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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
CAROLINA RODRIGUES TEÓFILO
EXPRESSÃO DE CD31, CD34 E TRIPTASE EM LESÕES POTENCIALMENTE
MALIGNAS E NOS CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAIS
FORTALEZA
2012
CAROLINA RODRIGUES TEÓFILO
EXPRESSÃO DE CD31, CD34 E TRIPTASE EM LESÕES POTENCIALMENTE
MALIGNAS E NOS CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAIS
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós Graduação em Odontologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Odontologia
Área de concentração: Clínica Odontológica
Orientadora: Prof. Dra. Ana Paula Negreiros
Nunes Alves
FORTALEZA
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
T29e Teófilo, Carolina Rodrigues.
Expressão de CD31, CD34 e triptase em lesões potencialmente malignas e nos carcinomas de
células escamosas orais / Carolina Rodrigues Teófilo. – 2012.
69 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará; Centro de Ciências da Saúde;
Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem; Departamento de Enfermagem; Programa
de Pós-Graduação em Odontologia; Mestrado em Odontologia; Fortaleza, 2012.
Área de concentração: Clínica Odontológica.
Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves.
1. Mastócitos. 2. Lesões Pré-Cancerosas. 3. Neovascularização Patológica. I. Título.
CDD 616.99431
AGRADECIMENTOS
Inicialmente, gostaria de agradecer à minha orientadora, Prof.ª Ana Paula Negreiros
pela confiança em mim depositada e por toda a atenção e os conhecimentos
repassados ao longo desses 2 anos.
Aos Professores Mário Mota e Fabrício Bitu por todos os ensinamentos, pela
disponibilidade e atenção.
Ao Prof. Renato Maia que sempre foi grande incentivador durante a graduação,
especialização e, mais do que nunca, no mestrado, tendo sempre as palavras certas
nos momentos necessários.
Ao Prof. Vagnaldo pela colaboração fornecida no cálculo amostral e com o programa
para avaliação de angiogênese.
À Suzana pelo auxílio durante a realização da imunohistoquímica.
À amiga Malena Freitas, companheira fiel, que compartilhou todos os momentos
desta empreitada. Obrigada pela disponibilidade, incentivo e por toda a assistência
que você sempre prestou.
À Galyleia Meneses, por toda sua ajuda na elaboração da estatística deste trabalho
e por sua amizade.
Às colegas do mestrado Juliana Ximenes e Patrícia Thé, que, além de parceiras
nesta jornada, tornaram-se amigas para toda a vida.
Aos colegas da estomatologia João Paulo Perdigão, Artur Forte e Clarissa Pessoa
pelo apoio.
Às amigas Isabela Pacheco e Renata Galvão que muito estimularam o meu ingresso
no mestrado.
Às amigas do trabalho Andreia e Renata que me deram todo o estímulo e que
organizaram suas vidas em função dos meus horários para que eu pudesse estar
presente na Universidade.
Às coordenadoras Juliana Medeiros e Mônica Monteiro que sempre me apoiaram e
proporcionaram minha liberação da Prefeitura Municipal de Fortaleza. Sem a ajuda
de vocês a realização deste sonho não teria sido possível.
À minha família, Verônica, Edson, Mauro, Leonardo e Cristiana, que sempre torceu
muito pelo meu sucesso.
Ao meu Ramon, por ter compreendido os momentos de ausência e pelo apoio
irrestrito.
A todos da UFG, Prof.ª Aline, Prof. Elismauro, Prof.ª Rejane, Nancy, Nádia, Mariana,
Marília, Andréia, Alysson, Erildo, que me receberam de forma muito carinhosa e
repassaram conhecimentos valiosos durante minha estada em Goiânia.
Às Atendentes da faculdade, Soninha, Cotinha e Cassilda, e do posto de saúde,
Danila, Janaína, Mara, Lila e Betinha, pelo assessoramento frente aos pacientes.
Aos professores do programa de Pós-graduação em Clínica Odontológica da
Universidade Federal do Ceará por todos os ensinamentos repassados durante as
disciplinas.
Às secretárias do Programa de Pós-graduação em Odontologia, Lúcia e Janaíne,
pelo auxílio durante o mestrado.
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
RESUMO
Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de capilares
pré-existentes, sendo um passo essencial no crescimento tumoral por fornecer
nutrição e oxigênio às células em proliferação. Uma célula que pode estar envolvida
nesse processo é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação de
vasos sanguíneos. Sua participação na indução da angiogênese tem sido sugerida
em vários tumores malignos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a
angiogênese e a densidade de mastócitos em displasias epiteliais e no carcinoma
espinocelular (CEC) de boca. Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo e
quantitativo, realizado através da seleção de amostra proveniente dos arquivos do
Departamento de Patologia e Medicina Legal e do laboratório de Patologia Bucal do
curso de Odontologia, ambos da Universidade Federal do Ceará. Para a avaliação
dos mastócitos, a amostra foi constituída por 73 blocos parafinados, distribuídos
entre CEC (n=30), displasias epiteliais (n=23) e hiperplasias fibroepiteliais (HFE)
(n=20), como controle, e para a angiogênese a amostra foi de 65 blocos, sendo 24
de CEC, 19 de displasias epiteliais e 22 de HFE. Foi realizada imunohistoquímica
utilizando-se os anticorpos anti-triptase, para mastócitos e anti-CD31 e anti-CD34,
para vasos sanguíneos. Para quantificação, foram capturadas imagens digitais e, em
seguida, utilizados softwares para auxiliar na contagem dos mastócitos (Image J) e
para determinação do percentual de marcação do anticorpo (SAMM). Com relação
aos mastócitos, houve menor densidade destes nas lesões malignas em relação às
HFE e displasias (p=0,0092). Avaliando angiogênese, a expressão de CD31 mostrou
diferença entre os grupos CEC e displasia epitelial e entre CEC e HFE, havendo um
maior percentual de vasos nos CEC (p<0,0001). Contudo, o CD34, não mostrou
diferença entre os grupos. O anticorpo CD31 mostrou-se melhor marcador de
angiogênese em mucosa oral do que CD34. O aumento da vascularização em CEC
oral sugere que a angiogênese é necessária ao crescimento tumoral, aumentando à
medida que inicia o processo de malignização. Não foi encontrada correlação entre
mastócitos e angiogênese.
Palavras-chave: Angiogênese, Mastócitos, Carcinoma de Células
escamosas, Lesões Pré-Cancerosas
ABSTRACT
Angiogenesis is the development of new blood vessels from pre-existing capillaries,
being an essential step in tumor growth for supplying nutrition and oxygen to cells in
proliferation. A cell that may be involved in this process is the mast cell (MC), since
besides the defense function, acts in the blood vessels regulation. The MC
participation in the induction of angiogenesis has been suggested in various
malignant tumors. The purposes of this study was to evaluate angiogenesis and mast
cell density in oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma (SCC). This is
an observational, retrospective and quantitative study using the sample selection
from the archives of the Department of Legal Medicine and Pathology and Laboratory
of Oral Pathology, both from the Federal University of Ceará. For MC evaluation , the
sample was consisted of 73 paraffin blocks, distributed between SCC (n=30),
epithelial dysplasia (n=23) and hyperplasias fibroepithelial (HFE) (n = 20), as control,
and for angiogenesis the sample was 65 blocks, consisted of 24 SCC, 19 epithelial
dysplasias and 22 HFE. Immunohistochemistry was performed using the MC-
tryptase, CD31 and CD34 antibodies. For quantification, digital images were
captured and then counting was performed using Image J software. The antibody
staining percentage was determined using SAMM software. With regard to mast
cells, there was a lower density in malignant lesions in relation to HFE and dysplasia
(p = 0.0092). Evaluating angiogenesis, CD31 expression showed differences
between epithelial dysplasia and SCC and between SCC and HFE, with a greater
percentage of vessels in SCC (p <0.0001). However, CD34 expression did not differ
between groups. The CD31 antibody was shown to be a better angiogenesis marker
in oral mucosa than CD34. Increased vascularity in oral squamous cell carcinoma
suggests that angiogenesis is necessary for tumor growth, increasing when the
malignant transformation starts. However, no correlation was found between mast
cells and angiogenesis.
Key-words: Angiogenesis, Mast cell, Squamous Cell Carcinoma, Precancerous
condition
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................................... 9
2. PROPOSIÇÃO ............................................................................................................................... 15
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................................... 15
2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................................. 15
3. CAPÍTULO ...................................................................................................................................... 16
CAPÍTULO 1 ....................................................................................................................................... 17
4. CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................................................. 44
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 45
ANEXOS .............................................................................................................................................. 51
ANEXO A - ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA HUMANA ................................. 51
ANEXO B – MANUAL DE NORMALIZAÇÃO PARA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE
MESTRADO E TESE DE DOUTORADONO FORMATO ALTERNATIVO DO PROGRAMA
DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ ...... 52
ANEXO C - NORMAS PERIÓDICO EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY ... 61
9
1. INTRODUÇÃO GERAL
As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema
de saúde pública no Brasil e no mundo. Segundo estimativas do Instituto Nacional
do Câncer, a previsão de novos casos de câncer de cavidade oral no Brasil para o
ano de 2012 é de 14.170 (BRASIL, 2011).
Muitos fatores contribuem para seu aumento crescente: dentre estes o
envelhecimento da população decorrente do desenvolvimento sócio-econômico,
urbanização, aditivos alimentares, pesticidas, poluição ambiental, tabagismo e
etilismo. Esses dois últimos fatores são responsáveis pelo aumento do risco relativo
da incidência de câncer bucal em até 140 vezes (PEREZ et al., 2007).
Na cavidade oral, o tipo histológico de tumor maligno mais comum,
presente entre 90 a 95% dos casos, é o Carcinoma Espinocelular (CEC). Esse tumor
representa uma neoplasia epitelial invasiva e agressiva, com graus variáveis de
diferenciação escamosa e exibem propensão para desenvolvimento de metástases
nodal precoce (CHRISTIAN, 2002).
