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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS LANA NAIADHY SILVA SANTOS CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE MEMBRANA DE GELATINA CONTENDO TIMOL COMPLEXADO EM β- CICLODEXTRINA SÃO CRISTÓVÃO - SE 2019
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LANA NAIADHY SILVA SANTOS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
MEMBRANA DE GELATINA CONTENDO TIMOL COMPLEXADO EM β-
CICLODEXTRINA
SÃO CRISTÓVÃO - SE
2019
LANA NAIADHY SILVA SANTOS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
MEMBRANA DE GELATINA CONTENDO TIMOL COMPLEXADO EM β-
CICLODEXTRINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Sergipe como requisito à
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora: Profª. Drª. Mairim Russo Serafini
SÃO CRISTÓVÃO-SE
2019
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237c
Santos, Lana Naiadhy Silva
Caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana de
membrana de gelatina contendo timol complexado em β-
ciclodextrina / Lana Naiadhy Silva Santos; orientadora Mairim
Russo Serafini. – São Cristóvão, SE, 2019.
85 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de Sergipe, 2019.
1. Ciclodextrinas. 2. Timol. 3. Agentes antiinfecciosos. 4.
Boca – Infecções. 5. Ferimentos e lesões. I. Serafini, Mairim
Russo, orient. II. Título.
CDU 615.276:616.31-001
______________
LANA NAIADHY SILVA SANTOS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
MEMBRANA DE GELATINA CONTENDO TIMOL COMPLEXADO EM β-
CICLODEXTRINA
Dissertação apresentada ao Programa de Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe,
como requisito à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
São Cristóvão, / / .
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Mairim Russo Serafini, DSc
Departamento de Farmácia- UFS
Prof. Dr. Marcelo Calvacante Duarte, DSc
Departamento de Farmácia- UFS
Profª. Drª Salvana Priscylla Manso Costa, DSc Universidade Tiradentes- Unit
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, referências em sabedoria e
perseverança.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por conduzir minha vida e me conceder tantas oportunidades de
aprendizado. Sem nossa fé e nossas crenças não vamos a lugar algum. Obrigada Senhor!
Aos meus pais, meus maiores incentivadores, por acreditarem que sou capaz, por terem
plantado em meu coração sementes de persistência, coragem e amor incondicional. Obrigada
por jamais podarem meus sonhos, mesmo quando parecem ser impossíveis.
Ao meu namorado, amigo e confidente, Carlos Michel. Obrigada pelo incentivo,
encorajamento, ajuda e paciência durante a realização deste trabalho. Você foi uma surpresa
boa em minha vida e sem dúvidas a deixou muito melhor. Amo-te!
Agradeço, de forma especial, à minha orientadora Profa. Drª Mairim Russo Serafini, pela
paciência, compreensão e dedicação serei eternamente grata pela oportunidade ofertada!
Obrigada por cada palavra de incentivo e principalmente por acreditar em mim. Admiro-te
muito!
À todos os meus companheiros do LeFT, vocês tornaram mais prazeroso esse percurso.
Agradeço imensamente todo apoio que tive nessa segunda casa, em especial a Bruno, Gaby,
Yasmim, Guilherme, Paulinha, Lee, Eloísa, Taty, Clara, Lívia, Ana Maria e ao meu amigo Caio
pelos tantos momentos, que na vida pessoal e profissional dividimos. Sou imensamente grata
por tudo!!!
Aos amigos que fiz durante essa jornada UFS, em especial Samy, Wagner, Adolfo, Lícia, Iraê
e Alex que me acompanharam nesta experiência tão rica. Muito obrigada pela oportunidade de
conhecê-los e por toda ajuda!
Por fim, agradeço aos professores e funcionários do Departamento de Farmácia e do Programa
de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFS, por contribuírem com a minha
formação. À todos os colaboradores (universidades, laboratórios e professores). À CAPES e ao
CNPq pelo financiamento dos meus estudos e pela concessão da bolsa de mestrado.
Aos que não foram citados e que contribuíram de alguma para que este momento fosse possível,
muito obrigada!!!
RESUMO
Caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana de membrana de gelatina contendo
timol complexado em β-ciclodextrina. Lana Naiadhy Silva Santos, 2019.
O timol, um composto fenólico, da classe dos monoterpenos encontrado em diferentes espécies
vegetais, tem sido amplamente utilizado em produtos farmacêuticos convencionais devido a
vasta atividade farmacológica, incluindo a antimicrobiana. Esse composto apresenta elevada
volatilidade, solubilidade limitada em água, odor desagradável, fotossensibilidade e fácil
oxidação, o que dificulta sua aplicação terapêutica. Estudos utilizando o timol com a β-
ciclodextrina (β-CD) tem se mostrado promissores na melhoria das características físico-
químicas e farmacológicas desse composto. A combinação de sistemas mucoadesivos com
complexos de inclusão (CI) é uma estratégia interessante do ponto de vista farmacocinético
para o tratamento de lesões da cavidade oral. Esses sistemas promovem o contato prolongado
da droga com a mucosa, podendo melhorar significativamente o desempenho terapêutico de
muitas substâncias. Assim, o objetivo do presente estudo foi desenvolver, caracterizar e avaliar
a atividade antimicrobiana de membranas de gelatina contendo timol complexado em β-CD. As
membranas foram obtidas por meio da técnica de evaporação do solvente e os CI pelo método
de liofilização em razões molares de 1:1. A caracterização das membranas foi realizada através
das técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/
termogravimetria derivada (TG/DTG), difração de raios-x (DRX), espectroscopia de refletância
total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR/ATR), microscopia
eletrônica de varredura (MEV), capacidade de intumescimento e mucoadesão. A eficiência de
complexação (EC) foi analisada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), o
ensaio de viabilidade celular pelo método da redução da rezasurina em macrófagos J774-G8 e
a avaliação da atividade microbiológica foi realizada pelo método de difusão em disco com
Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Os resultados mostraram que adição dos CI nas
membranas melhorou a estabilidade térmica da gelatina, como também as taxas de
intumescimento (>60%) e os parâmentros de mucoadesão. Além disso, apresentaram atividade
antimicrobiana mostrando inibição do crescimento das cepas bacterianas testadas. Logo,
conclui-se a partir dos resultados obtidos, que os sistemas mucoadesivos contendo complexos
de inclusão de timol podem ser promissores no tratamento de lesões infecciosas orais.
Palavras – Chave: Ciclodextrinas; timol; agentes antiinfecciosos; boca; ferimentos e lesões.
ABSTRACT
Characterization and evaluation of antimicrobial activity of the gelatin mucoadhesive
membrane containing tymol complexed in β-cyclodextrin. Lana Naiadhy Silva Santos, 2019.
Thymol, a phenolic compound of the monoterpene class found in several vegetal species, have
been widely used in conventional pharmaceuticals formulations due to the broad pharmacologic
activity, particularly the antimicrobial one.Such compound presents high volatility, limited
water solubility and low bioavailability, what hinders its therapeutic application. Studies
conducted using thymol with β-cyclodextrin (β-CD) have been shown as promising in the
enhancement of the physical-chemical and pharmacological characteristics of this compound.
The combination of mucoadhesive systems with inclusion complexes (IC) is an interesting
strategy from the pharmacokinetic point of view for the treatment of lesions of the oral cavity.
These systems promote longer-lasting contact of the drug with the mucosa, thus significantly
improving the therapeutic performance of many substances. Henceforth, the aim of this study
was to develop, characterize and evaluation of antimicrobial activity of the gelatin
mucoadhesive membrane containing tymol complexed in β-cyclodextrin. The membranes were
obtained by means of the solvent evaporation technique and the IC by means of lyophilization
in molar ratios of 1:1. The characterization of the membranes was performed through the
techiniques of differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry/derivative
thermogravimetry (TG/DTG), X-ray diffraction (DRX), Fourier transform infrared attenuated
total reflectance spectroscopy (FT-IR/ATR), scanning electron microscopy (MEV), swelling
capacity and mucoadhesion. The entrapment efficiency (EE) was performed with high-
performance liquid chromatography (HPLC) and the cellular viability assay with the resazurin
reduction method in J774-G8 macrophages. The assessment of the microbiological activity was
performed by disk diffusion method with Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The
results showed that the addition of the IC in the membranes enabled alterations in the rates of
intumescence (>60%) parameters favorable to mucoadhesion. Moreover, they presented
antimicrobial activity revealing inhibition of the growth of the bacterial strains tested.
Therefore, it is conclude from the result, that mucoadhesive systems containing tymol inclusion
complexes may be promising in the treatment of oral infectious lesions.
Key-words: Cyclodextrins; tymol; anti-infectious agents; mouth; wounds and injury.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Representação esquemática da mucosa oral. .............................................. 4
Figura 2- Estrutura do espitélio queratinizado e não queratinizado. ........................... 5
Figura 3- Fases da lesão tecidual causada por microorganismos...............; ................ 8
Figura 4- Estrutura química do timol (C10H14O; massa molar 150,22 g/mol) ........... 11
Figura 5 –Estrutura e dimensões das CDs. ................................................................. 13
Figura 6- Formação de CI em meio aquoso..............................,,. ............................. 13
Figura 7– Estágios do mecanismo de mucoadesão. ................................................... 16
Figura 8 –Estrutura química da gelatina .................................................................... 21
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resumo de ensaios in vivo com formulações mucoadesivas aplicadas em estudos de
lesões orais de 1993 – 2018. ...................................................................................................... 18
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
CDs : Ciclodextrinas
β-CD : Beta ciclodextrina
α- CD : Alfa ciclodextrina
γ- CD: Gama ciclodextrina
CI: Complexos de inclusão
EC : Eficiência de complexação
IEP: ponto isoelétrico
OEs: Óleos essenciais
AINES: Anti-inflamatórios estroidais
CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DSC: Calorimetria exploratória diferencial
DRX: Difração de Raio X
FTIR/ATR: Espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com transformada
de Fourier
MEV : Microscopia eletrônica de varredura
TGA/ DTA : Análise termogravimetria/ análise termogravimetria diferencial
Gelatina/TM/β-CD: Membranas de gelatina contendo timol complexado;
Gelatina/TM: Membranas de gelatina contendo timol sem complexo;
MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio
FDA: Food and Drug Administration
GRAS: Generally Regarded As Safe
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ............................................................................................................................. 1
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 2
2 REVISÃO DA LITERATURA. ............................................................................................. 4
2.1 Mucosa oral. .................................................................................................................... 4
2.2 Lesões orais. .................................................................................................................... 7
2.3 Tratamento atual e limitações.........................................................................., .............. 9
2.4 Timol.............................................................................................................................. 10
2.5 Ciclodextrinas. .............................................................................................................. 12
2.6 Sistemas mucoadesivos ................................................................................................ 15
2.7 Gelatina. ....................................................................................................................... 22
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 23
3.1 Geral. ............................................................................................................................ 23
3.2 Específicos. .................................................................................................................. 23
4 REFERÊNCIAS. ................................................................................................................. 24
CAPÍTULO II ......................................................................................................................... 38
Gelatin-based mucoadhesive membranes containing thymol/ β-cyclodextrin inclusion
complex for treatment of oral infections. .............................................................................. 39
5 CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................................... 71
ANEXO
1
CAPITULO I
INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS
2
1 INTRODUÇÃO
A estrutura básica da mucosa oral é semelhante à da pele, consiste em um epitélio e um
tecido conjuntivo subjacente, onde são encontrados fibroblastos, nervos, vasos sanguíneos e
linfáticos (GROEGER; MEYLE, 2015; POLITIS et al., 2016). Esse revestimento abriga mais
de 700 táxons, compostos principalmente por filos de Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria,
Actinobacteria, Spirochaetes e Fusobactérias (WADE, 2013; ZHANG et al.,2018). Embora a
maioria deles sejam considerados comensais, pode ocorrer o surgimento de microorganismos
patogênicos, responsáveis por desencadear doenças infecciosas que variam desde a cárie até a
gengivite e outras lesões relacionadas ao revestimento mucoso (VASUDEVAN, 2017).
