UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS ... · Com o objetivo de investigar a atividade...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

PATRÍCIA GEORGINA GARCIA DO NASCIMENTO

OBTENÇÃO DE DERIVADOS DO ÁCIDO LITOCÓLICO E SUAS ATIVIDADES

ANTIMICROBIANAS

FORTALEZA

2012

PATRÍCIA GEORGINA GARCIA DO NASCIMENTO

OBTENÇÃO DE DERIVADOS DO ÁCIDO LITOCÓLICO E SUAS ATIVIDADES

ANTIMICROBIANAS

Dissertação submetida à Coordenação do

Programa de Pós-Graduação em Química, da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para a obtenção do Título de Mestre em

Química.

Área de Concentração: Química Orgânica

Orientadora: Profª. Dra. Telma Leda Gomes de

Lemos

Co-Orientadora: Prof. Dra. Gilvandete Maria

Pinheiro Santiago

FORTALEZA

2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências e Tecnologia

N197o Nascimento, Patrícia Georgina Garcia do.

Obtenção de derivados do ácido litocólico e suas atividades antimicrobianas / Patrícia Georgina

Garcia do Nascimento. – 2012. 116 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Mestrado (Dissertação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciência, Departamento de

Química Orgânica e Inorgânica, Mestrado em Química, Fortaleza, 2012.

Área de Concentração: Química Orgânica.

Orientação: Profa. Dra. Telma Leda Gomes de Lemos.

Coorientação: Profa. Dra. Gilvandete Maria Pinheiro Santiago.

1. Ácido litocólico. 2.Derivados. 3. Anti-infecciosos. I. Título.

CDD 547

RESUMO

Esse trabalho descreve a obtenção de oito derivados do ácido litocólico, bem como, suas

atividades antimicrobianas. O interesse pela utilização do ácido litocólico como material de

partida na preparação de derivados surgiu pelo fato do mesmo sendo bastante estudado com o

objetivo de descobrir novas atividades biológicas e tais estudos terem apresentado bons

resultados. Nesse trabalho, o ácido litocólico foi submetido a modificações moleculares nas

posições C-3 e/ou C-24 do esqueleto esteroidal. A série foi preparada utilizando química

convencional e apresentando bons rendimentos. Com o objetivo de investigar a atividade

antimicrobiana dos compostos, foram realizados testes com as bactérias Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa, tento alguns deles

apresentado resultados bastante significativos. O ácido litocólico e seus derivados foram

caracterizados por métodos espectroscópicos de IV, RMN 1H, RMN

13C-BB e RMN

13C-

DEPT e por espectrometria de massa, bem como comparação com dados descritos na

literatura.

Palavras-chave: ácidos biliares, ácido litocólico, derivados, atividade antimicrobiana.

ABSTRACT

This paper describes obtaining eight lithocholic acid derivatives, as well as inhibitory activity.

Interest in the use of lithocholic acid as starting material for the preparation of derivatives

arose because of it being widely studied in order to discover new biological activities and

such studies have shown good results. In this work it was used for the synthesis of a series of

derivatives with modifications at the C-3 and/or C-24 of the steroid skeleton. The series was

prepared using simple chemical and showed good yields. Aiming to investigate the

antibacterial activity of the same and its derivatives, aiming to structure-activity relationships,

tests were performed with bacteria Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus

and Pseudomonas aeruginosa, try some of them presented significant results. And lithocholic

acid derivatives were characterized by spectroscopic IR, 1H NMR,

13C-BB NMR and

13C-

DEPT NMR and mass spectrometry as well as comparison with data in the literature and

described constitute the body of the dissertation.

Keywords: bile acids, lithocholic acid, derivatives, antimicrobial activity.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 01 - Núcleo básico dos esteróides ....................................................................... 17

Figura 02 - Vitamina D .................................................................................................. 17

Figura 03 - Testosterona ................................................................................................ 17

Figura 04 - Aldosterona ................................................................................................. 17

Figura 05 - Telocinobufagina ......................................................................................... 17

Figura 06 - Diosgenina ................................................................................................... 17

Figura 07 - Solasodina ................................................................................................... 18

Figura 08 - Colesterol .................................................................................................... 18

Figura 09 - Ácido Quenocólico ...................................................................................... 18

Figura 10 - Ácido Cólico ............................................................................................... 18

Figura 11 - Ácido Litocólico .......................................................................................... 18

Figura 12 - Ácido Desoxicólico ..................................................................................... 18

Figura 13 - Ácido Ursodesoxicólico .............................................................................. 19

Figura 14 - Estrutura do ácido litocólico ....................................................................... 29

Figura 15 - Esquema reacional de obtenção dos derivados do ácido litocólico .......... 32

Figura 16 - Estrutura do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila ................................. 34

Figura 17 - Estrutura do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila .................................... 35

Figura 18 - Estrutura do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de isopropila ........................... 36

Figura 19 - Estrutura do ácido 3α-acetoxi-5β-colano-24-óico ...................................... 37

Figura 20 - Estrutura do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de metila ................................. 38

Figura 21 - Estrutura do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de etila .................................... 39

Figura 22 - Estrutura do ácido 3-oxo-5β-colano-24-óico ............................................ 41

Figura 23 - Estrutura do ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico .................................. 42

Figura 24 - Reação de esterificação de AL .................................................................... 53

Figura 25 - Reação de acetilação de AL, AL(a) e AL(b) ............................................... 56

Figura 26 - Reação de oxidação de AL .......................................................................... 59

Figura 27 - Reação de formilação de AL ....................................................................... 60

Figura 28 - Espectro na região do IV de AL (KBr) ....................................................... 72

Figura 29 - Espectro de massa (EM-ESI(-)) de AL ....................................................... 72

Figura 30 - Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) de AL ...................................... 73

Figura 31 - Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) de AL ................. 73

Figura 32 - Espectro de RMN 13

C - BB (125 MHz, CD3OD) de AL ............................ 74

Figura 33 - Expansão do espectro de RMN 13

C - BB (125 MHz, CD3OD) de AL ....... 74


C - DEPT 135o (CD3OD) de AL ................................. 75

Figura 35 - Espectro na região do IV de AL(a) (KBr) ................................................... 76

Figura 36 - Espectro de massa (EM-APCI(+)) de AL(a) ............................................... 76

Figura 37 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a) .................................... 77

Figura 38 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a) ............... 77


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a) .......................... 78


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a) ..... 78


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(a) .............................. 79

Figura 42 - Espectro na região do IV de AL(b) (KBr) ................................................... 81

Figura 43 - Espectro de massa (EM-APCI(+)) de AL(b)................................................ 81

Figura 44 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b) ................................... 82

Figura 45 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b) ............... 82


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b) .......................... 83

Figura 47- Expansão do espectro de RMN 13

C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b) ...... 83


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(b) .............................. 84

Figura 49 - Espectro na região do IV de AL(c) (KBr) ................................................... 86

Figura 50 - Espectro de massa (EM-APCI(+)) de AL(c)................................................ 86

Figura 51 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(c) .................................... 87

Figura 52 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(c) ............... 87


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(c) .......................... 88


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(c) ..... 88


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(c) .............................. 89

Figura 56 - Espectro na região do IV de AL-04 (KBr) .................................................. 91

Figura 57 - Espectro de massa (EM-ESI(-)) de AL-04 .................................................. 91

Figura 58 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL-04 ................................... 92

Figura 59 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL-04 .............. 92


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL-04 ......................... 93


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL-04 ............................. 93

Figura 62 - Espectro na região do IV de AL(a)-04 (KBr) ............................................. 95

Figura 63 - Espectro de massa (EM-ESI(+)) de AL(a)-04.............................................. 95

Figura 64 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a)-04............................... 96

Figura 65 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a)-04.......... 96


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a)-04........................ 97


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a)-04... 97


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(a)-04.......................... 98

Figura 69 - Espectro na região do IV de AL(b)-04 (KBr) ............................................. 100

Figura 70 - Espectro de massa (EM-ESI(+)) de AL(b)-04............................................. 100

Figura 71 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b)-04............................... 101

Figura 72 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b)-04.......... 101


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b)-04....................... 102


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b)-04.. 102


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(b)-04.......................... 103






C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL-05 ......................... 107


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL-05 .... 107


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL-05 ............................. 108






C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL-06 ......................... 112


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL-06 .... 112


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL-06 ............................. 113


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL-06 ........ 113

Figura 91 - Estrutura do ácido litocólico e seus derivados .......................................... 115

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Derivados do ácido litocólico e seus registros na literatura ........................ 25

Tabela 02 - Padrão de hidrogenação dos carbono determinados através da análise

comparativa entre os espectros de RMN 13

C-BB e DEPT 135° de AL ..........................

30

Tabela 03 - Dados de RMN 1H e

13C de AL(a) - CDCl3 ................................................ 80


13C de AL(b) - CDCl3 ............................................... 85


13C de AL(c) - CDCl3 ................................................ 90


13C de AL-04 - CDCl3 ............................................... 94


13C de AL(a)-04 - CDCl3 .......................................... 99


13C de AL(b)-04 - CDCl3 .......................................... 104


13C de AL-05 - CDCl3 ............................................... 109


13C de AL-06 - CDCl3 ............................................... 114

Tabela 11 - Dados de RMN 13

C do ácido litocólico e seus derivados ......................... 116

Tabela 12 - Concentração inibitória mínima (CIM) das substâncias ............................. 43

Tabela 13 - Atividade moduladora por contato direto do AL ........................................ 44

Tabela 14 - Atividade moduladora por contato direto do AL(a) .................................... 45

Tabela 15 - Atividade moduladora por contato direto do AL(b) ................................... 45

Tabela 16 - Atividade moduladora por contato direto do AL(c) .................................... 46

Tabela 17 - Atividade moduladora por contato direto do AL(a)-04 .............................. 46

Tabela 18 - Atividade moduladora por contato direto do AL(b)-04............................... 47

Tabela 19 - Atividade moduladora por contato direto do AL-05 ................................... 47

Tabela 20 - Atividade moduladora por contato direto do AL-06 ................................... 48

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Ac2O Anidrido Acético

AcOEt Acetato de Etila

AMI Amicacina

APCI Ionização Química à Pressão Atmosférica

BHI Brain Heart Infusion

C Carbono

CC Coluna Cromatográfica

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CD3OD Metanol deuterado

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CENAUREM Centro Nordestino de Aplicação e Uso da ressonância Magnética Nuclear

CH2Cl2 Diclorometano

CIM Concentração Inibitória Mínima

d Dubleto

DEPT Distortionless Enhancement by Polazation Transfer

DMAP Dimetilamina piridina

DMSO Dimetil sulfóxido

EMAR Espectrometria de massa de alta resolução

EM-APCI(+) Espectrometria de Massas com Ionização Química à Pressão Atmosférica

em modo positivo

EM-IES Espectrometria de Massas com Ionização por Electrospray

EM-IES(-) Espectrometria de massas com ionização por electrospray em modo

negativo

EM-IES(+) Espectrometria de massas com ionização por electrospray em modo

positivo

ESI Ionização por Electrospray

EtOH Etanol

GEN Gentamicina

H2SO4 Ácido Sulfúrico

HCO2H Ácido Fórmico

Hex Hexano

Hz Hertz

IV Infravermelho

KBr Brometo de Potássio

LEMANOR Laboratório de Espectrometria de Massa do Nordeste

m Multipleto

m/z Relação Massa/Carga

MeOH Metanol

MHz MegaHertz

Na2CO3 Carbonato de Sódio

Na2SO4 Sulfato de Sódio

NEO Neomicina

p.f Ponto de fusão

PCC Clorocromato de Piridínio

Pi Piridina

PPM Partes por milhão

q Quarteto

RMN 13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

s Singleto

t Tripleto

UFC Universidade Federal do Ceará

UFC Unidade formadora de colônias

URCA Universidade Regional do Cariri

UV Ultravioleta

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

°C Grau Celsius

µg Microgramas

µL Microlitros

cm Centímetro

Da Daltons

g Gramas

h Hora

J Constante de Acoplamento

L Litros

MG Miligrama

min Minutos

mL Mililitro

mmol Milimol

nm Nanômetro

Ɵ Ângulo de nutação

α Rotação Óptica

δ Deslocamento Químico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 17

2 OBJETIVOS ............................................................................................ 22

2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 22

2.2 Objetivos Específicos ................................................................................ 22

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 24

3.1 Ácidos Biliares .......................................................................................... 24

3.2 Transformações químicas do ácido litocólico ........................................... 25

3.3 Atividade Antimicrobiana ......................................................................... 26

3.4 Resistência Microbiana ............................................................................. 27

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 29

4.1 Identificação Estrutural do ácido litocólico (AL) .................................. 29

4.2 Transformações químicas do ácido litocólico ........................................... 31

4.2.1 Obtenção dos derivados esterificados ....................................................... 33

4.2.1.1 Síntese do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila (AL(a)) ..................... 33

4.2.1.2 Síntese do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila (AL(b)) ........................ 34

4.2.1.3 Síntese do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de isopropila (AL(c)) .............. 35

4.2.2 Obtenção dos derivados acetilados ........................................................... 36

4.2.2.1 Síntese do ácido 3α-acetoxi-5β-colano-24-óico (AL-04) .......................... 36

4.2.2.2 Síntese do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de metila (AL(a)-04) ............... 37

4.2.2.3 Síntese do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de etila (AL(b)-04) .................. 38

4.2.3 Obtenção do derivado oxidado ................................................................. 40

4.2.3.1 Síntese do ácido 3-oxo-5β-colano-24-óico (AL-05) .................................. 40

4.2.4 Obtenção do derivado formilado .............................................................. 41

4.2.4.1 Síntese do ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico (AL-06) ....................... 41

4.3 Avaliação Antimicrobiana ......................................................................... 42

4.3.1 Atividade Antimicrobiana e Concentração Inibitória Mínima ................. 43

4.3.2 Avaliação da atividade moduladora por contato direto ........................... 44

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ................................................ 50

