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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

PARASITÁRIA

Estabelecimento de Modelo Murino para

Neurotuberculose Experimental

Camilla de Aguiar Dalan

SÃO CRISTÓVÃO-SE 2015

i


Estabelecimento de Modelo Murino para Neurotuberculose

Experimental

Dissertação de mestrado apresentada à pós-graduação da Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária.

Orientador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior

Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza

SÃO CRISTÓVÃO-SE

2015

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

D136e

Dalan, Camilla de Aguiar Estabelecimento de modelo murino para neurotuberculose

experimental / Camilla de Aguiar Dalan ; orientador Waldecy de Lucca Junior. – São Cristovão, 2015.

56 f. : il.

Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária) – Universidade Federal de Sergipe, 2015.

1. Tuberculose. 2. Sistema nervoso central – Doenças. I. Lucca Junior, Waldecy de, orient. II. Título.

CDU 616-002.5

iii

FICHA DE APROVAÇÃO


Estabelecimento de Modelo Murino para Neurotuberculose

Experimental

Dissertação de mestrado apresentada à pós-graduação da Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária.

Aprovada em:___/___/___

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior

(Orientador – DMO/Ufs)

Prof. Dr. Leandro Marques de Souza

(Examinador externo ao programa – DESL/Ufs)

Profa. Dra. Luciana Valente Borges

(Examinador externo ao programa – DESL/Ufs)

iv

Essa conquista dedico à minha queridíssima e

amada família e meus orientadores.

Sem o apoio de ambos seria muito

mais difícil! Gratidão pela confiança e ajuda!

v

AGRADACIMENTOS

Agradeço às pessoas e instituições que me ajudaram a desenvolver esse trabalho

e chegar até aqui!

Ao meu orientador Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior (Depto de Morfologia –

UFS) pelos meses que dispôs para o meu aprendizado, os inúmeros

ensinamentos, e além de abrir as portas do laboratório (Laboratório de

Neurociência e Molecular de Sergipe – LaNMSE) para o desenvolvimento do

trabalho, acreditando que eu era capaz.

À minha co-orientadora, Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza

(Depto de Educação em Saúde – UFS) por sempre acreditar e me motivar a

seguir em frente. Seu exemplo foi fundamental!

Ao Prof. Dr. Célio Lopes da Silva (Depto de Imunologia Pura e Aplicada –

FMRP – USP) por ceder a cepa H37Rv e o laboratório do Núcleo de Pesquisa

em Tuberculose (NPTb – FMRP - USP), sem os quais seria impossível a

realização do trabalho. A ajuda indispensável das técnicas Ana Paula (Aninha),

Wendy e Izaíra, nos procedimentos padrão.

À Profa. Dra. Simone Gusmão Ramos e a técnica Elaine Medeiros Floriano, com

os ensinamentos de Histologia e a recepção ao Laboratório de Patologia

Pulmonar (FMRP – USP). Sem a sua ajuda, Elaine, seria tudo muito mais

complicado, principalmente nos momentos difíceis!

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária (PROBP

– UFS) pelos ensinamentos depositados em nós, as amigas do Programa,

obrigada pelos cabelos caídos nas disciplinas que queimamos nossos neurônios.

Em especial à Profa. Dra. Rosilene Calazans Soares, pelo incentivo, apoio e por

acreditar desde de o início. Aos profs. coordenadores e seus secretários, que

sempre buscaram facilitar nossas vidas aos meios de tantas normas e regras,

principalmente a Profa. Dra. Karinna Conceição e Dani (secretária).

Aos muitos amigos que fiz no laboratório (LaNMSE), onde passei grande parte

desses dois últimos anos. Muitos foram alunos que passaram e deixaram sua

vi

contribuição, entre eles, há os que mais me marcaram, principalmente no

convívio e exemplo. Entre esses alunos, agradeço à Verônica, Camila, Thayana e

Priscila.

Agradeço as ajudas que os alunos de Iniciação Cientifica (IC‟s) puderam ceder,

principalmente os alunos José Gilmar da Costa e Rhamon Ribeiro da Costa, que

serão eternos IC‟s (incríveis companheiros), cuja ajuda atingiu a linha tênue,

tornando-os meus companheiros de pesquisa mais alegres, amigos e

motivadores!!! À Flavia Ellen, pelo ensino e ajuda em momentos cruciais!!!

Muita gratidão!!!

Aos membros da banca examinadora da qualificação: Profa. Dra. Luciana

Valente Borges (Depto de Educação em Saúde – UFS), Profa. Dra. Patrícia

Rodrigues Marques de Souza (Depto de Educação em Saúde – UFS) e Profa.

Dra. Tatiana Rodrigues de Moura (Depto de Morfologia – UFS), pelas valiosas

contribuições e sugestões.

Família e amigos, a minha gratidão não tem limites por tudo que me ofereceram

e em situações que eu nada podia oferecer-lhes! Amo muito vocês!!!

À Capes, por oferecer a bolsa de mestrado que ajudou, e muito, desde de o início

do programa.

Como finalizador, agradeço a Deus e seus anjos, muitos já citados anteriormente,

cuja vontade nunca me levou onde a graça de Deus pudesse me proteger!

Gratidão imensa por tudo!

vii

SUMÁRIO

Resumo ________________________________________________________xii

Abstract _______________________________________________________xiii

1. Introdução ___________________________________________________14

1.1. Histórico da Tuberculose (TB) __________________________________14

1.2. A descoberta do bacilo ________________________________________15

1.3. Epidemiologia da TB _________________________________________16

1.4. Agente patológico da TB, características e transmissão ______________18

1.5. Resposta imunológica contra o bacilo_____________________________18

1.6. TB no Sistema Nervoso Central _________________________________21

2. Objetivos ____________________________________________________24

2.1. Objetivo Geral_______________________________________________24

2.2. Objetivos Específicos _________________________________________24

3. Material e Métodos _____________________________________________25

3.1. Animais ____________________________________________________25

3.2. Delineamento Experimental ____________________________________26

3.3. Infecção Induzida por Estereotaxia com Microinjeção ________________27

3.4. Infecção Pulmonar ____________________________________________28

3.5. Coleta de Tecidos ____________________________________________29

3.6. Contagem de Colônias ________________________________________29

3.7. Processamento Tecidual para a Histologia _________________________29

3.8. Microtomia _________________________________________________30

3.9. Análise Morfológica __________________________________________30

3.10. Descartes __________________________________________________31

3.11. Aquisição e Análise das Imagens _______________________________31

3.12. Análise Estatística ___________________________________________31

4. Resultados ___________________________________________________32

viii

4.1.a. Eficácia dos controles do experimento___________________________32

4.2.b. Desenvolvimento de Neurotuberculose por infecção pulmonar________35

4.3.c. Infecção Diretamente no Sistema Nervoso Central__________________38

4.4.d. Confirmação da Presença do Bacilo Mycobacterium tuberculosis no

Cérebro ________________________________________________________41

5. Discussão ____________________________________________________ 43

6. Conclusão ____________________________________________________47

7. Referências ___________________________________________________48

8. Anexos ______________________________________________________53

A. Processamento Tecidual (cérebro) ________________________________53

B. Processamento Tecidual (pulmão) ________________________________ 54

C. Coloração Hematoxilina – eosina _________________________________55

D. Coloração Ziehl – Neelsen ______________________________________56

ix

SIGLAS

Bacilo Álcool-Ácido Resistentes – BAAR

Barreira Hemato-encefálica – BHE

Células Apresentadoras de Antígenos – APC‟s

Células Dendríticas – DCs

Células Natural Killer – NK

Coloração Ziehl-Neelsen – ZN

Complexo Principal de Histocompatibilidade de Classe II (em inglês Major

Histocompatibility complex) – MHCII

Fator de Necrose Tumoral tipo alfa – TNF-α

Fator de Transformação do Crescimento tipo beta (em inglês Transforming

Growth Factor Beta – TGF-β)

Hematoxilina-eosina – HE

Interferon tipo gama – INF-γ

Interleucina tipo 1 – IL-1








Linfócitos T com fenótipo CD4+ – Linf TCD4

+

Linfócitos T com fenótipo CD8+ – Linf TCD8

+

Liquido cefalorraquidiano – LCR

Molécula de Ligação diferenciada 40 (em inglês Cluster of differentiation 40) –

CD40

Mycobacterium tuberculosis – Mtb

x

Neurotuberculose – Ntb

Organização mundial da saúde – OMS (em inglês World Health Organization –

WHO)

Resposta Imunológica perfil Th1 – Th1

Resposta Imunológica perfil Th2 – Th2

Síndrome da Imunodeficiência Humana – SIDA (em inglês, Acquired

Immunodoficiency syndrome– AIDS)

Sistema Imunológico – SI

Sistema Nervoso Central – SNC

Solução Salina – em inglês phosphate buffered saline – PBS

Tratamento Supervisionado – TS

Toll-like receptor 2 – TLR-2

Tuberculose – TB

Unidades formadoras de colônias (em inglês colony forming units) – CFU

xi

Lista de Figuras

Figura 1: Esquema representativo da estrutura de um granuloma_________________20

Figura 2: Esquema representativo do delineamento experimental_________________26

Figura 3: Secção cerebral mostrando os ventrículos cerebrais ocupados por corante

(Azul de Metileno) _____________________________________________________28

Figura 4: Contagem das unidades formadoras de colônias em pulmão dos grupos

controles _____________________________________________________________33

Figura 5: Caracterização morfologia de pulmão de camundongos do grupo controle

(PBS – SNC). HE______________________________________________________34

Figura 6: A caracterização morfológica de pulmão murino no grupo controle da

infecção (H37Rv-Pulmão). HE. ___________________________________________35

Figura 7: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido nervoso dos grupos

controles. ____________________________________________________________36

Figura 8: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo controle negativo

(PBS – SNC). HE. _____________________________________________________37

Figura 9: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo que recebeu

infecção intratraqueal (105 CFU/mL de M. tuberculosis) (H37Rv – Pulmão).

