UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE … · para a vida e me ensinaram o verdadeiro...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS CENTRAIS DA IANGAMBINA ISOLADA DE Ocotea duckei Vattimo:
ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO EM CÓRTEX MOTOR E CORPO ESTRIADO DE CAMUNDONGO
VERA TARGINO MOREIRA LIMA
Fortaleza 2005
ii
VERA TARGINO MOREIRA LIMA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS CENTRAIS DA IANGAMBINA ISOLADA DE Ocotea duckei Vattimo:
ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO EM CÓRTEX MOTOR E CORPO ESTRIADO DE CAMUNDONGO
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia. Orientador: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa.
Fortaleza 2005
L711a Lima, Vera Targino Moreira Avaliação dos efeitos centrais da iangambina isolada de Ocotea duckei Vattimo: estudo comportamental e neuroquímico em córtex motor e corpo estriado de camundongo / Vera Targino Moreira Lima. – Fortaleza, 2005.
167 f: il.
Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Francisca Cléa Florenço de Sousa. Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará. Departamento de Fisiologia e Farmacologia. Faculdade de Medicina.
1. Farmacologia. 2. Lauraceae. 3. Ocotea. 4. Lignanas. 5. Yangambin.
6. Ansiolíticos. 7. Modelos animais. 8. Monoaminas biogênicas. 9. Receptores dopaminérgicos. 10. Receptores muscarínicos. 11. Receptores de serotonina. I. Sousa, Francisca Cléa Florenço de (orient.). II. Título.
CDD 615.1
iii
VERA TARGINO MOREIRA LIMA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS CENTRAIS DA IANGAMBINA ISOLADA DE Ocotea duckei Vattimo:
ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO EM CORTEX MOTOR E CORPO ESTRIADO DE CAMUNDONGO
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.
Tese aprovada com louvor em 20 de julho de 2005
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________ Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa (Orientador)
Universidade Federal do Ceará-UFC
____________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Universidade Federal da Paraíba-UFPB
____________________________________________
Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida Universidade Federal do Piauí-UFPI
____________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho Universidade Federal do Ceará-UFC
____________________________________________
Prof. Dr. Carlos Maurício de Castro Costa Universidade Federal do Ceará-UFC
iv
Agradeço a Deus por ter permitido a minha
convivência com pessoas competentes e inteligentes
que muito contribuíram para a realização deste trabalho.
v
Dedicatória
À minha mãe, Regina, e ao meu pai, Abelardo (in memorium), que me deram meu primeiro impulso
para a vida e me ensinaram o verdadeiro significado do amor e da integridade.
Aos meus irmãos, Regina, Helosine, Alberto, Abelardo e Paulo, grandes amigos e incentivadores.
À Daniela, Denise e Débora, minhas filhas, por serem a razão e estímulo para prosseguir adiante e
representarem sempre amor, alegria, integridade, sinceridade, entusiasmo e inteligência em minha
vida..
vi
“Tudo quanto fizerdes, por palavra ou por obra, fazei-o em
nome do Senhor Jesus, dando por ele graças a Deus Pai”.
(Colossenses 3: 17)
vii
“O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato não os despreza. O Altíssimo
deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas, e dela se serve para acalmar as
dores e cura-las. O farmacêutico faz misturas agradáveis, compõe ungüentos úteis à saúde, e seu
trabalho não terminará, até que a paz divina se estenda sobre a face da terra”.
(Eclesiástico 38, 4. 6-8)
viii
AGRADECIMENTOS
Aos Secretários de Saúde do Estado do Ceará Dr. Anastácio de Queiroz Sousa (2001-2002) e
Dr. Jurandi Frutuoso Silva, pela compreensão ao autorizar meu afastamento do trabalho
para dedicar-me ao doutorado.
À Profa. Francisca Cléa Florenço de Sousa, pela preciosa orientação, confiança e apoio na
execução deste trabalho.
Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba, nas
pessoas do Prof. José Maria Barbosa Filho e doutoranda Celidarque da Silva Dias, que
gentilmente nos cedeu a substância isolada e que muito colaborou para a realização deste
estudo.
Aos Profs. Reinaldo Nóbrega de Almeida, Fernanda Regina de Castro Almeida, Manoel
Odorico de Moraes Filho e Carlos Maurício de Castro Costa, por terem gentilmente aceito o
convite para participar da banca examinadora.
À Profa. Glauce Socorro Barros Viana, pessoa a quem tenho admiração e respeito, por sua
cordial acolhida em seu laboratório, para que eu pudesse executar os experimentos e
concluir o meu doutorado.
Aos professores do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos e dedicação
permanente aos alunos e ao programa de pós-graduação.
Aos Profs. Manoel Odorico de Moraes Filho e Maria Elisabete Amaral de Moraes, a quem
tenho muita estima e respeito, pela amizade e apoio recebido.
À Dra. Fátima Maria Fernandes Veras, diretora do Centro de Ciências de Saúde da
Universidade de Fortaleza (UNIFOR), grande amiga e incentivadora.
À Profa. Geanne Matos, pelos comentários pertinentes que contribuíram para o
enriquecimento deste trabalho.
ix
À Norma Carvalho Linhares, bibliotecária da UFC, o agradecimento especial por sua
dedicação na correção da referência bibliográfica.
À Danielle Silveira Macêdo, por sua amizade e espírito cooperativo em muitos momentos que
necessitei da sua ajuda.
Aos amigos de pós-graduação: Lissiana, Izabel, Thiciane, Kalyne, Aline, Viviane, Patrícia,
Emanuelle, Carlos Renato, Iri Sandro, e Jefferson, pela amizade e apoio recebido.
Aos estudantes de iniciação científica: Edenilce, Andreisa, Emídio e Bruno, pela dedicação e
seriedade na execução dos experimentos.
À Vilani Bastos e Jaqueline, pela sua cooperação e apoio.
A todos que fazem parte do Laboratório de Neurofarmacologia, pelos préstimos e convívio
amigável, que tornaram mais agradável minha passagem por este laboratório.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Ceará e em especial aos funcionários da secretaria do
curso de pós-graduação, pelo apoio e cooperação.
À Febe, sempre solicita e atenciosa em todas às vezes em que estive no biotério.
Ao Dr. José de Anchieta Correia Maia, meu grande amigo e companheiro, pela dedicação,
incentivo, carinho e apoio sempre presentes.
Às minhas filhas, Daniela, Denise e Débora, por aceitar e compreender as ausências, durante
esta etapa da minha formação acadêmica.
x
SUMÁRIO
Lista de Tabelas xiii
Lista de Figuras xiv
Lista de Quadros xvi
Lista de Abreviaturas xvii
Resumo xx
Abstract xxi
1 INTRODUÇÃO 2 1.1 Generalidades 2
1.2 Família Lauraceae 10
1.3 Ocotea duckei Vattimo 11
1.4 Lignóides 14
1.5 Iangambina 15
1.5.1 Características da iangambina 15
1.5.2 Propriedades farmacológicas da iangambina 16
1.6 Sistema dopaminérgico 18
1.6.1 Receptores dopaminérgicos 20
1.6.2 Expressão dos receptores dopaminérgicos 21
1.6.3 Vias de transdução de sinal 22
1.6.3.1 Adenilato ciclase 23
1.6.3.2 Canais de cálcio e potássio 23
1.6.4 Funções da dopamina 24
1.7 Sistema colinérgico 26
1.7.1 Receptores colinérgicos 28
1.7.1.1 Receptores nicotínicos 28
1.7.1.2 Receptores muscarínicos 29
1.7.2 Regulação do receptor muscarínico da acetilcolina 32
1.8 Sistema serotonérgico 32
1.8.1 Localização dos receptores serotonérgicos 34
1.9 Sistema gabaérgico 36
1.10 Áreas cerebrais (córtex motor e corpo estriado) 38
1.11 Relevância e justificativa 39
2 OBJETIVOS 41
xi
3 MATERIAIS E MÉTODOS 43
3. 1 Material utilizado nos experimentos 43
3.2 Animais 43
3.3 Material botânico 44
3.4 Extração e isolamento 44
3.5 Preparo da droga 47
3.6 Tratamento dos grupos experimentais 47
3.7 Testes comportamentais 48
3.7.1 Teste de campo aberto 48
3.7.2 Teste do rota rod 48
3.7.3 Teste do nado forçado 49
- Procedimento experimental 49
3.7.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital 50
- Procedimento experimental 50
3.7.5 Teste da placa perfurada 50
3.7.6 Teste de labirinto em cruz elevado 51
- Procedimento experimental 51
3.7.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol 52
3.8 Dissecação das áreas cerebrais 52
3.9 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC 53
- Método 53
- Procedimento experimental 54
- Soluções reagentes 55
3.10 Determinação da densidade dos receptores dopaminérgicos 55
- Método 56
- Procedimento experimental 56
- Soluções reagentes 57
3.11 Determinação da densidade dos receptores muscarínicos 58
- Método 59
- Procedimento experimental 59
- Soluções reagentes 60
3.12 Determinação da densidade dos receptores serotonérgicos (5-HT2) 61
3.13 Dosagem de proteína 62
xii
- Método 62
- Soluções reagentes 62
3.14 Análise estatística 63
4 RESULTADOS 65
4.1 Testes comportamentais 65
4.1.1 Teste do campo aberto (vias intraperitoneal e oral) 65
4.1.2 Teste do rota rod (vias intraperitoneal e oral) 72
4.1.3 Teste do nado forçado (vias intraperitoneal e oral) 75
4.1.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital (vias intraperitoneal
e oral)
78
4.1.5 Teste da placa perfurada (vias intraperitoneal e oral) 81
4.1.6 Teste de labirinto em cruz elevado (vias intraperitoneal e oral) 84
4.1.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol (vias intraperitoneal
e oral)
90
4.2 Estudo neuroquímico 93
4.2.1 Dosagens de monoaminas 93
4.2.2 Ensaios de binding 102
4.2.2.1 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em
homogenatos de córtex motor e corpo estriado de
camundongo (experimentos in vitro).
102
4.2.2.2 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em
presença de mianserina em homogenatos de córtex motor e
corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).
104
4.2.2.3 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em
homogenatos de córtex motor e corpo estriado de
camundongo (experimentos in vitro).
106
4.2.2.4 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em
presença de dopamina em homogenatos de córtex motor e
corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).
108
5 DISCUSSÃO 111
6 CONCLUSÕES 131
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 134
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do
rota rod para camundongos
73
Tabela 2 - Efeito da administração oral da iangambina no teste do rota rod para
camundongos
74
Tabela 3 - Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do
labirinto em cruz elevado para camundongos
86
Tabela 4 - Efeito da administração oral da iangambina no teste de labirinto em
cruz elevado para camundongos
88
Tabela 5 - Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via
intraperitoneal, no modelo de convulsão induzida com
pentilenotetrazol em camundongos
91
Tabela 6 - Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via oral,
no modelo de convulsão induzida com pentilenotetrazol em
camundongos
92
Tabela 7 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em
homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo
(experimentos in vitro)
103
Tabela 8 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em
presença de mianserina em homogenatos de córtex motor e corpo
estriado de camundongo (experimentos in vitro)
105
Tabela 9 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em homogenatos
de córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in
vitro)
107
Tabela 10 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em
presença de dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo
estriado de camundongo (experimentos in vitro)
109
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Folhas e flores da Ocotea duckei Vattimo 12
Figura 2 - Ocotea duckei Vattimo 13
Figura 3 - Estrutura química da iangambina 15
Figura 4 - Vias dopaminérgicas no cérebro 20
Figura 5 - Vias da acetilcolina no cérebro 28
Figura 6 - Vias da 5-hidroxitriptamina (serotonérgicas) no cérebro 34
Figura 7 Receptor GABAA 37
Figura 8 - Isolamento da iangambina à partir das cascas do caule de Ocotea
duckei Vattimo.
46
Figura 9 - Efeito da iangambina intraperitoneal sobre a atividade locomotora
(campo aberto)
66
Figura 10 - Efeito da iangambina via oral sobre a atividade locomotora (campo
aberto)
67
Figura 11 - Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via
intraperitoneal)
68
Figura 12 - Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via
oral)
69
Figura 13 - Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via
intraperitoneal)
70
Figura 14 - Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via
oral)
71
Figura 15 - Efeito do tratamento agudo com iangambina por via intraperitoneal
no tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos
76
Figura 16 - Efeito do tratamento agudo com iangambina por via oral no tempo
de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos.
77
Figura 17 - Efeito da iangambina intraperitoneal no tempo de sono induzido por
pentobarbital em camundongos
79
Figura 18 - Efeito da iangambina via oral no tempo de sono induzido por
pentobarbital em camundongos
80
Figura 19 - Efeito do tratamento agudo com iangambina via intraperitoneal no
teste de placa perfurada para camundongos
82
xv
Figura 20 - Efeito do tratamento agudo com iangambina via oral no teste de
placa perfurada para camundongos
83
Figura 21 - Efeito da iangambina intraperitoneal no teste de labirinto em cruz
elevado
87
Figura 22 - Efeito da iangambina via oral no teste de labirinto em cruz elevado 89
Figura 23 - Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,
i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em córtex
motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento
96
Figura 24 - Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,
i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em córtex
motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento
97
Figura 25 - Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de
DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em córtex motor de
camundongos determinado 24 horas depois da última administração
98
Figura 26 - Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,
i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em corpo
estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento
99
Figura 27 - Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,
i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em corpo
estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento
100
Figura 28 - Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de
DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em corpo estriado de
camundongos determinado 24 horas depois da última administração
101
xvi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Fármacos protótipos de categorias terapêuticas, a partir de plantas 6
Quadro 2 - Receptores de dopamina 21
Quadro 3 - Subtipos muscarínicos de receptores da acetilcolina 31
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS [3H]-NMS - [3H]-N-metil-escopolamina
[3H]-SCH 23390 - [3H]-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-3-metil-5-fenil-1H-3-benzazepina-7-ol 3H - Hidrogênio tritiado
5,7-DHT - 5,7-d-hidroxitriptamina
5-HIAA - Ácido-5-hidroxindolacético
5-HT - 5-hidroxitriptamina ou serotonina
AADC - L-aminoácido descarboxilase
Acetil-CoA - Acetil coenzima A
ADP - Adenosina difosfato
ALE - Atividade locomotora espontânea
AMPc - Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA - Análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATV - Área tegumentar ventral
BSA - Bovine seric albumin (Albumina sérica bovina)
CACA - Ácido cis-4-aminocrotônico
CE - Corpo estriado
CGP - Diretrizes para as Boas Práticas Clínicas
CHCl3 - Clorofórmio
CLAE/RMN - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotômetro
de ressonância magnética nuclear.
CLAE/UV/EM - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotômetro
de ultravioleta e espectofotômetro de massas.
