UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS ...contribuição dos receptores para cininas...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS

THÁSSIO RICARDO RIBEIRO MESQUITA

MODULAÇÃO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR PELOS RECEPTORES PARA CININAS E SUA CONTRIBUIÇÃO

PARA O STATUS REDOX CELULAR

SÃO CRISTÓVÃO 2013

i


MODULAÇÃO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR PELOS RECEPTORES PARA CININAS E SUA

CONTRIBUIÇÃO PARA O STATUS REDOX CELULAR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas. Orientador: Drª. Sandra Lauton Santos Co-orientador: Dr. Luciano dos Santos Aggum Capettini

SÃO CRISTÓVÃO 2013

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTR AL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

Mesquita, Thássio Ricardo Ribeiro

M582m

O

Modulação do sistema cardiovascular pelos receptores para cininas e sua contribuição para o status redox celular / Thássio Ricardo Ribeiro Mesquita; orientadora Sandra Lauton Santos – São Cristóvão, 2013. xi, 85 f.: Il. Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) – Universidade Federal de Sergipe, 2013.

1. Sistema cardiovascular. 2. Sistema calicreína-cinina. 3. Espécies

reativas de oxigênio. 4. Espécies reativas de nitrogênio. I. Santos, Sandra Lauton, orient. II. Título.

CDU: 612.1

iii


MODULAÇÃO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR

PELOS RECEPTORES PARA CININAS E SUA CONTRIBUIÇÃO PARA O STATUS REDOX CELULAR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

______________________________________________________ Orientadora: Drª. Sandra Lauton Santos

_____________________________________________________

Co-orientador: Dr. Luciano dos Santos Aggum Capettini

______________________________________________________ 1º Examinador: Drª. Silvia Carolina Guatimosim Fonseca

______________________________________________________

2º Examinador: Dr. Enilton Aparecido Camargo

______________________________________________________ 1º Examinador Suplente: Dr. Eduardo Antonio Conde Garcia

______________________________________________________

2º Examinador Suplente: Dr. Daniel Badauê Passos Junior

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Dedicatória Para as mulheres de minha vida, Minha Mãe, detentora de todo meu amor e admiração profunda. Minha Irmã, simplesmente amo. Minha Noiva, pelo amor, compreensão e dedicação ao nosso futuro. Ao meu Pai, ausência de corpo e presença de espírito diária.

v

AGRADECIMENTOS

Aos animais que doaram suas vidas inconscientemente em prol da evolução da ciência.

A toda minha família e amigos, que mesmo não sabendo ao certo o que eu fazia, e com

minha ausência, me compreendiam e apoiavam incondicionalmente.

À Drª. Sandra Lauton Santos, querida orientadora, que me ensinou mais do que

conhecimentos e técnicas, pela lição diária de compromisso com ensino e pesquisa. Agradeço

por provocar-me, também diariamente, que o limite é uma barreira que nós humanos

impomos e deve ser transposta, enfim, mas do que isto, a amizade foi e será um dos nossos

melhores bônus.

Ao Laboratório de Biofísica do Coração e seus membros, Dr. Eduardo Antônio Conde

Garcia, Drª. Carla Maria de Lins Vasconcelos, Drª. Evaleide Diniz de Oliveira, aos alunos de

mestrado, José Evaldo e os recentes mestres, Valéria Fernandes e Américo, aos alunos de

iniciação científica, Itamar Couto, Michel Santana, Jucilene Freitas e a todos que contribuíram

para o progresso de minha formação acadêmica.

Ao Dr. Jorge Luiz Pesquero, do Departamento de Fisiologia e Biofísica (ICB/UFMG)

e ao Dr. João Bosco Pesquero, do Departamento de Biofísica (UNIFESP), que gentilmente

forneceram os animais Knockouts para realização deste projeto.

À Drª. Silvia Carolina Fonseca Guatimosim e sua aluna de doutorado Aline Alves

Lara, do Departamento de Fisiologia e Biofísica (ICB – UFMG), pela valiosa contribuição

nos experimentos de microscopia confocal.

À Drª. Virgínia Soares Lemos, do Departamento de Fisiologia e Biofísica

(ICB/UFMG), Dr. Steyner França Côrtes e ao meu co-orientador, Dr. Luciano dos Santos

Aggum Capettini, do Departamento de Farmacologia (ICB/UFMG), por permitem livre

acesso aos seus respectivos laboratórios para realização de grande parte dos experimentos.

Aos membros da banca examinadora (PROASA, Qualificação e Defesa) pela

disponibilidade em contribuir com este trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas – PROCFIS, pela árdua

tarefa de implementar e consolidar este curso do qual orgulhosamente faço parte.

A CAPES-FAPITEC, pelo suporte durante todo período do mestrado.

vi

MODULAÇÃO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR PELOS RECEPTORE S PARA CININAS E SUA CONTRIBUIÇÃO PARA O STATUS REDOX CELU LAR. Thássio

Ricardo Ribeiro Mesquita. São Cristovão, 2013

O sistema calicreína-cinina (SCC) é reconhecido por desempenhar funções que envolvem a manutenção da homeostase do sistema cardiovascular. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição dos receptores para cininas na manutenção do status redox celular no sistema cardiovascular. Para isso, foi avaliada a função contrátil cardíaca (Langendorff) e vascular (reatividade vascular em banho de órgão isolado), além de medir, em coração e aorta torácica a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), nitrogênio (RNS), expressão de enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GPx), assim como das que sintetizam o óxido nítrico (NO - eNOS e nNOS) e proteínas relacionadas com homeostase intracelular do cálcio (SERCA2a e NCX) em animais knockouts dos receptores B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-) para cininas. Para avaliar a

expressão proteica das enzimas antioxidantes, NOS (total e fosforilada), SERCA2a e NCX, foram realizados experimentos de western blot no coração. Foram também realizados experimentos de co-imunoprecipitação em pool de aorta torácica para identificação de proteínas complexadas aos receptores para cininas. Como resultados, identificamos redução na tensão sistólica cardíaca (B1

-/-: 53% e B2-/-: 52%), entretanto, não foram identificadas

alterações na tensão diastólica e frequência cardíaca, quando comparados ao grupo WT. Detectamos, em cardiomiócitos, aumento na geração do peróxido de hidrogênio (H2O2, B1

-/-: 75% e B2

-/-: 54%), radical superóxido (O2•-, B1

-/-: 40% e B2-/-: 41%) quando comparados ao

grupo WT. Estes resultados foram acompanhados pela redução na expressão de enzimas antioxidantes SOD (B1

-/-: 32% e B2-/-: 20%), CAT (B1

-/-: 34% e B2-/-: 39%) e GPx (B1

-/-: 29% e B2

-/-: 25%). Verificamos, ainda, aumento na produção do NO (B1-/-: 75% e B2

-/-: 36%) e sugerimos que esta alteração ocorre devido ao aumento na expressão e da atividade das NOS (eNOS: B1

-/-: 20% e B2-/-: 23% e nNOS: B1

-/-: 27% e B2-/-: 30%) e (peNOSSer1177: B1

-/-: 161% e B2

-/-: 154%; peNOSThr495: B1

-/-: 43% e B2-/-: 45%; pnNOS

Ser852: B1-/-: 25% e B2

-/-: 26%). Demonstramos ainda, redução da expressão da SERCA2a (B1

-/-: 41% e B2-/-: 46%) e aumento

na expressão do NCX (B1-/-: 16% e B2

-/-: 22%). Os resultados de Langendorff permitiram identificar elevada resistência coronariana nos grupos B1

-/- (38%) e B2-/- (38%), sugerimos que

a disfunção endotelial seja a principal causa dessa alteração. Confirmamos esta hipótese através de experimentos de reatividade vascular em aorta torácica, onde foi demonstrado aumento da resposta vasoconstritora (B1

-/-: 66% e B2-/-: 266%) e prejuízo na vasodilatadora

(B1-/-: 50% e B2

-/-: 56%), devido, principalmente, ao comprometimento da nNOS em aorta de animais dos grupos B1

-/- e B2-/-. Sugerimos que, em aorta, os receptores B1 e B2 estão

espontaneamente heterodimerizados com a nNOS e eNOS. Desta forma, propomos que a deleção dos receptores para cininas criam perturbações na atividade catalítica da nNOS favorecendo o estado de desacoplamento desta enzima e, consequentemente, comprometendo a biodisponibilidade do NO (B1

-/-: 30% e B2-/-: 20%) e gerando exacerbada de H2O2 (B1

-/-: 30% e B2

-/-: 52%) e O2•- (B1

-/-: 46% e B2-/-: 69%). Concluímos que os receptores para cininas

contribuem na homeostase da função contrátil do coração e aorta torácica, como também, regulam a produção de ROS e RNS em ambos os tecidos. Palavras Chave: Sistema Calicreína-Cinina; Sistema Cardiovascular; Espécies Reativas de

Oxigênio; Espécies Reativas de Nitrogênio.

vii

MODULATION OF CARDIOVASCULAR SYSTEM BY KININS RECEP TORS AND THEIR CONTRIBUTION TO CELLULAR REDOX STATUS. Thássi o Ricardo

Ribeiro Mesquita. São Cristovão, 2013 The kallikrein-kinin system (SCC) is known for performing functions that involve maintain homeostasis of cardiovascular system. The aim of this study was to evaluate the contribution of kinin receptors in maintaining the cellular redox status of the cardiovascular system. For this, the cardiac contractile function (Langendorff) and vascular (vascular reactivity in isolated organ bath) was evaluated, and measured, in heart and thoracic aorta the production of reactive oxygen species (ROS), nitrogen (RNS), expression of antioxidant enzymes (SOD, CAT and GPx), as well as those which synthesize nitric oxide (NO - eNOS and nNOS) and proteins related to intracellular calcium homeostasis (SERCA2a and NCX) in knockout animals B1 receptor (B1

-/-) and B2 (B2-/-) to kinins. To evaluate the protein expression of

antioxidant enzymes, NOS (total and phosphorylated), SERCA2a and NCX, western blot experiments were performed in heart. Were also performed, co-immunoprecipitation experiments in pool of the thoracic aorta to identify proteins complexed with kinins receptors. As results, were identified reduction in cardiac systolic tension (B1

-/-: 53% and B2-/-: 52%),

however, no changes in diastolic tension and heart rate were identified when compared to the WT group. We detected in cardiomyocytes increase of hydrogen peroxide (H2O2, B1

-/-: 75% and B2

-/-: 54%), superoxide radical generation (O2•-, B1

-/-: 40%, and B2-/-: 41%) compared to

the WT group. These findings were followed by reduction in expression of antioxidant enzymes SOD (B1

-/-: 32% and B2-/-: 20%), CAT (B1

-/-: 34% and B2-/-: 39%) and GPx (B1

-/-: 29% and B2

-/-: 25%). Also verified an increase in NO production (B1-/-: 75% and B2

-/-: 36%) and we suggest that this alteration occurred due increase in the expression and activity of NOS (eNOS: B1

-/-: 20% and B2-/-: 23% and nNOS: B1

-/-: 27% and B2-/-: 30%) and

(peNOSSer1177: B1-/-: 161% and B2

-/-: 154%; peNOSThr495: B1-/-: 43% and B2

-/-: 45%; pnNOSSer852: B1

-/-: 25% and B2-/-: 26%). We also demonstrated, reduction in expression of

SERCA2a (B1-/-: 41% and B2

-/-: 46%) and increases in expression of NCX (B1-/-: 16% and B2

-/-

: 22%). The Langendorff results allowed identifying high coronary resistance in groups B1-/-

(38%) and B2-/- (38%), suggesting, that endothelial dysfunction is the main cause of this

alteration. We confirm this hypothesis through vascular reactivity experiments in thoracic aorta, which was demonstrated increased vasoconstrictor response (B1

-/-: 66% and B2-/-:

266%) and impaired vasodilation (B1-/-: 50% and B2

-/-: 56%), mainly due to the involvement of nNOS in the aorta of animals in groups B1

-/- and B2-/-. We suggest that, in aorta, the B1 and

B2 receptors are in spontaneously heterodimerization with nNOS and eNOS. Thus, we propose that deletion of the kinin receptors creates disturbances in the catalytic activity of nNOS, favoring the uncoupling state of this enzyme, impairing bioavailability of NO (B1

-/-: 30% and B2

-/-: 20%) and exacerbated H2O2 generation (B1-/-: 30% and B2

-/-: 52%) and O2•- (B1

-

/-: 46% and B2-/-: 69%). We conclude that, kinin receptors contribute to homeostasis for

contractile function of the heart and thoracic aorta, but also regulate the production of ROS and RNS in both tissues. Key-words: Kallikrein-Kinin System, Cardiovascular System, Reactive Oxygen Species, Reactive Nitrogen Species.

viii

LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Figura 1. Metabolismo peptídico do sistema calicreína-cinina...........................................03

Figura 2. Principais enzimas que metabolizam o peptídeo BK e seus respectivos sítios de

clivagem da molécula..............................................................................................................04

Figura 3. Representação esquemática da sequência de aminoácidos do receptor B1 em

humanos...................................................................................................................................05

Figura 4. Representação esquemática da sequência de aminoácidos do receptor B2 em

humanos...................................................................................................................................08

Figura 5. Registro típico de coração isolado de camundongo durante perfusão

retrógrada em sistema de Langendorff.................................................................................18

Figura 6. Genotipagem de camundongos knockouts para o receptor B1 para cininas (B1-/-

).................................................................................................................................................25

Figura 7. Genotipagem de camundongos knockouts para o receptor B2 para cininas (B2-/-

).................................................................................................................................................25

Figura 8. Variação da tensão sistólica em coração isolado de camundongos. Os registros

foram obtidos em corações de animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=5), e

knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-- n=6) e B2 (B2

-/--

n=5)...........................................................................................................................................26

Figura 9. Variação da tensão diastólica em coração isolado de camundongos. Os

registros foram obtidos em corações de animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type -

n=5), e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/- - n=6) e B2 (B2

-/- -

n=5)...........................................................................................................................................27

ix

Figura 10. Variação da frequência cardíaca espontânea em coração isolado de animais

dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=4) e knockouts para os receptores para cininas

B1 (B1-/- - n=5) e B2 (B2

-/- - n=4)...............................................................................................27

Figura 11. Variação da pressão de perfusão em coração isolado de animais dos grupos

selvagem (WT – Wild Type - n=8) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/- -

n=6) e B2 (B2-/- - n=5)...............................................................................................................28

Figura 12. Produção basal do ânion superóxido em cardiomiócitos dos animais dos

grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-)

e B2 (B2-/-)..................................................................................................................................29

Figura 13. Produção basal de peróxido de hidrogênio em cardiomiócitos dos animais dos

grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-)

e B2 (B2-/-)..................................................................................................................................30

Figura 14. Produção basal de óxido nítrico em cardiomiócitos dos animais dos grupos

selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2

(B2-/-)..........................................................................................................................................31

Figura 15. Determinação da expressão proteica da enzima Cu/Zn Superóxido Dismutase

(Cu/Zn SOD) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e

knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-

).................................................................................................................................................32

Figura 16. Determinação da expressão proteica da enzima catalase em tecido cardíaco

dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para

cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-)......................................................................................................33

Figura 17. Determinação da expressão proteica da enzima Glutationa Peroxidase (GPx)

em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para

os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-).....................................................................34

x

Figura 18. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase

endotelial (eNOS) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild

Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-).............................35

Figura 19. Avaliação dos níveis de fosforilação da enzima Óxido Nítrico Sintase

endotelial (peNOS Ser1177) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT –

Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-

).................................................................................................................................................36


endotelial fosforilada (peNOS Thr495) em tecido cardíaco dos animais dos grupos

selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2

(B2-/-)..........................................................................................................................................37

Figura 21. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase

neuronal (nNOS) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type)

e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-)........................................38


neuronal fosforilada (pnNOS Ser852) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem

(WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-

).................................................................................................................................................39

Figura 23. Determinação da expressão proteica do trocador sódio/cálcio (NCX) em

tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os

receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-)..........................................................................40

Figura 24. Determinação da expressão proteica da Cálcio ATPase do Retículo

Sarcoplasmático (SERCA2a) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT

– Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-

).................................................................................................................................................41

xi

Figura 25. Efeito vasorrelaxante induzido pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de

camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=21) e knockouts para os

receptores para cininas B1 (B1-/- - n=10) e B2 (B2

-/- - n=13)..................................................42

Figura 26. Efeito vasoconstritor induzido pela fenilefrina (Phen) em anéis de aorta de

camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=8) e knockouts para os

receptores para cininas B1 (B1-/- - n=5) e B2 (B2

-/- - n=4).......................................................43

Figura 27. Efeito da inibição não seletiva das NOS pelo L-NNA (100 µmol.L-1) sobre a

resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de

camundongos do grupo selvagem (WT – Wild Type - n=5 / L-NNA -

n=5)...........................................................................................................................................44

Figura 28. Efeito da inibição seletiva da nNOS sobre a resposta vasorrelaxante induzida

pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos do grupo selvagem (WT –

Wild Type - n=8 / TRIM - n=8)...............................................................................................44



camundongos knockout para receptor B1 para cininas (B1-/- - n=8 / L-NNA -

n=8)...........................................................................................................................................45



camundongos knockout para receptor B2 para cininas (B2-/- - n=5 / L-NNA -

n=5)...........................................................................................................................................46

Figura 31. Efeito da inibição seletiva da nNOS pelo TRIM (300 µmol.L -1) sobre a


camundongos knockout para receptor B1-/- para cininas (B1

-/- - n=5 / TRIM -

n=5)...........................................................................................................................................46

xii

Figura 32. Efeito da inibição seletiva da nNOS pelo TRIM (300 µmol.L -1) sobre a


camundongos knockout para receptor B2 para cininas (B2-/- - n=5 / TRIM -

n=5)...........................................................................................................................................47

Figura 33. Produção basal de óxido nítrico em anéis de aorta torácica de camundongos

dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1

(B1-/-) e B2 (B2

-/-)........................................................................................................................48

Figura 34. Produção basal de peróxido de hidrogênio em anéis da aorta torácica de

camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores

para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-).............................................................................................49

Figura 35. Produção basal de ânion superóxido em anéis da aorta torácica de

camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores

para cininas B1 (B1-/-) e B2 (B2

-/-).............................................................................................50

