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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

VINÍCIUS BATISTA DE CASTRO

AVALIAÇÃO DO METABOLISMO DE NITROGENIO NA FASE REPRODUTIVA

DO CAFEEIROS SOB DÉFICIT HÍDRICO

VIÇOSA – MINAS GERAIS

2016




Relatório final, apresentado à Universidade Federal

de Viçosa, como parte das exigências para a

obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.

Orientador: Herminia Emília Prieto Martinez

Coorientadores: Cléberson Ribeiro

Webert Saturnino Pinto

VIÇOSA – MINAS GERAIS

2016




Relatório final, apresentado à Universidade Federal

de Viçosa, como parte das exigências para a

obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.

APROVADO: 21/11/2016

Prof. Herminia Emília Prieto Martinez

(orientador)

(UFV)

RESUMO

O nitrogênio (N) é o elemento requerido em maior quantidade pelo cafeeiro, porém sua

eficiência de uso é consideravelmente baixa, da ordem de 50%. A ativação das enzimas chaves

no processo de assimilação de N estão diretamente ligadas à sua disponibilidade para as plantas,

e portanto, aos aspectos de fertilidade e disponibilidade hídrica dos solos, bem como à fenologia

e fatores genéticos das plantas. É fundamental entendermos os mecanismos metabólicos e

fisiológicos relacionados a absorção e assimilação do N com o objetivo de aprimorar as práticas

agrícolas durante o ciclo de cultivo do cafeeiro, afim de otimizar o aproveitamento da água e

nitrogênio. O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil metabólico de N ao longo das fases

fenológicas de pré-floração, floração/chumbinho, primeira expansão rápida e granação, em

folhas, raízes e seiva do xilema do cafeeiro (Coffea arabica L.) cv. Catuaí Vermelho IAC 99,

sob condições de suficiência de água e estresse hídrico moderado. O experimento foi conduzido

em casa de vegetação com plantas adultas em fase reprodutiva cultivadas em solução nutritiva.

O déficit hídrico foi induzido pela adição de polietilenoglicol 6.000 g mol-1 à solução nutritiva.

Após o período de condicionamento pré-experimental com restrição nutricional, procedeu-se

um ensaio de exaustão de NO3-. Após a estabilização do sistema, aproximadamente três horas

do início do ensaio, foram coletadas amostras de tecido foliar e raízes finas para determinação

da atividade das enzimas nitrato redutase (NR) e glutamina sintetase (GS). Também foram

coletados em cada avaliação os dados de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a. Ao final

do período de exaustão foram tomadas porções apicais de ramos novos para a extração da seiva

e avaliação dos teores de nitrato (NO3-) e amônio (NH4

+). O déficit hídrico reduziu

significativamente os valores da atividade da NR em folhas e não afetou significativamente a

atividade da GS. O déficit hídrico não influenciou a atividade da NR e GS em raízes. Os valores

de atividade da NR em folhas foram maiores na floração/chumbinho, enquanto as atividades da

GS foram maiores na pré-floração. As fases fenológicas não influenciaram na atividade das

enzimas relacionadas ao N em raízes finas. A concentração de NO3- na seiva não foi

influenciada pelo estresse hídrico, sendo que os teores mais altos foram observados na pré-

floração. As plantas sob estresse hídrico apresentaram maiores concentrações de NH4+ em seiva.

O déficit hídrico também afetou o potencial hídrico foliar, a fotossíntese líquida, taxa

respiratória, condutância estomática. Os parâmetros da fluorescência da clorofila a não foram

afetados de maneira significativa pelo déficit hídrico imposto.

Palavras-chave: atividade enzimática, déficit hídrico, Coffea arabica L.

ABSTRACT

In spite of being the most required mineral nutrient by coffee trees, the use nutrient efficiency

of nitrogen is considerably low, below 50% of total applied N. The activation of the key

enzymes in the process of N assimilation are directly related to their availability to the plants,

and therefore to the aspects of fertility and water availability of soils, as well as phenology and

genetic factors of plants. It is fundamental to understand the metabolic and physiological

mechanisms related to the uptake and assimilation of N with the objective of improving

agricultural practices during the coffee growing cycle in order to optimize the use of water and

nitrogen. The objective of this work was to determine the metabolic profile of N throughout the

phenological phases of pre-flowering, flowering/pin head fruit, fruit first fast expansion and

grain filling, in leaves, roots and sap of the coffee xylem (Coffea arabica L.) cv. Catuaí

Vermelho IAC 99, under conditions of water sufficiency and moderate water stress. The

experiment was conducted in greenhouse with adult plants at five years of age grown in nutrient

solution. Drought stress was induced by the addition of polyethyleneglycol 6000 g mol-1 to the

nutrient solution. After the pre-experimental conditioning period with nutritional restriction, a

NO3- exhaust test was performed. After stabilization of the system, samples of foliar tissue and

fine roots were collected approximately three hours after the start of the assay to determine the

activity of nitrate reductase (NR) and glutamine synthetase (GS) enzymes. The gas exchange

and fluorescence data of chlorophyll a were also collected at each evaluation. At the end of the

period of exhaustion apical portions of new branches were taken for the extraction of the sap

and evaluation of the levels of nitrate (NO3-) and ammonium (NH4

+). Drought stress

significantly reduced NR activity values in leaves and did not significantly affect GS activity.

The water deficit did not influence the NR and GS activity in roots. NR activity values in leaves

were higher at flowering/pin head, while GS activity was higher in pre-flowering. The

phenological phases did not influence the activity of N related enzymes in fine roots. The

concentration of NO3- in the sap was not influenced by water stress, and the highest levels were

observed in pre-flowering. Plants under water stress had higher concentrations of NH4+ in sap.

The drought stress also affected leaf water potential, net photosynthesis, respiratory rate,

stomatal conductance. The chlorophyll a fluorescence parameters were not affected

significantly by the imposed drought stress.

Keywords: enzymatic activity, drought stress, Coffea arabica L.

Sumário

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 7

2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 11

2.1. Condições experimentais ............................................................................................. 11

2.2. Esquema experimental ................................................................................................ 12

2.3. Condicionamento pré-experimental .......................................................................... 12

2.4. Determinação de tensão hídrica foliar ....................................................................... 13

2.5. Determinação do perfil metabólico relacionado ao N .............................................. 13

2.6. Preparo dos extratos para análises das atividades enzimáticas .............................. 13

2.7. Determinação da atividade da redutase do nitrato (NR) ......................................... 14

2.8. Determinação da atividade da glutamina sintetase (GS) ......................................... 14

2.9. Analise de trocas gasosas e da fluorescência da clorofila a ..................................... 15

2.10. Extração de seiva ..................................................................................................... 15

2.11. Determinação de NO3- e NH4

+ em seiva ................................................................. 16

2.12. Análises estatística ................................................................................................... 17

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 18

4. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 28

5. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 29

7

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, a cafeicultura é uma das principais atividades agrícolas no Brasil. Desde a

sua chegada na era Colonial, em meados do século XVIII, o cafeeiro adaptou-se rapidamente

ao solo e clima brasileiro, destacando-se economicamente, por movimentar mais de 90 bilhões

de dólares/ano, e apresentando um importante papel social por envolver cerca de 500 milhões

de pessoas em sua cadeia produtiva (MAPA 2016). O Brasil é o maior produtor de café do

mundo, com produção de 43,2 milhões de sacas de café em 2015 (CONAB 2016). O Brasil

ainda figura como o terceiro maior consumidor de café com 21 milhões de sacas e maior

exportador mundial, abastecendo o mercado externo de 2015 com 37,1 milhões de sacas

atingindo o faturamento de US$ 6,15 bilhões (CONAB 2016).

A produção nacional de café está presente em 15 estados brasileiros, sendo

predominantemente cultivada com a espécie arábica (Coffea arabica L.) por mini e pequenos

produtores. Dentre os estados brasileiros produtores, Minas Gerais se destaca por possuir a

maior área de cultivo, 1.008.039 hectáres, que representa 51,9% da área cafeeira e 57,3% da

produção nacional. Ainda assim, o estado é dividido em quatro regiões produtoras: Triangulo

Mineiro, Zona da Mata, Norte de Minas e Sul de Minas, dente as quais, a última se destaca com

51,8% da área de cultivo do estado e 48,4% da produção estadual (CONAB 2016).