CM - Córtex motor
CNS - Conselho Nacional de Saúde
DA - Dopamina, dopaminérgico (s), dopaminérgica (s)
DOPAC - Ácido 3,4-diidroxifenilacético
DS - Duração do sono
DZP - Diazepam
EA - Extrato acético
EC - Extrato clorofórmico
EE - Extrato etanólico
xviii
EMEA - European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (Agência
Europeia para Avaliação de Produtos Medicinais)
EPM - Erro padrão da média
Flu - Flumazenil
FM - Fórmula molecular
GABA - Ácido gama amino butírico
GTP - Trifosfato de guanina
HCLO4 - Ácido perclórico
HPLC - High Performance Liquid Chromatograph (Cromatografia líquida de
alta performance)
HVA - Ácido homovanílico
i.p. - Intraperitoneal
i.v. - Intravenoso
Iag - Iangambina
IMP - Cloridrato de imipramina
L-DOPA - L-3,4-dihidroxifenilalanina
LTB4 - Leucotrieno B4
MDMA - 3,4-methlyenedioxymethampthetamine
MeOH - Metanol
MS - Ministério da Saúde
NA - Noradrenalina
NADP - Dinucleotídeo fosfato de nicotidamida adenina
NEBA - Número de entradas nos braços abertos
NMDA - N-metil-d-aspartato
NRM - Núcleo medial da rafe
NQ - Número de quedas da barra
NRD - Núcleo dorsal da rafe
PAF - Fator ativador de plaquetas
PEBA - Percentagem do número de entradas nos braços abertos
PF - Ponto de fusão
PGHS-2 Prostaglandina-endoperóxido sintetase-2
PKA - Proteína Kinase A
PM - Peso molecular
xix
Proteína G - Guanina nucleotídeo
Proteína Gi - Proteína G do tipo inibitória
PTBA - Percentagem do tempo de permanência nos braços abertos
PTZ Pentilenotetrazol
RDC - Resolução de Diretoria Colegiada
RMN - Ressonância magnética nuclear
RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro
rpm - Rotação por minuto
SCH-23390 - 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-3-metil-5-fenil-1H-3-benzazepina-7-ol
SKF 97541 - Ácido 3-aminopropil-(metil)-fosfínico
SOS - Ácido octanosulfônico
SR 95531 - Gabazina
TACA - Ácido trans-4-aminocrotônico
TH - Tirosina-hidroxilase
TL - Tempo de latência do sono
TO - Tubérculo olfatório
TP - Tempo de permanência na barra
TPBA - Tempo de permanência nos braços abertos
TPMPA - Ácido [(1,2,5,6-tetrahidropiridina-4-y1)metilfosfínico]
UV - Ultra violeta
v.o. - Via oral
WHO - World Health Organization
xx
RESUMO
Avaliação dos efeitos centrais da iangambina isolada de Ocotea duckei Vattimo: Estudo comportamental e neuroquímico em córtex motor e corpo estriado de camundongo. VERA TARGINO MOREIRA LIMA. Orientador: Profa. Dra. Fca. Cléa Florenço de Sousa. Tese de Doutorado. Curso de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2005.
Os efeitos da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, por via intraperitoneal e oral), foram estudados em vários modelos animais de comportamento (campo aberto, rota rod, nado forçado, tempo de sono induzido por pentobarbital, placa perfurada, labirinto em cruz elevado, convulsão induzida por pentilenotetrazol). Binding in vitro com diferentes concentrações de iangambina (0,5-200 µl), foram realizados para avaliar sua interação com os receptores dopaminérgicos (D1- e D2-símile), receptores muscarínicos (M1+M2)-símile e receptores serotonérgicos (5-HT2)-símile, bem como, estudo em HPLC para determinar os efeitos da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,i.p.) após 24 horas de sua administração aguda sobre os níveis de monoaminas e seus metabólitos em córtex motor e corpo estriado de camundongos. Os resultados mostraram que a iangambina induziu uma diminuição significativa na atividade locomotora e nas freqüências de rearing e grooming no teste de campo aberto, indicativo de possível efeito ansiolítico. Estes resultados podem estar relacionados com o sistema dopaminérgico, desde que houve interação da iangambina com os receptores D1- e D2-símile, em corpo estriado e D2-símile em córtex motor, acompanhado de uma redução de dopamina, indicando uma provável ação antagonista dopaminérgica. A iangambina não causou alteração na coordenação motora dos animais no teste de rota rod, sugerindo que a redução da atividade locomotora possa envolver ação central. Houve um aumento significativo na imobilidade dos camundongos no teste do nado forçado induzido pela iangambina. Este efeito, juntamente com a redução da dopamina, noradrenalina e serotonina induzida pela iangambina em corpo estriado, pode explicar seu efeito depressor neste modelo. Além disso, corroborando estes resultados, a iangambina potenciou o tempo de sono induzido pelo pentobarbital em camundongos, sugestivo de efeito depressor central. Iangambina nas doses empregadas neste trabalho, não protegeu os animais das convulsões induzidas por pentilenotetrazol, sugerindo que este efeito depende da dose usada. No teste da placa perfurada, a iangambina aumentou o número de head dips, em todas as doses estudadas, por via intraperitoneal ou oral, demonstrando atividade ansiolítica. O efeito ansiolítco da iangambina (75 mg/kg, i.p e 25, 50 e 75 mg/kg, v.o.) também foi confirmado no teste do labirinto em cruz elevado, onde apresentou aumento significativo na percentagem do número de entradas nos braços abertos e na percentagem do tempo de permanência nos braços abertos. Iangambina (50 e 75 mg/kg, v.o.) também aumentou o número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos, respectivamente. No entanto, iangambina 25 e 50 mg/kg, i.p., apresentou efeito ansiogênico evidenciado pela redução do tempo de permanência nos braços abertos o que provavelmente pode dever-se a ausência da formação de algum metabólito ativo gerado no metabolismo de primeira passagem. O efeito ansiolítico induzido pela iangambina 75 mg/kg, v.o., no modelo do labirinto, foi revertido com o flumazenil (2,5 mg/kg,i.p), indicando a possível participação dos receptores GABAérgicos no seu mecanismo de ação. O efeito ansiolítico da iangambina, observado no teste da placa perfurada e no labirinto em cruz elevado, foi acompanhado por uma redução de noradrenalina e serotonina em corpo estriado, no entanto, em córtex motor, iangambina (75 mg/kg, i.p.), induziu um aumento dos níveis de noradrenalina, assim como iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) induziu aumento de serotonina, demonstrando que o efeito ansiolitico associado a redução de noradrenalina e serotonina depende da área cerebral. A iangambina interagiu com receptores muscarínicos em córtex motor e corpo estriado. O bloqueio dos receptores dopaminérgicos induzido pela iangambina foi sinérgico à sua ação agonista sobre os receptores colinérgicos, desde que não alterou a redução da atividade locomotora dos animais no modelo de campo aberto. O presente trabalho mostra uma interação entre os sistemas dopaminérgico, colinérgico, serotonérgico e GABAérgico, revelando a importância da iangambina em doenças que alteram estes sistemas de neurotransmissão. A iangambina apresentou alterações comportamentais e neuroquímicas compatíveis com efeito ansiolítico-símile.
xxi
ABSTRACT
Evaluation of the central effects of yangambin isolated from Ocotea duckei Vattimo: Behavioral and neurochemical study in mice motor cortex and striatum. VERA TARGINO MOREIRA LIMA. Supervisor: Prof. Dr. Fca. Cléa Florenço de Sousa. Doctor’s Tese. Course of Post-graduation in Pharmacology. Department of Physyology and Pharmacology, UFC, 2005.
The effects of the acute administration of yangambin (25, 50 and 75 mg/kg intraperitoneal and oral), were studied in some animals behavioral models (open field, rotarod, forced swimming test, barbiturate-induced sleeping time, hole board, elevated plus maze, pentilenotetrazole-induced convulsion). Binding in vitro with differents concentrations of yangambin (0.5-200 µl), had been carried out to evaluate its interaction with the dopaminergic receptors (D1- and D2-like), muscarinic receptors (M1+M2)-like and serotonergic receptors (5-HT2)-like, as well as, HPLC studies to determine the effects of yangambin (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) after 24 h of its acute administration on the monoamines levels and its metabolites in mice motor cortex and striatum. The results showed that yangambin induced a significant reduction in the locomotor activity and the frequencies of rearing and grooming in the open field test, indicative of possible ansiolytic-like effect. These results can have related with the dopaminergic system, since that it had interaction of the yangambin with D1- e D2-símile receptors, in striatum and D2-símile in motor cortex, followed by a dopamine reduction, indicating a probable dopaminergic antagonistic action. The yangambin did not cause alteration in the motor coordination of the animals in the rotarod test, suggesting that the reduction of the locomotor activity can involve central action. It had a significant increase in the immobility of the mice in the forced swimming test induced by the yangambin. This effect, taken together with the reduction of the dopamine, noradrenaline and serotonin induced by yangambin in striatum, can explain its depressant effect in this model. Moreover, corroborating these results, the yangambin increased pentobarbital-induced sleeping time in treated mice, suggestive of central depressant effect. Yangambin in the doses used in this work, did not protect the animals from pentilenotetrazole-induced convulsions, suggesting that this effect depends on the used dose. In the hole board test, the yangambin increased the number of the head dips, in all the doses studied, intraperitoneal or oral, demonstrating ansiolytic activity. The ansiolytic effect of yangambin (75 mg/kg, i.p. and 25, 50 and 75 mg/kg, p.o.) was also confirmed in the elevated plus maze, where it presented significant increase in the percentage of the entries number in the open arms and the percentage of the time of permanence in the open arms. Yangambin 50 and 75 mg/kg, p.o., also increased the number of entries and the time of permanence in the open arms, respectively. However, yangambin 25 and 50 mg/kg, i.p., presented ansiogenic effect evidenced by the reduction of the time of permanence in the open arms which probably due to the absence of the formation of some active metabolite generated in the first-pass metabolism. The ansiolytic effect induced for yangambin 75 mg/kg, p.o., in the plus maze, was reverted with flumazenil (2.5 mg/kg, i.p.), indicating the possible participation of the GABAergic receptors in its mechanism of action. The ansiolytic effect of the yangambin, observed in the hole board and the plus maze test, was followed by a reduction of noradrenaline and serotonin in striatum, however, in the motor cortex, yangambin (75 mg/kg, i.p.), induced an increase of the noradrenaline levels, as well as yangambin (25, 50 and 75 mg/kg, i.p.) induced serotonin increase, demonstrating that the ansiolytic effect associated to the reduction of noradrenaline and serotonin depends on the cerebral area. The blockade of the dopaminergic receptors induced by yangambin was synergic to its agonist action on the cholinergic receptors, since that it did not modify the reduction of the locomotive activity of the animals in the open field test. The present work shows an interaction between the systems dopaminergic, cholinergic, serotonergic and GABAergic, that suggest the importance of yangambin in illnesses that modify these systems of neurotransmission. The yangambin presented compatible behavioural and neurochemical alterations with ansiolytic-like effect.
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
1.1 Generalidades
As Plantas são fontes importantes de produtos naturais biologicamente ativos,
muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos.
Pesquisadores mostram-se impressionados com as diversidades, encontradas nos produtos
naturais em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas, (WALL;
WANI, 1996). Apesar do avanço nessa área de estudo, os dados disponíveis revelam que
apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal
(SOEJARTO, 1996).
Ao se considerar as perspectivas de obtenção de novos fármacos, dois aspectos
distinguem os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidadade molecular e a função
biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela derivada
dos processos de síntese, que, apesar dos avanços consideráveis, ainda é limitada (NISBET;
MOORE, 1997).
Quando se trabalha com plantas, a identificação da espécie e sua perpetuação são
os passos mais importantes para que qualquer investigação possa ser reproduzida. Estudos que
envolvem plantas medicinais, quer sejam nas áreas de etnobotânica, etnofarmacologia,
farmacologia, farmacognosia, fitoquímica, agronomia ou biotecnologia, para que mereçam
confiabilidade, devem partir da certeza de que as espécies envolvidas estejam corretamente
identificadas e depositadas no herbário de uma instituição. Para tanto, alguns procedimentos
devem ser seguidos, tais como coleta, herborização e registro.
Com a demanda pela utilização de plantas medicinais na cura ou prevenção de
doenças, o cultivo e/ou o extrativismo dessas plantas torna-se uma alternativa cada vez mais
importante na agricultura nacional (CORRÊA JÚNIOR et al., 1994).
Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da
indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte (FARIAS et al.,
1994). Desta forma, a exploração de plantas de uso medicinal da flora nativa através da
3
extração direta nos ecossistemas tropicais (extrativismo) tem levado a reduções drásticas das
populações naturais dessas espécies, seja pelo processo predatório de exploração, seja pelo
desconhecimento dos mecanismos de perpetuação das mesmas. Assim, considerando-se o
valor das plantas medicinais não apenas como recurso terapêutico, mas também como fonte
de recursos econômicos, torna-se importante estabelecer linhas de ação voltadas para o
desenvolvimento de técnicas de manejo ou cultivo, tendo em vista a utilização dessas espécies
vegetais pelo homem aliada à manutenção do equilíbrio dos ecossistemas tropicais (REIS,
1996; SHELDON et al., 1997).
O cultivo de plantas medicinais envolve a possibilidade de domesticação da
espécie utilizada. O primeiro passo é a escolha das plantas que serão cultivadas, para que
sejam preparadas as condições necessárias para o bom desenvolvimento das mesmas. O
desconhecimento destas questões pode levar ao insucesso na obtenção dos príncipios ativos
de interesse pela não-adaptação da planta ao local de cultivo, ou mesmo à ausência de um
orgão, como a flor, que, em muitos casos, como o da camomila (Chamomolla recutita (L.)
Rausch.), é a parte da planta utilizada.
Em geral, as espécies apresentam épocas específicas em que contêm maior
quantidade de príncipio ativo no seu tecido, podendo esta variação ocorrer tanto no período de
um dia como em determinadas épocas do ano (MARTINS et al., 1995). Além disso deve-se
ter cuidado com o recipiente de coleta do material, bem como o modo correto de fazer esta
coleta. Cuidados com o material coletado, o local de secagem das plantas (Corrêa Júnior et al.,
1994), o período de armazenagem (Petrovick et al., 1997) são outros critérios que devem ser
observados.
Após a década de 60 houve um decréscimo no interesse e investimentos por parte
da indústria farmacêutica e institutos de pesquisa. Estes estariam relacionados com o lento
desenvolvimento e o alto custo para se obter os componentes ativos, devido aos processos
trabalhosos para a separação e purificação desses constituintes e a sua elucidação estrutural
(SARRET, 1979; KINGSTON, 1996).
Muitas das desvantagens apontadas para a busca de novos fármacos a partir de
produtos naturais estão sendo ultrapassadas através de avanços técnicos significativos,
principalmente a partir dos anos 80, tanto no desenvolvimento de métodos novos de
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screening, como nas técnicas de isolamento e elucidação estrutural. Os novos métodos de
screening permitem em pouco tempo a avaliação de um número elevado de amostras quanto à
atividade sobre alvos específicos, enzima, receptor, determinada célula do organismo.