Frequentemente, ocorre o surgimento de lesões e alterações teciduais
que precedem o surgimento de neoplasias malignas, sendo denominadas lesões
potencialmente malignas. Estas podem permanecer estáveis por um considerável
período de tempo antes de evoluir, ou não, para malignidade e invasão. As
principais lesões potencialmente malignas que acometem a cavidade oral são
leucoplasia com displasia epitelial, eritroplasia e queilite actínica. Leucoplasia é
definida como placa esbranquiçada que não pode ser caracterizada como qualquer
outra lesão e apresenta-se, histologicamente, como área hiperceratótica, com
acantose, podendo ou não haver displasia (PRADO et al., 2010), sendo considerada
potencialmente maligna quando esta última alteração está presente. A eritroplasia
apresenta-se como uma placa eritematosa que não pode ser caracterizada como
qualquer outra lesão e tem como características histológicas presença de atrofia
epitelial e displasia. A queilite actínica é uma alteração causada em lábios pela ação
da radiação solar que apresenta frequente transformação maligna e caracteriza-se,
histologicamente, por hiperceratose, acantose, atrofia epitelial, infiltrado inflamatório
crônico, elastose solar e displasia (CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008).
10
Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de
capilares pré-existentes, podendo ser fisiológica ou patológica. Esse processo
envolve múltiplos passos, sendo necessária a proliferação de células endoteliais
ativadas, migração destas para o interior de novos capilares e síntese de uma nova
membrana basal, seguida pela maturação e formação do lúmen (ASAHARA et al.,
1999). Para que ocorra o aumento do vascularização, estão envolvidos diversos
tipos celulares, como células tumorais, endoteliais, macrófagos e mastócitos (FOX;
GATTER; HARRIS, 1996). Outros fatores que influenciam positivamente no sinal
para angiogênese são ação de proteínas originadas a partir de oncogenes, hipóxia,
baixo pH, nutrição deficiente e atuação de formas de oxigênio reativas (BERGERS;
BENJAMIN, 2003).
Nos tumores, quando as células endoteliais são estimuladas
positivamente, começam a secretar proteases e outras enzimas que promovem a
digestão da membrana basal do vaso. A dissolução da matriz extracelular promove,
então a liberação de fatores pró-angiogênicos. A junção entre as células endoteliais
torna-se frouxa e os novos vasos brotam em direção ao estímulo. As células
hematopoiéticas progenitoras também contribuem para a formação do lúmen capilar.
Em seguida, ocorre a maturação e estabilização, resultando em microvasos
tortuosos, irregulares e com membrana basal fragmentada, o que aumenta a
permeabilidade (EICHHORN et al., 2007).
A angiogênese constitui um passo essencial no crescimento tumoral e
nas metástases, pois fornece nutrição e oxigênio às células que estão em
proliferação, promove drenagem de metabólitos, além de funcionar como via de
transporte de células tumorais (FOLKMAN, 1990; SOUZA; FREITAS; MIRANDA,
2007). Segundo Folkman (1971), as neoplasias iniciam-se como um nódulo
avascular e só são capazes de crescer além de 2 milímetros nas três dimensões
(FOLKMAN, 1971; FOLKMAN et al., 1989) quando tornam-se vascularizadas, sendo
portanto, fundamental na transição da hiperplasia até a neoplasia. A principal
diferença entre a angiogênese que ocorre em um tecido normal e a patológica é que
esta última se dá de maneira desorganizada (TERMAN; STOLETOV, 2001) e os
vasos formados são tortuosos, dilatados, formando braços e shunts (MAAHS, 2008).
A angiogênese tumoral se dá pelo desequilíbrio entre fatores de regulação positivos
11
e negativos, havendo um aumento da secreção de fatores pró-angiogênicos e/ou
diminuição de fatores anti-angiogênicos. (RIBATTI; VACCA; DAMMACCO, 1999)
Uma célula que pode estar diretamente envolvida no processo de
neoangiogênese é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação
da homeostase de vasos sanguíneos (ALKHABULI, 2007). Sua participação na
indução da angiogênese tem sido sugerida em vários tumores malignos (ACIKALIN
et al., 2005; CHAN et al., 2005; DABIRI et al., 2004; ELPEK et al., 2001; TUNA et
al., 2006).
A grande quantidade de substâncias secretadas pelos mastócitos torna
difícil determinar qual será a atuação dessa célula no ambiente, principalmente em
meio a neoplasias. A produção de agentes que promovem tanto a inibição (IL-1, IL-
4, IL-6, TNF-α) quanto a progressão tumoral (VEGF, bFGF, triptase, quimase, TGF-
β, NGF, MMP-2 e 9) faz com que esta célula possa acarretar efeitos diferentes nos
diversos tumores, dependo das condições locais do estroma (THEOHARIDES;
CONTI, 2004).
A literatura é controversa em correlacionar densidade de mastócitos e
neoplasias. Há relatos de aumento de mastócitos em lesões malignas quando
comparadas ao tecido normal em esôfago (ELPEK et al., 2001), pulmão (TOMITA;
MATSUZAKI; ONITSUKA, 2000) e linfoma (DUSE et al., 2011). Nesses casos,
acredita-se que exista uma atuação dos mastócitos na progressão tumoral através
da liberação de mediadores que favorecem a angiogênese. Entretanto, estudo
recente em útero não achou relação estatisticamente significante, em neoplasias
malignas, entre angiogênese e mastócitos, não havendo aumento do número destes
com progressão da doença (GOKSU EROL et al., 2011). Em neoplasias e lesões
potencialmente malignas de cavidade oral, os trabalhos mostram, em sua maioria,
resultados que levam a crer que esta célula participe da progressão tumoral
(IAMAROON et al., 2003; JAHANSHAHI; SABAGHIAN, 2012; MICHAILIDOU;
MARKOPOULOS; ANTONIADES, 2008; MOHTASHAM et al., 2010; SHARMA et
al., 2010). No entanto, outros apresentam resultados discordantes (KALRA et al.,
2012; OLIVEIRA-NETO et al., 2007).
12
A capacidade das células tumorais induzirem a angiogênese parece estar
relacionada com o grau de agressividade da neoplasia (MAEDA et al., 1998). Além
disso, existe uma forte associação entre o grau de vascularização e o estágio
avançado da doença, profundidade de invasão em tumores e as metástases (POON;
FAN; WONG, 2001).
Nos mais variados tumores humanos a angiogênese pode ser mensurada
por microscopia ótica, através da quantificação dos vasos sanguíneos presentes nas
áreas de maior densidade destes nos tecidos. Sua evidenciação é feita aplicando-se
a técnica de imunoistoquímica, utilizando-se anticorpos com afinidade por epítopos
específicos da célula endotelial (SOUZA et al., 2007).
Os marcadores para células endoteliais podem ser divididos em duas
categorias: marcadores de proliferação/atividade do endotélio ou marcadores pan-
endoteliais, onde estão enquadrados o anti-CD31 e o anti-CD34. Esses anticorpos
apresentam sensibilidade tanto para pequenos quanto para grandes vasos e a
intensidade de marcação é semelhante em tecidos normais e tumorais. O anti-CD31
ou PECAM-1 pode apresentar marcação cruzada com plaquetas, fibroblastos e
células inflamatórias (macrófagos e linfócitos), porém essas células podem ser
facilmente identificadas, e removidas da contagem, pela morfologia. O anti-CD34
pode marcar além de células endoteliais, vasos linfáticos e fibroblastos
(MIDDLETON et al., 2005; PARUMS et al., 1990; SCHLINGEMANN et al., 1990;
VERMEULEN et al., 1996).
Atualmente, existem vários métodos que buscam avaliar a atividade
angiogênica. O método mais comumente usado é a densidade microvascular (MVD),
que consiste na contagem de vasos nos campos com maior concentração vascular
(WEIDNER, 1995; WEIDNER et al., 1993). A técnica de Chalkley utiliza os mesmos
passos, porém durante a contagem é utilizado um gratículo contendo 25 pontos
randomizados, sendo contados os pontos que estão em sobreposição aos
vasos(FOX et al., 1994). Outra forma de mensurar a angiogênese é o Sistema de
análise multiparamétrica computadorizada (CIAS), que preconiza a contagem
semiautomatizada, além de fazer uma análise morfométrica (dimensão dos vasos,
área do lúmen, perímetro vascular e percentual da área corada pela
13
imunohistoquímica) (BARBARESCHI et al., 1995). Foi descrito também a utilização
da análise da angiogênese através da mensuração da porcentual da área marcada
pelos anticorpos através do software SAAM, específico para este fim (DORNELAS,
2009; FECHINE-JAMACARU, 2006).
Correlações entre a MVD e prognóstico tem sido encontradas em várias
neoplasias malignas, como câncer de mama (ARNES et al., 2011), próstata
(WEIDNER et al., 1993), pulmão (MACCHIARINI et al., 1992) e melanoma
(GRAHAM et al., 1994).
Não existe um consenso na literatura quanto à utilização da densidade
microvascular como fator predictor de metástases e evolução clínica em lesões orais
malignas, tendo, alguns autores, achado correlação positiva (GALLO et al., 1998;
GASPARINI et al., 1993; KLIJANIENKO et al., 1995; WILLIAMS et al., 1994) e
outros nenhuma correlação (ARTESE et al., 2001; DRAY; HARDIN; SOFFERMAN,
1995; EROVIC et al., 2005; GLEICH et al., 1997; GLEICH et al., 1996; HEGDE et
al., 1998; LEEDY et al., 1994).