HE__________________________________________________________________38

Figura 10: Contagem das unidades formadoras de colônias no pulmão do grupo controle

(PBS – SNC) e grupo infectado (H37Rv – SNC). _____________________________39

Figura 11: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido nervoso do grupo

controle (PBS - SNC) e grupo infectado (H37Rv – SNC). ______________________40

Figura 12: Caracterização morfológica de cérebro infectado intracerebroventricular

(H37Rv – SNC). HE. ___________________________________________________41

Figura 13: Tecido cerebral de animal que recebeu microinjeções intracerebroventricular

de 1x105 CFU/mL da cepa H37Rv em um intervalo de 4 semanas de infecção. ZN. __42

xii

RESUMO

DALAN, Camilla de Aguiar. Estabelecimento de Modelo Murino para

Neurotuberculose Experimental. Sergipe, 2015. 56 f. Dissertação (mestrado) –

Programa de Biologia Parasitária, Universidade Federal de Sergipe, São

Cristóvão, 2015.

A ocorrência da tuberculose (TB) atinge grande parte da população

mundial e essa prevalência é acompanhada pela Organização Mundial de Saúde

(OMS) desde 1990. A mesma organização publica anualmente a situação global

da doença, assim como também a situação dos países onde a doença não está sob

controle. Além disso, nos últimos anos o número de pessoas infectadas pelo

Mycobacterium tuberculosis cresce por muitas razões, principalmente as

derivadas de desigualdade social, AIDS, migração e o surgimento de bacilo

resistente aos medicamentos. Além disso, a infecção no Sistema Nervoso Central

(SNC) pelo bacilo é uma das manifestações clínicas mais devastadoras da

doença. Esta forma extrapulmonar é denominada neurotuberculose (Ntb) e se

destaca com uma elevada taxa de mortalidade e morbidade entre as

manifestações extrapulmonares. Os fatores de risco para a Ntb incluem a idade, a

coinfecção com o HIV, desnutrição, crianças com sarampo recente, alcoolismo,

doenças malignas, o uso de imunossupressores em adultos e prevalência da

doença na comunidade. Entretanto, mecanismos fisiopatológicos da doença

precisam ser melhor compreendidos. Neste sentido mais pesquisas são

urgentemente necessárias para uma melhor compreensão da doença e para

estudar novas vacinas contra a doença. Métodos: No dia 0 camundongos

C57BL/6 foram desafiados no ventrículo lateral do SNC com técnica de micro

injeção estereotáxica contendo cepa virulenta Mycobacterium tuberculosis

(H37Rv). Após 30 dias, o cérebro e pulmão foram analisados por CFU e

histologia. Resultados: Neste estudo observou-se grande número de bacilos no

SNC determinadas pelo CFU. Além disso, a análise histológica mostrou uma

intensa atividade inflamatória no ventrículo, quando o animal foi desafiado com

H37Rv. Demonstrando assim um modelo de infecção com a cepa

H37Rvinfundida no ventrículo lateral do SNC nos camundongos machos

C57BL/6. Em conclusão, este modelo é o mais próximo com o curso normal da

doença em humanos, pois apresentou lesão tecidual com características

granulomatosa portanto uma importante estratégia para estudar a fisiopatologia

assim como mediadores envolvidos na progressão e prevenção desta doença.

Palavras-chave: Neurotuberculose; modelo experimental; desenvolvimento

xiii

ABSTRACT

DALAN, Camilla de Aguiar. Development Neurotuberculosis of

Experimental model murine. Sergipe, 2015. 56 f. Theses (Master‟s Degree) –

Program of Parasite Biology, Federal University of the Sergipe, São Cristóvão,

2015.

The occurrence of tuberculosis (TB) reaches much of the world's population and

the prevalence is accompanied by the World Health Organization (WHO) since

1990. The same organization publishes the overall situation of the disease, as well as

the situation of countries where the disease is not under control. Moreover, in recent

years the number of people infected with Mycobacterium tuberculosis grows for

many reasons, especially those derived from social inequality, AIDS, migration and

the emergence of resistant bacilli to drugs. Moreover, the infection in the central

nervous system (CNS) the bacillus is one of the most devastating clinical

manifestations of the disease. This is called extrapulmonary neurotuberculosis (Ntb)

and stands out with a high rate of mortality and morbidity among the

extrapulmonary manifestations. The risk factors include age Ntb, coinfection with

HIV, malnutrition, children with recent measles, alcoholism, malignant diseases, the

use of immunosuppressant‟s in adults and in community prevalence of the disease.

However, pathophysiological mechanisms of the disease need to be better

understood. In this respect, more research is urgently needed to better understand the

disease and to study new vaccines against the disease. Methods: On day 0 C57BL /

6 mice were challenged in the CNS of the lateral ventricle with micro stereotactic

injection technique containing virulent Mycobacterium tuberculosis (H37Rv). After

30 days, the brain and lung CFU were analyzed and histology. Results: In this study,

we observed large numbers of bacilli in the CNS determined by the CFU. Moreover,

histological analysis showed an intense inflammatory activity in the ventricle while

the animal was challenged with H37Rv. Thus demonstrating a model infection with

H37Rv strain infused into the lateral ventricle of the CNS in male C57BL / 6 mice.

In conclusion, this model is the closest to the normal course of disease in humans, as

presented granulomatous tissue lesion characteristics therefore an important strategy

for studying the pathophysiology well as mediators involved in the progression, and

prevention of this disease.

Keywords: Neurotuberculosis; experimental model; development

14

1. INTRODUÇÃO

1.1. Histórico da Tuberculose

O gênero Mycobacterium surgiu há 150 milhões de anos atrás e a espécie M.

tuberculosis surgiu no leste da África, por volta de 3 milhões de anos atrás. Esses

achados só foram possíveis devido a estudos de genética molecular e sequência

genômica das cepas que existem atualmente (1).

Os achados mais antigos conhecidos de tuberculose (TB) foram encontrados

no Egito, em 44 múmias de faraós e sacerdotes, datadas de 3700 a 1000 a.C. Elas

apresentaram lesões tuberculosas no pulmão, presença de sangue na traqueia e

lesões ósseas, sendo característica da forma extrapulmonar da TB quando atinge os

ossos. Além disso, em outra múmia preservada naturalmente, no Peru, foram

analisados os nódulos no pulmão, que possuíam DNA de micobactéria (1,2).

Durante a Idade Média, a TB estava espalhada por quase toda a Europa,

tanto na nobreza quanto na plebe, haviam multidões de tuberculosos que sofriam

com as formas graves de primo-infecção (2).

Com o fim do feudalismo e chegada do capitalismo (sec. XIII e XIV), a

Europa buscava novas conquistas, principalmente as conquistas territoriais por meio

das grandes navegações. Entre essas conquistas territorialistas estão as Índias e as

Américas. Nas embarcações, os tripulantes lidavam com a falta de higiene,

condições precárias de saúde, alimentação escassa e malconservada e as infestações

de ratos e baratas, durante longos períodos de tempo, então se tornava comum

doenças pulmonares, inclusive a TB. Onde os povos recém-descobertos não

possuíam imunidade capaz de deter essa doença matando grande parte da população

nativa. Esse fato ocorreu também com o território brasileiro, onde os nossos índios

sofreram bastante com a TB trazida pelos jesuítas e colonos (2).

Com a revolução industrial e, consequentemente, o aumento das massas

operárias sem o adequado desenvolvimento das condições de trabalho, saúde,

higiene e saneamento básico, novamente foram formadas as condições necessárias

para provocar uma elevação da quantidade de pessoas atingidas pela doença (1,2).

No continente brasileiro, no período colonial os padres jesuítas e os colonos

que optavam em vir para o Brasil, em sua maioria, estavam doentes, e acreditava-se

que o país recém-descoberto, era propício para a cura da doença, pois tinha clima

ameno comparado ao da Europa. Além disso, os territórios recém descobertos

15

recebiam os doentes, como uma alternativa para diminuir o contingente de doentes

na Europa. Onde os nativos não possuíam imunidade desenvolvida contra as

doenças infecciosas que assolavam a Europa, entre elas a TB, que causava milhares

de mortes em nossos nativos (2).

A Primeira Guerra Mundial contribuiu com a disseminação da doença,

principalmente dentre os soldados. Porque não haviam as mínimas condições de

saúde, higiene e saneamento básico. Esse quadro levou a um aumento das taxas de

mortalidade por TB, além de graves infecções de primo-infecção com o

comprometimento de outros órgãos e sistemas (1).