Modelos desse tipo, por exemplo inibição da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase,
enzima chave na biogênese do colesterol, permitem a avaliação de milhares de amostras em
alguns dias (HOOK et al., 1997).
A tendência na terapêutica, desde a metade do século XIX, tem sido a utilização
de substâncias isoladas em substituição aos extrativos vegetais que apresentam alguma
propriedade terapêutica comprovada e tenham seus constituintes ativos identificados. Tal
posicionamento leva em consideração vantagens como o asseguramento da constância de
composição, ausência de qualquer outra substância ativa, além daquela determinante da
atividade e maior facilidade para o controle de qualidade, em relação aos produtos de
composição complexa e não conhecida completamente.
Isso pode ser exemplificado através das vantagens da utilização de quinina em
comparação com extratos de quina, cujo teor em quinina é variável de acordo com a região e
época de coleta da droga vegetal, além da presença de cerca de 30 outros alcalóides
minoritários, entre os quais a quinidina, de ação cardíaca marcante sendo, portanto, o
asseguramento e a manutenção da constância de composição e da qualidade da preparação
mais difícil, em relação com uma forma farmacêutica contendo exclusivamente quinina.
Por esta razão, no período entre o isolamento da quinina (1820) e o final do século
passado, estabeleceram-se na Europa 20 empresas para a produção da quinina. De forma
semelhante, ao longo do tempo, a utilização de extrativos vegetais oriundos de espécies de
Digitalis spp., Papaver ssp., Colchicum autumnale L., Atropa belladonna L., Rauvolfia
serpentina (L.) Benth. Ex Kurz, Pilocarpus jaborandi L., Psychotria ipecacuanha (Brot.)
Strokes (= Cephaelis ipecacuanha (Brot) A. Rich), entre outras, foi substituída em maior ou
menor grau pelo emprego das substâncias isoladas dessas plantas, como: digoxina/digitoxina,
morfina/codeína, colchicina, atropina, reserpina, pilocarpina e emetina, respectivamente
(SCHENKEL et al., 2003).
Produtos naturais têm sido tradicionalmente empregados na identificação de
receptores e na investigação de funções fisiológicas e patofisiológicas e sítios de ação de
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fármacos. Exemplos clássicos incluem nicotina, fisostigmina, muscarina, pilocarpina e
atropina no estudo de receptores nicotínicos e muscarínicos. Um exemplo mais recente inclui
os ésteres de forbol na compreensão do ciclo do fosfatidilinositol como mecanismo de
transdução celular (EVANS, 1993).
Inúmeras classes de diferentes produtos naturais têm sido empregadas como
matéria-prima para a síntese de diferentes substâncias bioativas. Derivados 4-hidróxi-
cumarínicos originaram o dicumarol, um anticoagulante descoberto pela indústria
farmacêutica Abbott e Lilly em 1945, que interfere na ação da vitamina K. Vários derivados
terpênicos têm sido empregados como matéria-prima em síntese, para a obtenção da
artemisinina, derivado sesquiterpênico com importantes propriedades antimaláricas (AVERY
et al., 1987; 1992).
A síntese do paclitaxel, derivado taxóide identificado em Taxus brevifolia Nutt.
(Wani et al., 1971) licenciado para o uso terapêutico contra o câncer, foi realizada por
Nicolaou e colaboradores a partir da acetilbacatina III (Nicolaou et al., 1994; Nicolaou;
Sorensen, 1996), representando um exemplo da importância dos produtos naturais na síntese
de fármacos (CORRÊA, 1995).
O emprego do safrol, principal componente químico do óleo de sassafrás, como
matéria-prima para síntese de compostos farmacologicamente úteis, forneceu novos análogos
de prostaglandinas, tromboxanos, agentes antiinflamatórios clássicos, nova classe de
substâncias candidatas a protótipo de inibidores seletivos de prostaglandina-endoperóxido
sintase-2 (PGHS-2) e de amidas naturais bioativas.
A importância histórica das substâncias ativas obtidas de plantas como protótipo
para o desenvolvimento de fármacos pode ser demonstrada no Quadro 1. A descoberta da
atividade dessas substâncias não representou apenas o surgimento de um grupo novo de
substâncias, mas originou a identificação de uma nova possibilidade de intervenção
terapêutica. Por exemplo, não se conheciam anestésicos locais, bloqueadores musculares,
anticolinérgicos, entre outras categorias terapêuticas, antes do isolamento e estudo da
atividade da cocaína, tubocurarina e atropina respectivamente. A terapêutica atual seria muito
deficiente, não tivesse ocorrido a descoberta dessas substâncias ativas (ROCHA; SILVA,
1973).
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QUADRO 1 – Fármacos protótipos de categorias terapêuticas, a partir de plantas
Gênero
Fármaco
Data do isolamento
Categoria Terapêutica
Digitalis
digitoxina
1785-1875
Cardiotônico
Papaver morfina 1805 Hipnoanalgésico
Cinchona quinina 1820 Antimalárico
Atropa atropina 1833 Anticolinérgico
Physostigmina fisostigmina 1864 Anticolinesterásico
Pilocarpus pilocarpina 1875 Colinérgico
Ephedra efedrina 1887 Adrenérgico
Erythroxylon cocaína 1895 anestésico local
Chondrodendrum tubocurarina 1895 Bloqueador neuromuscular
Claviceps ergotamina 1922 Bloqueador adrenérgico
Melilotus dicumarol 1941 Anticoagulante
Rauvolfia reserpina 1952 Neuroléptico
Fonte: Schenkel et al., 2003
Entretanto, compostos conhecidos há muito tempo vêm sendo re-investigados
quanto a novas propriedades, como se exemplifica pela realização de ensaios clínicos com a
fisostigmina e galantamina em doença de Alzheimer (SHU, 1998).
Isto foi possível com a pesquisa fitoquímica que tem por objetivos conhecer os
constituintes químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença. A primeira etapa da
investigação é a coleta do material vegetal. Os processos de fracionamento de extratos
vegetais com vistas ao isolamento de substâncias ativas podem ser monitorados por ensaios
direcionados para a avaliação da atividade biológica (DEY; HARBORNE, 1991). Nos últimos
anos, também vem sendo utilizado o monitoramento das frações por cromatografia líquida de
alta eficiência acoplada a espectrofotômetro ultravioleta e espectrofotômetro de massas
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(CLAE/UV/EM) ou de ressonância magnética nuclear (CLAE/RMN). Essa combinação
possibilita direcionar as operações de fracionamento para o isolamento daqueles compostos
considerados de maior interesse em função dos dados espectrais obtidos (HOSTETTMANN
et al., 1997).
Entre os métodos físicos de análise empregados atualmente na determinação
estrutural, a espectrometria de massas, a espectrometria no ultravioleta (UV), no visível e no
infravermelho, bem como a ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio e carbono
13 constituem os mais amplamente empregados.
Geralmente, é graças ao conjunto de dados espectrais que o pesquisador consegue
elucidar completamente a estrutura de uma substância desconhecida. Essas informações
servem também como instrumentos importantes para a avaliação da qualidade de
fitoterápicos, tanto do ponto de vista qualitativo como quantitativo.
É importante salientar que a ação farmacológica é altamente dependente das
especificações dos produtos empregados. Como um dos exemplos mais claros pode ser
considerado os produtos oriundos do ópio (látex dessecado dos frutos imaturos de Papaver
somniferum L.). O pó de ópio tem usos bem diferentes dos apresentados para a tintura de ópio
(antiespasmódico para a musculatura lisa) e mais ainda dos alcalóides isolados, tais como a
morfina (analgésico de ação no sistema nervoso central) e a codeína (antitussígeno). Este
aspecto revela de modo o mais evidente possível que, raramente, a uma planta medicinal
podem ser imputadas indicações terapêuticas. O efeito farmacológico está ligado diretamernte
ao modo de emprego, onde a planta medicinal deve ser vista como matéria-prima do remédio
ou medicamento. Especialmente as condições de produção podem alterar a concentração das
substâncias ativas e, por conseqüência, a eficácia e a segurança terapêuticas (SCHENKEL et
al., 2003).
Muito freqüentemente, a atividade de extrativos vegetais não é reproduzida pelas
substâncias ativas isoladas, sendo a sua ação determinada por mais de um componente do
extrato, que pode eventualmente atuar sobre os mesmos processos bioquímicos, mas pode
também contribuir de outras maneiras, modificando a solubilidade, alterando fenômenos de
absorção ou influindo sobre a estabilidade. Deve-se salientar ainda a situação paradoxal das
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plantas medicinais brasileiras, consideradas como altamente promissoras, mas das quais tão
pouco se conhece (SCHENKEL et al., 2003).
As potencialidades de uso de plantas medicinais encontram-se longe de estarem
esgotadas. Novos conhecimentos e novas necessidades certamente encontrarão no reino
vegetal, soluções através da descoberta e desenvolvimento de novas moléculas com atividade
terapêutica, ou com aplicações na tecnologia farmacêutica ou no desenvolvimento de
fitoterápicos com maior eficiência de ação (SCHENKEL et al., 2003).
Individualmente, a descoberta de novos fármacos, ou fármacos acessíveis, pode
determinar a melhoria da qualidade de vida em doenças crônicas ou a própria sobrevivência
do paciente afetado. Socialmente, a descoberta de fontes naturais e locais de compostos
químicos usualmente importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de fabrificação
nacional, podem ter conseqüências econômicas significativas, além de possibilitar autonomia
de cada país no gerenciamento de suas políticas de saúde.
A idéia primordial na indicação do uso de fitoterápicos na medicina humana não é
substituir medicamentos registrados e já comercializados, mas sim aumentar a opção
terapêutica dos profissionais de saúde ofertando medicamentos equivalentes, também
registrados, talvez mais baratos, com espectro de ação mais adequados e, com indicações
terapêuticas complementares às medicações existentes, mas sempre em estrita obediência aos
preceitos éticos que regem o emprego de xenobióticos na espécie humana.
A planta medicinal utilizada em medicamentos é um xenobiótico, isto é, um
produto estranho ao organismo humano, nele introduzido com finalidades terapêuticas. Como
todo corpo estranho, os produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e assim
devem ser encarados até prova em contrário. De fato, não há por que, a priori, considerar
inócua uma planta medicinal, se do reino vegetal são obtidas substâncias extremamente
tóxicas como a estricnina, a digoxina, os curares e os heterosídeos cianogênicos (LAPA et al.,
2003).
Do ponto de vista toxicológico, deve-se considerar que uma planta medicinal ou
um fitoterápico não tem somente efeitos imediatos e facilmente correlacionados com a sua
ingestão, mas lembrar, principalmente, os efeitos que se instalam a longo prazo e de forma
9
assintomática, como os carcinogênicos, hepatotóxicos e nefrotóxicos, a exemplo do que
ocorreu recentemente no Brasil com os extratos de confrei (Symphytum officinalle L.)
(HIRONO et al., 1978; ABBOT, 1988; YEONG et al., 1991, 1993; BRASIL, 1992). De forma
semelhante e tão importante é o caso do ácido aristolóquico encontrado em espécies de
Aristolochia (como, por exemplo, o cipó-mil-homens), usadas em casos de gota, artrites,
reumatismo e doenças inflamatórias crônicas de pele. Estudos mostram que a exposição a
esses ácidos tem resultado em um grande número de pacientes com deficiências renais
chegando a alguns casos de morte (EMEA, 2000).
Portanto, o uso popular, e mesmo o tradicional, não são suficientes para validar
eticamente as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as
plantas medicinais não se diferenciam de qualquer xenobiótico sintético e sua preconização,
ou a autorização oficial do seu uso medicamentoso, devem ser fundamentadas em evidências
experimentais comprobatórias de que o risco a que se expõem aqueles que a utilizam é
suplantado pelos benefícios que possam advir (BRASIL, 1995).
A avaliação dessa segurança, ou seja, a avaliação da relação risco/benefício, é a
finalidade dos estudos farmacodinâmicos e toxicológicos pré-clínicos e clínicos de
medicamentos. Progressos nesse sentido ocorreram nos últimos 40 anos, após o acidente com
a talidomida (Lenz, 1988) e, portanto, foram posteriores à época em que muitos fitoterápicos
foram introduzidos no mercado.
Na sua essência, esses estudos visam garantir o cumprimento dos preceitos éticos
enunciados pela Organização Médica Mundial em 1964 – Declaração de Helsinki – revistos e
atualizados em Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong-Kong (1989) e traduzidos com muitas
particularidades e detalhes nas Diretrizes Éticas Internacionais Para Investigação Biomédica
Envolvendo Seres Humanos propostas pelo Conselho das Organizações Internacionais de
Ciências Médicas e Organização Mundial de Saúde, em 1982, e publicadas em World Health
Organization – WHO (1993). No mesmo sentido, com a intenção declarada de estabelecer
normas aplicáveis globalmente na pesquisa biomédica em seres humanos e facilitar a
movimentação internacional de produtos farmacêuticos, a Organização Mundial de Saúde
propôs o estudo das Diretrizes para as Boas Práticas Clínicas (CGP) em ensaios de produtos
farmacêuticos (WHO, 1992).
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Praticamente todos os países do mundo adotaram a Declaração de Helsinki. No
Brasil, os quatro conceitos bioéticos básicos (autonomia, não maleficência, beneficiência e
justiça) foram incorporados à Resolução 1/1988 do Conselho Nacional de Saúde (CNS),
Ministério da Saúde (MS), posteriormente substituída pela Resolução 196/1996 (Brasil,
1996), que normatiza as pesquisas nessa área visando o aprimoramento do conhecimento
científico e à produção de insumos para o atendimento médico-hospitalar.
Para a finalidade desta exposição, os fitoterápicos, remédios vegetais, remédios
herbários, ou simplesmente plantas medicinais, sob qualquer forma ou processamento, serão
considerados como novos medicamentos para o uso na espécie humana.
A portaria 6/1995 da Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde,
reformulada pela Portaria 1029/1988 e finalmente substituída pela Resolução RDC ANVISA
17/2000, regulamenta as condições para registro de medicamentos fitoterápicos (BRASIL,
1995; 1998; 2000).
A legislação brasileira mencionada acima (Resolução 196/1996 do Conselho
Nacional de Saúde – MS) regulamenta as etapas das pesquisas pré-clínicas e clínicas para
avaliação e registro de novos medicamentos (LAPA et al, 2003).
1.2 Família Lauraceae
A família Lauraceae possui 32 gêneros e em torno de 2000-2500 espécies. São
árvores e arbustos encontrados nas florestas tropicais e subtropicais com casca, folhas verdes
e frutos. O gênero inclui Persea (150spp.), Ocotea (300-400 spp.), Cinnamomum (250 spp.),
Aniba (40 spp.), Litsea (400 spp.), Neolitsea (80 spp.), Lindera (100 spp.), Laurus (2 spp.) e
Cryptocarya (200-250 spp.) (EVANS, 1996).