Os trabalhos existentes também são controversos quanto à possibilidade
de associação entre grau de angiogênese e grau histológico (AL-HARRIS et al.,
2008; ARTESE et al., 2001; BRAHIMI-HORN; BERRA; POUYSSEGUR, 2001;
KAYASELCUK et al., 2004; SIDDIQUI et al.).
Desde 1989, Folkman sugeriu que a angiogênese inicia-se em estágios
precoces da carcinogênese, antes da formação do tumor. Porém, poucos trabalhos
dedicam-se a estudar a angiogênese em lesões potencialmente malignas. Foi
encontrado aumento gradual da densidade microvascular, comparando-se ao tecido
normal, em lesões potencialmente malignas em útero (SMITH-MCCUNE; WEIDNER,
1994), estômago (FENG et al., 2002), tireóide (DE LA TORRE et al., 2006) e nevos
displásicos (EINSPAHR et al., 2007). Em boca, alguns estudos mostram que a
progressão do tecido normal, para displasia e CEC está associada ao aumento da
vascularização (ABBAS et al., 2007; CEDENO; TONINO, 2005; MACLUSKEY et
al., 2000; PAZOUKI et al., 1997; SAUTER et al., 1999; TIPOE; JIN; WHITE, 1996).
14
O presente trabalho tem como intuito avaliar a densidade de mastócitos e
a angiogênese em displasias epiteliais e carcinoma espinocelular de boca, buscando
correlacioná-los com a progressão das lesões potencialmente malignas para a
malignidade.
15
2. PROPOSIÇÃO
2.1 Objetivo Geral
Estudar a expressão dos marcadores CD31 e CD34 e avaliar mastócitos em lesões
potencialmente malignas e câncer de boca.
2.2 Objetivos Específicos
1- Avaliar a expressão de marcadores da angiogênese (Anti-CD31 e Anti-CD34)
em lesões potencialmente malignas de boca.
2- Avaliar a expressão de marcadores da angiogênese (Anti-CD31 e Anti-CD34)
em lesões malignas de boca.
3- Avaliar a densidade de mastócitos em lesões potencialmente malignas de
boca.
4- Avaliar a densidade de mastócitos em carcinoma de células escamosas oral.
5- Correlacionar a densidade de mastócitos com o percentual de vasos
sanguíneos em lesões potencialmente malignas e carcinoma de células
escamosas de cavidade oral.
.
16
3. CAPÍTULO
Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do
Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará,
que regulamenta o formato alternativo para dissertações de Mestrado e teses de
Doutorado e permite a inserção de artigos científicos de autoria ou co-autoria do
candidato. Por se tratar de pesquisas envolvendo seres humanos, ou parte deles, o
projeto de pesquisa foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa,
tendo sido aprovado (Anexo 1).
Capítulo 1:
“Expressão de CD31, CD34 e triptase em lesões potencialmente malignas e nos
carcinomas de células escamosas orais”
Teófilo, CR; Batista, AC; Sousa, FB; Mota, MRL; Silva, MRF; Alves, APNN.
Este artigo será submetido à publicação no periódico Experimental and Molecular
Pathology
17
CAPÍTULO 1
Título: Expressão de CD31, CD34 e triptase em lesões potencialmente malignas e
nos carcinomas de células escamosas orais
Autores:
Teófilo, CRa; Batista, ACb; Sousa, FBd; Mota, MRLc; Silva, MRFa; Alves, APNNAc
a Mestranda em Clínica Odontológica, Faculdade de Farmácia, Odontologia e
Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Brasil
b Doutora em Odontologia, Professora Adjunta da Universidade Federal de Goiás,
Brasil
c Doutor em Farmacologia, Professor Adjunto da Universidade Federal do Ceará,
Brasil
d Doutor em Odontologia, Professor Adjunto da Universidade Federal do Ceará,
Brasil
À Carolina Rodrigues Teófilo
Av. Padre Antônio Tomás, nº 2160 ap. 201 – Aldeota
CEP: 60140-160
Fortaleza-Ceará-Brasil
Fone: +55 85 88041003
e-mail: [email protected]
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Resumo
Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de capilares
pré-existentes, sendo um passo essencial no crescimento tumoral por fornecer
nutrição e oxigênio às células em proliferação. Uma célula que pode estar envolvida
nesse processo é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação de
vasos sanguíneos. Sua participação na indução da angiogênese tem sido sugerida
em vários tumores malignos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a
angiogênese e a densidade de mastócitos em displasias epiteliais e no carcinoma
espinocelular (CEC) de boca. Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo e
quantitativo, realizado através da seleção de amostra proveniente dos arquivos do
Departamento de Patologia e Medicina Legal e do laboratório de Patologia Bucal do
curso de Odontologia, ambos da Universidade Federal do Ceará. Para a avaliação
dos mastócitos, a amostra foi constituída por 73 blocos parafinados, distribuídos
entre CEC (n=30), displasias epiteliais (n=23) e hiperplasias fibroepiteliais (HFE)
(n=20), como controle, e para a angiogênese a amostra foi de 65 blocos, sendo 24
de CEC, 19 de displasias epiteliais e 22 de HFE. Foi realizada imunohistoquímica
utilizando-se os anticorpos anti-triptase, para mastócitos e anti-CD31 e anti-CD34,
para vasos sanguíneos. Para quantificação, foram capturadas imagens digitais e, em
seguida, utilizados softwares para auxiliar na contagem dos mastócitos (Image J) e
para determinação do percentual de marcação do anticorpo (SAMM). Com relação
aos mastócitos, houve menor densidade destes nas lesões malignas em relação às
HFE e displasias (p=0,0092). Avaliando angiogênese, a expressão de CD31 mostrou
diferença entre os grupos CEC e displasia epitelial e entre CEC e HFE, havendo um
maior percentual de vasos nos CEC (p<0,0001). Contudo, o CD34, não mostrou
diferença entre os grupos. O anticorpo CD31 mostrou-se melhor marcador de
angiogênese em mucosa oral do que CD34. O aumento da vascularização em CEC
oral sugere que a angiogênese é necessária ao crescimento tumoral, aumentando à
medida que inicia o processo de malignização. Não foi encontrada correlação entre
mastócitos e angiogênese.
Palavras-chave: Angiogênese, Mastócitos, Carcinoma de Células escamosas,
Lesões Pré-Cancerosas
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Introdução
As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema de saúde
pública no Brasil e no mundo. Muitos fatores contribuem para seu aumento
crescente: dentre estes se destacam, envelhecimento da população decorrente do
desenvolvimento sócio-econômico, aditivos alimentares, pesticidas, poluição
ambiental, tabagismo e etilismo. Esses dois últimos fatores são responsáveis pelo
aumento do risco relativo da incidência de câncer bucal em até 140 vezes (Perez et
al., 2007).
Segundo estimativas do Instituto Nacional do Câncer, a previsão de novos casos de
câncer de cavidade oral no Brasil para o ano de 2012 é de 14.170.
Aproximadamente 70% destes casos ocorrerão no sexo masculino (Brasil, 2011).
Na cavidade oral, o tipo histológico de tumor maligno mais comum, presente entre
90 a 95% dos casos, é o Carcinoma Espinocelular (CEC). Esse tumor representa
uma neoplasia epitelial invasiva e agressiva, com graus variáveis de diferenciação
escamosa e exibe propensão para desenvolvimento de metástases nodal precoce
(Christian, 2002). Frequentemente, ocorre o surgimento de lesões displásicas e
alterações teciduais que precedem o surgimento de neoplasias malignas. Estas
podem permanecer estáveis por um considerável período de tempo antes de evoluir
para malignidade e invasão. As principais lesões potencialmente malignas que
acometem a cavidade oral são leucoplasia com displasia, eritroplasia e queilite
actínica (Cavalcante et al., 2008; Prado et al., 2010).
Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de capilares pré-
existentes. Ela constitui um passo essencial no crescimento tumoral e nas
20
metástases, pois fornece nutrição e oxigênio às células que estão em proliferação,
promove drenagem de metabólitos, além de funcionar como via de transporte de
células tumorais (Folkman, 1990; Souza et al., 2007). Segundo Folkman, as
neoplasias iniciam-se como um nódulo avascular (Folkman, 1971) e só são capazes
de crescer além de 2 milímetros nas três dimensões quando se tornam
vascularizadas, sendo portanto, fundamental na transição da hiperplasia até a
neoplasia (Folkman et al., 1989). A principal diferença entre a angiogênese que
ocorre em um tecido normal e a patológica é que esta última se dá de maneira
desorganizada (Terman and Stoletov, 2001) e os vasos formados são tortuosos,
dilatados, formando braços e shunts (Maahs, 2008). A angiogênese tumoral se dá
pelo desequilíbrio entre fatores de regulação positivos e negativos, havendo um
aumento da secreção de fatores pró-angiogênicos e/ou diminuição de fatores
antiangiogênicos (Ribatti et al., 1999).
Para que ocorra o aumento da vascularização em neoplasias, há participação de
diversos tipos celulares, como células tumorais, endoteliais, macrófagos e
mastócitos (Fox et al., 1996). Outros fatores que influenciam positivamente no sinal
para angiogênese são: ação de proteínas originadas a partir de oncogenes, hipóxia,
baixo pH, nutrição deficiente e atuação de formas de oxigênio reativas (Bergers and
Benjamin, 2003).
A capacidade das células tumorais induzirem a angiogênese parece estar
relacionada com o grau de agressividade da neoplasia (Maeda et al., 1998). Além
disso, existe uma forte associação entre o grau de vascularização e o estágio
avançado da doença, profundidade de invasão em tumores e as metástases (Poon
et al., 2001).
21
Nos mais variados tumores humanos a angiogênese pode ser mensurada por
microscopia ótica, através da quantificação dos vasos sanguíneos presentes nas
áreas de maior densidade destes nos tecidos. Sua evidenciação é feita aplicando-se
a técnica de imunohistoquímica, utilizando-se anticorpos com afinidade por epítopos
específicos da célula endotelial (Souza et al., 2007).