Figura 36. Imunoprecipitação do complexo proteína-proteína nNOS/B1 e nNOS/B2 em

aorta torácica de camundongo selvagem (WT – Wild Type)...............................................51

Figura 37. Imunoprecipitação do complexo proteína-proteína eNOS/B1 e eNOS/B2 em

aorta torácica de camundongo selvagem (WT – Wild Type)...............................................51

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA Ácido Araquidônico ACh Acetilcolina AP-1 Activator Protein-1 Akt Proteína Cinase B Ang II Angiotensina II ANOVA Análise de variância (Analyses of variance) B1R Receptor B1 B1

-/- Animais knockout para os receptores B1 de cininas B2R receptor B2 B2

-/- Animais knockout para os receptores B2 de cininas BH4 Tetrahidrobiopterina (cofator da NOS) BK Bradicinina BPM Batimentos por Minuto COX Ciclooxigenases cAMP AMP cíclico (adenosina monofosfato cíclico) cDNA DNA complementar (ácido desoxiribonucleico complementar) cGMP GMP cíclico (guanosina monofosfato cíclico) Cu/Zn SOD Cobre-Zinco Superoxido Dismutase DBK Des-Arg9-Bradicinina DAF-FM 4-amino5-metilamino-2,7difluoresceina diacetato DAG Diacilglicerol DCF 2',7'-Dichlorofluorescein DHE Dihydroethidium DLBK Des-Arg10 Lys-Bradicinina DNA Ácido desoxiribonucléico (Deoxyribose Nucleic Acid) DTT Ditiotreitol ECA Enzima Conversora de Angiotensina I EDHF Fator hiperpolarizante derivado do endotélio (Endothelium derived hiperpolarizing factor) EDTA Ácido etilenediaminotetraacético ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EMAX Efeito Máximo eNOS Óxido nítrico sintase endotelial; NOS III (endothelial nitric oxide synthase) EOX Epoxigenases e.p.m. Erro padrão da média EPN Endopeptidase Neutra RNS Espécies Reativas de Nitrogênio (reactive nitrogen species) ROS Espécies Reativas de Oxigênio (reactive oxygen species) ERK 1/2 Extracellular Signal-Regulated Kinases GPx Glutationa Peroxidase GRKs Quinases de Receptores Acoplados à Proteína G (G-Protein Coupled Receptor kinases) H2O2 Peróxido de hidrogênio HCl Ácido clorídrico HEPES N-2-Hidroetilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfônico

xiv

(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Acid) H2DCFH-DA 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate HSP-90 Heat Shock Protein 90 HRP Horse radish peroxidase IL-1β Interleucina-1 beta iNOS Óxido nítrico sintase induzida ou indutivel; NOS II (inducible nitric oxide synthase) IP3 Inositol 1,4,5 Trifosfato JAK/STAT Janus Kinase K+ Íon potássio KATP Canal para potássio sensível a ATP KCa2+ Canal para potássio regulado por cálcio L-Arg L-Arginina L-NAME NG-nitro-L-arginina metil éster (NG-nitro-L-Arginine MethylEster) L-NNA NG-nitro-L-arginina (NG-Nitro-L-Arginine) LOX Lipooxigenases Lys-BK Calidina MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MnSOD Superóxido Dismutase Mitocondrial Manganês mtDNA DNA mitocondrial NF-κB Factor Nuclear Kappa B mRNA RNA mensageiro NADP Nicotinamida adenina difosfato NADPH Nicotinamida adenina difosfato reduzida NADPH oxidase Nicotine Adenine Dinucleotide Phosphate oxidase NCX Trocador sódio-cálcio nNOS Óxido nítrico sintase neuronal; NOS I (neuronal nitric oxide synthase) NO Óxido nítrico (Nitric Oxide) NOS Óxido nítrico sintase (nitric oxide synthase) O2

•- Ânion superóxido OD Densidade óptica (Optical Density) ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (inibidor de guanilil ciclase) OH• Radical hidroxil OONO- Peroxinitrito pb Pares de base PBS Solução tamponada de potássio (Phosphate Buffer Solution) PCR Reação da polimerase em cadeia (Polymerase Chain Reaction) PGI2 Prostaglandina I2 (prostaciclina) pH Potencial hidrogeniônico Phen Fenilefrina Pi3-K Fosfatidilinositol-3-Cinase PIP2 Fosfatidilinositol 4,5- Bifosfato PKA Proteína cinase A PKC Proteína cinase C PKG Proteína cinase G PLA2 Fosfolipase A2 PLC Fosfolipase Cγ

xv

PLB Fosfolamban PLC β Fosfolipase Cβ PLI2 Prostaglandina I2

PMSF Fluoreto de Fenilmetilsilfonila RNA Ácido ribonucléico (RiboNucleic Acid) RPM Rotações por minuto RS Retículo sarcoplasmático RyR2 Receptor de rianodina SCC Sistema Calicreína-Cinina SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SERCA2a Cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático de subtipo 2a SOD Superóxido dismutase SNAP Nitroprussiato de sódio (sodium nitroprusside) SRA Sistema Renina Angiotensina TBE Tampão Tris - Ácido bórico - EDTA TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine TRIM l-(2-Trifluoromethylphenyl)imidazole (inibidor seletivo da nNOS) u.a. Unidades arbitrárias (arbitraries units) WT Tipo selvagem – Wild type XO Xantina oxidase

xvi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................01

2 REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................................02

2.1 Metabolismo de Cininas..........................................................................................02

2.2 Estrutura, Sinalização Intracelular do Receptor B1 e Sistema Cardiovascular.......04

2.3 Estrutura, Sinalização Intracelular do Receptor B2 e Sistema Cardiovascular.......08

2.4 Sinalização Das Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio em Cardiomiócito..11

3 OBJETIVOS.........................................................................................................................14

3.1 Objetivo Geral.........................................................................................................14

3.2 Objetivos Específicos..............................................................................................14

4 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................15

4.1 Grupos Experimentais.............................................................................................15

4.2 Genotipagem...........................................................................................................15

4.3 Procedimento Cirúrgico para Retirada do Coração................................................16

4.4 Estudo dos Parâmetros Cardíacos..........................................................................17

4.5 Obtenção de Células Cardíacas Isoladas................................................................18

4.6 Experimentos de Reatividade Vascular..................................................................18

4.6.1 Obtenção e Montagem dos Anéis de Aorta.............................................18

4.6.2 Avaliação da Integridade Endotelial........................................................19

4.6.3 Remoção do Endotélio Funcional............................................................20

4.6.4 Curva de Contração Induzida pela Fenilefrina.........................................20

4.6.5 Participação da Via das Óxido Nítrico Sintases na Resposta

Vasorrelaxante à Acetilcolina............................................................................20

4.7 Mensuração dos Níveis Intracelulares das Espécies Reativas de Oxigênio............20

4.8 Mensuração dos Níveis Intracelulares do Óxido Nítrico........................................21

xvii

4.9 Extração de Proteínas do Tecido.............................................................................22

4.10 Determinação da Concentração Total de Proteínas...............................................22

4.11 Determinação da Expressão Proteica por Western Blot........................................22

4.12 Co-imunoprecipitação...........................................................................................23

4.13 Análises Estatísticas..............................................................................................24

5 RESULTADOS ....................................................................................................................25

6 DISCUSSÃO.........................................................................................................................52

7 CONCLUSÃO......................................................................................................................66

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................................66

9. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO...............................................................................68

1

1. INTRODUÇÃO

Os peptídeos e os derivados metabólicos ativos do sistema calicreína-cinina

(SCC) exercem uma variedade de efeitos biológicos. Estes efeitos ocorrem através da ativação

da superfamília de receptores acoplados à proteína G, atuando sobre um complexo conjunto

de vias de sinalização intracelular. Estas vias regulam diversas funções fisiológicas e

fisiopatológicas. A ação das cininas é mediada após a ligação destes peptídeos em dois

receptores distintos, B1 (B1R) e B2 (B2R). A literatura clássica aponta que os B2R são

constitutivamente expressos em condições fisiológicas basais, enquanto, os B1R tem sua

expressão reduzida nestas mesmas condições, porém, tem aumento significativo em algumas

situações patológicas (MARCEAU et al., 1998).

Durante o estado inflamatório, como, asma (BARNES, 1992), alergia (POLOSA,

1993) e após traumas e lesões, as cininas promovem a migração de células do sangue para os

tecidos lesionados a fim de ativar vários componentes anti-inflamatórios, tais como:

mastócitos, fibroblastos, macrófagos e outras células do sistema imune (BHOOLA et al.,

1992).

No endotélio, as funções fisiológicas deste sistema promovem a liberação de

moléculas sinalizadoras, como óxido nítrico (NO), prostaciclinas e fator hiperpolarizante

derivado do endotélio (REGOLI e BARABÉ, 1980; TODA et al., 1987; SCHINI et al., 1990;

MOMBOULI e VANHOUTTE, 1995), produzindo, na circulação periférica, a vasodilatação e

aumento do fluxo sanguíneo através da redução do tônus da musculatura arterial lisa.

No coração, o SCC está envolvido em vias de sinalização intracelulares que

regulam a mobilização do cálcio e consequentemente regulação da maquinaria contrátil

(LAUTON-SANTOS, 2007; ROMAN-CAMPOS et al., 2010). Sua ação estende-se ainda

sobre o músculo liso visceral e a quase todos os órgãos controlados pelos sistemas nervoso

autônomo simpático (TOUSIGNANT et al., 1987) e parassimpático (LOPES e COUTURE,

1992).

A literatura aponta a relação entre o SCC e a produção de moléculas sinalizadoras

como as espécies reativas de oxigênio (ROS) (OLDENBURG et al., 2004) e nitrogênio (RNS)

(LAUTON-SANTOS, 2007; ROMAN-CAMPOS et al., 2010), propondo a participação

destas, em vias de sinalização intracelular que modulam a função cardiovascular durante o

estado fisiológico.

2

A literatura ainda é inconclusiva sobre a participação de ROS e RNS como

moléculas sinalizadoras do SCC e ainda, mais distante, que estas moléculas sejam capazes de

regular a dinâmica de cálcio intracelular. Contudo, este trabalho propõe avaliar a participação

dos receptores para cininas na produção de ROS e RNS no sistema cardiovascular, para tentar

contribuir na produção de novos conhecimentos sobre estas vias de sinalização e sua

influência na manutenção da homeostase cardíaca e vascular.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Metabolismo de Cininas

O SCC é constituído por um componente plasmático e outro tecidual. O

nonapeptídeo bradicinina (BK) e o decapeptídeo calidina (Lys-BK) são os principais

peptídeos derivados da proteólise de seu precursor inativo, o cininogênio, através da ação

catalítica das enzimas cininogenases. A principal e mais potente cininogenase é a calicreína,

existindo nas formas plasmática e tecidual (Figura 1). Ambos os peptídeos produzidos pela

ação dessas enzimas são agonistas do receptor B2, tendo, porém, afinidades diferentes para o

mesmo. A cinina liberada pela calicreína plasmática humana, de rato ou camundongo é a BK,

entretanto, as calicreínas teciduais em humano produzem Lys-BK (BHOOLA et al., 1992).

No plasma, a BK pode, ainda, ser sintetizada através de outras cininogenases, como por

exemplo, a tripsina, uropepsina ou plasmina. Nos rins, a calicreína tecidual é a principal

cininogenase (CARRETERO e SCICLI, 1988). Estas enzimas diferem, dentre outros

aspectos, em sua massa molecular e no tipo de cininas sintetizadas (MARCEAU et al., 1998).

A BK apresenta meia vida curta, aproximadamente 15 segundos, e seus níveis

circulantes são relativamente baixos, variando entre 0,2–7,1 pM (NUSSBERGER et al, 1999;

MOREAU et al, 2005). Os peptídeos BK e Lys-BK são rapidamente hidrolisados pelas

enzimas cininases I e cininases II (Figura 1), as primeiras, compreendem as carboxipeptidases

M (membrana) e N (plasmática), e as cininases II compreendem a enzima conversora de

angiotensina I (ECA) e a endopeptidase neutra (EPN) (Figura 1). A carboxipeptidase N é

produzida no fígado e secretada na circulação, esta enzima é responsável pela degradação de

cerca de 90% da BK no plasma. A carboxipeptidase M é uma enzima de membrana

plasmática, encontrada no rim humano, pulmão e placenta (SKIDGEL e ERDÖS, 1998). Em

decorrência de sua localização na superfície celular, ancorada ao B1R, esta enzima

desempenha um importante papel no reconhecimento e sensibilização da interação agonista-

3

receptor, devido sua especificidade para ligações aos aminoácidos arginina ou lisina (KUHR

et al, 2010).

Figura 1. Metabolismo peptídico do sistema calicreína-cinina. ECA: Enzima Conversora de Angiotensina; EPN: Endopeptidase Neutra. Adaptado de Campbell, 2000.

Outras enzimas capazes de hidrolisar a BK são a prolidase (aminopeptidase P), as

endopeptidases (cininases A e B), a prolil endopeptidase e a enzima conversora de endotelina

(Figura 2). A ação das carboxipeptidases sobre a BK e Lys-BK, catalisa a formação de

derivados metabólicos ativos, Des-Arg9 Bradicinina (DBK) e Des-Arg10 Lys-Bradicinina

(DLBK), ambos exercem seus efeitos através da ativação do B1R (BHOOLA et al., 1992;

ERIC et al., 2003; CAMPBELL, 2000).

4

Figura 2. Principais enzimas que metabolizam o peptídeo BK e seus respectivos sítios de clivagem da molécula. ECA: Enzima Conversora de Angiotensina. Adaptado de Campbell, 2000.

2.2 Estrutura, Sinalização Intracelular do Receptor B1 e Sistema Cardiovascular

A descrição molecular do B1R iniciou-se com o sequenciamento em humanos

(MENKE et al., 1994), e posteriormente, em camundongos (PESQUERO et al., 1996) e ratos

(NI et al., 1999; JONES et al., 1999). A partir dos estudos destes receptores em humanos,

ficou conhecido que o B1R é composto por 334 aminoácidos e possui massa molecular de

aproximadamente 40 kDa, como representado na Figura 3 (PESQUERO et al., 1996;

MARCEAU et al., 1998).

5

Figura 3. Representação esquemática da sequência de aminoácidos do receptor B1 em humanos (Adaptado de LEEB-LUDBERG et al., 2005). AI-1: alça intracelular 1; AI-3: alça intracelular 2; AI-3: alça intracelular 3; AE-1: alça extracelular 1; AE-2: alça extracelular 2; AE-3: alça extracelular 3.

As características estruturais dos B1Rs os define como pertencentes a classe de

receptores metabotrópicos, acoplados à superfamília de proteínas G, exibindo uma arquitetura

molecular com 7 alfa-hélices transmembranares. A sinalização intracelular desencadeada pelo

B1R assemelha-se, em muitos aspectos, à do B2R, com a participação de proteínas Gq e Gi

acopladas ao receptor. Entretanto, a cascata de segundos mensageiros intracelulares associada

à sinalização do B1R envolve a ativação da fosfolipase C (PLC), a partir da hidrólise de um

fosfolipídeo da membrana celular, o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em inositol 1,4,5 -

trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). Estes segundos mensageiros estão envolvidos em

múltiplas funções celulares, como na ativação da proteína quinase C (PKC), que está

envolvida no aumento da influxo de cálcio (Ca2+), liberação de ácido araquidônico (AA),

produção de eicosaóides, e ativação da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) com

consequente produção do NO (TSUTSUI et al., 2000).

6

A partir de ensaios de binding em tecidos humanos (HESS et al., 1992;

SCHNECK et al., 1994) e em preparações in vivo (BHOOLA et al., 1992; LINZ et al., 1995)

foi demonstrado que os B1Rs e B2Rs diferem significativamente, no que se refere às respostas

induzidas pelas diferentes cininas. O B2R é ativado por BK e Lys-BK, e o B1R é mais sensível

aos peptídeos metabólitos gerados pela ação da cininase I e II, DBK e DLBK (MARCEAU et

al., 1998).

A afinidade das diferentes cininas aos seus respectivos receptores deve-se à

presença de um resíduo de lisina na posição 118 da porção C-terminal, localizada no terceiro

domínio transmembrânico do B1R. Este resíduo repele cargas positivas da BK e Lys-BK que

contém resíduos de arginina na posição 9, tornando o B1R seletivo para a DBK e ao DLBK

(MARCEAU et al., 1998).

O desenvolvimento de antagonistas seletivos tem sido crucial para definir as

respostas farmacológicas dos subtipos de receptores para cininas, entretanto, ainda no século

XXI se busca desenvolver antagonistas mais seletivos e potentes para o B1R. O primeiro

protótipo dos antagonistas de B1R foi o [Leu8] des-Arg9-BK (REGOLI et al., 1977), o qual

posteriormente, foi demonstrado não ser biologicamente ativo em bioensaios contráteis em

útero de rata, em íleo de cobaia ou em ensaios in vivo (REGOLI e BARABÉ, 1980).

Até o momento, os principais antagonistas para o B1R são de natureza peptídica.

Por apresentarem elevada seletividade para o B1R, são criticamente importantes para as

investigações de eventos fisiopatológicos e aplicações terapêuticas. Entretanto, peptídeos

sofrem várias desvantagens como potenciais agentes terapêuticos, tais como instabilidade

metabólica, baixa absorção oral, rápida eliminação, curta duração da ação e, em alguns casos,

dependendo da concentração, atividade como agonista parcial (MARCEAU et al., 1998).

Dentre os novos antagonistas, destaca-se o des-arg10 HOE 140, por exibir elevada

afinidade para o B1R em todas as espécies estudadas (ratos, camundongos, coelho e cobaia),

em ensaios de funcionalidade in vitro (RHALEB, GOBEIL e REGOLI, 1992) e in vivo

(LAGNEUX e RIBUOT, 1997), entretanto, alta concentrações e prolongada exposição à este,

é capaz de produz derivados metabólitos residuais que, dentre alguns efeitos, antagonizam o

B2R.

Os receptores para cininas apresentam diferentes padrões de expressão em

condições fisiológicas basais. Classicamente, é conhecido que o B2R é abundantemente

expresso, de forma constitutiva, em diferentes tecidos, incluindo endotélio vascular, músculo

liso vascular e cardiomiócitos (FELIPE et al., 2007). Os B1Rs são, geralmente, pouco

expressos em tecidos saudáveis, mas rapidamente expressos em situações de lesão tecidual e

7

inflamação (MARCEAU et al., 1998). Entretanto, artigos mais recentes demonstraram que

ambos os receptores para cininas desempenham funções no controle da homeostase

cardiovascular em estado fisiológico e fisiopatológico (LAUTON-SANTOS et al., 2007;

FELIPE et al., 2007).

