UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS ... · Dalai-Lama Dedico e ofereço As...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

Época de colheita, Irrigação, Fitoquímica e Atividades Carrapaticida e Fungicida do Óleo Essencial de Genótipos

de Lippia gracilis Schauer

Elizangela Mércia de Oliveira Cruz

São Cristóvão/Sergipe

Março/2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

Época de colheita, Irrigação, Fitoquímica e Atividades Carrapaticida e Fungicida do Óleo Essencial de Genótipos de Lippia gracilis Schauer

Elizangela Mércia de Oliveira Cruz

Arie Fitzgerald Blank – Orientador

Tese apresentada à

Universidade Federal de Sergipe/

RENORBIO para obtenção do

título de Doutor em Biotecnologia

São Cristóvão/Sergipe

Março/2013

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

C957e

Cruz, Elizangela Mércia de Oliveira Época de colheita, irrigação, fitoquímica e atividades carrapaticida e

fungicida do óleo essencial de genótipos de Lippia gracilis Schauer / Elizangela Mércia de Oliveira Cruz ; orientador Arie Fitzgerald Blank. – São Cristóvãoão, 2013.

77 f. : il. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Rede Nordeste de

Biotecnologia – RENORBIO, Universidade Federal de Sergipe, 2013.

1. Biotecnologia. 2. Lippia gracilis. 3. Essências e óleos essenciais. 4. Fungicidas. I. Blank, Arie Fitzgerald, orient. II. Título.

CDU 606:582.929.3

“Determinação, coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o sucesso. Não importam quais sejam os obstáculos e as dificuldades. Se estamos possuídos de uma inabalável determinação, conseguiremos superá-los. Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de orgulho.”

Dalai-Lama

Dedico e ofereço

As gerações futuras, que possam encontrar respostas simples, corretas e duradouras. E que cheguem onde nunca sonharam, sempre com bom senso, sabedoria e perseverança, assim suas

vidas serão plenas e brilhantes.

Agradecimentos

Ao mistério de amor infinito de Deus, que sempre derrama bênçãos e misericórdia em minha vida.

A minha incansável família, por tudo que vocês já sabem.

A Prof. Arie Fitzgerald Blank, pela orientação, confiança, ensinamentos, pela dedicação e apoio sinceros e acima de tudo, pela amizade e exemplo de vida, de caráter, de honestidade, de luta. Aprendi e cresci muito nesses anos de convivência e trabalho ao seu lado.

Aos co-orientadores: Renata Silva Mann, Maria de Fátima Arrigoni-Blank, Leandro Bacci, Lívio Martins, Regina Marino, Péricles Alves, Dulce Warwick, por seu tempo despendido, pelos conselhos e bate-papos, enfim, por todo meu aprendizado.

Aos bolsistas de iniciação cientifica Jessika e Saymo, sem vocês não existiria esse trabalho.

Ao GPMACO, trabalho duro, muito barulho e acima de tudo amizades duradouras. Não se esqueçam de me convidar para a laje...

Às minhas colegas de doutorado: Andrea, Magna, Daniela, Juliana e Mércia obrigada pela ajuda carinho e amizade, podem sempre contar comigo.

Aos amigos que fiz durante esses anos: Monica, Miraboau, Ana Guedes e muitos outros, obrigada.

Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais/UFS, Darlisson e Hugo, obrigada pelas cromatografias e consultorias de ultima hora.

Aos amigos do Laboratório de Sanidade Animal/UFMA, obrigada pela ajuda inestimável com os carrapatos. Especialmente a Sandra, Suzana e Bruna, meninas vocês são demais.

Aos amigos da Entomologia, Fabiana, Abraão e todos os outros, nunca vou esquecer o lema: resultados sempre!!!

A Ricardo (Laboratório de Fitopatologia/Embrapa Tabuleiros Costeiros), obrigada pelo apoio e incentivo.

À FAPITEC/SE e ao CNPq, meus agradecimentos pela bolsa e pelo apoio financeiro.

Em fim a todos que de alguma forma ou em algum momento contribuíram nessa etapa de crescimento.

Muito obrigada!!!

SUMÁRIO

Página RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 2

2.1 Origem, botânica e usos de Lippia gracilis ....................................................... 3 2.2 Óleos Essenciais: composição e atividade .......................................................... 3

2.2.1 Atividade carrapaticida .............................................................................. 5 2.2.2 Atividade fungicida .................................................................................... 6 2.2.3 Resinose do coqueiro ................................................................................. 8

2.3 Complexo de inclusão com ciclodextrina .......................................................... 9 3. REFERENCIAIS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 10 4. CAPÍTULO 1: Desempenho morfoagronômico e químico no óleo essencial de

genótipos de Lippia gracilis Schauer em função da época de colheita e irrigação . 17 Resumo ................................................................................................................... 18 Abstract ................................................................................................................... 18 Introdução ............................................................................................................... 19 Material e Métodos ................................................................................................. 20 Resultados e Discussão ........................................................................................... 23 Referências Bibliográficas ...................................................................................... 29

5. CAPÍTULO 2: Atividade de óleo essencial de Lippia gracilis Schauer e seus

constituintes majoritários em Rhipicephalus (Boophilus) microplus ..................... 40 Abstract ................................................................................................................... 40 Introdução ............................................................................................................... 41 Material e Métodos ................................................................................................. 42 Resultados e Discussão ........................................................................................... 43 Conclusões .............................................................................................................. 45 Referências Bibliográficas ...................................................................................... 45

6. CAPÍTULO 3 - Atividade fungicida de óleo essencial de genótipos de Lippia

gracilis Schauer em Thielaviopis paradoxa ............................................................ 52 Abstract .................................................................................................................... 52 Introdução ................................................................................................................ 53 Materiais e Métodos ................................................................................................. 55 Resultados e Discussão ............................................................................................ 61 Conclusões ............................................................................................................... 65 Referências Bibliográficas ....................................................................................... 65

Anexos .......................................................................................................................... 76 Patente depositada ........................................................................................................ 77

Lista de Tabelas Página

Capitulo 1 Tabela 1 Genótipos de L. gracilis presentes no BAG de plantas medicinais da

UFS ........................................................................................................ 32 Tabela 2 Composição química de óleo essencial de genótipos de L. gracilis

colhidos em época chuvosa e seca ........................................................ 33 Tabela 3 Composição química de óleo essencial de genótipos de L. gracilis

sem e com irrigação ............................................................................... 34 Capitulo 2

Tabela 1 Genótipos de Lippia gracilis mantidos no BAG de plantas medicinais da UFS e utilizados no presente estudo ................................................

49

Tabela 2 Composição química dos óleos essenciais de quatro genótipos de L. gracilis ................................................................................................... 50

Tabela 3 Concentração letal para 50 e 90% das larvas e fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus com respectivo Intervalo de confiança a 95% dos genótipos de L. gracilis ......................................................................... 51

Capitulo 3

Tabela 1 Genótipos de L. gracilis presentes no BAG de plantas medicinais da UFS ........................................................................................................ 70

Tabela 2 Composição química dos óleos essenciais de sete genótipos de L. gracilis ................................................................................................... 71

Tabela 3 Caracterização do óleo essencial de Lippia gracilis e dos complexos de inclusão com -Ciclodextrina obtidos por malaxagem com água (MAH) ................................................................................................... 72

Tabela 4 Percentual de inibição de colônia (PIC) de óleo essencial dos genótipos de L. gracilis, timol e carvacrol em T. paradoxa .................. 73

Tabela 5 Contagem de unidade formadora de colônia (UFC) de óleo essencial de genótipos de L. gracilis, timol e carvacrol em T. paradoxa ............. 74

Tabela 6 Concentração mínima inibitória (CIM) e concentração fungicida mínima (CFM) de óleos essenciais de L. gracilis, seus componentes majoritários timol e carvacrol e complexo de inclusão óleo essencial – ciclodextrina em T. paradoxa, valores expressos em µL.mL-1 ....... 75

Lista de Figuras Página

Capitulo 1 Figura 1 Precipitação pluviométrica (mm) na área experimental nas épocas

chuvosa e seca..................................................................................... 35 Figura 2 Dendrograma bi-dimensional representando a similaridade da

composição química entre 7 genótipos de Lippia gracilis colhidos na época chuvosa (A) e seca (B) ......................................................... 36

Figura 3 Distribuição dos constituintes químicos do óleo essencial de Lippia

gracilis extraído nas épocas chuvosa (A) e seca (B), através da análise de componente principal (ACP) ............................................. 37

Figura 4 Dendrograma bi-dimensional representando a similaridade da

composição química entre 7 genótipos de Lippia gracilis colhidos na época chuvosa (A) e seca (B) ......................................................... 38

Figura 5 Distribuição dos constituintes químicos do óleo essencial de Lippia

gracilis extraído nas épocas chuvosa (A) e seca (B), através da análise de componente principal (ACP) ............................................. 39

RESUMO O presente trabalho teve como objetivo determinar a influencia da época de colheita e do estresse hídrico na composição química do óleo essencial e testar a atividade carrapaticida e fungicida do óleo essencial de L. gracilis. Para as análises de época de colheita o material vegetal foi colhido de sete genótipos de L. gracilis no “Campus Rural da UFS”, nas épocas chuvosa e seca. Já para o ensaio de estresse hídrico o experimento foi conduzido na época seca. A extração de óleos essenciais foi realizada no Laboratório de Fitotecnia da UFS, por meio de hidrodestilação. A análise química do óleo essencial foi realizada utilizando CG-EM, no Laboratório de Cromatografia da UFS. Para a atividade carrapaticida foram realizadas os testes de pacote de larvas e de imersão de fêmeas ingurgitadas do carrapato Rhipicephalus microplus em diversas concentrações de óleo essencial, timol ou carvacrol. Para o teste de atividade fungicida, o óleo essencial, em diferentes concentrações foi adicionado ao meio BDA. Cada placa foi inoculada com micélios da cultura monospórica de Thielaviopis paradoxa. O óleo essencial de L. gracilis apresentou dois quimiotipos distintos um com o genótipo LGRA-106 apresentando o composto timol como majoritário e os demais o carvacrol. As folhas forneceram óleos essenciais amarelados com teor médio de 1,55% na época chuvosa e 2,09% na seca. Na época chuvosa não houve diferença significativa tanto no rendimento como no teor. A composição química dos óleos essenciais de L. gracilis apresentou altos níveis de terpenos, 92% na época chuvosa e 96% na época seca. No ensaio com irrigação os valores de teor e rendimento de todos os genótipos são menores quando comparado com o ensaio sem irrigação. De maneira geral a espécie L. gracilis, quanto à presença de água no solo, apresenta estabilidade na composição química do óleo essencial independente da época do ano, uma vez que as plantas submetidas à irrigação, mesmo no verão, produziram óleo essencial em quantidade e qualidade semelhantes à época do inverno. O óleo essencial de L. gracilis apresenta alta atividade carrapaticida, comprovados pelas concentrações letais dos genótipos LGRA-201 (1,31 mg.mL-1) e LGRA-106 (4,66 mg.mL-1), demonstrando eficiência no controle desse parasita. Os ensaios demonstraram que as concentrações 0,45; 0,91 e 2,75mg.mL-1 de todos os genótipos de L. gracilis inibiram completamente o desenvolvimento do patógeno T. paradoxa, correspondendo a uma porcentagem de inibição do crescimento micelial de 100%. A concentração de 0,18mg.mL-1 de óleo essencial foi suficiente para reduzir significativamente o número de esporos de T. paradoxa. A concentração fungicida mínima de T. paradoxa foi encontrada entre as concentrações de 0,80 a 0,98mg.mL-1 para os óleos essenciais e 0,26mg.mL-1 para o carvacrol, e 0,35mg.mL-1

para o timol.

Palavras- chave: Lippia gracilis, óleo essencial, composição química, época de colheita, estresse hídrico, carrapatos, fungos filamentosos.

ABSTRACT

The aim of this study was to determine the influence of harvesting time and water stress on the chemical composition of the essential oil and to test the activities against ticks and fungus of the essential oil of L. gracilis. For the analysis of harvest season the plant material was collected from seven genotypes of L. gracilis at the Research Farm "Campus Rural da UFS", in the rainy and dry seasons. The experiment testing water stress was conducted in the dry season. The extraction of essential oils was performed in the Laboratory of Phytotechnology of the UFS through hydrodistillation. Chemical analysis of the essential oil performed using GC-MS in the Laboratory of Chromatography of the UFS. For the activity tests against ticks package larvae and immersion of engorged tick Rhipicephalus microplus in different concentrations of essential oil, thymol or carvacrol. To test of fungicidal activity, the essential oil at different concentrations was added to PDA medium. Each plate was inoculated with mycelia culture of Thielaviopis paradoxa. The essential oil of L. gracilis presented two distinct chemotypes, one genotype LGRA-106 presenting as major compound thymol and the other genotypes presenting carvacrol as major compound. The leaves provided essential oil with an average grade of 1.55% in the rainy season and 2.09% in the dry season. In the rainy season there was no significant difference in both the yield and the content. The chemical composition of essential oils L. gracilis showed high levels of terpenes, 92% in the rainy season and 96% in the dry season. In the experiment with irrigation the values of content and yield of all genotypes were smaller when compared without irrigation. In general, the species L. gracilis, for the presence of water in the soil, provides stability in the chemical composition of the essential oil regardless of season, since plants subjected to irrigation, even in the dry season, the essential oil produced in quantity and quality similar to the rainy season. The essential oil of L. gracilis exhibits high activity against ticks, proven by lethal concentrations of genotypes LGRA-201 (1.31 mg.mL-1) and LGRA-106 (4.66 mg.mL-1), demonstrating efficiency in the control of this parasite. The tests showed that the concentrations 0.45; 0.91 and 2.75 mg.mL-1 of all genotypes of L. gracilis completely inhibited the development of the pathogen T. paradoxa, corresponding to a percentage of mycelium growth inhibition of 100%. The concentration of 0.18 mg.mL-1 of essential oil was sufficient to significantly reduce the number of spores of T. paradoxa. The minimal fungicidal concentration T. paradoxa was found between concentrations from 0.80 to 0.98 mg.mL-1 for the essential oils and 0.26 mg.mL-1 for carvacrol and 0.35 mg.mL-1 to thymol. Keywords: Lippia gracilis essential oil, harvesting time, hydric stress, ticks, filamentous fungi.

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1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, a retomada dos conceitos de saúde buscando uma alimentação mais saudável aliada à preocupação correta e crescente com o ambiente, reativou a agricultura que utiliza menos agroquímicos sintéticos, com a aplicação pelos agricultores de tecnologias visando não só a maior produtividade, mas também a qualidade do produto e a preservação do ambiente (Bettiol & Ghini, 2003).

A busca por substitutos para os agroquímicos sintéticos tem produzido muitos trabalhos científicos, contemplando inclusive a utilização de extratos ou constituintes ativos provenientes de plantas. Esta procura pode ser justificada pela fácil degradação destes constituintes, menor toxicidade ao homem e, conseqüentemente, representa uma alternativa mais segura para o meio ambiente (Vasconcelos et al., 2009).

A megadiversidade brasileira, resultado das adaptações dos organismos às amplas variações nas condições edafoclimáticas do país, representa uma reserva potencial de novos fitoquímicos bioativos. Dentre as substancias, encontradas em partes vegetais, mais pesquisadas na busca de atividades biológicas, destacam-se os óleos essenciais, compostos oleosos aromáticos, de composição complexa onde as espécies da flora medicinal da caatinga apresentam-se como uma fonte promissora de novos antimicrobianos. Das quais se destacam as espécies pertencentes ao Gênero Lippia, (Verbenaceae) (Dantas et al., 2010).

Os óleos essenciais têm sido utilizados como pesticidas ou modelos para pesticidas sintéticos, como o toxafeno, as piretrinas, a nicotina e a rotenona, pois podem causar interferência tóxica nas funções bioquímicas e fisiológicas de pragas e agentes causadores de doenças. No entanto, a maioria dos constituintes dos óleos essenciais são pouco tóxicos (dentro das primeiras 72h depois da aplicação) para os mamíferos (Chagas et al., 2002).

Diante disso o uso de óleos essenciais no combate a pragas e doenças de animais e plantas é uma alternativa mais segura tanto para o ambiente como para a humanidade. Esse trabalho tem como objetivo determinar a influencia da sazonalidade e do estresse hídrico na composição química do óleo essencial e testar a atividade carrapaticida e fungicida do óleo essencial de Lippia gracilis.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

Os primeiros habitantes do planeta queimavam plantas de odor agradável para pedir proteção aos bons deuses, constituindo, as de perfume desagradável, um meio de afugentar os animais, os inimigos ou para afastar os deuses maléficos. Aos aromas, sempre foi associada à idéia de purificação. O registro mais antigo que se conhece sobre a sua utilização, foi encontrado num túmulo do Neolítico (entre 5000 e 2500 anos a.C.) no qual se encontraram vestígios de um humano envolvido em plantas aromáticas, identificadas por restos de grãos de pólen. Com o passar dos anos as plantas aromáticas passaram a fazer parte de técnicas de prevenção e de tratamento das doenças, principalmente de feridas e contusões, como mostram documentos chineses e indianos com mais de 5000 anos (Cunha, 2007). As espécies aromáticas se fazem conhecidas do homem de forma mais rápida e estão atreladas a usos tradicionais que, ao ganharem pesquisa e desenvolvimento, permitem o aumento de escala de produção e melhoria da qualidade (Magalhães, 2011).

A utilização das plantas medicinais é uma das mais antigas práticas empregadas para o tratamento das enfermidades humanas e muito já se conhece a respeito de seu uso por parte da sabedoria popular. O uso de plantas medicinais pela população mundial tem sido muito significativo nos últimos tempos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 65-80% da população mundial dos países em desenvolvimento, devido a pobreza e a falta de acesso a medicina moderna, dependem essencialmente das plantas para a saúde primária. Porém, poucas destas plantas têm sido cientificamente estudadas para avaliação com segurança de suas qualidades e eficácia (Calixto, 2005).

Desde que o homem começou a cultivar plantas para sua alimentação, deu-se início um processo de desequilíbrio no ambiente de cultivo, que de certa forma favorece o surgimento de pragas e doenças (Innecco, 2006). De uma maneira geral, as doenças causadas por fitopatógenos são provocadas principalmente por fungos, bactérias, nematóides e vírus, que além de provocarem perdas nas fases de pré e pós-colheita, depreciam a qualidade dos frutos, prejudicando a sua aparência e/ou alterando suas características físicas e químicas (Junqueira et al., 2006).

A agricultura moderna baseou-se no uso indiscriminado de agentes químicos no combate de pragas e fungos, colocando em risco o meio ambiente. Os diversos métodos de controle disponíveis, especialmente o controle químico apresentam problemas quanto à eficiência, custo e impacto negativo ao meio ambiente. No entanto, a grande preocupação com o meio ambiente tem levado inúmeros pesquisadores a buscarem alternativas viáveis, efetivas e seguras no controle de pragas e doenças que acometem culturas de plantas de interesse comercial. Assim, o uso de compostos químicos extraídos das plantas, caracteriza uma proposta alternativa a esses problemas (Lameira, 2007).

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2.1 Origem, botânica e usos de Lippia gracilis Schauer

No Brasil, dentre as plantas do semi-árido nordestino conhecidas como alecrins, estão várias espécies do gênero Lippia (Verbenaceae). A caatinga é o principal bioma da região nordeste estendendo-se pelo domínio do clima semi-árido. As plantas do gênero Lippia são espécies próprias de região, de terrenos bem drenados, sendo comum sua presença nos Estados do Piauí, Bahia, Ceará, Paraíba e Pernambuco. O gênero Lippia, cujo nome deriva de August Lippi, um botânico italiano, é composto por cerca de duzentas espécies representadas por ervas, arbustos e pequenas árvores que são frequentemente aromáticas e distribuídas na América Central e do Sul e territórios da África Central (Calvacanti, 2006).

L. gracilis, popularmente conhecido como alecrim-de-tabuleiro ou alecrim-da-chapada, é um arbusto caducifólio, ramificado, de até 2 m de altura, bem ramificada, de caule quebradiço, com folhas pequenas, aromáticas e picantes, simples, cartáceas, com nervação impressa bem visível, de pouco mais que um centímetro de comprimento. As flores são miúdas e amarelo-esbranquiçadas, reunidas em espigas de eixo curto. Os frutos do tipo aquênio extremamente pequenos, cujas sementes raramente germinam (Lorenzi e Matos, 2002).

Esta espécie é tradicionalmente utilizada no tratamento de infecções gastrointestinais, respiratórias e cutâneas. Em geral o gênero apresenta composição química constante com alguns compostos que são encontrados em varias espécies, com atividades farmacológicas antimalárica, anti-viral e citostática. Em muitos casos as partes usadas são as folhas, e flores, são comumente preparadas em infusão ou decocção e administradas oralmente ou através de emplastes ou lavagem de ferimentos (Calvacanti, 2006).