Durante toda a história da TB nos diversos países, a doença sempre esteve

ligada a uma vida boemia, misturada com o descuido e vida desregrada. Por existir

esse preconceito e a ignorância quanto às causas da TB, era comum isolar os

pacientes mais pobres em clínicas distantes, onde os mesmos não recebiam um

tratamento humanizado e viviam amontoados e distantes da população em geral.

Nesse contexto, uma enfermeira (Florence Nightingale) contraiu a doença e

trabalhou constantemente para superar a doença e a imagem que os tísicos

passavam. A enfermeira faleceu aos 90 anos após concluir seu trabalho para a

humanização dos hospitais específicos para os tísicos, tendo conseguido alcançar

seus objetivos (2).

Assim como na Europa, no cenário brasileiro, a TB também esteve

relacionada à vida de boemia. Onde muitos dos românticos, poetas, compositores e

jornalistas passam noites em bares discutindo e bebendo. Sabe-se que esse estilo de

vida é propício para o desenvolvimento e estabelecimento da TB, mas na época,

isso não estava elucidado. Porém, por serem da população nobre, os tuberculosos

dessa classe social não sofriam preconceito e não ficam distanciados da população

em geral, ao contrário, muitas pessoas sadias compartilhavam das noites boêmias

nos bares. Isso contribuiu para a disseminação da TB em diferentes classes sociais,

alertando as autoridades da saúde coletiva para a doença que não discriminava suas

vítimas fatais (2).

1.2. A descoberta do Bacilo

Em 1890, Robert Koch, no XI Congresso Médico Internacional em Berlim,

anunciou o descobrimento de uma substância que se difundia nos meios líquidos

de cultura do bacilo da tuberculose, denominada "linfa”. Tal substância possuía a

16

capacidade de "insensibilizar animais de laboratório inoculados com „bacilos

tuberculosos‟, detendo assim o processo tuberculoso nos animais já infectados”.

No ano seguinte (1891), foi publicado o artigo intitulado “Sobre um remédio para

a cura da tuberculose”. Foi um marco na história da TB no mundo, pois pôs fim a

grande diversidade de tratamentos que iam de sangrias até exercícios físicos

exaustivos, os quais não contribuíam com a melhora do paciente (1,2).

Entretanto, a substância anunciada não foi eficaz contra a TB, embora

tenha sido útil para diagnosticar a doença. Contudo, o tratamento efetivo começou

em 1944, com o descobrimento da estreptomicina, sendo seguida pela isoniazida e

demais drogas, formando o esquema terapêutico capaz de combater e eliminar a

doença (1, 3–5).

1.3. Epidemiologia da TB

A TB é um dos problemas de saúde pública mundial, sendo considerada

uma doença infecciosa oportunista (6–8). Em 1993, a World Health Organization

(WHO) a classificou como “grave doença pública emergente”, e começou a

monitorar a doença infectocontagiosa desde 1997, a qual atualmente está atrás da

Síndrome da Imunodeficiência Humana (SIDA, em inglês, Acquired

Immunodoficiency syndrome – AIDS).

Em 2013, foram registrados 9 milhões de novos casos de TB no mundo.

No mesmo ano, foram contabilizados 1.5 milhões de óbitos pela doença (7).

Contudo, esses 9 milhões não estão distribuídos de forma uniforme pelo mundo.

A TB apresenta maior incidência na Ásia e África Oriental (7). Atualmente, a TB

no Brasil não está eliminada e cresce entre os grupos de risco, como

penitenciários e usuários de drogas, os quais não possuem as mínimas condições

de vida. Entre eles há um maior desenvolvimento da doença na forma

extrapulmonar, cujas manifestações são mais intensas e de difícil

tratamento/diagnóstico (1,9,10). O Brasil está entre os 22 países que merecem

destaque nas medidas de controle da TB segundo a OMS, porque esse conjunto de

países é responsável por 82% dos casos mundiais (7). No Brasil, o estado de São

Paulo possui a maior quantidade de casos e a maior incidência ocorre no estado do

Rio de Janeiro. Com base nesses dados, o Ministério da Saúde, desde 2003 vem

aumentando os esforços no combate a TB no Brasil. Cerca de 57 milhões de

17

brasileiros estão infectados com Mtb, sendo que a ocorrência maior é no sexo

masculino e a faixa etária mais atingida é entre os 20 a 49 anos (10).

No período de 2007 a 2013 foram confirmados 4813 casos de TB com 225

óbitos por tuberculose no estado de Sergipe, sendo a maioria dos casos na capital

sergipana (53%), onde ocorre uma maior representatividade para o extrato etário

de 20 a 39 anos de idade (47%) e para o sexo masculino (68%). A forma clínica

mais frequente da TB foi a pulmonar (85%) e, dentre as extrapulmonares,

predominou a ganglionar periférica (3,4%), na qual a neurotuberculose (Ntb)

totalizou 29 casos registrados (0,6%) no estado de Sergipe (11).

Todos os dados armazenados sobre a TB e suas formas são organizados

por um programa desenvolvido pela Organização Mundial de Saúde (OMS, em

inglês World Health Organization – WHO) para o acompanhamento da TB.

Esse programa é denominado “Stop TB” e reúne um conjunto de estratégias para

o combate da TB, entre esses conjuntos existe o Directly Observed Treatment

Short Course – DOTS (7).

As estratégias são cinco elementos que, em conjunto, tem como objetivo

85% de sucesso no tratamento e 70% de detecção de novos casos. Os cincos

elementos são: 1. compromisso dos governos ao suporte financeiro das

atividades de controle da TB; 2. detecção de casos pela baciloscopia de escarro

entre pacientes sintomáticos que se apresentam espontaneamente ao serviço de

saúde; 3. suprimento regular de todos os medicamentos essenciais

antituberculose; 4. sistema padronizado de registro e notificação que permita

conclusões seguras sobre os resultados do tratamento para cada paciente e do

controle do programa de forma geral; 5. regime de tratamento padronizado de

seis a oito meses para todos os casos confirmados a partir de testes positivos de

secreção, com tratamento supervisionado (TS) pelo menos nos dois meses

iniciais (7). Esse plano foi proposto em 1993 e seus objetivos deveriam ser

atingidos em 2015, porém com o advento da AIDS, o aumento do consumo de

drogas, o surgimento de bacilos multidrogas resistentes, as imigrações de

populações, a anemia em crianças de alguns países essas metas foram passadas

para a próxima data limite, que será 2025 (7,12).

18

1.4. Agente patológico da TB, características e transmissão

A TB é causada por micobactéria do gênero Mycobacterium, a espécie

patogênica ao homem é a Mycobacterium tuberculosis (8). Os bacilos desse

gênero possuem formato de bastonete, são imóveis, não produzem toxinas, porém

são capazes de sobreviver no interior de células fagocitárias, sendo classificadas

como patógeno intracelular facultativo e aeróbico obrigatório estrito. A parede do

M. tuberculosis (Mtb) é constituída principalmente por ácidos micólicos,

formando uma barreira hidrofóbica permitindo a resistência à dessecação e à

descoloração por álcool e ácido, propriedade diagnóstica do bacilo, que é

classificado como Bacilo Álcool-Ácido Resistente (BAAR) (10).

A transmissão ocorre quando o paciente com a forma pulmonar ativa de

TB (bacilífero) tosse, espirra, ou fala lançando ao ar bacilos em partículas de

aerossóis. Essas gotículas contêm cerca de 1 a 10 bacilos que atingem os alvéolos

pulmonares (7). Grande parte das pessoas infectadas (80 a 90%) consegue

eliminar o bacilo sem manifestações clinicas da TB. Enquanto que cerca de 5 a

10% das pessoas infectadas não são capazes de impedir a infecção, resultando na

TB ativa (13,14). Os demais indivíduos infectados possuem um equilíbrio entre a

virulência do Mtb e a ativação da resposta imunológica do hospedeiro (inata e

adquirida), mantendo a TB de forma latente, na qual o patógeno é capaz de

permanecer vivo no granuloma formado (8,15,16).

1.5. Resposta imunológica contra o bacilo

A principal resposta imunológica contra o Mtb é a fagocitose (13),

promovida pela interação entre proteínas e derivados lipídicos, do Mtb, com os

receptores de superfície celular de fagócitos (principalmente Toll-Like receptor 2

– TLR2) (17,18). A resposta inicial ocorre em macrófagos, buscando a eliminação

do bacilo através da mudança de pH ácido, enzimas lesivas pela fusão do

lisossomo com o fagossoma e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (19–21).

O mecanismo de eliminação efetiva do bacilo é desencadeado pela apresentação

de antígenos, onde macrófagos ativados e infectados com Mtb ativam o início da

resposta imunológica específica. Dessa forma, desenvolve-se a imunidade celular

e também a imunidade humoral. No entanto, essa resposta pode não ser suficiente

19

para a eliminação do bacilo, pois os anticorpos específicos contra o bacilo não

conseguem entrar nas células infectadas para destruir o bacilo.