5.1 Materiais Utilizados .................................................................................. 50

5.2 Métodos Cromatográficos ......................................................................... 50

5.2.1 Colunas Cromatográficas (CC) ................................................................ 50

5.2.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ............................................ 50

5.3 Métodos Espectrométricos e Espectroscópicos ......................................... 51

5.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .................... 51

5.3.2 Espectrometria de Massas (EM) ............................................................... 52

5.3.3 Espectroscopia na Região de Absorção do Infravermelho ....................... 52

5.4 Métodos Físicos ......................................................................................... 52

5.4.1 Ponto de Fusão .......................................................................................... 52

5.4.2 Rotação Óptica [α]D .................................................................................. 52

5.5 Obtenção dos derivados do Ácido Litocólico ........................................... 53

5.5.1 Preparação de AL(a), AL(b) e AL(c) ........................................................ 53

5.5.2 Preparação de AL-04, AL(a)-04 e AL(b)-04 ............................................. 56

5.5.3 Preparação de AL-05 ................................................................................ 59

5.5.4 Preparação de AL-06 ................................................................................ 60

5.6 Atividade Antimicrobiana ......................................................................... 61

5.6.1 Avaliação Antimicrobiana ......................................................................... 61

5.6.1.1 Atividade antimicrobiana e Concentração Inibitória Mínima .................. 61

5.6.1.2 Avaliação da atividade moduladora por contato direto ........................... 62

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................. 64

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 66

ANEXOS .................................................................................................. 72

INTRODUÇÃO

Capítulo 1 - Introdução 17

__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

1 INTRODUÇÃO

Os esteroides representam uma classe de compostos que contêm uma estrutura

básica de 17 átomos de carbono dispostos em quatro anéis condensados com um grupo metila

entre os anéis AB e outro entre os anéis CD (Fig. 01). Eles incluem uma vasta gama de

substâncias químicas com importante papel na fisiologia humana, dentre os quais estão a

vitamina D (Fig. 02), os hormônios sexuais, dentre os quais se destaca a testosterona (Fig.

03), os hormônios adrenocorticais, tais como a aldosterona (Fig. 04), os cardioativos (Fig. 05),

as sapogeninas (Fig. 06), alguns alcalóides (Fig. 07, p. 18), os esteróis, tais como o colesterol

(Fig. 08, p. 18) e os ácidos biliares (Fig. 09, 10, 11 e 12, p. 18) (KLYNE, 1957). Alguns

esteroides como, por exemplo, os anti-inflamatórios esteroidais, são produzidos através da

síntese orgânica com a finalidade médico-terapêutica.

Figura 01 - Núcleo básico dos esteróides.

A B

C D1

2

3

45

6

7

89

10

11

12

13

14 15

16

17

18

19

Figura 02 - Vitamina D Figura 03 - Testosterona Figura 04 - Aldosterona

OH

O

HH

H

O

HO

O

HH

O

H

OH

HO

H

Figura 05 - Telocinobufagina Figura 06 - Diosgenina

O

HO

H

HH

H

HO

OH

OHHO

H

H

OH

O

O

H

http://pt.wikipedia.org/wiki/Esterol

http://pt.wikipedia.org/wiki/Colesterol


__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 07 - Solasodina Figura 08 - Colesterol

HH

HO

H

HO

HO

HHH

H

HN

H

Os ácidos biliares, principais componentes do suco biliar, fazem parte do grupo

dos esteroides e apresentam um substituinte com cinco átomos de carbono no carbono 17

(QIAO et al., 2012). São sintetizados no fígado e são considerados produtos do catabolismo

do colesterol (EL KIHEL et al., 2008). Possuem a função fisiológica de ajudar na digestão de

lipídios e a reabsorção de vitaminas lipofílicas (VALKONEN et al., 2008).

O ácido quenocólico (Fig. 09) e o ácido cólico (Fig. 10) são classificados como

ácidos biliares primários do suco biliar humano, sendo secretados para o intestino auxiliando

a absorção de nutrientes lipossolúveis. No intestino, os ácidos biliares primários são

convertidos em ácidos biliares secundários, tais como ácido litocólico (Fig. 11) e ácido

desoxicólico (Fig. 12), que são reabsorvidos pelo intestino e retornam de volta para o fígado

(SUN et al., 2008).

Figura 09 - Ácido Quenocólico Figura 10 - Ácido Cólico

OH

O

OH

H

HHO

H

H

OH

O

OH

H

HHO

H

H

OH

Figura 11 - Ácido Litocólico Figura 12 - Ácido Desoxicólico

OH

O

H

HHO

H

H

OH

OH

O

H

HHO

H

H


__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Diversas atividades farmacológicas são relatadas para os ácidos biliares. Pode-se

mencionar a utilização do ácido ursodesoxicólico (Fig. 13) para a prevenção de distúrbios

gastrointestinais em pacientes com vários tipos de câncer. Outra forma de utilização consiste

no acoplamento de ácidos biliares com moléculas já utilizadas no tratamento convencional do

câncer através de ligações covalentes. Por esta razão, vários derivados de ácidos biliares

sintéticos têm sido desenvolvidos (EL KIHEL et al., 2008).

Figura 13 - Ácido Ursodesoxicólico

OH

O

OH

H

HHO

H

H

O ácido litocólico (Fig. 11, p. 18), um dos principais ácidos biliares excretados

pelos mamíferos, é produzido a partir da desidroxilação no carbono 7 do anel B do esqueleto

esteroidal do ácido quenocólico (Fig. 09, p. 18), por bactérias no cólon (EL KIHEL et al.,

2008). Apresenta como todos os ácidos biliares, um núcleo tetracíclico rígido e uma cadeia

lateral flexível no carbono 17, além de uma hidroxila no carbono 3 (BHATTARAI et al.,

1997).

Vários artigos têm relatado a síntese de derivados do ácido litocólico

(MIZUSHINA et al., 2004; VALKONEN et al., 2008; BELLINI et al., 1991) com o objetivo

de descobrir novas moléculas biologicamente ativas. Tais estudos têm apresentado bons

resultados, citando-se como exemplos o efeito antiproliferativo e pró-apoptótica em linhas

celulares de cancro humano (EL KIHEL et al., 2008) e a utilização destes como inibidores de

proteassoma (DANG et al., 2011).

Nos últimos tempos, a resistência frente aos antimicrobianos consiste em um sério

problema de saúde. Isso acontece pelo uso indiscriminado de tais quimioterápicos,

dificultando o controle de espécie de bactérias de interesse médico-sanitário (BACCARO et

al., 2002).

Bactérias patogênicas como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermes,

Salmonella sp., Salmonella enteritidis sorotipo Typhi e Salmonella enteritidis sorotipo

Typhimurium, já apresentam cepas resistentes aos antibióticos convencionais, tornando a sua

presença em alimentos e estabelecimentos comerciais uma ameaça potencial à saúde


__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

(BACCARO et al., 2002; GAYOSO et al., 2007; RAPINI et al., 2004; MANTILLA et al.,

2008; RIBEIRO et al., 2006).

Desta forma, este trabalho teve como objetivo a obtenção de derivados do ácido

litocólico e a avaliação da atividade antimicrobiana do ácido litocólico e de seus derivados.

OBJETIVOS

Capítulo 2 - Objetivos 22

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Utilizar o ácido litocólico, um esteróide biliar, como material de partida na obtenção de

derivados e posterior avaliação de suas atividades antimicrobianas.

2.2 Objetivos Específicos

Obter derivados do ácido litocólico através de transformações químicas na posição C-3 e

C-24 do esqueleto esteroidal;

Caracterizar os produtos obtidos por métodos espectroscópicos usuais, tais como IV,

RMN 1H, RMN

13C, EM;

Avaliar a atividade antimicrobiana do ácido litocólico e de seus derivados.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Capítulo 3 - Revisão Bibliográfica 24

__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Ácidos Biliares

Os ácidos biliares apresentam 24 átomos de carbono em suas estruturas, com um,

dois ou três grupos hidroxila e uma cadeia lateral com um grupo carboxílico terminal. São

compostos anfipáticos. Assim, esses compostos possuem uma parte polar e outra apolar e

podem atuar como agentes emulsificadores no intestino, ajudando na preparação dos

triacilgliceróis, e de outros compostos lipídicos da dieta, para a degradação pelas enzimas

digestivas pancreáticas (QIAO et al., 2012; EL KIHEL et al., 2008; VALKONEN et al.,

2008).

São compostos potencialmente citotóxicos, derivados dos esteroides, sintetizados

pelos hepatócitos e segregados nos canalículos biliares. Constituem componentes orgânicos

mais abundantes do suco biliar e são produzidos no fígado, a partir do colesterol através de

várias reações catalisadas por enzimas. Durante a colestase, os ácidos biliares acumulam-se

no fígado e na circulação sistêmica, atingindo concentrações tóxicas. Este acúmulo é capaz de

causar necrose, apoptose e fibrose do hepatócito, contribuindo para a patogênese das doenças

colestáticas e para o desenvolvimento de insuficiência e de cirrose hepática (PIRES;

COLAÇO, 2004). São excretados no suco biliar após conjugação com glicina e taurina, sendo

subsequentemente reabsorvidos no intestino. Os ácidos biliares que escapam da reabsorção

são convertidos em ácidos biliares secundários pela microflora intestinal (ADACHI et al.,

2005).

Os principais ácidos biliares sintetizados no fígado dos mamíferos são derivados

hidroxilados de um núcleo comum, o ácido 5β-colanoíco. Os ácidos biliares primários são o

ácido cólico (3α,7α,12α-trihidroxi-5β-colanoíco) e o ácido quenodesoxicólico (3α,7α-

dihidroxi-5β-colanoíco). No cólon, os ácidos biliares primários podem ser metabolizados pela

flora bacteriana em ácidos biliares secundários. Uma alteração comum é a 7α-desidroxilação

do ácido quenodesoxicólico e do cólico que resultam na formação de ácido litocólico (3α-

monohidroxi-5β-colanoíco) e desoxicólico (3α,12α-dihidroxi-5β-colanoíco), respectivamente.

Os ácidos biliares terciários, o ursodesoxicólico e o sulfolitocólico são produzidos no intestino

ou no fígado a partir dos secundários (PIRES; COLAÇO, 2004).

Nos humanos, os ácidos biliares mais abundantes são o ácido cólico (35%) e

quenodesoxicólico (35%), com menor quantidade de ácido desoxicólico (24%) e traços de

litocólico e ursodesoxicólico (PIRES; COLAÇO, 2004).


__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

A função fisiológica dos ácidos biliares é ajudar na digestão e absorção de lipídios

e vitaminas lipofílicas. A elevada especificidade e capacidade do sistema de transporte de

ácido biliar constituem a base do esforço da pesquisa para a elaboração de drogas conjugadas

com ácidos biliares para tecido ou órgão específico. Os ácidos biliares e seus derivados

possuem várias aplicações, agindo como opiáceos não-analgésicos, antivirais, antifúngicos e

como agentes sensibilizadores de bactérias Gram-negativas para os antibióticos e

radiofármacos (VALKONEN et al., 2008).

3.2 Transformações químicas do ácido litocólico

Alguns derivados sintéticos do ácido litocólico encontram-se descritos na

literatura, os quais tiveram suas atividades biológicas avaliadas em modelos variados,

indicando a potencialidade dessas substâncias como fonte de novas moléculas bioativas. A

Tabela 01 mostra a obtenção de derivados do ácido litocólico a partir do ano 2000.

Tabela 01 - Derivados do ácido litocólico e seus registros na literatura.

Derivados Referência

O

HH

HO

H

H

O

DANG et al., 2011

MIZUSHINA et al., 2004

NAHAR; TURNER, 2003

SHAIKH et al., 2006

O

HH

HO

H

H

O

DANG et al., 2011

SHAIKH et al., 2006

SHAIKH; MALDAR; LONIKAR, 2003

OH

HH

O

H

H

OO

ADACHI et al., 2005

BÜLBÜL et al., 2002

EL KIHEL et al., 2008

FELFÖLDI et al., 2005

HORIE et al., 2008

ISHIZAWA et al., 2008

MANSELL et al., 2009

NAHAR; TURNER, 2004

SHAIKH; MALDAR; LONIKAR, 2003


__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

O

HH

O

H

H

OO


MANSELL et al., 2009

MIZUSHINA et al., 2004

O

HH

O

H

H

OO

NAHAR; TURNER, 2004

OH

HH

H

H

O

O

DEO; BANDIERA, 2009

NAHAR; TURNER, 2003

NAHAR; TURNER, 2004

OH

HH

O

H

H

O

H

O

BABU; MAITRA, 2005

CHATTOPADHYAY; PANDEY, 2006


3.3 Atividade Antimicrobiana

Desde a antiguidade, o homem utiliza as plantas para tratar doenças infecciosas e,

até hoje, algumas delas são incluídas como parte do tratamento de várias enfermidades

(RIOS; RÉCIO, 2005).

Os produtos naturais vegetais são considerados pela população uma alternativa

para aliviar e, até mesmo, curar processos infecciosos e constituem uma importante fonte de

novos compostos biologicamente ativos (BASTOS, 2007).

O desenvolvimento de agentes antimicrobianos foi um dos grandes sucessos da

medicina no século XX. Desde a descoberta, por acaso, da penicilina por Alexander Fleming

em 1928, um arsenal de agentes antimicrobianos tem sido desenvolvido. O avanço da

indústria farmacêutica levou ao surgimento de diversos antimicrobianos, com espectro de

ação cada vez mais amplo. Apesar da disponibilização de novos antimicrobianos, o ritmo de

desenvolvimento de resistência microbiana aos diferentes patógenos, Gram-positivos e Gram-

negativos, representa um constante desafio terapêutico e, dessa forma, a seleção de

antibióticos eficazes tem se tornado uma tarefa difícil e desafiadora (ROSSI; ANDREAZZI,

2005).