Uma célula que pode estar diretamente envolvida no processo de evolução de
neoplasias é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação da
homeostase de vasos sanguíneos (Alkhabuli, 2007). Sua participação nesse
microambiente tem sido sugerida em vários tumores malignos (Acikalin et al., 2005;
Chan et al., 2005; Dabiri et al., 2004; Elpek et al., 2001; Tuna et al., 2006).
Mastócitos são células imunes originadas na medula óssea e que migram para os
tecidos periféricos, onde sofrem maturação final (Chen et al., 2005; Galli, 1990). São
células de longa duração que residem principalmente no tecido conjuntivo, mais
comumente próximo ao epitélio (Gurish and Boyce, 2002). Em secções histológicas,
apresentam-se como células arredondadas ou alongadas, com diâmetro entre 8 e
20µ, apresentando grande quantidade de grânulos em seu citoplasma (Dvorak,
2005). A constituição dos grânulos dos mastócitos é variável, podendo este produzir
e secretar uma série de substâncias como quimases, fator de crescimento de
fibroblastos básico (bFGF), triptase, heparina, histamina, fator de necrose tumoral
alfa (TNF-α), várias interleucinas (IL-3, 4, 5, 6, 8, 10, 13,16), quimiocinas ,
metaloproteinases (MMP-2 e 9), fator de transformação do crescimento beta (TGF-
β), fator de crescimento neural (NGF), fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Theoharides and Conti,
2004; Theoharides et al., 2007; Walsh, 2003).
22
Os mastócitos foram inicialmente descritos em 1878 (Ehrlich, 1878) e, a partir daí,
desenvolveu-se uma série de estudos direcionados a sua função nas alergias e
resposta frente a parasitas (Drennan, 1951; Gurd, 1911; Keller, 1971). Embora a
presença de mastócitos em volta de massas tumorais já tenha sido descrita por
Ehrlich em seus estudos iniciais, somente recentemente a atenção dos
pesquisadores se voltou mais fortemente para a atuação dessa célula em processos
neoplásicos. Em cavidade oral, existem poucos trabalhos relatados na literatura e os
resultados são conflitantes (Oliveira-Neto et al., 2007; Kalra et al., 2012; Iamaroon et
al., 2003; Jahanshahi and Sabaghian, 2012; Michailidou et al., 2008; Mohtasham et
al., 2010; Sharma et al., 2010).
Desde 1989, Folkman sugeriu que a angiogênese inicia-se em estágios precoces da
carcinogênese, antes da formação do tumor. Porém, poucos trabalhos dedicam-se a
estudar a angiogênese em lesões potencialmente malignas. Foi encontrado aumento
gradual da densidade microvascular, comparando-se ao tecido normal, em lesões
potencialmente malignas originadas em útero (Smith-McCune and Weidner, 1994),
estômago (Feng et al., 2002), tireóide (de la Torre et al., 2006) e nevos displásicos
(Einspahr et al., 2007). Alguns estudos, em boca, mostram que a progressão do
tecido normal, para displasia epitelial e Carcinoma espinocelular (CEC) está
associada ao aumento da vascularização (Abbas et al., 2007; Cedeno and Tonino,
2005; Macluskey et al., 2000; Pazouki et al., 1997; Sauter et al., 1999; Tipoe et al.,
1996), entretanto, ainda há resultados conflitantes na literatura (Ashkavandi et al.,
2010; Shivamallappa et al., 2011; Tae et al., 2000).
Este trabalho tem por objetivo avaliar a angiogênese e a densidade de mastócitos
em displasias epiteliais e no carcinoma de células escamosas de cavidade oral.
23
Materiais e Métodos
Amostra
A amostra foi dimensionada para proporcionar uma confiança de 95% para detectar
diferenças relevantes entre os três grupos considerando a densidade de mastócitos.
Estabeleceu-se que nos pacientes portadores de CEC haveria um aumento de pelo
menos 10% quando comparado com os demais grupos (Gandolfo et al., 2011).
Portanto, o tamanho da amostra foi calculado em torno de 26 pacientes em cada
grupo.
Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo e quantitativo através da seleção
de 73 blocos parafinados (amostra 1), para avaliação de mastócitos e 65 para
avaliação de angiogênese (amostra 2), provenientes do arquivo do Departamento de
Patologia e Medicina Legal e do laboratório de Patologia Bucal do curso de
Odontologia, ambos da Universidade Federal do Ceará-Brasil, constituídos por
fragmentos de lesões de hiperplasia fibroepitelial, utilizadas como controle,
displasias orais e carcinoma espinocelular oral.
Dos laudos histopatológicos, foram retirados os dados relacionados à idade dos
pacientes, ao sexo e à localização da lesão, tabulados através do software excel
2007 e os resultados mostrados através de estatística descritiva.
Para seleção dos casos, deu-se preferência a biópsias realizadas mais
recentemente (até 4 anos), com blocos parafinados íntegros. Antes de serem
selecionadas para a amostra, todas as lâminas foram revisadas por um patologista
oral e excluídas as que apresentavam grande quantidade de inflamação ou que não
possuíam fragmento representativo da lesão.
24
Este trabalho foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa Humana
da Universidade Federal do Ceará, sob número de protocolo 77/09.
Imunohistoquímica (IH)
Os ensaios imunohistoquímicos foram realizados em cortes histológicos de 5m de
espessura, dispostos em lâminas histológicas previamente silanizadas, identificados,
seguindo-se a técnica de estreptavidina-biotina-peroxidase padrão, descrito por Hsu
(Hsu et al., 1981a; Hsu et al., 1981b) com modificações. Como anticorpos primários,
foram utilizados a anti-triptase (M7052, DAKO) na diluição 1:1000, para avaliação de
mastócitos e o anti-CD34(M7165, DAKO) e o anti-CD31 (M0823, DAKO) , ambos na
proporção 1:100, para avaliação de angiogênese. As lâminas silanizadas foram
incubadas em estufa a 70ºC por 3 horas e, após este período, desparafinizadas em
xilol e gradiente de álcool. Foi realizada a recuperação antigênica, em tampão pH 9
(S2367, DAKO Target Retrival), em câmara de pressão pascal (3:30 minutos, 125oC,
18-24 psi). Após bloqueio da atividade endógena da peroxidase (solução aquosa de
H202 a 10V), foram incubados os anticorpos primários, por 12 horas a 4oC em
câmara úmida. Após lavagem, foi adicionado o anticorpo secundário biotinilado (60
minutos) seguido do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (60 minutos), sendo
revelado com o cromógeno diaminobenzidina (DAB) (K3468, DAKO) por 7 a 8
minutos, tendo o peróxido de hidrogênio como substrato. Após a revelação as
lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de Harris por 30 segundos e
montadas. Como controle negativo, foi omitido o anticorpo primário para avaliar
presença de alguma possível reação de interferência entre as células teciduais e o
complexo estreptavidina-biotina-peroxidase que pudesse comprometer os
resultados. Como controle positivo, avaliando a capacidade dos anticorpos de
25
ligarem-se às células-alvo, utilizou-se o mastocitoma e o granuloma piogênico. Após
a reação, os vasos puderam ser evidenciados pela coloração acastanhada em
contraste com um fundo discretamente azulado.
Captura de Imagens Digitais
Imagens digitais dos preparados histológicos foram capturadas de forma
padronizada, por um patologista experiente, utilizando-se, para tanto, um
microscópio de luz (Olympus CX 31, Olympus Corporation, Japão) equipado com
uma câmera digital (Sony 10.1 megapixels, Sony Corporation, Japão). O
procedimento compreendeu, inicialmente, uma varredura do tumor, utilizando o
pequeno aumento (40 vezes), com a finalidade de identificar as zonas de maior
densidade. Para cada tumor, selecionaram-se três zonas. Em seguida, utilizando
uma magnificação de 200 vezes, foram capturadas imagens digitais coloridas dos
campos escolhidos. As imagens foram armazenadas no formato Windows® Bitmap
(BMP)
Densidade de Mastócitos
Com o auxílio do software adaptado para microscopia (MBF Image J), foram
contadas as células coradas em marrom que possuíam morfologia compatível com
mastócito, determinando a densidade de mastócitos (DM) em cada campo.
Percentual de Marcação Vascular
Para quantificação vascular, foi utilizado o Sistema de Análise Morfométrica
(SAMM), um programa de computador desenvolvido especificamente para tal
finalidade (FECHINE-JAMACARU, 2006). O sistema foi previamente calibrado para
reconhecer o espectro de cores relativo às estruturas de interesse
26
(microvasculatura), de acordo com a técnica de coloração empregada. Esse
procedimento habilita o software a identificar e segmentar automaticamente os
vasos sanguíneos (separando-os dos demais componentes do preparado). Todavia,
novos parâmetros de segmentação foram realizados com relação ao ajuste da cor e
área de interesse, quando se julgou como inadequado o resultado do procedimento
automático. Concluída a segmentação, o software realizou a determinação do
percentual de superfície do campo corado. Para tanto, realizava o cálculo da
densidade de área (DA), que era definida pelo quociente entre a área ocupada pela
microvasculatura e a área total do campo analisado.
Para análise, foram consideradas duas metodologias: a média dos três campos
selecionados e a área com maior concentração de mastócitos/vasos.
Análise estatística
Para comparação de densidade de mastócitos entre os grupos, utilizou-se
os teste de Kruskal-Wallis seguido pelo Teste de Dunn, através do software
estatístico GraphPad Prism 5 para Windows. Foram considerados estatisticamente
significantes valores de p<0,05.
Resultados
Descrição das amostras
As amostras selecionadas foram compostas por lesões presentes em indivíduos com
idade variando entre 36 e 92 anos, com média de 64 anos para amostra 1 e 59 anos
para amostra 2. Com relação ao sexo, houve leve predominância de indivíduos do
27
sexo masculino (56%) na amostra 1, enquanto que na amostra 2 os homens
representavam (50,3%). As amostras utilizadas foram colhidas de lábio, palato,
mucosa jugal, língua, gengiva, soalho e freio labial.