A adubação nitrogenada é essencial em cafeeiros, tendo em vista a alta exigência deste

nutriente pelas plantas, sendo esse um dos nutrientes extraído em maior quantidade pela planta

e o segundo mais exportado pelos grãos (CATANI E MORAES, 1958). Considerando uma

lavoura com de 5.000 plantas por hectare, estabelecidas no espaçamento de 2 x 1 m, a

exportação foi da ordem de 490 kg ha-1 de N, sendo aproximadamente 125 kg ha-1 mobilizados

pelos frutos e consequentemente removidos pela colheita (MARTINEZ & NEVES, 2015). Este

nutriente participa da síntese de proteínas estruturais e enzimáticas, as quais são responsáveis

pela síntese de outras proteínas e de metabólitos secundários, assim como componentes da

estrutura celular, como ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios e pigmentos (LAWLOR, 1995).

A produtividade esperada interfere diretamente nas recomendações de adubação, em

que as doses podem variar entre 250 a 450 kg ha-1 de N para produtividades superiores a 1200

kg ha-1 (RIBEIRO, et. al., 1999; AGUIAR et. al., 2014). Entretanto, diferentemente da maioria

dos macronutrientes, a recomendação de adubação nitrogenada não se baseia em analises

química dos teores disponíveis no solo, devido a intensa atividade biogeoquímica deste

nutriente presente no solo, o que dificulta estimar sua disponibilidade para as plantas. A

8

recomendação é que a adubação seja feita com base na expectativa de produtividade

(exportação). A adequação das doses e as necessidades das plantas podem ser verificadas por

meio da diagnose foliar, sendo que para lavouras produtivas a faixa crítica está entre 2,90 e 3,20

dag kg-1 de matéria seca (MARTINEZ et. al., 1999).

Para otimizar as taxas de recuperação do N aplicado é necessário ajustar a dose e a época

de aplicação do fertilizante à demanda da planta. Para isso é preciso conhecer com mais detalhe

o processo de absorção de N, por meio de estudos dos parâmetros cinéticos em diferentes fases

fenológicas da cultura. Entretanto, a eficiência de absorção do nutriente não está associada

apenas aos fatores genéticos e fenológicos. Pesquisas revelam que cerca de 50% a 70 % do N

aplicado é perdido por lixiviação, desnitrificação, incorporação pela microbiota, erosão e

volatilização (GOOD et. al., 2004). Processos que além de prejudicar o aproveitamento das

plantas, ocasionam perdas econômicas, além de colocar em risco o ambiental (LEA &

AZEVEDO, 2006; VITOUSEK et al., 1997).

O ciclo do N é controlado por fatores físicos, químicos e biológicos, e afetado pelas

condições ambientais. Sabe-se que os estresses abióticos são importantes limitadores de

produtividade, por interferirem direta ou indiretamente na fisiologia da planta, podendo causar

ou potencializar outras condições de estresse. A absorção de N pelas plantas é regulada pelo

comprimento e volume das raízes, que por sua vez é influenciada pelo conteúdo e movimento

de água no solo. A medida que cresce no solo, a raiz encontra, ao longo da trajetória, nutrientes

que podem ser, então, absorvidos via interceptação radicular. No entanto, o contato entre o

nutriente e a raiz pode dar-se via outros mecanismos de transporte como fluxo de massa e

difusão (NOVAIS et. al. 2007). Estudos comprovaram que mesmo na presença de N mineral

na forma disponível na solução externa, plantas sob déficit hídrico podem apresentar absorção

reduzida deste nutriente (GONZALES-DUGO et.al., 2012).

O nitrogênio no solo encontra-se presente em diversas formas orgânicas e inorgânicas.

As espécies vegetais diferem na sua preferência por essas formas, mas a absorção de N ocorre

principalmente sob formas inorgânicas como nitrato (NO3-) e amônio (NH4

+) (WILLIAMS &

MILLER, 2001). Entretanto, a maioria das plantas preferencialmente absorvem o N na forma

de nitrato, sendo que a forma amoniacal em elevadas concentrações possui efeito toxico para

as plantas (COELHO et. al., 1991). Em solos cultivados, a concentração de N inorgânico pode

variar de micromolar (µM) a milimolar (mM) (MILLER et. al. 2007; MARSCHENER, 2012;

WANG et. al., 2012). Nessas condições variáveis de N disponível para as plantas, a aquisição

e assimilação ocorre por meio de transportadores de membranas que atuam em faixas

9

especificas quanto a afinidade por seu substrato, sendo os transportadores de baixa afinidade

(Low Affinity Transponter System – LATS) para concentrações acima de 1 mM, enquanto os

transportadores de alta afinidade (High Affinity Transponter System – HATS) responsáveis

pela aquisição de N em concentrações menores que 1 mM (MARSCHENER, H. &

MARSCHENER, P., 2012; WANG et. al., 2012)

Para cumprir sua função nutricional, o NO3- absorvido precisa ser reduzido a NO2

-

(Equação 1) e posteriormente a NH4+ (Equação 2) para então ser incorporado a compostos

orgânicos e exercer suas funções metabólicas ou poderá ser estocado no vacúolo

(MARSCHENER, H. & MARSCHENER, P., 2012).

A nitrato redutase (NR) considerada enzima chave neste processo e tem sido empregada

como marcador da capacidade de assimilar N externo (BEEVERS & HAGEMAN, 1980;

OAKS, 1994). De acordo com Patersson et. al. (2010) a atividade da NR é fortemente induzida

poucas horas após a adição de nitrato no meio. Segundo Hsiao (1979) déficits hídricos da ordem

de -0,8 MPa a -2,0 MPa, podem reduzir a produção de NR em até 20%, podendo esta redução

chegar a 50% caso o estresse hídrico seja intenso. Segundo Crocomo (1985) a baixa atividade

da NR em condições de estresse hídrico é consequência do decréscimo de NO3-, principal

regulador da síntese da enzima.

Em cafeeiros, o processo de redução do nitrito (NO3-) a amônio (NH4

+) é dividido em

duas partes. A primeira etapa, assimilação do nitrato (NO3-) a nitrito (NO3

-), acontece no citosol,

sendo regulada pela enzima nitrato redutase (NR). Este processo nas folhas utiliza-se o NADH

como fonte de potencial redutor, enquanto que nos tecidos não clorofilados utiliza-se o NADH

ou NAD(P)H (TAIZ & ZEIGER, 2010).

A segunda etapa na assimilação do nitrato é a redução do nitrito (NO2-) a amônio (NH4

+).

O nitrito é um íon instável e potencialmente toxico. Assim que é formado pelas plantas, é

rapidamente transportado do citosol para os plastídios de folhas e raízes. Nestes organelos a

enzima nitrito redutase (NiR) reduz o nitrito a amônio. Nas folhas a ferredoxina reduzida (FDred)

atua como doadora de elétrons para a enzima, enquanto que as raízes utiliza o NAD(P)H (TAIZ

& ZEIGER, 2010). A atividade da redutase de nitrato entre a raiz e a parte aérea pode variar de

acordo com a espécie, mais não é constante, podendo variar com idade da planta e tecido

analisado (ANDREWS, 1986; REIS, 2007).

O amônio formado pela assimilação do nitrato é incorporado rapidamente em

aminoácidos através da ação sequencial das enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato

sintetase (GOGAT), produzindo glutamina (GLN) e glutamato (GLU) (LEA, et. al.,1992). A

10

glutamina por atua como doadora de nitrogênio para a biossíntese de compostos orgânicos

nitrogenados, atuando como fator chave no controle da assimilação de nitrogênio pelas plantas.

A enzima GS é encontrada como isoenzimas no citosol (GS1) e nos cloroplastos ou plastídios

(GS2), onde desempenham papeis diferentes (IRELAND & LEA, 1999; LANCIEN; GADAL

& HODGES, 2000).