__________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

3.4 Resistência Microbiana

A partir de 1950, quando os antimicrobianos passaram a ser amplamente

utilizados, iniciou-se o fenômeno de resistência microbiana. Desde então, o problema de

resistência aos antimicrobianos passou a representar uma preocupação considerável em saúde

pública (RAPINI et al., 2004).

A resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético relacionado à

existência de genes contidos no microorganismo que codificam diferentes mecanismos

bioquímicos que impedem a ação dos fármacos. Uma bactéria é considerada resistente a um

determinado antibiótico quando é capaz de crescer, in vitro, na presença da concentração

inibitória mínima que esse fármaco atinge no sangue (TAVARES, 1996). A resistência a

fármacos é um dos casos mais bem documentados de evolução biológica e um sério problema

tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento (DUARTE, 2006).

Essa rápida evolução da resistência aos antimicrobianos e a alarmante

desaceleração no desenvolvimento de novos fármacos, despertam atenção para a busca por

substâncias antimicrobianas derivadas de plantas (KEITH; BORISY; STOCKWEL, 2005),

como também para a associação de antimicrobianos sintéticos com produtos naturais,

incluindo óleos essenciais e extratos vegetais, na tentativa de ampliar seu espectro de ação e

minimizar os efeitos indesejáveis (SALVAT et al., 2001; SHIN; PYUN, 2004; SOUSA et al.,

2010).

Os produtos naturais têm sido fontes valiosas para o desenvolvimento desses

novos compostos, permitindo a descoberta de agentes terapêuticos não somente para tratar

doenças infecciosas, mas também para tratar o câncer, imunodeficiência e outras (CLARDY;

WALSH, 2004). Extratos e óleos essenciais de plantas mostraram-se eficientes no controle do

crescimento de uma ampla variedade de microrganismos, incluindo fungos filamentosos,

leveduras e bactérias (SANTOS et al., 2011).

Diante da crescente resistência aos antimicrobianos, torna-se necessário o estudo

de novos produtos com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a

esses microorganismos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Capítulo 4 - Resultados e Discussão 29

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Identificação Estrutural do ácido litocólico (AL)

O ácido litocólico (Fig. 14) é um sólido branco amorfo, solúvel em MeOH, com

ponto de fusão na faixa de 168 - 170 °C e rotação óptica [α]D20

= +36,2 (c 0,01, MeOH). A

análise do referido composto através de CCD apresentou uma mancha de coloração azulada

após revelação com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol. Este foi denominado de

AL.

O espectro de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 28, anexo

A, p. 72) de AL, apresentou uma banda larga em 3277 cm-1

, característica de deformação

axial de ligação O-H de álcool e uma banda em 2560 cm-1

, característica de deformação axial

de ligação O-H de ácido carboxílico; duas bandas intensas em 2926 e 2861 cm-1

, relativas às

deformações axiais de ligação Csp3-H de alifático; uma absorção intensa e centrada em 1701

cm-1

, associada à presença de deformação axial de ligação C=O de ácido carboxílico; uma

banda fina em 1213 cm-1

de deformação axial de ligação Csp3-O de ácido carboxílico e outra

banda em 1070 cm-1

de deformação axial de ligação Csp3-O de álcool. Também foram

observadas absorções das deformações angulares de CH2 e CH3 em 1448 e 1367 cm-1

,

respectivamente.

O espectro de massa de alta resolução de AL, obtido através da ionização por

eletrospray (ESI) (Fig. 29, anexo A, p. 72) no modo negativo, forneceu o pico correspondente

ao íon molecular em m/z 375,2937 [M-H]-, correspondente à molécula desprotonada,

condizente com a fórmula molecular C24H40O3.

Figura 14 - Estrutura do ácido litocólico

OH

HH

HO

H

H

O

No espectro de RMN 1H [500 MHz, CD3OD] (Fig. 30, anexo A, p. 73) de AL

observou-se sinais múltiplos na região δH 0,70 - 2,04, atribuídos a átomos de hidrogênio


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ligados a carbonos sp3

metílicos, metilênicos e metínicos característicos dos esqueletos

esteroídicos. Os sinais simples em δH 0,70 e 0,97 foram atribuídos aos hidrogênios dos dois

grupos metila ligados a átomos de carbono não hidrogenados, enquanto o dubleto em δH 0,96

(d, J = 5,3 Hz, 3H), foi atribuído aos hidrogênios do grupo metila ligado ao átomo de carbono

metínico; um sinal em δH 3,54 - 3,56 (m, 1H, H-3), foi atribuído ao hidrogênio ligado ao

carbono oxigenado C-3 e dois multipletos em δH 2,19 - 2,24 (m, 1H, H-23) e δH 2,31 - 2,34

(m, 1H, H-23) foram atribuídos a hidrogênios diastereotópicos ligados ao carbono 23.

O espectro de RMN 13

C-BB [125 MHz, CD3OD] (Fig. 32, anexo A, p. 74) de AL

apresentou sinais correspondentes a 24 átomos de carbono. Uma comparação do espectro de

RMN 13

C totalmente desacoplado, com o espectro de RMN 13

C-DEPT 135° [125 MHz,

CD3OD] (Fig. 34, anexo A, p. 75), permitiu identificar a presença de três carbonos metílicos

em δC 24,11, 18,93 e 12,66, onze carbonos metilênicos e sete carbonos metínicos. Os três

sinais restantes foram identificados como carbonos não hidrogenados, sendo um característico

de carbono carbonílico (δC 178,3) (Tabela 02). Verificou-se que o carbono em δC 72,58

tratava-se de um carbono metínico sp3 oxigenado (carbono carbinólico), o que confirmou a

estrutura do ácido litocólico.

Tabela 02 - Padrão de hidrogenação dos carbonos determinados através da análise

comparativa entre os espectros de RMN 13

C-BB e DEPT 135° de AL.

C CH CH2 CH3 Fórmula molecular

178,3 (C=O) 72,58 (C-O) 41,69 24,11

44,07 58,07 37,33 18,93

35,84 57,63 36,66 12,66

43,70 32,47

42,04 32,17

37,40 31,35

36,85 29,37

28,52

27,82

25,42

22,11

3 C 7 CH 11 CH2 3 CH3 C24H40O3


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

4.2 Transformações químicas do ácido litocólico

Foram obtidos oito derivados de AL, com o objetivo da avaliação de suas

atividades antimicrobianas, bem como a obtenção de dados espectroscópicos de RMN 1H e

13C como fonte de consulta. A partir da observação da estrutura do ácido litocólico, as reações

foram programadas para modificações envolvendo o carbono oxigenado C-3 e/ou o carbono

da carboxila C-24. Dentre as reações programadas, optou-se pela esterificação, acetilação,

oxidação e formilação (Fig. 15, p. 32).

Todos os derivados sintetizados tiveram como material de partida o ácido

litocólico e, portanto, os dados espectroscópicos obtidos para esses produtos se assemelham

bastante àqueles do precursor (Item 4.1). Dessa forma, visando simplificar a apresentação dos

dados espectroscópicos de cada produto obtido, as análises dos espectros foram focadas nas

características que possibilitaram definir inequivocamente as transformações químicas

observadas e as diferenças em relação aos materiais de partida.


____________________________________________________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 15 - Esquema reacional de obtenção dos derivados do ácido litocólico

OH

O

H

HHO

H

H

CH3OHH2SO4

CH3CH2OHH2SO4

OHH2SO4

O

O

HO

O

HO

O

H

PCC

(CH3CO)2Opi/DMAP

HCOOHHClO4

HO

O

HO

HOH

O

(CH3CO)2Opi/DMAP

(CH3CO)2O

pi/DMAP

O

O

H

HO

H

HO

O

O

H

HO

H

HO


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

4.2.1 Obtenção dos derivados esterificados

O tratamento de AL com alcoóis na presença de H2SO4, conforme descrição no

item 5.5.1, conduziu à formação dos derivados esterificados AL(a) (Fig. 16, p. 34), AL(b)

(Fig. 17, p. 35) e AL(c) (Fig. 18, p. 36). As reações foram realizadas de acordo com a

metodologia descrita por Narasimhan et al. (2003), nas quais o H2SO4 promove a protonação

da carbonila do ácido litocólico e o metanol atua como nucleófilo na reação de substituição.

4.2.1.1 Síntese do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila (AL(a))

O composto se apresentou como sólido branco amorfo (961,1 mg, 92,29% de

rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 110 - 112 °C (lit. p.f. = 115 -

117 °C) (NAHAR; TURNER, 2003) e rotação óptica [α]D20

= +25,5 (c 0,01, CHCl3). O

referido composto, que através de análise em CCD mostrou uma mancha de coloração

azulada após revelação com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi denominado

de AL(a) e identificado através de técnicas espectroscópicas.

No espectro na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 35, anexo B, p. 76) de

AL(a) (Fig. 16, p. 34), observou o aparecimento da banda de absorção em 1712 cm-1

,

característica de deformação axial de C=O de éster. O espectro de RMN de 1H [300 MHz,

CDCl3] (Fig. 37, anexo B, p. 77) de AL(a) apresentou como principal diferença em relação ao

do ácido litocólico, a presença do singleto intenso em δH 3,66 (s, 3H, OCH3), atribuído aos

hidrogênios do grupo metoxila. No espectro de RMN 13

C-BB [75 MHz, CDCl3] (Fig. 39,

anexo B, p. 78), a presença dos sinais em δC 51,63 e em δC 174,95, atribuídos respectivamente

aos carbonos dos grupos metoxila e carbonila, confirmaram a formação do derivado

esterificado, e estão de acordo com os dados relatados na literatura (ARANDA; FETIZON;

TAYEB, 1987).

O espectro de massa de alta resolução de AL(a) obtido através da ionização

química a pressão atmosférica (APCI) (Fig. 36, anexo B, p. 76) no modo positivo, forneceu o

pico correspondente ao íon molecular em m/z 373,3112 [M-H2O]+, condizente com a fórmula

molecular C25H42O3.

A análise dos dados de RMN 1H e RMN

13C dispostos na Tabela 03 (anexo B, p.

80) e em comparação com dados espectrais descritos na literatura (ARANDA; FETIZON;

TAYEB, 1987), permitiram identificar o produto esterificado denominado de AL(a), como

3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila (Fig. 16, p. 34).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 16 - Estrutura do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila

O

HH

HO

H

H

O

4.2.1.2 Síntese do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila (AL(b))

O composto se apresentou como sólido branco amorfo (873,3 mg, 81,06% de

rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 81 - 83 °C (lit. p.f. = 90 - 91

°C) (DANG, 2011) e rotação óptica [α]D20

= +25,7 (c 0,01, CHCl3). O referido composto

através de análise em CCD mostrou uma mancha de coloração azulada após revelação com

solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi denominado de AL(b) e identificado

através de técnicas espectroscópicas.

A identificação de AL(b) (Fig. 17, p. 35) como produto da reação foi confirmada

pelo aparecimento das bandas de deformação axial de C=O em 1732 cm-1

e Csp3-O entre 1239

e 1171 cm-1

observado no espectro de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig.

42, anexo C, p. 81), a banda de deformação axial de OH livre em 3302 cm-1

sugeriu a

presença da hidroxila em C-3. O espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 44, anexo

C, p. 82) obtido para AL(b) apresentou como principal diferença em relação ao ácido

litocólico a presença de um quarteto referente aos hidrogênios ligados ao carbono metilênico

em δH 4,07 (q, 2H, J = 7,1 Hz) e um tripleto intenso em δH 1,22 (t, 3H, J = 7,1 Hz) referente

aos três hidrogênios ligados ao carbono metílico, do grupo etoxila. No espectro de RMN 13

C-

BB [75 MHz, CDCl3] (Fig. 46, anexo C, p. 83), a presença do sinal em δC 174,54 atribuído ao

carbono carbonílico e dos sinais em δC 14,46 e em δC 60,36 referentes aos carbonos metílico e

metilênico do grupo etoxila, respectivamente, confirmaram a formação do derivado

esterificado.

O espectro de massa de alta resolução de AL(b) obtido através da ionização

química a pressão atmosférica (APCI) (Fig. 43, anexo C, p. 81) no modo positivo, forneceu o


molecular C25H44O3.


13C dispostos na Tabela 04 (anexo C, p.

85) e a comparação com dados espectrais descritos na literatura (ARANDA; FETIZON;


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

TAYEB, 1987), permitiram identificar o produto esterificado denominado de AL(b), como

3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila (Fig. 17).

Figura 17 - Estrutura do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila

O

HH

HO

H

H

O

4.2.1.3 Síntese do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de isopropila (AL(c))

O composto obtido se apresentou como sólido branco amorfo (901,67 mg, 80,78%

de rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 78 - 80 °C e rotação

óptica [α]D20

= +23,8 (c 0,01, CHCl3). O referido composto por análise em CCD mostrou uma

mancha de coloração azulada após revelação com solução de vanilina em ácido perclórico e

etanol, foi denominado de AL(c) e identificado através de técnicas espectroscópicas.

A identificação de AL(c) (Fig. 18, p. 36) como produto da reação foi confirmada

pelo aparecimento das bandas de deformação axial de C=O em 1729 cm-1

e Csp3-O entre 1252

e 1107 cm-1

observado no espectro de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig.

49, anexo D, p. 86). O espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 51, anexo D, p. 87)

obtido para AL(b) apresentou como principal diferença em relação ao ácido litocólico a

presença de um sinal referente ao hidrogênio ligado ao carbono metínico oxigenado em δH

4,95 - 5,03 (m, 1H) e um sinal intenso em δH 1,21 (d, 6H, J = 6,2 Hz) referente aos seis

hidrogênios ligados aos carbonos metílicos, atribuídos aos hidrogênios do grupo isopropila.