Existe uma alta prevalência de infecções da cavidade oral na população adulta
(FERREIRA; MAGALHÃES;MOREIRA, 2010). De acordo com estudos de 2010 relacionados
à carga global de doenças, lesões e fatores de risco, as doenças orais aumentaram em quase
21% entre 1990 e 2010 (OMS, 2016). Essas desordens podem levar a má nutrição, circulação
sistêmica de mediadores inflamatórios e sensibilização do nervo trigêmeo. Além disso, elas tem
sido associadas a várias comorbidades, como a diabetes mellitus, endocardite, doenças
neurodegenativas, parto prematuro e algumas formas de câncer (DE SOUZA ROLIM et
al.,2013; FERGUSON et al.,2017; PAVLAKI et al.,2013).
O tratamento das lesões orais infecciosas geralmente envolve o uso de antibióticos. No
entanto, nos últimos anos, o aumento da resistência bacteriana vem representando sérios
desafios para a medicina moderna (DONG et al.,2017; MAREK; SHERRY; TIMMONS, 2019).
Nesse sentido, substâncias derivadas de produtos naturais apresentam-se como fontes
inestimáveis para novos agentes terapêuticos para o tratamento de várias doenças, incluindo
distúrbios infecciosos (ELALFI et al.,2015). O timol, metabólito secundário de plantas
reconhecido como um produto Generally Regarded As Safe (GRAS) pelo Food and Drug
Administration (FDA), mostra um perfil promissor como agente antimicrobiano contra um
amplo espectro de microorganismos patogênicos da cavidade oral (MARCHESE et al.,2016).
No entanto, algumas deficiências como a alta volatilidade, hidrofobicidade e especial, a baixa
biodisponibilidade limitam sua aplicação terapêutica. Tais deficiências podem ser superadas
através da formação de CI entre o TM e a βCD (NIEDDU et al.,2014).
3
As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos obtidos a partir da degradação
enzimática do amido pela enzima ciclodextrina glicosiltransferase. Elas apresentam cavidades
internas hidrofóbicas e superfícies externas hidrofílicas (GUO et al.,2011; STAPPAERTS et
al.,2017), que são responsáveis pela capacidade de formar CI com moléculas hóspedes
lipofílicas de tamanho adequado (CONCEIÇÃO; ADEOYE; CABRAL-MARQUES; LOBO,
2018). Devido à essa característica são observadas alterações nas propriedades físico-químicas
das moléculas hóspedes, no que se refere à solubilidade e a estabilidade físico-química. Além
disso, as CDs apresentam tamanho apropriado para penetrar no revestimento mucoso. Por outro
lado, não possuem propriedades mucoadesivas resultando em tempos curtos de permanência na
superfície da mucosa oral, sendo insuficientes para garantir um efeito terapêutico (ADEOYE;
CABRAL-MARQUES, 2017; LIU et al.,2018).
Uma abordagem para superar essa deficiência é o uso de polímeros mucoadesivos, que
surgem como uma ferramenta promissora no tratamento de doenças da cavidade oral
(MASTROPIETRO;PARK;OMIDIAN, 2017). Entre eles destaca-se, a gelatina, um polímero
natural que exibe excelentes propriedades, tais como: biocompatibilidade, biodegradabilidade,
baixa antigenicidade, além de ser mais econômico que o colágeno (DONG et al.,2017;
NEZHADI et al.,2009).
Estudos prévios realizados pelo nosso grupo de pesquisa, demonstraram o efeito
terapêutico das membranas de gelatina no tratamento de lesões na pele causadas por
queimaduras (NUNES et al.,2016). Adicionalmente, um outro estudo confirmou a incorporação
de CI de timol/β-CD nas razões molares de 1:1 em membranas de gelatina. As análises foram
realizadas através da caracterização físico-química e estudos de liberação in vitro. Os autores
descreveram melhoria das propriedades físicas e térmicas do timol bem como, na sua cinética
de liberação (LIN et al.,2018). Baseado nestes estudos, tornou-se promissor avaliar o efeito de
membranas à base de gelatina contendo CI, a fim de melhorar as limitações terapêuticas do
timol e da β-CD para aplicação terapêuticas em lesões infecciosas orais. Apesar das inúmeras
vantagens e aplicações, nenhum estudo relacionado com a mucoadesão foi realizado com esse
biopolímero. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo, obter membranas à base de
gelatina contendo CI timol/β-CD nas razões molares de 1:1, a fim de investigar as propriedades
físico-químicas morfológicas, citotóxicas e microbiológicas por diferentes técnicas de
caracterização.
4
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Mucosa oral
A cavidade oral é uma estrutura complexa e multifuncional, revestida por uma
membrana mucosa que compreende todas as suas superfícies, com exceção dos dentes. Esse
revestimento, atua como uma barreira contra substância exógenas, patógenos e danos
mecânicos (EVANS, 2017; UKKONEN et al.,2017; HOVAV ,2013; LIU; MAO; CHEN 2011).
A anatomia e a histologia da mucosa oral foram extensivamente descritas por vários autores
(Figura 1) (EVANS,2017; MARKIEWICZ et al.,2007; PRESLAND; DALE,2000).
Estruturalmente ela apresenta semelhanças com a pele, compreendendo uma área de
cerca de 200 cm2 de superfície total (GROEGER; MEYLE, 2017; QIN; SUKHO; FAZEL 2017;
HOFAMAN; DANIELS, 2018; TEUBL, et al., 2013). Existem três tipos de mucosa oral, cada
uma com características que diferem de acordo com a função e o local em que estão sendo
expostas. A mucosa mastigatória, como o próprio nome sugere, é responsável pelos processos
mastigatórios e apresenta superfícies mais resistente ao atrito, compreendendo a gengiva e o
palato. O restante, faz parte da mucosa de revestimento, formada por tecido elástico e flexível.
Entretanto, a mucosa especializada é uma exceção, pois possui tanto características da mucosa
mastigatória quanto da de revestimento (QIN; SUKHO; FAZEL,2017).
Figura 1. Representação esquemática da mucosa oral.
Fonte: Disponível em: https://pocketdentistry.com/12-oral-mucosa>
5
Histologicamente, a mucosa oral é composta pelo epitélio e pelo tecido conjuntivo,
também denominado de lâmina própria (HOVAV,2018; TURABELIDZE et al.,2014). O
epitélio é uma camada estratificada escamosa que está ligada à lâmina própria através da
membrana basal. As células epiteliais encontradas em maior proporção, são os queratinócitos.
Outras também são identificadas, entretanto em menor quantidade, como melanócitos, glóbulos
brancos células de Langerhans, Granstein e Merkel (VEERAVARMAL et al.,2018; OSMAN,
2015). Essas estruturas passam constantemente por diferenciações através de divisões e
migrações celulares. As diferenciações do epitélio oral podem ser classificadas como
queratinizada ou não queratinizada (Figura 2).
Figura 2- Estrutura do epitélio queratinizado e não queratinizado
Fonte: (Adaptado de PRESLAND, JUREVIC,2002).
O epitélio queratinizado, é dividido em diferentes subcamadas, a primeira é denominada
como estrato basal, seguida do estrato espinhoso, estrato granuloso e por fim, o estrato córneo
(HOVAV,2018; JONES; KLEIN,2013). O estrato basal é considerado como germinativo,
composto por células basais colunares com capacidade proliferativa, que migram, se
diferenciam e dão origem aos queratinócitos e melanócitos que constituem a camada espinhosa.
À medida que os queratinócitos entram em diferenciação, tornam-se maiores e começam a
acumular filamentos de citoqueratina. Além das queratinas, eles sintetizam algumas proteínas
específicas, incluindo profilagrina e involucrina (DAWSON et al., 2013). O produto final da
queratinização, é o estrato córneo (MALTOLTSY, 1976).
6
O estrato córneo é formado por células hexagonais planas preenchidas por queratina,
aminoácidos e outras substâncias de baixo peso molecular. Entretanto, aproximadamente 85%
da proteína presente nessa camada corresponde a queratina. A queratina é uma proteína
intermediária que forma filamentos em diferentes camadas do citoesqueleto epitelial e são
responsáveis principalmente, pela defesa do tecido contra danos estruturais (MOHANTA;
MOHANTY; PARIDA, 2016; RAMULU; KALE; HALLIKERIMATH; KOTRASHETTI,
2013).
O epitélio não-queratinizado corresponde a maior parte do revestimento da cavidade
oral, caracterizado pela ausência do estrato córneo. Esse epitélio, é mais flexível e abrange áreas
da mucosa de revestimento, como os lábios, bochechas, a mucosa alveolar, palato mole,
assoalho da boca e a parte inferior da língua (HOFFMAN; DANIELS, 2018; TEUBL, et al.,
2013). Divide-se em quatro camadas: basal, espinhosa, intermediára e superficial. Nesse tecido,
as células basais formam os queratinócitos que expressam queratinas dos subtipos K5, K14,
K15 e K19 (MOHARAMZADEH,2017; DAWSON et al., 2013).
A lâmina própria encontra-se abaixo do epitélio oral (CHEN; AHMAND; LI; SWAIN,
2015; FEHRENBACH; BATH-BALOGH,2012). Formada por um tecido compactado fibroso,
essa camada pode ser dividida em: papilar e densa (CHEN; AHMAND; LI; SWAIN, 2015). A
camada papilar é a mais superficial, formada pelo tecido conjuntivo frouxo. Por outro lado, a
camada densa é profunda, sendo constituída por tecido conjuntivo denso e uma grande
quantidade de fibras. Na lâmina própria, são encontrados fibroblastos, macrófagos,
plasmócitos, mastócitos e linfócitos. Além deles, componentes vasculares, vasos linfáticos,
nervos e terminações nervosas, também são identicados (OSMAN, 2015). A última camada é
a região submucosa, formada por tecido conjuntivo frouxo e por vasos sanguíneos, glândulas
salivares e nervos (SQUIER, BRODGEN, 2011). Todas as superfícies da mucosa apresentam
glicoproteínas com pesos moleculares que variam de 500 kDa a 20 MDa, denominadas de
mucina. Elas apresentam grande importância no estabelecimento da mucoadesão,
compreendendo aproximadamente um conteúdo de 1,2 mg/mL em indíviduos saudáveis e são
responsáveis pela natureza visoelástica de todas as secreções mucosas, devido a formação de
redes aquosas, semelhantes a gel. Essa visoelasticidade contribui para a lubrificação da
cavidade oral e serve como barreira contra substâncias estranhas, retardando a penetração de
xenobióticos nas células epiteliais (UKKONEN et al.,2017).
7
2.2 Lesões orais
A mucosa oral é comumente afetada por uma ampla variedade de lesões orais. Elas são
um resultado de dano epitelial, no tecido conjuntivo subjacente ou em ambos. Clinicamente,
apresentam sintomas similares, incluindo dor, ulcerações,eritema, glossite, descamação, edema
e formação de bolhas (RIERA MATUTE; RIERA ALONSO, 2011;EPSTEIN; VILLINES;
BAKER, 2018;FONSECA, 2019).