Densidade de mastócitos (DM) por análise imunohistoquímica
Os mastócitos foram claramente identificados pela reação de imunohistoquímica
utilizando-se o anticorpo anti-triptase, como células com coloração marrom, ovais ou
alongadas (Figura 1). Os controles negativos mostraram ausência total de
marcação.
A contagem numérica de mastócitos no campo com maior concentração mostrou
como resultados nos grupos CEC, displasia epitelial e hiperplasia fibroepitelial
(HFE), respectivamente, 22,34±14,38, 32,04±16,04 e 34,00±18,53. Quando se
utilizou a média entre os 3 campos, a DM encontrada em CEC foi de 16,15±10,65,
em displasia epitelial de 24,61±12,30 e hiperplasia fibroepitelial 25,74±13,41. Após
testes estatísticos, foram encontrados resultados semelhantes nas duas
metodologias, havendo diferença estatisticamente significante entre o grupo de
lesões malignas em relação às HFE e displasias epiteliais (p=0,0092 e p=0,0038),
tendo o CEC menor concentração de mastócitos que as demais lesões (Gráfico 1).
Análise da densidade de marcação vascular (%)
Os vasos sanguíneos foram identificados pela reação de imunohistoquímica
utilizando-se os anticorpos anti-CD31 e anti-CD34, como células com coloração
marrom, solitárias (considerados brotos vasculares) ou agrupamentos celulares
28
formando ou não lumens. O controle negativo mostrou ausência total de marcação.
Observou-se marcação mais intensa quando foi utilizado o anticorpo anti-CD34,
havendo também uma maior coloração de fundo. O anti-CD31 marcou mais
fracamente, porém foi mais específico para estruturas vasculares (Figura 1).
Com relação à morfologia dos vasos encontrados, observou-se que, nas HFE, estes
se mostram mais calibrosos que nas demais lesões.
O anticorpo anti-CD31 mostrou densidade de marcação vascular de 9,6±5,4% no
grupo CEC, 4,4±3,4% nas displasias epiteliais e 3,3±1,8% em HFE. Quando foi
considerada a média entre 3 campos, os resultados de CEC, displasia epitelial e
HFE foram, respectivamente, de 7±3,9%, 3±2,2% e 2,4±,3%. Foi encontrada
diferença estatisticamente significante entre os grupos CEC e displasia epitelial e
entre CEC e hiperplasia fibroepitelial (p< 0,0001), porém não houve diferença entre
HFE e displasia epitelial (Tabela 1).
Avaliando a expressão do anticorpo anti-CD34, obteve-se como resultado da
densidade de marcação vascular em 1 e 3 campos, respectivamente, 8,7±3,7% e
6,1±2,4% em CEC; 9,9±6,8% e 6,2±4,4% em displasia epitelial; e 8,8±6,3% ;
6,1±4,2% em HFE. Não houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p=0,91, avaliando 1 campo, p=0,67 considerando média de 3 campos).
Para ambos os anticorpos, encontrou-se resultados semelhantes ao analisar 1 ou 3
campos (Gráfico 2).
Discussão
29
As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema de saúde
pública no Brasil e no mundo. De acordo com estudo Indiano, cerca de 80% das
neoplasias de cavidade oral são precedidas por lesões potencialmente malignas
(LPM) (Gupta et al., 1989). O percentual de LPM que sofrem transformação maligna
pode variar de 6,6 a 36,4% (Arduino et al., 2009; Ho et al., 2009; Lumerman et
al.,1995). Portanto, é de grande importância identificar a ocorrência de mudanças no
padrão dessas lesões que indiquem a progressão destas para malignidade,
possibilitando o desenvolvimento de agentes que visem paralisar deste processo.
Segundo os estudos de Folkman (Folkman et al., 1989), há incremento da
vascularização antes mesmo que haja invasão tumoral, durante a formação de
ilhotas hiperplásicas. Também foi demonstrado que os fatores pró-angiogênicos já
estão presentes nas lesões pré-invasivas em lesões de ânus (Mullerat et al., 2003).
Entretanto, outros autores acreditam que as lesões potencialmente malignas
permanecem adormecidas antes de tornarem-se angiogênicas e proliferar
(Moriyama et al., 1997; Shieh et al., 2004).
Inúmeros trabalhos têm se proposto a avaliar angiogênese em lesões
potencialmente malignas. Em alguns, é mostrada um aumento dos vasos, à medida
que a lesão progride para a malignidade, havendo uma menor quantidade de vasos
no epitélio normal, aumentando na displasia epitelial e tornando-se maior no CEC
(Carlile et al., 2001; Cedeno and Tonino, 2005; Gandolfo et al., 2011; Iamaroon et
al., 2003; Macluskey et al., 2000; Michailidou et al., 2008; Mohtasham et al., 2010;
Pazouki et al., 1997). Outro estudo mostra não haver diferença entre tecido normal e
displasia epitelial, somente sendo possível encontrar diferença significante entre
CEC e tecido normal (Shivamallappa et al., 2011), o que corrobora com os achados
30
do presente trabalho. Para justificar tal resultado, o autor sugere que somente há
incremento da angiogênese quando a lesão se torna maligna. Já Tae et al. e
Ashkavandi et al., não encontraram diferença estatisticamente significante entre
mucosa normal, displasia epitelial e CEC (Ashkavandi et al., 2010; Tae et al., 2000) e
afirmam que comparar os trabalhos existentes na literatura é tarefa difícil, uma vez
que as metodologias empregadas para imunohistoquímica, para contagem vascular
e o anticorpo utilizado são diferentes, além de existir a variável do examinador que
pode influenciar nos resultados. Ashkavandi et al., que utilizou como anticorpo o
anti-CD34, afirma, ainda, que este não é capaz de diferenciar vasos pré-existentes
de neovascularização (Ashkavandi et al., 2010). Neste trabalho, quando empregado
o anticorpo anti-CD34, também não foi encontrada diferença significante entre
hiperplasia fibroepitelial, displasia epitelial e carcinoma espinocelular. Observou-se
que, em alguns casos, o CD34 mostrou marcações de outras estruturas além de
vasos, principalmente fibras colágenas no tecido conjuntivo, o que pode ter
contribuído para a não obtenção de diferença entre os grupos.
Os artigos existentes são controversos ao correlacionarem densidade de mastócitos
e neoplasias. Há relatos de aumento de mastócitos em lesões malignas quando
comparadas ao tecido normal em esôfago (Elpek et al., 2001), pulmão (Tomita et al.,
2000) e linfoma (Duse et al., 2011). Nesses casos, acredita-se que exista uma
atuação dos mastócitos na progressão tumoral através da liberação de mediadores
que favorecem a angiogênese. Entretanto, estudo recente avaliando neoplasias
uterinas não achou relação estatisticamente significante, em neoplasias malignas,
entre angiogênese e mastócitos, não havendo aumento do número destes com
progressão da doença (Goksu Erol et al., 2011).
31
No presente trabalho, encontrou-se diminuição do número de mastócitos com a
evolução da lesão, havendo diferença estatisticamente significante entre os grupos
de hiperplasia fibroepitelial e displasia epitelial e o grupo de CEC. Estes dados são
concordantes com os resultados descritos por Oliveira-Neto et al. e Kalra et al.(Kalra
et al., 2012; Oliveira-Neto et al., 2007). Porém, outros autores mostraram um
aumento de mastócitos proporcionalmente ao aumento de angiogênese, ocorrendo
maior densidade de mastócitos à medida que a agressividade das lesões bucais
progredia (Iamaroon et al., 2003; Jahanshahi and Sabaghian, 2012; Michailidou et
al., 2008; Mohtasham et al., 2010; Sharma et al., 2010). Provavelmente, o
comportamento biológico variado das neoplasias bem como o microambiente
diferenciado, determinados por hábitos individuais ou do ambiente, expliquem esses
resultados divergentes. Ressalta-se que o trabalho de Oliveira-Neto, onde se
encontraram resultados semelhantes aos do presente estudo foram, igualmente,
desenvolvidos na população brasileira.
A grande quantidade de substâncias secretadas pelos mastócitos torna difícil
determinar qual será a atuação dessa célula no ambiente, principalmente em meio a
neoplasias. A produção de agentes que promovem tanto a inibição (IL-1, IL-4, IL-6,
TNF-α) quanto a progressão tumoral (VEGF, bFGF, triptase, quimase, TGF-β, NGF,
MMP-2 e 9) faz com que esta célula possa acarretar efeitos diferentes nos diversos
tumores, dependo das condições locais do estroma (Theoharides and Conti, 2004).
Sabe-se que a maioria dos indivíduos que apresenta câncer oral ou alterações
potencialmente malignas faz uso de tabaco. Estudo que buscou avaliar os efeitos do
tabaco em mucosa oral mostrou que o carcinógeno 4-nitroquinoline-N-oxide (4-
32
NQO), presente no tabaco, pode causar a diminuição dos mastócitos (Sand et al.,
2002), o que pode explicar os achados do presente trabalho.
Outro ponto a ser considerado, é o de proliferação celular maligna ocorrer
preferencialmente em locais com baixa concentração de mastócitos, uma vez que
estas células podem ter efeito anti-tumoral e inibir o desenvolvimento da neoplasia
quando presentes em alto número (Samoszuk and Corwin, 2003). Ch´ng et al.
concluíram que os mastócitos têm efeito inibitório direto sob a proliferação de CEC
de cabeça e pescoço (Ch'ng et al., 2006). Além disso, mastócitos podem recrutar
linfócitos que agem contra células aberrantes, através da liberação de IL-8 e
RANTES, dificultando ainda mais o crescimento de neoplasias malignas (Aoki et al.,
2003).