No espectro de RMN 13

C-BB [75 MHz, CDCl3] (Fig. 53, anexo D, p. 88), a presença do sinal

em δC 174,04 atribuído ao carbono carbonílico e dos sinais em δC 22,04 referente a dois

carbonos metílicos idênticos e em δC 67,49 referente a um carbono sp3

metínico oxigenado,

atribuídos aos carbonos do grupo isopropila, confirmaram a formação do derivado

esterificado.

O espectro de massa de alta resolução de AL(c) obtido através da ionização

química a pressão atmosférica (APCI) (Fig. 50, anexo D, p. 86) no modo positivo, forneceu o


molecular C27H46O3.


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


13C dispostos na Tabela 05 (anexo D, p.

91), permitiram identificar o produto esterificado denominado de AL(c), como 3α-hidroxi-5β-

colano-24-oato de isopropila (Fig. 18). É válido acrescentar que não existem relatos na

literatura para este derivado.

Figura 18 - Estrutura do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de isopropila

O

HH

HO

H

H

O

4.2.2 Obtenção dos derivados acetilados

O tratamento do AL, AL(a) e AL(b) com (CH3CO)2/DMAP, na presença de

piridina à temperatura ambiente conforme descrito no item 5.5.2, conduziu à formação dos

derivados acetilado AL-04 (Fig. 19, p. 37), AL(a)-04 (Fig. 20, p. 38) e AL(b)-04 (Fig. 21, p.

39). A reação foi realizada segundo metodologia descrita por Bandeira et al. (2007), na qual o

DMAP agiu como ativador da carbonila do anidrido acético e a hidroxila do ácido litocólico

atuou como nucleófilo na reação de substituição.

4.2.2.1 Síntese do ácido 3α-acetoxi-5β-colano-24-óico (AL-04)

O composto se apresentou como um sólido branco amorfo (555,20 mg, 96,22% de

rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 156 - 158 °C (lit. p.f. = 167

°C) (EL KIHEL et al., 2008) e rotação óptica [α]D20

= +41,6 (c 0,01, CHCl3). O referido

composto por análise em CCD mostrou uma mancha de coloração azulada após revelação

com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi denominado de AL-04 e

identificado através de técnicas espectroscópicas.

A estrutura de AL-04 (Fig. 19, p. 37) foi confirmada através da análise do

espectro de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 56, anexo E, p. 91) onde

se observou o desaparecimento da banda de deformação de OH livre em 3277 cm-1

e o

aparecimento da banda de deformação axial de C=O de éster em 1732 cm-1

. No espectro de

RMN de 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 58, anexo E, p. 92) observou-se o deslocamento do sinal


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

em δH 3,54 - 3,56 (m, 1H, H-3), atribuído a H-3 no ácido litocólico, para δH 4,67 - 4,77 (m,

1H, H-3) em AL-04, devido à desproteção induzida pela carbonila e o aparecimento de um

singleto intenso em δH 2,03 (s, 3H, AcO) referente aos hidrogênios ligado ao carbono metílico

do grupo acetato. A formação do produto também foi confirmada a partir dos dados obtidos

do espectro de RMN de 13

C-BB [75 MHz, CDCl3] (Fig. 60, anexo E, p. 93), no qual a

presença dos sinais em δC 170,94 e δC 21,66 foram atribuídos, respectivamente, aos carbonos

carbonílico e metílico do grupo acetato (EL KIHEL et al., 2008).

O espectro de massa de alta resolução de AL-04 obtido através da ionização por

eletrospray (ESI) (Fig. 57, anexo E, p. 91) no modo negativo, forneceu o pico correspondente

ao íon molecular em m/z 417,3051 [M-H]-, correspondente a molécula desprotonada,



13C dispostos na Tabela 06 (anexo E, p.

94) e em comparação com dados espectrais descritos na literatura (EL KIHEL et al., 2008),

permitiram identificar o produto denominado de AL-04, como ácido 3α-acetoxi-5β-colano-

24-óico (Fig. 19).

Figura 19 - Estrutura do ácido 3α-acetoxi-5β-colano-24-óico

OH

OH

HH

O

O

H

4.2.2.2 Síntese do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de metila (AL(a)-04)

O composto se apresentou como um sólido branco cristalino (113 mg, 97,07% de

rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 122,9 - 123,9 °C (lit. p.f. =

132 °C) (OSAWA, 1962) e rotação óptica [α]D20

= +41,3 (c 0,01, CHCl3). O referido

composto por análise em CCD mostrou uma mancha de coloração azulada após revelação

com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi denominado de AL(a)-04 e


A estrutura de AL(a)-04 (Fig. 20, p. 38) foi confirmada através da análise do

espectro de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 62, anexo F, p. 95) onde

se observou o desaparecimento da banda de deformação de OH livre em 3277 cm-1

e o


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

aparecimento das bandas de deformação axial de C=O e Csp3-O de éster em 1730 cm-1

e 1245

cm-1

, respectivamente. No espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 64, anexo F, p.

96) observou-se o deslocamento do sinal em δ 3,58 - 3,63 (m, 1H, H-3), atribuído a H-3 no

3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila AL(a), para δ 4,65 - 4,76 (m, 1H, H-3) em AL(a)-

04, devido à desproteção induzida pela carbonila, e o aparecimento de um singleto intenso em

δ 2,01 (s, 3H, AcO) referente aos hidrogênios metílicos do grupo acetato. A estrutura do

produto também foi confirmada pela presença dos sinais em δ 170,82 e em δ 21,64 no

espectro de RMN de 13

C-BB [75 MHz, CDCl3] (Fig. 66, anexo F, p. 97), que foram atribuídos

aos carbonos carbonílico e metílico do grupo acetato (EL KIHEL et al., 2008).

O espectro de massa de alta resolução de AL(a)-04 obtido através da ionização

por eletrospray (ESI) (Fig. 63, anexo F, p. 95) no modo positivo, forneceu o pico

correspondente ao íon molecular em m/z 455,3144 [M+Na]+, referente ao aduto de sódio,



13C dispostos na Tabela 07 (anexo F, p.

99) e a comparação com dados espectrais descritos na literatura (EL KIHEL et al., 2008),

permitiram identificar o produto denominado de AL(a)-04, como 3α-acetoxi-5β-colano-24-

oato de metila (Fig. 20).

Figura 20 - Estrutura do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de metila

O

OH

HO

H HO

4.2.2.3 Síntese do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de etila (AL(b)-04)

O composto se apresentou como um sólido branco cristalino (107,5 mg, 91,19%

de rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 93,4 - 95,1 °C (lit. p.f. =

95 - 98 °C) (CHANG et al., 1957) e rotação óptica [α]D20

= +37,06 (c 0,00623, CHCl3). O

referido composto que por análise em CCD mostrou uma mancha de coloração azulada após

revelação com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi denominado de AL(b)-04

e identificado através de técnicas espectroscópicas.


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

A estrutura de AL(b)-04 (Fig. 21) foi confirmada através da análise do espectro

de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 69, anexo G, p. 100) onde se

observou o desaparecimento da banda de deformação de OH livre em 3277 cm-1

e o

aparecimento das bandas de deformação axial de C=O e Csp3-O de éster em 1736 cm-1

e 1241

cm-1

, respectivamente. No espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 71, anexo G, p.

101) observou-se o deslocamento do sinal em δH 3,57 - 3,65 (m, 1H, H-3), atribuído a H-3 no

3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila AL(b), para δH 4,66 - 4,77 (m, 1H, H-3) em AL(b)-

04, devido à desproteção induzida pela carbonila e o aparecimento de um singleto intenso em

δH 2,02 (s, 3H, AcO) referente aos hidrogênios metílicos do grupo acetato. A formação do

produto também foi confirmada a partir dos dados obtidos do espectro de RMN de 13

C-BB

[75 MHz, CDCl3] (Fig. 73, anexo G, p. 102), no qual a presença dos sinais em δC 170,81 e δC

21,63 foram atribuídos, respectivamente, aos carbonos carbonílico e metílico do grupo acetato

(EL KIHEL et al., 2008).

O espectro de massa de alta resolução de AL(b)-04 obtido através da ionização

por eletrospray (ESI) (Fig. 70, anexo G, p. 100) no modo positivo, forneceu o pico

correspondente ao íon molecular em m/z 469,3312 [M+Na]+, referente ao aduto de sódio,



13C dispostos na Tabela 08 (anexo G, p.

104) e em comparação com dados espectrais descritos na literatura (EL KIHEL et al., 2008),

permitiram identificar o produto denominado de AL(b)-04, como 3α-acetoxi-5β-colano-24-

oato de etila (Fig. 21).

Figura 21 - Estrutura do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de etila

O

OH

HO

H HO


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

4.2.3 Obtenção do derivado oxidado

A oxidação do ácido litocólico empregando-se PCC como agente oxidante foi

realizada conforme item 5.5.3 e seguiu a metodologia descrita por Albuquerque (2007). A

reação resultou na obtenção do derivado AL-05 (Fig. 22, p. 41).

4.2.3.1 Síntese do ácido 3-oxo-5β-colano-24-óico (AL-05)

O produto da oxidação se apresentou como sólido branco amorfo (149,8 mg, 37%

de rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 121 - 123 °C (lit. p.f. =

122 - 123 °C) (NAHAR; TURNER, 2003) e rotação óptica [α]D20

= +28,1 (c 0,01, CHCl3). O

referido composto que por análise em CCD mostrou uma mancha de coloração azulada após

revelação com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi denominado de AL-05 e


O espectro de absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 76, anexo

H, p. 105) obtido para AL-05 (Fig. 22, p. 41) apresentou bandas de deformação axial de C=O

de cetonas em 1698 cm-1

, e em comparação com o espectro de IV de AL, pôde-se verificar o

desaparecimento de uma banda larga na região de hidroxila em 3277 cm-1

. A análise dos

espectros de RMN 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 78, anexo H, p. 106) e de

13C-BB [75 MHz,

CDCl3] (Fig. 80, anexo H, p. 107) possibilitou a confirmação da oxidação da hidroxila em C-

3, a partir do desaparecimento do sinal referente a H-3 em δH 3,54 - 3,56 (m, 1H, H-3),

presente no espectro do precursor AL e surgimento do sinal em δC 213,88, referente ao

carbono carbonílico de cetona. Os demais sinais apresentam valores de deslocamento químico

semelhantes àqueles relatados por Nahar e Turner (2003) para a mesma substância.


eletrospray (ESI) (Fig. 77, anexo H, p. 105) no modo negativo, forneceu o pico

correspondente ao íon molecular em m/z 373,2793 [M-H]-, referente a molécula desprotonada,



13C dispostos na Tabela 09 (anexo H, p.

109) e em comparação com dados espectrais descritos na literatura (NAHAR; TURNER,

2003), permitiram identificar o produto reacional oxidado denominado de AL-05, como ácido

3-oxo-5β-colano-24-óico (Fig. 22, p 41).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 22 - Estrutura do ácido 3-oxo-5β-colano-24-óico

OH

OH

HH

OH

4.2.4 Obtenção do derivado formilado

A reação de formilação foi realizada usando como reagente uma mistura de

HCO2H/HClO4, conforme descrito no item 5.5.4 e seguindo a metodologia descrita por

Lemos e Mcchesney (1990). A reação resultou na obtenção do derivado AL-06 (Fig. 23, p.

42).

4.2.4.1 Síntese do ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico (AL-06)

O composto obtido se apresentou como sólido branco amorfo (227 mg, 92,28%

de rendimento), solúvel em CHCl3, com ponto de fusão na faixa de 128 - 130 °C (lit. p.f. =

127 - 128°C) (CHATTOPADHYAY; PANDEY, 2006) e rotação óptica [α]D20

= +38,5 (c

0,01, CHCl3). O referido composto que através de análise em CCD mostrou uma mancha de

coloração azulada após revelação com solução de vanilina em ácido perclórico e etanol, foi

denominado de AL-06 e identificado através de técnicas espectroscópicas.

A estrutura de AL-06 (Fig. 23, p. 42) foi confirmada pela análise do espectro de

absorção na região do infravermelho (IV) em KBr (Fig. 83, anexo I, p. 110) onde se observou

o desaparecimento da banda de deformação de OH livre em 3277 cm-1

e o aparecimento das

bandas de deformação axial de C=O em 1718 cm-1

e Csp3-O entre 1250 e 1180 cm-1

. No

espectro de RMN de 1H [300 MHz, CDCl3] (Fig. 85, anexo I, p. 101) observou-se o

deslocamento do sinal em δH 3,57 - 3,65 (m, 1H, H-3), atribuído a H-3 no ácido litocólico,

para δH 4,81 - 4,86 (m, 1H, H-3) em AL-06, devido à desproteção induzida pela carbonila, e

o aparecimento de um singleto intenso em δH 8,03 (s, 1H, HC=O) referente ao hidrogênio

ligado ao carbono do grupo formiato. A formação do produto também foi confirmada a partir

dos dados obtidos do espectro de RMN de 13

C-BB [75 MHz, CDCl3] (Fig. 87, anexo I, p.

112), no qual a presença do sinal em δC 161,05 foi atribuído ao carbono carbonílico do grupo

formiato (BABU; MAITRA, 2005).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


eletrospray (ESI) (Fig. 84, anexo I, p. 110) no modo negativo, forneceu o pico correspondente

ao íon molecular em m/z 403,2885 [M-H]-, referente a molécula desprotonada, condizente

com a fórmula molecular C25H40O4.


13C dispostos na Tabela 10 (anexo I, p.

114) e em comparação com dados espectrais descritos na literatura (BABU; MAITRA, 2005),

permitiram identificar o produto reacional formilado denominado de AL-06, como ácido 3α-

formiloxi-5β-colano-24-óico (Fig. 23).