Periodontite, gengivite, mucosite, estomatite aftosa, líquen plano, herpes e candidíase
são alguns exemplos. Diversos fatores podem contribuir para o aparecimento dessas condições,
incluindo doenças imunológicas, neoplasias, drogas, distúrbios sanguíneos, processos
infecciosos, lesões traumáticas, doenças gastrointestinais, entre outros (MUHAIDAT, 2013;
SCHEMEL-SUÁREZ; LÓPEZ-LÓPEZ; CHIMENOZ-KUSTNER, 2015; RIERA MATUTE;
RIERA ALONSO, 2011). Entretanto, a maior parte desses processos apresenta algum agente
infeccioso envolvido (FERREIRA, MAGALHÃES, MOREIRA, 2010; SILVA et al., 2017).
Os microrganismos mais comuns (60% -80%), incluem bactérias gram-negativas e
positivas, tais como Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Acinetobacter baumannii,
Klebsiella pneumoniae, e Morganella morganii; Enterococcus faecalis, Streptococcus bovis,
subespécie de Corynebacteria e Streptococcus viridans (LEVI et al., 2011; WADE et al., 2013).
Segundo Galvão-Moreira e colaboradores (2016), o epitélio oral orais fornece espaços
apropriados para a colonização de microorganismos, incluindo bactérias, archaea, leveduras e
protozoários e vírus. Esse tecido contribui direta e indiretamente para o controle da flora
comensal, através da secreção de péptídeos antimicrobianos e quimiocinas, respectivamente
(GORR, 2011; DELITTO et al.,2018). No entanto, alterações na flora microbiana resulta na
proliferação de microorganismos patológicos e no densenvolvimento de doenças inflamatórias
(ATANASOVA, YILMAZ, 2015; GALVÃO-MOREIRA; DA CRUZ, 2016; BUGSHAN,
2017).
Os mecanismos pelos os quais esses microorganismos podem causar doenças, são
variados. De maneira geral, eles apresentam capacidade de aderir à mucosa, competir por
espaço e nutrientes com a flora residente, resistir as defesas imunológicas e penetrar na
membrana do hospedeiro (Figura 3) (DONGARI-BAGTZOGLOU, 2008).
8
Figura 3. Fases da lesão tecidual causada por microorganismos.
Fonte: (ABIKO et al.,2017).
Uma resposta inflamatória é iniciada automaticaticamente através da liberação de
aminas vasoativas, mediadores lipídicos derivados dos fosfolipídios e citocinas (INF-gama
(Interferon gama), TNF-α (Fator de necrose tumoral-alfa), IL (interleucina) -1β, IL-2 e IL-6),
(HEGDE; AWAN,2018). As etapas seguintes são semelhantes a cicatrização da derme,
incluindo fases de proliferação e remodelagem da matriz de colágeno (GUO; DIPIETRO,
2010).
As lesões infecciosas podem ter várias apresentações clínicas, os principais os tipos são:
pseudomembranosas, eritematosas e hiperplásicas (MUÑOS-CORCUERA et al., 2009; RIERA
MATUTE; RIERA ALONSO, 2011). Dessa forma, a abordagem terapêutica dependerá das
condições ulcerativas apresentadas clinicamente (SOLLECITO; STOOPLER,2013;
ABDALLA-ASLAN; BENOLIEL; SHARAV; CZERNINSKI, 2016). Caso não tratada, essas
doenças podem afetar outros órgãos vitais através da circulação sanguínea e causar infecções
sistêmicas (JORTH et al., 2014; BLOD et al., 2017; SANTOS et al.,2017).
Os sintomas dependerão principalmente do órgão afetado (SANTOS et al., 2017).
Segundo uma revisão recente realizada por Casamassimo e colaboradores (2018) as lesões orais
contribuem para o desenvolvimento de doenças sistêmicas como a endocardite, bacteremia,
insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral isquêmico, doença do refluxo
gastroesofágico, diabetes, doença pulmonares, complicações na gravidez, doenças renais,
aterosclerose, hepatites virais, demência e câncer. Segundo a American Cancer Society,
tumores malignos na cavidade oral foram responsáveis por aproximadamente 17.000 novos
casos e 3.050 mortes em 2017 (TUNGLAND, 2018).
9
Fatores de risco podem contribuir ainda mais para o agravamento das lesões orais,
incluindo a escassez de higiene bucal, idade, uso de drogas, entre outros. Devido à diversidade
de fatores e as variadas formas de apresentação clínica, o diagnóstico e o tratamento das lesões
infecciosas orais pode ser bastante desafiador. Contudo, estudos demonstraram que tratamento
terapêutico adequado mostra resultados satisfatórios na redução da prevalência dessas doenças
(SHARMA et al., 2019; NAPEAS, 2017).
2.3 Tratamento atual e limitações
O tratamento odontológico das lesões infecciosas orais requer atenção aos achados
clínicos dos pacientes e deve seguir protocolos e diretrizes. Existem diferentes modalidades de
tratamento para o controle e prevenção dessas doenças (ALTENBURG et al.,2014).
Atualmente, uma variedade de medicamentos são utilizados na prática clínica, embora resultem
em uma eficácia limitada. Antibióticos, analgésicos, antiinflamatórios não esteroidais (AINES)
e corticóides são as classes terapêuticas mais utilizadas no tratamento de lesões infecciosas
orais, embora os antibióticos sejam dominantes (FRANCE; SOLLECITO, 2018; DESIMONE;
SOHAIL, 2018).
Nas formas de lesão aguda é necessário o uso da terapia medicamentosa para o controle
dos sintomas, incluindo os antimicrobianos de origem sintética, tais como iodopovidona,
peróxido de hidrogênio, citrato de zinco, derivados de fenol, clorexidina, hexetidina, cloreto de
cetilpiridio, triclosan e citrato de zinco. Entretanto, essas substâncias contribuem para o
aparecimento de vários efeitos adversos como vômitos, hipersensibilidade, diarréia, distúrbios
transitórios do paladar, entre outros (JAMES et al.,2017; TAKENAKA; OHSUMI; NOIRI,
2018). Por estas razões que esses produdos são indicados em situações clínicas durante curtos
períodos de tempo.
Atualmente, a maioria das abordagens terapêuticas incluem o uso da
antibioticoterapia profilática e terapêutica (MAREK; SHERRY; TIMMONS , 2019). Desde a
década de 1970 que as prescrições de antibióticos ocorre na odontologia (SEGURA-EGEA et
al., 2017). Antibióticos como ampicilina, eritromicina, penicilina, tetraciclina e a vancomicina
são amplamente utilizados a fim de inibir o crescimento bacteriano (LEVI; EUSTERMAN,
2014).
10
De acordo com protocolos, esses medicamentos devem ser recomendados para pacientes
cardiopatas de alto risco com risco de desenvolver uma endorcadite bacteriana,
imunocomprometidos, diabéticos, oncológicos com neoplasias na região da cabeça e antes de
procedimentos odontológicos invasivos (FRANCE; SOLLECITO, 2018; NAPEÑAS et
al.,2015). Isso porque existem riscos associados ao uso inadequado desses medicamentos, que
podem resultar em reações adversas, incluindo distúrbios gastrointestinais e anafilaxia. Além
disso, podem contribuir para o desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos
(NAPEÑAS, 2017; CUNHA et al.,2018; MOREHEAD; SCARBROUGH, 2018).
O aumento nas taxas de resistência bacteriana aos antibióticos é uma preocupação global
(OMS,2014). A cada ano, somente nos Estados Unidos, mais de dois milhões de pessoas são
infectadas por bactérias resistentes, levando a mais de 23.000 mortes (CDC,2013; DURKIN et
al.,2017). Nesse sentido, produtos naturais com propriedades antimicrobianas vem se tornado
uma abordagem interessante no controle de patógenos orais (DUBEY;MISHRA; THAKUR,
2018; SUROOWAN; MANHOMOODALLY,2018).
O crescente uso de medicamentos fitoterápicos renovou o interesse da medicina
moderna na aplicação terapêutica dessas substâncias em doenças infecciosas (FALZON;
BALABANOVA, 2014). Por exemplo, os monoterpenos representam mais de 80% da
composição de óleos essenciais de plantas (EL ASBAHAN et al.,2015). Nos últimos anos,
relatórios científicos vem confirmando o seu potencial como fonte de novos agentes
antimicrobianos para o tratamento de lesões orais (DI PASQUA et al., 2007; BHATTI et
al.,2014). Entre os diversos monoterpenos que apresentam potencialidade antimicrobiana, o
timol tem mostrado resultados favoráveis na inibição de diferentes microrganismos (DI
PASQUA et al., 2007; GHOLAMREZA et al.,2010).
2.4 Timol
O timol (2-isopropil-5-metilfenol) (Figura 4), é um monoterpeno fenólico extraído de
óleos essenciais de plantas pertencentes à família Lamiaceae, como as do gênero Thymus,
Ocimum, Origanum, Satureja, Thymbra e Monarda (LICATA et al.,2015; ELSHAFIE et al.,
2015; ALVAREZ ECHAZÚ et al.,2017).
11
Figura 4. Estrutura química do Timol (C10H14O; massa molar: 150,22 g/mol).
Fonte: (BASCH et al.,2004).
Esse composto é biossintetizado através da aromatização do α-terpineno, seguido de
hidroxilação do p-cimeno (POULOSE; CROTEAU, 1978). Desde os anos 60, que óleos
essenciais contendo timol são avaliados quanto aos seus possíveis benefícios em aplicações
terapêuticas Nestas aplicações, suas propriedades antimicrobianas é uma das áreas mais
estudadas. Lobo et al. (2014) verificou em um estudo randomizado, duplo-cego e controlado, o
uso do óleo essencial da planta Lippia sidoides Cham. no tratamento da cárie dentária em
crianças. No ensaio, o creme dental com óleo essencial de L. sidoides demonstrou redução de
S. mutans salivares após 5 dias de tratamento. Os dois principais constituintes do óleo de L.
sidoides são o timol (50-59%) e carvacrol (7-16%). Os dados experimentais mostraram um
amplo espectro antimicrobiano desses compostos fenólicos contra bactérias gram-positivas. Em
outro estudo, Nabavi et al. (2015) analisou a atividade antibacteriana do timol contra 120 cepas
de origem clínica, entre elas Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia e Pseudomonas. Os
resultados mostraram que o timol inibiou o crescimento de todos as bactérias resistentes. Braga
e colaboradores (2008) observaram que o tratamento com timol (após 6 horas de incubação)
reduziu 45,1% dos biofilmes maduros produzidos por Candida albicans.
12
Dalleau et al. (2008) em 2008 também demonstrou que o timol (bem como o carvacrol
e geraniol) foi o mais eficaz na redução (80% da inibição da massa do biofilme) dos biofilmes
de Candida albicans. Um estudo realizado por Marino et al. (1999) com diversos monoterpenos
que apresentam potencialidade antimicrobiana, o timol mostrou resultados satisfatórios na
inibição de diferentes microrganismos.
Devido as diversas propriedades terapêuticas, o timol tem sido amplamente utilizado na
indústria farmacêutica, de cosméticos, e de alimentos (POLZIN; RORRER, 2018; FREIRES et
al.,2015). Na odontologia, esse composto é utilizado em formulações bucais (Listerine®) com
finalidade anti-séptica no tratamento infecções orais (VAN LEEUWEN;SLOT;VAN DER
WEIJDEN, 2014). Devido à hidrofobicidade, eles conseguem interagir com a membrana celular
dos microorganismos, interferindo no mecanismo de transporte molecular e no conteúdo
protéico (MARCHESE, 2016).