Em estudos relacionados a ocorrência de isoenzimas da glutamina sintetase (GS) em

Chlorella kessleri, foi observado uma massa em torno de 350 kDa, com predominância da GS1

da ordem de 60% a 80% em relação a GS2, além de maior estabilidade ao calor da GS1 (SUMAR

et al. 1984). A GS1 está presente principalmente nos tecidos não verdes como sementes, flores,

nódulos e tem grande importância na assimilação de nitrogênio pelas raízes, enquanto a GS2

está restrita nos cloroplastos e tem papel fundamental na reassimilação do NH4+ liberado na

fotorrespiração (WALLSGROVE, et. al., 1987). A expressão da GS2 é dependente de luz e

sacarose (OLIVEIRA & CORUZZI, 1999).

Assim, o objetivo geral deste trabalho foi determinar a influência do déficit hídrico e da

época do ciclo fenológico no metabolismo de nitrogênio em cafeeiros (Coffea arabica L.) em

fase reprodutiva. Os específicos foram determinar as atividades das enzimas relacionadas ao

nitrogênio, quantificar a influência do déficit hídrico sobre a redução e incorporação de nitrato

(NO3-) e, por fim, avaliar a influência das fases de pré-florecimento, floração/chumbinho,

primeira expansão rápida e granação no metabolismo do nitrato em cafeeiros adultos.

11

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1.Condições experimentais

O experimento foi conduzido em casa de vegetação do Departamento de Fitotecnia da

Universidade Federal de Viçosa com 72 plantas de cafeeiros (Coffea arabica L.) cv. Catuaí

Vermelho IAC 99 em estádio reprodutivo e idade de 5 anos, cultivadas em vasos contendo areia

como substrato em sistema hidropônico, que recebiam automaticamente solução nutritiva

completa contendo 5,0; 0,5; 2,25; 1,0; 1,75 mmol L-1 de N, P, Ca, Mg, S e 23,0; 0,3; 12,0; 0,3;

1,0 e 40 µmol L-1 de B, Cu, Mn, Mo, Zn e Fe, sendo o N disponibilizado na forma de KNO3 e

Ca(NO3)2. A solução era qual era bombeada de um reservatório a intervalos regulares.

O sistema hidropônico era composto por um temporizador que em intervalos regulares

acionava o funcionamento do sistema, bombeando a solução nutritiva de um reservatório até as

plantas através das tubulações de alimentação e distribuição. Após permear a fase solida do

vaso, a solução nutritiva era drenada novamente para o reservatório como ilustrado na figura 1.

FIGURA 1. Esquema do Sistema Hidropônico Trifásico Fechado.

(Adaptado de Silva Filho, 2011)

1-Bancada de sustentação; 2-Tubulação de alimentação; 3-Tubulação de distribuição; 4 e 5-

Tubulação de retorno; 6-Reservatorio de solução nutritiva; 7-Motobomba; 8-Temporizador.

12

As plantas foram cultivadas em vasos com capacidade de 30 litros, composto por 1/3

(inferior) por argila expandida e os 2/3 restantes preenchido com areia lavada em meio ácido.

Cada bancada acomodava três vasos e cada um deles continha uma planta de cafeeiro. As três

plantas da bancada eram alimentadas pelo mesmo reservatório de solução nutritiva de

capacidade de 20 litros. A solução nutritiva foi mantida com pH na faixa ótima, entre 4,5 e 5,5,

e o controle da concentração dos nutrientes foi feita através da avaliação da condutividade

elétrica, sendo a reposição dos cátions e ânions em solução feita a partir da avaliação da

depleção, sempre que se obtinha depleção maior ou igual a 30% em relação ao padrão adotado,

os nutrientes eram repostos.

2.2.Esquema experimental

As avaliações foram realizadas quatro vezes ao longo das fases fenológicas dos

cafeeiros, empregando-se esquema experimental de parcelas subdivididas no tempo. As

parcelas principais foram plantas sob déficit hídrico (DH+) e plantas sem déficit hídrico

(controle), e as subparcelas foram diferentes fases do ciclo fenológico: pré-florescimento,

florescimento/chumbinho, primeira expansão rápida e granação. Sendo assim, o experimento

foi composto por duas parcelas, quatro sub-parcelas e três repetições. Em cada avaliação foram

utilizadas dezoito plantas, distribuídas ao acaso em seis linhas, cada linha com três plantas.

2.3.Condicionamento pré-experimental

As plantas de café passaram por uma fase de condicionamento com duração de quatro

dias antes de iniciar as avaliações. O objetivo dessa fase foi aumentar a capacidade de absorção

de N pelas plantas e induzir a deficiência hídrica nas plantas. Nessa fase as plantas foram

submetidas a uma restrição nutricional trocando as soluções nutritivas completas

disponibilizando durante o cultivo por solução contendo 2% de N nas formas de KNO3 e

Ca(NO3)2 e 10% dos demais nutrientes. Para a indução do déficit hídrico de -1,0 MPa de

potencial hídrico foliar, foi adicionado gradativamente polietilenoglicol 6000 g mol-1 (PEG

6000).

O período de condicionamento teve duração de quatro dias, adicionando 1,45 kg dia-1

de PEG, sendo metade no período da manhã e a outra metade no período da tarde. Cada

repetição do tratamento com déficit hídrico, contendo 3 plantas, recebeu a quantidade de 5,8 kg

13

de PEG em 20 litros de solução nutritiva, totalizando a dose recomendada de 290 g L-1de PEG,

de acordo com Vilella et. al. (1991) o equivalente a -1,0 MPa de déficit hídrico foliar (Ψwf).

No quinto dia após o condicionamento das plantas de cada fase fenológica foi aplicado os

tratamentos e realizado as avaliações.

2.4.Determinação de tensão hídrica foliar

As avaliações de potencial hídrico foliar (Ψwf) foram realizadas na antemanhã do dia

de cada avaliação utilizando-se câmara de pressão do tipo Scholander. Foram utilizadas para as

avaliações três folhas completamente expandidas de cada planta, coletadas entre o terceiro e

quarto par de folhas localizadas no terço médio da planta, determinado-se sua tensão hídrica

instantânea.

2.5.Determinação do perfil metabólico relacionado ao N

O metabolismo relacionado ao N em cafeeiros foi obtido durante quatro ensaios de

exaustão de nitrato, um em cada fase do ciclo fenológica conforme citado no item 2.2. No dia

das avaliações as soluções nutritivas pré-experimentais contidas nos reservatórios foram

substituídas por uma nova solução contendo 500,0 µmol L-1 de nitrato para o tratamento sem

deficiência hídrica (controle) e 5 mmol L-1 + 290 g L-1de PEG para o tratamento com deficiência

hídrica (DH+).

A solução nutritiva de exaustão para o tratamento sem deficiência hídrica (controle) foi

preparada adicionando-se 1,011 g de nitrato de potássio como fonte de N, em 20,0 L de água

deionizada. Para o tratamento com deficiência hídrica (DH+) foi utilizado a mesma quantidade

de nitrato de potássio, mais 5,8 kg de polietilenoglicol (PEG) e homogeneizado em 20,0 L de

água deionizada.

Três horas após início do ensaio de exaustão com NO3- foram coletadas amostras de

aproximadamente 1 g de folhas recém maduras e raízes finas. Esse material foi lavado em agua

deionizada, armazenado em nitrogênio líquido e mantido em ultra-freezer à -80°C para

posterior determinação da atividade da redutase do nitrato e atividade da glutamina sintetase.

2.6.Preparo dos extratos para análises das atividades enzimáticas

14

A extração foi realizada segundo protocolo proposto por Radin (1974), adaptado por

Cambraia et al. (1989), com modificações para otimizar a atividade das enzimas para café.