2.2 Óleos Essenciais: composição e atividade

As plantas não possuem um sistema locomotor para fugir de seus predadores e inimigos. Os inimigos naturais das plantas são: fungos, bactérias, insetos, outros herbívoros e etc. Nelas existem não apenas defesas físicas como os espinhos, mas também defesas químicas como taninos, óleos essenciais e outros. Os quais estão relacionados com a interação da planta com o ambiente, como por exemplo, a defesa contra herbívoros, insetos, bactérias e fungos (Lima et al., 2008). A produção de substâncias bioativas pelas plantas ocorre através de diferentes vias metabólicas, gerando grande número de compostos, muitos dos quais somente identificados em determinados grupos de plantas e em concentrações variáveis (Marcano et al., 2005).

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Os óleos essenciais são substancias derivadas do metabolismo secundário de plantas, e tem diversas funções, como: defesa contra predadores e atração para polinização. São considerados óleos por serem, geralmente, líquidos de aparência oleosa à temperatura ambiente; por apresentarem volatilidade, recebem ainda o nome de óleos voláteis; e são chamados essenciais devido ao aroma agradável e intenso da maioria dos seus representantes. A denominação óleos etéreos por serem solúveis em solventes orgânicos apolares (Dewick, 2003; Camargo, 2007). Os óleos essenciais são produtos instáveis a presença de luz, calor e umidade (Calvacanti, 2006). Estes constituem um dos mais importantes grupos de matérias primas para várias indústrias, notadamente as de perfumaria, alimentos e farmacêutica. Os países mais desenvolvidos importam esse óleo e lhes agregam valor através de purificação, destilação, preparação de derivados, isolamento de constituintes e modificações químicas (Craveiro & Queiroz, 1993)

A composição química do óleo essencial de L. gracilis reportada na literatura, mostra flutuações quantitativas dos componentes majoritários, provavelmente devido a condições genéticas, não padronização de cultivo e clima. Estudos demonstram variações na composição química do óleo essencial, tais como: 1,9 a 54,4% de carvacrol e 10 a 19% de p-cimeno (Matos et al., 1999; Pessoa et al., 2005).

O carvacrol cuja nomenclatura química é 2-metil-5(1-metil-etil) fenol (C4H14O), é isômero de posição do timol, possui características químicas e atividades diferentes. Possui um aroma forte e irritante. Este composto possui propriedades antimicrobianas, antiinflamatórias e antioxidantes. O timol de nomenclatura química 5-metil-2(1-etil) fenol (C4H14O), é uma substância química presente no óleo essencial de várias plantas do gênero Thymus, Occimum e Lippia, tem aroma forte e irritante. É utilizado como princípio ativo de formulações anti-sépticas, para tratamentos de infecções na boca, garganta e pele (Calvacanti, 2006).

A grande variação qualitativa e quantitativa na composição química do óleo essencial de uma mesma espécie é devida entre outras, da existência de variação genética entre plantas de diferentes populações, do estádio de desenvolvimento e da parte da planta como também da localização geográfica, características de solo, clima dentre outros fatores (Sena Filho et al., 2006; Potzernheim et al., 2006; Aguiar et al., 2008). Um exemplo do uso da variabilidade genética de óleos essenciais é o manjericão (Ocimum basilicum L.), do qual existem mais de 40 tipos descritos, a maioria comercializada nos Estados Unidos e Europa, com fins culinários, ornamentais e aromáticos. Estas variedades foram selecionadas por muitos anos, e para diferentes propósitos. A seleção de diferentes aromas em alfavacas buscando espécies de interesse para a indústria de cosméticos e higiene levou à formação de tipos químicos ricos em certos compostos, sendo denominados em função de seus altos teores de linalol, metilchavicol, eugenol, citral, entre outros (Potzernheim et al., 2006)

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2.2.1 Atividade carrapaticida

O Brasil é o maior produtor mundial de bovinos comerciais. No entanto devido as condições climáticas e deficiência no manejo de pastagens, o gado brasileiro é infestado pelo carrapato bovino (Perinotto, 2010). As perdas econômicas causadas por carrapatos em rebanhos bovinos no Brasil superam a cifra de 2 bilhões de dólares ao ano (Grisi et al., 2002).

O carrapato Rhipicephalus microplus é responsável por causar perdas na produção de leite e carne (Sutherst et al., 1983), através da perda de sangue, e da redução no ganho de peso é também um vetor para certas doenças, incluindo babesiose bovina (doença infecciosa, causadas por parasitas intraeritrocíticas do gênero Babesia) e anaplasmose (doença de ruminantes causada por intra-eritrocitário obrigatóriobactérias do género Anaplasma) (Ribeiro et al., 2010). Danos causados no couro devido às reações inflamatórias nos locais de fixação do carrapato (Seifert et al., 1968) se reflete em danos econômicos (Horn & Arteche, 1985).

O R. microplus adapta-se perfeitamente ao clima dos países tropicais, nos quais o calor e a umidade propiciam condições favoráveis à sobrevivência e manutenção da espécie, tornando-se o mais importante, ectoparasito bovino das regiões tropicais e subtropicais. O território brasileiro é potencialmente favorável à sua sobrevivência, uma vez que as características climáticas favorecem o seu desenvolvimento na maioria dos meses do ano. Essa espécie foi encontrada parasitando bovinos, caprinos e eqüinos (Costa et al, 2008).

O ciclo de vida do R. microplus divide-se em fase de vida livre e parasitaria. Na fase de vida livre ocorrem três dias para pré-postura, três a seis semanas para postura, vinte e dois a trinta dias para a eclosão das larvas e dois a três dias para o fortalecimento das cutículas para se tornarem larvas infestantes. A cada postura são colocados cerca de 2.000 a 3.000 ovos por fêmea. A fase de vida parasitaria ocorre de 18 a 26 dias. Os machos permanecem mais tempo nos animais e podem acasalar com varias fêmeas (Pereira et al., 2010).

O controle desta parasitose, basicamente, tem sido feito com produtos químicos que também acarretam malefícios ao homem, que consome os produtos de origem animal, e ao bovino (Chagas et al., 2003). Agrega-se a esses problemas a seleção de indivíduos resistentes aos produtos químicos utilizados (Furlong, 2004).

O controle do R. microplus, desde a década de 50, é feito utilizando-se acaricidas químicos de contato. O aparecimento acelerado da resistência a diversas bases químicas e os resíduos nos produtos de origem animal são problemas crescentes nos países endêmicos, sendo relatada no Brasil resistência dos carrapatos a quase todos os produtos químicos comerciais (Pereira et al., 2010).

Como os carrapaticidas sintéticos além de serem pouco eficientes também são tóxicos para os animais e humanos, vários tipos de controle alternativos são estudados: como controle biológico por fungos e bactérias, utilização de vacinas, raças resistentes

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de bovinos, uso de híbridos estéreis de carrapatos e cultivos de pastos repelentes a carrapatos (Martins & Gonzalez, 2007).

Nesse contexto, a fitoterapia pode ser ferramenta importante no controle dos ectoparasitas, possibilitando a associação com outras estratégias de controle e resultando num produto (carne e ou leite) livre de resíduos de acaricidas que possam prejudicar o homem, o animal e o ambiente (Agnolin et al., 2010).

Existem dois modos de ação para os óleos essenciais em parasitas externos: as propriedades imunomaduladoras e o efeito antiparasitíco. O primeiro caso o óleo essencial inibe mecanismos de regulação dos parasitas levando-os a morte. No segundo a inibição acontece quando o óleo essencial interfere na produção de algumas enzimas ou age como repelente (Anthony et al., 2005).

A ação acaricida dos óleos essenciais de eucalipto e citronela foi testada sobre R. microplus em estudos realizados por Chagas (2001) e Martins (2006), respectivamente. Em relação ao eucalipto, os óleos essenciais de três espécies apresentaram eficácia. O uso óleo essencial de citronela 50% não apresentou eficácia sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus.

Monoterpenos como timol, caravacrol e -terpineno foram testados em diferentes espécies da família Ixodidae, em diferentes estádios de desenvolvimento, demonstrando eficácia tanto como repelente como na mortalidade de larvas, ninfas e adultos (Mendes, et al., 2011; Cetin et al., 2010; Vale et al., 2007).

2.2.2 Atividade fungicida

Devido ao uso intensivo dos agroquímicos, os microrganismos fitopatogênicos criaram mecanismos de resistência à maioria dos produtos originados exclusivamente de cadeia química. Além da baixa eficiência e os danos causados por essas moléculas, os consumidores estão exigindo, cada vez mais, produtos sem resíduos dessas substancias (Silva, et al., 2005).

A exploração da bioatividade antimicrobiana e/ou elicitora de defesa utilizando compostos secundários presentes no extrato bruto ou óleos essenciais de plantas medicinais, constitui-se em mais uma forma potencial para controle de doenças em plantas cultivadas (Schwan-Estrada & Stangarlin, 2005).

A atividade antimicrobiana desenvolvida por óleos essenciais tem sido atribuída a pequenos terpenóides como timol, carvona, carvacrol, mentol e muroleno, que também na forma pura exibem atividade antifúngica (Conner, 1993; Smid et al., 1996; Knaak & Fiúza, 2010).

Apesar de os mecanismos de ação estarem pouco caracterizados, parecem estar associados ao caráter lipofílico dos compostos, havendo um acúmulo em membranas e perda de energia pelas células microbianas (Knaak & Fiúza, 2010), uma vez que determinados terpenos presentes nos óleos essenciais são capazes de tornarem a

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membrana celular do fungo permeável, causando o vazamento de seu conteúdo (Piper et al., 2001; Knaak & Fiúza, 2010).

Na avaliação do óleo essencial de Piper aduncum, na concentração de 0,5%, observou-se total inibição do crescimento micelial de Curvularia lunata, demonstrando que o óleo essencial de Piper aduncum L. é um potencial agente alternativo no controle do fungo estudado (Bastos & Benchimol, 2006).

Tratamentos com o óleo de nim, (Azadiracta indica Juss.) diminuem o poder germinativo do crescimento de fungos em grãos de soja (Glycine max) (Rangel et al., 2006).

Diversas plantas têm revelado atividade fungicida com várias substâncias já isoladas. Dentre estas, cita-se os trabalhos de Salgado et al. (2003), que demonstraram o efeito fungicida de óleos essenciais de três espécies de eucalipto (E. urophylla, E. citriodora e E. camaldulensis) sobre os fitopatógenos Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea e Bipolaris sorokinian. Em seus estudos observaram atividades fungitóxicas para a concentração de 500 mg L-1 das três espécies de eucalipto, porém o óleo essencial da espécie E. urophylla apresentou maior efeito inibitório no crescimento micelial das três espécies fúngicas.

Mendonça (2004), estudando o efeito dos óleos essenciais de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum), orégano (Origanum vulgare) e manjericão (O. basilicum) sobre Staphylococcus aureus, verificou efeito inibitório a partir das concentrações de 1, 5 e 10 %, respectivamente. Pereira et al. (2008), analisando os óleos essenciais de cravo-da-índia e orégano, observou atividade fungicida sobre o fungo Penicillium commune, com inibição total no crescimento a partir das concentrações de 250 mg.L-1 e 2000 mg.L-1, respectivamente

Os óleos das plantas de Origanum dictamnus (hortelã), Mentha pulegium (menta), Origanum majorana (manjerona) exibiram eficiente atividade fungicida e bactericida, utilizando concentrações de 85 mg mL-1 a 300 mg mL-1. O óleo extraído de Piper ponderosa, na concentração de 2% inibiu em 100% o crescimento micelial de três espécies de fungos fitopatogênicos do gênero Fusarium (Silva et al., 2005).

Parmar et al.. (1997) isolaram e caracterizaram quimicamente os arilpropanóides em extratos brutos e em óleos essenciais de plantas da família Piperaceae encontrando substâncias como safrol, miristicina, eugenol, dillapiol e apiol. Esses compostos apresentam propriedades antimicrobianas e antioxidantes assim como, efeitos citotóxicos e psicotrópicos. Relações entre o efeito fungicida observado no óleo essencial de Piper hispidinervum e a presença de safrol como seu componente majoritário foram observados (Zacaroni, et al., 2009).

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2.2.3 Resinose do coqueiro

A cultura do coqueiro é responsável, no Brasil, por cerca de 500 mil empregos diretos, além de milhares de empregos indiretos para pessoas envolvidas ao longo da cadeia produtiva. Somente na região Nordeste, a cocoicultura gera emprego e renda para mais de 220.000 produtores, com aproximadamente 85% representados por produtores familiares e com propriedades inferiores a 10 ha (Cuenca, 2007). Em decorrência da rápida expansão das áreas de plantio, especialmente para exploração do coco verde para o consumo da água, tem sido também observado um aumento da incidência de doenças, especialmente daquelas consideradas de importância secundária ou até mesmo desconhecidas no Brasil (Freire & Martin 2010). É o caso do sangramento do caule (stemblee-ding), conhecida desde 1906 no Sri Lanka e que teve sua patogenicidade comprovada na Índia por Nambiar et al. (1986).

A resinose do coqueiro ou “stem bleeding”, causada pelo fungo Thielaviopsis paradoxa (De Seynes) Höhn, tornou-se o principal problema na cultura do coqueiro no estado de Sergipe, devido a sua rápida disseminação e consequente queda de produção. T. paradoxa é a fase imperfeita ou assexual do patógeno, sendo responsável pela produção de dois tipos de esporos, os endoconídeos e os clamidósporos. Em sua fase sexual ou perfeita é denominado Ceratocystis paradoxa (Dade) C. Moreau, (1952) (Ascomycetes, Microascales, família Ophiostomatacea), fase esta raramente encontrada na natureza e até o momento não verificado nas condições nacionais (Costa e Carvalho, 2011).

Dentre os principais sintomas da resinose, pode-se destacar o aparecimento de um líquido marrom-avermelhado que escorre através de rachaduras no tronco, que ao secar pode adquirir uma coloração avermelhada ou enegrecida; redução na freqüência de emissão de folhas e no tamanho das mais novas; afinamento do tronco na região próximo à copa, folhas amarelo-pardacentas frágeis e sujeitas à quebra (Warwick & Passos, 2009).

Em levantamento realizado no Estado de Sergipe, foi evidenciado a presença da resinose em quase metade das propriedades na região do Platô de Neópolis, onde na grande maioria dos casos, as plantas atingidas já se encontravam em estágio avançado da doença, levando a morte da planta. A situação na região é preocupante pela forma como a doença se estabeleceu e como vem se disseminando, não existindo relatos na literatura de produtos químicos capazes de curar uma planta em estágio avançado da doença ou de conter a sua disseminação (Costa e Carvalho, 2011).

De acordo com Nambiar et al. (1986) o fungo T. paradoxa pode sobreviver por longos períodos no solo, nos restos de cultura em decomposição e pode causar infecção através de ferimentos e das fissuras naturais de crescimento do tronco, disseminando-se principalmente através de insetos vetores e do contato entre raízes. Esta doença tem como hospedeiros primários a bananeira, a cana-de-açúcar e o abacaxi (Garofalo & Macmillan, 2004).

Dentre as medidas de controle atualmente utilizadas, podem ser citadas: raspagem e pincelamento com piche ou alcatrão vegetal da região lesionada do estipe de

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plantas infectadas; erradicação e queima das plantas severamente infectadas; monitoramento e controle do Rhynchophorus palmarum, principal inseto transmissor da resinose, através do uso de armadilhas atrativas (isca vegetal atrativa + feromônio) (Costa e Carvalho, 2011).

Pesquisas desenvolvidas utilizando-se extratos brutos ou óleos essenciais obtidos de plantas medicinais têm mostrado um grande potencial no controle de fitopatógenos, tanto pela ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e a germinação de esporos, quanto pela indução de fitoalexinas, indicando a presença de compostos com características elicitoras (Stangarlin et al., 1999; Schwan-Estrada et al., 2002; Cunico et al., 2002; Salgado et al., 2003; Bonaldo et al., 2004; Bastos & Albuquerque, 2004; Schwan-Estrada & Stangarlin, 2005; Knaak & Fiúza, 2010).

2.3 Complexo de inclusão com ciclodextrina

Nas ultimas décadas vem se desenvolvendo novas formulações com o uso de inclusão de fármacos, odores e até mesmo sabores em diversas substancias, como quitosanas e ciclodextrinas entre outras, essas formulações visão a diminuição da toxidade, a proteção da substancia incluída e a liberação gradativa da substancia no meio (Venturini et al., 2008). A degradação do amido pela enzima glucosiltransferase (CGT) forma compostos cíclicos com ligações glicosídicas α-(1,4) (ciclodextrinas). As ciclodextrinas produzidas em maior quantidade são genericamente designadas por ciclodextrinas naturais (α ciclodextrina, ciclodextrina e ciclodextrina) com 6, 7 e 8 monômeros de glicopiranose respectivamente, em forma de cone truncado com cavidade no centro (Lima, 2005; Venturini et al., 2008).

A estrutura espacial cônica e a orientação dos grupos hidroxílicos para o exterior conferem a estes açúcares cíclicos propriedades físico-químicas únicas, sendo capazes de solubilizar-se em meio aquoso e ao mesmo tempo encapsular no interior da sua cavidade moléculas hidrofóbicas (Cunha Filho & Sá-Barreto, 2007).

Dentro da mesma unidade de glicopiranose de qualquer ciclodextrina, os grupos hidroxila podem estabelecer uma ligação de hidrogênio entre si. Contudo, só a ciclodextrina, possui uma cadeia homodrômica (i.e., no mesmo sentido), mesmo quando se encontra em solução aquosa. Esta cadeia homodrômica de ligações de hidrogênio contribui para conferir rigidez conformacional adicional à molécula (Lima, 2005).

Para a preparação do complexo com ciclodextrina existem vários métodos, os mais usados são os de solução aquosa: mistura física e malaxagem; os de estado sólido: atomização, liofilização, coprecipitação e fluidização supercrítica (Cunha Filho & Sá-Barreto, 2007).

O complexo de inclusão usando a -ciclodextrina consiste na substituição de parte ou todas as moléculas de água da cavidade por moléculas cujas dimensões se

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ajustem ao tamanho da mesma. A inclusão provoca um melhora nas propriedades físico-químicas das substancias, como aumento na solubilidade, proteção contra degradação oxidativa, aquecimento, volatilização e sublimação, isolamento físico de compostos incompatíveis, separações cromatográficas, modificações de sabor mascarando flavonóides, odores indesejáveis e libertação controlada de drogas ou flavonóides. Por isso, as ciclodextrinas são utilizadas na indústria alimentar, farmacêutica, na catálise, na cosmética, na proteção ambiental, em bioconversão e fermentação, na química analítica e nos têxteis (Lima, 2005; Venturini et al., 2008).

A ciclodextrina pode ser considerada um agente nanoencapsulador, uma vez que o complexo formado é equivalente ao encapsulamento molecular, já que as moléculas são isoladas uma das outras e são dispersas a nível molecular como uma matriz de oligossacarídeos (Marques, 2010).

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA

AGNOLIN, C.A.; OLIVO, C.J.; LEAL, M.L.R.; BECK, R.C.R.; MEINERZ, G.R.; PARRA, C.L.C.; MACHADO, P.R.; FOLETTO, V.; BEM, C.M.; NICOLODI, P.R.S.J. Eficácia do óleo de citronela [Cymbopogon nardus (L.) Rendle] no controle de ectoparasitas de bovinos. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.12, n.4, p.482-487, 2010.

AGUIAR, J.S.; COSTA, M.C.C.D.; NASCIMENTO, S.C.; SENA, K.X.F.R. Atividade antimicrobiana de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.18, n.3, p. 436-440, 2008.

ANTHONY, J.P., FYFE, L., SMITH, H. Plant active components – a resource for antiparasitic agents? Trends in Parasitology v.21, n.10, p.462-468, 2005

BASTOS, C.N.; ALBUQUERQUE, P.S.B.; Efeito do óleo de Piper aduncum no controle em pós-colheita de Colletotrichum musae em banana. Fitopatologia Brasileira, v. 29, n.5, p. 555-557, 2004.

BETTIOL, W.; GHINI, R. Proteção de plantas em sistemas agrícolas alternativos. In: CAMPANHOLA, C.; BETTIOL, W. (eds.) Métodos alternativos de controle fitossanitário. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2003. p.79-96.

BONALDO, S.M.; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.; STANGARLIN, J.F.; TESSMANN, D J.; SCAPIM, C.A. Fungitoxicidade, atividade elicitora de fitoalexinas e proteção de pepino contra Colletotrichum lagenarium, pelo extrato aquoso de Eucalyptus citriodora. Fitopatologia Brasileira, v.29, n.2, p.128-134, 2004.

11

CALIXTO, J.B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin América. Journal Ethnopharmacology, n.100, p. 131-134, 2005.