Vários estudos revelam a expressão do B1R em fibras simpáticas do miocárdio

(FOUCART et al., 1997), em fibras do sistema de condução do coração (GOUIN et al., 1996;

FERNANDES et al., 2006), e sabe-se que sua ativação é capaz de prolongar a duração do

potencial de ação cardíaco em ratos (GOUIN et al., 1996). O significado fisiológico da

presença e sinalização do B1R em tecido cardíaco pode ser ainda mais complexa. Estudos tem

demonstrado relação destes receptores com o reparo tecidual (TSCHÖPE et al., 2000) e

redução da área infartada após lesão por isquemia no miocárdio (LAGNEUX, ADAM,

LAMONTAGNE, 2003).

Os B1R são regulados por uma série de citocinas presentes no processo

inflamatório, e outros fatores, tais como proteína quinase ativada por mitógeno (do inglês

mitogen-activated protein kinase - MAPK) (LARRIVÉ et al., 1998) e o fator nuclear kappa B

(do inglês nuclear factor kappa B - NF-κB) (SCHANSTRA et al., 1998; NI et al., 1998).

Alguns autores sugerem que o B2R esteja relacionado à resposta inflamatória

aguda, enquanto o B1R, à processos inflamatórios crônicos ou prolongados (McLEAN et al.,

1999). Esta hipótese foi levantada devido ao B2R apresentar a capacidade de regulação

negativa, rapidamente internalizando e indisponibilizando ambos, o receptor e a proteína G

(AUSTIN et al., 1997; WEERD e LEEB-LUNDBERG, 1997).

Por outro lado, o B1R exibe dessensibilização bastante limitada. Foi demonstrado

o importante papel de alguns aminoácidos de sua cauda C-terminal citoplasmática no

processo de internalização do receptor. Observou-se que resíduos de aminoácidos serina e

treonina, nesta referida localização, são necessários para o mecanismo de dessensibilização e

internalização do receptor, via quinases, acopladas à proteína G (do inglês G-protein coupled

receptor kinases - GRKs) (BLAUKAT et al.,1999; FAUSSNER et al., 1998).

Além disso, o mecanismo de ativação do B1R também diferere do B2R, já que, em

células humanas, a fosforilação do B1R é inexistente na presença ou ausência do agonista

(BLAUKAT et al., 1999). Esta diferença no mecanismo de ativação dos receptores para

cininas certamente contribui para uma estimulação mais duradoura por parte do B1R e, por

conseguinte, das distintas vias de sinalizações intracelulares associadas aos mesmos, em

diferentes tipos celulares (LEEB-LUNDBERG et al., 2005).

8

2.3 Estrutura, Sinalização Intracelular do Receptor B2 e Sistema Cardiovascular

A codificação molecular, o sequenciamento e a clonagem dos genes que

expressam os receptores para cininas iniciaram-se com a clonagem do B2R em ratos

(McEACHERN et al. 1991) e em diferentes espécies de mamíferos, inclusive o homem

(Figura 4) (HESS et al. 1994).

Figura 4. Representação esquemática da sequência de aminoácidos do receptor B2 em humanos (Adaptado de LEEB-LUDBERG et al., 2005). AI-1: alça intracelular 1; AI-3: alça intracelular 2; AI-3: alça intracelular 3; AE-1: alça extracelular 1; AE-2: alça extracelular 2; AE-3: alça extracelular 3.

A clonagem de cDNA do B2R em camundongos, ratos e humanos revelou grande

similaridade desta molécula nas diferentes espécies. O cDNA de camundongos é 92%

idêntico ao de ratos e 84% ao de humanos (McEACHERN et al., 1991; HESS et al., 1994;

PAQUET et al., 1999). Todavia, a semelhança entre as sequências de aminoácidos entre estes

dois receptores para cininas, em humanos, é relativamente baixa, apresentando apenas 36% de

homologia (LEEB-LUNDBERG et al., 2005).

9

Em camundongos e ratos, o B2R é constituído por 366 aminoácidos e apresenta

uma massa molecular de aproximadamente 69 kDa (FIGUEROA et al., 2001) e, ainda, baixa

homologia (30%) ao B1R (PESQUERO et al., 1996).

Devido à sua elevada expressão em diferentes tecidos, a maioria dos efeitos in

vivo, das cininas são atribuídos ao B2R, incluindo broncoconstrição, hipotensão, reações

inflamatórias agudas, dor e hiperalgesia (STERANKA e BURCH, 1991; HALL, 1992). As

respostas fisiológicas das cininas mediadas pelo B2R, são caracterizados por sua elevada

afinidade pela BK e por sua sensibilidade, mesmo a baixas concentrações do antagonista

sintético seletivo HOE 140 (REGOLI et al., 1998). A ativação dos B2R exercem importantes

efeitos em numerosas preparações in vivo, ex vivo e in vitro, incluindo o trato gastrointestinal,

cardiovascular, genito-urinário, respiratório, neural e em tecidos oculares (revisto por HALL,

1992).

A ativação do B2R e o consequente acionamento dos mecanismos de transdução

de sinal, envolvem uma complexa cascata de sinalização intracelular que se inicia com a

ligação do agonista ao seu receptor na membrana celular. A ligação do agonista ao B2R ativa

a enzima PLC, entretanto, é descrito sua interação com várias proteínas G, como Gαi

(EWALD et al, 1989, LINDER et al, 1990), Gαs (LIEBMANN et al., 1996), e Gα12/13

(GOHLA et al., 1999). A resposta resultante desta ação promove a síntese de DAG e IP3 que,

respectivamente, conduzem à ativação da PKC e à mobilização de Ca2+ a partir do retículo

sarcoplasmático.

A ativação do receptor pode, ainda, promover o influxo de Ca2+ do meio

extracelular através de canais catiônicos não seletivos. A modulação direta de canais iônicos é

também descrita e parece criar um complexo fenômeno de hiperpolarização envolvendo a

abertura de canais para potássio (OLDENBURG et al., 2004). Devido ao seu grande espectro

de distribuição em vários tecidos, os B2R estão ainda envolvidos em vias de produção do NO,

da adenosina monofosfato cíclica (cAMP), liberação de AA, produção de eicosanóides e

prostaglandina I2 (PGI2) (FIELD et al., 1994; YANO et al.,1985; FASOLATO et al., 1988).

Não somente a ativação do B1R, mas também, a do B2R, está associada com a

translocação de fatores de transcrição nuclear, que regulam múltiplas funções celulares, como

a produção de citocinas e apoptose envolvidas na lesão tecidual após reperfusão de região

isquêmica-cardíaca (XIE et al., 2000). A BK é capaz de ativar o NF-κB com subsequente

ativação da fosfatidilinositol-3-quinase/proteína quinase B (Pi3-K/Akt) (XIE et al., 2000),

bem como, RhoA quinase (PAN et al., 1998).

10

Em culturas de células de músculo liso, a BK estimula aumento da expressão de

interleucina 8 (IL-8), por ativação de vias de sinalização dependentes ou não de prostanóides

(ZHU et al., 2003). No acionamento independente dos prostanóides, envolve a ativação de

NF-κB, enquanto que a ativação dependente de prostanóides envolve o fator de transcrição

proteína ativadora 1 (activator protein-1 AP-1: c-jun/c-fos), ativação da quinase regulada por

sinal extracelular (extracellular-signal-regulated kinases - ERK 1/2) (EL-DAHR et al., 1998)

e espécies reativas de oxigênio (ROS) (GREENE,VELARDE e JAFFA, 2000).

Em cultura de células endoteliais, a BK é eficaz na ativação do complexo

enzimático da eNOS e concomitante produção de NO, através de mecanismos dependentes do

aumento da concentração do Ca2+ intracelular (BUSSE e FLEMING, 1995). Nestas células, a

BK promove, também, a fosforilação da MAPK (FLEMING, FISSLHALTER e BUSSE,

1995), PLCγ (FLEMING, FISSLHALTER e BUSSE, 1996), proteína de choque térmico 90

(do inglês heat shock protein 90 - Hsp90) (HARRIS et al., 2000), Janus quinase (JAK/STAT)

(JU et al., 2000) e inclusive do próprio B2R (LEEB-LUNDBERG et al. 2005).

A difusão do NO para a camada muscular promove, dentre outras respostas, a

hiperpolarização da membrana das células musculares lisas, através da abertura de canais para

K+, promovendo, por fim, a vasodilatação (BUSSE e FLEMING, 1995). A resposta

vasorelaxante à BK e DBK é controversa, e, fatores como concentração do agonista e a

espécie de animal utilizada experimentalmente, se apresentam como determinantes das

diferentes respostas apresentadas.

Neste sentido, Gobeil et al. (1996a), em ensaio in vitro, com tiras de veia

umbilical humana, demonstraram que a BK foi capaz de promover a contração do músculo

liso, sendo sugerido a participação de autacóides e a produção de prostanóides na resposta

vasoconstritora (REGOLI e BARABÉ, 1980). Recentemente, foi demonstrado, em

experimento de reatividade vascular utilizando anéis de aorta abdominal de camundongos,

que a BK e DBK são vasoconstritores capazes de promover contrações de 51% e 30%,

respectivamente (FELIPE et al., 2007).

Com a disponibilização do HOE 140, muito se pode conhecer acerca das vias de

sinalização das cininas, bem como, a discriminação entre as mesmas, e, ainda, a importância

das respostas produzidas em diversas situações fisiopatológicas. O HOE 140, também

conhecido como Icatibant, é um potente antagonista competitivo e seletivo para o B2R, e,

apresenta uma alta afinidade pelos B2R na espécie humana, coelho, cobaia, rato e

camundongo. Esta substância apresenta uma ação prolongada e, devido à sua capacidade de

proteção contra degradação enzimática, impulsionou o conhecimento sobre as funções

11

cardiovasculares dos B2R (HOCK et al., 1991; GOBEIL et al., 1996). Em preparações in

vitro, o bloqueio de B2R é totalmente reversível, todavia, após sua remoção da solução, a

recuperação da resposta ao agonista é lenta (HOCK et al., 1991).

Experimentos realizados em humanos, com a infusão intravenosa de BK, em

voluntários saudáveis, resultou em diminuição da pressão arterial, aumento nos batimentos

cardíacos e diminuição na resistência periférica, entretanto, essas alterações hemodinâmicas

foram antagonizadas pelo uso de HOE-140. Estes estudos, envolvendo antagonistas em

humanos, sugerem um importante papel fisiológico das cininas na manutenção da pressão

arterial, uma vez que o SCC, juntamente com o sistema renina-angiotensina (SRA), estão

constitutivamente expressos no coração, no endotélio vascular, rins e diversos outros órgãos

que desempenham a regulação e manutenção da pressão arterial (BERTRAND, 2004).

As diferenças entre os mecanismos de ativação, assim como, na dessensibilização

e internalização dos receptores para cininas apontam a complexidade molecular das vias de

sinalização celular que envolve o SCC (LEEB-LUNDBERG et al., 2005).

2.4 Sinalização Das Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio em Cardiomiócito

As espécies reativas derivadas tanto, do oxigênio, quanto, do nitrogênio (RNS),

são produzidas em todos os sistemas biológicos e podem participar de complexas vias de

sinalização celular, em estados fisiológicos normais, participando de processos vitais para a

célula. Por outro lado, estas espécies, são potencialmente danosas e aparecem, também,

descritas como causa/consequência de diversas patologias e processo de envelhecimento

(SANTOS et al., 2011).

A sinalização promovida por essas espécies reativas compreende a transmissão e

amplificação de sinais, geralmente, envolvendo modificações pós-traducionais, de

redução/oxidação (redox) em proteínas. As ROS e RNS, em cardiomiócitos e outras células,

são geradas por diversas fontes, dentre as quais, as mais importantes são: as mitocôndrias, a

nicotinamida adenina dinucleotídeo fostato-hidrogênio oxidases da família Nox (NADPH

oxidase), xantina oxidase (XO) e as óxido nítrico sintases (NOS) (TZIOMALOS e HARE,

2009; DUNCAN et al., 2005). A produção dessas moléculas, por estas diversas fontes, pode

aumentar diversas vezes em diferentes contextos celulares (por exemplo, estado patológico)

ou por estimulação específica (por exemplo, NADPH oxidases).

As ROS e RNS são classificadas como oxidantes radicalares ̠ dentre os quais, o

radical ânion superóxido (O2•-) e o NO, e os oxidantes não radicalares ˗ peróxido de

hidrogênio (H2O2) e o peroxinitrito (ONOO-). Suas ações dependem do balanço entre a taxa

12

de produção e remoção das mesmas. Este equilíbrio será então dependente de fatores como a

concentração celular de antioxidantes enzimáticos, não enzimáticos e cofatores (AUGUSTO

et al, 2002). Entretanto, a reduzida capacidade antioxidante e elevada síntese destas

substâncias reativas são capazes de formar espécies oxidantes ainda mais reativas, tais como,

o radical hidroxila (OH•), e, posteriormente, caracterizar a condição de estresse oxidativo

(WINTERBOURN, 2008).

Os papéis fisiológicos e patológicos do NO, em cardiomiócitos, foram reunidos e

sugeridos em importantes revisões (SEDDON, SHAH e CASADEI, 2007; MASSION e

BALLIGAND, 2007; KASS et al., 2007). Vários autores revelaram que a redução da

biodisponibilidade de NO devido à sua reação com o O2•-, pode modular vias de sinalizações

intracelulares, devido ao aumento da geração do ONOO- (PACHER, BECKMAN e

LIAUDET, 2007).

Mesmo em baixas concentrações, moléculas, tais como, o OH• (concentração

subnanomolar) podem causar oxidações prejudiciais em componentes celulares, gerando

disfunção cardíaca mal adaptativa (CAVE et al., 2006). Sabe-se, também, que o estresse

oxidativo ocorre, muitas vezes, pela inadequada concentração de antioxidantes endógenos,

que contribui para o desenvolvimento da insuficiência cardíaca. Esta condição, pode ainda,

modular a ativação de cascatas de sinalização que desregulam a homeostase de proteínas

relacionadas ao controle do íon Ca2+ dentro da célula (CAVE et al., 2006).

As alterações na homeostase do Ca2+ intracelular, podem ocorrer devido

modificações promovidas por ROS e RNS em proteínas do miocárdio, tais como, oxidação de

tióis na cisteína, hidroxilação da prolina e arginina, e nitrosilação de tirosina. Essas

modificações podem afetar a conformação, estabilidade e atividade de receptores celulares,

transportadores iônicos (bombas, trocadores e canais), quinases, fosfatases, caspases,

translocases (GTPases), fatores de transcrição, proteínas contráteis e estruturais (AUGUSTO

et al, 2002; WINTERBOURN, 2008).

No coração, as atividades de proteínas que são alvo de modulação por

modificações redox são particularmente importantes para a manutenção fisiológica da função

cardíaca. Dentre estes alvos potenciais estão a proteína quinase A (PKA) (BRENNAN et al.,

2006), a proteína quinase G (PKG) (BURGOYNE et al., 2007), o receptor de rianodina

(RyR2) (XU et al., 1998), a pequena proteína G (Ras) (KUSTER et al., 2006) e a classe II das

histonas desacetilases (HDACs) (AGO et al., 2008).

Por outra via, o aumento exacerbado da geração de ROS mitocondrial na

hipertrofia cardíaca dilatada pode induzir a danos ao DNA mitocondrial (mtDNA), como por

13

exemplo, tornando-o mais susceptível ao dano oxidativo devido à falta de proteção das

histonas mitocondriais (IDE et al., 2001).

Neste mesmo sentido, evidências comprovam que o aumento substancial da

geração de ROS, desenvolvida em camundongos knockout para a superóxido dismutase

mitocondrial manganês (MnSOD), provoca o desenvolvimento de uma grave cardiomiopatia

dilatada (LI et al., 1995).

Em contraste, camundongos transgênicos apresentando expressão aumentada

(overexpression) da glutationa peroxidase (GPx) (SHIOMI et al., 2004) mostraram uma

atenuação significativa de efeitos adversos do remodelamento ventricular esquerdo após

infarto agudo do miocárdio. Da mesma forma, os ratos com exacerbada expressão da catalase

mitocondrial, curiosamente apresentaram tempo de vida prolongado, com função cardíaca

melhorada (SCHRINER et al., 2005), avaliada por ecocardiograma. Observou-se uma redução

da ativação de vias de transcrição nuclear, relacionadas ao desenvolvimento e progressão da

hipertrofia cardíaca, provocada, pela senescência (DAI et al., 2009).

A literatura claramente demonstra que a sinalização tanto das ROS, quanto das

RNS, é essencial para a manutenção da homeostase dos cardiomiócitos e está centralmente

envolvida nos mecanismos de sinalização celular que constitui a base integrada das respostas

contráteis cardíacas (SANTOS et al., 2011).

Santos et al. (2011) preveem que vários aspectos fundamentais devem ser

considerados nesta homeostase, incluindo: (1) a regulação por ROS e RNS da sinalização em

compartimentos específicos do cardiomiócito, (2) mecanismos que regulam e integram a

sinalização entre os compartimentos celulares, (3) como procede a integração da geração de

ROS com agentes antioxidantes e processos metabólicos (4) determinação das funções

prejudiciais e/ou de proteção através das modificações redox/nitroso, e (5) identificação dos

principais alvos moleculares susceptíveis às modificações redox/nitroso. Desta forma, uma

melhor compreensão deste complexo sistema poderá permitir o desenvolvimento de

estratégias terapêuticas mais específicas para as diversas doenças cardiovasculares.

14

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

O propósito deste estudo foi avaliar a contribuição dos receptores para cininas na

manutenção do status redox celular no sistema cardiovascular.