Outra falha na resposta que deve ser relatada são os vários mecanismos de

escape da resposta imunológica induzida pelo Mtb, dentre eles podemos

relacionar os seguintes: 1- inativação de enzimas lisossomais; 2- inibição da fusão

entre lisossomo e fagossoma, evitando o contato da bactéria com o ambiente

hostil do lisossomo; 3- alteração do pH ácido (19,22).

As células T CD4+ desempenham a principal função nessa resposta contra

a bactéria (23). Através do complexo principal de histocompatibilidade de classe

II (MHC II), as células apresentadoras de antígenos (APC‟s) como macrófagos e

células dendríticas apresentam antígenos do bacilo às células TCD4+, e também

produzem citocinas inflamatórias (por exemplo: TNF- IL-12, IL-6, e IL1) as

quais são capazes de recrutar neutrófilos e monócitos (16). Essa variedade de

células e citocinas são importantes para a formação do chamado granuloma ou

reação granulomatosa. A composição do granuloma (Fig. 1) é caracterizada pelo

infiltrado de macrófagos, neutrófilos e monócitos, com grande quantidade de

Linfócitos T e B que circundam o concentrado de macrófagos e células

dendríticas infectados com bacilos, além da presença de fibroblastos (17,24).

20

Figura 3: Esquema representativo da estrutura de um granuloma. Onde podemos perceber o bacilo

livre ou contido em células especilistas em apresentação de antígeno, como os macrófagos. Ao

redor existe grande quantidade de macrófagos epitelioides e linfócitos T e B, formando assim uma

reação granulomatosa. Fonte: Figura adaptada de Ramakrisnann, 2012 (24).

Em indivíduos imunossuprimidos a produção de citocinas pró

inflamatórias (principalmente IFN-γ e IL-12) é afetada por comprometimento das

funções dos Linf. T CD4+, resultando na má formação do granuloma e permitindo,

assim, que o bacilo infecte outros órgãos, tornando a TB extrapulmonar (25).

Dentre essas citocinas importantes para o combate ao bacilo, o TNF- é

primordial no controle do bacilo e manutenção do granuloma por regular

localmente a concentração de quimiocinas para o recrutamento de células, o que

impede reativação ou reinfecção da TB (17).

A IL-12 (produzida pelas APC‟s) e citocinas produzidas por linfócitos

ativados, como a IL-2, mantém a ativação e proliferação de linfócitos, induzindo a

resposta celular predominantemente pró-inflamatória. A IL-12 aumenta a

produção de INF- pelas células Natural Killer (NK) e a expansão de Th1

específicas a antígenos da micobactéria (18). Além disso, outras citocinas como

IL-23, IL-18 e IL-27 também induzem a produção de INF-γ (26,27). A produção

de IL-23 é essencial para a secreção de IL-17 (Th17), que é um potente indutor de

21

expressão de quimiocinas, que são substâncias capazes de causar a migração de

leucócitos do sangue para o local da inflamação (28).

Outro processo central para a defesa contra o Mtb é o de apresentação

cruzada, onde antígenos micobacterianos são secretados em vesículas apoptóticas,

associadas ao MHC classe I e, dessa forma, ativam células CD8+. Após a ativação,

as mesmas produzem INF- e liberam grânulos enzimáticos ricos em granulisina,

que ativam outras enzimas capazes de degradar lipídios e causar a lise celular por

apoptose (29). Além disso, na TB são também encontradas citocinas produzidas

por células Th2, como IL-4 e IL-10, que são supressoras da atividade Th1, assim

como IgE e IgG4 que tem o mesmo papel supressor (30). Além disso, existe na

TB a atuação de células T reguladoras (Treg), que regulam a resposta imunológica

do hospedeiro contra o Mtb através da produção de citocinas, como IL-4, IL-10 e

TGF-, com efeito supressor sobre a imunidade celular. Essas células podem

limitar a resposta imunológica eficaz, diminuindo a dano tecidual inflamatório,

mas por outro lado pode inibir a resposta Th1 impedindo o controle adequado da

infecção (13,16,20,31).

Os mecanismos imunológicos que ocorrem no combate da TB pulmonar

já são bem conhecidos, porém quando a doença atinge demais órgãos ainda há

uma grande interrogação, principalmente quanto as repostas imunológicas que

acontecem no Sistema Nervoso Central.

1.6. TB no Sistema Nervoso Central

As infecções bacterianas são processos dinâmicos influenciados por

múltiplas interações entre microrganismo e o sistema de defesa do hospedeiro. O

cérebro e a medula espinhal são protegidos de agentes infecciosos pelo tecido

ósseo do crânio e coluna vertebral, pelas meninges, pela barreira hemato-

encefálica (BHE) e pelas células do sistema imunológico como astrócitos e

células da micróglia (32). Além disso, quando o patógeno penetra o Sistema

Nervoso Central (SNC), mecanismos de defesa do hospedeiro são ativados para

controlar a infecção (8,32). A TB no SNC, conhecida como Neurotuberculose

(Ntb), geralmente deve-se à infecção inicial nos pulmões ou em outros órgãos, e a

disseminação para o SNC geralmente ocorre pela circulação sanguínea (6,32–35).

A Ntb é a forma mais grave de infecção pelo M. tuberculosis em humanos e, afeta

22

crianças predominantemente, levando ao óbito mais de 50% dos casos e deixando

sequelas neurológicas graves nos sobreviventes (36,37). Pacientes coinfectados

com TB-AIDS possuem grandes possibilidades de desenvolver a Ntb,

apresentando hidrocefalia e pequenos tubérculos nas meninges, no cérebro,

medula espinhal ou no plexo coroide, chamados de tuberculomas (33). Pacientes

com Ntb apresentam um quadro de cefaléias, vômitos, febre, convulsões e

sonolencia, dentre outros sintomas (14,35). A disseminação micobacteriana ocorre

através da quebra da BHE, possivelmente via plexo-coroide (38,39). Essa

disseminação pode ser facilitada com a ativação de mecanismos inflamatórios do

organismo, como a produção de TNF-α e IL-1 que parecem facilitar o transporte

de compostos para o encéfalo pela abertura da BHE (32,40). O resultado da

resposta inflamatória altera a permeabilidade da BHE, como consequência ocorre

a formação do edema cerebral, produção de exsudato inflamatório, interferindo a

dinâmica do líquido cefalorraquidiano (LCR) (32).

Vários trabalhos têm demonstrado a relação do SNC com sistema

imunológico (SI), revelando novas e valiosas descobertas. Estudos recentes vêm

desmistificando a função imunológica nesse tecido. Com grande quantidade de

APC‟s residentes mantendo a vigilância imunológica, quebrando a ideia de ser um

local imunoprivilegiado, onde os antígenos que atingissem o parênquima cerebral

não eram detectados e dificultavam uma resposta imunológica adaptativa.

Acreditava-se também que a anatomia e histologia do SNC não permitissem esse

tipo de resposta, visto que a existência da BHE restringia acesso de certas

substâncias e grandes moléculas (incluindo células do SI) da corrente sanguínea

até o encéfalo, onde o parênquima estaria protegido apenas pela micróglia (células

do SNC com atividade fagocitária) e que o LCR exerceria função similar a linfa

no organismo (41).

Nesse contexto as células da micróglia podem produzir IFNγ (42–44),

expressar moléculas acessórias (MCH II), CD 40 e outras moléculas

coestimuladoras, mas possuem baixa atividade de apresentação antigênica. Além

da micróglia parenquimal, outras células como as células dendríticas, macrófagos

meníngeos perivasculares e do plexo coroide e células epiplexas de Kolmer,

exercem funções de apresentação de antígeno, principalmente, aos linfócitos que

se encontram nos ventrículos (45–48).

23

O LCR surpreende no aspecto das células que o compõem, pois

inicialmente era considerado um líquido viscoso que mantinha o equilíbrio iônico,

porém com esses estudos tem se observado a existência de células T (90%)

havendo mais células com fenótipo TCD4+ (proporção de 3,5 para 1 TCD8

+),

células B (5%), monócitos (menor que 1%) (49–51). As células TCD4+ do SNC

têm características de memória, assim como células T efetoras (46,52), pois elas

apresentam fenótipo positivo para α4-integrina, que promove o tráfego de

linfócitos (53). Eles podem também expressar receptores, tal como CCR7 e a

molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), que promovem o recrutamento

de linfócitos para o tecido inflamado (49,53).

Apesar da gravidade da apresentação clínica, os mecanismos celulares e

moleculares envolvidos na patogênese da Ntb ainda são pouco compreendidos.

Além disso, não há modelo experimental tão próximo da infecção em humanos.

Por isso, o desenvolvimento de modelos experimentais de Ntb possibilitará o

estudo da expressão de fatores envolvidos na fisiopatologia da doença no SNC,

permitindo a avaliação de mecanismos celulares e moleculares da doença, como a

identificação de riscos para um possível modelo de tratamento para a Ntb.

24

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolver um modelo experimental de Meningite Tuberculosa.

2.2 Objetivos Específicos

2.2.a. Verificar a viabilidade da cepa laboratorial (H37Rv) no órgão comum

de infecção do bacilo (pulmão).

2.2.b. Analisar a existência de uma ligação entre o sistema respiratório e o

sistema nervoso central.