CALVACANTI, V.O. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracillis Shauer, Recife: UFPE, 2006 90p. (Dissertação de Mestrado em Fitopatologia).

CAMARGO, R.F. Tratamento alternativo na qualidade sanitária e fisiológica de sementes de espécies florestais. UFSM RS (Dissertação de Mestrado), 2007, 75p.

CETIN, H., CILEKB, J.E., OZA, E., AYDINC, L., DEVECID, O., YANIKOGLUA, A., Acaricidal activity of Satureja thymbra L. essential oil and its major components, carvacrol and -terpinene against adult Hyalomma marginatum (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitolology v.170, p.287–290, 2010

CHAGAS, A.C.S.; PASSOS, W.M. ; PRATES, H.T; LEITE, R.C.; FURLONG, J.; FORTES, I.C.P. Acaricide effect of Eucalyptus spp essential oils and concentrated emulsion on Boophilus microplus. Brazilian Journal Veterinary Research. Animal Science, v. 39, n. 5, p. 247-253, 2003

CHAGAS, A.C.S. Efeito acaricida de produtos naturais e sintéticos de plantas e solventes sobre Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae). Belo Horizonte: UFMG, 2001. 58f. (Tese de Doutorado em Ciência Animal).

CONNER, D.E. Naturally occuring compounds. In: P.M. DAVIDSON; A.L. BRANEM. Antimicrobials and Foods. New York: M. Dekker, 1993. p. 441-468.

COSTA e CARVALHO, R.R. Epidemiologia e controle da resinose do coqueiro e transmissibilade por meio de vetor. Lavras: UFLA, 2011 87p. (Tese de Doutorado em Fitopatologia).

COSTA, F.B.; VASCONCELOS, P.S.S.; SILVA, A.M.M.; BRANDÃO V.M.;. SILVA, I.A.; TEIXEIRA, W.C.; GUERRA, R.M.S.N.; SANTOS, A.C.G. Eficácia de fitoterápicos em fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus, provenientes da mesorregião oeste do Maranhão, Brasil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.17, Supl. 1, p. 83-86, 2008

CRAVEIRO, A.A.; QUEIROZ, D.C. Óleos essenciais e química fina. Química Nova, v.16, n.3. p. 224-228, 1993.

CUENCA, M.A.G. A cultura do coqueiro: importância econômica da cocoicultura no Brasil. Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2007. (Embrapa Tabuleiros Costeiros. Disponível em: http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Coco/ACulturadoCoqueiro/importancia.htm.

CUNICO, M.M.; CIRIO, G.M.; MIGUEL, O.G.; MIGUEL, M.D.; MONTRUCCHIO, D.P.; AUER, C.G.; GRIGOLETTI JÚNIOR, A. Contribuição ao estudo da atividade

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Coco/ACulturadoCoqueiro/importancia.htm

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Coco/ACulturadoCoqueiro/importancia.htm

12

antifúngica de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss., Celastraceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.12, n.2, p.69-73, 2002.

CUNHA, A.P. O emprego das plantas aromáticas desde as antigas civilizações até o presente. In: CUNHA, A. P.; RIBEIRO, J. A.; ROQUE, O. R.; “Plantas Aromáticas em Portugal – Caracterização e Utilizações” Ed. Fundação Calouste Gulbenkian - Lisboa (2007). Disponivel: http://antoniopcunha.com.sapo.pt

CUNHA-FILHO, M.S.S.; SÁ-BARRETO, L.C.L. Utilização de ciclodextrinas na formação de complexos de inclusão de interesse farmacêutico. Revista de Ciências Farmacêuticas Básicas e Aplicadas, v. 28, n.1, p.1-9, 2007.

DANTAS, L.I.S.; ROCHA, F.A.G.; MEDEIROS, F.G.M.; SANTOS, J.A.B. Atividade antibacteriana do óleo essencial de Lippia gracilis Schauer sobre patógenos de importância na indústria de alimentos. HOLOS, v. 5, p. 22-24, 2010

DEWICK, P.M. Medicinal Natural Products. 2 ed. London: John Wiley & Sons Ltd, 2003. 507p.

FREIRE, F.C.O.; MARTINS, M.V.V. Confirmação da ocorrência do sangramento do

caule do coqueiro no Estado do Ceará. Essentia, v. 12, nº 1, p. 31-39, 2010.

FURLONG, J. Controle estratégico do carrapato dos bovinos. A Hora Veterinária, v.23, n.137, p.53-56, 2004.

GAROFALO, J.F.; MACMILLAN, R.T. Thielasviopsis diseases of palms. Proceedings of the Florida State Horticultural Society, v.117, p. 324-325, 2004.

GRISI, L.; MASSARD, C.L.; MOYA-BORJA, G.E.; PEREIRA, J.B. Impacto das principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. A Hora Veterinária, v.21, n.125, p.8-10, 2002.

HORN, S.C.; ARTECHE C.C.P. Situação parasitária da pecuária no Brasil. A Hora Veterinária, v.23, p.12-32, 1985.

INNECCO, R. Uso de óleos essenciais como defensivo agrícola. In: 3º CONGRESSO BRASILEIRO DE DEFENSIVOS AGRÍCOLAS NATURAIS, Palestras...Embrapa: Belém, 2006. 158 p.

JUNQUEIRA, N.T.V.; JUNQUEIRA, K.P.; BRAGA, M.F.; SILVA, D.G.P. Potencial de defensivos de origem vegetal e mineral para o controle de doenças em frutíferas tropicais. In: 3º CONGRESSO BRASILEIRO DE DEFENSIVOS AGRÍCOLAS NATURAIS, Palestras...Embrapa: Belém, 2006, 158 p.

KNAAK, N.; FIUZA, L. Potencial dos óleos essenciais de plantas no controle de insetos e microrganismos. Neotropical Biology and Conservation, v.5, n.2, p.120-132, 2010.

http://antoniopcunha.com.sap/

http://antoniopcunha.com.sap/

13

LAMEIRA, C.N. Atividade do óleo-resina de copaifera reticulata ducke no crescimento micelial in vitro de fitopatógenos. Manaus: UFRA (Dissertação de Mestrado em Fitopatologia), 2007, 36p.

LIMA, R. K.; CARDOSO M. C.; MORAES, J. C.; VIEIRA, S. S.; MELO, B. A.; FILGUEIRAS, C.C. Composição dos Óleos Essenciais de Anis-estrelado Illicium verum L. e de Capim-limão Cymbopogon citratus (DC.) Stapf: Avaliação do Efeito Repelente sobre Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae). BioAssay v. 3. p.80-88, 2008,

LIMA, S.M.N. Inclusão de moléculas anfifílicas em ciclodextrina-b em soluções aquosas de electrólitos fortes. Lisboa: UA. 165p. 2005. (Tese de Doutorado em Química).

LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2002, 512 p

MAGALHÃES, P.J.C. Óleos essenciais de algumas plantas do Nordeste brasileiro e suas atividades. 4º SIMPÓSIO BRASILEIRO DE ÓLEOS ESSENCIAIS, Resumos, IAC: Campinas, 2011, 620p.

MARCANO, D.A.de; VARGAS, N.; PIRE, A. Efecto de extractos vegetales y fungicidas sintéticos sobre el crecimiento micelial in vitro de Sclerotium rolfsii y Thielaviopsis basicola . Revista Faculdade Agronômica, v. 22, p.315-323, 2005.

MARTINS, R.M. Estudo “in vitro” da ação acaricida do óleo essencial da gramínea Citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) no carrapato Boophilus microplus. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.8, n.2, p.71-78, 2006.

MARTINS, R.M.; GONZÁLEZ, F.H.D. Uso del aceite de citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) (Panicoidideae) como acaricida frente a la garrapata Boophilus microplus Canestrini (Acari:Ixodidae). Revista Brasileira de Plantas Medecinais, v.9, n.4, p.1-8, 2007.

MARQUES, H.M.C. A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles. Flavour Fragrance Journal, v.25, p.313–326, 2010.

MATOS, F.J.A; MACHADO, M.I.L; CRAVEIRO, A.A; ALENCAR, J.W.; SILVA, M.G.V. Medicinal plants of northeast Brazil containing thymol and carvacrol- Lippia sidoides Cham. and Lippia gracilis H.B.K. (Verbenaceae). Journal Essential Oil Research, v.11, p. 666-668, 1999.

MENDES, A.S., DAEMON, E., MONTEIRO, C.M.O., MATURANO, R., BRITO, F.C., MASSONI, T., Acaricidal activity of thymol on larvae and nymphs of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitology, v.183, p.136–139. 2011.

14

MENDONÇA, A.T. Efeito dos óleos essenciais de condimentos sobre o crescimento de Staphylococcus aureus em ricota cremosa. Lavras: UFLA (Tese de Doutorado em Fitotecnia), 2004, 72p.

NAMBIAR, K.K.N.; JOSHI, Y.; VENUGOPAL, M.N.; MOHAN, D.R..C. Stem bleeding disease of coconut: reproduction of symptoms by inoculation with Thielaviopsis paradoxa. Journal of Plantation Crops, v.14, n.2, p.130-133, 1986.

PARMAR, V.S.; JAIN, S.C.; BISHT, K.S; JAIN, R.; TANEJA, P.; JHA, A.; TYAGI, O.D.; PRASAD, A.K.; WENGEL J.; OLSEN, C.E.; BOLL, P.M. Phytochemistry of the genus Piper. Phytochemistry, v.46, n.4, p.597-673, 1997.

PEREIRA, C.D.; SOUZA, G.L.R.; BAFFI, M.A. Carrapatos dos bovinos: métodos de controle e mecanismos de resistência a acaricidas. Planaltina: Embrapa Cerrados, (Documentos n. 278), 2010, 28p.

PEREIRA, A.A.; CARDOSO, M.G.; ABREU, L.R.; MORAIS, A.R.; GUIMARÃES, L.G.L.; SALGADO, A.P.S.P Caracterização química e efeito inibitório de óleos essenciais sobre o crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Ciência e Agrotecnologia, v.32, n.3, p. 887-893, 2008.

PERINOTTO, W.M.S. Ação de Beauveria bassiana e Metahizium anisopliae sobre populações de Rhipicephalus (Boophilus) microplus em diferentes localidades. Rio de Janeiro: UFRRJ. (Dissertação de Mestrado em Saúde Animal), 2010, 61p.

PESSOA, O.D.L.; CARVALHO, C.B.M.; SILVESTRE, J.O.V.L.; LIMA, M.C.L.; NETO, R.M.; MATOS, F.J.A.; LEMOS, T.L.G. Antibacterial activity of the essencial oil from Lippia aff. gracillis. Fitoterapia, v.76, p.712-714, 2005.

PIPER, P.; CALDERON, C.O.; HATZIXANTHIS, K.; MOLLAPOUR, M. Weak acid adaptation: the stress response that confers resistance to organic acid food preservatives. Microbiology, v.147, n.10, p.2635-2642, 2001.

POTZERNHEIM, M.C.L.; BIZZO, H.R.; VIEIRA, R.F. Análise dos óleos essenciais de três espécies de Piper coletadas na região do Distrito Federal (Cerrado) e comparação com óleos de plantas procedentes da região de Paraty, RJ (Mata Atlântica). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, n.2, p. 246-251, 2006

RANGEL, M.A.S.; GABRIEL, M.; SMIDERLE, O.J. Avaliação de substâncias alternativas para proteção de grãos de soja contra fungos. 3º CONGRESSO BRASILEIRO DE DEFENSIVOS AGRÍCOLAS NATURAIS, Palestras...Embrapa: Belém, 2006, 158 p. RIBEIRO, V.L.S.; SANTOS, J.C.; BORDIGNON, S.A.L.; APEL, M.A.; HENRIQUES, A.T.; VON POSER, G.L. Acaricidal properties of the essential oil from Hesperozygis ringens (Lamiaceae) on the cattle tick Riphicephalus (Boophilus) microplus. Bioresource Technology v.101, p.2506–2509, 2010.

15

SALGADO, A.P.S.P.; CARDOSO, M.G.; SOUZA, P.E.; SOUZA, J.A.; ABREU, C.M.P.; PINTO, J.E.B.P. Avaliação da atividade fungitóxica de óleos essenciais de folhas de Eucalyptus sobre Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea e Bipolares sorokiniana. Ciência e Agrotecnologia, v.27, p. 249-254, 2003. SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.; STANGARLIN, J.R. Extratos e óleos essenciais de plantas medicinais na indução de resistência. In: CAVALCANTI, L.S. (Eds.). Indução de resistência em plantas a patógenos e insetos. Piracicaba: EEALQ, 2005. p.125-132

SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.; STANGARLIN, J.F.R.; CRUZ, M.E.S. uso de extratos vegetais no controle de fungos fitopatogênicos. Floresta, v.30, n.1, p.129-137, 2002.

SEIFERT, G.W.; SPRINGELL, P.H.; TATCHELL, R.J. Radioactive studies on the feeding of larvae, nymphs and adults of the cattle tick Boophilus microplus (Canestrini). Parasitology, v.58, p. 415-430, 1968.

SENA FILHO, J.G.; MELO, J.G.S.; SARAIVA, A.M.; GONÇALVES, A.M.; PSIOTTANO, A.N.C.; XAVIER, H.S. Antimicrobial activity and phytochemical profile from the roots of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, n.4, p.506-509, 2006

SILVA, I.D.; TAKATSUKA, F.S.; ROCHA, M.R.; CUNHA, M.G. Efeito do extrato de sucupira (Pterodon emarginatus VOG.) sobre o desenvolvimento de fungos e bactérias fitopatogênicos Pesquisa Agropecuária Tropical, v.35, n.2, p.109-115, 2005.

SMID, E.J.; KOEKEN, J.P.G.; GORRIS, L.G.M. Fungicidal and fungistatic action of the secondary plant metabolites cinnamaldehyde and carvone. In: LYR, H..; RUSSEL, P.E.; SISLER, H.D., (eds.), Modern Fungicides and Antimicrobial Compounds. Andover: Intercept, 1996, p. 173-180

STANGARLIN, J.R.; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F; CRUZ, M.E.S., NOZAKI, M.H. Plantas medicinais e controle alternativo de fitopatógenos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v.2, n.11, p.16- 21, 1999.

SUTHERST, R.W.; MAYWALD, G.F.; KERR, J.D.; STEGEMAN, D.A. The effect of the cattle tick (Boophilus microplus) on the growth of Bos indicus x Bos taurus steers. Aust. Journal Agricultural Research., v.34, p.317- 327, 1983.

VALE, T.L.; SANTOS, A.C.G.; SILVA, E.G.; GUERRA, R.M.S.N.C.; TEIXEIRA W.C. Avaliação do extrato botânico aquoso de Cymbopogon nardus (L.) Rendle in vitro na biologia de fêmeas de Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) em diferentes tempos de imersão. In: SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 19, Anais ... São Luís: UEMA, 2007 p.29-32.

VASCONCELOS, J. N.; LIMA, J. Q.; LEMOS, T. L. G.; OLIVEIRA, M. C. F.; ALMEIDA, M. M. B.; ANDRADE-NETO, M.; MAFEZOLI, J.; ARRIAGA, A.M.C.

16

Estudo químico e biológico de Tephrosia toxicaria Pers. Química Nova, v. 32, n. 2, p. 382-386, 2009.

VENTURINI, C.G.; NICOLINI, J.; MACHADO, C.; MACHADO, V.G. Propriedades e aplicações recentes das ciclodextrinas. Quimica Nova, v.31, n.2, p.360-368, 2008.

WARWICK, D.R.N.; PASSOS, E.E.M. Ataque de resinose do coqueiro causada por Thielavopsis paradoxa em Sergipe, Brasil. Tropical Plant Pathology, v.34, n.3, p.175-177, 2009.

ZACARONI, L.M.; CARDOSO, M.G.; SOUZA, P.E.; PIMENTEL, F.A.; GUIMARÃES, L.G.L.; SALGADO, A.P.S.P. Potencial fungitóxico do óleo essencial de Piper hispidinervum (pimenta longa) sobre os fungos fitopatogênicos Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides Acta Amazônica, v. 39, n.1, p.193 - 198, 2009.

17

CAPÍTULO 1

Desempenho morfoagronômico e químico no óleo essencial de

genótipos de Lippia gracilis Schauer em função da época de colheita e

irrigação

Elizangela Mércia de Oliveira Cruz,1 Arie Fitzgerald Blank,*,1 Jessika Andreza Oliveira

Pinto,1 Saymo Santos Fontes,1 Maria de Fatima Arrigoni-Blank,1 Renato Delmodez de

Castro,2 Hugo Cesar Ramos de Jesus,1 Darlisson Alexandria Santos1, Péricles Barreto

Alves1

1 Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N, Jardim Rosa Elze. São Cristovão/SE

CEP.: 49100-000 Fone: (79) 2105-6981

2 Universidade Federal da Bahia, Av. Reitor Miguel Calmon, S/N – Vale do Canela Salvador/BA CEP.:

40110-902

Key-words: chemical composition, essential oil, hidric stress, Lippia gracilis

Época de colheita e estresse hídrico em Lippia gracilis Schauer

* Autor para correspondência

E-mail: [email protected] Telefone: +55-79-2105-6981 Fax: +55-79-2105-6494 Artigo será submetido no periódico: Anais da Academia Brasileira de Ciências

18

ABSTRACT

The aim of this study was to analyze the chemical composition of the essential oil of

Lippia gracilis genotypes, in the dry and rainy seasons, and with and without irrigation.

The extraction of essential oil was realized by hydrodistillation in a Clevenger

apparatus. The chemical composition analysis was performed using a GC-MS/FID. The

leaves of the L. gracilis genotypes provide essential oil with content between 1.25% and

1.92% in the rainy season and 1.42% and 2.70% in the dry season, when irrigation was

used the content was between 1.42% and 2.87%, without irrigation contents between

1.60% and 3.00%. The chemical composition of L. gracilis showed high levels of

terpenes. The major constituent of genotypes LGRA-106 was thymol and carvacrol was

the major constituent for the other genotypes. Concentrations showed little variation

between seasons, demonstrating the stability of the chemical composition of L. gracilis

even with different climatic conditions.

Key-word: chemical composition, essential oil, hidric stress, Lippia gracilis

19

INTRODUÇÃO

O gênero Lippia contém cerca de 200 espécies de plantas aromáticas, que podem

ser herbáceas, subarbustivas e até árvores de pequeno porte. A maioria das espécies são

nativas da América e África, desenvolve-se em solos arenosos nas margens de rios e

lagos, em regiões de clima tropical e subtropical (Atti-Serafini, 2002). No Brasil, o

gênero é representado por 120 espécies caracterizadas por sua fragrância forte e

agradável (Mendes et al. 2010).

Algumas espécies do gênero Lippia são caracterizadas pela presença de óleos

essenciais, com atividade antimicrobiana, devido à presença de monoterpenos fenólicos

timol e carvacrol. Entre essas espécies, Lippia gracilis Schauer (Verbenaceae), nativa

do Nordeste brasileiro, tem-se destacado por apresentar altos teores destes

monoterpenos (Albuquerque et al. 2006).

L. gracilis, popularmente conhecida como alecrim-de-tabuleiro ou alecrim-da-

chapada, é um arbusto caducifólio, ramificado, de até 2 m de altura, própria da

vegetação do semi-árido nordestino de terrenos bem drenados, sendo comum nos

Estados da Bahia, Sergipe e Piauí (Lorenzi e Matos, 2002). As folhas aromáticas,

juntamente com as flores, constituem a parte medicinal da planta, de onde é extraído

óleo essencial (Marcelino-Jr et al. 2005, Pessoa et al. 2005). Os componentes

majoritários encontrados na L. gracilis são muito variados como carvacrol, p-cimeno, -

terpineno, -cariofileno, timol entre outros (Mendes et al. 2010).

A composição química de metabolitos secundários está relacionada a três fatores:

genética, ambiente e técnicas de cultivo. Dentro dos parâmetros climáticos, temperatura

atmosférica e precipitação pluviométrica têm sido apontadas como fatores que

20

influenciam a composição e conteúdo de óleo essencial em plantas aromáticas (Botrel et

al., 2010).

A composição do óleo essencial de uma planta é determinada geneticamente,

sendo geralmente específica para um determinado órgão e característica para o seu

estádio de desenvolvimento (Simões et al. 2002), mas as condições ambientais são

capazes de causar variações significativas, dando origem aos quimiotipos ou raças

químicas tão freqüentes em plantas ricas em óleos essenciais (Nogueira et al., 2007) .

Isto significa que as diferenças na composição dos diferentes quimiotipos não

constituem um produto só da influência de fatores ambientais, mas refletem também da

variação genotípica destas plantas (Tavares et al. 2005).

Assim, observa-se que há uma diferenciação muito grande no rendimento e na

composição química do óleo essencial das espécies nos diferentes ambientes,

ocasionado por diferenças na eficiência produtiva de princípios ativos. Ainda, deve-se

ressaltar que a época em que se obtém maior produção de óleo essencial, pode não ser a

época de maior produção do composto químico de interesse contido neste (Brant et al.