3.2 Objetivos Específicos

• Avaliar a participação dos receptores para cininas em parâmetros contráteis do

coração isolado de camundongos;

• Mensurar a contribuição dos receptores para cininas na produção de espécies reativas

de oxigênio (radical ânion superóxido, peróxido de hidrogênio) e da espécie reativa de

nitrogênio (óxido nítrico);

• Verificar a participação da sinalização para cininas na expressão de enzimas

antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e proteínas

relacionadas com a homeostase do cálcio intracelular (bomba cálcio ATPase do retículo

sarcoplasmático e trocador sódio/cálcio);

• Estudar as vias implicadas nas respostas vasorrelaxantes e vasoconstritoras associadas

aos receptores para cininas;

15

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Grupos Experimentais

Foram utilizados para realização desses experimentos, camundongos da linhagem

C57BL6/J, machos, idades entre 12 a 16 semanas e pesando de 25 a 30 g. Para o

delineamento experimental os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: grupo

controle (wild type - WT) e camundongos knockouts do receptor B1 para cininas (B1-/-), e B2

(B2-/-). Os animais foram mantidos em temperatura de 22 ± 2 ºC, em ciclo claro/escuro de 12

horas e acesso ad libidum à ração e água. Os camundongos transgênicos utilizados neste

estudo foram fornecidos pelos pesquisadores Dr. Jorge Luiz Pesquero (ICB/UFMG) e Dr.

João Bosco Pesquero (UNIFESP).

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com o guia

de cuidados e usos de animais de laboratório e aprovado pelo Comitê de Ética de

Experimentação Animal da UFMG (protocolo # 078/05 e 236/09 – CETEA).

4.2 Genotipagem

A genotipagem dos camundongos knockout para os receptores de cininas foi

realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). O DNA genômico foi

extraído de um fragmento de 0,5 cm da cauda dos animais e digerido em 80 µL do tampão de

extração contendo: 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2% SDS e pH ajustado para 8,5,

enriquecido com 8 µL de enzima proteinase K (10 mg/mL), por um período de 14 horas à 55

ºC sobre agitação de 550 rpm (Orbit M60, Labnet®®, USA). Após esse período, o

homogenato foi aquecido à 95ºC (ThermoBlock IT-2002, BIOPLUS®, USA) por 10 minutos e

então adicionado 700 µL de tampão Tris-HCl 10 mM contendo EDTA 1 mM, pH ajustado

para 8,0 e enriquecido com 5 µL de RNAse A (4 mg/mL). Em seguida as amostras foram

novamente incubadas à 37ºC por 25 minutos sob agitação de 550 rpm, posteriormente

centrifugadas a 10.000xg (Neofuge 15R, Heal Force®, China) por 10 minutos. O sobrenadante

foi separado por decantação e utilizado na PCR.

Para síntese do cDNA do B1R foram utilizados os oligonucleotídeos

TGAAGCTGTGAGCTCTTTG e GCTACCCAGATGAGCAGGCA e para o B2R

TGTCCTCAGCGTGTTCTTCC e GGTCCTGAACACCAACATGG. Os produtos da PCR

(550 pb para B1R e 361 pb para B2R) foram separados em gel de poliacrilamida 5%.

Paralelamente era feito a PCR para amplificar parte do gene da neomicina, presente nos

animais selvagens. Os oligonucleotídeos para a neomicina foram os seguintes:

16

CTTGGGTGGAGAGGCTATTC e AGGTGAGATGACAGGAGATC e o produto um

amplicon de 280 pb. Após a corrida, os géis foram fixados em solução contendo: etanol 10%

e ácido acético 0,5% por 3 minutos, sob suave agitação. Em seguida, o gel foi corado em

solução de nitrato de prata 10% por 7 minutos e lavado com água destilada por 2 vezes. O gel

foi colocado em solução reveladora (3% NaOH e 0,3% formaldeído) até as bandas

aparecerem. Após o descarte da solução reveladora, o gel foi novamente transferido para a

solução fixadora para interromper a reação. Os géis foram fotodocumentados para

interpretação dos resultados.

4.3 Procedimento Cirúrgico para Retirada do Coração

Os animais receberam injeção intraperitonial de 200 U.I. de heparina diluída em

200 µL de solução salina. Após 10 minutos, os camundongos foram sacrificados por

decapitação, e em seguida, procedeu-se a toracotomia. Neste procedimento, as cartilagens

costocondrais foram abertas em ambos os lados e o esterno rebatido para cima. Uma vez

exposta a cavidade torácica, seccionava-se sucessivamente a veia cava inferior, a veia cava

superior, as artérias aorta e pulmonar, a traqueia, o esôfago bem como parte dos pulmões,

retirando-se assim o coração em bloco. Depois de retirado, o coração foi colocado em um

béquer contendo solução de Krebs-Ringer contendo (mM): 118,4 NaCl; 4,7 KCl; 26,5

NaHCO3; 1,8 CaCl2.2H2O; 11,7 glicose; 1,2 KH2PO4; 1,2 MgSO4.7H2O ajustada para pH 7,4,

oxigenada com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2; White Martins®, Brasil) e em

temperatura de aproximadamente 4ºC. Depois de transferido para uma placa de petri, os

excedentes de tecido pulmonar e vascular, da traqueia e do esôfago que acompanhavam o

coração, foram removidos.

Em seguida, a aorta ascendente foi seccionada com uma tesoura de microcirurgia

na altura de sua primeira ramificação (tronco braquiocefálico) e fixada com fio de sutura em

uma agulha de aço inoxidável modificada, acoplada a uma seringa de 1 mL contendo solução

de Krebs-Ringer (LAUTON-SANTOS, 2007; OLIVEIRA et al., 2007).

Após a fixação da aorta na agulha, este conjunto foi removido da seringa e fixado

em uma coluna de vidro já contendo a solução de Krebs-Ringer. O tempo ótimo para

realização deste procedimento era sempre igual ou inferior a 5 minutos. Caso o tempo de

preparação excedesse este tempo o coração era descartado (LAUTON-SANTOS, 2007).

17

4.4 Estudo dos Parâmetros Cardíacos

O sistema de Langendorff com fluxo constante de perfusão foi utilizado para o

estudo de parâmetros fisiológicos cardíacos do órgão isolado.

Os registros das medidas da força de contração e pressão de perfusão eram

obtidos por transdutores acoplados a uma placa conversora (A/D), conectada ao computador.

Para a transformação dos registros analógicos obtidos, em sinais digitais, e a aquisição dos

mesmos, utilizou-se o equipamento Biopac Systems, modelo M100A-CE e o software

Acqknowledge 3.5.7.22.

Para a perfusão do coração utilizou-se solução de Krebs-Ringer, oxigenada com

mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2; White Martins®, Brasil) e aquecida a 37°C por

uma jaqueta de água acoplada a um reservatório com um termostato e uma bomba peristáltica

(Watson Marlon M-501U) para manter um sistema de circulação. Manteve-se, nos

experimentos, um fluxo constante entre 2,3 e 2,6 mL por minuto.

A pressão de perfusão era captada por um transdutor de pressão (TP-200, Nihon

Khoden) previamente calibrado utilizando-se uma coluna de mercúrio, ligado através de um

fino tubo de polietileno à extremidade inferior da coluna de vidro com a solução de Krebs-

Ringer.

Para averiguação das tensões sistólica e diastólica, foi colocado no ápice do

coração, um anzol ligado a um fio que passava por um sistema de roldana e era fixado a um

transdutor de força (TSD 125C, Biopac Systems, USA), previamente calibrado por um peso

padrão de 10 gramas. Impôs-se uma tensão diastólica de 0,5 grama durante o período de

estabilização (primeiros 20 minutos). Após este período as medidas foram coletadas por mais

20 minutos sem qualquer ajuste na tensão (LAUTON-SANTOS, 2007). A frequência cardíaca

foi obtida a partir dos registros de tensão sistólica (frequência espontânea cardíaca), expressa

em batimentos por minuto (BPM). Finalizado o experimento, o coração foi rapidamente

removido do sistema e seu peso úmido foi mensurado em balança analítica (Mettler Toledo®,

Mod. XS 205) para posterior normalização de seu respectivo registro de tensão sistólica e

diastólica.

A figura 5 representa o perfil típico do registro mecânico da contração de corações

isolados de camundongos durante perfusão retrógrada em sistema de Langendorff. As análises

dos dados foram feitas usando-se os software Acqknowledge 3.5.7 e Prism 5.1. (GraphPad,

San Diego, CA, USA).

18

Figura 5. Registro típico de coração isolado de camundongo durante perfusão

retrógrada em sistema de Langendorff.

4.5 Obtenção de Células Cardíacas Isoladas

O coração foi obtido conforme o protocolo já mencionado. Para a obtenção dos

cardiomiócitos ventriculares isolados, foi utilizado o procedimento padrão para a dissociação

enzimática do tecido, como descrito por Mitra e Morad (1985). Basicamente, uma solução

extracelular contendo baixa concentração de Ca2+ e adicionada de 1 mg/mL de colagenase

tipo II (Worthington, USA), foi perfundida retrogradamente com o uso de um sistema de

Langerdorff de pressão constante por 5 à 10 minutos. Após este período, o tecido foi cortado

em pequenos fragmentos e prosseguiu-se com uma delicada agitação mecânica para facilitar o

isolamento dos cardiomiócitos. O Ca2+ extracelular foi restaurado gradativamente para 1,8

mM. As células ventriculares obtidas ficaram armazenadas em solução Tyrode contendo

(mM): 140 NaCl; 5 KCl; 0,5 MgCl2.7H2O; 1,8 CaCl2; 5 Glicose; 5 HEPES, pH 7,4.

4.6 Experimentos de Reatividade Vascular

4.6.1 Obtenção e Montagem dos Anéis de Aorta

O procedimento para montagem dos anéis de aorta foi realizado de acordo com

Capettini et al. (2011). Os animais foram sacrificados por decapitação. Após esse

procedimento, a aorta torácica foi cuidadosamente removida, retirando-se o excesso de tecido

19

adiposo e conjuntivo. Transferiu-se o material biológico para uma placa de petri com solução

nutridora de Krebs-Henseileit contendo (mM): 118 NaCl; 4,7 KCl; 25 NaHCO3; 2,5

CaCl2.2H2O; 11 glicose; 1,2 KH2PO4; 1,2 MgSO4.7H2O.

A artéria foi cortada em anéis de aproximadamente 2-3 mm e duas hastes

metálicas triangulares foram cuidadosamente passadas através do lúmen do vaso. Um dos

triângulos foi fixado à parede da cuba, e o outro foi conectado verticalmente a um transdutor

de tensão isométrica. Para obtenção do registro, esses anéis foram acondicionados em cubas

para órgão isolado com volume de 10 mL, contendo solução de Krebs-Henseileit, aerada

continuamente com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2; White Martins®, Brasil),

mantida à temperatura de 37±1ºC e pH de 7,4. Após a montagem, os anéis aórticos foram

submetidos a uma tensão de repouso de 0,5 gramas, continuamente regulada na primeira hora

do experimento durante a estabilização da preparação. Neste período, a solução nutridora foi

trocada a cada 15 minutos, objetivando-se, dessa forma, evitar o acúmulo de metabólitos,

como também a restauração dos níveis de glicose necessários ao metabolismo vascular.

Os registros experimentais foram obtidos a partir de transdutores de tensão

isométrica (World Precision Instruments, Inc., USA), conectados a um amplificador (Modelo

TBM-4; World Precision Instruments, Inc., USA), sendo este, acoplado a um computador

equipado com uma placa conversora analógico-digital (AD16JR; World Precision

Instruments, Inc. USA). O programa WinDaq Data Acquisition (Dataq® Instruments, USA)

foi utilizado para aquisição dos dados, e, análise dos registros experimentais foi realizada no

Prism 5.1. (GraphPad, San Diego, CA, USA).

4.6.2 Avaliação da Integridade Endotelial

Após o período de estabilização, os anéis foram contraídos com o agonista α1-

adrenérgico, fenilefrina (Phen; 3X10-7 M; Sigma®, USA), e, observando-se um platô no

registro de contração, a presença de endotélio funcional vascular foi verificada através da

administração do agonista muscarínico, acetilcolina (ACh; 10-5 M; Sigma®, USA). Após

atingir o relaxamento máximo, a solução nutridora de Krebs-Henseileit foi renovada (por três

vezes). O procedimento anteriormente descrito foi repetido após 30 minutos. A integridade

funcional do endotélio foi considerada apenas nos anéis onde a ACh induziu > 70% de

relaxamento após contração com Phen, e, os anéis que não apresentaram este comportamento,

foram utilizados somente para construção de curvas de contração.

20

4.6.3 Remoção do Endotélio Funcional

Quando necessário, o endotélio foi removido mecanicamente com o auxílio de

uma haste metálica friccionada de forma delicada ao lúmen vascular. A ausência de endotélio

funcional foi confirmada pela ineficácia da ACh (10-5 M) em relaxar os vasos pré-contraídos

com Phen (3X10-7 M).

4.6.4 Curva de Contração Induzida pela Fenilefrina

Para realização desses experimentos foram utilizados anéis provenientes da aorta

torácica obtidos, como anteriormente descrito. Após o período de estabilização e teste

funcional do endotélio vascular, foram construídas curvas de contração concentração-resposta

cumulativas em resposta à Phen (10-9 - 10-4 M).

4.6.5 Participação da Via das Óxido Nítrico Sintases na Resposta Vasorrelaxante

à Acetilcolina

Após o período de estabilização e teste funcional do endotélio vascular, em anéis

aórticos pré-contraídos com concentração submáxima de Phen (10-7 M), foram construídas

curvas concentração-resposta à ACh (10-9 - 10-4 M), com a finalidade de se estudar a

participação das NOS na resposta vasorrelaxante induzida pela ACh.

Após lavagens de 30 minutos com solução nutridora, estes anéis de aorta foram

pré-incubados por 20 minutos com inibidores das NOS, NG-Nitro-L-Arginine (L-NNA, 10-6

M) ou l-(2 Trifluoromethylphenyl)imidazole (TRIM, 3x10-4 M). O L-NNA na concentração

utilizada é inibidor não-seletivo das NOS. O TRIM é inibidor seletivo da nNOS nesta

concentração. Em seguida, na presença dos inibidores, curvas concentração-resposta

cumulativas a ACh foram novamente construídas nos vasos pré-contraídos com Phen. Os

resultados obtidos foram comparados com as respostas vasorrelaxantes na ausência das drogas

inibidoras acima citadas.

4.7 Mensuração dos Níveis Intracelulares das Espécies Reativas de Oxigênio

Para a detecção dos níveis intracelulares do O2•- e do H2O2, os cardiomiócitos

ventriculares isolados e anéis de aorta torácica provenientes, ambos, dos animais em estudo,

foram obtidos como previamente descrito.

As células isoladas e os anéis de aorta foram carregados com 10 µM da sonda

fluorescente sensível ao O2•-, dihidroetídio (DHE), Calbiochem®, por 30 minutos à 37ºC. Para

a detecção do H2O2 foi utilizado 0,1 µM da sonda fluorescente sensível ao mesmo, 2,7-

21

diclorodihidrofluoresceína-diacetato (H2DCFH-DA), Invitrogen™|Molecular Probes®, por 15

minutos à 37ºC. Esta última é desacetilada intracelularmente por esterases não específicas, e,

pode ser oxidada pelo H2O2 intracelular, formando o composto 2,7-diclorofluoresceína (DCF)

cuja emissão de fluorescência pode ser correlacionada aos níveis de H2O2 intracelulares.

As amostras foram incubadas com as sondas fluorescentes em um solução de

Tyrode e então lavadas no mesmo tampão para remover o excesso das mesmas. Acrescenta-se

que a sonda DCF não é específica para o H2O2 detectando também a presença do OH-.

Para medir, nas células cardíacas a fluorescência das ROS, os miócitos foram

excitados no comprimento de onda de 488 nm e a luz emitida com comprimento de onda de

515 nm foi detectada com auxílio do microscópio confocal (Zeiss 510 Meta, GmbH, Jena,

Germany) (Cemel/ICB-UFMG) com a objetiva de imersão em óleo (63×).

Para a execução destes experimentos na aorta torácica, anéis com

aproximadamente 2 mm de dimensão, previamente carregados com as sondas, acima citadas,

foram incluídos em meio crioprotetor, Tissue-Tek O.C.T. (SAKURA Finetechnical®, Japan) e

mantidas à -20ºC. Posteriormente foram realizados cortes em criostato (CM 1850, Leica®)

com espessura de 10 µm. Os cortes dos anéis foram transferidos para lâminas histológicas, e,

para aquisição das imagens fluorescentes, foi utilizado microscópio de fluorescência (IX2-

ICB, Olympus®, USA) acoplado a câmera digital (XM-10, Olympus®, USA) com excitação e

emissão em comprimentos de onda semelhante ao utilizado para detecção em células

cardíacas.

O software do ImageJ 1.38x (NIH) foi utilizado para o processamento das

imagens capturadas. A análise das imagens foi realizada no Prism 5.1. (GraphPad, San Diego,

CA, USA). As imagens de microscopias confocal e fluorescência foram analisadas de acordo

com a intensidade de fluorescência por área. Os resultados obtidos foram expressos em

unidades arbitrárias (u.a.).

4.8 Mensuração dos Níveis Intracelulares do Óxido Nítrico

Para detecção dos níveis intracelulares de NO, os cardiomiócitos isolados e anéis

de aorta torácica foram processados como acima descrito, porém, carregados com 10 µM da

sonda fluorescente sensível ao NO, 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofluoresceína

diacetato (DAF-FM), Invitrogen™|Molecular Probes®, por 30 minutos à 37ºC. As imagens

foram capturadas e as análises processadas como descrito anteriormente.

22

4.9 Extração de Proteínas do Tecido

Após o sacrifício dos animais por decapitação, os ventrículos foram rapidamente

removidos e imersos em uma solução salina tamponada com Tris-Base (TBS) contendo

(mM): 50 Tris-Base; 150 NaCl, pH 7,4 e em seguida removidos os excesso de sangue, tecido

adiposo e conjuntivo. Posteriormente, em banho de gelo, os tecidos foram homogeneizados

(Dremel 300®) na presença de tampão de lise contendo (mM): 150 NaCl; 50 Tris 50; 5

EDTA.2Na; 1 MgCl2, pH 8,0 acrescido de 100 mM Dithiothreitol, 1% Nonidet P40, 0,3% de

Triton X-100, 0,5% de SDS, cocktail de inibidores de proteases (SigmaFast®, Sigma), 100

mM PMSF e de inibidores de fosfatases, 10 mM Na4P2O7, 10 mM Na3VO4 e 100 mM NaF.