Muitas espécies são usadas como madeira para construção, perfume e
condimento. Metabólitos secundários foram considerados de interesse fitoquímico
(GOTTLIEB, 1972; GOTTLIEB; YOSHIDA, 1989).
11
A família Lauraceae tem sido a mais estudada, destacando-se, entre outros, o
gênero da Ocotea (WARD, 1999).
1.3 Ocotea duckei Vattimo
A Ocotea duckei Vattimo é um vegetal de porte arbóreo pertencente à família
Lauraceae, conhecida popularmente como “louro de cheiro”, “louro pimenta” ou “louro-
canela”. É uma planta encontrada no nordeste brasileiro nos estados da Paraíba, Pernambuco,
Ceará, Sergipe e Bahia (Barreto, 1990) (Figuras 1 e 2).
As espécies do gênero Ocotea ocorrem em geral em florestas úmidas tropicais e
subtropicais. Quimicamente apresentam uma grande variedade de substâncias, cujos
principais metabólitos são monoterpenos, alcalóides, lignanas e neolignanas (ROMOFF et al.,
1984).
No estudo químico com as cascas do caule desse vegetal foram obtidas seis
lignanas furofurânicas identificadas como epi-de-O-metiliangambina, epivattimfurano,
sesartemina, sesamina, endesmina e iangambina (ALMEIDA et al., 1995).
12
FIGURA 1 – Folhas e flores da Ocotea duckei Vattimo
13
FIGURA 2 – Ocotea duckei Vattimo
14
1.4 Lignóides
As micromoléculas que apresentam na sua estrutura química apenas o grupo
fenilpropânico (C6-C3)n são denominados de lignóides. Essas micromoléculas subdividem-se
em lignanas, neolignanas, alolignanas, norlignanas, oligolignóides e heterolignóides
(HAWORTH, 1942; GOTTLIEB, 1978). Dentre esses lignóides, as lignanas, depois da
celulose, são as substâncias orgânicas mais abundantes nos vegetais (SANTOS, 2003).
As lignanas, neolignanas e seus análogos são micromoléculas resultantes do
metabolismo secundário e responsáveis por inúmeras atividades biológicas (ABREU, 1994).
O termo lignana é originado do latim lignum que significa madeira, lenho. Essas
micromoléculas são dímeros formados a partir do acoplamento oxidativo de álcoois
cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos (HAWORTH, 1942). A literatura relata
mais de 500 lignóides, destes, 90% pertence ao grupo das lignanas e neolignanas
(GOTTLIEB; YOSHIDA, 1989).
Os precursores primários dos lignóides, arilpropanóides, desenvolvem-se a partir
da fenilalanina ou da tirosina através da via redutora (NADP) gerando a formação de ácidos
cinâmicos, aldeídos cinâmicos e álcoois cinamílicos, portanto, quatro monômeros estão
envolvidos na biogênese dos lignóides: ácido cinâmico, ácido cinamílico, propenilfenóis e
alilfenóis. Desta maneira, a formação das lignanas pode ser explicada pelo acoplamento
oxidativo entre unidades monoméricas radicalares. Assim, o acoplamento oxidativo entre os
radicais (cinamoila e cinamila) seguidos da adição de um ou dois íons hidretos, adição de íon
hidreto mais hidroxila inter ou intramolecular e ciclização e aromatização, conduzem a vários
tipos de lignanas, tais como, hordatina, podofilotoxina e iangambina (BARBOSA-FILHO,
2003).
15
1.5 Iangambina
A iangambina é uma lignana furofurânica isolada da Ocotea duckei, que foi
originalmente isolada aproximadamente há 30 anos atrás (Massanet et al., 1989), e tem
também sido purificada de plantas brasileiras (De-QUEIROZ et al., 1991). Esta lignana foi
previamente isolada da Virola elongata bark por MacRae e Towers (1985) e este trabalho
serviu como referencial na identificação do mesmo composto isolado da Ocotea duckei. A
Figura 3 mostra a estrutura química da iangambina.
1.5.1 Características da iangambina
• Sólido incolor
• FM – C24H30O6
• PM = 446
• PF = 118 °C – 120 °C
FIGURA 3 - Estrutura química da iangambina
OMe
MeO
MeO
O
O
OMe
OMe
OMeHH
16
1.5.2 Propriedades farmacológicas da iangambina
O uso tradicional desta planta não é registrado na literatura, no entanto recentes
estudos farmacológicos com o constituinte maior isolado, a iangambina, mostram vários
efeitos biológicos (ALMEIDA et al., 1995).
Evidências indicam que a liberação endógena do PAF, por células ativadas em
situações patológicas tais como choque anafilático e séptico, está provavelmente envolvida no
colapso cardiovascular e morte súbita freqüêntemente observados nestas doenças (LEVI et al.,
1984; TERASHITA et al., 1992). Estudos realizados por Castro-Farias-Neto et al. (1995a),
mostraram que doses baixas de PAF administradas sistematicamente em coelhos induziram
um prejuízo, porém reversível, da função cardiovascular e alterações hematológicas
caracterizadas pela redução dose-dependente na pressão arterial, tanto quanto, pela presença
de leucopenia e trombocitopenia. Eles observaram que a administração de iangambina
provocou desvio paralelo para direita na curva dose-resposta da hipotensão arterial induzida
pelo PAF, sem reduzir a resposta máxima, sugerindo a existência de antagonismo competitivo
com o PAF. Esses estudos também mostraram que a iangambina é um antagonista seletivo aos
efeitos hipotensores induzidos pelo PAF i.v. nas ações cardiovasculares, desde que, não
bloqueou os efeitos de outros mediadores vasoativos tais como, acetilcolina, histamina e
serotonina. Iangambina mostrou seletividade em bloquear a trombocitopenia induzida pelo
PAF, no entanto a leucopenia permaneceu inalterada.
O choque anafilático representa a maior manifestação crítica de reações de
hipersensibilidade imediata. Os sinais clínicos das reações alérgicas podem variar desde
pruridos e urticária, a colapso cardiovascular e morte (BOCHNER; LICHTENSTEIN, 1991).
Alguns mediadores químicos, tais como, histamina, prostaglandinas, leucotrienos,
tromboxano A2 e PAF parecem estar envolvidos na patofisiologia do choque anafilático
(BAKATHIR et al., 1991). Estudos em modelo de choque anafilático em ratos anestesiados
mostram que, a iangambina, é um antagonista do PAF de origem natural que protege da morte
os animais e alivia o colapso cardiovascular causado pelo choque anafilático. Esses achados
caracterizam o PAF como um mediador letal nas reações de hipersensibilidade (RIBEIRO et
al.; 1996).
17
Estudos forneceram evidências farmacológicas que existem tipos diferentes de
receptores do PAF sobre as plaquetas e leucócitos polimorfonucleares (HWANG, 1988;
HWANG, 1990). A iangambina inibe a agregação plaquetária induzida pelo PAF, no entanto
falhou em inibir a agregação induzida pelo colágeno, ADP ou trombina, mostrando que a
lignana é um antagonista específico dos efeitos do PAF nas plaquetas. Esta lignana não inibiu
a quimiotaxia dos neutrófilos induzida pelo PAF, sugerindo que pode ter diferenças entre os
receptores expressos nas plaquetas e nos neutrófilos (CASTRO-FARIAS-NETO et al.,1995b).
O conceito de que o PAF parece contribuir na fase precoce do dano tecidual em
algumas reações alérgicas (Doebber et al., 1986) levou Serra et al. (1997) a examinarem o
potencial da iangambina como uma droga anti-anafilática. Neste estudo observaram a
interferência da iangambina na reação de hipersensibilidade imediata em três modelos,
incluindo o da pleurite alérgica, choque anafilático e contrações espasmogênicas de
segmentos jejunais. Os resultados destes estudos mostraram que a iangambina é um potente
inibidor da infiltração de neutrófilos e eosinófilos, mas não do exsudato, induzido pelo PAF
ou do antígeno na cavidade pleural de ratos. Além disso, ela impede a hemoconcentração,
trombocitopenia e leucocitose induzida pelo PAF e atenua, de forma significativa, a
trombocitopenia e anafilaxia associada a indução alérgica. Esta lignana também exerceu um
efeito supressor no recrutamento leucocitário elicitado pelo LTB4. Estes achados forneceram
evidências que a iangambina exibe propriedade antagonista não somente sobre os receptores
do PAF mas também sobre outros receptores, podendo ser uma importante ferramenta na
conduta de algumas doenças alérgicas (SERRA et al., 1997).
Almeida et al. (1995) avaliaram a possível ação analgésica da iangambina usando
diferentes metodologias tais como os testes de contorções abdominais, retirada da cauda e de
Randall e Selitto (1957). No primeiro modelo a iangambina apresentou uma redução
significativa no número de contorções abdominais induzidas por ácido acético, um teste que
envolve estímulo químico. O segundo teste foi feito através de um estímulo térmico e
apresenta uma maior especificidade para determinar atividade analgésica de substâncias que
agem a nível do sistema nervoso central (ROMOFF et al, 1984). No entanto, a iangambina
não apresentou efeito significativo durante a realização do mesmo. No teste de Randall e
Selitto, a iangambina não elevou o tempo de reação à dor, o que indicaria uma provavel ação
antinociceptiva de natureza periférica. Assim sendo, os autores concluíram que não poderiam
sugerir um efeito analgésico desta substância, entretanto não descartariam a possibilidade da
18
mesma atuar de forma semelhante a agentes anti-histamínicos, estimulantes centrais e
flavonas, que embora possam inibir as contorções abdominais, não possuem ação analgésica
(ICASAHARA; HIKINO, 1987).
Estudo com a finalidade de avaliar o potencial mutagênico da iangambina também
foi feito através do Ames test. Resultados negativos foram obtidos com o tratamento das
linhagens TA97a, TA100 e TA102 de Salmonella typhimurium com a iangambina, indicando
que a iangambina não foi mutagênica para as linhagens testadas mesmo na presença de
ativação metabólica (MARQUES, et al. 2003).
Pachú et al. (1990) através do estudo da toxicidade aguda puderam verificar as
doses tóxicas da iangambina e proceder, a determinação da dose letal 50 % (DL50). Eles
observaram que o efeito letal da iangambina até 48 horas após o tratamento agudo por via
intraperitoneal em camundongos, não ocorreu até a dose de 1 g/kg.
Estudos farmacológicos sugeriram que a iangambina, possui atividade depressora
do sistema nervoso central, havendo possibilidade de atuar como anticonvulsivante e
hipnótico-sedativo (PACHÚ et al., 1990).
1.6 Sistema dopaminérgico
A dopamina pertence ao grupo de neurotransmissores chamado de catecolaminas.
As características estruturais dessas monoaminas são a presença de um único grupamento
amina, um núcleo de catecol (um anel benzeno com dois gupos de hidroxilas adjacentes) e
uma cadeia lateral de etilamina ou um de seus derivados (FELDMAN et al., 1997).
O precursor para a síntese da dopamina é o aminoácido tirosina. Duas reações
transformam a tirosina em dopamina: a primeira é catalisada pela enzima tirosina-hidroxilase
(TH) a qual converte tirosina em L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). A tirosina-
hidroxilase é considerada a enzima limitante desta via (FELDMAN et al., 1997). O segundo
passo é a descarboxilação da DOPA, catalisada pela enzima L-aminoácido descarboxilase
(AADC), a qual produz dopamina (FELDMAN et al., 1997).
19
A dopamina constitui em torno de 80% do conteúdo de catecolaminas no cérebro.
Projeções originadas de áreas cerebrais que sintetizam este neurotransmissor se estendem para
regiões do mesencéfalo formando quatro vias dopaminérgicas: (1) nigroestriatal; (2)
mesolímbica; (3) mesocortical e (4) tuberoinfundibular (Figura 4).
O sistema nigroestriatal compreende os neurônios dopaminérgicos que se
originam da substância negra pars compacta e terminam na região chamada de corpo estriado
dorsal. Esta região, inclui o núcleo caudado e putamen. A via nigroestriatal esta envolvida no
controle dos movimentos e a sua degeneração causa a doença de Parkinson, caracterizada por
tremor de repouso, rigidez e bradicinesia (GERFEN, 1992; LANG; LOZANO, 1998a).
A via mesocortical tem origem na área tegumentar ventral (ATV) e inerva
diferentes regiões do cortex frontal. Esta via parece estar envolvida em alguns aspectos do
aprendizado e memória (LE MOAL; SIMON, 1991; FELDMAN et al., 1997).
A via mesolímbica é originada do mesencéfalo na área tegumentar ventral e
inerva o estriado ventral (nucleus accumbens), o tubérculo olfatório (TO) e parte do sistema
límbico (FELDMAN et al., 1997). Esta via está implicada com o comportamento
motivacional (KOOB; BLOOM, 1988; KOOB, 1992).
A via tuberoinfundibular origina-se das células do núcleo periventricular e
arqueado do hipotálamo (FELDMAN et al., 1997). Projeção desta via atinge a eminência
mediana do hipotálamo onde libera dopamina no espaço perivascular do plexo capilar do
sistema porta hipotalâmico-hipofisário. Daí a dopamina é transportada para a pituitária
anterior onde atua sobre o lactótrofo para inibir a liberação da prolactina. Este hormônio
estimula a produção do leite na glândula mamária (Feldman et al., 1997; Doppler, 1994) e
estimula a proliferação de lactótrofo por um mecânismo autócrino na glândula pituitária
(SAIARDI et al., 1997).
20
Fonte: Rang et al., 2004
FIGURA 4 – Vias dopaminérgicas no cérebro.
1.6.1 Receptores dopaminérgicos
A dopamina exerce sua ação pela ligação a receptores de membrana específicos
(Gingrich; Caron, 1993), os quais pertencem a família de receptores ligados à proteína G
(guanina nucleotídeo) com 7 domínios transmembranas.
Cinco distintos receptores dopaminérgicos foram isolados, caracterizados e
subdivididos em duas sub-famílias, D1- e D2-símile, com base em suas propriedades
bioquímicas e farmacológicas (Quadro 2).
A sub-família D1-símile compreende os receptores D1- e D5-, enquanto o D2-
símile inclui os receptores D2-, D3- e D4-. O C-terminal de ambas sub-famílias contém locais
de fosforilação e esterificação, os quais parecem estar envolvidos na dessenssibilização do
receptor (BATES et al., 1991; NG et al, 1994). Ligantes dopaminérgicos facilmente
distinguem os receptores das sub-famílias D1- e D2-símile. Entretanto, a maioria deles não
diferencia claramente entre os membros da mesma sub-família. Por exemplo, o antagonista do
receptor D1, SCH-23390, ou o agonista SKF-38393 tem afinidade semelhante para ambos
receptores D1- e D5. A seletividade farmacológica destes compostos tem ainda de ser
determinada em animais vivos. Para esta finalidade o uso de animais knock-out de um
21
receptor em particular será de grande ajuda na definição da seletividade de um composto
particular para um receptor específico.