A partir dos dados de RMN 13

C do ácido litocólico e de seus derivados, construiu-

se uma tabela (Tabela 11, anexo J, p. 116) para efeito de comparação e registro desses dados

na literatura. As respectivas estruturas encontram-se na Figura 91, anexo I, p. 115.

Figura 23 - Estrutura do ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico

OH

OH

HH

OH

O

H

4.3 Avaliação Antimicrobiana

Após a síntese e caracterização dos derivados do ácido litocólico, os mesmos

foram submetidos à avaliação microbiológica. Os testes foram realizados no Departamento de

Química Biológica da Universidade Regional do Cariri (URCA) - Ceará, no Laboratório de

Pesquisas de Produtos Naturais, sob a supervisão do Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa.

Os derivados foram avaliados quanto à sua capacidade antibacteriana e efeito

modulador com antibióticos aminoglicosídicos frente a bactérias patogênicas Gram (+),

linhagens padrão S. aureus ATCC 12692, B. cereus ATCC 33018 e multirresistente S. aureus

(Sa358), e Gram (-), E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa. ATCC 15442 e multirresistente E.

coli (Ec 27).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

4.3.1 Atividade antimicrobiana e Concentração Inibitória Mínima

Os resultados mostrados na Tabela 12 representam a concentração inibitória

mínima (CIM), do ácido litocólico e seus derivados, definida como a menor concentração das

substâncias capaz de inibir o crescimento de bactérias, como indicado pela coloração da

resazurina.

Tabela 12 - Concentração inibitória mínima (CIM) das substâncias.

Bactérias utilizadas

CIM S. aureus S. aureus E. coli E. coli B. cereus P.

aeruginosa

μg/mL (ATCC

12692) (Sa 358) (ATCC 25922) (Ec 27) (ATCC 33018)

(ATCC

15442)

AL 512 512 512 512 512 512

AL(a) 512 ≥1024 512 256 256 512

AL(b) 512 ≥1024 256 256 512 512

AL(c) 512 ≥1024 256 512 ≥1024 ≥1024

AL-04 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024

AL(a)-04 512 ≥1024 512 512 512 512

AL(b)-04 128 ≥1024 256 256 512 512

AL-05 256 512 512 256 512 256

AL-06 16 256 128 32 32 64

CIM: Concentração Inibitória Mínima

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 12, verificou-se que a

substância AL-06 (ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico) (Fig. 23, p. 42) mostrou os

melhores resultados, apresentando atividade inibitória para todas as linhagens com uma CIM

≤ 256 µg/mL. Para E. coli (Ec 27) e B. cereus observou-se uma CIM de 32 µg/mL, e para S.

aureus (ATCC 12692) representando o resultado mais significativo, uma CIM de 16 µg/mL.

AL-06 mostrou potencial para uso como desinfetante e conservante de alimentos

(microrganismos deteriorantes) e contra bactérias patogênicas (DEVILIEGHERE;

VERMEIREN; DEBEVERE, 2004), já que B. cereus é causador de gastrenterites de origem

alimentar (FANCO; LANDGRAF, 2011) e produtora de toxinas (ACHESON, 2000)

encontradas facilmente como contaminante em alimentos crus e processados, vegetais, entre

outros (GHELARDI et al., 2002). Por outro lado, S. aureus é responsável por um dos tipos

mais freqüentes de intoxicação alimentar, comumente veiculada pelo leite e derivados

(SANTOS; GENIGEORGIS, 1981). A substância AL(a) (3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

metila) (Fig. 16, p. 34) mostrou-se eficaz contra as linhagens Gram-positivas e Gram-

negativas testadas, apresentando atividade inibitória para as cepas de E. coli multirresistente e

B. cereus e AL-05 (ácido 3-oxo-5β-colano-24-óico) (Fig. 22, p. 41) apresentou atividade

inibitória para cepas multirresistente E. coli, P. aeruginosa e S. aureus (ATCC 12692).

Observou-se que a substância AL-04 (ácido 3α-acetoxi-5β-colano-24-óico) (Fig.

19, p. 37) não foi capaz de inibir o crescimento de nenhuma linhagem, considerando a CIM ≥

1024 µg/mL.

4.3.2 Avaliação da atividade moduladora por contato direto

Somente as amostras que apresentaram CIM menor ou igual a 512 µg/mL foram

submetidas aos ensaios de modulação com antibióticos aminoglicosídicos. A Tabela 13

mostra os resultados da atividade moduladora do AL por contato direto.

Tabela 13 - Atividade moduladora do AL por contato direto.

AMI: Amicacina; GEN: Gentamicina; NEO: Neomicina

Na análise dos resultados da Tabela 13, observou-se que AL (ácido litocólico)

(Fig. 14, p. 29) potencializou a atividade de todos os antibióticos testados frente à linhagem E.

coli (ATCC 25922), comparado com a CIM do antibiótico na ausência da substância. Já na

interação com a linhagem S. aureus (ATCC 12692), AL não demonstrou uma ação sinérgica

sobre a atividade da gentamicina e neomicina e para a amicacina houve uma redução da CIM

de 50% (Tabela 04).

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

S. aureus

(ATCC 12692) 64 64 64 32 50% 64 0,0 64 0,0

E. coli

(ATCC 25922) 32 64 512 8 75% 32 50% 128 75%


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Tabela 14 - Atividade moduladora do AL(a) por contato direto.


Na análise dos resultados apresentados na Tabela 14, observou-se que AL(a) (3α-

hidroxi-5β-colano-24-oato de metila) (Fig. 16, p. 34) potencializou a atividade dos

antibióticos quando testado frente à linhagem E. coli (Ec 27), redução de 50 - 75% na CIM

quando comparado com o do antibiótico na ausência da substância. Por outro lado, na

interação com a linhagem B. cereus (ATCC 33018) AL(a) demonstrou uma ação antagônica

sobre a atividade da amicacina e neomicina (Tabela 14).

Tabela 15 - Atividade moduladora do AL(b) por contato direto.


Na análise dos resultados obtidos (Tabela 15), observou-se que AL(b) (3α-

hidroxi-5β-colano-24-oato de etila) (Fig. 17, p. 35) potencializou a atividade dos antibióticos

amicacina e neomicina frente à linhagem E. coli (Ec 27) com redução da CIM de 50% para

ambas. Já na interação com a linhagem E. coli (ATCC 25922) AL(b) demonstrou uma ação

antagônica sobre a atividade da amicacina, aumentando o valor da CIM de 16 para 32 µg/mL,

e para neomicina houve uma potencialização, reduzindo o valor da CIM de 512 para 256

µg/mL (Tabela 15).

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL(a)

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

E. coli

(Ec 27) 32 128 32 16 50% 64 50% 8 75%

B. cereus

(ATCC 33018) 16 64 16 32 - 64 0,0 32 -

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL(b)

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

E. coli

(ATCC 25922) 16 64 512 32 - 64 0,0 256 50%

E. coli

(Ec 27) 128 64 128 64 50% 64 0,0 64 50%


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Tabela 16 - Atividade moduladora do AL(c) por contato direto.


A Tabela 16 apresenta os resultados obtidos para AL(c) (3α-hidroxi-5β-colano-

24-oato de isopropila) (Fig. 18, p. 36). Observou-se que o mesmo potencializou a atividade

dos antibióticos amicacina e neomicina quando testado frente à linhagem S. aureus (ATCC

12692) quando comparado com a CIM do antibiótico na ausência da substância. Já na

interação com a linhagem E. coli (ATCC 25922) AL(c) demonstrou uma ação antagônica

sobre a atividade da amicacina, sendo que o valor da CIM aumentou de 16 para 32 µg/mL,

entretanto para a gentamicina houve uma potencialização, reduzindo o valor da CIM de 64

para 32 µg/mL (Tabela 16).

Tabela 17 - Atividade moduladora do AL(a)-04 por contato direto.


A partir dos resultados da Tabela 17, observou-se que AL(a)-04 (3α-acetoxi-5β-

colano-24-oato de metila) (Fig. 20, p. 38) potencializou a atividade dos antibióticos amicacina

e neomicina quando testado frente à linhagem S. aureus (ATCC 12692), quando comparado

com a CIM do antibiótico na ausência da substância. Já na interação com a linhagem E. coli

(ATCC 25922) AL(a)-04 demonstrou uma ação antagônica sobre a atividade da gentamicina,

sendo que o valor da CIM aumentou de 32 para 64 µg/mL. Entretanto para a neomicina houve

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL(c)

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

S. aureus

(ATCC 12692) 128 64 256 64 50% 64 0,0 64 75%

E. coli

(ATCC 25922) 16 64 256 32 - 32 50% 256 0,0

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL(a)-04

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

S. aureus

(ATCC 12692) 128 64 256 64 50% 64 0,0 128 50%

E. coli

(ATCC 25922) 32 32 256 32 0,0 64 - 128 50%


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

uma potencialização, reduzindo o valor da CIM de 256 para 128 µg/mL (50%) (Tabela 17, p.

46).

Tabela 18 - Atividade moduladora do AL(b)-04 por contato direto.


Analisando os resultados da Tabela 18, observou-se que o AL(b)-04 (3α-acetoxi-

5β-colano-24-oato de etila) (Fig. 21, p. 39) potencializou apenas a atividade do antibiótico

neomicina, para ambas as linhagens S. aureus (ATCC 12692) e E. coli (ATCC 25922), sendo

os valor da CIM de 128 para 64 µg/mL, e de 256 para 128 µg/mL respectivamente, ou seja

em 50% (Tabela 18).

Tabela 19 - Atividade moduladora do AL-05 por contato direto.


Na análise dos resultados exibidos na Tabela 19, observou-se que o AL-05 (ácido

3-oxo-5β-colano-24-óico) (Fig. 22, p. 41) potencializou a atividade dos antibióticos amicacina

e neomicina quando testado frente à linhagem S. aureus (ATCC 12692) quando comparado

com o CIM do antibiótico na ausência da substância, sendo que para a neomicina o valor foi

bastante significativo com redução da CIM de 256 para 8 µg/mL (97%). Na interação com a

linhagem P. aeruginosa (ATCC 15442), AL-05 demonstrou uma ação sinérgica sobre a

atividade da amicacina, com redução da CIM de 64 para 16 µg/mL, já para a neomicina houve

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL(b)-04

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

S. aureus

(ATCC 12692) 64 64 128 64 0,0 64 0,0 64 50%

E. coli

(ATCC 25922) 16 64 256 16 0,0 64 0,0 128 50%

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL-05

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

S. aureus

(ATCC 12692) 32 64 256 16 50% 64 0,0 8 97%

P. aeruginosa

(ATCC 15442) 64 64 8 16 75% 64 0,0 32 -


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

um aumento do valor da CIM de 8 para 32 µg/mL representando um efeito antagônico

(Tabela 19, p. 47).

Tabela 20 - Atividade moduladora do AL-06 por contato direto.


Na análise dos resultados demonstrados na Tabela 20, observou-se que AL-06

(ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico) (Fig. 23, p. 42) potencializou a atividade dos

antibióticos quando testado frente à linhagem P. aeruginosa (ATCC 15442), com resultados

bastante significativos, quando comparado com a CIM do antibiótico na ausência da

substância, podendo destacar a neomicina com redução da CIM de 8 para 0,5 µg/mL (94%) e

a amicacina com redução da CIM de 16 para 4 µg/mL (75%). Já na interação com a linhagem

S. aureus (ATCC 12692) AL-06 não demonstrou ação sinérgica sobre a atividade dos

aminoglicosídicos (Tabela 20).

BACTÉRIAS

MIC µg/mL

Antibiótico Antibiótico + AL-06

AMI GEN NEO AMI (%)

inibição GEN

(%)

inibição NEO

(%)

inibição

S. aureus

(ATCC 12692) 32 64 8 32 0,0 64 0,0 8 0,0

P. aeruginosa

(ATCC 15442) 16 64 8 4 75% 32 50% 0,5 94%

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Capítulo 5 - Procedimento Experimental 50

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

5 PROCEDIMENTO EXPERIEMENTAL

5.1 Materiais Utilizados

O ácido litocólico, utilizado como material de partida nas reações foi de

procedência SIGMA®. Os alcoóis utilizados nas reações de esterificação foram de grau

CLAE/Spectro de procedência TEDIA®. Anidrido acético, ácido fórmico, ácido perclórico e

ácido sulfúrico foram de procedência VETEC®

. DMAP e PCC utilizados são de procedência

ALDRICH®

. Piridina, diclorometano e acetona foram de qualidade P.A. e procedência

SYNTH®, bem como os solventes utilizados nos tratamentos das reações e colunas

cromatográficas. Carbonato de sódio (Na2CO3), sulfato cúprico (CuSO4.5H2O) e sulfato de

sódio anidro (Na2SO4) foram de procedência VETEC®.

5.2 Métodos Cromatográficos

5.2.1 Colunas Cromatográficas (CC)

Na execução das análises cromatográficas de adsorção em coluna utilizou-se gel

de sílica 60 comum (0,063-0,200 mm; 70-230 mesh) da marca VETEC®. As dimensões das

colunas cromatográficas (comprimento e diâmetro) variaram de acordo com as quantidades de

amostras e solventes utilizados.

Na eluição foram utilizados solventes de qualidade P.A. (SYNTH®), tais como

hexano (Hex), diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH), puros ou

em misturas binárias, em ordem crescente de gradiente de polaridade.

5.2.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

As análises cromatográficas em camada delgada (CCD) foram efetuadas em gel

de sílica G60 da VETEC® sobre suporte de vidro e em gel de sílica 60 F254 (2-25 µm, camada

de 250 µm) sobre poliéster T-6145 da Merck®.