Entretanto, algumas limitações restringem o seu uso, devido a sua hidrofobicidade, baixa
estabilidade, alta volatilidade e ao seu sabor e odor desagradáveis (NIEDDU et al., 2014). Além
disso, foi demonstrado uma citotoxicidade moderada tanto em estudos experimentais in vitro
quanto em modelos animais (MANABE, NAKAYAMA,SAKAMOTO, 1987; SUZUKI;
FURUTA, 1987). Diversas técnicas foram exploradas para superar essas limitações, incluindo
o uso de CDs (DOU et al.,2018) e nanomateriais, como lipossomas (ENGEL et al.,2017) e
nanopartículas (MARCET et al., 2018).
2.5 Ciclodextrinas
As CDs são oligossacarídeos cíclicos de baixo peso molecular (973-2163 Da) obtidas a
partir do amido através da enzima ciclodextrina glicosiltransferase CGTas (DEL VALLE,
2004). São constituídos por subunidades de glucopiranose ligadas entre si por ligações α-1,4-
glicosídicas. De acordo com o número de unidades de glucopiranose, podem ser classificadas
em α-CD, β-CD e γ-CD (Figura 5), compostas por seis, sete e oito unidades de respectivamente
(CRINI et al.,2018).
13
Figura 5. Estrutura e dimensões das CDs.
Fonte: <http://www1.lsbu.ac.uk/water/cyclodextrin.html >. Acesso em 14 de Novembro de 2018.
As CDs apresentam estruturas toroidais na forma de cone truncado com superfície
externa revestida por grupos –CH e atómos de oxigênio glicosídico, que a tornam hidrofóbica.
Os grupos hidroxilas primários e secundários das CDs estão localizado nas extremidades
estreitas e largas, respectivamente, conferindo propriedades hidrofílicas a cavidade interna.
Dessa forma, substâncias hidrofóbicas podem ser encapsuladas na sua cavidade para formar
CI (Figura 6) através de forças de Van der Waals e fatores termodinâmicos (SHERJE et
al.,2017).
Figura 6. Formação de CI em meio aquoso.
Fonte: <http://www1.lsbu.ac.uk/water/cyclodextrin.html >. Acesso em 14 de Novembro de 2018..
14
O processo de complexação, aumenta a estabilidade in vivo da molécula hóspede e
consequentemente, a sua biodisponibilidade (LIMA et al.,2016; GUIMARÃES et al., 2015).
Além disso, prolonga a duração e a intensidade do efeito das substâncias, como também reduz
efeitos colaterais e odores desagradáveis (GUIMARÃES et al., 2015; NASCIMENTO et al.,
2014; MARRETO et al., 2008; POLYAKOV et al., 2004).
A eficiência da complexação está associada ao tamanho da molécula hóspede, bem
como o tipo de CD e ao método de preparação (DEL VALLE, 2004). Entre as CDs, β-CD é a
mais utilizada para a formação de CI com várias moléculas, íons e polímeros (incluindo
derivados aromáticos, corantes, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, orgânicos voláteis
compostos e metais, entre outros), isso porque ela apresenta baixa solubilidade em água
(18.5mg/mL), tamanho intermediário, estrutura cristalina estável, pureza, maior capacidade de
complexação e baixo custo (SIKDER et al., 2018; PORTE; PORTE; DE OLIVEIRA,2014).
Em relação ao método de obtenção das CI, as técnicas comumente utilizadas são a
moagem, ultrassom, spray drying, liofilização (LI), malaxagem, co-precipitação e fluido
supercrítico (KURKOV; LOFTSSON, 2013). Um estudo realizado por Tao e colaboradores
(2014), propôs a caracterização de CI de timol e β-CD pelos métodos de malaxagem e LI nas
razões de 1:1. Os resultados mostraram que a eficiência de complexação (EC) foi maior nos CI
obtidos pelo método LI (p<0,05) apresentando valores de EC que variavam de 71% a 73%. As
principais vantagens deste método, incluem a simplicidade, facilidade de escalabilidade e
redução de desperdícios (RINALDI et al.,2015; CRAVOTTO et al., 2012).
Atualmente, as CDs tem sido usadas em produtos de higiene pessoal, alimentícios,
têxteis, em cosméticos e em em mais de 35 medicamentos disponíveis comercialmente,
incluindo comprimidos, soluções parenterais, colírios, pomadas e supositórios (LOFTSSON;
BREWSTER, 2012; DE OLIVEIRA et al.,2015; KURKOV; LOFTSSON, 2013). Embora as
CDs naturais α-, β- e γ-CD, sejam muito utilizadas, algumas limitações ainda são evidentes, tais
como: toxicidade, baixa solubilidade e escassez das propriedades mucoadesivas. As CDs
quimicamente modificadas apresentam alterações nas propriedades de solubilidade e
toxicidade, possibilitando melhoria nas suas aplicações (SHERJE et al.,2017).
15
Os grupos hidroxilas primários e secundário são responsáveis pela modificação das
propriedades físicas e químicas das CDs, em particular os grupos 6-OH. Diversos grupos
funcionais podem ser ligados a essas estruturas, incluindo hidroxipropril, sulfobutil, hidroxietil,
carboximetil, entre outros (KURKOV; LOFTSSON, 2013).
Como mencionado anteriormente, as CDs não apresentam propriedades
mucoadesivas, o que resulta em tempos de permanência insuficientes para garantir o efeito
terapêutico das substâncias incorporadas. Essa propriedade pode ser melhorada através do uso
de polímeros mucoadesivos (ASSIM et al.,2018). Vários trabalhos na literatura tem
mencionado essas abordagens (LIN et al.,2018; DANG et al.,2018; HAROUN; EL-
HALAWANY, 2010; LI et l.,2018).
2.6 Sistemas Mucoadesivos
O conceito de mucoadesão foi desenvolvido em meados da década de 1980 como uma
metodologia voltada para direcionar a entrega local de medicamentos na superfície da mucosa
(MANSURI et al.,2016). Formulações mucoadesivas utilizam polímeros naturais ou sintéticos
a fim de aderir à camada de muco e prolongar tempo de contato da droga com a mucosa, e
assim, podem contribuir para melhoraria do desempenho terapêutico como também, para a
redução da frequência posológica dos medicamentos (AL-DHUBIAB et al., 2015; 2016; NAIR
et al., 2018). Além disso, esses sistemas apresentam excelentes propriedades mecânicas e
facilitam a entrega de moléculas de alto peso molecular, como proteínas e peptídeos.
Várias formulações mucoadesivas tem sido desenvolvidas, incluindo comprimidos,
filmes, soluções, sprays, géis, microagulhas, entre outros (KRAISIT et al., 2018). Desde os anos
80 que diferentes mecanismos de mucoadesão e métodos de caracterização tem sido
investigados. Embora esse mecanismo ainda não seja totalmente compreendido, várias teorias
têm sido propostas para descrever a interação dos diferentes polímeros com a mucosa (NAIR
et al.,2018).
Essas teorias envolvem a difusão, molhabilidade, interações eletrônicas, adsorção e o
mecanismo de fratura. A teoria da difusão baseia-se no gradiente de concentração do polímero.
A molhabilidade, descreve a dispersão das formulações na presença dos líquidos biológicos
(KOLAWOLE; LAU; KUTORYANSKIY,2018).
16
O grau de propagação pode ser calculado através da equação básica de Young. A
interação eletrônica baseia-se na transferência de elétrons entre os polímeros e a mucosa através
da diferença de cargas. A adsorção, inclui ligações iônicas, covalentes e metálicas, como fatores
de mucoadesão, enquanto a teoria de fratura é baseada no mecanismo da força de ligação entre
a formulação e a mucosa (MANSURI et al.,2016).
Entretanto,a teoria da molhabilidade seguida da adsorção estão entre as mais
amplamente aceitas nos estudos (MANSURI et al.,2016; MORALES; MCCONVILLE, 2011;
NAIR et al.,2018). Segundo Russo e colaboradores (2016), o fenômeno de mucoadesão pode
ser considerado como um resultado de duas fases (Figura 7) . Na primeira fase, é estabelecido
o contato entre a formulação mucoadesiva e a mucosa, através de forças interfaciais. Em contato
com o muco o polímero se expande e apresenta uma dupla camada de interpenetração mecânica.
Na segunda fase, que pode ser definida como fase de consolidação, é o resultado de
interações químicas entre os dois substratos, ou seja, ligações de hidrogênio, interações
eletrostáticas e forças de Van der Waals. Durante esta fase ocorre o fortalecimento da interface
mucoadesiva, constituída de muco e polímero mucoadesivo.
Figura 7: Estágios do mecanismo de mucoadesão.
Fonte: (SINGH; SHARMA; GARG, 2017).
17
Vários métodos são relatados na literatura para avaliação das propriedades
mucoadesivas do polímero. Elas podem ser analisadas por testes in vitro, entre eles destaca-se
os métodos de tração. Neste teste, o polímero é inserido na plataforma do equipamento de tração
automática, entrando em contato com a mucosa. A força necessária para causar o descolamento
entre os dois materiais é avaliada.
A principal limitação desta técnica é que alguns fatores podem afetar nos resultados,
tais como: velocidade e o tipo de mucosa utilizada (TOBYN; JOHNSON; DETTMAN, 1997).
Um método alternativo, utiliza o disco rotativo para avaliar o tempo gasto na separação da
formulação mucoadesiva com a mucosa. Os resultados tendem a correlacionar com os obtidos
no método de tração.
Outra técnica descrita pela primeira vez por Ranga Rao e Buri (1989), aplica saliva
artificial ou tampão nos ensaios de mucoadesão. A análise pode ser executada através da
lavagem da mucosa a fim de monitorar o tempo de retenção do material analisado. Testes in
vivo também podem ser utilizados para analisar o desempenho das formulações mucoadesivas.
A Tabela 1 apresenta um resumo de ensaios in vivo utilizando formulações mucoadesivas
aplicadas em estudos de lesões orais de 1983- 2018.
18
Tabela 1. Resultados de ensaios in vivo utilizando formulações mucoadesivas em estudos de lesões orais de 1993- 2018.
Autor
(ano)
Substância Concentraçã o Polímero Amostra Ferramentas de avaliação Resultados
Santos et
al. (2018)
Extrato de
Curcuma
longa Linn
e
Bidens pilosa
L
10 mg/mL de
extrato de
curcuminoids
e 20% de
extrato de
Bidens pilosa
L. e
(FITOPROT
A)
e
20 mg/mL de
extrato de
curcuminoids
e 40% do
extrato de
Bidens pilosa
L.
(FITOPROT
B)
Poloxamer 407
30 participantes
adultos
saudáveis com
idade entre 18 e
65 anos de
ambos os sexos.
Potencial de efeitos adversos
Avaliação da toxicidade
Coleta de células epitéliais
Coleta de saliva
Atividade de Mieloperoxidase (MPO)
e
Malondialdeído (MDA)
Concentração de óxido nítrico
Quantificação de citocinas
inflamatórias
O FITOPROT A demonstrou ser seguro e
tolerável em ambas as doses testadas, sem
ou eventos adversos locais
Sveinsson
and
Holbrook
(1993)
Acetato de
triacinolona
0.1 % (p/p)
Eudispert
Gelatina
35 participantes
com ulcerações
aftosas ou
lichen planus.
Aceitabilidade
Os resultados clínicos são escassos no
tempo presente e será relatado em separado
comunicação.