2.2.c. Aplicar a infecção de bacilos da cepa laboratorial de Mycobacterium

tuberculosis (H37Rv) usada na indução via intracerebroventricular pelo

procedimento de estereotaxia.

2.2.d. Confirmar a resposta inflamatória formada em resposta ao bacilo

Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) no parênquima cerebral de camundongos

infectados.

25

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos C57Bl/6 machos de 5 a 8 semanas de idade

e pesando entre 20 e 30 gramas, provenientes do Biotério Central do Campus de

Ribeirão Preto – USP. Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento

de Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP (FMRP –

USP) com regime livre de comida e água, com ciclos de claro/escuro de

12:00h/12:00h (claro das 6:00h às 18:00h) e à temperatura de 21 ± 1ºC. Os

animais tiveram uma semana de aclimatação ao biotério onde foram mantidos

durante o experimento.

26

3.2 Delineamento Experimental

Figura 4: Esquema representativo do delineamento experimental.

27

3.3. Infecção Induzida por Estereotaxia com Microinjeção

Todos os procedimentos de infecção dos camundongos com a cepa

laboratorial (H37Rv) de Mtb foram realizados no biotério, com o nível de

segurança necessário (nível 3 de biossegurança) e com capela de fluxo laminar

ligada. Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal

(1mL/100g de peso corporal) de cetamina (80mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg)

diluídas em solução salina isotônica (NaCl 0,15M). Com a intenção de reduzir os

riscos de infecção, antes do início da cirurgia, os camundongos foram submetidos

à tricotomia da região dorsal da cabeça. Posteriormente, para a realização da

cirurgia, os animais foram posicionados com a cabeça fixada pelas barras

auriculares do aparelho esterotáxico (Insight) e receberam analgésico via

subcutânea (Babamine® injetável pet – flunixina-meglumina – 1,1mg/Kg –

Schering).

Logo após a assepsia da pele com solução de álcool iodado, por via

subcutânea foi aplicada lidocaína contendo vasoconstritor (norepinefrina 2%) para

evitar sangramento durante o procedimento estereotáxico. Feito isto, foi realizada

a incisão longitudinal para expor a calota craniana. Utilizou-se peróxido de

hidrogênio (H2O2 – 10V) para melhor visualização das suturas do tecido ósseo. A

torre do aparelho estereotáxico foi posicionada no ângulo zero e tendo como

referência inicial o bregma. A partir dessas coordenadas, foi definido o ponto da

microinjeção que atingiria o ventrículo lateral direito do cérebro do animal. O

local exato da microinjeção foi obtido com o auxílio do atlas de Paxinos e Watson

(49), que definiu as seguintes subtrações a partir do ponto do bregma: -0,4mm

anteroposterior; -1,0mm latero-lateral; -2,1mm dorsoventral. Com as coordenadas

da microinjeção estabelecidas, realizou-se a trepanação da calota craniana

utilizando broca odontológica esférica acoplada a um motor. Anteriormente as

infecções, foi realizado o mesmo procedimento descrito acima, porem com a

utilização do corante com o objetivo de verificar a localização das coordenadas.

Na figura 3 percebemos que o local da aplicação da microinjeção, mostrando

a ocupação dos espaços ventriculares do Sistema Nervosos Central (SNC).

Através do orifício feito, foi micro injetada, no ventrículo lateral direito do

cérebro dos animais, solução contendo as concentrações pré-determinadas de Mtb

para cada grupo experimental. Terminada a aplicação da microinjeções, os

28

animais foram suturados com monofilamento de Nylon. Durante a recuperação da

anestesia, independentemente do grupo, os animais foram mantidos em sala do

Biotério do Departamento de Imunologia Pura e Aplicada (nível 3 de

biossegurança) da FMRP-USP com atmosfera e temperatura controladas.

A concentração de bacilos utilizada na infecção foi controlada através do

plaqueamento das soluções em Placas de Petri contendo meio de cultura 7H11, o

meio de cultura utilizado para o desenvolvimento do Mtb. Transcorridas quatro

semanas de incubação, fez-se a determinação de unidades formadoras de colônias

(CFU) nas placas.

Figura 3: Secção cerebral (controle do processo estereotáxico)

mostrando os ventrículos cerebrais ocupados por corante (Azul

de Metileno) proveniente de microinjeção

intracerebroventricular durante a cirurgia estereotáxica. Esse

procedimento foi realizado para confirmar que as coordenadas

estereotáxicas usadas para infectar os camundongos estavam

corretas

3.4. Infecção Pulmonar

A infecção pulmonar foi realizada na capela de fluxo no biotério do

Departamento de Imunologia Pura e Aplicada (nível de segurança 3) da

FMRP/USP. Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal

(1mL/100g de peso corporal) de cetamina (80mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg)

diluídas em solução salina isotônica (NaCl 0,15M), fixados com o abdômen

29

voltado para cima e a região da traqueia em evidência. Foi feita uma pequena

incisão e exposta a traqueia, onde foi inoculada a solução com o bacilo. Após esse

procedimento verificou se o animal respirava normalmente e em seguida realizada

pequena sutura com monofilamento de Nylon e o restabelecimento do animal

aconteceu no biotério.

3.5. Coleta dos Tecidos

Quatro semanas após a infecção, os animais foram anestesiados e

sacrificados. Foram coletados os órgãos (cérebro e pulmão). De maneira aleatória,

foram selecionados animais cujos tecidos destinaram-se ao processamento para

análise morfológica ou para a contagem de unidades formadoras de colônias

(CFU).

3.6. Contagem de Colônias

Após a retirada cautelosa e a seleção aleatória, os órgãos foram colocados

em Placas de Petri contendo solução de PBS. Cada órgão coletado foi separado e

colocado em placas identificadas. Os órgãos foram macerados e submetidos à

digestão com liberase. Feito este procedimento, iniciou-se o plaqueamento, onde

foram pipetados 100μL da solução formada (tecido junto solução com enzima). A

primeira diluição (1:100 ou 102) foi seguida das demais (1:1000 ou 10

3; 1:10000 ou

104; 1:100000 ou 10

5) nos compartimentos identificados da Placa de Petri contendo

o meio de cultura 7H11, próprio para as culturas com Mycobacterium tuberculosis.

Feito o plaqueamento do tecido de cada animal de maneira isolada, as placas foram

incubadas em estufa (37ºC) durante quatro semanas para o crescimento das

colônias. Passado esse período de incubação (quatro semanas), foram contadas as

unidades de colônias formadas. Para definir o valor preciso, fez-se cálculo simples

através da seguinte regra: R = a x 10b CFU/mL. Onde: R = resultado final; a = o

resultado da contagem; b = expoente da diluição mediante a qual obteve-se o

resultado de a (1:100 ou 102; 1:1000 ou 10

3; 1:10000 ou 10

4; 1:100000 ou 10

5);

CFU = Unidade Formadora de Colônias.

3.7. Processamento Tecidual para a Histologia

Após a dissecção, os tecidos determinados para análise histológica passaram

pela fixação em formol tamponado 10%. Posteriormente, os tecidos foram

desidratados em diferentes concentrações de etanol, diafanizados em xileno e

emblocados em parafina. Os cérebros e pulmões passaram por processamento com

tempos de banho diferentes (protocolos em anexo)

30

3.8. Microtomia

Os tecidos incluídos em parafina (cérebro e pulmão) foram cortados a 5μm

com auxílio do micrótomo histológico (Lupetec MRP-09). Foram realizados cortes

seriados para analisar a morfologia dos tecidos e caracterizá-los quanto à presença

ou ausência do bacilo (Mycobacterium tuberculosis) através das colorações

Hematoxilina-Eosina e Ziehl Neelsen, respectivamente. Na histologia, utilizou-se

lâminas de vidro sem a presença de gelatina ou silano.

O cérebro foi incluído dividindo-o através de um corte transversal,

separando-o em duas porções: anterior e posterior. Cada lâmina contempla dois

cortes de cérebro, tendo como primeiro corte a parte da porção anterior e o segundo

a parte da porção posterior. Esse procedimento foi realizado para possibilitar uma

melhor avaliação das regiões periventriculares, onde foi provocada a infecção

inicial pelo bacilo. O pulmão foi incluído de forma a obter-se um corte com maior

área possível para análise histológica.

3.9. Análise morfológica

As lâminas obtidas contendo os cortes histológicos (5 um) foram coradas

com hematoxilina e eosina (HE), a qual permite identificar o tipo de tecido, o

formato e a organização das células, uma vez que essa técnica cora o núcleo

(hematoxilina) e o citoplasma (eosina) celulares. Também foi realizada a técnica de

coloração conhecida como Ziehl Neelsen, específica para identificar as bactérias

classificadas como BAAR (bacilos álcool-ácido resistentes) e, neste caso, detectar

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) nos tecidos analisados. Esta técnica é realizada

através da coloração das bactérias com fucsina básica e, em seguida, descora-se o

tecido com álcool-ácido, sendo que a constituição da parede bacteriana não permite

sua descoloração, tornando perceptível a visualização da bactéria no tecido contra

corado com o azul de metileno, que é absorvido pelos constituintes celulares e por

outras estruturas.