O número de mastócitos que migram em direção ao tecido também pode estar
diminuído, contribuindo para o baixo número total de mastócitos em displasias e
neoplasias malignas. Oliveira-Neto et al. observaram esse fato através do baixo
número de mastócitos c-kit+ e baixa proporção entre mastócitos residentes e
mastócitos recrutados encontrado em lesões pré-malignas e malignas de mucosa
oral. Atribuem esse fato à liberação de baixa quantidade de substâncias que atraem
mastócitos pelos queratinócitos e microambiente tumoral (Oliveira-Neto et al., 2007).
Parizi et al. realizaram estudo comparando DM em CEC de pele e cavidade bucal,
encontrando nesta uma menor DM, o que estaria relacionado à menor necessidade
de ativação de mastócitos para promover aumento da vascularização em mucosa
oral (Parizi et al., 2010).
33
Diferentes técnicas de identificação de mastócitos em espécimes histológicas são
empregadas desde reações de histoquímica, como o azul de toluidina (Parizi et al.,
2010) e o alcian blue com safranina (Tomita et al., 2000), até as reações de
imunohistoquímica através do anticorpo monoclonal anti-triptase (Mohtasham et al.,
2010). A imunohistoquímica é a técnica mais específica para detecção destas
células (Batista et al., 2005) e o presente estudo foi realizado com a técnica de
imunohistoquímica com anti-triptase, aumento de 200x e contagem em 1 e 3
campos.
Resultados semelhantes foram encontrados ao considerar 1 campo e a média de 3
campos, o que indica que ambas as metodologias podem ser usadas sem
alterações dos resultados. Nos trabalhos publicados, são utilizados, para contagem
de mastócitos, aumentos de 100x (Kalra et al., 2012), 200x (Michailidou et al., 2008)
ou 400x (Iamaroon et al., 2003). Também não há consenso quanto ao número de
campos a serem avaliados, variando entre 1 (Michailidou et al., 2008), 3 (Duse et al.,
2011),4 (Kalra et al., 2012), 5 (Jahanshahi and Sabaghian, 2012) e 10 (Souza et al.,
2010). Os diferentes métodos usados para contagem de mastócitos podem ser um
dos motivos para os resultados diferentes encontrados na literatura.
Atualmente, diversos marcadores são utilizados com o intuito de identificar as
células endoteliais. Dentre os mais comumente utilizados estão o anti-CD31 (ou
PECAM-1), anti-CD34, anti-FvW (ou fator VIII), anti-CD105 e VEGF. No presente
estudo, utilizaram-se o anti-CD31 e o anti-CD34 buscando avaliar a marcação
destes em displasias epiteliais e CEC de cavidade oral. A literatura ainda é muito
controversa em apontar o marcador ideal para avaliar angiogênese em LPM e
câncer oral. Shieh et al. relatam que CD31 e CD34 são melhores que o fator VIII em
34
casos de CEC orais e que são geralmente os marcadores de escolha quando se
trata de tecidos emblocados em parafina (Shieh et al., 2004).
Vários métodos são relatados na literatura para avaliação da vascularização
(Barbareschi et al., 1995; Fox et al., 1994; Weidner et al., 1993). Neste estudo,
utilizou-se um novo método para quantificação (Fechine-Jamacaru, 2006), em que,
após segmentação, há determinação do percentual do campo corado pelo anticorpo.
Esse método promove uma menor variação de resultados uma vez que a variável do
examinador foi eliminada durante a contagem.
Quando se avalia os estudos disponíveis na literatura, percebe-se que, em relação à
angiogênese, também existe uma grande variação com relação ao número de
campos analisados bem como ao aumento da objetiva do microscópio utilizado. Os
estudos iniciais de Weidner preconizavam que se utilizasse aumento de 200x e que
fosse contado apenas um campo com maior concentração de vasos, chamado
“hotspots” (Weidner et al., 1993). Entretanto, várias modificações à técnica foram
realizadas pelos pesquisadores, desde variações no aumento da objetiva, utilizando
400x (Ashkavandi et al., 2010; Michailidou et al., 2008; Shieh et al., 2004; Tae et al.,
2000) ou 250x (Cedeno and Tonino, 2005) em vez de 200x; contagem em múltiplos
campos, porém considerando para análise apenas o de maiores resultados
(Macluskey et al., 2000; Pazouki et al., 1997); ou contagem de múltiplos campos
analisando a média dos resultados (Ashkavandi et al., 2010; Carlile et al., 2001;
Michailidou et al., 2008; Mohtasham et al., 2010; Shivamallappa et al., 2011; Tae et
al., 2000). No presente trabalho, avaliou-se o campo com maior marcação e a média
entre três campos, com aumento de 200x, e foram obtidos resultados semelhantes
em ambas as metodologias.
35
São necessários novos estudos acerca dos mastócitos e seu comportamento nos
diversos microambientes tumorais, uma vez que se apresenta como uma célula
bastante complexa e que pode assumir diversos papéis, tanto como favorecedor do
crescimento quanto inibidor das neoplasias e lesões potencialmente malignas.
Também é importante que haja uma padronização quanto à metodologia empregada
para avaliação tanto para mastócitos quanto para angiogênese, possibilitando uma
comparação mais confiável dos resultados dos estudos.
Conclusão
O anticorpo CD-31 mostrou-se melhor marcador para avaliação de angiogênese em
mucosa oral do que o anti-CD34. O aumento da vascularização em CEC oral
quando comparado aos grupos de displasia epitelial e hiperplasia fibroepitelial
sugere que a angiogênese é necessária ao crescimento tumoral aumentando à
medida que se inicia o processo de malignização. Além disso, os marcadores
utilizados para angiogênese não foram eficazes na detecção de componentes pré-
malignos, provavelmente presentes nas lesões potencialmente malignas.
Há uma menor densidade de mastócitos em carcinomas epidermóides de boca
quando comparada às hiperplasias fibroepiteliais e displasias epiteliais, sugerindo
que essa célula não funciona como promotora de processos neoplásicos malignos
em cavidade oral.
Não foi possível encontrar correlação entre mastócitos e angiogênese em lesões
potencialmente malignas e câncer de boca, indicando que nos carcinomas de
células escamosas orais não há participação dessa célula no processo de
angiogênese.
36
Referências
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41
Figuras
Figura 1. Fotomicrografia de mucosa oral mostrando padrão de marcação de triptase em CEC (A), displasia epitelial (B) e HFE (C); CD31 em CEC (D), displasia epitelial (E) e HFE (F) e CD34 em CEC (G), displasia epitelial (H) e HFE (I). IHQ Estreptavidina-biotina. Aumento de 200X.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
42
Gráficos
Grafico 1. Comparação da densidade de mastócitos em CEC, displasia epitelial e HFE considerando 1 e 3 campos, utilizando como marcador o anticorpo anti-triptase. Os dados foram expressos sob forma de média + EPM e a análise estatística foi realizada através dos testes Kruskal-Wallis seguido pelo Teste de Dunn, com p <0,05, sendo observada diferença estatisticamente significante entre o grupo CEC e os grupos displasia epitelial e hiperplasia fibroepitelial (*) (p= 0,0092 –1 campo; p= 0,038 – 3 campos).
Grafico 2. Correlação entre percentual de densidade de marcação vascular utilizando anticorpos CD31 e CD34 em CEC, displasia epitelial e HFE. Os dados foram apresentados sob forma de média. A análise estatística foi feita utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo Teste de Dunn, com p<0,05 sendo observada diferença estatisticamente significante entre os grupos CEC e displasia epitelial e entre os grupos CEC e hiperplasia fibroepitelial quando utilizado o marcador CD31(*).
*
*
43
Tabela
CD31 (1) Média ±DP
p CD31 (3) Média ±DP
p CD34 (1) Média ±DP
p CD34 (3) Média ±DP
p
CEC 9,61±1,11 <0,0001 7,05±0,80 <0,0001 8,32±0,76 0,92 6,02±0,50 0,05
Displasia
4,47±3,35
3,20±0,51
10,82±1,50
6,35±0,99
HFE
3,35±0,39
2,50±0,29
9,22±1,33
5,98±0,91
Tabela 1. Percentual de densidade de marcação vascular em CEC, displasia epitelial
e HFE, utilizando os anticorpos anti-CD31 e anti-CD34.
*(1) Avaliado 1 campo com maior percentual de marcação; (3) Avaliada média de 3
campos com maior percentual de marcação.
44
4. CONCLUSÕES GERAIS
Há uma menor densidade de mastócitos em carcinomas epidermóides de
boca quando comparado a hiperplasias fibroepiteliais e displasias epiteliais.
Há aumento da angiogênese quando a lesão torna-se maligna.
Entretanto, não há alteração da vascularização quando comparadas hiperplasias
fibroepiteliais e displasias epiteliais.
Não foi possível encontrar correlação entre mastócitos e angiogênese em
lesões potencialmente malignas e câncer de boca, indicando que nos carcinomas de
células escamosas orais não há participação dessa célula no processo de
angiogênese.
45
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51
ANEXOS
ANEXO A - ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA HUMANA
52
ANEXO B – MANUAL DE NORMALIZAÇÃO PARA DEFESA DE DISSERTAÇÃO
DE MESTRADO E TESE DE DOUTORADONO FORMATO ALTERNATIVO DO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE
FEDERAL DO CEARÁ
ESTRUTURA DO TRABALHO
As teses e dissertações apresentadas ao Programa de Pós-Graduação em
Odontologia da Universidade Federal do Ceará poderão ser produzidas em formato
alternativo ou tradicional de acordo com o artigo 46 do Regimento Interno do
Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará. O
formato alternativo estabelece: a critério do orientador e com a aprovação da
Coordenação do Programa, que os capítulos e os apêndices poderão conter cópias
de artigos de autoria ou co-autoria do candidato, publicados ou ainda não
submetidos para publicação em periódicos científicos, escritos no idioma exigido
pelo veículo de divulgação.