Hassan et
al (2011)
Naproxeno
1% (p/v)
H
idroxipropilmetilcelulose
(HPMC)
e
Eudragit
Sete voluntátios
adultos
saudáveis.
Análise de amostras de saliva.
Os resultados foram satisfatórios em termos de
liberação controlada de droga (mantida acima de
4 μg / mL por um período de 120 min),
propriedades mecânicas e bioadesão. Além
disso, não causou desconforto aos voluntários,
.
Continua
19
Tabela 1. Resultados de ensaios in vivo utilizando formulações mucoadesivas em estudos de lesões orais de 1993- 2018.
Perioli et
al (2007)
Flurbiprofeno
20- 40 mg
Polivinilpirrolidona (PVP)
e
Carboximethilcelulose na
forma de sal de sódio
(NaCMC)
5 voluntários
humanos
saudáveis .
.
Tempo de residência,
Perda de fragmentos,
Excesso de salivação
Aceitabilidade
Estudos in vivo mostraram a presença de
ibuprofeno na saliva (variação de 70– 210 mg
/mL) por 5 h e não foi observada irritação.
Averineni
et al.
(2009)
Valdecoxibe
0.10 e 0.15 mg
Quitosana
and
HPMC K4M
12 participantes
saudáveis entre
24- 26 anos.
Parâmetros farmacocinéticos
Métodos bioanáliticos
Tempo de residência
Os estudos farmacocinéticos mostraram que a
droga foi liberada l no local de ação alvo, e uma
quantidade muito pequena pode ter absorvido de
maneira sistemica.
Tanabe (et
al., 2008)
Indometacina
0,5 % ou 1%
ou 2% (p/p)
Etilcelulose (EC)
17 homens e 31
mulheres com
idade entre 22 e
83 anos,
apresentando
diferentes tipos
de lesões orais
Efeitos analgésicos
Duração de efeitos
Efeitos colateriais
A formulação com 2% de indometacina e 10&
de EC mostrou uma potente ação analgésica.
Cilurzo et
al. (2010)
Proprianato de
Clobetasol
24 µg Poli (metacrilato de sódio)
e
HPMC
16 participantes
com diagnóstico
de lichen
planus.
Estudo de mucoadesão
Eventos adversos
Sintomas
O estudo, dor e ulceração foram resolvidos em
13/16 e 11/16 pacientes do grupo CP-T e grupo
CP-O, respectivamente. Nenhuma mudança nos
sinais clínicos dos pacientes foi evidente.
Jadhav et
al (2004)
Eugenol
10 mg
HPMC K4M
and
carbopol 934 P
.
6 homens
saudáveis entre
24 e 26 anos.
Bioadesão
Liberação de droga
Aceitabilidade
O estudo de liberação in vivo mostrou a
completa liberação de eugenol da formulação
dentro de 6 h com 82,3% de liberação da droga.
Continua
20
Tabela 1. Resultados de ensaios in vivo utilizando formulações mucoadesivas em estudos de lesões orais de 1993- 2018.
Ammar et
al. (2016)
Proprianato de
fluticasona
2% (p/p)
HPMC, EC, Carboximetil
celulose (SCMC) e
Carbopol 971P
Seis
participantes
saudáveis com
idade entre 25 –
50 anos.
Bioadesão
Parâmetros farmacocinéticos
Os parâmetros farmacocinéticos melhorados
para os filmes mucoadesivos em comparação
com o enxaguatório bucal.
Saxen
Et al
(1997)
Diclofenaco
Lidocaína
3% (p/p)
3% (p/p)
Ácido hialurônico
Homens e
mulheres com
idades entre 18
e 65 anos,
apresentando
úlceras orais
entre 2 e 10 mm
de diâmetro.
Alívio de dor a longo prazo
Resposta à estimulação
Foi observado um efeito altamente
significativono tratamento com o diclofenaco e
o ácido hialurônico isoladamente entre 2 e 6
horas após a aplicação.
21
De maneira geral, a extensão da mucoadesão de uma formulação dependerá de vários
fatores, incluindo o tamanho e as propriedades físico-químicas do polímero. Características,
como peso molecular e viscosidade também mostram uma correlação com as propriedades
mucoadesivas (BIANCO-PELED;DAVIDOVICH-PINHAS, 2015; KOLAWOLE; LAU;
KUTORYANSKIY,2018; KALDYBEKOV et al.,2018). Entre os polímeros usados em
odontologia, estão o polietileno, polimetilmetacrilato, policarbonato,
polietilenoglicol,polidimetilsiloxano, poliuretano,ido poliltico (PLLA), poli (e-
caprolactona),polipirrol,hexametildissilazano,N-isopropilacrilamida e alginato de sódio,
gelatina, quitosana e derivados de celulose (ROKAYA et al., 2018; MANSURI et al., 2016).
2.7 Gelatina
A gelatina é um biopolímero natural obtido partir da hidrólise do colágeno, que é um
dos principais componentes da pele, osso e tecido de animais. Ela distingue-se dos outros
polímeros devido a presença de sequências de aminoácidos como Arg-Gly-Asp (RGD) em sua
estrutura (Figura 8). Esses aminoácidos modulam a adesão celular e consequentemente,
desempenham um papel biológico significativo (WANG et al., 2016).
Figura 8: Estrutura química da gelatina.
Fonte: (DEVI et al., 2017)
22
Comercialmente, dois diferentes tipos de gelatina (A e B) estão disponíveis. A gelatina
A é obtida da pele de porco através do pré-tratamento em ácido antes do processo de extração,
resultando num ponto isoelétrico (IEP) de 7-9. Por outro lado, a do tipo B é de origem bovina
obtida através do tratamento alcalino. Essa tipo de gelatina, possui uma proporção maior de
grupos carboxilícos, resultando em um IEP de 4,5 a 6,0 (NINAN; JOSE; ABUBACKER,2011;
SAHOO et al.,2015).
A literatura relata diversas vantagens, como baixo custo, biodegradabilidade,
biocompatibilidade e excelentes propriedades cicatrização da pele (NGUYEN et al.,2016). Por
esta razão, a gelatina tem sido amplamente utilizada na engenharia de tecidos, na entrega de
genes, em cultura de células e nas indústrias, sendo considerada como um material Generally
Regarded As Safe (GRAS) pelo Food and Drug Administration (FDA). (GÓMEZ-GUILLÉN
et al., 2011; AL-HASSAN; NORZIAH, 2012, MOHAMMADI et al., 2018).
No tratamento odontológico, esponjas de gelatina são utilizadas em intervenções
cirúrgicas para obter uma hemostasia local (HASSAN et al.,2011). Sua porosa estrutura
estabiliza a coagulação do sanguinea e promove a cicatrização de lesões orais. De acordo com
trabalhos da literatura, uma variedade de sistemas mucoadesivos à base de gelatina foram
desenvolvidos para entrega intraoral.
Os resultados mostram que a adição deste biopolímero promove melhoria nas
propriedades físico-químicas e farmacológicas das drogas, a exemplo do timol (DANG; SHAN;
CHEN, 2017). Híbridos de filmes gelatina-carboximetilcelulose (DEKINA et al.,2016),
comprimidos de gelatina-quitosana (ABRUZZO et al.,2015); gelatina-
hidroxipropilmetilcelulose (TEDESCO; MONACO-LOURENÇO; CARVALHO,2016),
formas de gelatina estruturalmente modificada (DUGGAN et al.,2015) e a combinação de
gelatina com CI de timol/β-CD(LI et al.,2018) são alguns dos exemplos de formulações
estudadas nos últimos anos.
23
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Caracterizar e avaliar a atividade antimicrobiana de membrana de gelatina contendo
timol complexado em β-ciclodextrina.
3.2 Específicos
Preparar membranas de gelatina pelo método de evaporação do solvente;
Preparar os CI timol/β-CD pelo método de liofilização (LI) na razão molar de 1:1;
Caracterizar as formulações por parâmetros físicos e químicos;
Avaliar a eficiência de complexação do timol nos CI;
Avaliar o teor de timol nas membranas;
Verificar as propriedades mucoadesivas das membranas;
Avaliar o perfil de intumescimento das membranas;
Avaliar a viabilidade celular em cultura de macrófagos;
Analisar a atividade antimicrobiana das membranas em Staphylococcus aureus e
Escherichia coli.
24
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38
CAPITULO II
Gelatin-based mucoadhesive membranes containing thymol/ β-cyclodextrin
inclusion complexes for treatment of oral infections
Artigo será submetido na International Journal of Pharmaceutics
Fator de impacto de 3.862
Qualis Farmácia A2
39
1 2 Gelatin-based mucoadhesive membranes containing inclusion complex of thymol/ β-
3 cyclodextrin for treatment of oral infections
4 5 6 Lana Silva Santos1*, Bruno dos Santos Lima1, Tatianny de Araújo Andrade1, Yasmim Maria
7 Barbosa Gomes de Carvalho1, Ana Maria Santos Oliveira1, Eloísa P. Barros Silva Soares de
8 Souza1, Cochiran Pereira dos Santos2, Luiza Abrahão Frank3, Sílvia Stanisçuaski Guterres3,
9 Álvaro Silva Lima4, Marco V. Chaud5, Thais Ribeiro Alves5, Lucindo José Quintans Júnior1,
10 Adriano Antunes de Souza Araújo1, Mairim Russo Serafini1
11 12
13 1Pharmacy Department, 2Physics Department. Federal University of Sergipe, Marechal 14 Rondom Avenue s/n, São Cristóvão, SE, Brazil.
15 3 Post-Graduation Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio Grande do 16 Sul, Ipiranga Avenue 2752, Porto Alegre, 90610-000, RS, Brazil.
17 4Institute of Technology and Research. Tiradentes University, Murilo Dantas Avenue 300, 18 Aracaju, SE, Brazil.
19 5LaBNUS – Biomaterials and Nanotechnology Laboratory, University of Sorocaba, Rodovia
20 Raposo Tavares, Sorocaba, 18023-000, SP, Brazil 21 22
23 ABSTRACT
24 Oral infections are associated with changes in the oral microbiota and also with the appearance
25 of systemic diseases. Among the natural products commercially used in dental formulations is
26 thymol (TM). However, this compound presents some limitations related to its physical-
27 chemical and pharmacological stability. Many strategies have been explored and developed,
28 including the use of mucoadhesive systems containing inclusion complexes (IC). The
29 membranes were prepared by the solvent evaporation method and TM/β-CD by the liofilization
30 technique. The results showed that the presence of IC in the membranes causes considerable
31 modifications in the physical-chemical, morphological and mucoadhesive (>60%) properties.