QUADRO 2 – Receptores de dopamina
Distribuição
Papel Funcional
Tipo D1 Tipo D2
D1 D5 D2 D3 D4
Córtex
Reatividade, Humor
+++
−
++
−
+
Sistema límbico Emoção, Comportamento Estereotipado
+++ + ++ +
Estriado Controle motor
+++ + ++ + +
Hipotálamo ventral e adeno-hipófise
Secreção de prolactina − − ++ + −
Transdução de sinais
↑AMPc ↑AMPc ↓AMPc e/ou ↑IP3
↓AMPc e/ou ↑IP3
↓AMPc e/ou ↑IP3
IP3 – trifosfato de inositol Fonte: Rang et al., 2004
1.6.2 Expressão dos receptores dopaminérgicos
Os gens dos receptores dopaminérgicos D1- e D2 possuem uma maior distribuição
e apresentam maiores níveis de expressão. O receptor D1 é principalmente expresso no
caudado-putamen, núcleo accumbens, tubérculo olfatório, córtex cerebral (JACKSON;
WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Os receptores D1 também foram detectados na ilha de
Calleja e no núcleo sub-talâmico (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Na
substância negra pars reticulata não foi detectado nenhum RNAm para o receptor D1, embora
tenha sido mostrado a ligação de ligantes específicos para este receptor nesta região. Isto
sugere que o receptor D1 é sintetizado no neurônio estriatal que envia suas projeções para a
substância negra através da via nigroestriatal (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON,
1994).
22
O gen do receptor D5 tem um padrão de expressão mais restrito quando
comparado com o receptor D1. A expressão deste receptor foi detectada no hipocampo, núcleo
mamilar lateral e no núcleo parafascicular do tálamo (JACKSON; WESTLIND-
DANIELSSON, 1994).
O receptor D2 é expresso predominantemente nos tecidos cerebrais, tais como o
caudado putamen, tubérculo olfatório e núcleus accumbens. Este receptor é também expresso
na substância negra pars compacta e na área tegumentar ventral. Estas são as regiões
anatômicas que originam as fibras dopaminérgicas, indicando que os receptores D2 têm uma
localização pré-sináptica. Em contraste, os receptores D1-símile são receptores
exclusivamente pós-sinápticos (CIVELLI et al., 1991). Além do cérebro os receptores D2
estão também localizados na retina, fígado, sistema vascular e glândula pituitária (NG et al,
1994, JACKSON;WESTLIND-DANIELSSON, 1994; PICETTI et al., 1997).
A distribuição neuroanatômica do RNAm do receptor D3 no cérebro de ratos é
restrita a poucas regiões cerebrais tais como a ilha de Calleja, um pouco do núcleo septal,
hipotálamo e regiões distintas do tálamo e cerebelo (JACKSON; WESTLIND-
DANIELSSON, 1994). Além disso, o receptor D3 está também localizado na substância negra
pars compacta indicando localização pré-sináptica.
O receptor D4 parece estar altamente expresso no córtex frontal, amígdala, bulbo
olfatório, hipocampo, hipotálamo e mesencefálo (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON,
1994).
1.6.3 Vias de transdução de sinal
As vias de transdução de sinal ativadas pelos receptores dopaminérgicos são
numerosas. Entretanto os efeitos mais descritos mediados pela dopamina são a ativação ou
inibição da via do AMPc e a modulação da atividade de canais.
A estimulação de efetores celulares originados de receptores dopaminérgicos é
mediada via interação com membros de proteínas regulatórias heterotriméricas ligadas ao
GTP (proteína G) (HEPLER; GILMAN, 1992). A região da terceira alça intracelular dos
23
diferentes receptores dopaminérgicos tem um papel central na interação com a proteína G
(STRADER et al., 1989).
1.6.3.1 Adenilato ciclase
Receptores do sub-tipo D1-símile são reguladores dos níveis de AMPc
(MONSMA-JR et al., 1990; SUNAHARA et al.,1991; JACKSON; WESTLIND-
DANIELSSON, 1994). A estimulação destes receptores resulta na ativação da proteína kinase
A (PKA). A PKA fosforila proteínas citoplasmáticas e nucleares e regula o metabolismo
celular, incluindo a função de canais iônicos e também dessenssibiliza a proteína G ligada aos
receptores, levando a uma resposta celular para liberar o neurotransmissor (CHOI et al., 1993;
HOFMANN et al., 1994).
A inibição da atividade da adenilato ciclase, entretanto, parece ser uma
propriedade geral dos receptores D2-símile. O receptor D2 foi primeiro caracterizado como um
inibidor dos níveis de AMPc intracelular na glândula pituitária, e nas células estriatais. O
receptor D2 desencadeia a inibição da adenilato ciclase por acoplamento de vias sinalizadas
bloqueadas pela toxina pertussis (GINGRICH; CARON, 1993; JACKSON; WESTLIND-
DANIELSSON, 1994). Similarmente ao receptor D2, o receptor D3 é descrito como um
inibidor dos níveis de AMPc endógeno em vários tipos celulares (JACKSON; WESTLIND-
DANIELSSON, 1994; ROBINSON; CARON, 1997; MISSALE et al., 1998). Entretanto, o
receptor D3 parece inibir a adenilato ciclase com menos eficiência que o receptor D2
(MISSALE et al., 1998). A literatura também relata que o receptor D4 pode inibir o acúmulo
de AMPc na retina e em uma variedade de tipos celulares (MISSALE et al., 1998).
1.6.3.2 Canais de cálcio e potássio
A estimulação do receptor D1 aumenta a corrente dos canais de Ca2+ do tipo L e
leva a redução da corrente nos canais de Ca2+ do tipo N e P em neurônios neoestriatais de
ratos, via uma ação direta ou indireta da PKA (MISSALE et al., 1998). De modo oposto, em
células glomerulares da adrenal em ratos, o receptor D1 inibe a corrente dos canais de Ca2+ do
tipo T (DROLET et al., 1997). Os receptores D1 podem também mobilizar os estoques de
24
Ca2+ intracelulares pela ativação da via do AMPc sem ativar a hidrólise do fosfoinositídeo
(MISSALE et al., 1998).
Os receptores D2 podem diretamente modular vários efetores diferentes pela
ligação da subunidade α da proteína Gi (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).
Além disso, via proteína Gi, o receptor D2 reduz a corrente de canais de Ca2+ do tipo N em
interneurônios colinérgicos neoestriatais em ratos (Yan et al., 1997) e medeia a inibição da
atividade de Ca2+ nos melanótrofos (TARASKEVICH; DOUGLAS, 1990).
A modulação do receptor D2 na concentração do Ca2+ intracelular pode ter um
papel importante na biossíntese da dopamina, visto que os receptores D2 têm localização tanto
pré como pós-sináptica. De fato a tirosina-hidroxilase, a enzima que limita a taxa de produção
da dopamina, é ativada pela Ca2+/calmodulina dependente de proteína-quinase (Braun;
Schulman, 1995) e a Ca2+/calmodulina dependente de proteína-quinase é subsenqüêntemente
ativada por Ca2+ ligado a calmodulina (CHOI et al., 1993).
Existem trabalhos conflitantes reportando que os receptores D1-símile são capazes
de aumentar ou diminuir o efluxo de potássio. De fato foi demonstrado que os agonistas D1-
símile aumentam a corrente de potássio em células de retina de galinha via um mecanismo
independente de AMPc, mas inibem este efluxo em neurônios estriatais de ratos (MISSALE
et al., 1998). Correntes de potássio em vários tecidos neurais, tais como o estriado, neurônios
dopaminérgicos mesencefálicos, lactótrofos e melanótrofos são regulados pela ativação dos
receptores D2 (SUNAHARA et al., 1991; JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).
1.6.4 Funções da dopamina
A importância da dopamina no controle dos movimentos é demonstrada em
condições patológicas tais como a doença de Parkinson. De fato esta doença é caracterizada
pela redução da dopamina circulante devido à degeneração de neurônios dopaminérgicos
(LANG; LOZANO, 1998a, 1998b). A disponibilidade de agonistas e antagonistas permitiu
estudos, os quais indicam o papel dos receptores dopaminérgicos nas funções motoras tais
como locomoção, rearing, catalepsia, sniffing e grooming em camundongos e ratos.
Geralmente, agonistas aumentam a função dopaminérgica, aumentando a atividade motora,
25
enquanto os antagonistas possuem efeito oposto. A administração sistêmica do agonista do
receptor D1, SKF-38393, em ratos aumenta o grooming e o sniffing, mas não aumenta
significantemente a locomoção ou outros comportamentos estereotiopados (JACKSON;
WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Entretanto, a infusão direta deste agonista dentro do
núcleo accumbens também afeta a locomoção, rearing e a estereotipia de maneira dose-
dependente (MEYER et al., 1993a). De forma oposta, a injeção de antagonistas dos receptores
D1, tais como SCH-23390 ou SKF-83566 reduzem os mesmos comportamentos, de maneira
dose e tempo-dependente (MEYER et al., 1993b).
As administrações de baixas doses de agonistas dos receptores D2 causam uma
redução das funções motoras, provavelmente pela estimulação dos receptores pré-sinápticos.
Isto leva a uma redução do disparo das células dopaminérgicas e liberação de dopamina
(JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994). A injeção de antagonistas dos receptores
D2, tanto quanto antagonistas dos receptores D1, diminuem a atividade motora. Quando altas
doses destes compostos são administradas, o animal torna-se cataléptico, mantendo uma
posição anormal por um período de tempo (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994;
FELDMAN et al., 1997). Um achado interessante consiste no efeito sinérgico entre os
receptores D1 e D2, desde que estereotipia induzida pela administração de agonistas dos
receptores D1 e D2 juntos são mais intensas que aquelas produzidas por um dos agonistas
sozinho (JACKSON;WESTLIND-DANIELSSON, 1994; FELDMAN et al., 1997).
A geração de camundongos modificados geneticamente para os diferentes
componentes das vias dopaminérgicas constitui uma poderosa ferramenta para estudar o papel
dessas proteínas in vivo. Análise comportamental de animais mutantes para quatro receptores
dopaminérgicos (D1-D4) mostrou que cada um apresenta um fenótipo locomotor.
Inesperadamente, em contraposição aos prognósticos feitos a partir de análises
farmacológicas, a locomoção em animais knock-out de receptores D1 não é afetada (Drago et
al., 1994), nem tão pouco a sua linha de base aumenta, quando comparado aos animais
normais (XU et al., 1994). Estes resultados confirmam dados anteriores sugerindo uma
interação mais complexa entre os diferentes tipos de receptores dopaminérgicos na regulação
dos movimentos voluntários, especialmente com respeito à interação dos receptores D1 e D2.
26
O estudo do comportamento locomotor de camundongo Knock-out para o receptor
D2 claramente revelou um impedimento motor no camundongo mutante (BAIK et al., 1995).
O impedimento é caracterizado pelos movimentos reduzidos e não-coordenados e também na
supressão de rearings.
Mutantes de receptores D3 e D4 também mostraram fenótipo locomotor anormal.
Mutantes do receptor D3 apresentaram um fenótipo hiperlocomotor o qual está de acordo com
os resultados obtidos pelos estudos farmacológicos usando agonistas (Feldman et al., 1997) e
antagonistas (Accili et al., 1996) de receptores D3. Surpreendentemente, a locomoção em
mutantes dos receptores D4 foi também afetada, e em particular é reduzida, apesar do que tem
sido predito da expressão anatômica deste receptor (SVENSSON et al., 1994; RUBINSTEIN
et al., 1997).
1.7 Sistema colinérgico
A acetilcolina representa a classe de neurotransmissores do sistema nervoso
parassimpático, ambos em nível de transmissão ganglionar e nas junções neuroefetoras
(BARNES, 1987; ANDERSON; GRUNDSTROM, 1987; UNDEM; MYERS,1997).
Como neurotransmissor a acetilcolina é sintetizada nas terminações nervosas pela
enzima colina acetiltransferase, usando Acetil-CoA e colina como substratos. A aceticolina é
então acumulada em vesículas sinápticas. Eventualmente, o influxo de cálcio induz
despolarização gerando a liberação exocitótica do neurotransmissor dentro do espaço
extracelular. Aí, a acetilcolina pode interagir com os receptores localizados sobre as células
alvo (pós-sinápticos ou receptores pós-juncionais) tanto quanto sobre os seus próprios
terminais nervosos colinérgicos (pré-sinápticos ou auto-receptores pré-juncionais). A ação da
aceticolina é finalizada pela aceticolinesterase, a qual está altamente expressa nas adjacências
dos nervos colinérgicos, ambos pré- e pós-juncionais (CANNING; FISCHER, 1997).
Recentes estudos, em particular o de Wessler et al. (2001), demonstraram
claramente que a colina acetiltransferase e o seu produto acetilcolina, estão presentes em uma
grande extensão de células não-neuronais, incluindo células epiteliais e endoteliais, células do
músculo liso, tanto quanto, várias células do sistema imune, tais como linfócitos, macrofágos,
27
eosinófilos e neutrófilos (KLAPPROTH et al., 1997; WESSLER et al., 1999). Comparada à
situação nos nervos, onde a acetilcolina é estocada em vesículas, está faltando um mecanismo
de estoque particular para a acetilcolina, nas células não-neuronais. Todavia, existe uma boa
evidência de que a acetilcolina pode também ser liberada de células não-neuronais. Por
exemplo, a liberação de acetilcolina foi demonstrada em diferentes preparações de células
epiteliais (WESSLER et al., 1999). Entretanto o mecanismo de liberação de células não-
neuronais é completamente diferente do observado nas terminações nervosas. Usando
placenta humana como modelo para estudo in vitro da liberação de acetilcolina não neuronal,
evidências mostram que a acetilcolina é expelida de células não-neuronais via transporte ativo
mediado por membros da família transportadora de cátion orgânico (WESSLER et al., 2001).
Embora existam especulações substanciais a respeito do papel funcional da aceticolina não-
neuronal (Wessler et al., 1998; Wessler et al., 1999), dados limitados foram elaborados para
apoiar a função específica desta acetilcolina. Uma contribuição no controle da adesão celular
epitelial, interações célula-célula, e na proliferação, parece ser a mais documentada, tendo
portanto, um papel na regulação da integridade da camada epitelial.