§1º - O orientador e o candidato deverão verificar junto às editoras a possibilidade de
inclusão dos artigos na dissertação ou tese, em atendimento à legislação que rege o
direito autoral, obtendo, se necessária, a competente autorização, devendo assinar
declaração de que não estão infringindo o direito autoral transferido à editora.
O formato padrão e alternativo das dissertações de mestrado e teses e doutorado da
UFC deverão obrigatoriamente conter:
a) capa – cobertura externa de material flexível ou rígido que oferece melhor
proteção ao trabalho. Usa-se a cor preta para dissertações e teses com os
caracteres dourados. Nela devem constar, na seguinte ordem:
- nome da instituição, seguido do centro ou faculdade, departamento e curso, todos
centralizados a partir da primeira linha do texto, em letras maiúsculas;
- nome do autor, centralizado e colocado após o cabeçalho inicial, em letras
maiúsculas;
- título em letras maiúsculas e centralizado, colocado após o nome do autor;
- subtítulo (se houver) em letras maiúsculas, separado por dois pontos do título;
53
- número de volumes (se houver) centralizado e colocado logo após o título ou o
subtítulo;
- local (cidade) da instituição onde vai ser apresentado o trabalho, em letras
maiúsculas, na margem inferior e centralizado na penúltima linha;
- ano de entrega, seguindo o local, na margem inferior e centralizado na última linha.
b) lombada (opcional) - de acordo com a NBR 12225/1992, é a parte da publicação
que reúne as margens internas ou dobras das folhas, sejam elas costuradas,
grampeadas, coladas ou mantidas juntas de outra maneira:
- último sobrenome do autor e título do trabalho escrito longitudinalmente e legível
do alto para o pé da lombada. Dessa forma, possibilita a leitura quando a publicação
estiver no sentido horizontal, com a face voltada para cima;
- ano de publicação colocado logo após o título;
- quando necessário, identifica-se com outros elementos alfanuméricos, por
exemplo: v. 2.
c) folha de rosto (obrigatório) – contém elementos essenciais que identificam o
trabalho:
O anverso da folha de rosto deve conter, na seguinte ordem:
- nome do autor, responsável intelectual do trabalho, centralizado na primeira linha
do texto, em letras maiúsculas;
- título principal do trabalho em letras maiúsculas e centralizado, colocado após o
nome do autor;
- subtítulo (se houver) em letras maiúsculas, separado por dois pontos do título;
- número de volumes (se houver mais de um, deve constar em cada folha de rosto)
centralizado e colocado logo após o título ou o subtítulo acompanhado da respectiva
especificação;
- nota explicativa contendo a natureza e objetivo do trabalho, nome da instituição e
área de concentração, transcrita em espaço simples e em letras normais, alinhada a
partir do centro da folha em tipo menor que o usado para o texto;
- nome do orientador e do co-orientador (se houver) iniciando e finalizando nas
mesmas margens da nota explicativa, distante desta por uma linha em branco;
- local (cidade) da instituição onde vai ser apresentado o trabalho, em letras
maiúsculas e centralizado na penúltima linha;
- ano de entrega, seguindo o local, na margem inferior e centralizado na última linha.
54
O verso da folha de rosto deve conter:
- ficha catalográfica no tamanho 7,5 cm x 12,5 cm, elaborada de acordo com o
Código de Catalogação Anglo-Americano vigente e localizada na parte inferior da
folha. A ficha deve ser feita pelo(a) bibliotecário(a) da biblioteca que serve ao curso
em questão.
d) errata (de acordo com a necessidade) – constituída pela referência do trabalho e
pelo texto da errata. Pode ser apresentada em papel avulso ou encartado acrescido
ao trabalho depois da impressão do mesmo. Deve ser inserida após a folha de rosto.
Página 6 de 21
e) folha de aprovação (obrigatório para teses e dissertações) – colocada em folha
distinta logo após a folha de rosto, contém:
- autor, centralizado na primeira linha do texto, em letras maiúsculas;
- título por extenso e subtítulo (se houver), centralizados e em letras maiúsculas,
colocados logo após o autor;
- o subtítulo deve ser separado do título por dois pontos;
- nota explicativa contendo a natureza e objetivo do trabalho, nome e área de
concentração, transcrita em espaço simples e em letras normais, alinhada a partir do
centro da folha em tipo menor que o usado para o texto;
- data de aprovação, colocada logo após a nota;
-nome, titulação e assinatura dos componentes da banca examinadora e instituição
a que pertencem, ocupando a metade inferior da folha. Os trabalhos defendidos em
formato alternativo têm como exigência mínima:
em revista científica com classificação Qualis A Nacional ou superior;
publicação em
revista científica com classificação Qualis C Internacional ou superior.
Obs.: A lista Qualis válida é a mais recente disponível no site da CAPES
http://qualis.capes.gov.br/webqualis/ConsultaListaCompletaPeriodicos.
Em formato alternativo:
Capa
Folha de rosto (primeira folha interna)
Ficha catalográfica (verso da folha de rosto)
55
Folha de aprovação
Dedicatória (Opcional)
Agradecimentos (Opcional)
Epígrafe (Opcional)
Resumo
Abstract
Lista de Abreviaturas e Siglas (Opcional)
Sumário
1. Introdução Geral
2. Proposição
3. Capítulos
4. Conclusão Geral
Referências
Bibliografia (Opcional)
Glossário (Opcional)
Apêndice (Opcional)
Anexo (Opcional)
RESUMO
O Resumo é a síntese dos pontos relevantes do documento, em linguagem clara,
concisa e direta. Ele transmite informações e fornece elementos para decidir sobre a
consulta do texto completo. Seis itens são essenciais para a elaboração de um
resumo: a) situar o trabalho; b) expor os objetivos; c) descrever a metodologia
utilizada; d) expor a própria experiência; e) apresentar os resultados obtidos; f)
conclusão. Usar, de preferência, a terceira pessoa do singular e empregar o verbo
na voz ativa. Localizado em folha separada, limita-se a um parágrafo. Deve ter no
mínimo 250 e no máximo 500 palavras. Logo abaixo do resumo, indicam-se as
palavras-chave. Deve obrigatoriamente estar relacionado a todos os capítulos do
trabalho sejam eles experimentais ou não.
ABSTRACT
É a tradução fiel do resumo para a língua inglesa, desta forma segue a mesma
orientação do resumo. Logo abaixo do abstract, devem ser indicadas as key-words.
56
SUMÁRIO
É a indicação do conteúdo do documento, refletindo as principais divisões e seções
na mesma ordem e grafia em que se apresentam no texto. O sumário deve oferecer
ao leitor uma visão global do estudo realizado, e deve:
• Ser localizado após todos os elementos pré-textuais, e não devem constar no
sumário.
• Ser transcrito em folha distinta, com o título centrado.
• O título do capítulo ou seção deve aparecer no sumário com o mesmo tipo de letra
utilizado no texto.
• Cada parte é seguida pelo número da página em que se inicia.
• Usa-se o termo "sumário" (e. não a palavra índice ou lista) para designar esta
parte.
1 INTRODUÇÃO GERAL
Parte inicial do texto, a introdução apresenta a formulação clara e simples do tema
investigado; deve constar a delimitação do assunto tratado, sua justificativa,
objetivos da pesquisa, rápida referência a trabalhos anteriormente realizados e
outros elementos necessários para situar o tema do trabalho. A introdução, como
primeira seção do texto, receberá o indicativo 1 (um), não sendo aconselhada a
inclusão de figuras e/ou tabelas.
2. PROPOSIÇÃO
Trata-se da descrição dos objetivos da investigação – o propósito da pesquisa
científica. Constitui a segunda parte do texto, recebendo o indicativo 2. Nesta parte
será(ão) apresentado(s) o(s) objetivo(s) da pesquisa que será(ão) concernente(s)
ao(s) capítulo(s) apresentado(s) subseqüentemente.
3. CAPÍTULOS
Deve(m) ser inserida(s) a(s) cópia(s) de artigo(s) de autoria ou co-autoria do
candidato, já publicado(s) em periódicos científicos ou ainda não publicado(s). Cada
capítulo deve conter sua indicação, seguido do número (em arábico)
correspondente. Ex.: Capítulo 1, Capítulo 2 e assim sucessivamente e deverá
57
informar o nome do periódico onde o artigo foi submetido para publicação. O idioma
e as normas de referências e de escrita devem ser as da revista na qual o artigo foi
submetido para publicação.
4. CONCLUSÃO GERAL
Podendo ser apresentada de forma dissertativa ou de tópicos, a conclusão é a parte
final do texto na qual se apresenta o fechamento das idéias correspondentes aos
objetivos, tentando responder às hipóteses formuladas. A conclusão deve ser
apresentada de maneira lógica, clara e objetiva, fundamentada nos resultados e na
discussão. Portanto, não é permitida inclusão de dados novos neste capítulo. Não
deve ser uma repetição dos resultados, deve constar o que foi resolvido,
comprovado, justificado, atingido, dificuldades encontradas, mudanças que se
fizeram necessárias, novas indagações que surgiram durante o transcorrer do
trabalho, que contribuições esse trabalho trouxe e sugestões de novas pesquisas.
Devem ser referentes a todos os capítulos apresentados.
PÓS-TEXTUAIS
São elementos complementares que têm relação com o texto, mas que, para torná-
los menos densos e não prejudicá-los, costumam vir apresentados após a parte
textual.