Os tecidos foram homogeneizados a uma proporção de 100 mg/mL de tampão de

lise. Após o processamento, as amostras foram centrifugadas a 15.000 rpm (Neofuge 15R,

HEAL FORCE®, China) por 15 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi aliquotado e congelado a

-80ºC para posterior utilização.

4.10 Determinação da Concentração Total de Proteínas

A concentração total de proteínas foi determinada pelo método de Lowry et al.

(1951). Resumidamente, as amostras foram diluídas 10x e adicionado NaOH 0,5 M. Após 15

de incubação, adicionou-se em cada amostra uma solução composta por 2% Na2CO3, 1%

CuSO4 e 2% KNaC4H4O6·4H2O, na proporção de 100:1:1. Ao final, foi adicionado o reagente

de folin diluído 2x. Após incubação por 30 minutos, foi realizada a leitura no comprimento de

onda de 630 nm em espectrofotômetro de placa (ELx800, BIOTEK Instruments®, USA). Para

confecção da curva de proteína padrão, utilizou-se albumina bovina (Sigma-Aldrich®) em

várias concentrações.

4.11 Determinação da Expressão Proteica por Western Blot

As amostras foram diluídas em tampão da amostra (Tris HCl/SDS pH=6,8, 3%

Glycerol, 1% SDS, 0,6% β-mercaptoetanol e 0,1% Azul de Bromofenol) e aquecidas à 98°C

por 5 minutos. Para separação, foram aplicados 60 µg de proteínas em gel de SDS-PAGE (do

inglês sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) à 7,5% ou 10%.

Após serem separadas no gel de poliacrilamida, as proteínas foram transferidas

para uma membrana de nitrocelulose (Millipore®, USA) com poros de 0,44 µm. A qualidade

da transferência foi monitorada através da coloração da membrana com solução de Ponceau

0,3%. A membrana foi então lavada em solução salina tamponada com Tris-Base acrescido

com 0,05% de Tween 20% (TBS-T) e colocada por 1 à 2 horas em solução de bloqueio (4%

23

de albumina em TBS-T). Após o bloqueio, a membrana foi incubada em temperatura de 6-

8ºC, com o anticorpo primário específico diluído em 1% de albumina em TBS-T, overnight.

Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: anti-nNOS / anti-eNOS / anti-NCX / anti-

GPx (1:1000; policlonal feito em coelho; Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, CA,

USA) e anti-pnNOS Ser852 / anti-peNOS Ser1177 / anti-peNOS Thr495 / anti-SOD-1 / anti-Catalase

/ anti-SERCA2a / anti-GAPDH (1:1000; policlonal feito em cabra; Santa Cruz Biotechnology

Inc - Santa Cruz, CA, USA).

Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBS-T durante 5 minutos e

incubada por 2 horas com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase (HRP) (1:5000,

anti-goat IgG-HRP ou anti-rabbit IgG-HRP, Sigma, St. Louis, MO) diluído em 1% de

albumina em TBS-T. Após o período de incubação, a membrana foi novamente lavada por

mais três vezes em TBS-T durante 5 minutos. As bandas proteicas foram detectadas por uma

reação de quimioluminescência (Luminata strong™ - Western HRP substrate, Merck-

Millipore, Darmstad, Germany) e a intensidade das mesmas foi avaliada por análise

densitométrica através do software ImageJ 1.38x (NIH).

Para os experimentos acima citados, foram utilizados o sistema Mini Protean III-

Tetracell e Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BIORAD®, CA, USA).

4.12 Co-imunoprecipitação

Para se avaliar a interação entre os receptores B1, B2 e nNOS, foram realizados

experimentos de co-imunoprecipitação. Para este ensaio, 100 µg dos lisados proteicos

provenientes do pool de aortas torácicas de 3 camundongos do grupo WT foram incubados

com 1 µg do anticorpo anti-nNOS ou anti-eNOS por 2 horas à 4 °C, após este período, o

complexo amostra-anticorpo foi conjugada com beads de proteína A/G-sepharose, overnight à

4 °C.

Posteriormente, as amostras foram lavadas com tampão de imunoprecipitação

contendo (mM): 25 Tris-Base, 150 NaCl, pH 7,2 e centrifugadas por 3 minutos à 8000 rpm

(Neofuge 15R, HEAL FORCE®, China). O precipitado foi ressupendido em tampão de

eluição (200mM Glicina, pH 3,0) para desligamento do complexo imunoprecipitado das

beads.

Em seguida, foi adicionado o tampão de neutralização (1 M Tris-Base, pH 9,0) e

centrifugado por 1 minuto à 6.000 rpm. O sobrenadante foi aliquotado e submetido ao

protocolo de western blot, como previamente descrito. Para detecção do complexo de

interação proteína-proteína, foram executados experimentos com anticorpos primários que

24

reconhecem os receptores B1 e B2 para cininas, anti-B1 e anti-B2 (ambos, 1:1000; policlonal

feito em coelho; Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, CA, USA).

4.13 Análises Estatísticas

Para tratamento estatístico, as análises dos resultados obtidos foram processadas

em software Prism 5.1 (GraphPad, San Diego, CA, USA).

Os dados de coração isolado, tensão sistólica e diastólica, foram representados em

g/g ± e.p.m., a frequência cardíaca em BPM ± e.p.m. e a pressão de perfusão em mmHg ±

e.p.m., sendo adotado a análise de variância ANOVA two-way para medidas paramétricas,

seguidas do pós-teste de BONFERRONI para comparação entres os grupos.

Os resultados de contração e relaxamento vascular foram representados como o

percentual de reposta aos agonistas, Phen e ACh. As curvas concentração-resposta foram

analisadas ponto-a-ponto, através da análise de variância ANOVA two-way para medidas

paramétricas, seguidas do pós-teste de BONFERRONI, para comparação entres os grupos. O

efeito final máximo (Emax) foi a concentração da droga que produziu a resposta máxima de

contração ou relaxamento.

Os resultados de expressão proteica obtidos através do western blot foram

normalizados pelo resultado da proteína normalizadora (GAPDH) de cada amostra ou eNOS e

nNOS, em alguns casos, sendo expressos em u.a., média ± e.p.m., e, adotada a análise de

variância ANOVA one-way, seguidas do pós-teste de BONFERRONI, para comparação entres

os grupos.

As imagens de microscopias confocal e fluorescência foram analisadas de acordo

com a intensidade de fluorescência por área, sendo expressas em u.a., média ± e.p.m., e,

adotada a análise de variância ANOVA one-way, seguidas do pós-teste de BONFERRONI

para comparação entres os grupos.

Para efeito estatístico, foram considerados significativos os valores que

apresentavam p<0,05.

25

5. RESULTADOS

Inicialmente, amostras do DNA dos animais knockouts para os receptores de

cininas foram coletadas, a fim de confirmarmos a deleção genética completa dos B1R e B2R.

Os resultados apresentados na figura 6 confirmaram que os animais do grupo B1-/- não

apresentam a expressão do B1R, mas expressam o B2R. Já os resultados ilustrados na figura 7,

confirmaram que os animais do grupo B2-/- não apresentavam a expressão do B2R, mas

expressavam o B1R.

Figura 6.Genotipagem de camundongos knockouts para o receptor B1 para cininas (B1-/-).

Figura 7.Genotipagem de camundongos knockouts para o receptor B2 para cininas (B2-/-).

Após a confirmação da ausência dos receptores para cininas nos animais

knockouts, propusemos avaliar os mecanismos contráteis e fisiológicos do coração isolado,

através da técnica da perfusão retrógada em sistema de Langendorff. Na figura 8 estão

26

apresentados os resultados dos registros da variação da força desenvolvida pelo coração dos

camundongos durante a sístole, denominada como tensão sistólica.

0 5 10 15 20

1

2

3

4

B2-/-

B1-/-

WT

******

Tempo (min)

Ten

são

Sis

tólic

a (g

/g)

Figura 8. Variação da tensão sistólica em coração isolado de camundongos. Os registros foram obtidos em corações de animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=5), e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-- n=6) e B2 (B2-/-- n=5). Os resultados

estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x B1-/- / WT x B2

-/- ).

As medidas de tensão sistólica revelaram que os animais knockouts para ambos os

receptores de cininas apresentam um comprometimento dos mecanismos envolvidos no

desenvolvimento da força máxima contrátil. Quando comparada a média dos registros obtidos

dos corações dos animais WT (3,04 ± 0,07 g/g), aos valores apresentados pelos animais

deficientes em receptores para cininas B1-/- (1,43 ± 0,08 g/g) e B2

-/- (1,47 ± 0,03 g/g), foi

detectado uma redução significativa (p<0,001) da tensão sistólica cardíaca durante o período

de 20 minutos. Esta diminuição, em relação aos animais selvagens, representou uma redução

de 53% em animais B1-/- e 52% em B2

-/-.

Na figura 9 são apresentados os resultados dos registros da variação da força,

desenvolvida pelo coração isolado, durante a diástole, denominado como tensão diastólica

(WT: 0,41 ± 0,01 g/g; B1-/-: 0,37 ± 0,01 g/g e B2

-/-: 0,44 ± 0,01 g/g). Já, na figura 10, são

apresentados os valores médios da frequência cardíaca espontânea do coração durante o

período de 20 minutos (WT: 326 ± 2 BPM; B1-/-: 321 ± 3 BPM e B2

-/-: 318 ± 1 BPM). Os

27

resultados encontrados em ambas as medidas, tensão diastólica e frequência cardíaca, não

diferem, de forma significativa (p>0,05) entre os grupos avaliados.

0 5 10 15 20

0.3

0.4

0.5

0.6

B2-/-

WTB1

-/-

Tempo (min)

Ten

são

Dia

stól

ica

(g/g

)

Figura 9. Variação da tensão diastólica em coração isolado de camundongos. Os registros foram obtidos em corações de animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=5), e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/- - n=6) e B2 (B2-/-- n=5). Os

resultados estão representados em média ± e.p.m.

0 5 10 15 20

250

300

350

400B2

-/-

WTB1

-/-

Tempo (min)

Fre

quên

cia

Car

díac

a (B

PM

)

Figura 10. Variação da frequência cardíaca espontânea em coração isolado de animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=4) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/- - n=5) e B2 (B2-/- - n=4). Os resultados estão representados em média ± e.p.m.

28

Outro parâmetro fisiológico analisado foi a resistência coronariana, avaliada

através da medida da pressão de perfusão. A figura 11 mostra os valores médios dos registros

da pressão de perfusão do coração, obtidos em sistema de Langendorff durante 20 minutos.

Os resultados encontrados mostraram uma elevada pressão de perfusão nos animais dos

grupos B1-/-(173 ± 2,4 mmHg) e B2

-/- (173 ± 0,6 mmHg), que apresentaram alteração

significativa (p<0,001) quando comparados com os animais do grupo WT (125 ± 1,6 mmHg),

representando, desta forma, um aumento de 38% em ambos os grupos.

0 5 10 15 20

100

120

140

160

180

200 B2-/-

B1-/-

WT

******

Tempo (min)

Pre

ssão

de

Per

fusã

o (m

mH

g)

Figura 11. Variação da pressão de perfusão em coração isolado de animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=8) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/- - n=6) e B2 (B2

-/- - n=5). Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x B1

-/- / WT x B2-/-).

Com base no fato de que a função contrátil cardíaca é controlada tanto por ROS

quanto por RNS, e, que, a sinalização das cininas, em pontos específicos, pode influenciar a

produção de tais espécies (SANTOS et al, 2011), sugerimos que a deleção genética dos

receptores para cininas possa criar perturbações no metabolismo oxidativo e,

consequentemente, alterar a geração das ROS e RNS nas células cardíacas. Portanto, para este

29

tipo de análise, foram executados experimentos com cardiomiócitos isolados dos ventrículos

dos animais em estudo. Estas células foram carregadas com sondas sensíveis às ROS (DHE e

DCFH) e às RNS (DAF). Os resultados apresentados na figura 12 mostraram que os animais

com deleção dos receptores para cininas geram, de forma significativa (p<0,001), uma maior

quantidade de O2•-, B1

-/- (483 ± 13 u.a.; 40% maior) e B2-/- (484 ± 9 u.a.; 41% maior), quando

comparados aos animais do grupo controle (343 ± 9 u.a.).

WT B1 -/- B2 -/-

0

200

400

600

n=95 n=65 n=85

*** ***

DH

E F

luor

escê

ncia

(u.a

.)

Figura 12. Produção basal do ânion superóxido em cardiomiócitos dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2

-/-). No painel superior estão apresentadas as figuras representativas (A) WT, (B) B1-/-,

(C) B2-/-. Barra de escala: 10µm. Os resultados estão representados em média ± e.p.m.

(***p<0,001, entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Os dados obtidos e mostrados na figura 13, reforçam os resultados das medidas de

O2•- apresentados na figura 12. Assim, demonstramos que os animais com deleção dos

receptores para cininas geram, de forma significativa (p<0,001), uma maior quantidade de

H2O2 (B1-/-: 482 ± 19 u.a.; 75% maior e B2

-/-: 426 ± 13 u.a.; 54% maior), quando comparados

aos animais WT (275 ± 11 u.a.).

30

WT B1 -/- B2

-/-

0

200

400

600

n=130 n=50 n=60

******

DC

F F

luor

escê

ncia

(u.a

.)

Figura 13. Produção basal de peróxido de hidrogênio em cardiomiócitos dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2

-/-). No painel superior estão apresentadas as figuras representativas (A) WT, (B) B1-/-,

(C) B2-/-. Barra de escala: 10µm. Os resultados estão representados em média ± e.p.m.


-/-).

Uma vez mensuradas as ROS, o passo seguinte foi avaliar a produção de RNS. Na

figura 14 estão apresentados os resultados das medidas da produção intracelular de NO em

cardiomiócitos isolados. Foi detectado aumento significativo (p<0,001) na produção de NO

nos animais do grupo B1-/- (568 ± 14 u.a.; 75% maior) e B2

-/- (441 ± 12 u.a.; 36% maior),

quando comparados aos animais WT (323 ± 8 u.a.). Foi ainda detectado aumento significativo

(p<0,001) na produção de NO nos animais do grupo B1-/- quando comparados com o grupo

B2-/-.

31

WT B1 -/- B2 -/-

0

200

400

600

n=115 n=80 n=80

***

***###

DA

F F

luor

escê

ncia

(u.a

.)

Figura 14. Produção basal de óxido nítrico em cardiomiócitos dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2

-/-). No painel superior estão apresentadas as figuras representativas (A) WT, (B) B1-/-, (C)

B2-/-. Barra de escala: 10µm. Os resultados estão representados em média ± e.p.m.


-/-; ###p<0,001, entre B1-/- x B2

-/-).

Atualmente, a literatura sugere que as ROS e RNS desempenham uma importante

função na regulação da contratilidade cardíaca. Portanto, para avançarmos no conhecimento

dos mecanismos moleculares afetados pela deleção dos receptores para cininas, propomos a

realização de experimentos de detecção e quantificação de enzimas envolvidas em reações

antioxidantes, através da técnica de western blot. Nas figuras 15, 16 e 17 estão mostrados os

resultados das medidas da expressão das enzimas antioxidantes Cu/Zn SOD, catalase e GPx,

respectivamente. Estas enzimas, juntas, desempenham a importante função de sequestrar e

neutralizar as ROS.

Foram detectadas reduções significativas nas expressões de todas as enzimas

antioxidantes estudadas, corroborando os resultados das medidas de ROS realizadas (Figuras

32

12 e 13). Na mensuração da expressão da enzima Cu/Zn SOD (Figura 15) detectou-se uma

significativa redução de 32% e 20%, nos corações dos animais dos grupos B1-/- e B2

-/-,

respectivamente, quando comparados aos animais WT.

Figura 15. Determinação da expressão proteica da enzima Cu/Zn Superóxido Dismutase (Cu/Zn SOD) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). Os resultados estão

representados em média ± e.p.m. (**p<0,01 entre WT x B1-/- e *p<0,05 entre WT x B2

-/-).

Na determinação da expressão da catalase (Figura 16) também foi detectado uma

significativa redução de cerca de 34% e 39% nos corações dos animais dos grupos B1-/- e B2

-/-,


33

Figura 16. Determinação da expressão proteica da enzima catalase em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (*p<0,05

entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Somando-se aos resultados anteriores, a expressão da GPx (Figura 17) apresentou

uma redução significativa, de cerca de 29% e 15% nos corações dos animais dos grupos B1-/- e

B2-/-, respectivamente, quando comparados aos WT.

34

Figura 17. Determinação da expressão proteica da enzima Glutationa Peroxidase (GPx) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). Os resultados estão representados em média

± e.p.m. (**p<0,01 entre WT x B1-/- e *p<0,05 entre WT x B2

-/-).

Para tentarmos justificar a origem do aumento na produção do NO, avaliamos a

expressão total e a atividade das enzimas NOS constitutivas, isoformas eNOS (Figuras 18, 19

e 20) e nNOS (Figuras 21 e 22). Estas enzimas são reconhecidamente expressas no tecido

cardíaco, e a atividade de ambas promovem modulações em vias de sinalização intracelular

que regulam, dentre outros processos, a contração cardíaca (KUSTER et al., 2006).

Na figura 18 está representada a medida da expressão total da eNOS, na qual foi

detectada um aumento significativo (p<0,05), cerca de 20% e 23% nos corações dos animais

dos grupos B1-/- e B2

-/-, respectivamente, quando comparados aos animais WT.

35

Figura 18. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase endotelial (eNOS) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1


representados em média ± e.p.m. (*p<0,05 entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Na figura 19 está apresentada a mensuração da expressão da eNOS fosforilada no

resíduo de serina na posição 1177 (peNOS Ser1177), classicamente conhecido como um resíduo

ativador do complexo enzimático, quando fosforilado (FÖRSTERMANN e SESSA, 2012;

ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001). Nesta medida detectamos aumento

significativo (p<0,001) da expressão desta isoforma enzimática fosforilada, ao qual está

associado com o aumento de sua atividade. O aumento da atividade encontrado foi de

aproximadamente 161% e 154% nos animais dos grupos B1-/- e B2

-/-, respectivamente, quando

comparados aos animais WT.