Amostras contendo 0,2 g de tecido foliar e 0,4 g de raízes finas foram maceradas em almofariz

na presença de N2 líquido, com 0,2 g de PVPP (Polivinilpirrolidona). Em seguida foram

adicionados 2 mL de um meio de extração constituído de tampão tris-HCl 0,1 mol L-1, pH 8,1,

NiSO4 4 mmol L-1, glutationa reduzida 20 mmol L-1 e 20 µmol L-1 de PMSF

(Phenylmethanesulfonyl fluoride). Os extratos brutos foram filtrados através de quatro camadas

de gaze e centrifugados a 15.000 g durante 15 minutos, a 4°C. O sobrenadante (extrato) foi

utilizado para determinação da atividade das enzimas NR e GS.

2.7.Determinação da atividade da redutase do nitrato (NR)

A determinação da atividade da redutase do nitrato foi feita empregando-se o ensaio em

in vitro seguindo a metodologia de Radin (1974), adaptado por Cambraia et al. (1989).

Alíquotas de 0,3 mL do extrato enzimático foram adicionadas a 0,7 mL de um meio de reação

constituído de 200 mmol L-1 de tampão tris-HCl, pH 7,5, 20 mmol L-1 de KNO3, 0,1 mmol L-1

de NADH e de triton X-100 1% (v/v), sendo a mistura incubada à temperatura de 37ºC durante

50 minutos. Após este tempo, a reação foi interrompida pela adição de 1 mL de sulfanilamida

1 % (m/v) em mistura com N-naftil etilenodiamino 0,01 % (m/v) em HCl 1,0 mol L-1. O nitrito

produzido foi determinado por espectrofotometria do visível a 540 nm. Os teores de NO2- nas

amostras foram estimados com base em curva de calibração preparada com padrões de NO2- e

a atividade enzimática foi expressa em µmol de NO2- h-1 mg-1 de matéria fresca.

2.8.Determinação da atividade da glutamina sintetase (GS)

A determinação da atividade da enzima glutamina sintetase foi feita empregando-se o

método proposto por Elliott (1953), que se baseia na formação de λ-glutamilhidroxamato. A

atividade da GS foi avaliada pela adição de 0,2 mL do extrato a 0,8 mL do meio de reação

constituído de 100 mmol L-1 de tampão Tris-HCI, pH 7,5, 10 mmol L-1 de 2-mercaptoetanol,

40 mmol L-1 MgSO4.7H2O, 10 mmol L-1 de NH2OHCI, 10 mmol L-1 de ATP e 50 mmol L-1 de

glutamato. O meio foi incubado em banho-maria por 10 minutos a 37º C. Em seguida, a reação

foi paralisada com a adição de 1,0 mL da solução de cloreto férrico, contendo 370 mmol L-1 de

FeCI3, 370 mmol L-1 de HCI e 200 mmol L-1 de ácido tricloro-acético (TCA). Em seguida, a

15

amostra foi centrifugada por 5 minutos a 16.000 g. O quelato Fe-L-glutamil-y-hidroxamato

(GHA) produzido foi quantificado por espectrofotometria a 540 nm e estimado com base em

curva de calibração preparada com padrões de GHA. Os resultados foram expressos em µmol

de λ-GH h-1 mg-1 de matéria fresca.

2.9.Analise de trocas gasosas e da fluorescência da clorofila a

As avaliações de atividade fotossintética fizeram-se utilizando aparelho IRGA (Infrared

Gas Analyzer). Avaliaram os valores de condutância estomática (gs), taxa de assimilação de

carbono (A), taxa transpiratória (E) e concentração de CO2 subestomático (Ci). A eficiência no

uso da água (EUA) foi calculada através da razão da taxa de assimilação de carbono e a taxa

transpiratória (EUA = A/E). Estas medições foram realizadas após a estabilização do sistema,

entre duas e três horas após o início de fornecimento de nitrato às plantas, pinçando-se uma das

folhas do terceiro ou quarto par de um ramo plagiotrópico localizado na porção média da planta.

As avaliações foram realizadas nas condições de radiação fotossinteticamente ativa (PAR)

natural (~850-1100 μmol fótons m-2 s-1), concentração atmosférica de CO2 (Ca) (~400 μmol

mol-1), temperatura da câmara foliar (25-35º C) e temperatura da folha (28-39º C).

As informações de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos (PPFD), temperatura do

ar e umidade relativa do ar ao longo de cada dia de avaliação, foram obtidas de dados da estação

meteorológica do INMET, localizada em Viçosa-MG.

Para estimar a eficiência fotoquímica do fotossistema II, utilizou-se fluorômetro portátil

modelo JUNIOR-PAM simultaneamente as avaliações de trocas gasosas, selecionado as folhas

opostas a avaliação de trocas gasosas, cobrindo-se as folhas com papel alumínio para adaptação

ao escuro por 30 minutos. Em seguida, determinou-se a fluorescência inicial (F0) e

fluorescência máxima (Fm).

Com os resultados obtidos, estiou-se o rendimento quântico potencial do fotossistema

II por meio da equação da razão da Fv (fluorescência variável) / Fm (Fluorescência máxima).

2.10. Extração de seiva

A obtenção da seiva dos cafeeiros foi feita segundo Souza et. al. (2012), para posterior

determinação dos teores de nitrato e amônio. Após o período de exaustão de nitrato, foram

tomadas porções apicais de 10 cm de comprimento de 20 ramos novos por planta. Estas

16

amostras então foram armazenadas em tubos do tipo Falcon contendo éter etílico padrão

analítico, quantidade suficiente para cobrir os ramos e assim garantir a completa extração de

seiva. Após 15 dias mantidas a temperatura de -80°C, a seiva foi separada do éter em funil de

decantação.

2.11. Determinação de NO3- e NH4

+ em seiva

As concentrações de nitrato em seiva foram determinadas pelo método colorimétrico

descrito por Doane e Horwath (2003). Adicionou-se 0,1 mL de extrato de seiva diluída em agua

em 2,0 mL do meio de reação. O reagente de reação foi preparado pela adição, em meio ácido,

de cloreto de vanádio (VCl3), sulfanilamida e N-(1-nafitil)-etilamina. O reagente de reação

quando adicionado a amostra promove a dissociação do VCl3, e o V (III) originado desta

dissociação reduz o nitrato presente na amostra a nitrito e óxido nitroso, que capturados pelo

reagente de Griess, promovem a formação de uma coloração avermelhada/rósea. Após o

período de reação de aproximadamente 8 horas, as amostras foram transferidas para placas de

microtitulação e as concentrações de nitrato em seiva foram quantificados por

espectrofotometria a 540 nm e estimado com base em curva de calibração preparada com

padrões de NO3-.

As avaliações de concentração de nitrogênio na forma de N-NH4+, foram determinadas

por destilação a vapor, segundo a método kjeldahl, descrita por MORRIES (1983); JONES JR.

(1987), adaptado por Silva et. al. (2010), com modificações para determinação de NH4+ em

seiva de café. Adicionou-se 0,6 mL de seiva em um tubo de ensaio contendo 5 mL de agua

deionizada, encaixou-se o tubo de ensaio no aparelho Kjeldahl e iniciou a destilação. Em um

recipiente, adicionou-se 25 mL da solução de de ácido bórico a 1% mais indicador, para coletar

o destilado. A destilação foi mantida até que o volume coletado fosse 60 mL. A solução

recolhida no recipiente, contendo ácido bórico com o indicador, adquire a cor verde-acinzentada

à medida que vai se formando o borato de amônio (NH4H2BO3). Após coletar o destilado,

realizou-se a titulação com ácido clorídrico até o ponto de viragem. A quantidade de amônio

recuperado da seiva é estimada através de equação, relacionando a quantidade de HCl gasta

para chegar até o ponto de viragem do indicador vermelho de metila/verde de bromocresol. Os

resultados dos teores de NH4+ foram expressos em mg L-1 de seiva.

17

2.12. Análises estatística

Os dados obtidos foram submetidos a analises de variância, em delineamento

inteiramente ao acaso com parcelas subdivididas no tempo, com três repetições. A significância

do efeito do déficit hídrico foi avaliada por meio do teste F, a 5% de probabilidade. Para as

comparações entre as medias obtidas nas diferentes fases fenológicas e com interações entre

déficit hídrico x fase fenológica foi aplicado teste de médias Student-Newmann-Keuls a 5% de

probabilidade.