Os neurônios colinérgicos possuem um papel central no controle da atividade
estriatal via receptores muscarínicos (BERNARD et al., 1993). Infelizmente poucos estudos
existem que elaborem tal regulação muscarínica, especialmente visando interações entre
acetilcolina e aminoácidos. De qualquer modo, o conhecimento dos subtipos de receptores
muscarínicos sobre os terminais nervosos estriatais liberando os principais transmissores
inibitórios e excitatórios do cérebro deveriam ser explorados do ponto de vista terapêutico em
algumas desordens do movimento e na doença de Alzheimer (SUGITA et al., 1991). Um
estudo usando fatias de estriado e superfusão local no estriado de ratos anestesiados indicou
que os receptores colinérgicos controlam a atividade de liberação do glutamato corticoestriatal
via um mecanismo de feed-back negativo (GODUKHIN et al., 1984). Realmente, foi
demonstrado que o glutamato parece ativar os interneurônios colinérgicos (Kawaguchi et al.,
1995), levando a liberação da acetilcolina (Giovannini et al., 1994), a qual diminui a liberação
do glutamato via receptores muscarínicos pré-sinápticos e receptores nicotinícos sensíveis nos
interneurônios estriatais (Godukhin et al., 1984) (Figura 5). A liberação espontânea de
GABA endógeno foi elevada quando oxotremorina, um agonista muscarínico não-seletivo, foi
administrada em estriado de rato, aparentemente por intermédio de uma facilitação
muscarínica (van der HEYDER et al., 1980). Registros intracelulares realizados em neurônios
estriatais in vitro demonstraram que a muscarina e aceticolina inibiram a liberação do GABA
28
e do aminoácido excitatório (SUGITA et al., 1991). Dois estudos de microdiálise, em ratos
movimentando-se livremente, levaram a conclusão de que a ativação de receptores
muscarínicos M1 eleva e que a dos receptores M2 inibe a liberação da dopamina no estriado
desses animais (XU et al., 1989; DE KLIPPEL et al., 1993).
Fonte: Rang et al., 2004
FIGURA 5 – Vias da acetilcolina no cérebro
1.7.1 Receptores colinérgicos
A acetilcolina pode atuar através de duas classes diferentes de receptores, os
receptores nicotínicos e muscarínicos.
1.7.1.1 Receptores nicotínicos
Os receptores nicotínicos estão ligados a canais iônicos e sua ativação usualmente
causa um influxo de íons de carga positiva resultando na despolarização da membrana, a qual
pode ser detectada, por exemplo, como “potencial excitatório pós-sináptico” em neurônios
pós-ganglionares. Receptores nicotínicos são formados por cinco sub-unidades homólogas ou
29
idênticas organizadas formando um íon de canal central (CONTI-TRONCONI et al., 1994;
LINDSTRON, 2000). Existem múltiplas isoformas de receptores nicotínicos. Receptores
nicotínicos musculares, localizados na placa terminal das junções neuromuscular são
formados de duas subunidades α, uma β, uma γ e uma δ, embora os receptores nicotínicos
neuronais parecem ser compostos de somente dois tipos diferentes de subunidades (α e β) ou
de cinco subunidades α. Pelo menos dez diferentes subunidades α e quatro β foram
identificadas até o momento e os neurônios expressaram α2-10 e β2-4 (CONTI-TRONCONI et
al., 1994; SGARD et al., 2002). Dependendo da composição da subunidade, os receptores
nicotínicos mostram diferentes cinéticas de ativação e inativação e variadas propriedades
farmacológicas.
1.7.1.2 Receptores muscarínicos
Os receptores muscarínicos da acetilcolina medeiam a maioria das ações do
neurotransmissor acetilcolina no sistema nervoso central e no sistema nervoso periférico
assim como em orgãos de terminações nervosas parassimpáticas. Em mamíferos, cinco
distintos subtipos de receptores muscarínicos (M1-M5) foram identificados, com cada subtipo
de receptor sendo produto de um gen diferente (Quadro 3). Os receptores muscarínicos
pertencem à superfamília de receptores de sete segmentos transmembranas, os quais ativam
vias de transdução de sinais através de sua interação com o nucleotídeo guanina ligados a uma
proteína heterotrimérica regulatória (proteína G). Os subtipos de receptores M1, M3 e M5 são
eficientemente ligados à toxina pertussis através de subtipos de proteína Gαq/11 e Gα13,
levando por exemplo, a ativação da fosfolipase C e fosfolipase D, enquanto os receptores M2
e M4 ligam-se preferencialmente a toxina pertussis ativando proteínas Gi e Go, levando a
inibição da adenilato ciclase (CAULFIELD, 1993; RÜMENAPP et al., 2001).
Os diferentes subtipos de receptores muscarínicos mostram único mas não
exclusivo, modelo de expressão no sistema nervoso central e orgãos periféricos, tais como o
coração, glândulas exócrinas e tecidos musculares lisos (LEVEY et al., 1991, CAULFIELD,
1993). Estudos em camundongos geneticamente modificados faltando um dos subtipos de
receptores muscarínicos tem identificado importantes, mas desconhecidas, funções de vários
subtipos de receptores no sistema nervoso central e sistema nervoso periférico. Por exemplo,
30
os receptores muscarínicos M1 no sistema nervoso central são os principais mediadores da
ativação da MAP-quinase induzida pela acetilcolina, um processo essencial para a memória
(HAMILTON et al., 1997; HAMILTON; NATHANSON, 2001). A deficiência do receptor
M1 também leva a uma significante elevação da transmissão dopaminérgica no estriado e um
enorme aumento da atividade locomotora (GERBER et al., 2001; MIYAKAWA, 2001). Além
disso, a deficiência de receptores M1 em camundongos apresenta um aumento da resposta
para os efeitos estimulatórios da anfetamina (GERBER et al., 2001).
Os receptores muscarínicos do subtipo M2 contribuem para a mediação da
antinocicepção central, e os camundongos knockout para este receptor mostram interrupção
do tremor induzido pelo agonista e atenuação da hipotermia induzida pelo agonista
(GOMEZA et al., 1999a). Além do mais, os receptores muscarínicos M2, são essenciais para a
bradicardia dependente deste receptor e contribuem, embora somente em pequena extensão,
para a contração induzida na base do estômago, bexiga urinária e traquéia (STENGEL et al.,
2000).
Os receptores muscarínicos do subtipo M3 têm um papel chave na secreção
salivar, contração da pupila e contração do músculo detrusor da bexiga em camundongos
(MATSUI et al., 2000). De forma importante os receptores M3 estão envolvidos na regulação
da ingestão da comida e apetite: camundongos deficientes para este tipo de receptor
apresentam uma significante redução na ingesta de alimentos, redução do peso corporal e dos
depósitos de gordura periférica (YAMADA et al., 2001b).
Como os receptores muscarínicos M1, os receptores M4, no cérebro, estão
envolvidos na modulação da resposta dopaminérgica central: camundongos com deficiência
de receptores M4 mostram um aumento na atividade locomotora basal e uma grande elevação
na resposta locomotora após ativação de receptores dopaminégicos D1 (GOMEZA et al.,
1999b). Os receptores M4, entretanto, parecem possuir um papel insignificante na regulação
do tônus da musculatura lisa periférica (STENGEL et al., 2000).
Finalmente, os receptores muscarínicos da acetilcolina do subtipo M5 facilitam a
liberação da dopamina induzida pelos receptores muscarínicos no estriado e modulam em
ambos processos de recompensa e retirada da morfina (BASILE et al., 2002). Além disso, os
31
receptores M5 são requisitados na dilatação colinérgica de artérias e arteriolas sangüíneas
cerebrais (YAMADA et al., 2001a).
Um aspecto geral dos receptores muscarínicos e de outros receptores ligados à
proteína G é que eles são altamente regulados. Progressos impressionantes têm sido feitos no
entendimento do mecanismo molecular que regula os sinais dos receptores muscarínicos.
Como os receptores muscarínicos são largamente considerados como modelo para outros
receptores ligados a proteína G, especialmente aqueles ligados às proteínas Gαi e Gαq/11, este
conhecimento aplica-se a um grande número de outros receptores ligados à proteína G.
QUADRO 3 - Subtipos muscarínicos de receptores da acetilcolina
Receptor Principais localizações
Resposta celular Resposta funcional
M1 SNC: córtex, hipocampo Glândulas: gástrica, salivares, etc.
↑ IP3, DAG Despolarização
Excitação (peps lento)
↑ condutância do K+
Excitação do SNC (?memória) Secreção gástrica
M2 Coração: átrios Músculo liso: TGI SNC: ampla distribuição
↓AMPc ↓ Condutância do Ca++
↑ Condutância do K+
Inibição cardíaca Inibição neural Efeitos muscarínicos centrais (tremor e hipotermia)
M3 Glândulas exócrinas: gástricas, salivares, etc. Músculo liso: trato GI, olho Vasos sangüíneos: endotélio
↑ IP3
↑ [Ca++]i Secreção gástrica, salivar Contração do músculo liso GI Acomodação ocular Vasodilatação
M4 ? Pulmão SNC: corpo estriado
Igual ao M2 Aumento da locomoção
M5 SNC: expressão muito localizada na substância negra Glândulas salivares Íris/ músculo ciliar
Igual ao M3 Desconhecida
Fonte: Rang et al., 2004
IP3- trifosfato de inositol; DAG – diacilglicerol; GI- gastrintestinal
32
1.7.2 Regulação do receptor muscarínico da acetilcolina
Embora a acetilcolina seja rapidamente hidrolisada depois de liberada, a
dessenssibilização dos receptores muscarínicos ocorre abaixo das condições fisiológicas assim
como os nervos vagais são tonicamente ativos no animal intacto. Além do mais, a
administração in vivo de antagonistas dos receptores muscarínicos bloqueando a liberação da
acetilcolina ou induzindo o estado de inatividade do receptor muscarínico pode evocar up-
regulation deste receptor (WALL et al., 1992; WITT-ENDERBY et al., 1995). Assim como
ocorre com um grande número de receptores ligados a proteína G, a dessenssibilização
induzida por agonistas dos receptores muscarínicos usualmente envolve fosforilação do
receptor (KWATRA; HOSEY, 1986; HAGA; HAGA, 1990). Esta modificação do receptor
ocorre sobre os resíduos de serina ou treonina na terceira alça citoplasmática e no C-terminal
dos receptores muscarínicos da aceticolina.
1.8 Sistema serotonérgico
Desde a sua descoberta há mais de 50 anos atrás, a serotonina tem provado ser um
dos maiores neuromediadores centrais, tanto do ponto de vista filogenético como
ontogenético. Seu papel como neurotransmissor foi demonstrado em uma grande variedade de
invertebrados e vertebrados, enquanto as funções morfogenéticas da serotonina surgem muito
cedo durante o desenvolvimento cerebral (LAUDER; KREBS, 1978). Além disso, a
serotonina não é restrita ao sistema nervoso central. Os neurônios serotonérgicos têm um
papel importante na inervação entérica, e a serotonina pode ser estocada e liberada dos assim
chamados paraneurônios e plaquetas sangüíneas. A profusa distribuição dos terminais
contendo serotonina contrasta com a limitada e discreta localização de suas células corporais
correspondentes, localizadas principalmente nos núcleos da rafe. Esta ampla distribuição da
inervação serotonérgica explica a variedade de funções nas quais a serotonina está envolvida,
incluindo o ciclo sono-vigília, controle do humor, controle sexual e alimentar,
termoregulação, controle da dor etc. Além do mais, disfunções serotonérgicas foram
reportadas em numerosos processos neuropatológicos tais como desordens do sono, ansiedade
e depressão, agressividade, bulimia e anorexia, tanto quanto nas condições
33
neurodegenerativas incluindo as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington (VERGÉ;
CALAS, 2000).
Os neurônios contendo serotonina originam-se no mesencefálo no núcleo da rafe e
inervam a substância negra e a área tegmentar ventral. Estudos neuroanatômicos mostram
uma alta densidade de fibras serotonérgicas imunoreativas na substância negra pars compacta,
pars reticulata e área tegmentar ventral (HERVÉ et al., 1987; MOUKHLES et al., 1997).
Interessantemente, o tegmento ventral mesencefálico incluindo a substância negra contém
altas concentrações de serotonina, e ambas, substância negra pars compacta e reticulata,
recebem uma densa contribuição serotonérgica, a qual é maior na substância negra reticulata
(9x106 varicosidade/mm3) que na pars compacta (6x106 varicosidade/mm3) (MOUKHLES et
al., 1997). Áreas terminais de substância negra pars compacta e área tegmentar ventral, tais
como o estriado ou o núcleo accumbens, recebem uma contribuição de neurônios
serotonérgicos originados no núcleo da rafe (Azmitia; Segal, 1978) (Figura 6). Vários
subtipos de receptores serotonérgicos estão presentes nos gânglios basais. Uma alta densidade
de receptores 5-HT1B foram encontrados na substância negra, área tegmentar ventral, globus
pallidus e núcleo entopenducular (PAZOS; PALACIOS, 1985; BARNES; SHARP, 1999). Em
contraste, locais de ligação dos receptore 5-HT1A e RNAm codificando o receptor 5-HT1A são
detectados nos gânglios basais (BARNES; SHARP, 1999). Por outro lado, de alto a moderado
níveis de receptores 5-HT2A e 5-HT2C e o RNAm correspondente estão presentes em várias
áreas do prosencéfalo incluindo o gânglio basal e o sistema límbico.
O entendimento da função da neurotransmissão dentro de áreas do sistema
nervoso onde ela tem sido localizada também requer a identificação do seu alvo e os
mecanismos de transduções associados aos receptores. A história dos receptores
serotonérgicos começou com o trabalho de Gaddum e Picarelli (1957) que definiu dois
subtipos de receptores 5-HT, chamados D e M baseado no bloqueio destes receptores pela
dibenzilina ou morfina, respectivamente. O desenvolvimento de ensaios de binding usando
radioligante e a progressiva disponibilidade de ligantes seletivos, tornou possível a
caracterização de vários subtipos de receptores, enquanto a sua distribuição cerebral é
estudada usando autoradiografia quantitativa. Mais recentemente, um grande número de gens
codificando subtipos de receptores 5-HT foram identificados (HOYER; MARTIN, 1997). A
disponibilidade do número crescente de anticorpos específicos (Vergé; Harmon, 1997)
possibilitou o estudo da localização dos receptores 5-HT em níveis celular e subcelular.
34
Fonte: Rang et al., 2004
FIGURA 6 - Vias da 5-hidroxitriptamina (serotonérgicas) no cérebro.
1.8.1 Localização dos receptores serotonérgicos
Estudos de autoradiografia usando radioligantes seletivos demonstraram que os
locais de ligação de cada subtipo de receptor mostram uma particular distribuição regional no
cérebro e os estudos imunocitoquímicos geralmente confirmam estes dados.
Desta forma os receptores 5-HT1A estão principalmente localizados nas estruturas
límbicas: o hipocampo, córtex, septum, amígdala e núcleus da rafe e a projeção dorsal da
coluna espinhal (MARCINKIEWICZ et al., 1984; PAZOS; PALACIOS, 1985; KIA et al.,
1996).