32 The membranes presented antimicrobial activity, against Escherichia coli and Staphylococcus
33 aureus. In addition, demonstrated a safety in the MTT assays. These data show that
34 mucoadhesive membranes containing IC may be promising systems for TM delivery in the
35 treatment of oral infections. 36
37
38 KEYWORDS: thymol, oral infections, mucoadhesive, gelatin, inclusion complex. 39 40 41 42 43 44 45 46
40
47 Abbreviations
48 β-CD: β-cyclodextrin
49 TM: Thymol
50 IC: Inclusion complex
51 XRD: X-ray diffraction
52 ATR-FTIR: Attenuated Total Reflectance-Fourier Transform Infrared
53 SEM: Scanning electron microscopy
54 DSC: Differential Scanning Calorimetry
55 TG: Thermogravimetry
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
41
75 1. Introdução
76 The oral cavity is considered the second most complex microbiota in the human body,
77 behind only the colon (Wade, 2013). Approximately 700 species are present,
78 including bacteria, fungi, viruses, archaea and protozoa (Idris et al.,2017; Zhang et al., 2018;
79 Palmer, 2013). Changes in microbial flora, results pathological proliferation of microorganisms
80 and the development of oral infection, including caries, gingivitis, periodontitis, candidiasis
81 (Bugsha et al., 2017). These diaseases can affect vital organs and cause systemic infection, such
82 as cardiovascular disease, bacteremia, ischemic stroke, disease of gastroesophageal reflux,
83 diabetes, lung disease, prematurity, dementia and various types of neoplasm (Khocht and
84 Albandar,2014; Kelsey and Lamster, 2008).
85 Mouthwash containing essential oils (EOs) are among the most studied and
86 commercialized therapeutic agents, due to their antimicrobial activity and safety (Kalemba and
87 Kunicka, 2003; Dali et al.,2015). Among the constituents of EOs, stands out the TM, a
88 monoterpene present in plants of the genus Lippia, Thymus, Ocimum, Otiganum and Monard
89 (Elshafie et al., 2015; Licata et al, 2017). This compound acts through the interaction between
90 the hydroxyl groups, present in their structure and the cell wall of microbes, reducing the protein
91 content and lipopolysaccharide (Marchese et al.,2016). However, it presents limitations, regards
92 to its odor, low solubility in water and high volatily, restricting its therapeutic application
93 (Buchabauer and Wallner,2016).
94 An alternative is the use of cyclodextrins (CDs), cyclic oligomers composed by 6-8
95 units of glucopyranose bonded together by a-(1,4) linkages (Conceição et al., 2018). The CDs
96 are recognized as pharmaceutical excipients, considering the ability to form IC with a wide
97 range of substances (Conceição et al., 2017). Among the CDs, β-CD is the most used due to its
98 low cost (Huang et al.,2013; Porte et al., 2014). The formation of inclusion complexes presents
99 several advantages, including the improvement in physical-chemical stability, the solubility and
100 bioavailability of drugs (Adeoye and Cabral-Marques, 2017; Salústio et al., 2011).
101 Despise the advantages and growing number of technological applications of CDs,
102 many questions regarding intraoral therapeutic use are still open. The CDs do not have
103 mucoadhesive properties, this results in short residence times on the mucosal surface and
104 consequently, low therapeutic effect of the incorporated drugs (Stappaerts and Augustijns,
105 2016).
42
106 In this context, in recent years oral mucoadhesive systems have been extensively
107 investigated. These systms are able to adhere to the mucosa and prolong the residence time at
108 the site of action, thus increasing the efficacy of the drug (Sogias et al.,2012; Mansuri et al.,
109 2016). Several mucoadhesive polymers have been proposed for oral application (Russo et al.,
110 2016; Salamat-Miller et al., 2005). Gelatin is one of the most widely used biopolymers due to
111 its high biocompatibility, biodegradability, bioadhesiveness and low cost (Sarem et al.,2016;
112 Chirani et al.,2015, Dang et al.,2018; Xing et al.,2014).
113 Several EOs and release systems, such as nanoparticle and CDs were inserted into
114 mucoadhesive films of gelatin (Bonilla et al.,2018; Nourbakhsh et al.,2017; Dang et al.,2018).
115 There is evidence in the literature that the use of mucoadhesive systems containing IC of TM/β-
116 CD can improve release kinetics and the physicochemical properties of TM in food films
117 (Li Zhang et al.,2018).
118 In this sense, we are aiming at the therapeutic application of TM in the treatment of oral
119 infections. Our study aims to develop mucoadhesive membranes containing TM/β-CD as a
120 potential drug delivery system for the treatment of oral infectious diseases. In addition, this
121 work evaluates the influence of IC on the gelatin membranes, in relation to physical-chemical,
122 morphological properties and antimicrobial activity.
43
123 123
124 124
125 125
126 126
127 127
128 128
129 129
130 130
131 131
132 132
133 133
134 134
135 135
136 136
137 137
184
231
232
233
234
235
236
237
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239 240
241
242
243
244
245
246
44
2. Ma
t
e
r
i
a
l
s
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m
e
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h
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d
s
2.1. Ma
t
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i
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G
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l
a
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i
n
(
t
y
p
e
B
,
bovine skin) obtained from NP food products LTDA (São Paulo, Brazil), Thymol (purity
≥98.5%, lot #MKBW6202V), was acquired from Sigma-Aldrich® (St. Louis,USA), β-CD
from Wacker Chemie AG (Burghausen, Germany), propylene glycol (PPG) from SYNTH
(São Paulo, Brazil), acetic acid analitical grade from NEON®, (São Paulo, Brazil), Getamicin
antibiotic, fetal bovine serum (FBS) and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (MTT) were procured from Sigma-Aldrich (St. Louis,USA). All
other chemicals used were of analytical grade.The bacterial samples were obtained from
Department of Pharmacy, Federal University of Sergipe, Lagarto, Sergipe, Brazil. Distilled
water was used throughout the experiment.
2.2. Preparation of IC (TM/β–CD)
Freeze-drying method (FD) was used to prepare TM/β–CD of according to Hill et al.
(2013) and Tao et al. (2014). The FD was carried out by adding distilled water (20 mL)
containing IC in the molar rations of 1:1 (TM - 150,22 g/mol-1 and β-CD - 1135 g/mol-1). The
solution was strirred by a magnetic stirring device operating at 150 rpm (Quimis Q 261A21,
Brazil) at room temperature for 36 h. After mixing, the solution was frozen at 50°C and
lyophilized in a freeze-dryer until all moisture had been sublimated. The lyophilized powder
was stored in sealed containers inside a desiccator at 25°C.
2.3. Membranes Preparations
Gelatin-based membrane containing IC was prepared in two steps. First a solution
containing gelatin (1%) in 0.5 M acetic acid with 2% of PPG was created and mechanically
stirred for 12 hours. At the same time, a solution containing TM/β-CD (2.2) was added. The
two solutions were then mixed for 24 hours and poured into Petri dishes at 25 ± 2 ºC during
five days to allow the solvent evaporation (Table 1). Subsequently, a dry membrane was formed
on the plate. This method of preparation was adapted from Nunes et al., 2016.
45
247 2.4. Characterization of Membranes
248
249 2.4.1. Quantification of TM Release from TM/β-CD IC and G/TM/β–CD Membrane
250 The amounts of TM in TM/β-CD complexes and G/TM/β–CD membrane film determined
251 by HPLC-UV (Shimadzu, Kyoto, Japan) method at the chromatographic conditions described
252 in SM (supplementary material) (Trindade et al., 2019). The procedures were as follows: for
253 IC, 0.5 g of sample with 10 mL of acetonitrile for 20 min was stirred (250 rpm) as described
254 by Hill et al. (Hill et al., 2013). For membrane G/TM/β–CD, the samples with area of 7 cm2
255 were dissolved in 10 mL of acetonitrile and after kept under constant stirring (250 rpm) for 20
256 min (Perez, 2011). The resulting solutions were centrifuged at 3200 rpm for 15 minutes to
257 remove any β-CD from the solution, leaving only the active compound. The supernatant was
258 collected and filtered on 0,45 µm membrane filter (PTFE) . The Entrapment Efficiency (EE)
259 was calculated according to equation 1:
260 260 Amout of active compound entrapped
261 261
262 262
263 263
𝐸𝐸% =
2.4.2. Thermal Analysis
Initial amount of active compound 𝑥 100 (1)
264 The thermal analyzes of the samples were conducted by Differential Scanning
265 Calorimetry (DSC) and Thermogravimetry (TG/DTG). TG/DTG and DSC curves were
266 obtained in the temperature range of 25 to 600 °C and 25 to 300°C respectively using DSC-60
267 (Kyoto,Japan) and TGA-60 Instruments from Shimadzu (Kyoto,Japan) under dynamic nitrogen
268 atmosphere (50 mL.min-1) and heating rate of 10°C/min-1 utilizing aluminum (DSC) and
269 platinum (TG/DTG) crucibles with approximately 2 mg of the sample. The equipment was
270 calibrated with calcium oxalate (purity 99.99%) according to ASTM. Further graphs were
271 plotted by Origin Pro 8 software.
272 272
273 2.4.3. Attenuated Total Reflectance-Fourier-transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTI-R)
274 ATR-FTIR spectra of the samples were perfomed on a IRTracer 100 spectrometer from
275 Shimadzu (Kyoto, Japan) with resolution of 4 cm−1. The samples were scanned in the spectral
276 region between 4000 and 500 cm−1 at room temperature.
46
277 2.4.4. X-ray diffraction (XRD)
278 XDR patterns of the samples were obtained using a Rigaku diffractometer equippped
279 with monochromatized Cu-Kα radiation and analysed over a 2θ angle range 5–60°. The XRD
280 patterns were collected with tube voltage of 40 kV and tube current of 40 mA in a stepwise scan
281 mode (1 s-1).
282
283 2.4.5. Scanning Electron Microscopy (SEM)
284 The samples were mounted on aluminum stubs, metallized with gold beams and
285 visualized with a scanning electron microscope (Jeol JSM-6480LV, Tokyo, Japan) at an
286 accelerated 200 voltage of 7 kV.
287 .
288 2.4.6. Thickness 289
290 The thickness of the membranes were measured using a manual micrometer (High-
291 Accuracy Digimatic Digital Micrometer, USA). Five different points of samples were
292 evaluated.
293 294 2.4.7. Swelling Studies
295
296
297
298
299
300
301
302
303
The swelling studies of the membranes (2 x 2 cm2) were evaluated by the immersion
technique (Hasanabadi et al.,2011). The membranes were immersed in phosphate buffer pH 7,
4 at 37± 2 °C. To determine the degree of swelling, the samples were weighed at different time
intervals 0, 30, 60, 90, 120, 150 and 180 minutes. All samples were performed in triplicate. The
swelling ratio was calculated using the following equation 2:
Swelling (time) = (Wi−𝑊𝑓) 𝑥 100 (2) 𝑊𝑓
Where, Wi is the initial weight and Wf is the final weight.
304 2.4.8. Mucoadhesive Properties
305 The mucoadhesive properties of the samples were analyzed by mechanical testing
306 method (Nelly et al., 2008). A TA-XTplus texture analyzer (Stable Micro Systems, Surrey,
307 United Kingdo) was utilized to investigate the adhesive properties of the formulations. Mucin
308 discs from porcine stomach (150 mg) was prepared by compression using a ring press with a
309 13 mm diameter and a compression force of 10 tonnes, applied for 30 s.
47
310 The discs were fixed with double-sided cohesive tape on the lower base of the test piece
311 (n.15347) and previously hydrated with ultrapure. The samples were evaluated in speed
312 compression mode at 0.5 mm.s-1, under a force of 5g at 37°C. After 60 seconds of contact, the
313 test piece was moved in opposite direction at 1.0 mm.s-1 of speed. The results were detected by
314 Texture Expoente Lite software. All analyzes of the membranes were performed in triplicates.
315 2.4.9. Cell culture experiments
316 Cells of the J774G8 lineage were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's
317 Medium) medium and supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum). Cells were incubated
318 at 37 °C under humidified atmosphere of carbon dioxide incubator. After 24 hours the growth
319 medium was removed.
320 2.4.10. Cytotoxicity Assay
321 For this study, initially 1x104 cells were seeded to each well of a 96 well-plate and
322 incubated overnight. Cytotoxicity experiments were performed on J774G8 cells first with free
323 TM, TM/β-CD, G/TM/β-CD (5 x 5 cm²) and G/TM (5 x 5 cm²) membranes at two
324 concentrations of 50 and 100µg/mL, duranting a period of about 72 h. Control cells treated
325 with triton-x (TXT) 100 were also maintained for comparing growth inhibition. For cytotoxicity
326 tests, MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] assay was used.