18

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1.Potencial hídrico foliar (Ψwf)

Segundo Vilela (1991), a adição do PEG em solução afeta as propriedades do solvente,

causando uma diminuição na energia livre de Gibbs e consequentemente reduzindo a pressão

osmótica. A concentração de 290,0 g de PEG 6000 por L-1 de solução resultou em uma alteração

significativa no potencial hídrico foliar (Ψwf), medidos na antemanhã dos dias de avaliação

(Tabela 1).

O potencial hídrico foliar não é um processo exato e estático nas plantas. O horário das

avaliações foi padronizado na antemanhã de cada avaliação para reduzir a variabilidade entre

as épocas das fases fenológicas. A redução do potencial hídrico (Ψwf) foliar está relacionada

com o aumento da taxa transpiratória da planta, sendo assim, as condições ambientais de cada

avaliação influenciaram nos resultados obtidos. Como na fase de primeira expansão rápida o

dia apresentou-se nublado, já era esperado que o potencial hídrico foliar nesta época fosse

menor em relação as demais épocas avaliadas.

Tabela 1. Tensão hídrica foliar (Ψwf) medida na antemanhã em cafeeiros em solução nutritiva

contendo 0,0 g L-1 (Controle) e 290,0 g L-1(DH+) de polietilenoglicol 6.000 g mol-1.

Fases de avaliação

Tratamento Pré-floração Floração/

Chumbinho

Primeira

expansão

rápida

Granação Média CV-a*

(%)

Tensão hídrica foliar (Ψwf)

MPa

Controle -0,50 bB -0,62 bAB -0,49 bB -0,62 bAB -0,56 b 16.13

DH+ -0,97 aA -1,04 aA -0,75 aB -0,94 aA -0,93 a

Média -0,74 B -0,83 A -0,62 C -0,78 AB

CV-b** (%) 7.57

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma coluna não diferem pelo teste Student Newmann-

Keuls a 5% de probabilidade.

Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na mesma linha não diferem pelo teste Student Newmann-


*Coeficiente de variação na parcela;

**Coeficiente de variação na subparcelas

19

3.2.Atividade enzimática em cafeeiros adultos em diferentes fases fenológicas sob

déficit hídrico (DH+) e sem déficit hídrico (controle)

3.2.1. Atividade da nitrato redutase (NR) em folhas e raízes.

Houve efeito significativo do déficit hídrico sob a atividade da enzima nitrato redutase

(NR) em folhas de cafeeiros, onde o valor da atividade da NR observado nas plantas do

tratamento controle foram em média 69% superiores (p<0,05) em relação ao tratamento

submetido a deficiência hídrica (Tabela 2). A avaliação da atividade de NR em raízes, não

resultou em efeito significativo da deficiência hídrica na atividade da enzima (Tabela 3).

Quando considerado as fases fenológicas, foi observado uma maior atividade da NR em

folhas na fase de floração/chumbinho em relação as demais fases avaliadas, que não diferiram

entre si (Tabela 2). Durante as fases de primeira expansão rápida e granação o déficit hídrico

reduziu a atividade da NR em mais de 50% (Tabela 2).

A forma mais comum da nitrato redutase está presente nos tecidos fotossintetizantes.

Portanto, quando analisada em raízes, as atividades foram inferiores se comparado com as

folhas e não apresentaram efeito significativo entre fases fenológicas de cafeeiros em fase

reprodutiva (Tabela 3).

Tabela 2. Valores da atividade da nitrato redutase (NR) em folhas de cafeeiros sob diferentes

fases fenológicas, com déficit hídrico (DH+) e sem déficit hídrico (controle).



Chumbinho

Primeira

expansão

rápida


(%)

µmol h-1 g-1 de matéria fresca

Controle 25,43 aB 41,39 aA 33,62 aAB 36.63 aAB 34.27 a 45.28

DH+ 25,74 aAB 37,15 aA 17,36 bB 14.79 bB 23.76 b

Média 25,58 B 39,27 A 25,49 B 25.71 B

CV-b** (%) 34,84

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma coluna não diferem pelo teste Student

Newmann-Keuls a 5% de probabilidade.





20

Tabela 3. Valores da atividade da nitrato resutase (NR) em raiz de cafeeiros sob diferentes



Tratamento Floração/Chumbinho

Primeira

expansão

rápida


(%)


Controle 10,55 6,72 7,66 8.31 a 22,52

DH+ 6,20 6,97 4,05 5.74 a

Média 8,38 A 6,84 A 5,85 A

CV-b** (%) 17,45







Com base nos resultados obtidos, pode-se dizer que a deficiência hídrica reduziu a

atividade da enzima nitrato redutase (NR) em folhas. Segundo Crocomo (1985) a baixa

atividade da NR em condições de estresse hídrico deve-se ao decréscimo do fluxo de substrato

(NO3-), principal regulador da síntese da enzima.

A maior atividade foi observada em folhas na fase de floração/chumbinho, inferindo-se

que a planta tenha uma maior atividade nesta fase para que não falte substrato nas fases

seguintes de maior demanda como primeira expansão rápida e granação. Entretanto variações

ambientais e climáticas também podem influencias na capacidade de assimilação de N durante

as fases fenológicas do cafeeiro (DA MATTA et. al., 1999). Os resultados obtidos no presente

trabalho corroboram com obtidos por Taleisnik et. al. (1980) e Carelli et. al. (1989), que

relataram que as taxas mais elevadas de atividade da NR nas folhas foram na fase de chumbinho.

3.2.2. Atividade da glutamina sintetase (GS) em folhas e raízes.

O déficit hídrico de -1,0 MPa induzidos nas plantas do tratamento DH+ não foi o

suficiente para que a atividade da GS nas folhas (tabela 4) e raízes (tabela 5) diferissem (p<0,05)

em comparação com as plantas do tratamento sem deficiência hídrica (controle). Sendo assim,

estatisticamente as médias dos dois tratamentos foram iguais.

Já durante as fases fenológicas, foi observado uma maior atividade da GS nas folhas de

cafeeiros em fase de pré-floração em relação as fases de floração/chumbinho, primeira

21

expansão rápida e granação as quais não diferiram entre si (Tabela 4). Já era previsto resultados

de maior atividade da GS em folhas, pois a isoenzima GS2, presente nos tecidos

fotossintetizantes, predomina a isoenzima GS1 da ordem de 60% a 80%, como já citado na

página 10 deste trabalho. Para as atividades da GS em raízes, não foi observado diferença ente

as fases fenológicas (Tabela 5).

A atividade da GS não é influenciada pela atividade da redutase do nitrato. O NH4+

assimilado pela NR pode ser transportado para as folhas por fluxo de transpiração através do

xilema e incorporado a aminoácidos pela atividade da GS e GOGAT ou pode ser estocada nos

vacúolos das folhas e raízes.

A possível hipóteses para os resultados obtidos é que a GS possui certa estabilidade,

independentemente da atividade da redutase do nitrato, sendo que o NH4+ assimilado pela NR

é incorporado e o restante é estocado nos vacúolos de onde retorna ao citoplasma a concentração

citoplasmática alcança um limite mínimo para manter estável a atividade da GS/GOGAT não

seja prejudicada.

Tabela 4. Valores da atividade da glutamina sintetase (GS) em folhas de cafeeiros sob

diferentes fases fenológicas, com déficit hídrico (DH+) e sem déficit hídrico (controle).