36

Figura 19. Avaliação dos níveis de fosforilação da enzima Óxido Nítrico Sintase endotelial (peNOS Ser1177) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). Os resultados

estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001 entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Reforçando esses resultados (Figura 19), os dados apresentados na figura 20

mostram a expressão da eNOS fosforilada no resíduo de treonina na posição 495 (peNOS Thr495), conhecido por inativar a eNOS, quando fosforilado (FÖRSTERMANN e SESSA,

2012; ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001). Detectamos uma redução significativa

(p<0,05) de aproximadamente 44% e 45% na expressão da peNOS Thr495, nos corações dos

animais dos grupos B1-/- e B2


37

Figura 20. Avaliação dos níveis de fosforilação da enzima Óxido Nítrico Sintase endotelial (peNOS Thr495) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1


estão representados em média ± e.p.m. (*p<0,05 entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Na figura 21 esta mostrada a medida da expressão total da nNOS, detectamos um

aumento significativo (p<0,05), aproximadamente 27% e 31%, nos corações dos animais dos

grupos B1-/- e B2


38

Figura 21. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase neuronal (nNOS) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1


representados em média ± e.p.m. (*p<0,05 entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Na figura 22 está representada a determinação da expressão da nNOS fosforilada

no resíduo de serina na posição 852 (pnNOS Ser852), conhecido, quando fosforilado, causar

inativação desta enzima (ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001). Nas medidas

realizadas foram detectadas reduções significativas (p<0,05) na expressão da pnNOS Ser852 nos

corações dos animais dos grupo B1-/- (25%) e B2

-/- (26%) quando comparados aos animais

WT.

39

Figura 22. Avaliação dos níveis de fosforilação da enzima Óxido Nítrico Sintase neuronal (pnNOS Ser852) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1


estão representados em média ± e.p.m. (*p<0,05 entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

Recentemente foi descrito que o trocador sódio/cálcio (NCX) e a bomba de cálcio

ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA2a) são potencialmente alvos de modificação

redox provocadas pela exposição aguda às ROS (SANTOS et al., 2011). Entretanto, pouco se

conhece sobre suas expressões durante a exposição prolongada à altos níveis de ROS e RNS.

Desta forma, realizamos medidas da expressão do NCX no coração dos animais em estudo

(Figura 23). Nesta avaliação detectamos aumento significativo na expressão do NCX nos

animais com deleção dos receptores para cininas, B1-/- (18%, p<0,05) e B2

-/- (23%, p<0,01)

quando comparados aos animais WT.

40

Figura 23. Determinação da expressão proteica do trocador sódio/cálcio (NCX) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). Os resultados estão representados em média ±

e.p.m. (* p<0,05 entre WT x B1-/- e ** p<0,01 entre WT x B2

-/-).

Na figura 24 está apresentada a medida da expressão da SERCA2a, na qual foi

encontrada uma significativa (p<0,01) redução de 42% e 46%, na expressão desta bomba de

Ca2+ nos corações dos animais com deleção dos receptores para cininas, B1-/- e B2

-/-,


41

Figura 24. Determinação da expressão proteica da Cálcio ATPase do Retículo Sarcoplasmático (SERCA2a) em tecido cardíaco dos animais dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). Os

resultados estão representados em média ± e.p.m. (**p<0,01 entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

A partir da comparação das médias dos registros de pressão de perfusão (Figura

11), e a verificação do aumento das mesmas nos corações dos animais dos grupos B1-/- e B2

-/-,

sugerimos que uma possível disfunção vascular estaria gerando o aumento da resistência

coronariana. Assim, para se avaliar os mecanismos envolvidos nesta disfunção vascular,

foram executados experimentos de reatividade vascular (Figuras 25 e 26) em anéis da aorta

torácica. Curvas concentração-resposta à ACh foram então construídas para se avaliar o

relaxamento vascular dependente de endotélio, em preparações pré-contraídas com Phen.

Os dados apresentados na figura 25 revelaram que a presença dos B1R e B2R é

essencial para a resposta vasodilatadora dependente do endotélio, por uma via independente

da ativação direta destes receptores pelas cininas. Foi detectada uma redução significativa

(p<0,001) do relaxamento vascular induzido pela ACh, em aproximadamente 50% e 56% nos

42

anéis de aorta obtidos dos animais dos grupos B1-/- (EMAX 48,4 ± 5,9%) e B2

-/- (EMAX 41,7 ±

4,9%), respectivamente, quando comparados aos animais WT (EMAX 95,3 ± 1,2%).

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100

WTB1

-/-

B2-/-

***

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 25. Efeito vasorrelaxante induzido pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=21) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/- - n=10) e B2 (B2-/- - n=13). Os resultados estão

representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

A disfunção endotelial clássica, caracterizada por redução da vasodilatação

dependente de endotélio, é comumente acompanhada por um aumento da resposta contrátil

vascular à agonistas. Para aprofundar o entendimento das origens da disfunção endotelial

apresentada nos animais com deleção de receptores para cininas, foram construídas curvas de

contração-resposta à Phen. Os resultados apresentados na figura 26 revelaram um aumento

significativo (p<0,001) na tensão desenvolvida durante a contração pela aorta dos animais dos

grupos B1-/- (EMAX 5,1 ± 0,9 mN.mm-1) e B2

-/- (EMAX 11,3 ± 0,2 mN.mm-1), representando,

desta forma, um aumento de 66% e 266% dos respectivos grupos, quando comparados ao

grupo WT (EMAX 3,0 ± 0,2 mN.mm-1).

43

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0

2

4

6

8

10

12 WTB1

-/-

B2-/-

***

log [Phen] M

Con

traç

ão (

mN

.mm

-1)

Figura 26. Efeito vasoconstritor induzido pela fenilefrina (Phen) em anéis de aorta de camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type - n=8) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/- - n=5) e B2 (B2-/- - n=4). Os resultados estão representados

em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x B1-/- e WT x B2

-/-).

É bastante consolidado o conhecimento sobre o papel das NOS sobre a função

vascular. Portanto, a fim de avançarmos no conhecimento dos mecanismos moleculares

implicados na disfunção vascular encontrada, propusemos avaliar a participação destas

enzimas no processo de relaxamento vascular destes animais em estudo.

Os resultados apresentados nas figuras 27 e 28 mostram, respectivamente, o

relaxamento vascular induzido pela ACh na presença ou ausência do inibidor não seletivo

para NOS (L-NNA) e do inibidor seletivo para nNOS (TRIM) em anéis de aortas de animais

do grupo WT. A inibição não-seletiva pelo L-NNA (Figura 27) praticamente aboliu o efeito

vasodilatador da ACh (EMAX 92,5 ± 4,4% para 10,8 ± 8,7% ), enquanto a inibição seletiva da

nNOS pelo TRIM (Figura 28) reduziu, pela metade, este efeito (EMAX 91,8 ± 4,0% para 42,7 ±

6,5%).

44

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100WT L-NNA

***

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 27. Efeito da inibição não seletiva das NOS pelo L-NNA (100 µmol.L-1) sobre a resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos do grupo selvagem (WT – Wild Type - n=5 / L-NNA - n=5). Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x L-NNA).

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100

WTTRIM

***

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 28. Efeito da inibição seletiva da nNOS sobre a resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos do grupo selvagem (WT – Wild Type - n=8 / TRIM - n=8). Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x TRIM).

45

Os experimentos de reatividade vascular conduzidos nos animais knockouts para

receptores para cininas demonstraram que a inibição não seletiva das NOS pelo L-NNA abole

a vasodilatação induzida pela ACh, tanto nos animais B1-/- (Figura 29, EMAX 51,4 ± 6,6% para

EMAX -18,0 ± 2,7%), quanto nos B2-/- (Figura 30, EMAX 51,8 ± 5,1% para EMAX -10,4 ± 4,0%).

Entretanto, em ambos os grupos, a presença do inibidor seletivo para nNOS não foi capaz de

reduzir o relaxamento induzido pela ACh, diferentemente do ocorrido nos animais WT,

sugerindo que nos animais B1-/- (Figura 31, EMAX 69,8 ± 3,7% para EMAX 58,0 ± 6,6%) e B2

-/-

(Figura 32, EMAX 56,7 ± 2,1% para EMAX 53,5 ± 1,7%) há um comprometimento da via da

nNOS.

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100

B1-/-

L-NNA

***

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 29. Efeito da inibição não seletiva das NOS pelo L-NNA (100 µmol.L-1) sobre a resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos knockout para receptor B1 para cininas (B1

-/- - n=8 / L-NNA - n=8).Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre B1

-/- x L-NNA).

46

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100

B2-/-

L-NNA

***

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 30. Efeito da inibição não seletiva das NOS pelo L-NNA (100 µmol.L-1) sobre a resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos knockout para receptor B2 para cininas (B2

-/- - n=5 / L-NNA - n=5). Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre B2

-/- x L-NNA).

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100B1

-/-

TRIM

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 31. Efeito da inibição seletiva da nNOS pelo TRIM (300 µmol.L -1) sobre a resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos knockout para receptor B1 para cininas (B1

-/- - n=5 / TRIM - n=5). Os resultados estão representados em média ± e.p.m., não apresentaram diferenças significativa (p>0,05).

47

-9 -8 -7 -6 -5 -4

-25

0

25

50

75

100

B2-/-

TRIM

log [ACh] M

Rel

axam

ento

(%

)

Figura 32. Efeito da inibição seletiva da nNOS pelo TRIM (300 µmol.L -1) sobre a resposta vasorrelaxante induzida pela acetilcolina (ACh) em anéis de aorta de camundongos knockout para receptor B2 para cininas (B2

-/- - n=5 / TRIM - n=5). Os resultados estão representados em média ± e.p.m., e não apresentaram diferença significativa (p>0,05) entre si.

Recentemente tem sido proposta a participação das ROS e RNS na regulação do

tônus vascular. Todavia, o SCC, particularmente, tem recebido pouca atenção no que tange à

sua participação no controle na produção dessas espécies reativas. Entretanto, a procura na

literatura de indícios que pudessem nortear este estudo, levantamos a hipótese do

desacoplamento das NOS em animais knockouts para os receptores para cininas.

A fim de responder esta lacuna encontrada na literatura, foram realizados

experimentos para a avaliação da produção destas espécies utilizando sondas fluorescentes

sensíveis às ROS e RNS em anéis de aorta torácica dos animais em estudo.

Na figura 33 estão apresentados os resultados das medidas da produção

intracelular de NO, onde foram detectadas reduções significativas (p<0,001), de

aproximadamente 30% e 20%, respectivamente, nas aortas dos animais dos grupos B1-/- (33 ±

0,9 u.a.) e B2-/- (38 ± 1,5 u.a.), quando comparadas às dos animais WT (47 ± 1,4 u.a.).

48

WT B1 -/- B2

-/-

0

20

40

60

***

***

n=20 n=10 n=23

DA

F F

luor

escê

ncia

(u.a

.)

Figura 33. Produção basal de óxido nítrico em anéis de aorta torácica de camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). No painel superior estão apresentadas as imagens representativas das

medidas realizadas em (A) WT, (B) B1-/-, (C) B2

-/-. Barra de escala: 20µm. Os resultados estão representados em média ± e.p.m. (***p<0,001, entre WT x B1

-/- e WT x B2-/-).

Na figura 34 estão apresentados os resultados da avaliação da produção de H2O2,

onde foram detectados aumentos significativos (p<0,001), de cerca de 30% e 52%,

respectivamente, na produção desta espécie reativa nas aortas dos animais dos grupos B1-/- (47

± 1,2 u.a.) e B2-/- (55 ± 1,5 u.a.), quando comparadas às medidas nos animais WT (36 ± 1,0

u.a.).

49

WT B1 -/- B2 -/-

0

20

40

60

***

***

n=7 n=21 n=19

DC

F F

luor

escê

ncia

(u.a

.)

Figura 34. Produção basal de peróxido de hidrogênio em anéis da aorta torácica de camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). No painel superior estão apresentadas as imagens

representativas das medidas realizadas em (A) WT, (B) B1-/-, (C) B2


-/- e WT x B2

-/-).

Na figura 35 estão apresentados os resultados da produção do O2•-, onde foram

detectados aumentos significativos (p<0,001), de aproximadamente 46% e 69%,

respectivamente, na produção desta espécie reativa nas aortas dos animais dos grupos, B1-/-

(180 ± 4,7 u.a.) e B2-/- (208 ± 4,6 u.a.), quando comparada às medidas obtidas nos animais do

grupo WT (123 ± 3,5 u.a.).

50

WT B1 -/- B2

-/-

0

50

100

150

200

250

***

***

n=17 n=11 n=17

DH

E F

luor

escê

ncia

(u.a

.)

Figura 35. Produção basal de ânion superóxido em anéis da aorta torácica de camundongos dos grupos selvagem (WT – Wild Type) e knockouts para os receptores para cininas B1 (B1

-/-) e B2 (B2-/-). No painel superior estão apresentadas imagens

representativas das medidas realizadas em (A) WT, (B) B1-/-, (C) B2


-/- e WT x B2

-/- ).

Com base nos resultados obtidos nos experimentos de reatividade vascular

(Figuras 25 a 32), propusemos que o comprometimento do relaxamento vascular, encontrado

nos animais dos grupos B1-/- e B2

-/-, seja devido ao desacoplamento catalítico da nNOS, e,

ainda, que este fenômeno esteja envolvido na produção de elevadas quantidades de ROS

tecidual identificadas nesses grupos.

A literatura aponta a importância da interação proteína-proteína na regulação do

funcionamento de receptores e enzimas (JU et al., 1998; GOLSER et al., 2000). Desta forma,

para elucidarmos a existência de interação física dos receptores para cininas com a nNOS

(Figura 36) e eNOS (Figura 37), executamos o experimento de co-imunoprecipitação de

proteínas (Figura 36 e 37). Neste ensaio, foram detectados que ambos B1R e B2R, estão

51

espontaneamente heterodimerizados formando um complexo de interação com as enzimas

nNOS e eNOS.

Figura 36. Imunoprecipitação do complexo proteína-proteína nNOS/B1 e nNOS/B2 em aorta torácica de camundongo selvagem (WT – Wild Type). As imagens são representativas de dois experimentos independentes onde foram usados pools de amostras de proteínas. No experimento foi imunoprecipitado (IP) a enzima nNOS e em seguida a identificação por western blot (WB) dos receptores B1 ou B2 para cininas.

Figura 37. Imunoprecipitação do complexo proteína-proteína eNOS/B1 e eNOS/B2 em aorta torácica de camundongo selvagem (WT – Wild Type). As imagens são representativas de dois experimentos independentes onde foram usados pools de amostras de proteínas. No experimento foi imunoprecipitado (IP) a enzima eNOS e em seguida a identificação por western blot (WB) dos receptores B1 ou B2 para cininas.

52

6. DISCUSSÃO

Os resultados apresentados nesta dissertação propõem a participação do SCC na

regulação contrátil do sistema cardiovascular através da sinalização envolvendo as ROS e

RNS. Para este estudo foram utilizados animais transgênicos para investigar a influência do

SCC (via receptores para cininas) na resposta contrátil cardíaca e função vascular.

O primeiro passo deste trabalho, foi confirmar, em animais knockouts, a

modificação genética. Desta forma, os animais foram previamente genotipados e comprovada

a deleção dos genes que expressam os B1R ou B2R para cininas nestes grupos avaliados

(Figuras 6 e 7).

Nolly et al. (1994) detectaram a expressão de mRNAs da calicreína em

cardiomiócitos atriais e ventriculares de ratos. Campbell, Kladis e Duncan (1993) e Lagneux

et al.(1998) mensuraram, no coração, a presença tecidual da BK e seus derivados peptídicos.

Estes estudos demonstraram a contínua produção de cininas no coração isolado, no entanto, a

isquemia parece ser um potente estímulo para uma maior liberação local destes peptídeos

(BAUMGARTEN et al., 1993) e consequente aumento da expressão do B1R e B2R no coração

(TSCHÖPE et al., 2000a; TSCHÖPE et al., 2000b). Em conjunto, estes resultados, associados

à dados da literatura, demonstraram a expressão, no coração, de todos os componentes do

SCC de forma fisiológica e a importância da sinalização deste sistema em situações de injúria.

Os efeitos benéficos cardíacos apresentados pelas cininas foram observados após

administração local de BK em miocárdio isquêmico de suínos (LINZ, WIEMER e

SCHOLKENS, 1996; TIO et al., 1991). Tais efeitos cardioprotetores são também

identificados através do aumento na expressão da calicreína em ratos transgênicos (SILVA et

al., 2000; PINTO et al., 2000), essas respostas, são semelhantes às obtidas com a inibição da

ECA (MARTORANA et al., 1990; ERTL et al., 1982).

Tem sido demonstrado, em estudos experimentais e clínicos, que os efeitos

cardioprotetores da inibição da ECA são mediados pela ativação dos B2R (HORNIG,

KOHLER e DREXLER, 1997; SILVESTRE et al., 2001; LIU et al., 1997). Entretanto,

diversas evidências indicam a importância da sinalização dos B1R nas ações envolvidas na

inibição desta enzima (WITHEROW et al., 2001; IGNJATOVIC et al., 2002; MARIN-

CASTANO et al., 2002).

Tschöpe et al. (2004) demonstraram que o B1R apresenta potencial cardioprotetor

e propõe, a partir de observações anteriores, que suas ações envolvem a modulação de

liberação da noradrenalina (FOUCART et al., 1997), e efeito antiarrítmico após reperfusão

53

(CHAHINE et al., 1993). Adicionalmente, a ativação do B1R também envolve o aumento na

produção das prostaglandinas, NO ˗ gerando a vasodilatação das artérias coronarianas (SU et

al., 2000) ̠ e efeitos antiproliferativos, estes últimos, suprimindo o fator de crescimento

fibroblastos e consequentemente a síntese de colágeno (KIM et al., 1999).

As funções cardioprotetoras da BK intermediada pelo B2R são classicamente

conhecidas, dentre as quais, sua ação anti-hipertrófica tem recebido bastante atenção

(EMANUELI et al., 1999). Tem sido proposto que a BK impede a hipertrofia de

cardiomiócitos isolados, através da liberação do NO associada à elevação de GMP cíclico

(cGMP) (ROSENKRANZ, DUSTING e RITCHIE, 2000).

Corroborando as observações anteriores, Rosenkranz et al. (2002) demonstraram,

em modelo de hipertrofia induzida por Ang II, que a BK (100 nmol), exerce um importante

papel anti-hipertrófico, sugerindo uma ação semelhante ao inibidor da ECA, ramiprilat (100

nmol), e ao doador de NO, nitroprussiato de sódio (3 µmol). Estes efeitos foram mediados

através da liberação de cGMP, que modula diferentes vias de sinalização intracelulares como,

a inibição da MAPK (SUHASINI et al., 1998) e endotelina-1 (GRAY et al., 1998).