327 Briefly, MTT and DMEM were mixed at a ratio of 5:1. Then, prepared MTT solution was
328 diluted with PBS (0.01 M, pH 7.4) at 1:10 ratio. MTT solutions (100 μl) were added to each
329 well and plates were incubated for 5 h at 37 °C in dark. The MTT solution was removed and
330 100 μl DMSO was added to each well for 15 min by continuous shaking. Then, the optical
331 densities were measured by spectrophotometer with microplate reader at 570 nm (Ferrari et al.,
332 1990). Each experimental group was studied in quaternary replicates in a plate with three
333 technical replicates (n=3). Percent cellular viability values were calculated by accepting only
334 cell wells as the control with 100% cell viability.
335 2.4.11. Antimicrobial Assay
336 The antibacterial activity of the samples were evaluated using the agar diffusion assay.
337 The samples were tested against S. aureus and E. coli. Briefly, 200 µl of 108 UFC/mL grown
338 cultures were spread onto sterilized agar plates. After this procedure, the samples were
339 applied to 6mm filter paper disks and put on the surface of agar plates.
48
340 The marketed Getamicin ointment was used as positive control. The plates were then
341 kept overnight in an incubator at 37°C for observing the zone of inhibition. All experiment was
342 performed in triplicate (n=3).
343 343
344 2.5. Statistical analysis 345 345
346 Data analyses were performed using GraphPad Prism 5.0 software (San Diego, CA, USA).
347 Results were evaluated by one-and-two-way Analysis of Variance (ANOVA) with Tukey’s
348 post-test (p < 0.05) was considered statistically significant.
349 349
350 3. Results and discussion
351 The drug quantification is a parameter used to calculate the amount of active compound
352 presented on a carrier (Da Rocha Neto et al.,2018). Fig. S-1 shows the chromatogram of TM
353 with UV absorption spectra at 274 nm and retention time of 6.8 minutes obtained after the
354 development of the analytical method by HPLC. The results listed in Table 2.showed that the
355 incorporation of TM/β-CD exhibited efficiently a good complexation, obtaining 77,87 ±
356 0.028% EE, while the content of TM released into the G/TM/β-CD membranes was 10,42 ±
357 0,05 mg/mL. According to Astray et al. (2009) and Li et al. (2018), several factors can influence
358 in this results, including physical properties molecules, chemical interactions and the method
359 used in the preparation of the formulation.
360 Thermal analysis refers to tecniques that investigate changes in the thermal properties
361 of materials (Mukasyan, 2017). As it can be seen, Fig. 1A and B present the thermal behavior
362 of the samples obtained by TG/DTG and DSC. TG/DTG curves of TM (Fig. 1A) between 25
363 and 100°C showed weight loss of 5.06%, related to its volatilization (Celeblioglu et al., 2018).
364 The thermal decomposition of this monoterpene was observed between 100 and 290°C. The β-
365 CD demonstrated exhibithed two endothermic events in the temperature ranges of 25 to 100ºC
366 and between 290-600°C with weight losses of 10.08% and 86.13%,respectively. The first event
367 of β-CD, showed the release of water molecules on its surface and the second was attributed to
368 its thermal decomposition (Zarif et al., 2012; Barbieri et al., 2018).
369 The TM/β-CD, presented low percentage of weight loss of 11.34% between 100-290°C,
370 probably related to TM complexed, due to decomposition of this monoterpene (Fernandez et
371 al., 2004). TG/DTG curves of the G-B and G/TM membranes showed similarities with weight
372 loss of 8.12% and 10.34% in the range of 25-100°C, corresponding to the release of water,
373 followed by decomposition of gelatin at 100-290°C and degradation (Nunes et al.,2010; Gutam
374 et al.,2013; Moreno et al., 2017).
49
375 The G/TM/β-CD membranes exhibited weight loss continued after 190°C indicating
376 that the gelatin membranes increases the stability of TM and gelatin, as described by Dang et
377 al. (2018).
378 The DSC curves (Fig. 1B) of TM showed an endothermic event in temperature of
379 approximately 50ºC, related to its melting point, followed by the composition (Ponce Cevallos
380 et al., 2010; Celebioglu et al.,2018). The β-CD presented a broad thermal peak between 34 and
381 100ºC, indicanting to water release (Abarca et al.,2016; Pinto et al.,2005). TM/β-CD showed
382 the disappearance of an endothermic peak characteristic of TM in ~ 50ºC, suggested interaction
383 between the TM and β-CD (Nieddu et al.,2014). DSC curve of G-B membrane showed three
384 endothermic events in 110°C, 159°C and 250°C. Several authors attribute this endothermic
385 peaks to the overlapping of different process such aswater evaporation, melting and
386 recrystallization of small and/or imperfect gelatin crystallites, and association of the glass
387 transition of α-amino acid blocks in the polypeptide chain amino acids (Denavi et al.,2009;
388 Rivero et al.,2010; Fraga and Williams, 1985). In addition, a fourth endothermic event was
389 observed at 279°C, associated to its decomposition. G/TM membranes exhibited an event in the
390 temperature range of 25-78°C and 143°C, probably related to the loss of water present on the
391 gelatin suface (Nunes et al., 2010). Furthermore, Its was also observed in the temperature range
392 of 240-263°C the thermal degradation of this polymer. Therefore, the incorporation of IC TM/β-
393 CD in the membranes did not present any endothermic characteristic of gelatin. These results
394 suggest that TM was stabilized in TM/β-CD and additionally in gelatin membranes. Similar
395 results were described by Li et al. (2018).
396 The ATR-FTIR technique is widely used in the elucidation structural of materials and
397 employed also to observe any chemical interaction occurring between the two (Swaminathan
398 et al., 2007). The ATR-FT-IR was used to identify and determine possibilities of interaction
399 between the components of the formulation (Komati et al., 2018). Fig. 2A and B depicts the
400 ATR-FTI-R spectrum of TM, β-CD, TM/β-CD and G-B, G/TM and G/TM/β-CD membranes.
401 The ATR-FTI-R of TM showed characteristic band at 1450 cm-1 and 3100 cm-1,which are
402 associated with stretching of C=C corresponding of the aromatic ring and the asymmetric
403 stretching of the hydroxyl (-OH) group of the phenol, respectively (Rukamani and
404 Sundrarajan, 2011; Celebioglu et al. 2018).
50
405 ATR-FT-IR of the β-CD, the band at 3385 cm -1 represents the asymmetrical
406 stretching of the hydroxyl (OH) group and the region of 2925 cm-1 is associated with C-H
407 stretching vibrations.
408 The absorption band at 1645 cm-1, corresponds the angular deformation of the H-
409 O-H bonds, while the region between 1157 cm -1 and 1029 cm-1 associated with the
410 asymmetric and symmetrical stretching of C-O-C (Wang et al.,2014; Abarca et al., 2016).
411 IC TM/ β-CD showed characteristic overlapping bands of TM and β-CD. The spectra of
412 the G-B and G/TM exhibited a has wide adsorption band at 3327 cm-1 due to the stretching
413 of –OH and -NH (Jalaja and James, 2015; Chen et al., 2018). In addition, characteristic
414 bands at 1651, 1546 and 1245 cm-1 correspond to amide I (tensile vibration of CO), amide
415 II (bending vibration of NH) and amide III (stretching vibration of CN and N), respectively
416 (Ma et al., 2012; Chen et al., 2018). The infrared absorption of G/TM/β-CD membranes
417 showed an increase in band intensity at 1025 cm-1 in its wavenumbers, associated with
418 symmetrical stretching of ethers C-O-C of presented in the structure of CDs. These events
419 may be due to the interatomic bonds between gelatin and TM/β- CD.
420 XDR is an analytical tecnique used in the identification of the morphological and
421 structural characteristics of malterials (Bunaciu, Udristioiu & Aboul-Enein, 2015). XDR
422 partterns of TM, β-CD, β-CD/TM and G-B, G/TM and G/β-CD/TM membranes are present
423 in Fig. 3A and B. XDR of TM demonstred a series of thin and intense lines, which are
424 indicative of crystallinity (Barbieri et al., 2018). The ßCD presented a predominantly
425 crystalline profile between 10 and 60 θ, corroborating with the results obtained in the study
426 by Sun et al., 2010. The XDR of β-CD/TM showed overlapping of the main characteristic
427 spectral lines of β-CD and TM. However, as the TM was complexed in the β-CD,
428 characteristic peaks of this monoterpene in 12, 17 and 22 θ evidently disappeared.This
429 results can be attributes to changes in molecular organization, suggesting the formation of
430 IC (Abarca et al., 2016). G-B and G/TM membranes present two peaks, one of high
431 intensity and other of lower intensity around 39 and 45 θ, respectively. G/TM/β-CD
432 exhibited new diffration patterns in spectral lines, demonstring a reduction of crystallinity
433 of materials (Panduratu et al., 2010).
434 434
51
435 435
436 The investigation of the morphology of the superface of samples were performed by
437 scanning electron microscopy. The SEM of TM, β –CD, TM/β-CD and G-B, G/TM and
438 G/TM/β-CD are illustrated in Fig. 4. The TM showed the presence of crystals of different
439 sizes and geometric shapes, as was observed by Barbieri et al., 2014. The β-CD also
440 presented crystal structure of irregular sizes in monocyclic parallelogram format. The
441 decrease in size and cristallinity of TM and β–CD was seen in TM/β-CD (Dou et al.,2018).
442 Gelatin-based films generally has regular and smooth surface, as shows the SEM of the G-
443 B membrane (Nilsuwan et al., 2018). G/TM/β-CD revealed the presence of pores in the
444 central surface its sctructure, while TM/β-CD exhibited compacted and homogeneous
445 morphology, suggesting the complete solubization of IC TM/β-CD in polymer network
446 (Dang et al., 2018).
447 The thickness of the membranes is an essential parameter that ensures uniform
448 distribution of the drugs and the excipients present in the formulation (Abo et
449 al.,2016). The thickness of the membranes was found in the range of 0.43 ± 0.09 to 0.71 ±
450 0.09 mm. The increase in tchikness was observed after TM/β-CD incorporation. However,
451 all results may be considered suitable for application to the oral mucosa. (Ansari et al.,
452 2018).
453 Swelling studies gives an insight into the water imbibing capability in polymers and
454 show influence the release profile of the drug (Carbinatto et al.,2014). Fig. 5 shows the
455 swelling profile of of G-B G/TM and G/TM/β-CD membranes. Gelatin is formed by strong
456 polar functional groups: amines and amides for gelatin and carbonyl and hydroxyl groups,
457 which contributes to water adsorption into the membrane (Kirdponpattara et al., 2017). The
458 graph suggested that with the initial TM incorporation caused a decrease in water uptake
459 of gelatin membranas. However, swelling capacity of the gelatin membrane was increased
460 (>60%) with incorporation of IC TM/β-CD (Padhi et al., 2018). This result was observed
461 due the presence of groups (-OH) in the external cavity of β-CD which form
462 interconnections with gelatin and can interact with water molecules, resulting in higher
463 degree of swelling.
464 The mucoadhesive properties are associated with diferent physic-chemical
465 interactions which define the strength and adhesion time of the polymer with the surface
466 of the mucosal membrane (Tangri et al., 2011). In the present investigation of the
467 mucoadhesive properties of the of the G-B, G/TM and G/TM/β-CD membranes (Table 3).