Chumbinho

Primeira

expansão

rápida


(%)


Controle 12,85 9,24 9,06 7.88 9.76 a 12.33

DH+ 11,02 8,66 8,53 7.62 8.96 a

Média 11,93 A 8,95 B 8,80 B 7.75 B

CV-b** (%) 13,52







22

Tabela 5. Valores da atividade da glutamina sintetase (GS) em raiz de cafeeiros sob diferentes



Tratamento Floração/Chumbinho

Primeira

expansão

rápida


(%)


Controle 3,37 2,06 1,94 2,46 a 23.32

DH+ 2,54 2,25 1,96 2,25 a

Média 2,95 A 2,15 A 1,95 A

CV-b** (%) 29,52







3.3.Trocas gasosas

No presente trabalho, os valores da taxa fotossintética (A) foram afetados pelo déficit

hídrico, sendo os valores médios do controle superiores ao tratamento DH+ (Tabela 6). A taxa

de fotossíntese pode ser direta ou indiretamente afetada por mecanismos estomáticos. Esta

diferença na taxa fotossintética ser explicada pela menor condutância estomática nas plantas

sob deficiência hídrica.

Entre as fases fenológicas estudadas não houve interação com o déficit hídrico. No

entanto, primeira expansão rápida exibiu a maior taxa fotossintética, enquanto na fase de pré-

floração foi obtida a menor taxa fotossintética (Tabela 6). O aumento das taxas fotossintéticas

deve-se a maior exigência de nutrientes e fotoassimilados na fase de enchimentos dos grãos em

relação as outras fases estudadas, embora a carga de frutos tenha sido baixa, em média 40 frutos

por ramo. Portanto, a taxa fotossintética pode sofrer uma redução média da ordem de 61% em

fase da alta demanda de fotoassimilados quando as plantas são submetidas a deficiência hídrica

da ordem de -1,0 MPA.

As taxas transpiratórias (E) e condutância estomática (gs) também foram afetadas sob

condição de déficit hídrico, com redução de 47% e 36% respectivamente em comparação com

o controle (Tabela 6). Não houve interação ente as fases fenologias e o déficit hídrico para a

taxa transpiratória, porém, as médias das fases de primeira expansão rápida e granação foram

23

superiores. Entretanto, para a condutância estomática houve interação e as médias da fase de

primeira expansão rápida sobressaiu em relação as demais fases fenológicas (Tabela 6).

As variações no metabolismo da planta como os valores de A, E e gs ocorrem para que

haja redução na perda de água e uma maior eficiência de uso deste recurso, principalmente

situações sob estresse hídrico. Este fator pode ser evidenciado pela observação dos valores de

eficiência do uso de água (EUA) que relaciona a quantidade de carbono fixada em relação a

quantidade de água perdida da planta para a atmosfera. Com exceção da fase de pré-floração,

os valores médios de EUA se mantiveram estáveis em relação ao déficit hídrico e as fases

fenológicas, não diferindo estatisticamente durante as épocas em nenhum tratamento.

A concentração de CO2 subestomática (Ci) foi em média 16% superior nas plantas sob

deficiência hídrica e foi nas sucessivas fases fenológicas avaliadas, sendo maior na fase de pré-

floração e menor na fase de granação. Visto os resultados de fotossínteses, estes valores de Ci

já eram esperados, pois numa situação onde a taxa fotossintética é considerada maior, a

concentração de CO2 na câmara sub estomática tende a ser menor existindo uma relação

inversamente proporcional entre Ci e taxa fotossintética (CONCENÇO et al., 2008).

Segundo Matos, et. al. (2013), a Ci é considerada variável fisiológica influenciada por

fatores ambientais, como disponibilidade hídrica, de luz e energia, entre outros. O incremento

na Ci pode indicar um mecanismo adaptativo de escape da planta ao estresse gerado pela

competição pelos recursos do ambiente.

24

Tabela 6. Taxa fotossintética (A), taxa transpiratória (E), condutância estomática (gs),

concentração interna de CO2 subestomático (Ci) e eficiência de uso da água pela fotossíntese

(EUA) influenciados pela fase fenológica e pela presença de déficit hídrico (DH+) e ausência de

déficit hídrico (controle).



Chumbinho

Primeira

expansão

rápida


(%)

Taxa fotossintética (A)

µmol CO2 m-2 s-1

Controle 0,74 1,84 4,04 3,20 2,45 a 11,33

DH+ -0,50 0,64 2,47 1,55 1,04 b

Média 0,12 D 1,24 C 3,25 A 2,37 B

CV-b** (%) 19,02

Taxa Transpiratória (E)

mmol CO2 m-2 s-1

Controle 0,21 0,85 1,54 1,73 1,08 a 59,87

DH+ 0,11 0,45 0,87 0,61 0,51 b

Média 0,16 C 0,65 B 1,20 A 1,17 A

CV-b** (%) 39,39

Condutância estomática (gs)

Mmol H2O m-2 s-1

Controle 6,7 aC 16,7 aC 76,7 aA 56,7 aB 39,1 a 43,30

DH+ 6,7 aA 10,0 aA 23,3 bA 16,7 bA 14,1 b

Média 6,7 C 13,33 C 50,0 A 36,6 B

CV-b** (%) 36,44

CO2 subestomático (Ci)

µmol CO2 m-2 s-1

Controle 263,23 bA 250,05 bA 299,70 aA 261,48 aA 268,61 b 12,64

DH+ 483,83 aA 343,12 aB 248,15 bC 206,55 bC 320,41 a

Média 373,53 A 296,59 B 273,92 B 234,01 C

CV-b** (%) 9,67

Eficiência de uso da água (EUA)

µmol CO2 m-2 s-1

Controle 3,4333 aA 1,23 aA 1,28 aA 1,20 aA 1,26 a 18,97

DH+ 0,67595 bB 1,21 aA 1,30 aA 1,28 aA 1,11 a

Média 1,00 B 1,22 A 1,29 A 1,24 A

CV-b** (%) 13,81







25

3.4.Fluorescência da clorofila a

A deficiência hídrica não influenciou nas médias da eficiência quântica potencial do

fotossistema II (Fv/Fm), que mede a quantidade de energia máxima que pode ser utilizada na

fotossíntese (Tabela 7), Já durante as diferentes fases do ciclo fenológico a pré-floração e

floração/chumbinho, os valores médios de eficiência quântica potencial do fotossistema II

foram menores na primeira expansão rápida e granação,

Sendo assim, nos resultados do presente trabalho observa-se que a deficiência hídrica

não foi limitante às reações fotossintéticas, pois a queda da Fv/Fm não resultou em médias

estatisticamente diferentes (Tabela 7), desta forma, a Fv/Fm não foi uma variável sensível ao

estresse, O contrário pode ser afirmado para as subparceas, pois a redução da Fv/Fm foi

limitante para as reações fotossintéticas (Tabela 7), indicando assim, que esta variável foi

sensível as diferentes fases do ciclo fenológico,

Tabela 7. Rendimento quântico potencial do fotossistema II (Fv/Fm) e influenciados pela fase

fenológica e pela presença (DH+) e ausência de déficit hídrico (controle),



Chumbinho

Primeira

expansão

rápida


(%)

Fv / Fm

Controle 0,50 0,54 0,63 0,64 0,58 a 14,37

DH+ 0,41 0,48 0,65 0,64 0,54 a

Média 0,46 B 0,51 B 0,64 A 0,64 A

CV-b** (%) 9,69







3.5.Concentração de NO3- e NH4

+ em seiva de cafeeiros adultos em diferentes fases

fenológicas sob déficit hídrico (DH+) e sem déficit hídrico (controle)

O déficit hídrico não influenciou significativamente nas características teor de nitrato

em seiva de plantas de café adultas (Tabela 8). Mesmo apresentando diferença na taxa

26

transpiratória (Tabela 6), fator que influencia a chegada de NO3-1 à superfície da raiz, sua

absorção depende de carreadores, a variação de nitrato observado na seiva estatisticamente não

teve diferença.

Quando observadas as fases fenológicas, a pré-floração forneceu valores superiores aos

encontrados nas fases de floração/chumbinho e granação que não diferiram entre si. Uma

possível explicação é que durante as fases de floração/chumbinho e granação, épocas em que a

demanda por fotoassimilados são superiores as taxas fotossintéticas foram superiores. Maiores

taxas fotossintéticas implicam maior disponibilidade de carbono para incorporação do N

reduzido, modulando a atividade da NR e justificando as maiores concentrações de nitrato na

seiva na pré-floração.

