho.

Neste experimento pôde ser observado pela análise radiográfica que os cães do grupo que

recebeu células-tronco e rhBMP-2 apresentaram um melhor percentual de cicatrização em

todos os tempos avaliados, concordando com os resultados de Ferrigno et al. (2007). Ao

contrário de Lima et al. (2004) que utilizaram rhBMP-2 em fraturas diafisárias instáveis do

rádio de coelhos e observaram durante 90 dias, concluindo que em relação ao grupo controle,

pela densitometria óptica radiográfica não há diferença entre os membros tratados ou não com

esse biomaterial, esta diferença ocorre somente pelo exame radiográfico aos 30 dias de pós-

operatório com maior porcentagem de restabelecimento cortical. Porém a espécie e o tipo de

44

defeito utilizados por estes autores eram diferentes dos deste experimento, o que pode ter

interferido nas diferenças obtidas nos resultados.

A coleta de medula óssea segundo Lucarelli et al. (2004) é um procedimento simples, o

que pode ser constatado durante a realização da mesma nos cães deste experimento, pois o

tempo de coleta não passou de uma hora e trinta minutos, e em três animais pode ser

coletados no mesmo turno. Porém, foi observado que quando a mesma é realizada em dias

frios, a dificuldade aumenta, isso provavelmente se deve ao fato de que o frio torna o sangue

mais viscoso. Algumas amostras de medula coagularam, mesmo com a utilização de heparina,

segundos após a colheita em dias extremamente frios.

A quantidade de medula óssea colhida que foi de 10ml kg-1 por animal foi estabelecida

com base na pesquisa de Pizzo; Poplack (2005), em humanos, que relatam que esta é a

quantidade de medula ideal a ser colhida para que um número adequado de CTM seja

alcançado.

A doação de sangue autólogo pré-operatório, em humanos, tornou-se comum na década de

80 com a preocupação da transmissão de doenças infecto-contagiosas (MCCULLOUGH,

1993). O sangue é coletado dos doadores de MO previamente à doação e é armazenado para

ser devolvido ao doador no trans-operatório, visando diminuir a queda da concentração dos

níveis de hemoglobina (PARKKALI et al., 2005). Na presente pesquisa realizou-se a

transfusão sanguínea autóloga durante o procedimento de coleta de medula óssea, para manter

os níveis de hemoglobina destes animais e observou-se que após a realização da mesma, a

concentração de hemoglobina aumentou em alguns animais e em outros teve uma diminuição

discreta quando comparada aos valores obtidos antes da realização da transfusão, uma vez que

o sangue transfundido contém hemoglobina.

Embora os resultados não demonstrem uma queda brusca da hemoglobina, todos os

animais seriam submetidos a um novo procedimento cirúrgico no período da tarde, desta

forma, qualquer alteração desses valores seria significativa nesses casos.

Kadiyala et al. (1997) afirmam que muitos trabalhos confirmam a superioridade da terapia

com CTM expandidas em cultura em relação à utilização de aspirados de medula óssea. Essa

afirmação não se refere à utilização de medula óssea processada, como foi procedido no atual

experimento, uma vez que o número de células presente no botão celular é que vai determinar

o sucesso da terapia. A vantagem em se utilizar células não expandidas, segundo Lucarelli et

al. (2004) é que este tipo de procedimento além de ter um menor custo, é mais facilmente

realizável, requer menor tempo de espera, menos instrumentação, não requer

imunossupressão, uma vez que o doador é o receptor e sofre mínima invasão.

45

Os resultados demonstraram uma diferença estatística significativa entre G1 e G3 em

todos os tempos estudados e entre G1 e G2 aos 30 e 45 dias. Estes resultados são favoráveis à

utilização de CTM ou de CTM associadas a BMP-2, em relação ao grupo controle. Já entre os

grupos G2 e G3, só aos 15 dias que se observaram diferenças significativas, o que demonstra

que os dois tratamentos trazem bons resultados em defeitos ósseos experimentais de tíbia de

cães.

Das 18 lâminas lidas em microscópio fluorescente, 12 apresentaram fluorescência, já no

microscópio óptico as principais células identificadas foram osteoblastos, osteoclastos,

osteócitos e hemácias. Esses dados levam a supor que as células marcadas se transformaram

em um dos tipos celulares encontrado na lâmina lida no microscópio óptico e que nanocristais

fluorescentes Q-tracker, são marcadores úteis na identificação de células-tronco

mononucleares em tecido ósseo.

O tempo de uma semana definido para obter a amostra para identificação de células

marcadas com nanocristais foi determinado com base no comportamento dos nanocristais que

perdem sua fluorescência ao longo do tempo. Este tempo se mostrou satisfatório, pois as

células ainda estavam fluorescentes e, além disso, foram encontradas células marcadas que

eram da linhagem óssea.

Nem todos os animais que receberam células-tronco marcadas foram submetidos à biopsia

aos sete dias pós-operatório para confecção de laminas, pois havia necessidade de verificar a

cicatrização óssea em alguns animais de cada grupo sem interferência durante este período.

Desta forma, apenas três animais de cada grupo, incluindo o G1, foram submetidos a este

procedimento.

O carreador escolhido foi a esponja de colágeno (gelfoam), apesar de não possuir todas as

características de um scaffold ideal (POTIER; PETITE, 2005), mostrou-se maleável,

biocompativel, poroso, radiotransparente e reabsorvível. Além disso, além de acomodar com

facilidade nos defeitos ósseos, quando colocado no botão celular, este carreador por ser uma

esponja, embebe-se com o mesmo, mantendo-o no local desejado por mais tempo, uma vez

que o tempo de absorção deste material é em torno de 14 dias. Pode-se então considerar, que

este carreador se mostrou apropriado para o objetivo esperado neste trabalho.

46

3 CONCLUSÃO

Por meio deste estudo observou-se que:

- tanto células-tronco-mesenquimais aplicadas isoladamente como em associação com

rhBMP-2 induzem taxa de consolidação mais rápida em defeitos tibiais experimentais de cães,

pela análise radiográfica;

- nanocristais Q-tracker são eficientes como marcadores para identificação de células-

tronco mononucleares adultas quando aplicadas em defeito ósseo no cão;

- baixas temperaturas interferem na incoagulabilidade de medula óssea devido ao

aumento na viscosidade sangüínea;

- a esponja de gelatina comporta-se como um carreador apropriado para inoculação de

células-tronco mesenquimais em defeitos ósseos de cães.

47

4 REFERÊNCIAS

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