2008).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da época de colheita e da

disponibilidade de água para a planta na composição química dos óleos essenciais de

genótipos de L. gracilis

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram implantados na Fazenda experimental “Campus Rural”

da UFS, que apresenta solo do tipo argissolo vermelho-amarelo distrófico. As plantas

foram dispostas em espaçamento 1,0 m x 1,0 m, com adubação com esterco bovino a

cada três meses, capina manual sempre que necessário e irrigação por gotejamento. Os

21

experimentos foram em blocos casualizados com três repetições, 16 plantas por

parcelas.

Os genótipos de L. gracilis utilizados (Tabela 1) foram obtidos de coletas nos

Estados de Sergipe e Bahia, e registrados e identificados nos herbários da UFS e UFC

respectivamente.

Experimento de época de colheita em genótipos de L. gracilis

As plantas de sete genótipos de L. gracilis foram cultivadas em experimento

implantado em delineamento de blocos casualizados, em esquema de parcelas

subdivididas no tempo, com três repetições. Nas parcelas foram testados os genótipos e

nas subparcelas as épocas (chuvosa e seca). Cada parcela foi constituída por quatro

linhas de quatro plantas e as plantas centrais constituíram a parcela útil. A desfolha foi

feita manualmente e a secagem em estufa de secagem com circulação de ar forçada a

40°C, por cinco dias.

Tabela 1

As colheitas das folhas para a obtenção do óleo essencial foram realizadas em

Julho de 2009 (época chuvosa) e dezembro de 2009 (época seca).

Foram coletados os dados de precipitação pluviométrica durante o período de

condução do experimento estão na Figura 1.

Figura 1

Experimento de estresse hídrico em genótipos de L. gracilis

O experimento foi conduzido na época seca, no período de 20 de dezembro de

2009 a 24 de Janeiro de 2010. O ensaio foi implantado em delineamento experimental

de blocos ao acaso, com três repetições, sendo cada parcela constituída por 16 plantas.

22

A parcela útil foi constituída pelas quatro plantas centrais. Foram testados sete

genótipos de L. gracilis (Tabela 1), após um mês de estresse hídrico (sem irrigação) e

com irrigação por gotejamento com um turno de rega e uma vazão de 8L/planta/dia.

As variáveis avaliadas foram: teor (%), rendimento (mL/planta) e composição

química dos óleos essenciais.

Extração do óleo essencial

A extração do óleo essencial foi realizada no Laboratório de Fitotecnia da UFS,

através de hidrodestilação com aparelho Clevenger modificado. Cada amostra foi

composta por 75g de folhas secas, que foram destiladas por 140 mim (Ehlert et al.

2006).

Análise química do óleo essencial

A análise da composição química do óleo essencial foi realizada em

cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas CG-EM (Shimadzu, modelo

QP 5050A), equipado com um autoinjetor AOC-20i (Shimadzu) e coluna capilar de

sílica fundida J&W Scientific (5%-phenyl-95%-dimethylpolysiloxane) de 30 m x 0.25

mm i.d., 0.β5 μm de filme, usando He como gás de arraste com fluxo de 1,2 mL/min, a

temperatura foi programada mantendo 50°C por 1,5 min, seguido de um aumento de

4°C/min até atingir 200 °C, depois a 15°C até atingir 250°C mantendo constante esta

temperatura por 5 min.; temperatura do injetor de 250°C e temperatura do detector (ou

interface) de 280°C; foi injetado um volume de 0,5 µL em acetato de etila; taxa de

partição do volume injetado de 1:100 e pressão na coluna de 64.20 kPa. As condições

do EM foi detector de captura iônica operando por impacto eletrônico e energia de

impacto de 70 eV; velocidade de varredura 1.000; intervalo de varredura de 0,50

fragmentos/s e fragmentos detectados na faixa de 40 a 500 Da.

23

As análises quantitativas dos constituintes foram realizadas em um cromatógrafo

gasoso equipado com detector de ionização de chamas (FID), usando um equipamento

Shimadzu GC-17A, sob as seguintes condições operacionais: coluna capilar de sílica

fundida ZB-5MS (5% dimethylpolysiloxane) com γ0 m x 0.β5 mm i.d. x 0.β5 μm de

filme, usando as mesmas condições do CG-EM. A quantificação dos constituintes foi

realizada pela normatização da área (%). As concentrações dos compostos foram

calculadas pela área e colocados em ordem de eluição do CG.

Os componentes do óleo essencial foram identificados através da comparação de

seu espectro de massas com espectros existentes na literatura (Adams, 2007), com

espectros do banco de dados (NIST05 e WILEY8) do equipamento e, também, pela

comparação dos índices de retenção com aqueles da literatura. Os índices de retenção de

Kovats (IK) foram determinados utilizando uma série homologa de n-alcanos (C8-C18)

injetados nas mesmas condições cromatográficas das amostras, utilizando a equação de

Van den Dool e Kratz (1963).

Análise estatística

As análises estatísticas multivariada de componentes principais e distancia

euclidiana foram feitas com o programa Statistica 7.0, e os testes de média Scott &

Knott com o programa estatístico SISVAR 5.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Época de colheita em genótipos de L. gracilis

As folhas forneceram óleos essenciais amarelados com teor médio de 1,55% na

época chuvosa e 2,09% na seca. Os genótipos LGRA201 e LGRA202 obtiveram

maiores rendimentos e teores, independente da época; na época seca ocorreu diferença

24

significativa apenas para LGRA106 e LGRA109, na chuvosa não houve diferença

significativa tanto no rendimento como no teor. Teor entre 1,2 e 2,8%, foram

encontrados em três amostras de L. gracilis de diferentes regiões de Pernambuco, na

região mais seca o teor foi maior (Neves et al. 2007).

Tabela 2

Foram identificados 20 compostos no óleo essencial dos genótipos de L. gracilis

sendo sete compostos com teores maiores que 2%, com o timol sendo o composto

majoritário para o genótipo LGRA106 (58% em média) com baixo teor de carvacrol, e o

carvacrol para os demais genótipos (40% em média), com baixos teores de timol

(Tabela 2). Os teores de timol variaram de 3,25% (LGRA108) na época chuvosa a

6,95% (LGRA201) na época seca. Resultados semelhantes foi encontrado por Mendes

et al. (2010) cujos componentes são terpenos em sua maioria e em todas as amostras o

componente majoritário foi o mesmo com pequenas variações percentuais de acordo

com índices de água no solo.

A inversão timol/carvacrol pode ocasionar respostas diferenciadas quando o óleo

é usado em testes biológicos, uma vez que o timol é usado no tratamento de infecções

de boca, garganta e pele e o carvacrol é comprovadamente antiinflamatório e

antimicrobiano muito potente (Cavalcanti, 2006). No caso relatado por Burt (2007),

existe interação entre o carvacrol e o timol, resultando em ação sinérgica entre eles

potencializando a ação de ambos frente ao controle das células bacterianas.

As concentrações apresentaram pequenas variações entre as épocas, com

diferenças significativas apenas nos genótipos LGRA106 para o timol; LGRA202 e

LGRA108 para o carvacrol; LGRA107 e LGRA109 para o -cariofileno. Demonstrando

a estabilidade da composição química do óleo essencial de L. gracilis mesmo com

25

diferentes condições climáticas. Uma triagem de amostras do óleo essencial de L.

gracilis obtidas em Pernambuco/PE, estabeleceu as concentrações entre 36,4 a 45% de

carvacrol, 18,1-β6,β% de ρ-cimeno e 37,4% de timol (Rocha et al. 2010). Como

observado por Blank et al, (2010), em manjericão onde a variação da composição

química foi pequena de um ano para o outro.

Os percentuais de mirceno, 1,8 cineol e -terpineno também variaram pouco nas

diferentes épocas, tendo a época seca apresentado os maiores percentuais, com exceção

do mirceno cujos percentuais foram maiores na época chuvosa. O mirceno variou de

1,8% (LGRA108) a γ,β0% (LGRAβ01). O -terpineno e metil timol apresentam ampla

variação entre os genótipos e as épocas com percentuais de 3,50% (LGRA106) na época

seca a 21,11% (LGRA201) na chuvosa e 0,19 (LGRA201) na época chuvosa a 10,78%

(LGRA106) na época seca, respectivamente. O genótipo LGRA109 não contém 1,8

cineol, a ausência deste constituinte pode estar relacionada ao metabolismo vegetal

(Figueiredo et al. 2007).

Os resultados obtidos neste estudo indicam certa estabilidade na composição

química do óleo essencial de L. gracilis em diferentes condições ambientais. Resultados

divergentes foram encontrados em genótipos de L. sidoides colhidos em diferentes

épocas (Oliveira, 2008).

Considerando as similaridades dos constituintes químicos do óleo essencial dos

sete genótipos, nota-se que foram formados dois grupos distintos, independentes da

época (Figura 2). Os agrupamentos foram caracterizados como Grupo 1: o genótipo

LGRA106 cujo componente principal é o timol; Grupo 2: com os demais genótipos

(LGRA107, LGRA108, LGRA109, LGRA110, LGRA201 e LGRA202) os quais

apresentam o carvacrol como majoritário.

Figura 2

26

De acordo com a análise dos componentes principais (Figura 3), o componente

principal primário na época seca representa das informações totais 43,74% e na época

chuvosa 38,56%. Já o componente principal secundário contribuiu com 24,20% das

informações na época seca e 22,10% na época chuvosa

Figura 3

Esses resultados, confirmam a existência de dois quimiotipos de L. gracilis, um

tendo o timol como marcador principal e o outro o carvacrol, da mesma forma que

Sabino et al., (2012) conseguiram determinar a presença de diversos quimiotipos de L.

graveolens por meio de análises multivariadas dos componentes do óleo essencial.

Influencia do estresse hídrico em genótipos de L. gracilis

Este ensaio apresentou óleo essencial com 20 compostos, com alto percentual de

monoterpenos, independente da irrigação. De acordo com os testes de média (Tabela 3)

os genótipos LGRA201 e LGRA 202 obtiveram as maiores médias nas variáveis teor e

rendimento de óleo quando comparado aos outros genótipos. Os valores do teor de óleo

essencial são maiores que os encontrados por Blank, et al. (2006) que usou os mesmo

genótipos de L. gracilis, é expressiva a discrepância da quantidade de timol do

LGRA106 quando comparado aos outros genótipos que possuem valores semelhantes

de carvacrol. Há uma variação significativa da quantidade de metil timol entre os

genótipos LGRA106 e LGRA201.

Tabela 3

No ensaio com irrigação os valores de teor e rendimento de todos os genótipos são

menores quando comparado com o ensaio sem irrigação, podendo observar o efeito do

estresse hídrico no aumento das quantidades de óleo essencial nas plantas estudadas. E

27

não houve diferença significativa para todos os genótipos nestes parâmetros quando

compara os dois sistemas. Potzernheim et al. (2006) apresenta valores muito baixos de

teor de óleo em plantas de Piper hispidum irrigado e Oliveira (2008) encontrou dados

próximos com L. sidoides, onde os genótipos de época seca apresentam maiores valores

de rendimento e teor de óleo essencial.

Em experimento com e sem irrigação de L. gracilis foi observado um maior

rendimento (2,10%) quando as plantas eram submetidas a estresse hídrico e um

rendimento duas vezes menor (1,12%) quando as mesmas eram irrigadas (Mendes et al.

2010).

Em relação às médias dos principais compostos químicos, a quantidade de água

no solo não teve completa influência, já que alguns percentuais foram maiores com e

outros sem irrigação. O percentual de timol, que é o composto majoritário, do genótipo

LGRA106 foi maior com irrigação, já o carvacrol que o majoritário do LGRA201 foi

obtido maior média sem irrigação.

O óleo essencial de L. gracilis dos genótipos LGRA107, LGRA108, LGRA109,

LGRA110, LGRA 201 e LGRA 202 apresentaram o carvacrol em percentual maior. A

composição química do óleo essencial nos diversos genótipos não apresentou mudanças

significativas mesmo em sistema diferentes.

De maneira geral o comportamento de L. gracilis quanto à presença de água no

solo é a mesma independente da época do ano, uma vez que as plantas submetidas à

irrigação, mesmo no verão, produziram óleo essencial em quantidade e qualidade

semelhantes à época do inverno.

Os resultados da analises multivariada (Figuras 4 e 5) complementam as

informações de que na população de L. gracilis presente no “Campus Rural” da UFS

existem dois quimiotipos definidos, uma vez que a distância euclidiana determina a

28

presença de dois grupos definidos, independente da presença de água. A plotagem dos

escores, tendo os componentes timol e carvacrol como marcadores, explicam 42,59% e

50,48% para os componentes primários e 22,32% e 21,23% para os componentes

secundários para as análises sem irrigação e com irrigação respectivamente. Esses

estudos estatísticos estabeleceram a correlação química entre os diferentes genótipos,

que é fundamental na classificação quimiotaxonômica de espécies nativas (Silva, 2009).

Figura 4 e Figura 5

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro de RENORBIO, FAPITEC/SE, CNPq e

CAPES.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi caracterizar quimicamente o óleo essencial de L. gracilis

nas épocas seca e chuvosa e com e sem irrigação. A extração do óleo essencial foi

realizada por hidrodestilação com Clevenger. A análise da composição química foi

realizada em CG-EM. As folhas forneceram óleos com rendimento de 2,07% na época

chuvosa e 2,8% na época seca. A composição química de L. gracilis apresentou como

componente majoritário o timol para o genótipo LGRA106 e carvacrol para os demais.

As concentrações apresentaram pequenas variações entre as épocas demonstrando a

estabilidade da composição química de L. gracilis mesmo com diferentes condições

climáticas.

Palavras-chave: composição química, estresse hídrico, Lippia gracilis, óleo essencial

29

REFERÊNCIAS

ADAMS RP 2007. Identification of Essential Oil Components by Gas

chromatography/Mass Spectroscopy, Allured Publ. Corp., Carol Stream, Chicago. 803p.

ALBUQUERQUE CC, CAMARA TR, MARIANO RLR, WILLADINO LJCM, ULISSES C 2006. Antimicrobial Action of the Essential Oil of Lippia gracilis Schauer. Braz Arc of Biol and Technol 49(4): 527-535.

ATTI-SERAFINI L 2002. Variation in essential oil yield and composition of Lippia alba (Mill). N.E.Br grow in southern Brazil. Rev Bras Pl Med 4(2):72-74.

BLANK AF, SOUZA EM, PAULA JWA, ALVES PB 2010. Comportamento fenotípico e genotípico de populações de manjericão. Hort Bras 28:305-310.

BLANK AF, RICARDO BS, ARRIGONI-BLANK MF, EHLERT PAD, PAULA JWA, SANTANA THB. 2006. Caracterização morfológica e agronômica de genótipos de Lippia gracillis. 16º EIC/UFS. CD Room

BOTREL PP, PINTO JEBP, FERRAZ V, BERTOLUCCI, SKV, FIGUEIREDO FC 2010. Teor e composição química do óleo essencial de Hyptis marrubioides Epl., Lamiaceae em função da sazonalidade. Acta Sci Agro 32(3):533-538

BRANT RS, PINTO JEBP, BERTOLUCCI SKV, ALBUQUERQUE CJB 2008. Teor

do óleo essencial de cidrão [Aloysia triphylla (L’Hér.) Britton] em função da variação sazonal. Rev Bras Pl Med 10(2):83-88.

BURT SA 2007. Antibacterial activity of essential oils: potential aplication in food. N etherlands, Utrecht: Utrecht University, ISBN/EAN: 978-90-393-4661-7

CALVACANTI VO. 2006. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracillis Shauer, Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Pernambuco. 102p

DUDAREVA N, PICHERSKY E, GERSHENZON J 2004. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiol 135:1893-1902.

EHLERT PAD, BLANK AF, ARRIGONI-BLANK MF, PAULA JWA, CAMPOS DA, ALVIANO CS 2006. Tempo de hidrodestilação na extração de óleo essencial de sete espécies de plantas medicinais. Rev Bras Pl Med 8: 79–80.

FIGUEIREDO R, RODRIGUES AI, COSTA MC 2007. Volatile composition of red clover (Trifolium pratense L.) forages in Portugal: The influence of ripening stage and ensilage. Food Chem 104: 1445-1453

LORENZI H, MATOS FJA 2002. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum. 512 p.

MARCELINO-JR CAC, BARBOSA RMN, CAMPOS AF, SANTOS AP, LACERDA CC, SILVA CEG 2005. Utilizando uma cuscuzeira extração de óleo essencial do alecrim-da-chapada (Lippia gracillis), uma planta da caatinga. Quím Nov na Esc 22: 205-210

30

MENDES SS, BONFIM RR, JESUS HCR, ALVES PB, BLANK AF, ESTEVAM CS, ANTONIOLLI AR, THOMAZZIA SM 2010. Evaluation of the analgesic and anti-inflammatory effects of the essential oil of Lippia gracilis leaves. J Ethnopharmacol 129:391–397

NEVES IA, OLIVEIRA JCS, SELVA TMG, SCHWARTZ MOE, CAMARA CAG 2007. Composição química do óleo das folhas de Lippia gracilis Schauer de duas localidades de Pernambuco. 30a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. CD Room

NOGUEIRA MA, DIAZ G, SAKUMO L 2007. Caracterização química e atividade biológica do óleo essencial de Lippia alba cultivada no Paraná. Rev Ciênc Farm Básica Apl 28, (3):273 - 278,

OLIVEIRA TC. 2008. Caracterização e comportamento dos genótipos de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.) mantidos em banco ativo de germoplasma em São Cristóvão-SE. UFS (Dissertação) 100 p.

PESSOA ODL, CARVALHO CBM, SILVESTRE JOVL, LIMA MCL, NETO RM, MATOS FJA, LEMOS TLG 2005. Antibacterial activity of the essential oil from Lippia aff. gracillis. Fitot, 76:712-714

POTZERNHEIM MCL, BIZZO HR, VIEIRA RF 2006. Análise dos óleos essenciais de três espécies de Piper coletadas na região do Distrito Federal (Cerrado) e comparação com óleos de plantas procedentes da região de Paraty, RJ (Mata Atlântica). Rev Bras Farmacogn 16: 246-251.

ROCHA FAG, DANTAS LIS, MEDEIROS FGM, MEDEIROS LC 2010. Screening da

atividade antibacteriana do óleo essencial de Lippia gracilis Scaher sobre patógenos de importância na indústria de alimentos. Relatório final de pesquisa. V CONEPI

SABINO JFP, REYES MM, BARRERA, CDF 2012. Análise e discriminação de quimiotipos de Lippia graveolens H.B.K. da Guatemala por microextração em fase sólida, CG-EM e análise multivariada. Quim. Nova 35, (1): 97-101.

SANTOS RF e CARLESSO R 1999. Relações água-solo-planta-atmosfera -

Enrolamento das folhas de milho submetidas a déficit hídrico em diferentes solos. Rev Bras Eng Agr Amb 3 (1):1-6,

SILVA AL 2009. Análise química de espécies de valeriana brasileira. Porto Alegre. UFRS (Tese) 205p.

SILVA PS, VICCINI LF, SINGULANI JL, SIQUEIRA EP, ZANI CL, ALVES TMA 2010. Chemical composition of the essential oil and hexanic fraction of Lippia and Lantana species. Rev Bras Farmacog 25: 312-319.

SIMÕES CMO, SCHENKEL EP, GOSMAM G, MELLO JCP, MENTZ LA, PETROVICK PR 2002. Farmacognosia da planta ao medicamento. Editora da UFSC. 821p.

TAVARES ES, JULIÃO ES, LOPES HD, BIZZO HR, LAGE CLS, LEITÃO SG. 2005. Análise do óleo essencial de folhas de três quimiotipos de Lippia alba (Mill.)

31

N. E. Br. (Verbenaceae) cultivados em condições semelhantes. Rev Bras Farmacog 15:1-5.

VAN DEN DOOL H e KRATZ PHJ. 1963. Chromatography. 11, 463 p.