Os receptores 5-HT1B estão localizados predominantemente nas áreas
extrapiramidais tais como a substância negra, globus pallidus e com menor densidade no
estriado (PAZOS; PALACIOS, 1985; PAZOS et al., 1985b; VERGÉ et al., 1986; SARI et al.,
1997).
35
Os receptores 5-HT1D, os quais estão intimamente relacionados com os receptores
5-HT1B, são menos abundantes e localizam-se nas mesmas áreas. De qualquer modo, o
RNAm do receptor 5-HT1D foi encontrado em alta densidade com respeito aos receptores 5-
HT1B no nucleos trigêmeo de cobaio e humano (Rebeck et al., 1994; Bouchelet et al.,1996),
sugerindo o envolvimento preferencial deste subtipo de receptor no efeito inibitório do
sumatriptano na inflamação neurogênica.
Os receptores 5-HT1E e 5-HT1F são menos abundantes e os mais pobremente
caracterizados. O primeiro subtipo foi encontrado nas áreas corticais, estriado e amígdala de
cérebros de roedores e primatas (BRUINVELS et al., 1994). No cérebro de cobaio, o RNAm e
locais de ligação para os receptores 5-HT1F foram detectados no córtex, núcleo mamilar,
núcleo talâmico e núcleo oculomotor (MENGOD et al., 1996).
Locais de ligação para os receptores 5-HT2A, formalmente denominados de 5-HT2,
são particularmente abundantes no claustrum, tubérculo olfatório e córtex frontal (PAZOS et
al., 1985a). Estudos imunocitoquímicos recentes (Hamada et al., 1998; Wu et al., 1998;
Cornea-Hébert et al., 1999) confirmaram esta localização.
Os receptores 5-HT2C (formalmente chamados de 5-HT1C) são altamente
expressos no plexo coróide (Pazos; Palacios, 1985), e estão também presentes em muitas
estruturas cerebrais, tais com o núcleo olfatório anterior, córtex piriforme, nucleus
accumbens, estriado ventral, núcleo talâmico e amigdalóide, substância negra (MENGOD et
al., 1990).
Os locais de ligação do receptor 5-HT3 estão principalmente localizados em um
número limitado de estruturas medulares: o núcleo do trato solitário, o núcleo dorsal do nervo
vago e o núcleo do trato espinhal do nervo trigêmeo, e a projeção dorsal da coluna espinhal
(KILPATRICK et al., 1988; LAPORTE et al., 1992). Locais de baixa densidade foram
encontrados no hipocampo, amígdala e cortex entorinal (LAPORTE et al., 1992).
Investigações iniciais imunocitoquímicas indicaram uma enorme distribuição do receptor 5-
HT3, notavelmente no córtex e núcleo olfatório anterior (MORALES et al., 1996, 1998).
Os locais de ligação e o RNAm do receptor 5-HT4 foram encontrados em várias
áreas cerebrais: o sistema olfatório, estriado, córtex, septum, hipocampo, amígdala,
36
hipotálamo dorsal, substância negra e núcleo interpeduncular (WAEBER et al., 1994;
VILARÓ et al., 1996).
Os receptores 5-HT5 são pobremente caracterizados. Tem sido sugerido que este
subtipo de receptor está localizado principalmente nos astrócitos (CARSON et al., 1996).
Estudos recentes com camundongos knock-out para os receptores 5-HT5A, usando
autoradiografia e 125I-LSD na presença de clozapina e espiperona indicaram uma restrita
localização de locais de ligação dos receptores 5-HT5A no bulbo olfatório e neocortex, embora
os locais de ligação do receptor 5-HT5B fossem encontrados no dorsomedial do tálamo
(WAEBER et al., 1998).
Os receptores 5-HT6, os quais não puderam ser estudados usando ligantes
seletivos, foram localizados no tubérculo olfatório, córtex, estriado, núcleo accumbens e
hipocampo, usando hibridização localizada (Ruat et al., 1993) e imunocitoquímica (GÉRARD
et al., 1997).
Na ausência de um radioligante seletivo, os locais de ligação dos receptores 5-HT7
foram estudados usando diferentes radioligantes com coquetéis de drogas apropriadas.
Estruturas fortemente marcadas incluíram o cortex, hipocampo e o núcleo talâmico,
hipotalâmico e amigdalóide (WAEBER; MOSKOWITZ, 1995; GUSTAFSON et al., 1996).
1.9 Sistema gabaérgico
O ácido γ-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório no
sistema nervoso central de vertebrados. O GABA ativa três diferentes classes de receptores
tais como: GABAA, GABAB e GABAC.
Os receptores GABAA, estão ligados a canais iônicos de Cl- (BORMANN, 1988;
SILVILOTTI; NISTRI, 1991). Estes receptores são ativados pelo GABA, muscimol e
isoguvacina, e são inibidos pela bicuculina, gabazina (SR 95531) e (+)-β-hidrastina
(WERMUTH et al., 1986). Os receptores GABAB são ativados pelo GABA, (-)-baclofen,
ácido (±)-4-amino-3-(5-cloro-2-tienil)butanóico e ácido 3-aminopropil-(metil)fosfínico (SKF
97541), e são inibidos pelo faclofen, saclofen e 2-hidroxisaclofen (SEABROOK et al., 1990).
37
Estes receptores são conhecidos por estarem ligados a canais de Ca2+ ou K+, via proteína G,
tanto quanto por ativarem sistemas de segundos mensageiros dentro da célula (BORMANN,
1988; BOWERY, 1993). Os receptores GABAC são derivados de várias isoformas da
subunidade-ρ, e estão diretamente associados a canais de íon cloro. Estes receptores são
ativados por GABA e certas conformações restritas análogas ao GABA tais como ácido cis-4-
aminocrotônico (CACA) e ácido trans-4-aminocrotônico (TACA), e são inibidos pelo ácido
imidazol-4-acético e ácido [(1,2,5,6-tetrahidropiridina-4-yl)metilfosfínico] (TPMPA)
(Ragozzino et al., 1996) mas são insensíveis a bicuculina, barbituratos, benzodiazepínicos e
baclofen (FEIGENSPAN et al., 1993; QIAN; DOWLING, 1993, WISDEN et al., 1996).
Recentemente tem sido proposto que os receptores GABAC poderiam ser classificados como
um set especializado de receptores GABAA (BARNARD et al., 1998). Os receptores GABAA
(Figura 7) são os de maior importância por possuirem um papel central na regulação da
excitabilidade cerebral, e muitas drogas importantes tais como os benzodiazepínicos,
barbitúricos, neuroesteróides, etanol e alguns anticonvulsivantes e anestésicos gerais
interagem com estes receptores tanto quanto elicitam seus efeitos farmacológicos.
Fonte: <http://www.pr.mq.edu.au/macnews/sept01/apaf.htm>
FIGURA 7 - Receptor GABAA
38
1.10 Áreas cerebrais (córtex motor e corpo estriado)
O lobo frontal, constituído pelo córtex prefrontal, córtex premotor e córtex motor
primário, é responsável pelo planejamento da ação e controle do movimento (KANDEL,
2000). As áreas motoras do córtex cerebral são subdivididas em área motora primária e várias
áreas premotoras. Cada área contém populações de neurônios que se projetam do córtex para
o tronco cerebral e coluna vertebral. O córtex motor também recebe impulsos do gânglio basal
e do cerebelo. A área motora do córtex cerebral é responsável pelo movimento voluntário
(KRAKAUER; GHEZ, 2000). O gânglio basal possui grande papel nos movimentos
voluntários normais. Esta região também está envolvida na produção das desordens do
movimento. Estudos postmortem de pacientes com doença de Parkinson e de Huntington
revelaram alterações nesta área cerebral. Essas doenças têm três tipos de distúrbios motores:
tremor e outros movimentos involuntários, alterações na postura e tônus muscular e
finalmente, pobreza e lentidão dos movimentos sem paralisia. Desta forma distúrbios nos
gânglios da base podem resultar tanto na redução do movimento, como a que ocorre na
doença de Parkinson, movimento excessivo, aquele observado na doença de Huntington.
Além destas desordens do movimento, danos nos núcleos da base estão associados com
distúrbios neuropsiquiátricos cognitivos comportamentais, refletindo o importante papel
destes núcleos em diversas funções do lobo frontal (DeLONG, 2000). Os circuitos que
envolvem o comportamento não-motor dos núcleos da base, originam-se de regiões prefrontal
e límbica do córtex e engaja em áreas específicas do estriado, pallidum e substância negra
(DeLONG, 2000). Diferente de outros componentes motores, o gânglio basal, não conecta
diretamente com a coluna vertebral. Estes núcleos recebem impulso primário do córtex
cerebral e envia seus impulsos para o cérebro, via tálamo, córtex prefrontal anterior, córtex
premotor e motor. As funções motoras do gânglio basal são mediadas, em grande parte, por
áreas motoras do córtex frontal. Os quatro principais núcleos dos gânglios da base são o corpo
estriado, globus pallidus, substância negra e núcleo subtalâmico. O corpo estriado consiste de
três importantes subdivisões: o núcleo caudado, o putamen e o estriado ventral, o qual inclui o
nucleus accumbens, uma região envolvida com a emoção e memória (DeLONG, 2000).
39
1.11 Relevância e justificativa
O uso de produtos naturais como matéria-prima para síntese de substâncias
bioativas, especialmente fármacos, tem sido amplamente relatado ao longo do tempo. É de
interesse da medicina o estudo de substâncias isoladas de plantas, por apresentarem grande
potencial no mercado. A iangambina, uma substância pura, extraída da casca do caule da
Ocotea duckei Vattimo, apresentou em estudos preliminares possível efeito depressor em
nível de sistema nervoso central. Visto que, estes efeitos foram pouco estudados, resolvemos
verificar suas ações comportamentais em vários modelos relacionados com a atividade no
sistema, bem como seus efeitos neuroquímicos em duas áreas cerebrais, córtex motor e corpo
estriado. O córtex motor é responsável pelo movimento voluntário e, esta área motora do
córtex cerebral, recebe impulsos do gânglio basal. O gânglio basal, constituído pelo corpo
estriado, globus pallidus, substância negra e núcleo subtalâmico, também possui um
importante papel no movimento voluntário. Desordens nesta região, têm importância na
clínica neurológica, além de fornecer importantes informações sobre o controle motor e servir
como modelo para estudar as relações dos neurotransmissores nas desordens do humor,
cognição e comportamento não-motor. Assim, existe uma correlação entre estas duas áreas
cerebrais, o que justifica a importância de seu estudo. Ambas áreas cerebrais recebem
inervações dopaminérgicas, serotonérgicas, noradrenérgicas, gabaérgicas, que são
moduladoras da intrínseca neurotransmissão a qual medeia a função cortical, além disso, são
regiões envolvidas com o controle motor, que é um evento bastante alterado em pessoas que
apresentam psicopatologias, valendo a pena mencionar, que a emoção e a memória também
estão relacionadas com o corpo estriado. Com base nestas considerações o presente trabalho
objetivou estudar os efeitos da iangambina em vários modelos animais de comportamento
com a finalidade de verificar seus efeitos na atividade motora, depressão, ansiedade, além de
possível atividade miorelaxante e anticonvulsivante. Os sistemas muscarínico,
catecolaminérgico e serotonérgico foram focalizados porque, o mau funcionamento destes
sistemas está relacionado com distúrbios motores e doenças afetivas.
OBJETIVOS
41
2 OBJETIVOS
Gerais:
- Avaliar os efeitos da iangambina em nível do sistema nervoso central, através do
estudo das alterações comportamentais e neuroquímicas produzidas em córtex
motor e corpo estriado de camundongos.
Específicos:
- Estudar as alterações comportamentais nos seguintes modelos:
• Campo aberto (ALE)
• Rota rod
• Nado forçado
• Tempo de sono induzido por pentobarbital
• Placa perfurada
• Labirinto em cruz elevado
• Convulsão induzida por pentilenotetrazol
- Estudar as alterações neuroquímicas produzidas em córtex motor e corpo
estriado de camundongos através de:
• Determinação dos níveis de monoaminas NA, DA e 5-HT e seus
metabólitos DOPAC, HVA e 5-HIAA
• Investigação da possível interação da iangambina com os sistemas
dopaminérgico, colinérgico e serotonérgico através dos seguintes
ensaios de binding in vitro:
Receptores dopaminérgicos D1-símile
Receptores dopaminérgicos D2-símile
Receptores muscarínicos (M1+M2)-símile
Receptores serotonérgicos (5-HT2)-símile
METODOLOGIA
43
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3. 1 Material utilizado nos experimentos
Materiais utilizados nos experimentos
Marca/Modelo
- Agitador de tubos
Modelo 251, FANEN, SP, Brasil
- Balança analítica Modelo H5, Mettler, Suíça - Banho Maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil - Centrífuga refrigerada Eppendorf - Contador de cintilação líquida Modelo LS 6500, Beckman, Fullerton, Ca, USA - Cubetas de plástico para leitura em espectrofotômetro
Sarstedt, Alemanha Oriental
- Espectrofotômetro Modelo Beckman DU 640B, Fullerton, CA, USA - Estufa para secagem Modelo 315 SE FANEM, SP, Brasil - Filtros de fibra de vidro GF/B Whatman, Maidstone England- - Freezer -70 ºC Modelo ULT 2586-3D14, Revco Scientific, Inc.
Asheville, N.C.,USA - Frascos de vidro (vials) para contagem de cintilação
Beckman, Fullerton, Ca, USA
- Guilhotina Harvard, USA - Homogeneizadores manuais Bellico, USA - Medidor de pH Modelo B374, Micronal, SP, Brasil - Micropipetas H.E., Pedersen, Dinamarca - Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc.
NY, USA - Bomba para HPLC LC-10AD Shimadzu Corp, Japan - Programa de computação para integração de picos
Shimadzu Corp., Japan
- Degaseificador DGU-2A Shimadzu Corp., Japan - Detector de fluorescência RF-535 Shimadzu Corp., Japan - Equipamento de Millipore para filtração a vácuo Millipore Apparatus, Bedford, MA, USA - Campo aberto Caixa de acrílico - Labirinto em cruz elevado Acrílico - Rota Rod Ugo Basile, Italy - Placa Perfurada Ugo Basile, Italy - Cuba
Acrílico
3.2 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos com peso variando entre 25–30 g
provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará.
44
Durante todos os experimentos os animais foram mantidos em gaiolas com no
máximo 30 animais, em condições ambientais semelhantes, com ciclos de alternância
claro/escuro de 12 horas, recebendo ração tipo Purina e água ad libitum. Os protocolos
experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal desta universidade.
3.3 Material botânico
A planta Ocotea duckei Vattimo coletada no município de Santa Rita-Paraíba foi
identificada pela botânica Maria de Fátima Agra do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e a exsicata está depositada e catalogada no
Herbário Prof. Lauro Pires Xavier do Departamento de Biologia /CCEN /UFPB sob o número
de registro JPB 4309.