3.10. Descartes

Após a coleta dos tecidos, as carcaças dos animais foram depositadas em

sacos plásticos apropriados e destinados ao tratamento específico para resíduos

infectantes. Esse processo ocorreu no Centro de Pesquisa em Tuberculose da

FMRP-USP.

31

Os resíduos perfuro cortantes foram armazenados em caixas adequadas para

posterior descarte. Os resíduos líquidos, provenientes das etapas de processamento

tecidual e colorações, foram coletados e armazenados em vasilhames específicos e

destinados à coleta seletiva do Campus São Cristóvão da Universidade Federal de

Sergipe (UFS) onde ocorreu o processamento tecidual.

3.11. Aquisição e Análise das Imagens

Com as lâminas coradas, as imagens foram capturadas usando o

microscópio óptico acoplado a um computador com o programa de captura e

análise de imagens LAS (Leica). As fotos micrografias obtidas abrangeram todo o

tecido (cérebro e pulmão) do animal, considerando o intervalo de 50μm de

distância entre os cortes seriados. As imagens foram analisadas sem a interferência

do conhecimento de cada grupo (duplo-cego).

3.12. Análise Estatística

Os resultados dos experimentos serão expressos com média ± erro padrão da

média e submetidos ao Test T, utilizando o programa computacional GraphPad

Prism® (GraphPad Software, Inc., USA).

32

4. RESULTADOS

4.1. a. Viabilização da infecção intratraqueal

A verificação da infecção foi realizada através do procedimento de infecção

intratraqueal com a cepa H37Rv e com a mesma concentração (1x105 CFU/mL) no

órgão alvo de desenvolvimento da tuberculose (TB) e controle de infecção pelo

procedimento de estereotaxia com solução salina (PBS).

O gráfico a seguir possui no eixo das abscissas os grupos que foram feitas as

contagens de colônias, e no eixo das ordenadas está indicando a quantidade de

unidades que foram resultado da fórmula matemática que resulta em Log10 por

grama de tecido analisado.

Com resultado da análise quantitativa vemos que nos pulmões dos animais

infectados intratraquealmente (controle positivo), houve a formação de 106

Log10

CFU de colônias por grama de pulmão, enquanto que no grupo que recebeu solução

salina por meio da estereotaxia não apresentaram o desenvolvimento de colônias.

Mostrando a eficácia da cepa utilizada, sendo considerado o controle

positivo da infecção (H37Rv – Pulmão) e do controle negativo da infecção (PBS –

SNC).

33

Figura 4: Contagem das unidades formadoras de colônias em pulmão dos

grupos controles. Camundongos machos C57Bl que foram infectados com

bacilos da cepa H37Rv via intratraqueal 1x105 CFU/mL (H37Rv – Pulmão) e

solução salina nos ventrículos cerebrais (PBS - SNC), após um intervalo de 4

semanas foi realizada a determinação das Unidades Formadoras de Colônias

(p<0,001).

Nas imagens de análise histológica dos mesmos grupos, conseguimos

visualizar a preservação do tecido funcional do pulmão, alvéolos e brônquios e

bronquíolos. Essa preservação mostra que o grupo PBS – SNC não indica sinais de

infecção no pulmão, pois o tecido não apresentou modificação significativa dos

espaços alveolares (Figura 5).

34

Figura 5: Caracterização morfologia de pulmão de camundongos do grupo controle (PBS –

SNC). A. Após quatro semanas do procedimento de estereotaxia com solução salina, a histologia

mostra a preservação do tecido. B. Na imagem é possível perceber as estruturas funcionais do

pulmão, principalmente os alvéolos pulmonares e vasos sanguíneos com células sanguíneas também

está preservado. Legenda: EA: espaços alveolares; seta: vaso sanguíneo congesto. Aumento: A.:

40x; B. 400x. HE.

Os pulmões dos animais infectados intratraqueal (H37Rv – pulmão) com a

cepa laboratorial de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) demonstraram resposta

inflamatória. Principalmente com a redução dos espaços alveolares, devido a

aglomeração de macrófagos alveolares e espessamento dos brônquios, além de

aumento da concentração de células com características inflamatórias e de células

sanguíneas dispersas no tecido (Figura 6).

35

Figura 6: A caracterização morfológica de pulmão murino no grupo controle da infecção (H37Rv-

Pulmão). A. O pulmão apresentou aumento do número de células devido ao processo inflamatório, com

as estruturas funcionais danificadas. B. A diminuição dos espaços alveolares devido ao recrutamento de

células inflamatórias para o sítio da infecção; estas células são caracterizadas com a morfologia

evidenciando grande quantidade de citoplasma e núcleo central, além de vasos sanguíneos com os

glóbulos vermelhos e células pequenas sem citoplasma e núcleo visível. Legenda: EA: espaço alveolar;

VS: vaso sanguíneo; círculos: células com características morfológicas de resposta imunológica; seta:

eritrócitos. Aumento: A.: 40x; B. 400x. HE.

4.2.b. Desenvolvimento de Neurotuberculose por infecção pulmonar

A Figura 7, representa um gráfico de contagem de CFU, onde avaliamos a

formação de colônias nos cérebros dos animais que foram infectados via

intratraqueal (H37Rv – Pulmão) e dos animais que passaram pelo procedimento

estereotaxia com solução salina (PBS – SNC).

Concluímos que houve a formação de colônias no tecido nervoso do grupo

classificado como H37Rv – Pulmão, apesar de pouca concentração (102 CFU/g de

tecido nervoso), enquanto que no tecido nervoso dos animais do grupo controle

negativo (PBS – SNC) não apresentaram a formação de colônias.

36

Figura 7: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido nervoso

dos grupos controles. Camundongos machos C57Bl que foram infectados com

bacilos da cepa H37Rv via intratraqueal 1x105 CFU/mL (H37Rv – Pulmão) e



(p<0,001).

Nas análises morfológicas entre os tecidos dos animais dos grupos H37Rv-

Pulmão e PBS – SNC podemos comparar a preservação do tecido nervoso no grupo

com a infecção pelo procedimento de estereotaxia com a solução salina (PBS – SNC)

(Figura 8) em comparação com as imagens da Figura 9, que representa o tecido

nervoso dos animais que foram infectados pela via traqueal com solução contendo

105 CFU/mL de M. tuberculosis (H37Rv – Pulmão).

A preservação do tecido cerebral no grupo que recebeu solução salina (PBS –

SNC) é perceptível nas figuras 8 (A e B) observando os pericários (corpo celular dos

neurônios) no córtex cerebral (CC) assim como as células ependimárias (EC),

organizadas em epitélio cúbico simples, que são responsáveis por revestir os

ventrículos cerebrais (VS). Em maior aumento (Fig. 8B) é possível visualizar células

com morfologia características das células da micróglia, além dos cílios das células

ependimárias, que são responsáveis por facilitar a movimentação do líquido

cefalorraquidiano (LCR).

37

Figura 8: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo controle negativo (PBS –

SNC). A. Os animais que receberam micro injeção intracerebroventricular com PBS não apresentou

alterações morfológicas após as quatro semanas da infecção. B. Pode ser observado a preservação das

células ependimárias, pericários e células da micróglia. Em maior aumento, os cílios das células

ependimárias podem ser notados, que são características destas células. Legenda: CE: células

ependimárias; EV: espaço ventricular; CC: córtex cerebral. Aumento: A.: 40x; B. 400x. HE.

Ao analisar morfologicamente o cérebro dos animais que receberam 105

CFU/mL do bacilo via intratraqueal, podemos perceber que no parênquima cerebral

apresentou sinais de edema, tais como o extravasamento de células sanguíneas e

líquidos pelos vasos sanguíneos, caracterizados pelos espaçamentos no parênquima,

além da presença de vasos sanguíneos sem a delimitação (Figuras 9 A e B).

38

Figura 9: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo que recebeu infecção

intratraqueal (105 CFU/mL de M. tuberculosis) (H37Rv – Pulmão). A. Apresentaram alterações

morfológicas após as quatro semanas da infecção como a ausência de tecido pertencente à pia-máter. B.

Pode ser observado a presença de células sanguíneas dispersas no córtex cerebral, bem como espaços

próximos a uma estrutura de vascularização destruída por edema. Legenda: ES: espaço subaracnóide;

CC: córtex cerebral; seta: eritrócitos dispersos no parênquima. Aumento: A.: 40x; B. 400x. HE.

4.3.c. Infecção diretamente no Sistema Nervoso Central

Após as verificações anteriores, as infecções com a cepa virulenta (H37Rv)

ocorreram diretamente no ventrículo lateral do cérebro, por meio do procedimento de

estereotaxia. Tendo como controle negativo a solução salina diretamente no ventrículo

lateral, com as mesmas coordenadas.

Com os procedimentos estereotáxicos realizados, com um grupo de animais

infectados diretamente no ventrículo cerebral (H37Rv – SNC) com 105CFU/mL de

M.

tuberculosis; e outro grupo, que também passou pelo mesmo procedimento, porém com

a aplicação de solução salina, foi realizada a contagem de colônias a partir do pulmão

desses animais. Onde foi confirmado mais uma vez que o grupo denominado PBS –

SNC não desenvolveu colônias, porém o grupo infectado diretamente no cérebro

desenvolveu cerca de 104Log10 por grama de pulmão (Figura 10).