As placas foram cortadas nas dimensões apropriadas para cada análise. As

amostras foram aplicadas com o auxílio de um tubo capilar à uma altura de aproximadamente

0,9 cm, com uma distância de aproximadamente 0,3 cm de uma amostra para outra; em

seguida foram eluídas em cuba com uso de eluente apropriado.


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

As revelações das substâncias nas cromatoplacas analíticas foram realizadas por

imersão em solução de vanilina (C8H8O3; C = 5g/100mL) em ácido perclórico (HClO4)

0,75M/100mL de etanol, seguido de aquecimento em soprador térmico HL-500, da Steinel à

aproximadamente 150° C, durante alguns segundos.

Na eluição foram utilizados os solventes de qualidade P.A. (SYNTH®): hexano

(Hex), diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH), puros ou em

misturas binárias, em ordem crescente de gradiente de polaridade.

A remoção dos solventes das frações resultantes das cromatografias foi realizada

em evaporador rotatório BÜCHI “Waterbath” Modelo B-480 e R-114, sob pressão reduzida.

5.3 Métodos Espectrométricos e Espectroscópicos

Os espectros apresentados neste trabalho foram obtidos em aparelhos pertencentes

ao Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, em

Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear

(CENAUREM/UFC).

5.3.1 Espectroscopia de Ressonância magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e de

carbono 13 (RMN 13

C) unidimensionais e bidimensionais foram obtidos em espectrômetro

Bruker modelo Avance DRX-300 e Avance DRX-500, operando na freqüência de hidrogênio

a 300 MHz e 500 MHz, e na freqüência de carbono a 75 MHz e a 125 MHz, respectivamente.

As amostras foram dissolvidas nos solventes deuterados clorofórmio (CDCl3) e

metanol (CD3OD) para a obtenção dos espectros. Os deslocamentos químicos (δ) foram

expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados para RMN 1H pelo pico do hidrogênio

pertencente à fração não deuterada do solvente de clorofórmio (δ 7,27) e de metanol (δ 3,31).

Para o RMN 13

C, o padrão foi o pico central do tripleto em δ 77,23 para o clorofórmio e do

septeto em δ 49,1 para o metanol deuterado.

As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN ¹H foram

indicadas segundo a convenção: s (singleto), t (tripleto), d (dubleto), q (quarteto) e m

(multipleto).

O padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN 13

C foi determinado através da

utilização da técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ângulo de nutação (Ɵ) de 135°, com CH e CH3 com amplitude em oposição aos CH2, sendo

descrito conforme a convenção: C (carbono não hidrogenado), CH (carbonos metínicos), CH2

(carbono metilênicos) e CH3 (carbonos metílicos). Os carbonos não hidrogenados foram

caracterizados pela comparação dos espectros de RMN 13

C DEPT 135° e RMN ¹³C BB (Broad

Band).

5.3.2 Espectrometria de Massa (EM)

Os espectros de massa de alta resolução foram obtidos através da ionização por

eletrospray (ESI) ou ionização química a pressão atmosférica (APCI) em espectrômetro de

massa modelo LCMS-IT-TOF (225-07100-34) SHIMADZU, pertencente ao Laboratório de

Espectrometria de Massa do Nordeste (LEMANOR-DQOI-UFC).

5.3.3 Espectroscopia na Região de Absorção do Infravermelho (IV)

Os espectros de absorção na região do infravermelho (IV) foram obtidos em

espectrômetro Perckin Elmer, modelo FT-IR SPECTRUM 100, utilizando-se pastilhas de

brometo de potássio (KBr) como suporte para as substâncias a serem analisadas.

5.4 Métodos Físicos

5.4.1 Ponto de Fusão (pf)

Os pontos de fusão foram determinados em equipamento de microdeterminação

digital da Mettler Toledo provido de uma estação de aquecimento FP82HT, uma central de

processamento FP90 e acoplada a um microscópio óptico monocular. As determinações foram

realizadas a uma velocidade de aquecimento de 2°C/min e não foram corrigidas.

5.4.2 Rotação Óptica [α]D

As rotações ópticas foram determinadas em polarímetro digital Perkin Elmer

modelo 341. As medidas foram feitas em um comprimento de onda de 589 nm e a

temperatura de 20°C, utilizando uma cubeta de 1 mL.


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

5.5 Obtenção dos derivados do ácido litocólico

5.5.1 Preparação de AL(a), AL(b) e AL(c)

Figura 24 - Reação de esterificação de AL

i, ii e iii

H2SO4

i: MeOH - AL(a); R: CH3

ii: EtOH - AL(b); R: CH2CH3

iii: Isopropanol - AL(c); R: CH(CH3)2

HO

OH

H

H

HH

O

HO

O

H

H

HH

O

R

AL (1,0 g, 2,7 mmol) foi inicialmente dissolvido em uma mistura de 150 mL dos

diferentes alcoóis (metanol, etanol ou isopropanol) e 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. As

diferentes soluções foram submetidas a refluxo sob agitação magnética durante 24 horas

(Figura 24). Após esse período o solvente foi evaporado, seguido da adição de água (100 mL)

e extração com diclorometano (3 x 30 mL). As fases orgânicas foram lavadas com solução de

carbonato de sódio 20% (3 x 60 mL) e secadas com sulfato de sódio anidro. Após filtração, o

solvente foi removido em rotaevaporador sob pressão reduzida. Os produtos brutos obtidos

foram submetidos à cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando como eluente hexano

: Acetato de etila (8 : 2), fornecendo sólidos amorfos brancos, que foram denominados AL(a)

(961,1 mg, 92,29%), AL(b) (873,3 mg, 81,06%) e AL(c) (901,67 mg, 80,78%). Os compostos

foram identificados através da análise de seus dados espectroscópicos (IV, EM, RMN 1H e

RMN 13

C) e por comparação com dados espectrais descritos na literatura (ARANDA;

FETIZON; TAYEB, 1987).

Dados Físicos do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de metila (AL(a))

Sólido branco amorfo

Fórmula molecular: C25H42O3

Massa molar [M-H2O]+: 373,3112 g/mol


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Espectroscopia de absorção na região do IV (KBr, cm-1

) - 3517,88; 2932,44; 2861,26;

1711,68; 1443,71; 1384,09; 1238,88.

Rotação Óptica: [α]D20

= +25,5 (c 0,01; CHCl3)

Espectroscopia de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) - δ (Integração, Multiplicidade e

Constante de Acoplamento): 3,58 - 3,63 (m, 1H, H-3β); 2,18 - 2,26 (m, 1H, H-23); 2,30 -

2,40 (m, 1H, H-23); 3,65 (s, 3H, OCH3); 0,63 (s, 3H, H-18); 0,91 (s, 3H, H-19); 0,89 (d, J =

5,37, 3H, H-21).

Espectroscopia de RMN 13

C (125 MHz, CDCl3) - δ (Correlação estrutural): 34,79 (C-10);

42,96 (C-13); 174,95 (C-24); 72,08 (CH-3); 42,34 (CH-5); 36,08 (CH-8), 40,68 (CH-9); 56,72

(CH-14); 56,20 (CH-17); 35,58 (CH-20); - (CH2-1); 30,78 (CH2-2); 36,70 (CH2-4); 27,41

(CH2-6); 26,63 (CH2-7); 21,04 (CH2-11); 40,40 (CH2-12); 24,41 (CH2-15); 28,38 (CH2-16);

31,29 (CH2-22); 31,23 (CH2-23); 12,24 (CH3-18); 23,57 (CH3-19); 18,47 (CH3-21); 51,63

(OCH3).

Dados Físicos do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de etila (AL(b))





) - 3302,34; 2925,27; 2863,58;

1732,51; 1446,59; 1366,10; 1239,28.


= +25,7 (c 0,01; CHCl3)



2,38 (m, 1H, H-23); 4,07 (q, J = 7,11 Hz, 2H, OCH2); 1,22 (t, J = 7,11 Hz, 3H, CH3); 0,63 (s,

3H, H-18); 0,91 (s, 3H, H-19); 0,89 (d, J = 4,56 Hz, 3H, H-21).



42,95 (C-13); 174,54 (C-24); 72,03 (CH-3); 42,33 (CH-5); 36,07 (CH-8), 40,67 (CH-9); 56,72


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

(CH-14); 56,20 (CH-17); 35,55 (CH-20); 35,58 (CH2-1); 30,75 (CH2-2); 36,66 (CH2-4); 27,41

(CH2-6); 26,63 (CH2-7); 21,04 (CH2-11); 40,39 (CH2-12); 24,41 (CH2-15); 28,37 (CH2-16);

31,54 (CH2-22); 31,21 (CH2-23); 60,36 (OCH2); 12,24 (CH3-18); 23,58 (CH3-19); 18,48

(CH3-21); 14,45 (CH3).

Dados Físicos do 3α-hidroxi-5β-colano-24-oato de isopropila (AL(c))





) - 3300,38; 2927,53; 2864,51;

1729,43; 1447,09; 1373,22; 1252,04.


= +23,8 (c 0,01; CHCl3)



2,33 (m, 1H, H-23); 4,94 - 5,03 (m, 1H, OCH); 1,21 (d, J = 6,24 Hz, 6H, 2CH3); 0,63 (s, 3H,

H-18); 0,91 (s, 3H, H-19); 0,89 (d, J = 4,98 Hz, 3H, H-21).



42,92 (C-13); 174,04 (C-24); 72,01 (CH-3); 42,30 (CH-5); 36,04 (CH-8), 40,63 (CH-9); 56,69

(CH-14); 56,19 (CH-17); 35,50 (CH-20); 67,49 (OCH); 35,55 (CH2-1); 30,71 (CH2-2); 36,63

(CH2-4); 27,39 (CH2-6); 26,61 (CH2-7); 21,01 (CH2-11); 40,37 (CH2-12); 24,38 (CH2-15);

28,36 (CH2-16); 31,85 (CH2-22); 31,21 (CH2-23); 12,21 (CH3-18); 23,56 (CH3-19); 18,45

(CH3-21); 22,04 (2CH3).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

5.5.2 Preparação de AL-04, AL(a)-04 e AL(b)-04

Figura 25 - Reação de acetilação de AL, AL(a) e AL(b)

Ac2O

AL-04; R: HAL(a)-04; R: CH3

AL(b)-04; R: CH2CH3

HO

O

H

H

HH

O

R

O

O

H

H

HH

O

R

Opi/DMAP

AL (500 mg, 1,33 mmol), AL(a) (105,1 mg, 0,27 mmol) e AL(b) (106,8 mg, 0,26

mmol) foram dissolvidos em uma mistura de anidrido acético (4 mL) e piridina (2 mL) e em

seguida, adicionou-se alguns cristais de DMAP, conforme esquema reacional apresentado na

Figura 25. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 24 horas. Decorrido esse período,

a mistura reacional foi tratada com solução saturada de sulfato de cobre e em seguida extraída

com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com água destilada (3 x 20 mL) e seca com

Na2SO4 anidro e concentrada em rotaevaporador sobre pressão reduzida. Os produtos brutos

foram submetidos à cromatografia em coluna de gel de sílica eluída com hexano : acetato de

etila (8 : 2). Os sólidos brancos cristalinos obtidos foram denominados AL-04 (555,20 mg,

96,22%), AL(a)-04 (113 mg, 97,07%) e AL(b)-04 (107,5 mg, 91,19%) e caracterizados por

técnicas espectroscópicas (IV, EM, RMN 1H e RMN

13C) e os dados espectroscópicos

obtidos estão de acordo com os descritos na literatura (EL KIHEL et al., 2008).

Dados Físicos do Ácido 3α-acetoxi-5β-colano-24-óico (AL-04)



Massa molar [M-H]-: 417,3051 g/mol


) - 2923,77; 2868,89; 1731,89;

1707,58; 1449,68; 1375,68; 1244,23.


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


= +41,6 (c 0,01; CHCl3)



2,45 (m, 1H, H-23); 2,03 (s, 3H, AcO); 0,65 (s, 3H, H-18); 0,93 (s, 3H, H-19); 0,91 (d, J =

4,26 Hz, 3H, H-21).



42,97 (C-13); 180,32 (C-24); 170,94 (C=O); 74,66 (CH-3); 42,12 (CH-5); 36,02 (CH-8),

40,65 (CH-9); 56,71 (CH-14); 56,22 (CH-17); 35,52 (CH-20); 30,99 (CH2-1); 26,54 (CH2-2);

35,26 (CH2-4); 27,24 (CH2-6); 26,85 (CH2-7); 21,05 (CH2-11); 40,37 (CH2-12); 24,39 (CH2-

15); 28,37 (CH2-16); 31,22 (CH2-22); 32,47 (CH2-23); 12,26 (CH3-18); 23,54 (CH3-19);

18,46 (CH3-21); 21,66 (AcO).

Dados Físicos do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de metila (AL(a)-04)

Sólido branco cristalino


Massa molar [M+Na]+: 455,3144 g/mol


) - 2929,04; 2865,97; 1730,02;

1435,76; 1376,56; 1244,88.


= +41,3 (c 0,01; CHCl3)



2,39 (m, 1H, H-23); 2,01 (s, 3H, AcO); 3,65 (s, 3H, OCH3); 0,63 (s, 3H, H-18); 0,91 (s, 3H,

H-19); 0,89 (d, J = 6,00 Hz, 3H, H-21).



42,94 (C-13); 174,92 (C-24); 170,82 (C=O); 74,59 (CH-3); 42,10 (CH-5); 36,00 (CH-8),

40,62 (CH-9); 56,70 (CH-14); 56,21 (CH-17); 35,56 (CH-20); 31,21 (CH2-1); 26,52 (CH2-2);

35,24 (CH2-4); 27,22 (CH2-6); 26,83 (CH2-7); 21,03 (CH2-11); 40,35 (CH2-12); 24,38 (CH2-


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

15); 28,37 (CH2-16); 31,25 (CH2-22); 32,45 (CH2-23); 12,23 (CH3-18); 23,52 (CH3-19);

18,46 (CH3-21); 21,64 (AcO); 51,64 (OCH3).