Alternativamente, outros autores sugerem que a BK dispara mecanismos

adicionais independentes da sinalização por cGMP, incluindo, a ativação de receptores

purinérgicos do tipo P2 (ANNING et al., 1999), supressão do metabolismo mitocondrial

(STUMPE, DECKING e SCHRADER, 2001), disparando a produção de ROS (MASSOUDY,

BECKER e GERLACH, 1995), inibição da proliferação de células endoteliais (HELLER et

al., 1999), ativação direta de canais para Ca2+ dependente de voltagem (BOLOTINA et al.,

1994) e regulação direta da bomba Na+/K+ cardíaca (HOOL et al., 1995).

A literatura tem evidenciado a participação do SCC na função cardíaca

(LAUTON-SANTOS, et al., 2007; ROMAN-CAMPOS et al., 2010; EMANUELI et al.,

1999). A primeira parte de nossos resultados (Figura 8 – 11) não são inovadores, uma vez que

já foram previamente publicados (LAUTON-SANTOS, et al., 2007). Entretanto, estes

resultados tiveram papel essencial no acompanhamento do fenótipo dos animais descrito

naqueles estudos, os quais serviriam de base para o nosso trabalho.

Em nossos estudos, detectamos a participação do B1R e B2R para cininas na

manutenção da homeostase fisiológica do sistema cardiovascular (Figuras 8 – 11 e 25 – 32).

Esta afirmação originou-se de observações experimentais nas quais as deleções gênicas destes

receptores causaram modificações nas vias de sinalização intracelulares que repercutiram no

comprometimento da função sistólica cardíaca, com redução significativa da mesma (Figura

54

8). Apesar disto, nenhuma modificação foi detectada na tensão diastólica ou frequência

cardíaca espontânea durante seus registros em coração isolado (Figuras 9 e 10).

Nossos resultados apresentados na figura 8 reproduziu a observação da redução da

tensão sistólica verificada anteriormente (LAUTON-SANTOS, 2007) e estão de acordo com a

literatura onde foi demonstrado que cardiomiócitos de animais B1-/- apresentam uma redução

de 9% no pico do transiente de Ca2+, mas não apresentam alterações na taxa de recaptação

deste íon pela SERCA2a e, também, a corrente que flui pelo canal para cálcio do tipo-L não

estava alterada. Em nossa análise, estes resultados sugerem que as alterações funcionais

apresentadas pelo coração isolado podem ter ocorrido por modificações na atividade do RyR2

ou ainda, no conteúdo de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (LAUTON-SANTOS et al., 2007).

De forma similar, nossos resultados dos registros do coração dos animais B2-/-,

também indicaram reduções na tensão sistólica (Figura 8), estes dados são corroborados pela

literatura, na qual, Roman-Campos et al. (2010) detectaram modificações em cardiomiócitos

ventriculares de animais B2-/- apresentando redução de 61% no encurtamento celular, avaliado

em sistema desenvolvido para detecção da velocidade e amplitude de contração de células

quando estimuladas eletricamente ou farmacologicamente. Detectaram, ainda, redução na

densidade de corrente através do canal retificador para potássio e no canal para Ca2+ do tipo-L

com concomitante prejuízo, cerca de 17%, no pico do transiente de Ca2+ intracelular.

Duka et al. (2008) demonstraram evidências de que a deleção do B1R aumenta a

expressão de mRNA do B2R, sugerindo existir um mecanismo de intercomunicação e

regulação entre os receptores para cininas. Estes autores sugerem que esta seja uma resposta

compensatória, no entanto, a regulação positiva dos receptores é insuficiente para criar efeito

cardioprotetor satisfatório, enfatizando, desta forma, a importância da presença de ambos

receptores de cininas para efetivamente produzir efeito cardioprotetor.

A contribuição dos B1Rs para a manutenção da função cardíaca sobre o estado

fisiológico e fisiopatológico tem sido pouco explorada. Bouchard, Chouinard e Lamontagne

(1998) demonstraram que o pré-condicionamento isquêmico protege a função endotelial, e

que o B1R, em parte, participa deste efeito protetor. Um mecanismo molecular possivelmente

implicado neste processo envolve a regulação positiva destes receptores através da

retroalimentação produzida pelo seu agonista, o DBK. Este peptídeo, de fato, representa um

poderoso sinal para indução de sua exponencial produção durante a isquemia cardíaca

(SCHANSTRA et al., 1998). Esta sinalização rápida ocorre através da transcrição gênica

envolvendo a proteína p38MAPK (CLERK et al., 1998) e o NF-κB (CHANDRAZEKAR e

55

FREEMAN, 1997) levando a expressão de novos B1R (LARRIVÉE et al., 1998; NI, CHAO,

CHAO, 1998).

Contraditoriamente, Xu et al. (2009) demonstraram que o B1R não parece

desempenhar papel essencial na hemodinâmica e na função cardíaca, em condições normais,

ou durante o desenvolvimento de insuficiência cardíaca. No entanto, podem estar envolvidos

na manutenção da estrutura cardíaca e integridade morfológica, já que camundongos B1-/-

apresentaram aumento da massa ventricular esquerda e da dimensão desta câmara em

condições basais, porém sem prejuízos na função cardíaca (TSCHÖPE et al, 2000).

Embora a deleção genética dos componentes do SCC, calicreína tecidual e o B2R,

torne susceptível o crescimento celular exagerado, Trabold et al. (2002) demonstraram um

fenótipo cardíaco normal em fêmeas de 3 a 5 meses de idade, deficiente em B2R, sugerindo

que períodos mais longos de tempo são necessários para a mutação resultar em significativos

efeitos cardíacos. Além disso, os autores acima citados propuseram que a influência protetora

dos hormônios sexuais femininos como o estrogênio ˗ que exerce ação anti-hipertrófica direta

e ação antiapoptótica em cardiomiócitos ˗ poderia ter prevenido o remodelamento ventricular

em animais B2-/- (GROHE et al, 1997). Estas contradições observadas podem ser devido à

diferenças metodológicas usadas pelos diversos autores.

Mais evidências da participação do SCC na função fisiológica cardíaca tem sido

apontadas em estudos com animais deficientes no gene que expressa o B2R ou a calicreína

tecidual, que mostraram ativação desequilibrada do sistema renina-angiotensina (SRA)

(EMANUELI et al., 1999; MENETON et al., 2001). Essas respostas também foram descritas

por Madeddu et al. (2000) que observaram que o bloqueio do receptor de angiotensina

(AngII) AT1 impede o remodelamento cardíaco hipertrófico de animais B2-/-.

Além disso, evidências sugerem a participação de receptores envolvidos no

controle hemodinâmico e na sinalização que contribui para a geração do estresse oxidativo e,

consequentemente, a reprogramação gênica e a hipertrofia dos miócitos cardíacos (IZUMIYA

et al., 2003; HIGUCHI et al., 2003; MARKOU, HADZOPOULOU-CLADARAS e LAZOU,

2004).

Em cultura de cardiomiócitos, a Ang II é capaz de estimular a produção de ROS e

fatores de crescimento que levam ao aumento da expressão ou da atividade de vários

reguladores críticos da hipertrofia cardíaca, tais como, MAPKs e o NF-κB (WENZEL et al.,

2001). A ativação de NF-κB foi também demonstrada desempenhar um papel crítico na

produção de ROS durante a hipertrofia cardíaca (PURCELL et al., 2001; HIGUCHI et al.,

2002).

56

Baseado nas observações do comprometimento da função cardíaca e na

importância de sua regulação pelas ROS (SANTOS et al., 2011), resolvemos investigar o

status redox nos animais deficientes de receptores para cininas.

Nossos resultados de mensuração intracelular das ROS em cardiomiócitos

isolados podem ser visualizados nas figuras 12 e 13, os quais comprovaram que os animais

pertencentes aos grupos B1-/- e B2

-/- apresentam um significativo aumento na produção destas

espécies reativas. Em particular, demonstramos que a produção de O2•- (Figura 12) teve

aumento substancial em ambos os grupos, B1-/- e B2

-/-, acompanhado pela baixa expressão da

enzima Cu/Zn SOD (Figura 15), que catalisa a dismutação do O2•- em H2O2.

Apesar da alta reatividade (velocidade de reação: 109 M-1s-1) (HUIE e

PADMAJA, 1993), o O2•- desempenha uma variedade de efeitos biológicos. Estes efeitos

podem produzir prejuízos, não somente, pela alteração da sua velocidade de reação química,

mas também, através da produção de outras ROS, como o H2O2 que pode reagir com o NO

gerando um radical ainda mais reativo, o peroxinitrito (ONOO-) (CZAPSKI e GOLDSTEIN,

1995).

Em sequência, executamos experimentos para medidas de H2O2 (Figura 13), onde

encontramos o aumento significativo da produção desta espécie. Este resultado foi reforçado

pela verificação da expressão reduzida da enzima catalase (Figura 16) e GPx (Figura 19), que

decompõem a referida espécie reativa em água (H2O) e oxigênio (O2). Estes achados

reforçaram nossa hipótese da ocorrência de estresse oxidativo na ausência dos receptores para

cininas.

Oldenburg et al. (2004) demonstraram que cardiomiócitos ventriculares produzem

grandes quantidades de ROS quando estimulados com BK, sendo proposto, a participação dos

canais mitocondriais para potássio sensíveis ao ATP (mitoKATP) na produção desta resposta.

Corroborando esses resultados, Sasaki et al. (2000), demonstraram em cardiomiócitos

ventriculares de coelhos, que o doador de NO (SNAP), provoca a abertura dos canais de

mitoKATP, através da ativação do cGMP, e, consequentemente, fosforilação da PKG e geração

das ROS.

Rakhit et al. (2000), utilizando coração de ratos submetidos ao pré-

condicionamento isquêmico, identificaram que o inibidor da guanilato ciclase (ODQ),

bloqueou os efeitos cardioprotetores produzido pelo SNAP, e concluíram a dependência do

cGMP na cardioproteção produzida pelo NO. Portanto, estes dados são consistentes e

demonstram a participação das RNS em eventos cardioprotetores.

57

O SCC é classicamente conhecido por apresentar ação cardioprotetora através da

ativação de vias intracelulares que produzem o NO, demonstrando melhora da função

ventricular após isquemia cardioplégica (OLDENBURG et al., 2004). Tem sido demonstrado

que a sinalização envolvendo as cininas, é um importante mecanismo de proteção em eventos

isquêmicos e de pré-condicionamento (GOTO et al., 1995, PAN et al., 2000, WALL,

SHEEHY e HARTMAN, 1994) e, a ativação do B2R sugere ser o gatilho fisiológico desta

cardioproteção (GOTO et al., 1995, WALL, SHEEHY e HARTMAN, 1994).

A partir das evidências que revelam a participação do NO em vias de sinalização

intracelulares iniciada pelo SCC, realizamos a medida da produção intracelular de NO em

células cardíacas ventriculares (Figura 14). Foi detectado aumento significativo da

fluorescência, sendo esta medida, indicativo de que os cardiomiócitos dos animais

pertencentes aos grupos B1-/- e B2

-/- tem produção aumentada do NO. Esses achados foram

previamente descritos, e, comprovam que animais deficientes de B1R e B2R para cininas

apresentam distúrbio na síntese desta biomolécula (LAUTON-SANTOS et al. 2007 e

ROMAN-CAMPOS et al. 2010).

Para buscarmos a gênese da produção desequilibrada do NO (Figura 14),

realizamos experimentos para mensurar a expressão proteica das principais enzimas que a

sintetizam no coração, eNOS e nNOS, conhecidas por apresentarem expressão constitutiva

neste tecido (Figuras 18 e 21). Em nossos resultados, identificamos aumentos significativos

tanto na expressão total de eNOS (Figura 18), quanto na de nNOS (Figura 21) nos corações

dos animais dos grupos B1-/- e B2

-/-. Portanto, sugerimos que nossos resultados anteriores, os

quais mostraram o aumento de NO intracelular (Figura 14), podem ser explicados devido ao

aumento na expressão destas enzimas.

Lauton-Santos et al. (2007) demonstraram que animais B1-/- apresentam aumento

na expressão do mRNA de nNOS e iNOS, não sendo detectado alterações na expressão do

mRNA da eNOS. Entretanto, Duka et al. (2008) demonstraram que ambos grupos, B1-/- e B2

-/-,

apresentam aumento na expressão do gene que codifica a síntese de eNOS e, posteriormente,

Roman-Campos et al. (2010) verificou aumento na expressão proteica da eNOS, mas, com

redução da expressão da nNOS em coração de animais B2-/-. A controvérsia de alguns de

nossos resultados com dados da literatura, pode ser justificada pelas diferentes técnicas

metodológicas utilizadas nos estudos citados.

Demonstramos, ainda, que além destas enzimas estarem com expressão

aumentada, ambas, eNOS e nNOS, apresentaram aumento significativo em suas atividades

nos grupos de animais B1-/- e B2

-/ (Figura 19, 20 e 22). A atividade da eNOS foi medida

58

através da fosforilação da serina1177, onde verificamos o aumento significativo da expressão

da peNOSSer1177, sendo este, um sítio de ativação desta enzima (Figura 19) (FÖRSTERMANN

e SESSA, 2012; ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001). De forma similar,

comprovamos este resultado uma vez que demonstramos a diminuição da fosforilação no

resíduo de treonina495, peNOS Thr495, sítio de inativação da enzima (Figura 20)

(FÖRSTERMANN e SESSA, 2012; ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001).

A atividade da nNOS foi também verificada por ensaios similares (Figura 22).

Identificamos diminuição significativa na expressão da forma fosforilada desta enzima, no

resíduo serina852, pnNOSSer852, a fosforilação deste resíduo, na referida enzima, está

relacionado ao seu estado inativado (ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001).

Nosso conjunto de resultados demonstrou, de forma convincente, que o aumento

da produção do NO em cardiomiócitos com deleção de receptores para cininas (Figuras 14),

ocorre devido, não somente, ao aumento da expressão das enzimas eNOS e nNOS, como,

também, pelo aumento na atividade das mesmas (Figuras 18 - 22).

Vários autores sugerem que a produção de ROS dependente de cininas é iniciada

pela produção do NO, que irá conduzir efeitos diretos e indiretos em nível subcelular. Estes

efeitos envolvem modificações complexas na estrutura e atividade de algumas proteínas.

Dentre estas modificações, pode ser evidenciado a abertura de canais mitoKATP e

consequentemente, geração de ROS (OLDENBURG et al., 2002; LAGNEUX et al. 2003;

LOCHNER et al., 2000; VEGH, SZEKERES e PARRATT, 1991) que podem levar à ativação

de cascatas de sinalização via modificações redox.

Dentre as principais modificações redox em proteínas, os resíduos de cisteínas

representam um alvo molecular importante. Dentre as proteínas, receptores e bombas

relacionados à homeostase do cálcio que podem sofrer essas modificações, destaca-se a

SERCA2a, conhecida por ser modificada pela oxidação da cisteína ou nitração de tirosina,

entretanto, vários outros resíduos aminoácidos podem ser modificados oxidativamente

(SCHÖNEICH e SHAROV, 2006; ADACHI et al., 2004; XU et al., 2006; SHAROV et al.,

2006). Estas modificações, nesta bomba, incluem a nitração de tirosinas294 e 295 (XU et al.,

2006), S-glutationação e oxidação de cisteínas669 e 674 (ADACHI et al., 2004; SHAROV et al.,

2006). Sugere-se que os baixos níveis de ROS podem aumentar a atividade da SERCA2a,

enquanto, níveis mais elevados, podem causar inativação como resultado das irreversíveis

modificações oxidativas (SCHÖNEICH e SHAROV, 2006; SHAROV et al., 2006).

As alterações causadas pelo ambiente redox celular podem também culminar em

alteração da translocação de fatores de transcrição celular, levando, assim, a alterações na

59

expressão gênica de proteínas (SANTOS et al., 2011). Para conhecermos acerca da

participação das ROS e RNS sobre a regulação das expressões de proteínas que estão

relacionadas com a homeostase de cálcio no coração, foram realizados medidas da expressão

da SERCA2a (Figura 24) e NCX (Figura 23).

Nossos resultados, revelaram que corações de animais B1-/- e B2

-/- apresentam

reduções na expressão da SERCA2a (Figura 24), e aumento na expressão do NCX (Figura

23). Juntos, estes dados justificam, em parte, nossos resultados de contratilidade sistólica

cardíaca diminuída (Figura 8-10). Entretanto, Lauton-Santos et al. (2007) e Romam-Campos

et al. (2010) não detectaram alterações no tempo de recaptação do Ca2+ em cardiomiócitos de

animais B1-/- e B2

-/-, indicando não haver alteração na atividade da SERCA2a. Esta

discordância dos nossos resultados pode ser devido a utilização de métodos indiretos para

medida da atividade desta bomba utilizada nos trabalhos citados acima.

A literatura tem associado redução no transiente de Ca2+ em cardiomiócitos ao

estresse oxidativo provocado, dente outras ROS, pelo H2O2 (LI et al., 2006). Esta molécula

pode estar envolvida na diminuição na atividade da SERCA2a e aumento da atividade do

NCX. Em nossos resultados detectamos redução da expressão da SERCA2a (Figura 24) e

aumento na expressão do NCX (Figura 23), que juntos desempenham a função de reduzir o

conteúdo de Ca2+ no citosol (KUSTER et al., 2010).

Tocchetti et al. (2007) relataram efeito inotrópico positivo envolvendo exposição

aguda de cardiomiócitos ao nitroxil, sendo detectado, aumento na recaptação do Ca2+ para o

retículo sarcoplasmático. As modificações oxidativas irreversíveis, envolvendo exposição

prolongadas às ROS e RNS, produzem alterações na atividade da SERCA2a e NCX

contribuindo para a anormalidade no transiente de Ca2+ e déficit da função contrátil. Assim,

estes resultados reforçam nossa hipótese da participação das ROS e RNS na regulação da

homeostase do Ca2+ intracelular, visto que, como previamente descrito, em cardiomiócitos de

animais B1-/- e B2

-/- apresentam redução no pico de transiente de Ca2+ (LAUTON-SANTOS et

al., 2007 e ROMAN-CAMPOS et al., 2010).