32

Tabela 1 – Genótipos de L. gracilis presentes no BAG de plantas medicinais da UFS Código Local de origem Dados geográficos No Voucher Herbário UFS LGRA106 Tomar do Geru – SE 11 19' 16,7'' S; 37 55' 09,2'' W 14733 LGRA107 Tomar do Geru – SE 11 19' 20,1" S; 37 55' 13,5" W 14737 LGRA108 Tomar do Geru – SE 11 19' 22,4" S; 37 55' 12,6" W 14734 LGRA109 Tomar do Geru – SE 11 19' 20,7" S; 37 55' 16,9" W 14735 LGRA110 Tomar do Geru – SE 11 19' 21,1" S; 37 55' 14,9" W 14732 LGRA201 Rio Real – BA 11 23' 38,7" S; 38 00' 54,1" W 14736 LGRA202 Rio Real – BA 11 23' 45,3" S; 38 00' 51,3" W 14731

33

Tabela 2 – Composição química de óleo essencial de genótipos de L. gracilis colhidos em época chuvosa e seca

Constituinte IK LGRA106 LGRA107 LGRA108 LGRA109 LGRA110 LGRA201 LGRA202 Época chuvosa

α-Thujeno 924 0,45 bA 0,98 bA 0,98 bA 0,85 bA 0,95 bA 1,37 aA 1,00 bA α-Pineno 931 0,28 aA 0,24 aA 0,38 aA 0,26 aA 0,33 aA 0,37 aA 0,28 aA

-Pineno 971 0,10 aA 0,0 bA 0,14 aA 0,0 bA 0,0 bA 0,12 aA 0,0 bA Mirceno 976 2,74 bA 2,65 bA 2,05 cA 2,06 cA 3,10 aA 3,20 aA 3,02 aA

α Terpineno 988 1,00 cA 2,28 bA 1,79 cA 1,82 cA 2,27 bA 3,01 aA 2,23 bA p-Cimeno 1016 6,70 cA 11,46 bA 11,75 bA 13,02 aA 12,87 aA 13,74 aA 13,30 aA Limoneno 1023 0,36 aA 0,38 aA 0,38 aA 0,21 bA 0,37 aA 0,44 aA 0,41 aA 1,8 Cineol 1028 3,92 aB 0,61 dA 2,10 bB 0,0 dA 2,50 bA 1,50 cA 0,72 dA -Terpineno 1031 3,66 eA 13,52 bA 8,81 dA 8,55 dA 11,81 cA 21,11 aA 11,99 cA

Linalol 1057 0,41 bA 0,80 aA 0,44 bA 0,79 aA 0,54 bA 0,72 aA 0,73 aA Terpinen-4-ol 1100 0,57 aA 0,57 aA 0,59 aA 0,61 aA 0,62 aA 0,57 aA 0,65 aA

Metil timol 1180 8,32 aB 4,28 dB 5,85 bB 4,77 cB 4,35 dB 0,19 eA 5,05 cA Timol 1195 59,26 aB 4,50 bA 3,65 bA 3,20 bA 4,06 bA 5,78 bA 4,03 bA

Carvacrol 1228 0,88 dA 43,24 bA 47,10 aA 48,99 aA 48,91 aA 35,28 cA 47,29 aA -Cariofileno 1291 8,57 aA 6,20 bA 3,92 aA 7,80 aA 4,44 aA 6,26 bA 3,86 aA

α-Humuleno 1298 0,47 cA 0,85 bA 1,00 aA 0,38 dA 0,33 dA 0,49 cA 0,29 dA Viridifloreno 1418 0,15 bA 0,77 aA 1,02 aA 0,84 aA 0,25 bA 0,51 bA 0,43 bA

Biciclogermacreno 1432 0,07 cA 1,40 bA 1,95 aA 0,55 cA 0,44 cA 1,05 bA 0,42 cA Espathulenol 1437 0,19 dA 0,62 bA 1,36 aA 0,58 bA 0,33 dA 0,69 bA 0,48 bA

Oxido de Cariofileno 1454 0,74 aB 0,58 bA 0,62 bA 0,71 aA 0,56 bA 0,82 aA 0,57 bA

Monoterpenos 88,56 85,51 86,0 85,13 92,68 87,49 90,70 Sesquiterpenos 10,19 10,42 9,87 10,86 6,35 9,82 6,05 Teor de óleo essencial (%) 1,25 aA 1,70 aA 1,60 aB 1,35 aB 1,52 aB 1,92 aA 1,52 aB Rendimento de óleo essencial (mL/planta)

1,67 aA 2,27 aA 2,13 aB 1,80 aB 2,03 aB 2,57 aA 2,03 aB

Época seca α-Thujeno 924 0,51 cA 1,05 bA 0,98 bA 0,93 bA 1,05 bA 1,24 aA 1,14 aA α-Pineno 931 0,31 bA 0,25 bA 0,40 aA 0,22 bA 0,36 aA 0,40 aA 0,29 bA

-Pineno 971 0,16 aA 0,0 bA 0,18 aA 0,0 bA 0,17 aA 0,15 aA 0,0 bA Mirceno 976 2,25 cB 2,46 bA 1,80 eB 2,00 dA 2,67 aB 2,74 aB 2,51 bB

α Terpineno 988 0,91 dA 2,39 bA 1,89 cA 2,08 cA 2,27 bA 3,02 aA 2,30 bA p-Cimeno 1016 8,12 bA 12,86 aA 12,51 aA 13,34 aA 14,03 aA 13,22 aA 12,80 aA Limoneno 1023 0,38 aA 0,36 aA 0,46 aA 0,21 bA 0,37 aA 0,48 aA 0,39 aA 1,8 Cineol 1028 5,03 aA 0,52 dA 3,03 bA 0,0 dA 3,13 bA 2,02 cA 0,33 dA -Terpineno 1031 3,50 dA 13,66 bA 9,86 cA 10,52 cA 11,33 cA 19,65 aA 12,53 bA

Linalol 1057 0,36 bA 0,55 aA 0,23 bA 0,59 aA 0,48 aA 0,53 aA 0,59 aA Terpinen-4-ol 1100 0,64 bA 0,64 bA 0,67 bA 0,69 bA 0,81 aA 0,66 bA 0,69 bA

Metil timol 1180 10,78 aA 5,40 bA 6,97 bA 5,93 bA 6,03 bA 0,23 cA 6,01 bA Timol 1195 56,77 aA 4,42 cA 3,25 dA 3,50 dA 3,76 dA 6,95 bA 4,53 cA

Carvacrol 1228 0,64 dA 43,74 bA 44,00 bB 48,29 aA 45,40 bA 36,57 cA 44,41 bB -Cariofileno 1291 7,27 aA 4,72 bB 3,75 cA 5,23 bB 3,33 cA 5,30 bA 4,18 cA

α-Humuleno 1298 0,37 bA 0,58 bA 0,99 aA 0,22 bA 0,25 bA 0,44 bA 0,41 bA Viridifloreno 1418 0,0 cA 0,60 aA 0,68 aA 0,46 bA 0,0 cA 0,45 bA 0,50 bA

Biciclogermacreno 1432 0,0 cA 1,28 bA 2,22 aA 0,48 cA 0,37 cA 1,14 bA 1,08 bA Espathulenol 1437 0,0 cA 0,61 bA 1,09 aA 0,61 bA 0,37 cA 0,56 bA 0,60 bA

Oxido de Cariofileno 1454 1,13 aA 0,73 cA 0,69 cA 1,09 aA 0,87 bA 0,93 bA 0,77 cA

Monoterpenos 90,36 88,30 86,23 88,30 91,90 87,86 88,52 Sesquiterpenos 8,77 8,52 9,42 8,09 5,19 8,82 7,54 Teor de óleo essencial (%) 1,42 bA 2,02 aA 2,17 aA 1,85 bA 2,15 aA 2,37 aA 2,70 aA Rendimento de óleo essencial (mL/planta)

1,90 bA 2,70 aA 2,90 aA 2,47 bA 2,87 aA 3,17 aA 3,60 aA

Médias seguidas das mesmas letras minúsculas, nas linhas (constituintes), e maiúsculas nas colunas (época) não diferem entre si pelo teste de Scott&Knott (p<0,05).

34

Tabela 3 – Composição química de óleo essencial de genótipos de L. gracilis sem e com irrigação

Constituinte IK LGRA106 LGRA107 LGRA108 LGRA109 LGRA110 LGRA201 LGRA202 Sem irrigação

α-Thujeno 924 0,74bA 0,97bA 1,13aA 0,88bA 1,01bA 1,26aA 1,28aA α-Pineno 931 0,28bA 0,24bA 0,36aA 0,26bA 0,36aA 0,35aA 0,26bA

-Pineno 971 0,03aB 0,00aA 0,00aA 0,00aA 0,00aB 0,00aA 0,00aA Mirceno 976 2,72aA 2,13bB 1,81cA 1,63cB 2,46aA 2,64aA 2,53aA

α Terpineno 988 1,06dA 2,08bB 1,88cA 1,67cB 2,09bA 3,01aA 2,12bA p-Cimeno 1016 7,34bA 8,95bB 11,22aA 10,99aB 10,78aB 11,79aA 11,85aA Limoneno 1023 0,34aA 0,26bA 0,34aA 0,22bA 0,29aA 0,37aB 0,32aA 1,8 Cineol 1028 3,25aB 0,39dA 1,70bA 0,00dA 0,95cB 0,96cB 0,19dA -Terpineno 1031 4,21dA 13,08bA 9,60cB 8,49cB 11,31bA 20,20aA 11,38bA

Linalol 1057 0,13cB 0,78aA 0,40bA 0,66aA 0,44bA 0,63aA 0,71aA Terpinen-4-ol 1100 0,65aA 0,59aA 0,65aA 0,63aA 0,64aA 0,54aA 0,65aA

Metil timol 1180 10,08aA 4,07cB 6,24bA 5,00cA 4,40cB 0,17dA 5,07cA Timol 1195 53,62aB 5,03bA 3,80bA 3,72bA 4,82 bA 6,23bA 4,61bA

Carvacrol 1228 0,90dA 45,96bA 44,98bA 51,35aA 52,24aA 35,16cA 46,12bA -Cariofileno 1291 11,98aA 6,29cA 3,87dA 6,81cA 3,94dA 8,24bA 5,04dA

α-Humuleno 1298 0,61bA 0,89aA 1,08aA 0,44cA 0,31cA 0,67bA 0,40cA Viridifloreno 1418 0,27aA 0,00aB 0,24aA 0,00aA 0,00aA 0,62aA 0,00aA

Biciclogermacreno 1432 0,00cA 1,46bA 3,41aA 0,91bA 0,17cA 1,30bA 0,90bA Espathulenol 1437 0,00dA 0,72bA 1,69aA 0,70bA 0,34cA 0,94bA 0,84bA

Oxido de Cariofileno 1454 0,45bB 0,51bB 0,61bA 0,75aB 0,57bB 0,80aA 0,85aA

Monoterpenos 97,02 90,58 87,62 92,05 90,55 91,20 91.87 Sesquiterpenos 1,33 3,59 7,03 2,80 1,39 4,33 2,99 Teor de óleo essencial (%) 1,60cA 2,32bA 2,25bA 2,00bA 1,95cA 3,00aA 2,45bA Rendimento de óleo essencial (mL/planta)

2,01cA 3,10bA 3,00bA 2,66cA 2,60cA 4,00aA 3,20bA

Constituinte IK LGRA106 LGRA107 LGRA108 LGRA109 LGRA110 LGRA201 LGRA202 Com irrigação

α-Thujeno 924 0,51cB 1,05bA 0,97bA 0,93bA 1,00bA 1,24aA 1,25aA α-Pineno 931 0,31bA 0,25bA 0,40aA 0,22bA 0,36aA 0,39aA 0,29bA

-Pineno 971 0,16aA 0,00bA 0,00bA 0,00bA 0,11aA 0,00bA 0,00bA Mirceno 976 2,25bB 2,46aA 2,00bA 2,00bA 2,63aA 2,74aA 2,40aA

α Terpineno 988 0,91cA 2,39bA 2,12bA 2,08bA 2,24bA 3,02aA 2,30bA p-Cimeno 1016 8,12bA 12,86aA 12,08aA 13,34aA 14,28aA 13,22aA 12,80aA Limoneno 1023 0,38bA 0,36bA 0,42bA 0,21cA 0,36bA 0,48aA 0,39bA 1,8 Cineol 1028 5,03aA 0,52cA 2,27bA 0,00cA 2,65bA 2,02bA 0,33cA -Terpineno 1031 3,50cA 13,66bA 11,54bA 10,52bA 11,45bA 19,55aA 12,53bA

Linalol 1057 0,36bA 0,55aB 0,28bA 0,59aA 0,45aA 0,56aA 0,59aA Terpinen-4-ol 1100 0,64aA 0,64aA 0,64aA 0,69aA 0,74aA 0,66aA 0,69aA

Metil timol 1180 10,78aA 5,40bA 6,18bA 5,70bA 5,93bA 0,23cA 6,01bA Timol 1195 56,77aA 4,42cA 3,89cA 3,50cA 3,83cA 6,95bA 4,53cA

Carvacrol 1228 0,64dA 43,84bA 43,85bA 48,29aB 46,91aA 36,57cA 44,41bA -Cariofileno 1291 7,27aB 4,72bB 4,22cA 4,96bB 3,21cA 5,30bB 4,18cA

α-Humuleno 1298 0,37cA 0,58bB 0,88aA 0,16dB 0,24dA 0,44cA 0,44cA Viridifloreno 1418 0,00bA 0,60aA 0,66aA 0,46aA 0,00bA 0,45aA 0,50aA

Biciclogermacreno 1432 0,00bA 1,28bA 2,03aB 0,48bA 0,24bA 1,14aA 1,08aA Espathulenol 1437 0,00cA 0,61aA 0,84aB 0,61aA 0,35bA 0,56aB 0,60aB

Oxido de Cariofileno 1454 1,13aA 0,73bA 0,62bA 1,09aA 0,84bA 0,93aA 0,77bA

Monoterpenos 97,16 92,85 90,46 92,77 95,68 92,54 92,41 Sesquiterpenos 1,50 3,19 5,03 2,80 1,67 3,03 3,39 Teor de óleo essencial (%) 1,42cA 2,02bA 2,17bA 1,85bA 2,15bA 2,87aA 2,77aA Rendimento de óleo essencial (mL/planta)

1,90cA 2,70bA 2,90bA 2,46bA 2,86bA 3,83aA 3,70aA

Médias seguidas das mesmas letras minúsculas, nas linhas (constituintes), e maiúsculas nas colunas (época) não diferem entre si pelo teste de Scott&Knott (p<0,05).

35

Figura 1 – Precipitação pluviométrica (mm) na área experimental nas épocas chuvosa e seca. Na época seca metade das parcelas recebeu irrigação por gotejamento (6mm/dia). C=indicam períodos de colheita de Lippia gracilis.

Pre

cipi

taçã

o pl

uvio

mét

rica

(mm

)

0

20

40

60

80

100

Época chuvosa

19 24 29 04 09 14 19

Junho/ 2009

0

1

2

3

4

5

6

Julho/ 2009

15 20 05 20 30 04 19

Novembro/ 2009 Dezembro/ 2009

25 30 10 15 25 09 14

Janeiro/ 2010

Época seca

C

com irrigaçãoC

sem irrigaçãoC C

36

0 10 20 30 40 50 60 70

Distância Euclidiana

LGRA201

LGRA109

LGRA202

LGRA110

LGRA108

LGRA107

LGRA106

0 10 20 30 40 50 60 70


LGRA201

LGRA109

LGRA110

LGRA108

LGRA202

LGRA107

LGRA106

Figura 2. Dendrograma bi-dimensional representando a similaridade da composição química entre 7 genótipos de Lippia gracilis colhidos na época chuvosa (A) e seca (B)

A

B

37

a-Thujeno

a-Pineno

b-Pineno

Mirceno

a-Terpinenop-Cimeno

Limoneno

1,8 Cineol

g-Terpineno

Linalol

Terpinen-4-ol

Metil timol

Timol

Carvacrol b-Cariofileno

a-Humuleno

Viridifloreno

BiciclogermacrenoSpatulenol

Oxido de cariofileno

-1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Componente principal primário (38,56%)

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8C

om

po

ne

nte

prin

cip

al se

cu

nd

ario

(2

2,1

0%

)

a-Thujeno

a-Pineno

b-Pineno

Mirceno

a-Terpinenop-Cimeno

Limoneno

1,8 Cineol

g-Terpineno

Linalol

Terpinen-4-ol Metil timolTimolCarvacrol

b-Cariofileno

a-Humuleno

Viridifloreno

Biciclogermacreno

SpatulenolOxido de cariofileno

-1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2


-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Co

mp

on

en

te p

rin

cip

al se

cu

nd

ário

(2

4,2

0%

)

Figura 3. Distribuição dos constituintes químicos do óleo essencial de Lippia gracilis extraído nas épocas chuvosa (A) e seca (B), através da análise de componente principal (ACP).

A

B

38

0 10 20 30 40 50 60 70


LGRA201

LGRA110

LGRA109

LGRA108

LGRA202

LGRA107

LGRA106

0 10 20 30 40 50 60 70


LGRA201

LGRA110

LGRA109

LGRA108

LGRA202

LGRA107

LGRA106

Figura 4 - Dendrograma bi-dimensional representando a similaridade da composição química entre 7 genótipos de Lippia gracilis colhidos sem irrigação (A) e com irrigação (B)

A

B

39

a-Thujeno

a-Pimeno

b-Pimeno

Mirceno

a-terpineno

p-cimeno

Limoneno

1,8 cineolg-terpineno

Linalol

Terpinen-4-ol

Metil timol

Timol

Carvacrol

b-Cariofileno

a-Hamuleno

Viridrifloreno

BiciclogermagrenoSpatuleno


-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2


-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Co

mp

on

en

te p

rin

cip

al se

cu

nd

ário

(2

2,2

3%

)

-Thujeno

a-Pimeno

b-Pimeno

Mirceno

-Terpineno

p-Cimeno

Limoneno

1,8 Cineol

g-Terpineno

LinalolTerpinen-4-ol

Metil timol

Timol

Carvacrol

b-Cariofileno

a-Humuleno

Viridifloreno

Biciclogermagreno

Spatuleno


-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2


-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Co

mp

on

en

te p

rin

cip

al se

cu

nd

ário

(2

1,3

2%

)

Figura 5 - Distribuição dos constituintes químicos do óleo essencial de Lippia gracilis extraído sem irrigação (A) e com irrigação (B), através da análise de componente principal (ACP).

B

A

40

CAPÍTULO 2 Atividade de óleo essencial de Lippia gracilis Schauer e seus constituintes majoritários em Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Elizangela Mércia de Oliveira Cruza, Livio Martins Costa-Juniorb, Jessika Andreza Oliveira Pintoa, Darlisson de Alexandria Santosc, Sandra Alves de Araujob, Maria de Fátima Arrigoni-Blanka, Leandro Baccia, Péricles Barreto Alvesc, Sócrates Cabral de Holanda Cavalcantid, Arie Fitzgerald Blanka* a

Departamento de Agromonia, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N, CEP 49100-000, São Cristóvão-SE, Brasil b

Departamento de Ciencia Animal, Universidade Federal do Maranhão. Rua São José de Ribamar, nº 15. Boa Vista. CEP: 65500-000 Chapadinha/MA c Departamento de Quimica, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N, CEP 49100-000, São Cristóvão-SE, Brasil d Darpatamento de Farmacia, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N, CEP 49100-000, São Cristóvão-SE, Brasil Resumo O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade do óleo essencial de Lippia gracilis Schauer obtidos de diferentes genótipos de L. gracilis e de seus componentes principais, carvacrol e timol contra Rhipicephalus (Boophilus) microplus (carrapato bovino) larvas e fêmeas ingurgitadas. O teste larval foi realizado paralelo ao teste de imersão de adultos para fêmeas ingurgitadas de quatro genótipos de L. gracilis. Testes semelhantes foram também realizadas para a sua principal compostos de carvacrol e timol. Carvacrol (CL50 de 0,22 e 4,46 mg / ml, para as larvas e ingurgitadas fêmea, respectivamente) foi mais eficiente do que o timol (CL50 de 3,86 e 5,50 mg / ml, para as larvas e ingurgitadas fêmea, respectivamente). As concentrações letais obtidos para o óleo essencial isolado a partir de genótipos LGRA201 contra larvas (1,31 mg / mL) e LGRA106 contra ingurgitadas fêmea (4,66 mg / mL) confirmou a atividade acaricida do óleo essencial de L. gracilis e da sua eficácia no controle o carrapato bovino. Palavras chave: L. gracilis, óleo volátil, carvacrol, timol, carrapatos. Abstract

The present study aimed to evaluate the activity of Lippia gracilis Schauer essential oil obtained from different L. gracilis genotypes and their major components, carvacrol and thymol against Rhipicephalus (Boophilus) microplus (cattle tick) larvae and engorged females. The larval test was performed parallel to the adult immersion test for engorged females for four L. gracilis genotypes. Similar tests were further performed for their

* Corresponding author. tel.: +55 79 21056497; fax: +55 79 21056494

E-mail address: [email protected] (A.F. Blank)

Artigo publicado: Veterinary Parasitology . DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetpar.2012.12.046

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major compounds carvacrol and thymol. Carvacrol (LC50 of 0.22 and 4.46 mg/ml, to larvae and engorged female, respectively) were more efficient than thymol (LC50 of 3.86 and 5.50 mg/ml, to larvae and engorged female, respectively). The lethal concentrations obtained for the isolated essential oil from genotypes LGRA-201 against larvae (1.31 mg/mL) and LGRA-106 against engorged female (4.66 mg/mL) confirmed the acaricidal activity of L. gracilis essential oil and its effectiveness in controlling the southern cattle tick. Keywords: Lippa gracilis; volatile oil; carvacrol; thymol; cattle tick

1. Introdução Lippia gracilis Schauer (Verbenaceae) é um arbusto de caducifólio ramificado de até 2 m de altura. Esta planta é uma espécie típica da vegetação de solo bem drenados, da região semi-árida do nordeste do Brasil. As folhas aromáticas, juntamente com as flores, constituem a parte medicinal da planta, de onde é extraído o óleo essencial. O óleo vegetal exibe atividade antimicrobiana devido ao seu alto teor de carvacrol e / ou timol (Pessoa et al., 2005). O Banco Ativo de Germoplasma de L. gracilis que é mantido pela Universidade Federal de Sergipe onde o material vegetal está disponível para fornecer mudas para o cultivo em grande escala e a produção de óleo essencial.