Dados Físicos do 3α-acetoxi-5β-colano-24-oato de etila (AL(b)-04)

Sólido branco cristalino


Massa molar [M+Na]+: 469,3312 g/mol


) - 2930,73; 2865,39; 1735,95;

1449,44; 1376,72; 1241,52.


= +37,06 (c 0,00623; CHCl3)



2,38 (m, 1H, H-23); 4,08 (q, J = 6,00 Hz, 2H, OCH2); 1,22 (t, J = 6,00 Hz, 3H, CH3); 2,02 (s,

3H, AcO); 0,64 (s, 3H, H-18); 0,92 (s, 3H, H-19); 0,90 (d, J = 6,00 Hz, 3H, H-21).



42,93 (C-13); 174,49 (C-24); 170,81 (C=O); 74,59 (CH-3); 42,10 (CH-5); 36,00 (CH-8),

40,61 (CH-9); 56,69 (CH-14); 56,22 (CH-17); 35,53 (CH-20); 31,20 (CH2-1); 26,51 (CH2-2);

35,23 (CH2-4); 27,22 (CH2-6); 26,82 (CH2-7); 21,03 (CH2-11); 40,34 (CH2-12); 24,37 (CH2-

15); 28,36 (CH2-16); 31,52 (CH2-22); 32,45 (CH2-23); 60,34 (OCH2); 12,22 (CH3-18); 23,51

(CH3-19); 18,46 (CH3-21); 14,44 (CH3); 21,63 (AcO).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

5.5.3 Preparação de AL-05

Figura 26 - Reação de oxidação de AL

PCC

AL-05; R: H

HO

O

H

H

HH

O

R

O

O

H

H

HH

O

R

Em um balão de fundo redondo, clorocromato de piridínio (PCC) (600 mg, 2,78

mmol) foi adicionado às soluções de AL (406 mg, 1,08 mmol) em acetona (6,0 mL) e

diclorometano (4,0 mL). Após 24 horas sob agitação à temperatura ambiente, a mistura

reacional foi concentrada em rotaevaporador sob pressão reduzida. O produto bruto foi

purificado por coluna de gel de sílica eluída com hexano : acetato de etila (1 : 1), fornecendo

o derivado oxidado, denominado AL-05 (149,8 mg, 37%), que se apresentou como sólido

branco amorfo. O mesmo foi caracterizado por técnicas espectroscópicas (IV, EM, RMN 1H e

RMN 13

C) e os dados espectroscópicos obtidos estão de acordo com os descritos na literatura

(NAHAR; TURNER, 2003).

Dados Físicos do Ácido 3-oxo-5β-colano-24-óico (AL-05)





) - 2926,10; 2879,55; 1698,57;

1447,39; 1376,90.

Rotação Óptica: +28,1 (c 0,01; CHCl3)


Constante de Acoplamento): 2,21 - 2,30 (m, 1H, H-23); 2,32 - 2,44 (m, 1H, H-23); 0,67 (s,

3H, H-18); 1,00 (s, 3H, H-19); 0,91 (d, J = 6,3 Hz, 3H, H-21).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C (125 MHz, CDCl3) - δ (Correlação estrutural): 213,88 (CH-

3); 35,07 (C-10); 42,99 (C-13); 180,26 (C-24); 44,51 (CH-5); 35,49 (CH-8), 40,94 (CH-9);

56,62 (CH-14); 56,16 (CH-17); 35,73 (CH-20); 37,38 (CH2-1); 37,20 (CH2-2); 42,53 (CH2-4);

25,96 (CH2-6); 26,81 (CH2-7); 21,39 (CH2-11); 40,25 (CH2-12); 24,35 (CH2-15); 28,33 (CH2-

16); 31,22 (CH2-22); 30,94 (CH2-23); 12,28 (CH3-18); 22,83 (CH3-19); 18,45 (CH3-21).

5.5.4 Preparação de AL-06

Figura 27 - Reação de formilação de AL

HCOOH

AL-06; R: H

HO

O

H

H

HH

O

R

O

O

H

H

HH

O

R

O

H

HClO4

À solução de AL (229 mg, 0,608 mmol) em ácido fórmico (2 mL), adicionou-se

ácido perclórico concentrado (20 gotas). A mistura foi mantida sob agitação em banho maria a

60°C por 4 horas. Decorrido esse período, a mistura reacional foi mantida sob agitação

magnética e resfriada em banho de gelo. Em seguida, adicionou-se anidrido acético (1 mL) e

um pequeno volume de água destilada, sendo obtido precipitado. O sólido branco amorfo

obtido foi denominado AL-06 (227 mg, 92,28%), e caracterizado por técnicas

espectroscópicas (IV, EM, RMN 1H e RMN

13C) e os dados espectroscópicos obtidos estão de

acordo com os descritos na literatura (BABU; MAITRA, 2005).

Dados Físicos do Ácido 3α-formiloxi-5β-colano-24-óico (AL-06)





) - 2936,87; 2866,73; 1718,03;

1704,53; 1448,96; 1379,88; 1249,99.


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


= +38,5 (c 0,01; CHCl3)


Constante de Acoplamento): 8,03 (s, 1H, HC=O); 4,81 - 4,86 (m, 1H, H-3β); 2,20 - 2,30 (m,

1H, H-23); 2,34 - 2,43 (m, 1H, H-23); 0,65 (s, 3H, H-18); 0,93 (s, 3H, H-19); 0,91 (d, J = 7,38

Hz, 3H, H-21).



42,96 (C-13); 180,60 (C-24); 74,64 (CH-3); 42,12 (CH-5); 36,00 (CH-8), 40,67 (CH-9); 56,67

(CH-14); 56,17 (CH-17); 35,50 (CH-20); 161,05 (HC=O); 30,96 (CH2-1); 26,51 (CH2-2);

35,17 (CH2-4); 27,19 (CH2-6); 26,84 (CH2-7); 21,05 (CH2-11); 40,33 (CH2-12); 24,38 (CH2-

15); 28,35 (CH2-16); 31,24 (CH2-22); 32,43 (CH2-23); 12,26 (CH3-18); 23,52 (CH3-19);

18,45 (CH3-21).

5.6 Atividade Antimicrobiana

5.6.1 Avaliação Antimicrobiana

5.6.1.1 Atividade antimicrobiana e Concentração inibitória mínima

A atividade antibacteriana das amostras foi avaliada através do método de

microdiluição, com base no documento M7-A6 do NCCLS (NCCLS, 2003). No ensaio foram

utilizadas três linhagens de bactérias Gram negativas e três Gram positivas, sendo estas

linhagens padrão e isolados clínicos multirresistentes: Escherichia coli (27), obtidos (a partir

de escarro) e Staphylococcus aureus (358) de ferida cirúrgica.

Previamente aos testes, as cepas bacterianas foram ativadas em meio Brain Hear

Infusion Broth (BHI 3,8%) para o crescimento bacteriano (24 h, 35 ± 2ºC). Após este

subcultivo, o inóculo foi padronizado a partir de uma suspensão bacteriana a uma

concentração final de aproximadamente 1 x 108 UFC/mL (0,5 unidades de turbidez

nefelométrica- escala McFarland). Em seguida, esta suspensão foi diluída a 1 x 106 UFC/mL

em caldo BHI a 10%. Volumes de 100 μL foram adicionados e então homogeneizados nos

poços de uma placa de microdiluição acrescido de diferentes concentrações das amostras,

resultando num inóculo final de 5 x 105 UFC/mL (HADACEK; GREGER, 2000; NCCLS,

2002; VILJOEN et al., 2003).


___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

As amostras foram diluídas em água destilada e dimetilsulfóxido (DMSO) a uma

concentração de 1.024 µg/mL. Outras diluições seriadas foram realizadas através da adição de

caldo BHI para alcançar uma concentração final no intervalo de 512 a 8 µg/mL. Todos os

experimentos foram realizados em triplicata e as placas de microdiluição foram incubadas a

35 ± 2 º C por 24 h. A atividade antibacteriana foi detectada através do método colorimétrico

pela adição de 25 μL de solução de resazurina (0,01%) após o período de incubação

(SALVAT et al., 2001). A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor

concentração das substâncias capaz de inibir o crescimento de bactérias, como indicado pela

coloração da resazurina.

5.6.1.2 Avaliação da atividade moduladora por contato direto

Para avaliar as amostras como potencializadoras da resistência de antibióticos da

classe dos aminoglicosídeos tais como neomicina, gentamicina e amicacina, foram

selecionadas as linhagens bacterianas que apresentaram CIMs ≤ 512 µg/mL. O teste de

modulação foi realizado na presença e na ausência das substâncias através de microdiluição

em triplicata.

Inóculos bacterianos (MIC/8) em BHI a 10% foram distribuídos em placas de

microdiluição seguido da adição de 100 µL das soluções de antibióticos (1.024 µg/mL)

seguido de diluições seriadas (1:2). As microplacas foram incubadas a 35 ± 2 º C por 24 h e a

leitura dos resultados foram obtidos de acordo como descrito anteriormente (SAGDIÇ, 2005).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Capítulo 6 - Considerações Finais 64

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A partir de reações químicas simples e utilizando reagentes comercialmente

disponíveis, foi possível obter seis derivados do ácido litocólico, com modificação no carbono

C-3 e/ou C-24 do esqueleto esteroidal.

Foram obtidos três derivados com modificação no C-3, (um acetilado, um oxidado

e um formilado), três derivados com modificação no C-24, (ésteres com grupamento metila,

etila e isopropila, sendo o último relatado pela primeira vez na literatura) e dois derivados

com modificação em C-3 e C-24 ao mesmo tempo (acetilado em C-3 e esterificado em C-24).

Todas as reações apresentaram bons rendimentos e os produtos foram devidamente

caracterizados por técnicas espectroscópicas de IV, RMN de 1H,

13C-BB e

13C-DEPT e

espectrometria de massa.

O ácido litocólico e seus derivados foram submetidos à atividade antimicrobiana,

observando-se bons resultados, exceto pelo oxidado. Com relação à avaliação da concentração

inibitória mínima, AL foi ativo frente a todas as cepas multirresistente com CIM de 512

µg/mL. Por outro lado, AL(a), AL(b), AL(a)-04 e AL(b)-04 não se mostraram ativos frente a

cepa S. aureus (Sa 358) com CIM ≥ 1024 µg/mL. AL(c) foi ativo frente a cepa de S. aureus

(ATCC 12692) e E. coli (Ec 27) com CIM de 512 µg/mL e a cepa E. coli (ATCC 25922) com

CIM de 256 µg/mL. AL-05 apresentou ação antimicrobiana frente a todas as cepas com CIM

variando de 512 a 256 µg/mL. Já AL-06, demonstrou ser o mais eficiente frente a todas as

cepas multirresistente, especialmente para B.cereus (ATCC 33018) e E. coli (Ec27), com CIM

de 32 µg/mL, e para S. aureus (ATCC 12692), com CIM de 16 µg/mL.

Apesar das substâncias não apresentarem atividade inibitória frente a todas as

linhagens patogênicas testadas, esses resultados são promissores e indicam que os mesmos

possuem atividade antimicrobiana oferecendo dessa forma, uma importante contribuição para

ampliar o conhecimento biológico das substâncias.

Vale ressaltar que o derivado AL-06 (Ácido 3α-formil-5β-colano-24-óico)

apresentou resultados promissores frente as bactérias testadas com CIM em alguns casos mais

eficientes que os antibióticos padrões avaliados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas 66

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

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ANEXOS

Anexos 72

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXOS

ANEXO A - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL

Figura 28 - Espectro na região do IV de AL (KBr)

Figura 29 - Espectro de massa (EM-ESI(-)) de AL

OH

HH

H

H

O

HO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 73

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 30 - Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) de AL

Figura 31 - Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) de AL

OH

HH

H

H

O

HO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

H

H

O

HO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 74

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (125 MHz, CD3OD) de AL


C - BB (125 MHz, CD3OD) de AL

OH

HH

H

H

O

HO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

H

H

O

HO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 75

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - DEPT 135o (CD3OD) de AL

OH

HH

H

H

O

HO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 76

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO B - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL(a)

Figura 35 - Espectro na região do IV de AL(a) (KBr)

Figura 36 - Espectro de massa (EM-APCI(+)) de AL(a)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 77

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 37 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a)

Figura 38 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 78

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a)


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 79

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(a)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 80

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


13C de AL(a) - CDCl3

δC δH *δC *δH

C

10 34,79 - 34,6

13 42,96 - 42,7

24 174,95 - 174,5

CH

3 72,08 3,58 - 3,63 (m, 1H, H-3β) 71,7 1,82 (s, 1H, 3-OH)

5 42,34 42,1

8 36,08 35,8

9 40,68 40,4

14 56,72 56,5

17 56,20 55,9

20 35,58 35,4

CH2

1 35,5

2 30,78 30,5

4 36,70 36,5

6 27,41 27,2

7 26,63 26,4

11 21,04 20,8

12 40,40 40,2

15 24,41 24,2

16 28,38 28,2

22 31,29 31,0

23 31,23 2,17 - 2,26 (m, 1H, H-23)

2,30 - 2,40 (m, 1H, H-23) 31,0

CH3

18 12,24 0,63 (s, 3H, 18-Me) 12,0 0,63 (s, 3H, 18-Me)

19 23,57 0,91 (s, 3H, 19-Me) 23,4 0,92 (s, 3H, 19-Me)

21 18,47 0,89 (d, J = 5,37, 3H, 21-Me) 18,3 0,92 (d, 3H, 21-Me)

OCH3 51,63 3,65 (s, 3H, CO2CH3) 51,4 3,62 (s, 3H, CO2CH3)

*(ARANDA; FETIZON; TAYEB, 1987)

Anexos 81

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO C - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL(b)