468 It is possible to observe in the results that membranes containing G-TM/β-CD showed
52
469 greater adhesive properties that G-TM. The chemical nature of β-CD increase the capability
470 of gelatin to interact with mucin (Hoque et al., 2011; Li et al.,2018; Chen et al.,2018). Thus,
471 these results suggest that the interaction of the G /TM/β-CD membranes with mucin did
472 not occur through the electronic theory and could therefore be understood by different
473 theories.
474 The cell viability assay by reducing MTT to formazan showed that the cells
475 remained viable, with MTT reduction percentage comparable to the 10% DMEM control ,
476 when treated with the compounds at doses of 50 and 100 μg/mL for 72
477 hours. Each treatment was done four times and an n = 3 experiments, the graph related to
478 the test are shown in Fig. 6. This is an indication that formulations may show no toxicity for
479 the cells, since they do not interfere in its viability, demonstrating a possible safety of the
480 formulation. Through the analysis of the MTT reduction percentage was calculated from
481 the absorbance values, observed that the treatments presented levels of cellular viability
482 comparable to the control (p<0.001) that corresponded to the cells without treatment. These
483 data indicate that the test compounds did not interfere with cell viability under the
484 conditions tested, indicating a lack of toxicity and possible safety of the formulations in the
485 body. The J774 cell line is derived from rat macrophages and is widely used in biological
486 assays in the scientific setting. The use of this lineage is justified because the macrophages
487 are the first line of defense of the organism and a cellular type distributed throughout the
488 tissues (Dong et al., 2018).
489 The antimicrobial activity of the samples was evaluated through the conventional
490 agar diffusion method. This method is considered the fastest and simplest for the
491 determination of antimicrobial susceptibility in vitro (Bose et al., 2018). Table 4 presents
492 the results of the microbiological analysis. The results showed that TM at concentrations
493 of 0.5-3.0 μg/mL exhibited excellent antimicrobial effects at concentrations 0,5-3,0
494 µg/mL with inhibition diameters of 35 ± 0.49 mm in Staphylococcus
495 aureus species, similar to the positive control 35 ± 0.40 mm.
496 In assays with Escherichia coli, the TM showed diameters of only 20 mm using the
497 same concentration. These results are in accordance with those obtained by Madigan et al.
498 (2010),that also evaluated the antimicrobial activity of TM in stains of Staphylococcus
499 aureus and Escherichia coli, suggest that this behavior may be associated with the cell
500 composition of gram-negative and gram-positive bacteria, since their mechanism of action
501 is associated with cellular membranolysis.
53
502 The E. coli presented a thin layer of peptidoglycan and an outer layer of
503 lipoproteins, lipopolysacharides and phospholipids, while the cell wall of S.
504 aureus comprises a peptidoglycan layer with many pores. The structure of the porous cell
505 wall of S. aureus may facilitate the TM action (Madigan et al., 2010; Trombetta et al.,
506 2005). The IC TM/β- CD and G/TM/β- CD membrane in equivalent concentrations
507 exhibited a lower effect that TM (p <0.05) for Staphylococcus aureus with diameters of 5,0
508 ± 0.082 mm and 6,5 ± 0.166 mm and also for Escherichia coli, exhibited zones of
509 inhibition of 5,1 ± 2.357 mm and 4,0 ± 0,141 mm. This result was obtained by Aytac et
510 al. (2017), that showed which that complexations of TM/ β-CD can affect in the release
511 capacity of TM, retarding or prolonging the antimicrobial effect. Thus, release studies
512 should performed to confirm this behavior.
513 513
514 4. Conclusion
515 The results of the present study showed that the addition of TM/β-CD in the molar
516 rations of 1:1 on gelatin membranes obtained by solvent evaporation method was
517 successful. The presence of β-CD can increase the thermal stability, swelling rates and the
518 mucoadhesiveness of gelatin membranes, due to the chemical interaction between the
519 hydroxyl group of β-CD and the functional groups of gelatin that allow the entry of water
520 on the surface of membranes. In addition, an antibacterial effect of the membranes on
521 species of S. aureus and Escherichia coli. These results confirm that the membranes
522 containing IC can be used in the TM delivery, but also open the possibility to perform
523 future searches in vitro release studies and animal models.
524 524
525 5. Acknowledgments
526 The authors are grateful to National Council for Scientific and Technological
527 Development - CNPq and Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Sergipe -
528 FAPITEC-SE for the financial support. Instituto de tecnologia e pesquisa - ITP and
529 University of Sorocaba - Uniso for perfoming out the tests.
530 6. Conflict of Interests
531 The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication
532 of this paper.
54
533 7. References
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813 Figure Legends
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815 Fig. 1. TG/DTG (A) and DSC (B) curves of thymol (TM), β -cyclodextrin (β-CD), TM/β-
816 CD and G-B,G-TM and G-TM/β-CD membranes under dynamic nitrogen atmosphere and
817 heat rate of 10 °C min-1.
818
819
820 Fig. 2. ATR- FT-IR spectra of TM, β-CD and TM/β-CD (A); and G-B, G/TM and G/β-
821 CD/TM membranes (B) obtained in the spectral range 4000-500 cm-1 at room temperature.
822
823 Fig. 3. XDR patterns for (A) TM,β-CD and TM/ β- CD; and (B) G-B, G-TM and G-TM/
824 β-CD membranes.
825
826 Fig. 4. SEM images of TM, β-CD,TM-β-CD and G-B, G/TM, G/TM/ β-CD membranes.
827
828 Fig. 5. Swelling profile of G-B, G/TM and G-TM/ β-CD membranes. (*, p<0.05, ***
829 p<0.001 when compared to control without the drug, one-way ANOVA with Tukey’s post-
830 test, n=3).
831
832 Fig. 6. MTT cell viability test with macrophages of the J774 lineage. TM, TM/β-CD and
833 G/TM, G/TM/β-CD at concentrations of 50 and 100 µg/mL through 72h. (***, p < 0.001
834 when compared to control, one-way ANOVA with Tukey’s post-test, n=3).
835
836
837
838
839
840
841
842
843
844
845
846
64
847 Table 1. Formulations of gelatin membranes and composition.
Sample Gelatin (%) PPG (%) TM (mg) TM/β-CD
G-B 1 2 - -
G/TM 1 2 150mg -
G/TM/ β-CD 1 2 - 1:1
848 849 Table 2. Entrapment efficiency (EE) of TM/β-CD inclusion complexes and drug content
850 values of G/TM/ β-CD membrane. 851
Sample EE (%)* Drug content (mg/mL)*
TM/ β-CD
77,87 ± 0.028
-
G/TM/ β-CD
-
10,42 ± 0.05
*Values given are averages and standard deviations of three replicate sample.
852
853 Table 3. Mucoadhesion testing of G-B, G/TM and G-TM/ β-CD in mucin dispersion at
854 and pH 7.4 855
Sample Peak positive force
(N)*
Work of adhesion
(N.s-1)*
Deformation of peak
(mm)*
G-B 0.791 ± 0.175 0.287 ± 0.042 0.430 ± 0.128
G/TM 0.687 ± 0.071 0.294 ± 0.049 0.279 ± 0.068
G/TM/ β-CD 0.903 ± 0.114 0.374± 0.072 0.493 ± 0.195
856 857 *Values given are averages and standard deviations of three replicate samples.
858
859 Table 4. Antimicrobial activity of Getamicin, TM, TM/ β-CD and G-TM/ β-CD using
860 diffusion assay.
Sample Staphylococcus aureus (mm)* Escherichia coli (mm)*
Gentamicin 35 ± 0.40 25 ± 0.370
TM 35 ± 0.49 20 ± 0.094
TM/ β-CD
G/TM/ β-CD
6,5 ± 0.166 a
5,0 ± 0.082 a
5,1 ± 2.357b
4,0 ± 0,141b
861 *Values given are averages of three replicate samples; standard deviations are displayed.
Inhibitory diameter values with differing superscript letters indicate significantly
different values (p < 0.05).
65
862
863 List of Figures 1-6
864
865 A B
866
867
868
869
870
871
872 Fig. 1.
66
873
874
875 A B
876
877
878
879
880
881
882 Fig. 2.
883
884
885
886
887
888
889
890
891
892
67
893
894 A B
895
896
897
898
899
900 Fig. 3.
901
902
903
904
905
906
907
908
909
68
910
911
912
913
914
915
916
917 Fig. 4.
918
919
920
921
922
923
69
924
925
926
927
928 Fig. 5.
929
930
931
932
933
934
935
936
937
938
939
940
941
942
943
944
*** ***
***
* *
71
p < 0 ,0 0 1
1 0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
0
C o n tro l
TX
T M 5 0
T M /B -C D 5 0
G /T M 5 0
G /T M /B -C D 5 0
T M 1 0 0
T M /B -C D 1 0 0
G /T M 1 0 0
G /T M /B -C D 1 0 0
T r e a tm e n ts (7 2 h )
945 946
947 Fig. 6
948
949
950
951
952
953
954
955
956
957
958
959
960
961
962
963
964
965
966
967
***
M T
T r
e d
u c
t i
o n
(%
)
71
968
969
970
971
972
973
974
975
976
977
978
979
980
981
982
983
984
985
986
987
988
989 990 991
992
993
994
995
996
997
998
999
1000
1001
1002
1003
1004
1005
1006
1007
Supplementary Material
Fig. S-1 – TM chromatographic profile analyzed with UV absorption spectra at 274 nm
and retention time of 6.8 minutes obtained after the development of the analytical method
by HPLC.
5. CONCLUSÃO GERAL
As membranas de gelatina contendo CI de timol/β-CD foram caracterizadas pelas
técnicas de TG/DTG, DSC, FTI-R, DRX, MEV, mucoadesão e intumescimento. Além
delas, também foram realizadas análises microbiológicas e de viabilidade celular em
macrófagos.
Os resultados mostraram que houve alterações na propriedades físico-químicas das
membranas de gelatina após a incorporação dos CI. Nas análises térmicas, as curvas do
TG/DTG mostraram que houve um aumento na estabilidade térmica do TM e da gelatina.
Essas observações corroboraram com a curva DSC, que não apresentam nenhum evento
endotérmico característico ao ponto de fusão ou degradação do TM, como também nada
relacionado com a gelatina. As análises estruturais realizadas através do FTI-R, DRX,
MEV mostraram que houve uma interação do polímero com TM/ β-CD. O FTI-R
apresentou um aumento na intensidade da da banda característica do grupamento éter (C-
O-C), presente na estrutura química da β-CD. Os difratogramas da G/TM/β-CD mostrou
sobreposição da cristalinidade da β-CD e do TM.
As análises de intumescimento e mucoadesão, ambas significativas no
estabelecimento da mucoadesividade confirmaram a influência da incorporação do TM/ β-
CD em membranas de gelatina através do comparativo com G-B e G/TM. A viabialidade
celular em macrófagos J774, pode confirmar a segurança dessas formulações.
As análises antimicrobianas com espécies de S. aureus e Escherichia coli
mostraram diâmetros inibitórios de 5,0±0.082 mm e 4.0 ± 0.141 mm, respectivamente.
Resultados inferiores ao TM livre, utilizando a mesma concentração. Estudos anteriores
associam esse comportamento a liberação do TM em β-CD, que pode resultar em efeitos
antimicrobianos retardantes ou prolongados. Entretanto, a confirmação dessas evidências
só será possível após análises de liberação do TM, que já estão sendo realizadas pelo grupo.