Em geral o gênero Lippia apresenta composição química constante com alguns compostos que são encontrados em varias espécies como timol, carvacrol, 1,8 cineol, α-hamuleno, p-cimeno entre outros, com atividades farmacológicas antimalárica, anti-viral e citostática (Calvacanti, 2006) e que podem servir para o controle de insetos e carrapatos. O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tem sido associada com perdas em produção de leite e carne, bem como danos à peles de animais, que por sua vez resultaram em perdas econômicas em toda a região tropical e subtropical, onde este carrapato é distribuído (Graf et al.,2004).

O uso de produtos acaricidas sintéticos é o método mais comum para controlar o carrapato bovino. No entanto, o uso frequente destes produtos em rebanhos bovinos pode levar à contaminação de leite e carne e fomentando a seleção de carrapatos resistentes. Em muitos países, as populações de carrapatos resistentes a acaricida aumentou a tal ponto que alguns acaricidas sintéticos continuam a ter eficiência superior a 75% (Graf et ai., 2004). Castrejón (2003) propuseram previamente a utilização combinada de métodos de controlo não-químicas, incluindo a utilização de plantas com os compostos acaricidas, para reduzir o impacto ambiental e financeiro de acaricidas sintéticos. Neste contexto, fitoquímicos podem representar uma ferramenta útil para o controle de ectoparasitas e podem também, potencialmente, ser combinada com outras estratégias de controle. Além disso, fitoquímicos podem contribuir para a produção de leite e carne de animais livres de produtos químicos perigosos que são prejudiciais para os seres humanos, animais e meio ambiente (Agnolin, 2010). Além disso, timol e carvacrol são geralmente considerados como aromatizantes de alimentos seguro, que é uma indicação de materiais de baixa toxicidade (United States Office of the Federal Register, 2009).

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O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do óleo essencial de genótipos de L. gracilis e seus principais componentes, carvacrol e timol, em larvas e fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus

2. Metodologia 2.1 Material vegetal e biológico

As folhas foram coletadas de quatro genótipos de L. gracilis (Tabela 1) do

Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Plantas Medicinais na Fazenda Experimental Campus Rural da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Desfolha foi realizada manualmente, e as folhas foram secas num estufa de circulação de ar forçada a 40 ° C durante cinco dias. Os carrapatos R. (B.) microplus utilizados nos bioensaios foram criados e mantidos no Departamento de Ciência Animal da Universidade Federal do Maranhão (UFMA). 2.2 Extração e análise de óleo essencial A extração do óleo essencial foi realizada no Laboratório de Fitotecnia da UFS, através de hidrodestilação com aparelho Clevenger. Cada amostra foi composta por 75g de folhas secas, que foram destiladas por 140 minutos. A análise da composição química do óleo essencial foi realizada em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM) (Shimadzu, modelo QP 5050A), equipado com um autoinjetor AOC-20i (Shimadzu) e coluna capilar de sílica fundida J&W Scientific (5%-phenyl-95%-dimethylpolysiloxane) de 30 m x 0.25 mm i.d., 0.β5 μm de filme, usando He como gás de arraste com fluxo de 1,2 mL/min, a temperatura foi programada mantendo 50°C por 1,5 min, seguido de um aumento de 4°C/min até atingir 200 °C, depois a 15°C até atingir 250°C mantendo constante esta temperatura por 5 min.; temperatura do injetor de 250°C e temperatura do detector (ou interface) de 280°C; foi injetado um volume de 0,5 µL em acetato de etila; taxa de partição do volume injetado de 1:100 e pressão na coluna de 64.20 kPa. As condições do EM foi detector de captura iônica operando por impacto eletrônico e energia de impacto de 70 eV; velocidade de varredura 1.000; intervalo de varredura de 0,50 fragmentos/s e fragmentos detectados na faixa de 40 a 500 Da. Os componentes do óleo essencial foram identificados através da comparação de seu espectro de massas com espectros existentes nos espectros do banco de dados (NIST05 e WILEY8) do equipamento e, também, pela comparação dos índices de retenção com aqueles da literatura (Adams, 2007). Os índices de retenção relativos (IRR) foram determinados utilizando uma série homologa de n-alcanos (C8-C18) injetados nas mesmas condições cromatográficas das amostras, utilizando a equação de Van den Dool & Kratz (1963).

As médias dos constituintes químicos do oleo essencial foram submetidos ao teste de análise de variância e F foram comparados usando o teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade 2.3 Teste de sensibilidade larval O teste de sensibilidade larvar foi realizado em R. (B.) microplus no Laboratório de Parasitologia Animal da UFMA (Campus Chapadinha). A metodologia foi

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desenvolvida por Stone e Haydock, em 1962, e adaptado pela Organização para a Alimentação e Agricultura (FAO, 1984) e Leite (1988). Duas folhas de papel de filtro (4 cm2) (Whartman, 80g) foram tratados com 0,4 mL de uma solução contendo 3% de dimetil sulfóxido (DMSO) e de óleo essencial ou de um dos componentes principais. Dez concentrações variando de 0,0612 a 25,00 mg / mL de timol (Merck) ou carvacrol (Sigma-Aldrich) ou óleo essencial isolado de cada um dos quatro genótipos de L. gracilis foram usadas para o teste.

Aproximadamente 100 larvas foram colocadas sobre uma das folhas e, em seguida, coberta com a outra folha, formando um sanduíche. Os papéis de filtro e larvas foram então colocados num envelope de papel não-impregnado de filtro dobrado (72,25 cm2) e selados com um prendedor de plástico. O envelope foi colocado em uma incubadora e mantida em β7 ± 1 º C, com umidade relativa do ar (UR) ≥ 80% por β4 horas. Após este tempo, as larvas vivas e mortas foram contadas. Foram considerados mortos os carrapatos sem movimento. O experimento foi efetuado com quatro repetições de cada tratamento. Além disso, uma solução de 3% de dimetil sulfóxido (DMSO) foi utilizado como controle negativo. As correções para o teste de sensibilidade de larvas foram realizados de acordo com a fórmula de Abbott (Abbot, 1925). 2.4 Sensibilidade das fêmeas ingurgitadas em testes de imersão O teste de sensibilidade de fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus foi realizado através do teste de imersão de acordo com a técnica desenvolvida por Drummond et al. (1973). As fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus coletadas dos bezerros infestados artificialmente, foram lavadas em água corrente, secas em papel toalha, e pesadas em grupos de 10 espécimes, procurando obter os pesos dos grupos o mais homogêneo possível. Cada grupo de carrapato foi submerso, durante cinco minutos, em dez concentrações entre 1,00 a 25,00 mg/mL de timol (Merck) ou carvacrol (Sigma–Aldrich) ou óleos essenciais isolados de quatro diferentes genótipos de L. gracilis, usando uma solução de 3% de DMSO como solvente. DMSO (3%) foi usado como controle negativo. Após este período as fêmeas ingurgitadas foram secas em papel toalha, acondicionadas em placas de Petri e levadas a estufa BOD a β7 ± 1 ºC e UR ≥ 80%, por 15 dias. Concentração letal para 50 e 90% das larvas e fêmeas foram calculado para cada genótipo de L. gracilis utilizando o software GraphPad Prism 5.0. 3. Resultados e discussão Óleos essenciais de plantas podem ser utilizados como alternativas ou adjuvantes de terapias antiparasitárias (Anthony et al., 2005). Entretanto variabilidade química ocorre em óleos essenciais da mesma espécie vegetal (Cavalcanti et al., 2010) podendo ocasionar diferenças na bioatividade. No presente estudo foram identificados 20 compostos no óleo essencial de L. gracilis (Tabela 2). Destes 92% foram terpenos (mono e sesquiterpenos). Timol foi identificado como maior componente do genótipo

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LGRA106, que produz percentuais muito baixos de carvacrol. E para os demais genótipos, o carvacrol representa o maior componente. Com exceção do genótipo LGRA108, o percentual de mortalidade foi acima de 50% apartir da concentração de 2mg.mL-1. As concentrações 5, 4, 8 e 10mg.mL-1 apresentaram quase 100% de mortalidade para todos os genótipos. O carvacrol apresentou maior mortalidade que o timol isoladamente. Os resultados com timol, um dos principais componentes do óleo essencial L. gracilis, são mais visíveis do que os relatados por Mendes et al. (2011) quando o timol foi testado contra Amblyomma cajennense. Em concentrações de 2,5 e 5,0 mg / mL, que foram observadas taxas de mortalidade de 18,2% e 51,8%, respectivamente. Os resultados do presente estudo estão de acordo com os de Novelino et al. (2007) e Daemon et al. (2009), em que 1% e 2% de timol resultou em 100% de mortalidade, proporcionando evidência para a elevada atividade deste composto no gênero Rhipicephalus. Velazquez et al. (2011) relataram resultados similares para os óleos essenciais de Cuminum cyminum e Pimenta dioica, com concentrações de 2,5 mg / mL, produzindo 100% de mortalidade. Scolarick et al. (2012) observaram uma mortalidade superior a 90% em todas as experiências com o timol solubilizados em etanol. Panella et al. (2005) relataram LC50/90 para carvacrol para Ixodes scapularis e Dietrich et al. (2006) relataram repelência de carvacrol em I. scapularis. A Tabela 2 indica que terpinen-4-ol estava presente nas amostras. Panella et al. (1997) relataram LC50/90 para (+)-terpinen-4-ol para I. scapularis.

As concentrações resultantes em 50% de letalidade (CL50) em larvas de R. (B.) microplus variaram entre 1,31 mg / mL (LGRA201) a 4,34 mg / mL (LGRA108), e os valores de LC90 variaram de 2,18 mg / mL (LGRA201) a 6,02 mg / mL (LGRA109) (Tabela 3). Estes valores demonstram a elevada eficiência do óleo essencial L. gracilis para o controle de carrapatos, juntamente com a eficiência do seu principal componentes carvacrol (0,22 mg/mL) e timol (3,86mg/mL). O óleo essencial isolado do genótipo LGRA201 provou ser o mais letal para as larvas de carrapato, com altas taxas de mortalidade observadas mesmo em baixas concentrações. Uma possível explicação para esta descoberta é a presença de carvacrol como componentes principais e de efeito sinérgico com os outros monoterpenos, tais como α-thujene, α-terpineno e -terpineno. Da mesma forma, ao investigar o efeito do óleo essencial de L. javanica em vários subgênero Boophilus, Madzimure et al. (2011) observaram elevada eficiência do óleo essencial em ambos, larvas e adultos. Os padrões observados para as concentrações letais em fêmeas ingurgitadas foram semelhantes aos observados em larvas. No entanto, para o genótipo LGRA106 CL50 (4,66 mg / mL) e CL90 para o genótipo LGRA201 (8,87 mg / mL) indicou maior eficácia em relação às outras amostras contra fêmeas ingurgitadas (Tabela 3). No que diz respeito aos componentes principais, foi encontrado efeito superior em carvacrol, com elevada letalidade mesmo em baixas concentrações. Da mesma forma, Cetin et al. (2010) obteve CL50 de 3,18 mg / mL usando carvacrol puro em adultos do carrapato Mediterrâneo Hyalomma marginato.

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4. Conclusões

A utilização de produtos naturais como acaricidas pode representar uma alternativa importante para o controle de parasitas de animais, uma vez que são fontes ricas de compostos bioativos que sejam biodegradáveis e, potencialmente adequado para utilização como pesticidas. Os presentes resultados demonstram que o óleo essencial L. gracilis pode ser utilizado como um acaricida natural. Timol e carvacrol são os principais compostos no óleo essencial de L. gracilis e podem agir sinergicamente para produzir a ação acaricida observada contra R. (B.) microplus. Agradecimentos Os autores agradecem a CNPq, FAPITEC/SE e CAPES pelo apoio financeiro. 5. Referencias Abbott, W.S., 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ.

Entomol., 18, 265-267.

Adams, R.P., 2007. Identification of Essential Oil Components by Gas

chromatography/Mass Spectroscopy, Allured Publ. Corp., Carol Stream, Chicago.

Agnolin, C.A., Olivo, C.J., Leal, M.L.R., Beck, R.C.R., Meinerz, G.R., Parra, C.L.C.,

Machado, P.R., Foletto, V., Bem, C.M., Nicolodi, P.R.S.J., 2010. Efficacy of

Cymbopogon nardus (L.) Rendle citronella oil on controlling bovine ectoparasites.

Rev. Bras. de Plant. Med., 12 (4), 482-487.

Anthony, J.P., Fyfe, L., Smith, H., 2005. Plant active components – a resource for

antiparasitic agents? Tren. in Parasitol. 21 (10), 462-468.

Cavalcanti, S.C.H., Niculau, E. S., Blank, A.F., Câmara, C.A.G., Araújo, I.N., Alves,

P.B., 2010. Composition and acaricidal activity of Lippia sidoides essential oil

against two-spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch). Bioresource

Technology 101, 829–832.

46

Castrejón, F.M., 2003. Repellence of Boophilus microplus larvae in Stylosanthes

humilis and Stylosanthes hamata plants. Parasitol. Latinoamer., 58 (2-3), 118-121.

Cetin, H., Cilekb, J.E., Oza, E., Aydinc, L., Devecid, O., Yanikoglua, A., 2010.

Acaricidal activity of Satureja thymbra L. essential oil and its major components,

carvacrol and -terpinene against adult Hyalomma marginatum (Acari: Ixodidae).

Vet. Parasitol. 170, 287–290

Daemon, E., Monteiro, C.M.O., Rosa, L.S., Clemente, M.A., Arcoverde, A., 2009.

Evaluation of the acaricide activity of thymol on engorged and unengorged larvae

of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1808) (Acari: Ixodidae). Parasitol. Res.,

105, 495–497.

Dietrich, G., Dolan, M.C., Peralta-Cruz, J., Schimdt, J., Piesman, J., Eisen, R.J.,

Karchesy, J.J., 2006. Repellent activity of fractioned compounds from

Chamaecyparis nootkatensis essential oil against nymphal Ixodes scapularis

(Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 43, 957-961.

Drummond, R.O., Ernst, S.E., Trevino, J.L., Gladney, W.J., Graham, O.H., 1973.

Boophilus annulatus and Boophilus microplus: laboratory tests for insecticides. J.

Econ. Entomol. 66, 130-133, 1973.

FAO, 1984. Ticks and tickborne disease control: a practical field manual. Roma: FAO,

621 p.

Graf, J.F., Gogolewski, R., Leach-Bing, N., Sabatini, G.A., Molento, M.B., Bordin, E.

L., Arantes, G. J., 2004 .Tick control: An industry point of view. Parasitol. 129,

427-442.

Leite, R.C., 1988. Boophilus microplus (Canestrini, 1887): susceptibility, current and

retrospective usage of acaricides in lands from baixada do Grande-Rio and Rio de

47

Janeiro physiogeographic regions. An epidemiological approach. Belo Horizonte:

UFMG, 151 p. (Thesis – Doctor Degree on preventive veterinary medicine).

Madzimure, J., Nyahangare, E.T.N., Hamudikuwanda, H., Hove, T., Stevenson, P.C.,

Belmain, S.R., Mvumi, B.M., 2011. Acaricidal efficacy against cattle ticks and

acute oral toxicity of Lippia javanica (Burm F.) Spreng. Trop Anim Health Prod

43, 481–489

Mendes, A.S., Daemon, E., Monteiro, C.M.O., Maturano, R., Brito, F.C., Massoni, T.,

2011. Acaricidal activity of thymol on larvae and nymphs of Amblyomma

cajennense (Acari: Ixodidae). Vet. Parasitol. 183, 136–139.

Novelino, A.M.S., Daemon, E., Soares, G.L.G., 2007. Evaluation of acaricide effect of

thymol, menthol, salycilic acid and methyl salycilate on Boophilus microplus

(Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) larvae. Parasitol Res 101, 809–811.

Panella, N.A., Dolan, M.C., Karchesy, J.J., Xiong, Y., Peralta-Cruz, J., Khasawneh, M.,

Montenieri, J.A., Maupin, G.O., 2005. Use of novel compounds for pest control:

insecticidal and acaricidal activity of essential oil components from heartwood of

Alaska yellow cedar. J. Med. Entomol., 42, 352-358

Panella, N.A., Karchesy, J., Maupin, G.O., Malan, J.C., Piesman, J., 1997.

Susceptibility of immature Ixodes scapularis (Acari:Ixodidae) to plant-derived

acaricides. J. Med. Entomol., 34, 340-345.

Pessoa, O.D.L., Carvalho, C.B.M., Silvestre, J.O.V.L., Lima, M.C.L., Neto, R.M.,

Matos, F.J.A., Lemos, T.L.G., 2005. Antibacterial activity of the essencial oil from

Lippia aff. gracillis. Fitoter., 76, 712-714.

Scolarick, M.G., Daemon, E., Monteiro, C.M.O., Maturano, R. 2012. Enhancing the

acaricide effect of thymol on larvae of the cattle tick Rhipicephalus microplus

(Acari: Ixodidae) by solubilization in ethanol. Parasitol Res., 110, 645–648

48

Stone, B.F., Haydock, K.P., 1962. A method for measuring the acaricide susceptibility

of the cattle B.microplus (Can.). Bull. Entomol. Res., 53, 563-578.

United States Office of the Federal Register, 2009. Code of federal regulations. 21, food

and drugs, part 170-199. Washington.

Velazquez, M. M., Herrera, G. A. C., Cruz, R. R., Fernandez, J. M. F., Ramirez, J.L.,

Gutierrez.,R. H., Cervantes, E. C. L., 2011, Acaricidal effect and chemical

composition of essential oils extracted from Cuminum cyminum, Pimenta dioica

and Ocimum basilicum against the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus

(Acari: Ixodidae). Parasitol Res. 108, 481–487.

Vandendool, H., Kratz, P.D., 1963. A generalization of retention index system including

linear temperature programmed gas–liquid partition chromatography. J.

Chromatogr. 11, 463–471.

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Tabela 1 Genótipos de Lippia gracilis mantidos no BAG de plantas medicinais da UFS e utilizados no presente estudo. Código Local de origem Dados geográficos da origem No Voucher Herbário UFS LGRA-106 Tomar do Geru – SE 11 19' 16,7'' S; 37 55' 09,2'' W 14733 LGRA-108 Tomar do Geru – SE 11 19' 22,4" S; 37 55' 12,6" W 14734 LGRA-109 Tomar do Geru – SE 11 19' 20,7" S; 37 55' 16,9" W 14735 LGRA-201 Rio Real – BA 11 23' 38,7" S; 38 00' 54,1" W 14736

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Tabela 2 Composição química dos óleos essenciais de quatro genótipos de L. gracilis Constituintes IRR LGRA106 LGRA108 LGRA109 LGRA201 α-Thujeno 924 0,45c 0,98 b 0,85b 1,37 a α-Pineno 931 0,28 b 0,38 a 0,26 b 0,37 a

-Pineno 971 0,10 a 0,14 a 0,0 b 0,12 a Mirceno 976 2,74 a 2,05 b 2,06 b 3,20 a α-Terpineno 988 1,00 d 1,79 c 1,82b 3,01 a p-Cimeno 1016 6,70 b 11,75 a 13,02 a 13,74 a Limoneno 1023 0,36 b 0,38 b 0,21 c 0,44 a 1.8 Cineol 1028 3,92 a 2,10 b 0,0 d 1,50 c -Terpineno 1031 3,66 c 8,81 b 8,55 b 21,11a

Linalol 1057 0,41 b 0,44 b 0,79 a 0,72 a Terpinen-4-ol 1100 0,57 a 0,59 a 0,61 a 0,57 a Metil timol 1180 8,32 a 5,85 b 4,77 c 0,19 d Timol 1195 59,26 a 3,65 c 3,20 c 5,78 b Carvacrol 1228 0,88 c 47,10 a 48,99 a 35,28 b

-Cariofileno 1291 8,57 a 3,92 d 7,80 b 6,26 c α-Humuleno 1298 0,47 b 1,00 a 0,38 b 0,49 b Viridifloreno 1418 0,15 d 1,02 a 0,84 b 0,51 c Biciclogermacreno 1432 0,07 d 1,95 a 0,55 c 1,05 b Spathulenol 1437 0,19 c 1,36 a 0,58 b 0,69 b Óxido de cariofileno 1454 0,74 a 0,62 a 0,71 a 0,82 a Monoterpenos (%) 88,65 86,01 85,13 87,04 Sesquiterpenos (%) 10,19 9,87 10,86 9,82 Total (%) 98,17 95,88 96,29 92,02 Teor de óleo essencial (%) 1,42 b 2,17 a 1,85 b 2,37 a Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem pelo teste de Scott & Knott (p <0.05).