REFERÊNCIAS GERAIS
Consistem numa listagem de todo material bibliográfico utilizado para a produção da
parte geral do trabalho, permitindo a identificação de publicações, no todo ou em
parte. Inclui apenas referências das citações utilizadas no texto e não indicadas em
nota de rodapé. Esta lista permite ao leitor comprovar fatos ou ampliar
conhecimentos, mediante consulta as fontes referenciadas. As comunicações
pessoais não fazem parte da lista de referências, sendo colocadas apenas em nota
de rodapé. É válido ratificar que não devem ser inseridas as referências já
relacionadas nos trabalhos apresentados nos capítulos, apenas deve conter as
referências usadas na introdução geral e na discussão geral. As referências nos
trabalhos apresentados à FFOE/UFC deverão ser baseadas nas normas
58
apresentadas no Guia para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da Biblioteca
Universitária.
APRESENTAÇÃO GRÁFICA
Formato
a) papel branco, formato A4 (210 mm x 297 mm);
b) digitação em fonte tamanho 12 para o texto (Times New Roman ou Arial);
c) digitação em fonte tamanho 10 (Times New Roman ou Arial) para citações longas,
notas de rodapé, paginação, legendas de ilustrações e tabelas;
d) a digitação é feita no anverso da folha com exceção para a folha de rosto;
e) opcionalmente pode-se digitar no anverso e no verso da folha dependendo do tipo
de papel utilizado;
f) a digitação é feita na cor preta;
g) o projeto gráfico é de responsabilidade do autor do trabalho.
Margem
a) margens esquerda e superior de 3 cm;
b) direita e inferior de 2 cm;
c) parágrafo inicial de 2 cm a partir da margem esquerda;
d) a citação longa é destacada com recuo de 4 cm da margem esquerda.
Espacejamento
a) todo o texto deve ser digitado com 1,5 cm de entrelinhas;
b) as citações longas, as notas, os resumos, as referências, as legendas das
ilustrações e tabelas, a ficha catalográfica, a natureza do trabalho, o objetivo, o
nome da instituição e a área de concentração devem ser digitados em espaço
simples;
c) as referências ao final do trabalho devem ser separadas entre si por espaço
duplo;
d) os títulos das seções e subseções devem ser separados do texto que os precede
ou os sucede por um espaço duplo ou dois espaços simples;
59
e) as notas de rodapé devem ser digitadas dentro das margens, separadas do texto
por um espaço simples de entrelinhas e por filete de 3 cm, a partir da margem
esquerda;
f) na folha de rosto e na folha de aprovação, a natureza do trabalho, o objetivo, o
nome da instituição e a área de concentração devem ser alinhados do centro da
folha para a margem direita.
Indicativos de seção
a) indicativo numérico de uma seção antecede seu título, alinhado à esquerda,
separado por um espaço de caractere;
b) os títulos sem indicativo numérico, como errata, agradecimentos, resumo, listas
de ilustrações, listas de abreviaturas e siglas, lista de símbolos, sumário, glossário,
apêndices, anexos e índices devem ser centralizados conforme a NBR 6024/1989.
Paginação
a) todas as folhas do trabalho são contadas a partir da folha de rosto,
seqüencialmente;
b) a numeração é colocada, a partir da primeira folha da parte textual;
c) a numeração é em algarismos arábicos, no canto superior direito da folha a 2
cm da borda superior, ficando o último algarismo a 2 cm da borda direita da folha,
em tamanho menor que o do texto;
d) em caso de digitação no anverso e verso da folha, a numeração das páginas deve
ser em algarismos arábicos no canto superior esquerdo (para páginas pares) e no
canto superior direito (para páginas ímpares);
e) para trabalhos em mais de um volume, deve ser dada uma numeração seqüencial
das folhas do primeiro ao último volume;
f) a numeração de apêndices e anexos, quando utilizados, deve ser contínua à do
texto principal.
Numeração progressiva, de acordo com a NBR 6024/1989
a) evidencia e sistematiza o conteúdo do trabalho em seções;
60
b) as seções são partes em que se divide o texto de um documento, que contêm as
matérias consideradas afins na exposição ordenada do assunto;
c) as seções primárias são as principais divisões do texto de um documento, e
devem iniciar em folha distinta;
d) as seções primárias podem ser divididas em seções secundárias; as secundárias,
em terciárias; as terciárias, em quaternárias; e assim por diante;
e) os títulos das seções são destacados gradativamente, usando-se racionalmente
os recursos de negrito, itálico ou grifo, caixa alta ou maiúsculas etc., conforme a
NBR 6024, no sumário e de forma idêntica, no texto;
f) quando uma seção tem título, este é colocado na mesma linha do respectivo
indicativo, e a matéria da seção pode começar na linha seguinte da própria seção ou
em uma seção subseqüente;
g) o título da seção primária deve aparecer em destaque (maiúsculas e negrito); as
seções secundárias, aparecem em letras normais e em negrito; as demais seções,
terciárias, quaternárias e assim por diante aparecem em letras normais, sem
destaque, todas alinhadas à margem esquerda.
61
ANEXO C - NORMAS PERIÓDICO EXPERIMENTAL AND MOLECULAR
PATHOLOGY
Use of wordprocessing software
It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used.
The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as
possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the
article. In particular, do not use the wordprocessor's options to justify text or to
hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc.
When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each
individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces,
to align columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that
of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:
http://www.elsevier.com/guidepublication). Note that source files of figures, tables
and text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text.
See also the section on Electronic artwork.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and
'grammar-check' functions of your wordprocessor.
Article structure
Introduction
State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a
detailed literature survey or a summary of the results.
62
Material and methods
Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already
published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be
described.
Results
Results should be clear and concise.
Discussion
This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A
combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive
citations and discussion of published literature.
Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,
which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and
Discussion section.
Appendices
If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae
and equations in appendices should be given separate numbering: Eq. (A.1), Eq.
(A.2), etc.; in a subsequent appendix, Eq. (B.1) and so on. Similarly for tables and
figures: Table A.1; Fig. A.1, etc.
Essential title page information
• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval
63
systems. Avoid abbreviations and formulae where possible.
• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a
double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses
(where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a
lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the
appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the
country name and, if available, the e-mail address of each author.
• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all
stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone
and fax numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-
mail address and the complete postal address. Contact details must be kept up
to date by the corresponding author.
• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in
the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent
address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which
the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address.
Superscript Arabic numerals are used for such footnotes.
Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the
purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is
often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this
reason, References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and
year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if
essential they must be defined at their first mention in the abstract itself.
Keywords
64
Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American
spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for
example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly
established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing
purposes.
Abbreviations
Define abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on
the first page of the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract
must be defined at their first mention there, as well as in the footnote. Ensure
consistency of abbreviations throughout the article.
All abbreviations, chemical names, and journal names should follow the style of
Chemical Abstracts Service Source Index. Use generic names of chemicals wherever
possible. Proprietary names and trademarks should appear only to identify the
source of the chemical and subsequently only the generic name should be used. All
abbreviations should be unpunctuated. A useful writing guide is the "CBE Style
Manual" published by the Council of Biology Editors.
Acknowledgements
Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the
references and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the
title or otherwise. List here those individuals who provided help during the research
(e.g., providing language help, writing assistance or proof reading the article, etc.).
65
Figure captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached
to the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a
description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum
but explain all symbols and abbreviations used.
Tables
Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place
footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript
lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that
the data presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the
article.
References
Citation in text
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference
list (and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full.
Unpublished results and personal communications are not recommended in the
reference list, but may be mentioned in the text. If these references are included in
the reference list they should follow the standard reference style of the journal and
should include a substitution of the publication date with either 'Unpublished results'
or 'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that the item
has been accepted for publication.
Web references
66
As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was
last accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference
to a source publication, etc.), should also be given. Web references can be listed
separately (e.g., after the reference list) under a different heading if desired, or can
be included in the reference list.
References in a special issue
Please ensure that the words 'this issue' are added to any references in the list (and
any citations in the text) to other articles in the same Special Issue.
Reference management software
This journal has standard templates available in key reference management
packages EndNote ( http://www.endnote.com/support/enstyles.asp) and Reference
Manager ( http://refman.com/support/rmstyles.asp). Using plug-ins to
wordprocessing packages, authors only need to select the appropriate journal
template when preparing their article and the list of references and citations to these
will be formatted according to the journal style which is described below.
Reference style
Text: All citations in the text should refer to:
1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity) and
the year of publication;
2. Two authors: both authors' names and the year of publication;
3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of
publication.
Citations may be made directly (or parenthetically). Groups of references should be
67
listed first alphabetically, then chronologically.
Examples: 'as demonstrated (Allan, 2000a, 2000b, 1999; Allan and Jones, 1999).
Kramer et al. (2010) have recently shown ....'
List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted
chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s) in the
same year must be identified by the letters 'a', 'b', 'c', etc., placed after the year of
publication.
Examples:
Reference to a journal publication:
Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2010. The art of writing a scientific
article. J. Sci. Commun. 163, 51–59.
Reference to a book:
Strunk Jr., W., White, E.B., 2000. The Elements of Style, fourth ed. Longman, New
York.
Reference to a chapter in an edited book:
Mettam, G.R., Adams, L.B., 2009. How to prepare an electronic version of your
article, in: Jones, B.S., Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the Electronic Age. E-
Publishing Inc., New York, pp. 281–304.
Journal abbreviations source
Journal names should be abbreviated according to
Index Medicus journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html;
List of title word abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-online.php;
CAS (Chemical Abstracts Service): http://www.cas.org/sent.html.
68
Submission checklist
The following list will be useful during the final checking of an article prior to sending
it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for further details of
any item.
Ensure that the following items are present:
One author has been designated as the corresponding author with contact details:
• E-mail address
• Full postal address
• Telephone and fax numbers
All necessary files have been uploaded, and contain:
• Keywords
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes)
Further considerations
• Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked'
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources
(including the Web)
• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the
Web (free of charge) and in print, or to be reproduced in color on the Web (free of
charge) and in black-and-white in print
• If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are also
supplied for printing purposes