Figura 42 - Espectro na região do IV de AL(b) (KBr)

Figura 43 - Espectro de massa (EM-APCI(+)) de AL(b)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 82

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 44 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b)

Figura 45 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 83

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b)


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 84

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(b)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 85

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


13C de AL(b) - CDCl3

δC δH

C

10 34,79 -

13 42,95 -

24 174,54 -

CH

3 72,03 3,57 - 3,65 (m, 1H, H-3β)

5 42,33

8 36,07

9 40,67

14 56,72

17 56,20

20 35,55

CH2

1 35,58

2 30,75

4 36,66

6 27,41

7 26,63

11 21,04

12 40,39

15 24,41

16 28,37

22 31,54

23 31,21 2,14 - 2,24 (m, 1H, H-23); 2,28 - 2,38 (m, 1H, H-23)

OCH2 60,36 4,07 - 4,14 (q, J = 7,11 Hz, 2H, CO2CH2)

CH3

18 12,24 0,63 (s, 3H, 18-Me)

19 23,58 0,91 (s, 3H, 19-Me)

21 18,48 0,89 (d, J = 4,56 Hz, 3H, 21-Me)

CH3 14,45 1,22 - 1,26 (t, J = 7,11 Hz, 3H)

Anexos 86

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO D - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL(c)

Figura 49 - Espectro na região do IV de AL(c) (KBr)

Figura 50 - Espectro de massa (EM-APCI(+)) de AL(c)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 87

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 51 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(c)

Figura 52 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(c)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 88

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(c)


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(c)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 89

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(c)

O

HH

HO

H

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 90

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


13C de AL(c) - CDCl3

δC δH

C

10 34,76 -

13 42,92 -

24 174,04 -

CH

3 72,01 3,56 - 3,67 (m, 1H, H-3β)

5 42,30

8 36,04

9 40,63

14 56,69

17 56,19

20 35,50

OCH 67,49 4,94 - 5,03 (m, 1H, CO2CH)

CH2

1 35,55

2 30,71

4 36,63

6 27,39

7 26,61

11 21,01

12 40,37

15 24,38

16 28,36

22 31,85

23 31,21 2,11 - 2,22 (m, 1H, H-23); 2,25 - 2,33 (m, 1H, H-23)

CH3

18 12,21 0,63 (s, 3H, 18-Me)

19 23,56 0,91(s, 3H, 19-Me)

21 18,45 0,89 (d, J = 4,98 Hz, 3H, 21-Me)

2CH3 22,04 1,21 (d, J = 6,24 Hz, 6H)

Anexos 91

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO E - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL-04

Figura 56 - Espectro na região do IV de AL-04 (KBr)

Figura 57 - Espectro de massa (EM-ESI(-)) de AL-04

OH

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 92

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 58 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL-04

Figura 59 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL-04

OH

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 93

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL-04


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL-04

OH

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 94

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


13C de AL-04 - CDCl3

δC δH *δC *δH

C

10 34,80 - 34,5 -

13 42,97 - 42,7 -

24 180,32 - 180,2 -

C=O 170,94 - 170,7 -

CH

3 74,66 4,67 - 4,77 (m, 1H, H-3β) 74,4 4,68 - 4,76 (m, 1H, H-3)

5 42,12 41,8

8 36,02 35,7

9 40,65 40,3

14 56,71 56,4

17 56,22 55,9

20 35,52 35,3

CH2

1 30,99 30,8

2 26,54 26,3

4 35,26 35,0

6 27,24 26,9

7 26,85 26,5

11 21,05 20,8

12 40,37 40,1

15 24,39 24,1

16 28,37 28,1

22 31,22 31,2

23 32,47 2,20 - 2,31 (m, 1H, H23)

2,35 - 2,45 (m, 1H, H23) 32,2

CH3

18 12,26 0,65 (s, 3H, 18-Me) 12,0 0,65 (s, 3H, 18-Me)

19 23,54 0,93 (s, 3H, 19-Me) 23,3 0,93 (s, 3H, 19-Me)

21 18,46 0,91 (d, J= 4,26 Hz, 3H, 21-Me) 18,2 0,92 (d, J= 5,4 Hz, 3H, 21-Me)

AcO 21,66 2,03 (s, 3H, COCH3) 21,4 2,03 (s, 3H, COCH3)

*(EL KIHEL et al., 2008)

Anexos 95

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO F - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL(a)-04

Figura 62 - Espectro na região do IV de AL(a)-04 (KBr)

Figura 63 - Espectro de massa (EM-ESI(+)) de AL(a)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 96

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 64 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a)-04

Figura 65 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(a)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 97

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a)-04


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(a)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 98

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(a)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 99

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Tabela 07- Dados de RMN 1H e

13C de AL(a)-04 - CDCl3.

δC δH

C

10 34,7775 -

13 42,9367 -

24 174,9228 -

C=O 170,8191 -

CH

3 74,5888 4,65 - 4,76 (m, 1H, H-3β)

5 42,0993

8 35,9955

9 40,6238

14 56,7025

17 56,2098

20 35,5575

CH2

1 31,2065

2 26,5185

4 35,2410

6 27,2192

7 26,8300

11 21,0333

12 40,3499

15 24,3753

16 28,3722

22 31,2563

23 32,4543 2,15 - 2,25 (m, 1H, H-23); 2,29 - 2,39 (m, 1H, H-23)

CH3

18 12,2298 0,63 (s, 3H, 18-Me)

19 23,5230 0,91 (s, 3H, 19-Me)

21 18,4632 0,89 (d, J = 6,00 Hz, 3H, 21-Me)

AcO 21,6419 2,01 (s, 3H, AcO)

OCH3 51,6434 3,65 (s, 3H, OCH3)

Anexos 100

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO G - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL(b)-04

Figura 69 - Espectro na região do IV de AL(b)-04 (KBr)

Figura 70 - Espectro de massa (EM-ESI(+)) de AL(b)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 101

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Figura 71 - Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b)-04

Figura 72 - Expansão do espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de AL(b)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 102

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b)-04


C - BB (75 MHz, CDCl3) de AL(b)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 103

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


C - DEPT 135o (CDCl3) de AL(b)-04

O

HH

O

H

H

OO

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 104

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.


13C de AL(b)-04 - CDCl3.

δC δH

C

10 34,7735 -

13 42,9325 -

24 174,4875 -

C=O 170,8073 -

CH

3 74,5859 4,66 - 4,77 (m, 1H, H-3β)

5 42,0951

8 35,9935

9 40,6167

14 56,6958

17 56,2268

20 35,5362

CH2

1 31,1988

2 26,5141

4 35,2331

6 27,2153

7 26,8244

11 21,0270

12 40,3459

15 24,3672

16 28,3597

22 31,5245

23 32,4483 2,14 - 2,28 (m, 1H, H-23); 2,30 - 2,38 (m, 1H, H-23)

OCH2 60,3391 4,08 (q, J = 6,00 Hz, 2H, OCH2)

CH3

18 12,2199 0,64 (s, 3H, 18-Me)

19 23,5149 0,92 (s, 3H, 19-Me)

21 18,4669 0,90 (d, J = 6,00 Hz, 3H, 21-Me)

AcO 21,6330 2,02 (s, 3H, AcO)

CH3 14,4434 1,22 (t, J = 6,00 Hz, 3H, CH3)

Anexos 105

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO H - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL-05



OH

HH

H

H

O

O

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 106

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.



OH

HH

H

H

O

O

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

H

H

O

O

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 107

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.





OH

HH

H

H

O

O

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

H

H

O

O

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 108

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.



OH

HH

H

H

O

O

1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 109

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.



δC δH *δC *δH

C

3 213,88 - 203,8

10 35,07 - 35,2

13 42,99 - 43,1

24 180,26 - 180,1

CH

5 44,51 44,6

8 35,49 35,6

9 40,94 41,1

14 56,62 56,7

17 56,16 56,3

20 35,73 35,8

CH2

1 37,38 37,5

2 37,20 37,3

4 42,53 42,6

6 25,96 26,1

7 26,81 26,9

11 21,39 21,5

12 40,25 40,3

15 24,35 24,4

16 28,33 28,4

22 31,22 31,2

23 30,94 2,21 - 2,30 (m, 1H, H-23)

2,32 - 2,44 (m, 1H, H-23) 31

CH3

18 12,28 0,67 (s, 3H, 18-Me) 12,4 0,68 (s, 3H, 18-Me)

19 22,83 1,00 (s, 3H, 19-Me) 22,9 1,01 (s, 3H, 19-Me)

21 18,45 0,91 (d, J = 6,3 Hz, 3H, 21-Me) 18,5 0,92 (d, J = 6,1 Hz, 3H, 21-Me)

*(NAHAR; TURNER, 2003)

Anexos 110

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO I - Dados espectrométrico e espectroscópicos da substância AL-06



OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 111

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.



OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 112

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.





OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 113

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.





OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

OH

HH

O

H

H

O

H

O1

2

3

4

5

6

10

7

8

14

15

9

1112

1316

19

18

17 20

21

22

2324

Anexos 114

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.



δC δH *δC *δH

C

10 34,78 34,55

13 42,96 42,72

24 180,60 180,29

CH

3 74,64 4,81 - 4,86 (m, 1H, H-3β) 74,42 4,88 - 4,81 (m, 1H)

5 42,12 41,88

8 36,00 35,70

9 40,67 40,42

14 56,67 56,43

17 56,17 55,92

20 35,50 35,28

HC=O 161,05 8,03 (s, 1H, HC=O) 160,84 8,03 (s, 1H)

CH2

1 30,96 30,73

2 26,51 26,28

4 35,17 34,94

6 27,19 26,95

7 26,84 26,61

11 21,05 20,82

12 40,33 40,09

15 24,38 24,15

16 28,35 28,14

22 31,24 30,98

23 32,43 2,20 - 2,30 (m, 1H, H-23)

2,34 - 2,43 (m, 1H, H-23) 32,18 2,44 - 2,19 (m, 2H)

CH3

18 12,26 0,65 (s, 3H, 18-Me) 12,03 0,64 (s, 3H)

19 23,52 0,93 (s, 3H, 19-Me) 23,29 0,93 (s, 3H)

21 18,45 0,91 (d, J = 7,38 Hz, 3H, 21-Me) 18,22 0,92 (d, J = 6,6 Hz, 3H)

*(BABU; MAITRA, 2005)

Anexos 115

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

ANEXO J - Dados do Ácido Litocólico e seus derivados

Figura 91 - Estrutura do ácido litocólico e seus derivados

OH

O

H

HHO

H

H

OH

O

H

HO

H

H

O

OH

O

H

H

H

H

O

O

O

H

H

H

H

HO

O

O

H

HHO

H

H

OH

O

H

O

H

H

H

O

H

O

O

H

HHO

H

H

AL

AL-04 AL(a)

AL-05

AL(b)

AL-06

AL(c)

O

O

H

HO

H

H

O

AL(a)-04

O

O

H

HO

H

H

O

AL(b)-04

Anexos 116

___________________________________________________________________________ Nascimento, P.G.G.

Tabela 11 - Dados de RMN 13

C do ácido litocólico e seus derivados

AL AL(a) AL(b) AL(c) AL-04 AL(a)-04 AL(b)-04 AL-05 AL-06

C

10 35,84 34,79 34,79 34,76 34,80 34,78 34,77 35,07 34,78

13 44,07 42,96 42,95 42,92 42,97 42,93 42,93 42,99 42,96

24 178,30 174,95 174,54 174,04 180,32 174,92 174,49 180,26 180,60

C=O - - - - 170,94 170,82 170,81 213,88 -

CH

3 72,58 72,08 72,03 72,01 74,66 74,59 74,58 - 74,64

5 43,70 42,34 42,33 42,30 42,12 42,10 42,09 44,51 42,12

8 37,40 36,08 36,07 36,04 36,02 36,00 35,99 35,49 36,00

9 42,04 40,68 40,67 40,63 40,65 40,62 40,61 40,94 40.67

14 58,07 56,72 56,72 56,69 56,71 56,70 56,69 56,62 56,67

17 57,63 56,20 56,20 56,19 56,22 56,21 56,22 56,16 56,17

20 36,85 35,58 35,55 35,50 35,52 35,56 35,53 35,73 35,50

HC=O - - - - - - - 161,05

OCH - - - 67,49 - - - -

CH2

1 36,66 35,58 35,55 30,99 31,20 31,20 37,38 30,96

2 31,35 30,78 30,75 30,71 26,54 26,52 26,51 37,20 26,51

4 37,33 36,70 36,66 36,63 35,26 35,24 35,23 42,53 35,17

6 28,52 27,41 27,41 27,39 27,24 27,22 27,21 25,96 27,19

7 27,82 26,63 26,63 26,61 26,85 26,83 26,82 26,81 26,84

11 22,11 21,04 21,04 21,01 21,05 21,03 21,03 21,39 21,05

12 41,69 40,40 40,39 40,37 40,37 40,35 40,34 40,24 40,33

15 25,42 24,41 24,41 24,38 24,39 24,37 24,37 24,35 24,38

16 29,37 28,38 28,37 28,36 28,37 28,37 28,36 28,33 28,35

22 32,47 31,29 31,54 31,85 31,22 31,25 31,52 31,22 31,24

23 32,17 31,23 31,21 31,21 32,47 32,45 32,45 30,94 32,43

OCH2 - - 60,36 - - - 60,34 - -

CH3

18 12,66 12,24 12,24 12,21 12,26 12,23 12,22 12,28 12,26

19 24,11 23,57 23,58 23,56 23,54 23,52 23,51 22,83 23,52

21 18,93 18,47 18,48 18,45 18,46 18,46 18,46 18,45 18,45

AcO - - - - 21,66 21,64 21,63 - -

OCH3 - 51,63 - - - 51,64 - - -

CH3 - - 14,45 22,04 - - 14,44 - -

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