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Tabela 3 Concentração letal para 50 e 90% das larvas e fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus com respectivo Intervalo de confiança a 95% dos genótipos de L. gracilis.

Genótipo CL50 (mg/mL) LC CL90 (mg/mL) LC R2 Larvas

LGRA-201 1.31 1.22 - 1.42 2.18 1.96 - 2.43 0.947 LGRA-106 2.23 1.21 - 4.13 3.21 2.64 - 3.91 0.830 LGRA-109 3.21 3.08 - 3.34 6.02 5.25 - 6.90 0.939 LGRA-108 4.34 1.83 - 10.32 5.26 4.22 - 6.56 0.871 Carvacrola 0.22 0.8 – 0.5 0.89 0.51 – 0.1 0.781

Timola 3.86 3.25 - 4.57 6.89 5.88 - 8.06 0.824 Fêmeas ingurgitadas

LGRA-201 6.55 6.25 - 6.88 8.87 7.39 - 10.66 0.999 LGRA-106 4.66 4.13 - 5.27 11.32 9.06 - 14.13 0.997 LGRA-109 7.15 2.69 - 19.00 12.82 6.18 - 26.57 0.960 LGRA-108 9.21 4.92 - 17.24 20.01 12.73 - 31.43 0.923 Carvacrol 4.46 4.32 - 4.60 5.71 5.36 - 6.09 0.995

Timol 5.50 5.41 - 5.58 6.01 5.88 - 6.15 0.998 CL50 = Concentração em que 50% de larvas ou fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus morrem; CL90 = Concentração em que 90% de larvas ou fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus morrem; LC = Limite de confiança para 95% de probabilidade. R2 = Regressão a Produto comercial.

52

CAPÍTULO 3

Atividade fungicida de óleo essencial de genótipos de Lippia gracilis Schauer em

Thielaviopis paradoxa.

Elizangela M.O. Cruza, Dulce R.N. Warwickb, Jessika A.O. Pintoa, Juliana O. Meloa,

Maria F. Arrigoni-Blanka, Péricles B. Alvesc, Patrícia Cerpe, Rogéria Nunes, Arie F.

Banka*

aDepartamento de Engenharia Agronômica, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N,

CEP 49100-000, São Cristóvão-SE,Brasil

bEmbrapa Tabuleiros Costeiros. Av. Beira Mar, 1300. 13 de Julho, Aracaju-SE

c Departamento Química, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N, CEP 49100-000,

São Cristóvão-SE,Brasil

Abstract

The aim of this study was to evaluate the effect of essential oils of genotypes of L.

gracilis, its major components thymol and carvacrol and complex of inclusion of the

essential oil in ciclodextrin, on Thielaviopis paradoxa. To test the antifungal activity,

the essential oil in different concentrations was added to BDA medium flux with a

maximum temperature of 45 °C. Each plate was inoculated in the center, with 5 mm

diameter disk containing mycelium culture T. paradoxa. The plates were incubated at a

temperature between 25-28° C under a photoperiod of 12 hours. The assessments made

daily, until one reaches the treatment foverall diameter petri dish. The essential oil of L.

gracilis has high fungicidal activity, and the genotype LGRA109 demonstrated greater

efficiency.

Keywords: L. gracilis, carvacrol, thymol, ciclodextrina, filamentous fungi

_______________________________

53

* Autor correspondente: tel.:+ 55 79 2105-6981; fax: + 55 79 2105-6494 Email: [email protected] (A.F. Blank) Artigo a ser submetido para publicação no periódico Tropical Plant Patology

Introdução

A cultura do coqueiro é uma atividade agrícola de grande importância em mais de

86 países, gerando emprego, renda e alimentação para a população (Cuenca et al.,

2002). É responsável, no Brasil, por cerca de 500 mil empregos diretos, além de

milhares de empregos indiretos para pessoas envolvidas ao longo da cadeia produtiva.

Somente na região Nordeste, a cocoicultura gera emprego e renda para mais de 220.000

produtores, com aproximadamente 85% representados por produtores familiares e com

propriedades inferiores a 10 ha (Cuenca, 2007).

Em decorrência da rápida expansão das áreas de plantio, especialmente para

exploração do coco verde para o consumo da água, tem sido também observado um

aumento da incidência de doenças, especialmente daquelas consideradas de importância

secundária ou até mesmo desconhecidas no Brasil (Freire et al., 2010).

A resinose do coqueiro ou “stem bleeding”, causada pelo fungo Thielaviopsis

paradoxa (De Seynes) Höhn, tornou-se o principal problema na cultura do coqueiro no

estado de Sergipe, devido a sua rápida disseminação e consequente queda de produção.

T. paradoxa é a fase imperfeita ou assexual do patógeno, sendo responsável pela

produção de dois tipos de esporos, os endoconídeos e os clamidósporos. Em sua fase

sexual ou perfeita é denominado Ceratocystis paradoxa (Dade) C. Moreau, (1952)

(Ascomycetes, Microascales, família Ophiostomatacea), fase esta raramente encontrada

na natureza e até o momento não verificado nas condições nacionais (Costa e Carvalho

et al., 2011).

Em levantamento realizado no Estado de Sergipe, foi evidenciada a presença da

resinose em quase metade das propriedades da região, onde na grande maioria dos

54

casos, as plantas atingidas já se encontravam em estágio avançado da doença, levando a

morte da planta. A situação na região é preocupante pela forma como a doença se

estabeleceu e como vem se disseminando, não existindo relatos na literatura de produtos

químicos capazes de curar uma planta em estágio avançado da doença ou de conter a

sua disseminação (Costa e Carvalho, 2011).

Dentre as medidas de controle atualmente utilizadas, podem ser citadas: raspagem e

pincelamento com piche ou alcatrão vegetal da região lesionada do estipe de plantas

infectadas; erradicação e queima das plantas severamente infectadas; monitoramento e

controle do Rhynchophorus palmarum, principal inseto transmissor da resinose, através

do uso de armadilhas atrativas (Costa e Carvalho et al., 2011).

No Brasil, dentre as plantas do semi-árido nordestino conhecidas como alecrins,

estão várias espécies do gênero Lippia (Verbenaceae). Lippia gracilis Schauer,

popularmente conhecida como alecrim-de-tabuleiro ou alecrim-da-chapada, é um

arbusto caducifólio, ramificado, de até 2 m de altura (Lorenzi e Matos, 2002), que

produz óleo essencial nas folhas, com atividades antimicrobiana e carrapaticida, devido

à presença de monoterpenos fenólicos timol e carvacrol (Albuquerque et al., 2006;

Costa e Carvalho et al., 2013; Cruz et al., 2013).

A atividade antimicrobiana desenvolvida por óleos essenciais tem sido atribuída

a pequenos terpenóides e compostos fenólicos como timol, carvona, carvacrol, mentol e

muroleno, que também na forma pura exibem atividade antifúngica. Apesar dos

mecanismos de ação serem pouco caracterizados, parecem estar associados ao caráter

lipofílico dos compostos, havendo um acúmulo em membranas e perda de energia pelas

células microbianas, uma vez que determinados terpenos presentes nos óleos essenciais

são capazes de tornarem a membrana celular do fungo permeável, causando o

vazamento de seu conteúdo. Pesquisas desenvolvidas utilizando-se extratos brutos ou

55

óleos essenciais obtidos de plantas medicinais têm mostrado um grande potencial no

controle de fitopatógenos, tanto pela ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento

micelial e a germinação de esporos, quanto pela indução de fitoalexinas, indicando a

presença de compostos com características elicitoras (Knaak e Fiúza, 2010).

A -ciclodextrina é resultante da quebra do amido pela enzima glucosiltransferase

(CGT), formando compostos cíclicos com ligações glicosídicas α-(1,4), formadas de sete

unidades de glicopiranose, em forma de cone truncado com cavidade no centro. As

ligações glicosídicas estão voltadas para o centro da cavidade, apresentando um caráter

de base de Lewis, proporcionando a -ciclodextrina um caráter hidrofóbico ou semi-

polar. O complexo de inclusão usando a -ciclodextrina consiste em na substituição de

parte ou todas as moléculas de água da cavidade por moléculas cujas dimensões se

ajustem ao tamanho da mesma. A inclusão provoca uma melhora nas propriedades

físico-químicas das substancias, como aumento na solubilidade, proteção contra

degradação oxidativa, aquecimento, volatilização e sublimação, entre outras (Lima,

2005; Venturini et al., 2008).

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de óleos essenciais de

genótipos de L. gracilis, dos seus componentes majoritários carvacrol e timol e do

complexo de inclusão óleo essencial – ciclodextrina, em T. paradoxa.

Material e Métodos

Material vegetal

As coletas de folhas de sete genótipos de L. gracilis (Tabela 1) do Banco Ativo

de Germoplasma (BAG) de L. gracilis da Universidade Federal de Sergipe (UFS), que

conta com seis plantas de cada genótipo. Os tratos culturais despendidos são capinas

56

manuais, sempre que necessário, adubação com esterco bovino a cada três meses e

irrigação por microaspersão.

A desfolha foi feita manualmente e secagem foi realizada em estufa de secagem

com circulação de ar forçada a 40°C, por cinco dias.

Isolado de Thielaviopsis paradoxa Höhn

Fragmentos de tecido da raiz do coqueiro lesionados foram removidos das

margens da lesão, esterilizados superficialmente com etanol a 70%, seguido por 45

segundos de hipoclorito de sódio, 0,65% e plaqueadas em placas de Petri (9 mm de

diâmetro) com agar de batata-dextrose. As culturas foram incubadas rotineiramente

(23-25 º C). Um fragmento de 5 mm de diâmetro retirados da margem da cultura foi

transferido para purificação em BDA. A morfologia dos isolados foi típica de T.

paradoxa. O fungo tinha micélio marrom pálido e conidióforos retos até 250 µm de

comprimento. Cada um tinha uma phialide terminal. Os conídios eram incolores,

cilíndricos para castanho claro (7-15 x 2,5-6 m). Os clamidósporos foram encontrados

em cadeias, lisos, castanho-oval pálido ao castanho-preto (9-25 x 6-15 mm).

A patogenicidade do fungo foi testada pela inoculação de três anos de idade, de

folhas coco anão verde em uma casa de vegetação. Inoculo consistiu de 5mm de

diâmetro de a partir de uma cultura de sete dias, cultivadas em BDA. Os fragmentos de

BDA foram colocadas em troncos saudáveis, ráquis e folíolos que eram intactos ou

feridos. As feridas foram feitas com um furador de cortiça estéril. Os locais das

inoculações foram embrulhados com fita plástica para evitar a dessecação. O

experimento foi realizado com três repetições. Os controles receberam BDA estéril. O

isolado foi depositado na Coleção de Fungos Maria Menezes Recife PE, como isolado

CMM 1588.

57

Extração do óleo essencial

A extração do óleo essencial foi realizada no Laboratório de Fitotecnia da UFS,

através de hidrodestilação com aparelho Clevenger modificado. Cada amostra foi

composta por 75g de folhas secas, que foram destiladas por 140 mim (Ehlert et al.,

2006).

O óleo essencial foi estocado a -20 ± 2°C em frascos âmbar até a sua análise

química. O teor de óleo essencial foi calculado e expresso em percentagem (v.p). Os

padrões carvacrol e timol foram obtidos da Sigma-Aldrich.

Complexo de inclusão do óleo essencial em ciclodextrina

O complexo de inclusão óleo essencial de L. gracilis e ciclodextrina (Sigma-

Alderich) foi obtido por meio da malaxagem, que consiste em formar uma pasta a partir

da adição de quantidade suficiente de líquido (água) para umedecer a mistura em pó de

óleo essencial e ciclodextrina (Cunha-Filho e Sá-Barreto, 2007).

O complexo de inclusão foi homogeneizada manualmente em um gral contendo

5g de ciclodextrina . Após, foi adicionado 0,66 g de óleo essencial, razão molar 1:1

(baseado no peso molecular do carvacrol), a amostra foi secada em dessecador até a

formação de um filme seco. Em seguida, foram trituradas e acondicionadas em frascos

plásticos.

Para a confirmação da inclusão do óleo essencial na ciclodextrina foi feita a

extração do óleo total dos complexos utilizando água destilada 8 ml, hexano 4 ml e 0,2 g

do complexo de inclusão, foram colocados em um Becker sob agitação e aquecimento

constante a 85 ºC por 20 mim. A suspensão foi filtrada e o resíduo lavado com hexano

10 ml, três vezes. Depois a amostra foi concentrada em rota evaporador. Adicionou-se,

hexano 1 mL e o padrão interno mentol 2mg a amostra concentrada e analisado por

58

CG/EM. O total de óleo corresponderá à quantidade de óleo essencial complexado na

cavidade da -ciclodextrina mais o óleo adsorvido na superfície da mesma. Também foi

realizada a extração do óleo adsorvido à superfície da ciclodextrina foram determinados

através de 3 g do complexo de inclusão em 20 mL de hexano, sob agitação por 20min.

A suspensão foi filtrada e o resíduo lavado com hexano 10 ml, três vezes, a amostra foi

concentrado em rota evaporador e após, adicionou-se hexano 1 mL e o padrão interno

mentol 2mg a amostra concentrada e analisado por CG/EM. A diferença entre o óleo

total e o óleo adsorvido na superfície foi utilizado para determinar o teor de inclusão

(Marreto et al., 2008).

Análise química dos óleos essenciais

As análises de qumíca do óleo essencial foram realizadas no laboratorio de

Cromatografia do Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe,

utilizando um CG-EM/DIC (GC-2010 Plus; CGEM-QP2010 Ultra, Shimadzu

Corporation, Kyoto, Japão) equipado com um amostrador automático AOC-20i

(Shimadzu). As separações foram realizadas usando uma coluna capilar de sílica

fundida Rtx®-5MS Restek (polissiloxano 5%-difenil-95%-dimetil) de 30 m x 0,25 mm

de diâmetro interno(d.i.), 0,25-m de espessura de filme, em um fluxo constante de

hélio (99,999%) com taxa de 1,2 mL.min-1. Foi utilizado um volume de injecção de 0,5

uL (5 mg.mL-1), com uma razão de split de 1:10. A programação de temperatura do

forno utilizada foi a partir de 50 ° C (isoterma durante 1,5 min), com um aumento de 4 °

C / min, à 200 ° C, em seguida, a 10 ° C / min até 250 ° C, terminando com uma

isoterma de 5 min a 250 °C.

Os dados de EM e DIC foram simultaneamente adquiridas empregando um

sistema de separação de detector; a razão de separação de escoamento foi de 4:1 (EM:

59

DIC). Um tubo restritor de 0,62 m x 0,15 milímetros d.i.. (coluna capilar) foi usado para

ligar o divisor para o detector EM; um tubo restritor de 0,74 m x 0,22 mm d.i. foi usado

para ligar o divisor para o detector DIC. A temperatura do injetor foi de 250 °C e a

temperatura da fonte de íons foi de 200 ° C. Os espectros de massa foram gerados à 70

eV; uma velocidade de varrimento de verificação 0,3 s , e os fragmentos detectados no

intervalo de 40-350 Da. A temperatura do DIC foi ajustada para 250 ºC, e os

suprimentos de gás para o DIC foram ar sintético, hidrogénio, hélio em taxas de fluxo

de 30, 300 e 30 mL.min-1, respectivamente. A quantificação de cada constituinte foi

estimada por normalização da área do pico gerado no DIC (%). As concentrações dos

compostos foram calculados a partir das áreas dos picos de CG e foram dispostos por

ordem de eluição de CG.

A identificação dos constituintes foi realizada com base na comparação dos

índices de retenção da literatura (ADAMS, 2007). Para o índice de retenção foi

utilizando a equação de Van den Dool e Kratz (1963) em relação a uma série homóloga

de n-alcanos (nC9- nC18). Também foram utilizadas três bibliotecas WILEY8,

NIST107 e NIST21, do equipamento, que permitem a comparação dos dados dos

espectros com aqueles constantes das bibliotecas utilizando um índice de similaridade

de 80%.

Teste de atividade fungicida

Os bioensaios foram realizados no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa

Tabuleiros Costeiros, e testou-se as concentrações de 0,18; 0,45; 0,91 e 2,75 mg.mL-1 de

óleos essenciais de L. gracilis e os compostos majoritários timol (Sigma) e carvacrol

(Aldrich). Estas substâncias foram solubilizadas em DMSO a 1% e homogeneizadas em

meio de cultura BDA (Agar Batata Dextrose, HIMEDIA). O controle consistiu do disco

60

do fungo cultivado em meio BDA em placas de Petri de 9 cm de diâmetro. Cada placa

foi inoculada, no centro, com um disco de 5 mm de diâmetro, contendo micélios da

cultura monospórica de T. paradoxa. As placas foram incubadas a uma temperatura

entre 25-28ºC sob fotoperíodo de 12h. As avaliações foram realizadas diariamente,

através de medições do diâmetro das colônias em dois eixos ortogonais (média das duas

medições diametricamente opostas), iniciado 24 h após adição do inóculo nas placas e

sempre no mesmo horário, até que um dos tratamentos atingisse o diâmetro total da

placa de Petri. Após a realização das avaliações, calculou-se a porcentagem de inibição

do crescimento do fungo dos tratamentos em relação à testemunha, utilizando-se a

fórmula:

PIC = (diâmetro da testemunha – diâmetro do tratamento)/diâmetro da testemunha) x

100

Para avaliar a quantidade de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por

tratamento foram adicionados 10 mL da solução água mais Tween20 a 1% na superfície

das colônias e raspadas com auxílio da alça de Drigalski. Os esporos das placas foram

filtrados em gazes e resuspensos em 50 mL de água. Para cada suspensão de esporos,

três alíquotas de 0,1 mL foram transferidas, separadamente, para uma lâmina de

hemacitômetro, onde se procede a contagem de esporos através do microscópio óptico.

Os dados médios das três contagens foram transformados em número de conídios por

cm2 de colônia, considerando-se a quantidade de conídios produzidos na área tomada

pela colônia em cada placa. Os dados obtidos nesse estudo foram submetidos à análise

de variância, e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade

sendo esta realizada utilizando-se o programa SISVAR.

61

As análises das atividades fungistática e fungicida foram realizadas com óleo

essencial de sete diferentes genótipos de L. gracilis, timol (Sigma), carvacrol (Aldrich)

e o complexo de inclusão de óleo essencial de L. gracillis e -Ciclodextrina foram

utilizados nas concentrações que variam de 0,20 a 3mg.mL-1, foram primeiramente

adicionados ao meio BDA fundente com temperatura máxima de 45ºC, e em seguida

vertido em placas de Petri de 9cm de diâmetro. Cada placa foi inoculada, no centro, com

um disco de 5mm de diâmetro contendo micélios da cultura monospórica de T.

paradoxa. As placas foram incubadas a uma temperatura entre 25-28ºC durante sete

dias.

Foi considerada Concentração Inibitória Mínima (CIM) a menor concentração

na qual não houve crescimento visível do fungo após sete dias de tratamento com óleo

essencial ou um dos majoritários ou do complexo de inclusão. As placas com

concentrações que não houve crescimento do fungo foram repicadas em meio BDA

puro para determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM), ou seja, onde o

fungo mesmo sem a presença do óleo essencial, um dos majoritários ou do complexo de

inclusão não se desenvolveu após sete dias, o qual foi considerado morto. Todos os

experimentos foram realizados com três repetições. Como testemunhas foram usadas

meio BDA puro e meio BDA mais -Ciclodextrina pura.

Resultados e Discussão

No presente estudo foram identificados 19 compostos químicos no óleo

essencial de L. gracilis (Tabela 2). Destes mais de 95% foram terpenos (mono e

sesquiterpenos), tendo como componente majoritário o timol para o genótipo LGRA106

e carvacrol para os demais genótipos. Outros compostos encontrados em percentagens

62

representativas foram -cimeno, -terpineno e -cariofileno. Na análise química do

complexo de inclusão (Tabela 3) foram encontrados componentes similares ao do óleo

puro em concentrações um pouco mais baixa, a exemplo do carvacrol (46,76%), p-

cimeno (10,7%), -terpineno (13,85%) e timol (4,99%). O mentol foi usado como

padrão interno nas analises de CG/EM.