39

Figura 10: Contagem das unidades formadoras de colônias no pulmão do

grupo controle (PBS – SNC) e grupo infectado (H37Rv – SNC).

Camundongos machos C57Bl que foram infectados com bacilos da cepa

H37Rv via intracerebroventricular com 1x105 CFU/mL (H37Rv – SNC) e



(p<0,001).

Ao avaliar a formação de colônias no tecido nervoso, após quatro semanas

da infecção, tendo como controle negativo (PBS – SNC) e grupo experimental que

passou pelo procedimento estereotáxico com a solução contendo a concentração de

105

CFU/mL de bacilos da cepa H37Rv. Com os dados plotados no gráfico,

verificou-se que houve a formação de 106

CFU Log10 por grama de tecido nervoso

dos animais que foram infectados com os bacilos, além disso o grupo controle

negativo (PBS – SNC) não houve o desenvolvimento de colônias (Figura 11).

40

Figura 11: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido

nervoso do grupo controle (PBS - SNC) e grupo infectado (H37Rv -

SNC). Camundongos machos C57Bl que foram infectados com bacilos da

cepa virulenta H37Rv via intracerebroventricular com 1x105 CFU/mL

(H37Rv – SNC) e solução salina nos ventrículos cerebrais (PBS - SNC), após

um intervalo de 4 semanas foi realizada a determinação das Unidades

Formadoras de Colônias (p<0,001).

O tecido nervoso que recebeu PBS, como já dito anteriormente, indica a

preservação da morfologia tecidual pelos seguintes fatos: o tecido (epitélio cúbico

simples) que reveste o plexo coroide está intacto, cílios nas células ependimárias,

no parênquima cerebral é notável a existência de micróglia além de pericários, parte

visível dos neurônios (Figura 8).

No grupo de animais infectados com o bacilo pela microinjeção

intracerebroventricular (H37Rv – SNC), mostrou alteração na morfologia do tecido

de revestimento dos ventrículos, assim como no parênquima cerebral. Próximo ao

local da infecção, o tecido de revestimento apresentou a proliferação de células de

caráter inflamatório (Figura 12A). Além de sinais clássicos de edema,

principalmente a existência de espaços no tecido e células sanguíneas dispersas no

tecido (Figura 12B).

41

Figura 12: Caracterização morfológica de cérebro murino infectados intracerebroventricular

(H37Rv – SNC). A. Os animais que receberam micro injeção intracerebroventricular (H37Rv – SNC),

que mostra a mudança morfológica no plexo coroide, (B) em destaque é percebida a presença de

células fagocitárias e células vermelhas do sangue, o que indica uma maior intensidade da inflamação.

Legenda: EV: espaço ventricular; CC: córtex cerebral; PC: plexo coroide; seta: eritrócitos dispersos

no parênquima. Aumento da Objetiva: A: 40x; B: 400x. HE.

4.4.d. Confirmação da presença do bacilo M. tuberculosis no cérebro

Os tecidos nervosos infectados via intracerebroventricular (H37Rv – SNC)

foram analisados quanto a presença do bacilo nas imagens coradas por Ziehl-

Neelsen.

As analises foram feitas em lâminas que não tinham a preservação

morfológica, e a Figura 13(A) mostra os ventrículos cerebrais e região do

parênquima. Na histologia sem inflamação, o tecido que reveste os ventrículos é

cúbico e densamente compacto, chamado de células ependimárias, o epitélio da

imagem apresenta sinais de inflamação, como a aumento das camadas do epitélio de

revestimento dos ventrículos e ligeira ocupação do espaço ventricular. Os demais

sinais de inflamação foram vistos em lâminas anteriores e posteriores do tecido

correspondente.

Em maior aumento (Figura 13B) foi analisado a região que apresentou sinais

de inflamação, pode-se encontrar os bacilos. Os mesmos foram encontrados

42

formando um aglomerado (típico do bacilo) envolto por células, mas também

percebemos alguns dispersos no tecido de células ependimárias.

Figura 13: Tecido cerebral de animal que recebeu microinjeções

intracerebroventricular de 1x105 CFU/mL da cepa H37Rv em um intervalo de 4

semanas de infecção. A. Epitélio de revestimento dos ventrículos do SNC, assim como os

espaços ventriculares e pericários. B. Em maior aumento é possível identificar aglomerados

de bacilos entre as células do tecido de revestimento do ventrículo cerebral. Legenda: EV:

espaços ventriculares; P: pericários; Círculos: Aglomerados de bacilos. Objetivas: A: 40x;

B: 1000x. Coloração: ZN.

B

A

43

5. DISCUSSÃO

O Sistema Imunológico (SI) do Sistema Nervoso Central (SNC) possui

ferramentas de defesa que são ativados quando o patógeno atinge o SNC (14,32). A

Neurotuberculose (Ntb) é o acometimento do SNC pela reação inflamatória

desencadeada nesse sistema em resposta ao Mycobacterium tuberculosis, que

compromete a funcionalidade devido ao desenvolvimento da doença que apresenta

diversos sintomas, variando de febre a convulsões (14). Quando as células do SI são

ativadas, produzem citocinas e secretam diversos fatores pró-inflamatórios e tóxicos

desencadeando uma resposta específica, voltada para a eliminação do bacilo por

meio da formação de granuloma (33).

A importância do estabelecimento de um modelo experimental mais próximo

da fisiopatologia é devido à falta de detalhamento da patologia, pois é uma doença

que apresenta sintomas diversos levando o paciente a óbito em um curto espaço de

tempo (14). Com base na literatura é sabido que pacientes com imunossupressão e

tuberculose possuem grandes possibilidades de desenvolver a forma extrapulmonar

da doença, como objetivo do estudo a Ntb. Na maioria das vezes, a doença se

desenvolve quando o bacilo consegue atravessar a barreira hemato-encefálica

(BHE) pela resposta inflamatória que produziu TNF-α e IL-1 em resposta a

interação das proteínas próprias do bacilo com os receptores das células

apresentadoras de antígenos (APC‟s), permitindo que o bacilo atinja o parênquima

cerebral, ou seja, levado até os ventrículos cerebrais pelo líquido cefalorraquidiano

(LCR) (8,14,32,33,40,48,54).

Para o delineamento desse modelo experimental, o modo de infecção, a

concentração e o intervalo de tempo entre a infecção com o bacilo e o sacrifício dos

animais desafiados foram estabelecidas seguindo o estudo de Zucchi (2007) (8),

utilizou as concentrações de 102

CFU/mL, 103

CFU/mL e 104

CFU/mL da mesma

cepa utilizada nesse trabalho (H37Rv), com intervalos de pós-infecção de 1, 2, 4 e 8

semanas para as diferentes concentrações de infecção. Onde concluiu que para o

modelo murino de TB em cerebelo, a concentração que apresentou resultado

satisfatório foi de 104

CFU/mL, após de 4 semanas. Dessa forma, optamos por

manter o procedimento de infecção, período de pós-infecção e variar a concentração

para 105

CFU/mL. Com o intuito de melhorar os resultados, a indução realizada no

presente trabalho foi diretamente nos ventrículos cerebrais (Figura 3), onde está

44

situado grande quantidade do LCR, que possui constante renovação, reveste todos

os órgãos do SNC, ocupa também os espaços aracnoide e circula pela coluna

vertebral estendendo a funcionalidade até a medula espinhal. Além de possuir

grande abrangência física, LCR apresenta grande quantidade e variedade de células

do SI, como os linfócitos T com fenótipo T CD4+, que possuem maior eficiência em

combater os antígenos do bacilo que foram fagocitados devido à ligação das

proteínas e derivados lipídicos próprios do Mtb com os receptores de superfície das

APC‟s (55).

Autores apontam que o desenvolvimento da doença no SNC está ligada a

falhas na resposta imunológica contra a TB pulmonar ativa (6,14,56). Em Tsenova

(2002) (57) indica que a resposta inflamatória no SNC é capaz de alterar a

conformação da BHE. Dados do trabalho apontam que depois de 14 dias após o

início da infecção é possível que bacilo atinja outros órgãos (pulmão e baço). Os

nossos resultados mostraram que com o intervalo de quatro semanas após a infecção

houve desenvolvimento de colônias no pulmão (Figura 4), em menor quantidade

quando comparado a quantidade de colônias que foram formadas com a indução

intratraqueal (Figura 10). As análises histológicas confirmam o resultado da CFU,

indicando que houve reação de inflamação nos pulmões (Figura 6A a 6B) dos

animais que receberam a infecção por meio de microinjeções

intracerebroventriculares. Indicando que a Ntb possa desenvolver pela falta da

integridade da BHE e que o LCR possui um papel importante no recrutamento de

células do SI para o local da infecção, devido a apresentação de antígenos solúveis

aos linfonodos cervicais (39,41,58).

A contagem de CFU no órgão alvo da fisiopatologia em questão (Figura 11)

deixa evidente que após as quatro semanas a concentração do bacilo indica que a

Ntb foi desenvolvida no grupo que recebeu a concentração de 105

CFU/mL do

bacilo Mycobacterium tuberculosis da cepa laboratorial (H37Rv), diferenciando o

grupo induzido com solução salina (PBS), onde as análises morfológicas não

apontaram reação inflamatória (Figuras 5A e 5B) e também não apresentou colônias

determinadas pela CFU (Figura 4).