Finalizamos a discussão dos nossos resultados obtidos em coração propondo a

participação das ROS (Figuras 12-13, 15-17) e RNS (Figuras 14 e 18-22) como biomoléculas

sinalizadoras do SCC, sendo estas moléculas, capazes de criar modificações redox e nitroso

e/ou capazes de modular a expressão de proteínas que estão relacionadas com a homeostase

de Ca2+ intracelular em cardiomiócitos ventriculares (Figuras 23 e 24) e, portanto, regulando a

função contrátil cardíaca (Figuras 8-10).

60

Durante o experimento de registro da função contrátil cardíaca no sistema de

Langendorff, foram simultaneamente adquiridos os resultados da pressão de perfusão (Figura

11), onde, foram detectados uma pressão de perfusão aumentada nos grupos B1-/- e B2

-/-, sendo

esta, uma medida do aumento da resistência coronariana. Esses resultados comprovam dados

da literatura que apontam a participação do SCC na função vascular (LOIOLA et al., 2011).

Ainda hoje é bastante controversa a vasodilatação, dependente do endotélio,

produzida pelos peptídeos derivados do SCC, na circulação coronária de ratos (McLEAN et

al., 1999), bois (DRUMMOND, 1995), porcos (PRUNEAU et al., 1996), coelhos

(PRUNEAU e BELICHARD, 1993) e humanos (DRUMMOND et al., 1995) sendo

demonstrado, que a vasodilatação não envolve a ativação das ciclo-oxigenases e geração de

prostaciclinas, mas sim, da geração endógena do NO.

Contrariamente, tem sido demonstrado em alguns estudos que a ativação de B1R

pode causar constrição em aorta de coelho (LEVESQUE et al., 1995; BAWOLAK et al.,

2008), veia mesentérica de coelho (REGOLI, MARCEAU e BARABE, 1978), veia renal de

porcos (RIZZI et al., 1997) e em veia e artéria umbilical de humanos (GOBEIL et al., 1996a;

ABBAS et al., 1998).

Foi demonstrado em anéis da aorta abdominal de camundongos da linhagem

C57JBL/6, que a ativação do B2R e B1R é capaz de produzir vasoconstrição de 51% e 30%,

respectivamente (FELIPE et al, 2007). No entanto, se propõe que a vasocontrição identificada

é geralmente independente do endotélio, e, envolve a ativação de PKC e influxo de

Ca2+(McLEAN et al., 1999). Portanto, avaliar a função vascular dos componentes do SCC

parece ser uma tarefa ainda mais complexa, que envolve critérios experimentais como a

escolha da espécie animal e/ou leito vascular estudado.

A contração no músculo liso vascular é desencadeada por uma série de estímulos

extracelulares, como a ligação de substâncias químicas, hormônios, neurotransmissores

peptídeos aos seus receptores na membrana plasmática ou através da ativação de receptores

ou canais sensíveis a distensão mecânica (BOLOTINA et al., 1994).

A Phen, é classicamente conhecida por produzir uma potente vasoconstrição,

atuando como agonista de receptores adrenérgicos α1, sendo, sua resposta contrátil,

dependente da mobilização Ca2+. Nossos resultados de reatividade vascular (Figura 26)

demonstraram a participação do SCC na resposta contrátil do músculo liso vascular.

Demonstramos que a aorta torácica quando estimulada com Phen produziu uma amplificada

vasoconstrição em animais dos grupos B1-/- e B2

-/- quando comparados com WT. Esses

61

resultados nos sugeriram que os receptores para cininas participam da mobilização de Ca2+

intracelular.

Partindo deste pressuposto, e tentando esclarecer os resultados acima observados,

executamos ensaios experimentais onde verificamos, ainda, um significativo prejuízo no

relaxamento vascular induzido pela ACh (Figura 25). Sabe-se que a ativação do receptor

muscarínico M3 produz o NO, considerado o principal fator relaxante derivado do endotélio

(FURCHGOTT e ZAWADZKI, 1980). Desta forma, a fim de avaliar a participação do NO

nestas respostas, medimos na condição basal a produção do NO em anéis de aorta torácica

(Figura 33). Detectamos uma reduzida biodisponibilidade de NO neste leito vascular

justificando, assim, o reduzido relaxamento vascular nos grupos B1-/- e B2

-/-.

O comprometimento na produção e biodisponibilidade do NO em animais

knockout para os receptores de cininas foi recentemente proposto por Loiola et al. (2011), que

também demonstraram uma reduzida resposta vasorrelaxante em artéria mesentérica,

comprovando experimentalmente a baixa biodisponibilidade do NO tecidual e sistêmico.

Entretanto, os resultados de ensaios enzimáticos da atividade das NOS constitutivas

demonstraram aumento significativo, e estes autores propuseram um funcionamento

desacoplado das NOS.

As NOS são heme proteínas com arquitetura molecular homodimérica durante seu

estado ativado. Em sua estrutura, os monômeros homólogos das NOS são constituídos por um

domínio C-terminal transportador de elétrons denominado domínio redutor, ligante à

calmodulina, e um domínio N-terminal ou oxidante, que forma o sítio catalítico para síntese

do NO (FÖRSTERMANN, 2000).

A síntese do NO ocorre através da transferência de elétrons iniciada no domínio

redutor, onde se encontram os sítios de ligação para aceptar os elétrons doados pelo NADPH,

que doa elétrons para os cofatores, flavina-adenina dinucleotídeo (FAD) e flavina

mononucleotídeo (FMN), que transferem esses elétrons para o domínio redutor. Entretanto,

entre os domínios redutor e oxidante, encontra-se o domínio de ligação à calmodulina, que,

nas isoformas eNOS e nNOS, este sítio desempenha a importante função de autoinibição

enzimática (FENG, 2012).

No domínio oxidante, os elétrons são transferidos para o átomo de ferro do

grupamento heme, permitindo a ligação do oxigênio ao sítio de ligação do cofator

tetraidrobiopterina (BH4), ao substrato, a L-arginina (FLEMING e BUSSE, 1999). A reação

catalítica das NOS constitutivas envolve dois estágios de oxidação: a hidroxilação da L-

arginina em NG-hidroxi-L-arginina, seguida da oxidação desta molécula formando L-citrulina

62

e NO (ANDREW e MAYER, 1999). Na reação de síntese do NO, a contribuição relativa dos

cofatores, como ferro heme, BH4 e L-arginina, tem recebido bastante atenção, sendo descrito

que a baixa biodisponibilidade desses componentes é capaz de provocar o desacoplamento da

atividade enzimática das NOS (VASQUEZ-VIVAR et al., 1998; CAI e HARRISON, 2000).

Durante o estado de desacoplamento, as NOS permanecem ativas e são capazes de

receber e transferir elétrons entre seus domínios redutor e oxidante. Entretanto, a ausência do

cofator BH4 e/ou do substrato L-arginina, gera a redução do grupo heme, que, gradativamente,

doa elétrons ao O2, e consequentemente, produz o O2•- (SATOH et al., 2005). A literatura tem

proposto que durante o estado de desacoplamento não ocorre diminuição da síntese do NO,

mas aumento de seu consumo em outras reações, como por exemplo, reação com O2•-, e,

consequentemente, reduzindo sua biodisponibilidade (MONCADA e HIGGS, 1993).

Sugere-se que o principal componente deste desacoplamento seja a ausência de

BH4, que está envolvido na manutenção da dimerização dos momômeros das NOS

(FÖRSTERMANN e SESSA, 2012). Além disso, sugere-se também, que o BH4 regula a

atividade do complexo Ferro(I)-O2 (presente no grupamento heme) permitindo o correto

posicionamento do grupamento para a oxidação da NG-hidroxi-L-arginina, e

consequentemente, síntese do NO (ALDERTON, COOPER e KNOWLES, 2001;

FÖRSTERMANN e SESSA, 2012).

Em condição fisiológica, as NOS constitutivas desempenham sua atividade sobre

estado acoplado, onde a isoforma eNOS é capaz de produzir somente NO e a nNOS produz

baixas concentrações de O2•-, H2O2 e NO (VASQUEZ-VIVAR et al., 1998; POU et al., 1992).

Entretanto, como previamente descrito, sobre determinadas condições patológicas ou baixa

biodisponibilidade dos substratos e/ou cofatores, a atividade de ambas, eNOS e nNOS, é

drasticamente alterada passando a atuar sob estado desacoplado, produzindo grandes

concentrações de O2•-, H2O2 e NO (VASQUEZ-VIVAR et al., 1998; POU et al., 1992).

Conhecendo a atividade das NOS constitutivas e com os indícios de que sua

atividade esteja desacoplada, sugerimos a ocorrência de disfunção endotelial. Portanto,

realizamos experimentos para mensurar a produção tecidual das ROS, H2O2 (Figura 34) e O2•-

(Figura 35), onde detectamos elevada produção dessas espécies, fortalecendo nossa proposta

que a deleção genética cria perturbações na homeostase catalítica das NOS.

Esta bem estabelecida a participação conjunta das isoformas eNOS e nNOS na

resposta vasorrelaxante induzida pela ACh. A deleção da isoforma nNOS atenua a resposta

vasodilatadora em aorta de camundongos (NANGLE, COTTER e CAMERON, 2004).

63

Confirmando esta proposta, Capettini et al. (2008) descreveram a participação do eixo

nNOS/H2O2/NO no relaxamento vascular.

A fim de avançarmos no conhecimento, propomos avaliar a contribuição relativa

das NOS constitutivas no relaxamento vascular, sendo assim, nossos resultados no grupo WT

demonstraram, através do experimento de reatividade vascular, a contribuição significativa

das NOS (Figura 27) e, particularmente, da nNOS (Figura 28), no relaxamento induzido pela

ACh.

Para fortalecermos nossa hipótese da participação dos receptores para cininas na

modulação da atividade enzimática das NOS, propomos que a deleção genética do B1R ou

B2R, resulta em distúrbio na produção do NO e geração exacerbada das ROS.

Os resultados de relaxamento vascular induzido pela ACh, na presença de

inibidores não seletivos para NOS (Figuras 29 e 30) e seletivos para nNOS (Figuras 31 e 32),

revelaram que a deleção dos receptores para cininas criam perturbações sobre a via de

sinalização da nNOS, visto que, o relaxamento não apresentou alteração na presença de seu

respectivo inibidor. Por outro lado, a inibição não seletiva das NOS foi capaz de abolir a

resposta vasorrelaxante nos grupos B1-/- e B2

-/-.

Interessantemente, nossos resultados se assemelham ao estudo de Li et al. (2004)

que após infusão crônica de Ang II foi induzido hipertensão arterial, sendo detectado,

desequilíbrio entre a geração de ROS e de moléculas antioxidantes, atribuindo a condição de

estresse oxidativo como fator determinante para uma menor sensibilidade e resposta

vasodilatadora dependente do endotélio.

É clássico o conhecimento das ações da Ang II via receptor AT1 atuando na

resposta inflamatória e alterando a permeabilidade vascular, extravasamento leucocitário e

reparo tecidual (TRACEY, 2002). Este peptídeo é reconhecido como um importante mediador

inflamatório em vários tecidos, incluindo leitos vasculares (SUZUKI et al., 2003), e

produzindo apoptose e remodelamento por fibrose (TOUYZ et al., 2003).

A Ang II participa, ainda, de processos inflamatórios através da geração de ROS e

RNS, como O2•-, OH•, H2O2, NO e o ONOO-. Entretanto, em células vasculares, a principal

fonte de geração de ROS é proveniente da enzima NADPH oxidase (nicotine adenine

dinucleotidephosphate oxidase) que permanece constitutivamente ativa na camada adventícia

e músculo liso vascular, catalisando a constante produção de O2•- (LASSEGUE et al., 2003).

Duka et al. (2001) revelaram que a infusão de Ang II aumentou a expressão de

B2R na aorta dos ratos. Entretanto, Fernandes et al. (2006) demonstraram, semelhantemente,

64

que a hipertensão renovascular provoca aumento na produção sistêmica de Ang II e

consequente aumento na expressão de mRNA do B1R.

Ceravolo et al. (2007) demonstraram também, em aorta de ratos, que a infusão de

Ang II induz o aumento da geração do O2•- e, concomitantemente, produz aumento na

atividade e translocamento nuclear do NF-κB neste leito vascular. Interessantemente, o

tratamento com apocinina, inibidor da NADPH oxidase, reduziu a geração de O2•-, a atividade

e translocamento do NF-κB, como também reduziu a expressão de B1R na aorta de ratos,

sugerindo uma relação de dependência do O2•- com a expressão deste receptor para cininas.

Estes dados revelaram a íntima comunicação e interação entre os SRA e SCC,

onde ambos, desempenham importantes funções na regulação do sistema vascular. Abdalla et

al. (2005) demonstraram, através de experimentos em cultura de células, que os B2R e AT1

estão espontaneamente heterodimerizados. As consequências desta heterodimerização

B2R/AT1 foi descrita em modelo de pré-eclampsia e em células mesenquimais de ratos

espontaneamente hipertensos (Spontaneous hypertensive rats - SHR) onde a interação entre

estes receptores é responsável pelo aumento da sensibilidade, potência e eficácia da resposta à

Ang II, entretanto, com redução da potência e eficácia à BK (ABDALLA et al., 2001;

ABDALLA et al., 2005).

A literatura aponta as interações proteína-proteína como importantes mecanismos

moleculares na sinalização intracelular desencadeada por receptores. Estas interações entre os

receptores para cininas foram recentemente demonstradas em células humanas, onde os B1R e

B2R foram identificados espontaneamente heterodimerizados quando co-expressados em

cultura de células HEK293 transfectadas, sendo detectado, através de co-imunoprecipitação e

co-localização na membrana plasmática por microscopia de imunoelétrons (KANG et al.,

2005). Os autores sugeriram que este é o mecanismo de intercomunicação entre os receptores

para cininas, onde, o estímulo prolongado do B2R, gera a heterodimerização destes receptores

aos B1R, e o conseguinte direcionamento dos B2R para vias de degradação proteolítica. Desta

forma, o B1R passa assumir funções inicialmente desempenhadas pelo B2R (KANG et al.,

2005).

É conhecida a interação física dos receptores de cininas com diversas proteínas G

(MATHIS e LEEB-LUNDBERG, 1991). A ativação do B2R em células endoteliais estimula a

produção do NO através da ativação mediante aumento da concentração de Ca2+ intracelular e

fosforilação da NOS constitutiva (BUSSE e FLEMING, 1995; VENEMA, 2002), entretanto,

este não é o único mecanismo regulador das NOS.

65

Ju et al. (1998) e Golser et al. (2000) detectaram, em células endoteliais, a

interação física do B2R/eNOS e B2R /nNOS através de resíduos de aminoácidos localizados

no 4º domínio intracelular da porção C-terminal do receptor. Experimentalmente, a

estimulação com BK causou dissociação do complexo B2R/eNOS, sugerindo que, a interação

física entre estas proteínas é de natureza inibitória.

Nossos resultados demonstraram, de forma inédita, através da técnica de co-

imunoprecipitação, que em aorta torácica de camundongos, o complexo enzimático da eNOS

e nNOS se encontram heterodimerizados com os B1R e B2R (Figuras 36 e 37). Sendo estes,

fortes indícios, e, que nos fizeram sugerir que a deleção genética dos receptores para cininas

criam perturbações na homeostase catalítica das NOS, principalmente da isoforma nNOS,

gerando seu funcionamento desacoplado, comprovado pela ineficiência do relaxamento

vascular e exacerbada produção de ROS.

66

7. CONCLUSÃO

Concluímos, ao final deste trabalho, que a deleção genética do receptor B1 ou B2

para cininas gera o aumento na produção de ROS e RNS em consequência da diminuída

expressão das enzimas antioxidantes e das que sintetizam o NO. Portanto, nossa hipótese

sugere que o status redox resultante desta ausência de sinalização pelos receptores para

cininas regulam os mecanismos que controlam a função celular do sistema cardiovascular.

Sugerimos ainda, que esta modulação da homeostase celular ocorre pela interação destes

receptores para cininas, entre si, e com as NOS.

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A participação do SCC na regulação da função cardiovascular é ainda mais

complexa que a apresentada pela literatura atual. Comprovamos a participação deste sistema

na regulação do metabolismo celular, tanto por estar envolvido em vias de sinalização

intracelular que promovem a produção de ROS e RNS, como, também regulando a expressão

de enzimas antioxidantes.

Sugerimos que as alterações cardíacas e vasculares, identificadas neste trabalho

estejam relacionadas aos seguintes fatores:

(1) dependência de ambos os receptores para cininas para a manutenção fisiológica da função

cardiovascular;

(2) a remoção do B1R ou B2R para cininas amplifica as ações do SRA e consequentemente a

atividade da Ang II;

(3) propomos que a ausência de B1R ou B2R e consequente potencialização do SRA são

fatores determinantes para o desenvolvimento do estresse oxidativo identificado em

cardiomiócitos dos grupos B1-/- e B2

-/-;

(4) com base nas evidências da literatura que apontam a participação das ROS e RNS em

modificações redox/nitroso em proteínas relacionadas com a homeostase do Ca2+ intracelular,

sugerimos que o estado de estresse oxidativo nos grupos B1-/- e B2

-/- causou o

comprometimento na função sistólica cardíaca através de oxidações e/ou nitrosilações que

repercutiram na redução da expressão da SERCA2a e aumento na expressão do NCX;

67

(5) com relação a resistência coronariana aumentada nos grupos B1-/- e B2

-/-, sugerimos que a

disfunção endotelial destas artérias seja a principal causa dessa alteração, confirmadas através

do comprometimento nos mecanismos vasodilatadores e vasoconstritores;

(6) apesar dos fortes indícios no comprometimento do eixo nNOS/NO demonstrado na

reatividade vascular, confirmamos que ambos receptores para cininas, B1 ou B2, estão

heterodimerizados com a nNOS e eNOS, portanto, a deleção dos receptores criam

perturbações na biodisponibilidade do NO intracelular e, consequentemente, alterações no

relaxamento vascular induzido pela ACh;

(7) adicionalmente, sugerimos que a deleção dos receptores modifica a atividade catalítica da

nNOS favorecendo o estado de desacoplamento, e consequentemente, uma exacerbada

produção de ROS, identificado em aorta de camundongos B1-/- e B2

-/-.

68

9. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO

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