Existem poucos trabalhos que relatem os teores de nitrato em seiva cafeeiros, e tão

pouco que há relatos desses trabalhos associados a fases do ciclo fenológico. Alguns trabalhos

relatam a variação nos teores foliares de nitrato, juntamente com a determinação da atividade

da NR e sazonalidade da absorção de N.

Alguns autores como Neto et al. (2014) e Carvajal e Acevedo (1969) encontraram que

as taxas de absorção de nitrato são mais intensas na pré-floração e no início da maturação dos

frutos, enquanto que após a fase de florescimento estas taxas decresceram.

Tabela 8. Concentração de NO3- em seiva de cafeeiros sob diferentes fases fenológicas, com

déficit hídrico (DH+) e sem déficit hídrico (controle).


Tratamento Pré-floração Floração/Chumbinho Granação Média CV-a

(%)

mg L-1 de seiva

Controle 380,30 38,34 38,53 152,39 a 27,05

DH+ 507,88 22,24 24,92 185,02 a

Média 444,09 A 30,29 B 31,73 B

CV-b (%) 29,61







27

O nitrogênio fornecido para as plantas durante as épocas das fases fenológicas foi

disponibilizado na forma de nitrato de potássio KNO3, sendo assim, todo o amônio (NH4+)

encontrado surgiu através dos processos metabólicos de assimilação do nitrato.

Os teores de amônio (NH4+) em seivas não diferiram entre si durante as diferentes

épocas de avaliações (Tabela 9). No entanto, o estresse hídrico aumentou concentração de

amônio na seiva (Tabela 9), porém apresentou certa instabilidade nos resultados quando

comparados entre as fases fenológicas.

Com base nestes resultados, como a atividade da NR foi superior no tratamento controle,

pode-se supor que as plantas sem estresse hídrico estocaram maior quantidade de amônio no

vacúolo das folhas e raízes, estando estes em menor quantidade prontamente disponíveis na

seiva para serem assimilados. O inverso vale para as plantas sob estresse hídrico, onde maior

parte do NH4+ produzido pela NR foram translocados para a seiva.

Outra possível hipótese seria a decomposição de aminoácidos presente na seiva de

plantas sob estresse hídrico, aumentando assim o teor de NH4+.

Tabela 9. Concentração de NH4+ em seiva de cafeeiros sob diferentes fases fenológicas, com

déficit hídrico (DH+) e sem déficit hídrico (controle).


Tratamento Pré-floração Floração/Chumbinho Granação Média CV-a

(%)

mg L-1 de seiva

Controle 11,58 12,56 8,72 10,95 b 3,62

DH+ 13,19 11,94 9,88 11,67 a

Média 12,38 A 12,25 A 9,30 A

CV-b (%) 20,48







28

4. CONCLUSÃO

A aplicação de 290,0 g L-1 de polietilenoglicol 6,000 g mol-1 resultou em uma alteração

significativa no potencial hídrico foliar (Ψwf).

O estresse hídrico reduziu significativamente os valores de atividade da nitrato redutase

(NR) em folha, entretanto não houve diferença da atividade em raiz.

Durante as fases fenológicas, a floração/chumbinho apresentou maior atividade da

nitrato redutase (NR) em folha, enquanto quando avaliado em raiz não obteve diferença entre

as épocas.

A atividade da glutamina sintetase (GS) não foi influencia pela deficiência hídrica, tanto

em folha quanto em raízes.

Foi observado maior atividade da glutamina sintetase (GS) em folhas na fase de pre-

floração, no entanto, nas raízes as atividades não diferiram entre si durante as épocas,

A concentração de nitrato (NO3-) presente na seiva não foi afetada significativamente

entre os tratamentos.

A fase de pré-floração apresentou teor de nitrato (NO3-) na seiva superior em relação as

fases de floração/chumbinho e granação, as quais não diferiram entre si.

O teor de NH4+ foi superior nas plantas sob estresse hídrico, porém não obteve diferença

entre as fases fenológicas.

O déficit hídrico afetou o processo fotossintético, reduzindo a taxa fotossintética (A), a

taxa transpiratória (E) e a condutividade estomática (gs), e aumentando a concentração de CO2

subestomático (Ci).

Os parâmetros da fluorescência da clorofila a não foram afetados de maneira

significativa pelo déficit hídrico imposto.

A eficiência quântica máxima do FSII (Fv/Fm) foi superior durante a primeira expansão

rápida e granação.

29

5. REFERÊNCIAS

AGUIAR, A. T. E.; GONSALVES, C.; PATERNIANI, M. E. G. Z.; TUCCI, M. L. S.;

CASTRO, C. E. F. Instruções Agrícolas para as Principais Culturas Econômicas,

Campinas, SP, n° 200, 7ᵃ ed. 2014.

ANDREWS, M. The partitioning of nitrate assimilation between root and shoot of higher plants,

Plant, Cell e Environment, v, 9, p. 511–519, 1986.

BEEVENS, L.; HAGEMAN, R. H. Nitrate and nitrite reduction, In: The Biochemistry of plants

(Ed) Miflin, B. J., Academic Press, Inc, New York, 166-169, 1980.

CAMBRAIA, J.; PIMENTA, J. A.; ESTEVÃO, M. M.; SANT'ANNA, R. Aluminum effects

on nitrate uptake and reduction in sorghum. Journal of Plant Nutrition, v,12, p,1435-1445,

1989.

CARELLI M. L. C. FAHL, J. I. MAGALHÃES A. C. Assimilação de nitrato durante o

desenvolvimento reprodutivo de plantas de café, Rev, bras, Ci, Solo, 13:59-64, 1989.

CARVAJAL, J. F.; ACEVEDO, A. C.; LOPES, C. A. Nutrient uptake by the coffee tree during

a yearly cycle. Turrialba, San José v, 19, p, 13–20, 1969.

CATANI RA & MORAES FRP. A Composição Química do cafeeiro, Revista de Agricultura,

1: 45-57, 1958.

COELHO, A. M.; FRANÇA, G. E.; BAHIA, A. F. C.; GUEDES, G. A. A. Balanço de

nitrogênio (15N) em latossolo vermelho-escuro, sob vegetação de cerrado, cultivado com

milho. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v, 15, p, 187-193, 1991,

CONAB. Acompanhamento da Safra Brasileira: Café, v, 2, n,1, p, 63 , 2016,

30

CONCENÇO, G.; FERREIRA, E. A.; SILVA, A. A.; FERREIRA, F. A.; GALON, L.; REIS,

M. R.; D'ANTONINO, L.; VARGAS, L.; SILVA, L. V. B. D. Fotossíntese de biótipos de

azevém sob condição de competição. Planta Daninha, Viçosa, v, 26, n, 3, p. 595-600, 2008.

CROCOMO, O. J. Assimilação do nitrogênio pelas plantas, In: FERRI, MG, (Ed,) Fisiologia

Vegetal, São Paulo: EPU, p 181-209, 1985.

DA MATTA F. M.; AMARAL, J. A. T.; RENA, A. B. Growth periodicity in trees of Coffea

arabica L. in relation to nitrogen supply and nitrate reductase activity. Field Crops Res, 60:223-

229, 1999.

DOANE, T. A.; HORWATH, W. R. Spectrophotometric determination of nitrate with a single

reagent. Analytical Letters v, 36, n, 12, p, 2713–2722, 2003.

ELLIOT, W. H. Isolation of glutamine synthetase and glutamotransferase from green peas. J,

Biol Chem, 201:661-672, 1953.

GONZALES-DUGO, V.; DURAND, J. L.; GASTAL, F.; BARIAC, T. & POINCHEVAL, J.

Restricted root-to-shoot translocation and decreased sink are responsible for limited nitrogen

uptake in three grass species under water deficit. Environmental and Experimental Botany,

75:258-267, 2012.

GOOD, A. G.; SHRAWAT, A. K.; MUENCH, D. G. Can less yield more? Is reducing nutrient

input into the environment compatible with maintaining crop production? Trends in Plant

Science, 9:597-605, 2004.