Quanto aos resultados da análise histológica, no cérebro podemos perceber

que houve a formação de exsudato inflamatório pela presença de espaços entre os

elementos teciduais, antes ocupado pelo líquido extravasado dos vasos sanguíneos,

com alto teor de água, além de características de necrose caseosa que altera a

45

organização morfológica do tecido inflamado (Figuras 12A e 12B) quando

comparado ao tecido não inflamado (Figuras 8A e 8B) (59). Nos pulmões de

animais infectados intratraquealmente (Figuras 6A e 6B) o tecido apresenta aspecto

de inflamação, pois analisando encontra-se granulomas com macrófagos rodeado

por camadas distintas de tecido conjuntivo englobados por linfócitos. Esses dados

da histologia da TB pulmonar também foram verificados no trabalho de Cyktor

(2013) (59) onde o mesmo acrescenta dizendo que a interleucina-10 (IL-10) é de

fundamental importância para a formação e manutenção do granuloma, resposta que

mantem o bacilo vivo, porém preso entre linfócitos T e B, macrófagos (59).

Os animais que foram desafiados diretamente no SNC com o bacilo (105

CFU/mL) apresentaram lesão tecidual intensa no cérebro, bem como resposta

inflamatória. Isso foi observado infiltrado linfocitário presente nas figuras 12A e

12B, além dos sinais de edema serem mais presentes quando comparado ao cérebro

dos animais que foram infectados via traqueia (Figuras 9A e 9B). O pulmão

também apresentou a resposta inflamatória condizente com o local da indução, pois

as figuras 6A e 6B (H37Rv – Pulmão) mostraram comprometimento dos espaços

alveolares devido a resposta inflamatória quando comparado as figuras 5A e 5B

(PBS – SNC), já que na resposta inflamatória típica da TB, esses espaços alveolares

apresentariam mais células do SI (macrófagos alveolares, neutrófilos), a lesão

tecidual com a troca do tecido funcional pelo tecido conjuntivo como o de

calcificação e de necrose, essa formação é característica de granuloma. Vale

ressaltar que em modelos murino a estrutura do granuloma é diferente da estrutura

do granuloma em humanos (Figura 1). O estudo de Yoshida (2010) (60) afirma que

a formação do granuloma é dependente de citocinas inflamatórias, além da IL-10

(59) e que o recrutamento de células T para a formação do granuloma é dependente

da IL-17, que induz a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e LFA-1)

aumentando ainda mais a concentração de células T para o sítio de infecção (60).

Mantendo o bacilo envolto por esses linfócitos que foram recrutados e produzem e

liberam citocinas que tem como função recrutar outros linfócitos e modular a

resposta com as citocinas do perfil Th17 (60).

Porém, é evidente que para compreender melhor a fisiopatologia da Ntb é

necessário restringir a infecção no SNC. Mesmo que resultados similares ao

presente trabalho tenham sido observados em outros trabalhos com objetivos

similares, como o citado anteriormente (57), o detalhamento pode ser atingindo com

46

a determinação de citocinas e células do SI envolvidas na fisiopatologia, pois nos

resultados podemos perceber que a quantidade de células nos tecidos infectados

aumentou significativamente, porém ainda não se pode determinar o tipo celular

presente no infiltrado inflamatório observado nas figuras. A TB pulmonar ainda

apresenta muitas falhas no diagnóstico, tratamento e controle da doença. Quando

tratamos da Ntb, esse quadro é agravado em diversos fatores, sendo um grande

passo o desenvolvimento de modelos experimentais mais próximos dos sinais e

sintomas da doença em humanos, para que haja elucidação dos mecanismos

fisiopatológicos da Ntb e eventos moleculares envolvidos nas lesões, permitindo

que no futuro haja o estabelecimento de esquemas terapêuticos, drogas e vacinas

voltados a essa patologia que atinge paciente com imunossupressão ou com fatores

sociais que levam a complicações da TB pulmonar em TB miliar, classe da Ntb.

Com os resultados apresentados, é possível afirmar que no presente trabalho

desenvolvemos um modelo experimental de Neurotuberculose (Ntb). A infecção foi

realizada utilizando o método de estereotaxia com a cepa laboratorial (H37Rv) do

bacilo Mycobacterium tuberculosis. As análises quantitativas ocorreram por

determinação da contagem de colônias (CFU), sendo que a contagem aconteceu

após quatro semanas do tempo de infecção.

47

6. CONCLUSÃO

a. Eficácia do controle negativo (PBS – SNC), do controle positivo (H37Rv –

Pulmão);

b. Em modelo murino é possível desenvolver a neurotuberculose após uma infecção

intratraqueal;

c. O tecido nervoso apresentou características de infecção causada pelo bacilo,

quando infectado diretamente no SNC;

d. Após o intervalo da infecção (4 semanas), confirmando o resultado quantitativo,

foram encontrados M. tuberculosis no tecido nervoso central.

Com os resultados apresentados, é possível afirmar que no presente trabalho

desenvolvemos um modelo experimental de Neurotuberculose (Ntb). A infecção foi

realizada utilizando o método de estereotaxia com a cepa laboratorial (H37Rv) do

bacilo Mycobacterium tuberculosis. As análises quantitativas ocorreram por

determinação da contagem de colônias (CFU), sendo que a contagem aconteceu após

quatro semanas do tempo de infecção, juntamente com as análises qualitativas, por

comparação morfológica dos tecidos.

48

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53

8. ANEXOS

A. Processamento do cérebro

Tirar os cérebros do formol e um de cada vez deve ser feito os procedimentos a seguir:

1. Desprezar a parte da coluna vertebral;

2. Cortar os cérebros de forma transversa (em cada corte vai ficar com os dois

lóbulos);

3. Colocar os cortes em cassetes separados e identificados com lápis (tipo HB) em

papel (escrever de forma firme até marcar o papel);

4. Identificar na parte apropriada no próprio cassete;

5. Organizar os cassetes de uma forma e reproduzir essa forma em um papel a parte

(sugestão: da esquerda para a direita, de baixo para cima);

6. Quando todos estiverem devidamente identificados começa a rodar a bateria.

Álcool 70% - 30‟

Álcool 80% - 30‟

Álcool 90% - 30‟

Álcool 100% I - 40‟

Álcool 100% II - 40‟

Álcool-Xilol (1:1) - 15‟

Deve tirar o excesso de álcool antes de seguir para os Xilol‟s

Xilol I - 60‟

Xilol II - 60‟

Xilol III - 60‟

Tira, novamente o excesso do xilol para ir para a parafina

Parafina infiltração - 60‟

Inclusão da peça

54

B. Processamento do pulmão

Os pulmões devem ser identificados em papel escrito com lápis HB e nos cassetes.

Álcool 90% = 90‟

Álcool 95% = 90‟

Álcool 100%= 60‟

Álcool 100%= 30‟

Álcool-Xilol = 60‟

Xilol = 30‟

Xilol = 12‟ (nessa etapa o pulmão deve ficar até diafanizar)

Xilol = 13‟

Parafina 1 = 45‟

A peça anatômica fica com o ápice voltado para cima.

55

C. Hematoxilina Eosina

Colocar as laminas em estufa a 60°C por 5 minutos

Xilol I – 2‟

Xilol II – 2‟

Xilol III – 2‟

Álcool Absoluto – 2‟


Álcool 95% - 2‟

Álcool 80% - 2‟

Álcool 70% - 2‟

Agua destilada I – 2‟

Agua destilada II – 2‟

Hematoxilina – 3‟

3 Lavagens em agua destilada

Agua destilada III – 2‟

Eosina 1% - 30‟‟

Álcool 80% - 2‟

Álcool 95% - 2‟

Álcool absoluto – 2‟

Xilol I – 2‟

Xilol II – 2‟

Xilol III – 2‟

Montagem em Entellan ® e lamínula

56

D. Ziehl Neelsen

Xilol I – 15‟

Xilol II – 15‟

Xilol III – 15‟


Álcool 90% - 2‟

Álcool 80% - 2‟

Água corrente – 5‟

Fucsina – 60‟

Água – 10‟ a 30‟ (até ver a agua límpida)

Diferenciador (até tirar o excesso do tecido)

Azul de metileno – 5‟

Agua destilada (até o tecido ficar azulado)

Álcool 70% - 2 mergulhos



Álcool absoluto – 2 mergulhos

Álcool absoluto – 2 mergulhos

Xilol I – 2 mergulhos

Xilol II – 2 mergulhos

Montagem em Entellan ® e lamínula

o Solução de fucsina básica

0,5g de fucsina básica

5 mL de álcool absoluto

1g de fenol cristal

50 mL de agua destilada

o Diferenciador

990 mL de álcool 70%

10 mL de ácido clorídrico

o Solução Estoque azul de metileno

1,4g de azul de metileno

100 mL de álcool 95%

o Solução Uso de azul de metileno

10 mL da solução estoque

90 mL de água destilada

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE CENTRO DE … · i Camilla de Aguiar Dalan Estabelecimento de...

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