As concentrações 0,45; 0,91 e 2,75 mg.mL-1 de todos os genótipos de L. gracilis

inibiram completamente o desenvolvimento do patógeno T. paradoxa, correspondendo

a uma porcentagem de inibição do crescimento micelial de 100% ocasionando uma forte

ação fungicida nessas três concentrações (Tabela 4). Para a concentração de 0,18

mg.mL-1 houve uma maior variação na atividade dos genótipos estudados, sendo que

para LGRA106, LGRA107, LGRA110, LGRA201 e LGRA202 houve, em média, uma

inibição micelial acima de 50% em contrapartida os genótipos LGRA108 e LGRA109

apresentaram uma baixa atividade fungistática, nesta mesma concentração, ficando

abaixo dos 20% de inibição.

Trabalhos anteriores indicavam a forte atividade antimicrobiana do óleo

essencial de L. gracilis, no controle do crescimento micelial de alguns fungos

contaminantes de laboratório utilizando óleos essenciais L. gracilis na concentração de

114,58 mg.mL-1, observou-se que está espécie mostrou-se eficiente na inibição do

crescimento micelial de todos os fungos avaliados (Oliveira et al., 2008). Em outro

estudo realizado in vitro contra Geotrichum candidum; Trichoderma viride; Torula

herbarum; Paecillomyce ssp.; Pseudomonas aeruginens; Aspergillus nidulans;

Aspergillus flavus; Fusiococcum sp. houve inibição total na concentração mínima de 42

mg.mL-1do óleo essencial de L. gracilis (Albuquerque et al., 2006).

A concentração de 0,18 mg.mL-1de óleo essencial foi suficiente para reduzir

significativamente o número de esporos de T. paradoxa quando comparado com o

63

controle. Observou-se também que os componentes majoritários presentes nos óleos

essenciais de L. gracilis os monoterpenos timol e carvacrol inibiram completamente a

produção de conídios em todas as concentrações avaliadas (Tabela 5). A ação

antifúngica do óleo de L. gracilis deve-se a presença do timol e carvacrol, que já

apresentaram ação comprovada contra outros tipos de fungos como demonstrados na

patente PI090503-5 e nos trabalhos de Gomes et al., (2011) e Oliveira et al, (2008). O

mecanismo de ação dessas substâncias baseia-se no seu caráter lipofílico que interage

facilmente com a membrana celular, provocando distorção na sua estrutura física,

causando expansão e, consequentemente, desestabilidade na membrana, modificando a

sua permeabilidade, desnaturando proteínas essenciais e enzimas ligadas a respiração

celular, além de alterar a força próton motora por meio de variações no pH e no

potencial elétrico (Cavalcanti et al., 2011).

De acordo com Aligiannis et al. (2001) são considerados como de forte atividade

antimicrobiana óleos ou extratos que apresentaram CIM de até 0,5 mg.mL-1; de

atividade moderada, os que apresentaram CIM entre 0,6 e 1,5 mg.mL-1; e de fraca

atividade os que apresentaram CIM acima de 1,6 mg.mL-1. Portanto o óleo essencial de

L. gracilis e seus componentes majoritários (Tabela 6) têm forte atividade fungistática

uma vez que varia entre 0,18 e 0,27 mg.mL-1, podendo inibir com alta eficiência o

agente causador da resinose.

O óleo essencial de várias espécies de citros apresentou CIM de 0,56 a 1,13

mg.mL-1para vários tipos de Aspergilus e Penicilium (Rammanee e Hongpattarakere,

2011). Em trabalho como óleo essencial de Callistemonlance olatusa CIM foi de 0,68

mg.mL-1sobre fungos filamentosos isolados de grão de bico (Shukla et al., 2012).

A CFM de T. paradoxa foi encontrada entre as concentrações de 0,89 a 0,80

mg.mL-1para os óleos essenciais e 0,26 mg.mL-1 para o carvacrol, e 0,35 mg.mL-1 para o

64

timol (Tabela 5). Esses resultados indicam o carvacrol como um dos principais

compostos responsáveis pela ação fungicida dos óleos essenciais de L. gracilis. O

genótipo LGRA109 apresentou a menor CIM (0,23 mg.mL-1). Além da forte atividade

antimicrobiana ser bem justificada pela presença dos marcadores químicos timol e

carvacrol, também podemos sugerir que esta forte atividade pode estar associada a

presença de compostos como -cimeno, -terpineno e -cariofileno, que são

comprovadamente fungicidas (Pascual et al. 2001).

O complexo de inclusão apresentou atividade superior a do óleo essencial puro

uma vez que apresentou atividade fungistática com CIM de 0,22 mg.mL-1 (Tabela 6),

demonstrando atividade contra o fungo causador da resinose, podendo ser a base para o

desenvolvimento de um produto comercial para o tratamento desta doença.

Estudos recentes com complexos de inclusão com substancias organicas e

medicamentos já conhecidos demonstram o grande potencial do uso desse metodo. Uma

vez que favorece sua disponibilidade, sem o risco da degradação pelo ambiente e a

facilidade de aplicação. Fernandes (2008) observou esses aspectos com o complexo de

inclusão do oleo essencial de L. sidoides no combate a fungos e bacterias, com

resultados promissores. Ribeiro (2008), testando o mecanismo de ação de complexos de

inclusão em celulas humanas confirma sua eficiencia e sua segurança na liberação

gradativa do matreial incluido na celula alvo.

A testemunha com a -ciclodextrina pura não apresentou diferenças da

testemunha com BDA puro quanto o crescimento e o numero de esporos produzidos na

colônia de T. paradoxa.

65

Conclusão

O óleo essencial de L. gracilis tem potencial antifúngico para o controle da

resinose do coqueiro. Os terpenos avaliados timol e carvacrol, principais compostos dos

óleos essenciais de L. gracilis, também apresentaram atividade fungicida. O complexo

de inclusão óleo essencial em ciclodextrina é uma alternativa no controle de T.

paradoxa no coqueiro.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq, RENORBIO e FAPITEC/Se pelo suporte

financeiro.

Referências bibliográficas

Adams RP (2007) Identification of Essential Oil Components by Gas

chromatography/Mass Spectroscopy. Chicago. Allured Publ. Corp., Carol Stream,

Albuquerque CC, Camara TR, Mariano RLR, Willadino L, Júnior CM, Ulisses C (2006)

Antimicrobial Action of the Essential Oil of Lippia gracilis Schauer. Brazilian Archives

of Biology and Technology 49 (4): 527-535.

Aligiannis N, Kalpotzakis E, Mitaku S, Chinou IB (2001) Composition and

antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. Journal of

Agricultural and Food Chemistry 40: 4168-4170.

Cavalcanti YW, Almeida LFD, Padilha WWN (2011) Atividade Antifúngica de Três

Óleos Essenciais Sobre Cepas de Candida. Revista de Odontologia

do Brasil Central 20 (52): 68-73.

66

Calvacanti VO (2006) Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracillis

Shauer, UFP (Dissertação de Mestrado). 96p.

Costa e Carvalho RR, Laranjeira D, Carvalho Filho JLS, Souza PE, Blank AF, Alves

PB, Jesus HCR, Warwick DRN (2013) In vitro activity of essential oils of Lippia

sidoides and Lippia gracilis and their major chemical components against Thielaviopsis

paradoxa, causal agent of stem bleeding in coconut palms. Química Nova 36 (2): 241-

244.

Costa e Carvalho RR (2011) Epidemiologia e controle da resinose do coqueiro e

transmissibilade por meio de vetor. Lavras: UFLA (Tese de doutorado em

Fitopatologia). 87p.

Costa e Carvalho RR, Warwick DRN, Souza PE, Carvalho Filho JLS (2011)

Longevidade de Thielaviopsis paradoxa , agente causal da resinose do coqueiro em

Rhynchophorus palmarum. Scientia Plena 7 (4): 31-37.

Cuenca MAG (2007) A cultura do coqueiro: importância econômica da cocoicultura no

Brasil. Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros. Disponível em:

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Coco/ACulturadoCoqueiro/i

mportancia.htm.

Cuenca MAG, Resende JM, Saggin Junior OJ, Reis CS (2002) Mercado brasileiro do

coco: situação atual e perspectivas. In: Aragão WM Coco pós-colheita. Aracaju.

Embrapa Tabuleiros Costeiros. 76p

Cunha-Filho MSS, Sá-Barreto LCL (2007) Utilização de ciclodextrinas na formação de

complexos de inclusão de interesse farmacêutico. Revista de Ciências Farmacêuticas

Básica e Aplicada 28, (1): 1-9

67

Ehlert PAD, Blank AF, Arrigoni-Blank MF, Paula JWA, Campos DA, Alviano CS

(2006). Tempo de hidrodestilação na extração de óleo essencial de sete espécies de

plantas medicinais. Revista Brasileira de Plantas Medicinais8: 79-82

Fernandes LP (2008) Desenvolvimento tecnológico de produtos particulados obtidos a

partir de L. sidoides pela técnica de spray drying e avaliação das propriedades

antifúngicas. Ribeirão Preto: USP (Tese de doutorado em Ciências Farmacêuticas) 24p.

Freire FCO, Martins MVV (2010) Confirmação da ocorrência do sangramento do caule

do coqueiro no Estado do Ceará. Essentia 12(1): 31-39.

Fontenelle ROS, Morais SM, Brito EHS, Kerntopf MR, Brilhante RSN, Cordeiro RA.

(2007) Chemical composition, toxicological aspects and antifungal activity of essential

oil from Lippia sidoides Cham. Jornual Antimicrobial Chemotherapy 59 (3): 934-940.

Gomes SVF, Nogueira PCL, Moraes VRS (2011) Aspectos químicos e biológicos do

gênero Lippia enfatizando Lippia gracilis Schauer. Eclética Química, 36 (1): 64-77.

Knaak N, Fiuza L (2010) Potencial dos óleos essenciais de plantas no controle de

insetos e microrganismos. Neotropical Biology and Conservation 5 (2): 120-132.

Lima SMN (2005) Inclusão de moléculas anfifílicas em ciclodextrina-b em soluções

aquosas de electrólitos fortes. Lisboa: UA. 165p. (Tese de Doutorado em Química)

Lorenzi H, Matos FJA (2002) Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova

Odessa: Instituto Plantarum, 512p.

Marreto RN, Almeida ECV, Alves PB, Niculau ES, Nunes RS, Matos CRS, Araujo A AS

(2008) Thermal analysis and gas chromatography coupled mass spectrometry analyses

of hydroxypropil-b-cyclodextrin inclusion complex containing Lippia gracilis essential

oil. Thermochimica Acta. 475: 53-58.

68

Oliveira OR, Terao D, Carvalho ACPP, Innecco R, Albuquerque CC (2008) Efeito de

óleos essenciais de plantas do gênero Lippia sobre fungos contaminantes encontrados na

micropropagação de plantas. Revista Ciência Agronômica 39 (1): 94-100.

PI090503-5. Alysson Hoffimann Pegoraro (2011). Uso de timol e carvacrol em

formulações antimicrobianas naturais. Depósito no INPI: PI090503-5.

Pascual ME, Slowing K, Carretero E, Sánchez Mata D, Villar A (2001) Lippia:

traditional uses, chemistry and pharmacology: a review. Jornual of Ethnopharmacology

76: 201–214.

Pozzatti P, Loreto ES, Lopes PGM, Athayde ML, Santurio JM, Alves SH (2009)

Comparison of the susceptibilities of clinical isolates of Candida albicans and Candida

dubliniensisto essential oils. Mycoses 53 (1): 12-15.

Rammanee K, Hongpattarakere T (2011) Effects of tropical citrus essential oils on

growth, aflatoxin production, and ultrastructure alterations of Aspergillus flavus and

Aspergillu sparasiticus. Food Bioprocess Technology 4: 1050–1059.

Ribeiro AM (2008) Preparação, caracterização e aplicação de complexos de inclusão de

miconazol com metil- -ciclodextrina: administração bucal. Porto: UP (Dissertação de

Mestrado em Farmácia). 175p.

Souza EL, Lima EO, Freire KRL, Sousa CP (2005) Inhibitory Action of Some Essential

Oils and Phytochemicals on the Growth of Various Moulds Isolated From Foods.

Brazilian Archives of Biology and Technology 48 (2): 245-50.

Shukla R, Singh P, Prakash B (2012) Antifungal, aflatoxin inhibition and antioxidant

activity of Callistemon lanceolatus (Sm.) Sweet essential oil and its major component

1,8-cineole against fungalisolates from chickpea seeds. Food Control 25: 27-33.

Venturini CG, Nicolini J, Machado C, Machado VG (2008) Propriedades e aplicações

recentes das ciclodextrinas. Química Nova 31 (2): 360-368.

69

Van Den Dool H, Kratz, PHJ (1963). Chromatography 11, 463 p

70

Tabela 1. Genótipos de L. gracilis presentes no BAG de plantas medicinais da UFS

Código Local de origem Dados geográficos No Voucher Herbário UFS

LGRA106 Tomar do Geru – SE 11 19' 16,7'' S; 37 55' 09,2'' W 14733 LGRA107 Tomar do Geru – SE 11 19' 20,1" S; 37 55' 13,5" W 14737 LGRA108 Tomar do Geru – SE 11 19' 22,4" S; 37 55' 12,6" W 14734 LGRA109 Tomar do Geru – SE 11 19' 20,7" S; 37 55' 16,9" W 14735 LGRA110 Tomar do Geru – SE 11 19' 21,1" S; 37 55' 14,9" W 14732 LGRA201 Rio Real – BA 11 23' 38,7" S; 38 00' 54,1" W 14736 LGRA202 Rio Real – BA 11 23' 45,3" S; 38 00' 51,3" W 14731

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Tabela 2 - Composição química dos óleos essenciais de sete genótipos de L. gracilis

Constituinte IRR LGRA106 LGRA107 LGRA108 LGRA109 LGRA110 LGRA201 LGRA202 α-Thujeno 924 0,44 0,25 0,56 1,04 1,01 1,38 1,55 α-Pineno 931 0,21 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Mirceno 976 2,18 1,64 1,61 1,89 2,43 2,79 2,96

α Terpineno 988 0,94 1,39 1,33 1,94 1,56 2,92 2,01 p-Cimeno 1016 6,31 12,59 14,44 15,27 20,09 14,91 18,98 Limoneno 1023 0,50 0,34 0,58 0,26 0,35 0,48 0,45 1,8 Cineol 1028 3,80 1,33 3,21 0,0 2,32 2,06 0,0 -Terpineno 1031 4,37 8,89 6,68 8,89 6,98 18,88 9,55

Linalol 1057 0,44 1,03 0,22 0,66 0,44 0,14 0,62 Terpinen-4-ol 1100 0,66 0,81 0,75 0,70 0,72 0,66 0,64

Metil timol 1180 9,81 5,51 7,43 6,25 6,10 0,23 7,20 Timol 1195 60,47 5,43 3,09 3,23 3,51 6,29 3,68

Carvacrol 1228 0,38 48,15 46,10 49,25 48,70 35,02 40,29 -Cariofileno 1291 6,55 4,11 2,93 5,34 2,51 6,83 3,66

α-Humuleno 1298 0,34 0,55 0,71 0,0 0,0 0,55 0,29 Viridifloreno 1418 0,32 0,76 0,51 0,40 0,0 0,0 0,26

Biciclogermacreno 1432 0,39 0,97 1,63 0,54 0,0 1,28 0,65 Espathulenol 1437 0,0 1,08 1,85 1,04 0,39 0,65 0,78

Oxido de Cariofileno 1454 1,15 1,30 1,03 0,46 1,38 0,99 1,16 Monoterpenos (%) 90,51 87,36 86,00 89,38 94,21 85,76 87,93 Sesquiterpenos (%) 8,75 8,77 8,66 7,80 4,28 10,30 6,80

Total (%) 99,26 96,13 94,66 97,18 98,49 96,06 94,73 Teor de óleo essencial (%)

1,42 2,02 2,17 1,85 2,15 2,37 2,70

72

Tabela 3 - Caracterização do óleo essencial de Lippia gracilis e dos complexos de inclusão com -Ciclodextrina obtidos por malaxagem com água (MAH)

L. gracilis MAH TR (mim) Componentes % Óleo superf. Óleo total Óleo (%) complexado 7.267 α – Thujeno 0,83 0,24 0,54 0,30 7.483 α – Pineno 0,16 0,09 0,23 0,14 9.375 Miceno 2,39 0,74 1,63 0,89 10.367 α – Terpineno 2,27 0,64 1,55 0,91 10.642 p-Cimeno 10,70 4,33 10,16 5,83 10.783 Limoneno 0,19 0,49 0,40 -0,09 10.933 1,8 Cineol 0,22 0,73 1,44 0,71 11.883 ϒ – Terpineno 13,85 3,80 8,08 4,28 13.442 Linalol 0,60 0,08 0,30 0,22 16.392 Menthol (P.I) - 64,34 37,43 - 16.500 Terpineno-4-ol 0,56 0,33 0,62 0,29 20.492 Timol 4,99 1,08 2,58 1,50 20.808 Carvacrol 46,76 14,15 29,40 15,25 25.058 -Cariofileno 5,78 2,78 1,12 -1,66 25.683 Aromadendreno 0,48 0 0,09 0,09 26.258 α- Humuleno 0,75 0,29 0,08 -0,21 27.417 Viridifloreno 0,84 0,12 0,16 0,04 30.142 Spathulenol 0,67 1,60 0,20 -1,4 30.325 Oxido Cariofileno 0,51 0,98 0,15 -0,83 P.I = Padrão interno

73

Tabela 4. Percentual de inibição de colônia (PIC) de óleo essencial dos genótipos de L. gracilis, timol e carvacrol em T. paradoxa.

PIC* (%)

Genótipos 0,18 mg.mL-1 0,45 mg.mL-1 0,91 mg.mL-1 2,75 mg.mL-1

LGRA106 69,81 b 100 a 100 a 100 a

LGRA107 60,55 b 100 a 100 a 100 a

LGRA108 14,25 c 100 a 100 a 100 a

LGRA109 29,07 c 100 a 100 a 100 a

LGRA110 49,44 b 100 a 100 a 100 a

LGRA201 61,29 b 100 a 100 a 100 a

LGRA202 57,96 b 100 a 100 a 100 a

Timol1 100 a 100 a 100 a 100 a

Carvacrol1 100 a 100 a 100 a 100 a

Testemunha 0,0 d 0,0 b 0,0 b 0,0 b

CV (%) 10,62

*Média seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de média de Scott Knot a 5% de probabilidade 1Produto comercial

74

Tabela 5. Contagem de unidade formadora de colônia (UFC) de óleo essencial de genótipos de L. gracilis, timol e carvacrol em T. paradoxa.

UFC x 108

Genótipos 0,18 mg.mL-1 0,45 mg.mL-1 0,91 mg.mL-1 2,75 mg.mL-1

LGRA-106 0,86 e 0 b 0 b 0 b LGRA-107 2,26 d 0 b 0 b 0 b LGRA-108 5,10 b 0 b 0 b 0 b LGRA-109 3,90 c 0 b 0 b 0 b LGRA-110 1,16 e 0 b 0 b 0 b LGRA-201 1,10 e 0 b 0 b 0 b LGRA-202 1,16 e 0 b 0 b 0 b Timol1 0 f 0 b 0 b 0 b Carvacrol1 0 f 0 b 0 b 0 b Testemunha 11,73 a 11,73 a 11,73 a 11,73 a CV (%) 66,39

Média seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de média de Scott&Knot a 5% de probabilidade 1Produto comercial

75

Tabela 6. Concentração mínima inibitória (CIM) e concentração fungicida mínima (CFM) de óleos essenciais de L. gracilis, seus componentes majoritários timol e carvacrol e complexo de inclusão óleo essencial – ciclodextrina em T. paradoxa, valores expressos em mg.mL-1

Composto CIM* CFM* LGRA 106 0,24 0,82 LGRA 107 0,24 0,80 LGRA 108 0,26 0,86 LGRA 109 0,23 0,80 LGRA 110 0,24 0,89 LGRA 201 0,27 0,88 LGRA 202 0,25 0,80

Timola 0,18 0,35 Carvacrola 0,25 0,26

Complexo de inclusão 0,22 ND aProduto comercial ND- Não determinado * Média de três repetições

76

Anexos

77

Patente Depositada no INPI: PI0000221107712

RESUMO

FORMULAÇÃO CARRAPATICIDA, MÉTODO PARA REPELIR OU ELIMINAR CARRAPATOS COM USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE LIPPIA GRACILIS E/OU CARVACROL. A presente invenção refere-se à formulação carrapaticida, método para repelir ou eliminar carrapatos e aplicações em vertebrados terrestres ou em ambientes contendo óleo essencial de Lippia gracilis, como constituinte único ou misturado com outros óleos essenciais, ou isoladamente o cravacrol que é um de seus componentes majoritários.

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