HAGEMAN, R. H. Ammonium versus nitrate nutrition of higher plants. In Nitrogen in crop

production, (Ed,) R. D. Hauck. ASA-CSSA-SSSA, Madison, WI, p, 67-85, 1984.

HSIAO, T. C. Plant responses to water deficits efficiency and drought resistace. Agricultural

Meteorogy, 14:59-84, 1979.

31

IRELAND, R. J. & LEA, P. J. The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine and aspirate

metabolism, In: SINGH, B, K, (Ed,), Plant Amino acids: biochemistry and biotechnology,

New York: p. 49-109, 1999.

LANCIEN, M.; GADAL, P. & HODGES, M, Enzyme redundancy and the importance of 2-

oxoglutarate in higher plant ammonium assimilation, Plant Physiology, Rockville, v, 123, p,

817 – 824, 2000.

LAWLOR, D. W. Photosyntesis, productivity and environment, Journal of Experimental

Botanic, Oxford, v,46, p, 1449-1461, 1995.

LEA, P. J. & AZEVEDO, R. A. Nitrogen use efficiency. 1. Uptake of nitrogen from the soil.

Annals of Applied Biology v, 149, n, November 2015, p, 243–247, 0003-4746, 2006.

LEA, P. J.; BLACKWELL, R. D. & JOY, K. W. Ammonia assimilation in higher plants, In:

MENGEL, K,; PILBEAM, D, J, (Ed,), Nitrogen metabolism of plant, Oxford: Claredon,

1992, P, 153 (Proccedings of the Phytochenical Society of Europe, 33),

MAPA, Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento, Vevetal, Estatisticas, Café,

Informe Estatístico do Café - AGOSTO de 2016, Disponível em:

<http://www,agricultura,gov,br/vegetal/estatisticas> (acesso em 06/10/2026),

MARSCHNER, H. & MARSCHNER, P. Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants,

3ᵃ ed, London: Academic Press, 2012.

MARTINEZ, H. E. P.; CARVALHO, J. G. & SOUZA, R. B. Diagnose Foliar, In: A. C. Ribeiro;

P. T. G. Guimarães; V. H. Alvarez V. (Orgs,); Recomendações para o uso de corretivos e

fertilizantes em Minas Gerais - 5° Aproximação, p. 359, 1999, Viçosa,

MARTINEZ, H. E. P. & NEVES, J. C. L. Nutrição Mineral, Calagem, Gessagem e Adubação.

In: N. S. Sakiyama; H. E. P. Martinez; M. A. Tomaz; A. Borém (Orgs,); Café Arábica: do

Plantio à Colheita, p,316, 2015, Viçosa.

http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/8_%20Cafe-Agosto2016.xlsx

http://www.agricultura.gov.br/vegetal/estatisticas

32

MATOS, C. C.; FIALHO, C. M. T.; FERREIRA, E. A.; SILVA, D. V.; SILVA, A. A.;

SANTOS, J. B. & FRANÇA, A. B. & GALON, L, Características fisiológicas do cafeeiro em

competição com plantas daninhas. Biosci, J,, Uberlândia, v, 29, n, 5, p, 1111-1119, 2013.

MILLER, A. J.; FAN, X.; ORSEL, M.; SMITH, S. J. & WELLS, D, M, Nitrate transport and

signaling. J, Exp, Bot,, 58: 2297-2306, 2007.

NETO, A. P.; FAVARIN, J. L. & DOS REIS, A. R. Nitrogen metabolism in coffee plants in

response to nitrogen supply by fertigation. Theoretical and Experimental Plant Physiology,

v, 27, n, 1, p, 41–50, 2014.

NOVAIS, R. F. et, Al, Fertilidade do solo. Viçoza, MG; Sociedade Brasileira de Ciência do

Solo, p, 1017, 2007.

OAKS, A. Efficiency of nitrogen utilizacion in C3 and C4 cereals. Plant Physiology, 106:407-

414, 1994.

OLIVEIRA, I. C. & CORUZZI, G. M. Carbon and amino acids reciprocally modulante the

expression of glutamine synthetase in Arabidopsis. Plant Physiology, Rockville, v, 121, n, 1,

p, 301-309, 1999.

PATTERSON, K.; CAKMAK, T.; COOPER, A.; LANGER, I.; RASMUSSON, A. L. &

ESCOBAR, M. A. Distinct signaling pathways and transcriptome response signatures

differentiate ammonium and nitrate supplied plants. Plant, Cell and Environment, 33: 1486-

1501, 2010.

RADIN, J. W. Distribution and development of nitrate reductase activity in germinating cotton

seedling. Annual Review of Plant Phisyology, Stanford, v, 53, p, 458-463, 1974.

REIS, A. R. Metabolismo do Nitrogenio e Estado Nutricional do Cafeeiro (Coffea arábica

L). Dissertação de Mestrado, Escola Superior de Agricultura “Luiz Queiroz” – USP, Piracicaba,

80p, 2007.

33

RIBEIRO, A. C.; GUIMARÃES, P. T. G. & ALVARES, V. V. H. Recomendações para uso

de corretivos e fertilizantes em Mina Gerais: 5° aproximação. Viçosa, MG: comissão de

Fertilidade do solo do Estado de Minas Gerais, 180 p, 1999.

SILVA, D. F.; ANDRADE, C. L. T.; SIMEONE, M. L. F.; AMARAL, T. A.; CASTRO, L. A.

& MOURA, B. F. Análise de Nitrato e Amônio em Solo e Água, Sete Lagoas: Embrapa

Milho e Sorgo, 2010, 55 p,: il, -- (Documentos / Embrapa Milho e Sorgo, ISSN 1518-4277;

114).

SILVA FILHO, J. B. Índices de nitrogênio na planta e produtividade de tubérculos de

batata-semente em sistema hidropônico de três fases. 2011, 89 f. Dissertação (Mestrado em

Fitotecnia), Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2011.

SOUZA, T. R.; VILLAS BOAS, R. L.; QUAGGIO, J. A. & SALOMÃO, L. C. Nutrientes na

seiva de plantas cítricas fertirrigadas. Revista Brasileira de Fruticultura, 34:482-492, 2012.

SUMAR, N.; CASSELTON, P. J.; McNALLY, S. F. & STEWART, G. L. Occurrence of

isoenzymes of glutamine sintetase in chlorella kessleri. Plant Physiology, v, 74, p, 204-207,

1984.

TAIZ, L. & ZEIGER, E. Plant Physiology, 5ᵃ ed, Sinauer Associates, Sunderland, 2010.

TALEISNIK, E.; BRICEÑO, J. A. & CARVAJAL, J. F. Variación estacional de la reductasa

de nitrato em el cafeto. Turrialba, 43:330-337, 1980.

VILELLA, F. A.; FILHO, L. D. & SEQUEIRA, E. L. Tabela de potencial osmótico em função

da concentração de polietilenoglicol 6.000 e da temperatura. Pesquisa Agropecuária

Brasileira v. 26, n, 99, p, 1957–1968, 1991.

VITOUSEK, P. M.; et. Al. Human alteration of the global nitrogen cycle: Sources and

consequences. Ecological Applications, v. 7, n, 3, p. 737–750 ,1997.

34

WALLSGROVE, R. M.; TURNER, J. C.; HALL, N. P.; KENDALL, A. C. & BRIGHT, S. W.

J. Barley mutants lacking chloroplast glutamine sintetase-biochemical and genetic analysis.

Plant Physiology, Rockville, v, 83, p,155-158, 1987.

WILLIAMS, L. E. & MILLER, A. J. Transporters responsible for the uptake and partitioning

of nitrogenous solutes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52:659-688, 2001.

WANG, X.; BIAN, Y.; CHENG, K.; ZOU, H.; SUN, S. S. M. & HE, J. X. A Comprehensive

Differential Proteomic Study of Nitrate Deprivation in Arabidopsis Reveals Complex

Regulatory Networks of Plant Nitrogen Responses. J, Proteome Res., 11:2301-2315, 2012.

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