A coleta do material (caule) e o isolamento da iangambina foram realizados pelo
grupo de pesquisa do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da
Paraíba. A extração e isolamento foram feitas pela doutoranda Celidarque da Silva Dias
conforme descrito abaixo sob a orientação e supervisão do Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho
que gentilmente nos cedeu a substância isolada e que muito colaborou para a realização deste
estudo.
3.4 Extração e isolamento
As cascas do caule de Ocotea duckei foram secas (40 – 45°C), pulverizadas e
extraídas com etanol 95 %, em percolador por 72 horas. O extrato etanólico foi destilado em
rotavapor sob pressão reduzida a 60 °C, originando um resíduo que foi submetido a um
screening farmacológico e fitoquímico. Este resíduo foi então tratado com solução de ácido
acético a 5 % sob agitação vigorosa e filtrado em celite, fornecendo um material insolúvel
(descartado), e um extrato acético que foi extraído três vezes com clorofórmio (CHCl3). O
extrato CHCl3 foi concentrado em rotavapor a 50 °C e o resíduo obtido foi tratado com
metanol, que resultou na formação de um precipitado onde foi isolado a iangambina. O
45
sobrenadante foi então submetido à cromatografia em coluna e camada delgada de sílica gel
que levou ao isolamento de outras substâncias incluindo iangambina (Figura 8).
46
CHCl3 (3 vezes)
CASCA SECA E PULVERIZADA
EXTRATO ETANÓLICO (EE)
Percolação com etanol 95 % (3 vezes) Concentração
Ácido acético 5 % (3 vezes) Filtração com celite
INSOLÚVEL EXTRATO ACÉTICO (EA)
RESÍDUO DO EC EA DESENGORDURADO
MeOH
IANGAMBINA
Figura 8 – Isolamento da iangambina à partir das cascas do caule de Ocotea duckei Vattimo.
47
3.5 Preparo da droga
A iangambina (Iag) (LTF/UFPB) foi emulsificada com Tween 80 a 5 % (SIGMA-
USA) e dissolvida em água bidestilada, obtendo-se a concentração final de 2,5; 5,0 e 7,5
mg/mL para ser administrada nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg. Diazepam (DZP) 1 mg/kg
(União Química Brasil) e Cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg (Geigy)
foram usadas como droga padrão. Flumazenil (Ro 15-1788) (Flu) 2,5 mg/kg (Sigma-USA),
Pentobarbital sódico 40 mg/kg (Sigma-USA), Pentilenotetrazol (PTZ) 100 mg/kg (Sigma-
USA). O flumazenil foi emulsionado em Tween 80 a 2 % em água bidestilada.
3.6 Tratamento dos grupos experimentais
As doses de 25, 50 e 75 mg/kg de iangambina foram escolhidas para a realização
deste trabalho a partir de dados obtidos por Pachú et al. (1990) que observaram que o efeito
letal da iangambina até 48 horas após o tratamento não ocorreu até a dose de 1 mg/kg,
portanto foi possível estabelecer essas doses com maior segurança. Os animais foram tratados
com iangambina de forma aguda, por via intraperitoneal (i.p.) ou via oral (v.o.). Vinte e
quatro horas após a administração por via i.p., os animais foram sacrificados, seus cérebros
removidos e o estriado e o córtex motor dissecados sobre gelo, para a dosagem de
monoaminas utilizando HPLC. Para os experimentos de binding in vitro a dissecação das duas
áreas cerebrais foi feita em animais não tratados. No caso dos testes comportamentais, os
animais foram submetidos a cada teste 30 minutos ou 1 hora após a administração
intraperitoneal ou oral da droga, respectivamente. Os animais do grupo controle foram
tratados com solução de Tween 80 a 5 %, usado como veículo. Grupos com diazepam (DZP)
1 mg/kg i.p. ou Cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p., foram feitos,
onde ambas as substâncias, foram usadas como droga de referência ansiolítica e
antidepressiva, respectivamente. O DZP foi usado também no modelo do rota rod, no teste do
tempo do sono induzido por pentobarbital e no teste da convulsão induzida por
pentilenotetrazol, como droga padrão, para avaliar as atividades miorelaxante, sedativa e
anticonvulsivante, respectivamente. Com a finalidade de investigar, o mecanismo de ação da
iangambina, foi feito outro grupo, onde se administrou flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg, i.p., um
48
antagonista do receptor benzodiazepínico, e 15 min depois foi administrado iangambina (Iag)
75 mg/kg, v.o. (FLU + Iag 75).
3.7 Testes comportamentais
Foram usados sete testes comportamentais: campo aberto (open field), rota rod,
nado forçado, tempo de sono induzido por pentobarbital, placa perfurada (hole board),
labirinto em cruz elevado (plus maze) e o teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol.
3.7.1 Teste de campo aberto
Um campo aberto feito em acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x
15 cm) dividido em nove quadrados de áreas iguais, foi usado para avaliar a atividade
exploratória do animal (ARCHER, 1973). Após 30 ou 60 minutos da administração da droga
por via intraperitoneal ou oral respectivamente, cada animal foi colocado no centro do campo
e o número de cruzamentos (com as quatro patas), números de rearing e grooming foram
registrados durante 5 minutos
3.7.2 Teste do rota rod
Para o teste de rota rod, após 30 ou 60 minutos da administração da droga por via
intraperitoneal ou oral respectivamente, o animal foi colocado com as quatro patas sobre uma
barra de 2,5 cm de diâmetro, elevado a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm. Para cada
animal foram registrados o número de quedas (sendo o limite máximo de 3 quedas para cada
animal) e o tempo de permanência na barra, em um período de até 1 minuto (DUNHAM;
MIYA, 1957).
49
3.7.3 Teste do nado forçado
Este modelo, idealizado por Porsolt et al., 1977a, se baseia no fato de que o
roedor, ao ser colocado em uma cuba de acrílico com água, apresenta um comportamento
desesperado, caracterizado como desespero comportamental. Neste modelo, os roedores são
forçados a nadar por 5 minutos em um ambiente sem saída. De princípio o animal apresenta
comportamento de fuga e luta, nadando e buscando uma saída deste ambiente. Quando
percebe que seu esforço está sendo em vão, o animal, então, apresenta um comportamento de
conformismo, tentando se adaptar a esta nova situação aversiva. Neste momento, o animal
apresenta uma postura típica de imobilidade, realizando apenas movimentos mínimos
necessários para não se afogar. O uso de drogas que causam depressão, como a reserpina,
aumenta o comportamento de conformismo, e portanto, o tempo em que o animal apresenta-se
imóvel no teste. Já as drogas que apresentam efeitos antidepressivos, exacerbam o
comportamento de fuga e luta, e desta forma, diminuem o tempo em que o animal apresenta-
se imóvel. Também foi constatado que o tempo de imobilização do animal durante o teste está
diretamente correlacionado com a eficácia clínica de drogas antidepressivas. Isto é, quanto
menor o tempo de imobilidade apresentado pelo animal, maior será a eficácia clínica da droga
teste (PORSOLT et al., 1977a, 1977b, 1978; BUCKETT et al., 1982; NISHIMURA et al.,
1988; BORSINI; MELI, 1988; SANCHEZ; MEIER, 1997).
- Procedimento experimental
O teste do nado forçado (Porsolt et al., 1978), incluiu duas exposições dos
animais, em uma cuba de acrílico com água, separadas por um espaço de um dia. Assim, os
animais foram submetidos a uma primeira exposição (pré-teste), para induzir a depressão, 24
horas antes da realização do teste final (segunda exposição). Durante o pré-teste, cada animal
não tratado, foi colocado, durante 15 minutos, em uma cuba de acrílico transparente de 40 cm
de altura por 18 cm de diâmetro, contendo 15 cm de água fresca a 25 °C. No teste final, 30
minutos ou 1 hora após o tratamento com a iangambina, via intraperitoneal ou oral
respectivamente, os animais foram novamente colocados na cuba e deixados por 5 minutos.
Durante este período foi observado o tempo em que o animal apresentou-se imóvel. O
camundongo foi considerado imóvel quando permaneceu flutuando, fazendo apenas pequenos
50
movimentos para manter a cabeça fora d’agua. Neste modelo um grupo de animais recebeu
Cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p., como droga padrão.
3.7.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital
Este teste se baseia no fato de que, em geral, as drogas depressoras do sistema
nervoso central atuam sinergicamente aumentando o tempo de sono induzido por barbitúricos,
embora algumas drogas desprovidas de ação central, como por exemplo, adrenalina e
histamina, também apresentem resultados positivos (RILEY; SPINKS, 1958).
- Procedimento experimental
Trinta minutos ou uma hora após a administração de iangambina (25 ou 50
mg/kg) intraperitoneal e oral, respectivamente, veículo (i.p. ou v.o.) ou Diazepam 1 mg/kg,
i.p., todos os grupos receberam pentobarbital sódico 40 mg/kg, intraperitoneal. O tempo desde
a injeção do pentobarbital até o animal perder o reflexo postural é registrado como latência de
sono e o tempo de latência entre a perda e a recuperação voluntária do reflexo postural é
registrado como tempo de sono (WAMBEBE, 1985; ROLLAND et al., 1991). Um tempo
máximo de 240 min foi imposto nesta medida, isto é, animais os quais o tempo de sono estava
acima de 240 min foram contados como 240 min. A latência de sono foi também registrada.
3.7.5 Teste da placa perfurada
O teste da placa perfurada, usado para avaliar o comportamento exploratório em
camundongos, foi realizado como descrito previamente por Dorr et al., 1971. O aparato usado
foi um Ugo Basile de 60 x 30 cm com 16 buracos espaçados uniformemente com sensores de
infra-vermelho. Camundongos machos adultos foram divididos em cinco grupos. Foi feito o
grupo controle (Tween 80 a 5 %), três grupos receberam doses de iangambina 25, 50 e 75
mg/kg, respectivamente, por via i.p. ou oral e em outro grupo foi administrado Diazepam 1
mg/kg, i.p., que foi usado como droga padrão. O número de vezes que o animal colocou a
cabeça no buraco da placa perfurada, head dips, foi contado para cada animal durante um
51
período de 5 minutos. O procedimento experimental foi executado em uma sala silenciosa,
com luz de baixa intensidade.
3.7.6 Teste de labirinto em cruz elevado
Através do uso de modelos animais indutores de ansiedade, foram obtidos muitos
achados em relação à ansiedade. O mais utilizado e aceito pela comunidade científica é o
labirinto em cruz elevado (TREIT, 1985; RODGERS, 1997; ZANGROSSI JR., 1997).
O labirinto em cruz elevado para camundongos (Lister, 1987), consistiu de dois
braços abertos (30 x 5 cm) e dois braços fechados (30 x 5 x 25 cm), conectados entre si por
uma plataforma central (5 x 5 cm), formando uma cruz grega, elevada a 45 cm do chão. As
paredes foram confeccionadas em acrílico transparente e o piso em acrílico preto. Neste
modelo, os roedores evitam os braços abertos do labirinto, restringindo a maioria de suas
atividades aos braços fechados. Uma atividade relativamente baixa nos braços abertos é
indicativa de ansiedade. Em contrapartida, roedores submetidos ao tratamento com
ansiolíticos cruzam mais vezes pelos braços abertos e permanecem mais tempo nestes braços
quando comparados aos animais controle (ZANGROSSI JR. 1997).
- Procedimento experimental
Trinta minutos ou uma hora após o tratamento com a iangambina, através da via
intraperitoneal ou oral respectivamente, cada animal foi colocado na plataforma central com o
focinho direcionado para um dos braços fechados. Durante 5 minutos foram observados os
seguintes parâmetros: número de entradas nos braços abertos e fechados e o tempo de
permanência do animal em cada um desses braços. A percentagem do tempo de permanência
em cada braço foi calculada utilizando-se a razão do tempo em cada um dos braços e o tempo
total de permanência em ambos os braços. A percentagem do número de entradas foi
calculada usando a razão entre o número de entradas em cada um dos braços e o número total
de entradas nos braços abertos e fechados. Além dos grupos tratados com a iangambina, foi
feito um grupo no qual foi administrado diazepam 1 mg/kg, i.p., como droga padrão. Os
animais controle foram tratados com solução de Tween 80 a 5 %, usado como veículo.
52
Subseqüentemente, com a finalidade de investigar o mecanismo de ação da
iangambina, foram feitos dois grupos, ou seja, em um grupo, camundongos foram tratados
com flumazenil (Ro 15-1788) 2,5 mg/kg, i.p., um antagonista do receptor benzodiazepínico, e
15 min depois foi administrada salina por via oral. No outro grupo foi administrado
flumazenil e 15 min depois foi associado a iangambina 75 mg/kg, v.o.. Os dois grupos
experimentais foram conduzidos ao labirinto, e os animais colocados um a um no centro da
plataforma deste modelo, 1 hora depois da administração da salina e iangambina 75,
respectivamente. O grupo (Flu + Iag 75 v.o.) foi comparado com o grupo Iag 75 mg/kg, v.o..
Todo o teste foi realizado em uma sala fechada, com temperatura e umidade
controlada (23 ± 1 0C), iluminação de pouca intensidade (lâmpada vermelha de 15 W) e
ruídos atenuados.
3.7.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol
Este experimento foi realizado seguindo a metodologia descrita por Swinyard et
al., 1952, e teve a finalidade de avaliar a possível ação anticonvulsivante da droga em teste.
Trinta minutos ou uma hora após o tratamento com iangambina 25, 50, 75 mg/kg ou controle
(Tween 80 a 5 %), através das vias i.p. e v.o. respectivamente, ou Diazepam 1 mg/kg, i.p., foi
feita a administração em todos os animais com pentilenotetrazol 100 mg/kg, i.p..Em seguida
os camundongos foram colocados em gaiolas individuais e observados por até 20 minutos. O
tempo de manifestação da primeira convulsão do tipo clônica ou tônico-clônica (latência de
convulsão) e a latência de morte foram os parâmetros observados.
3.8 Dissecação das áreas cerebrais
Os animais foram mortos por estiramento cervical, os encéfalos retirados
rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com gelo.
Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi retirada
das leptomeninges com o auxílio de uma pinça reta de microdissecação, a qual, progredindo
delicada e tangencialmente aos ventrículos laterais, divulsionou o córtex em toda a sua
53
extensão fronto-occipital. O córtex já divulsionado foi rebatido para os lados, expondo parte
do corpo estriado. O corpo estriado (caudado, putamen e núcleo acumbens) foi isolado das
estruturas circunjacentes por divulsionamento com uma tesoura de microdissecação, sendo a
sua retirada orientada pelo diâmetro da porção tuberosa visível desses núcleos, após o
rebatimento lateral do córtex.
Após a retirada do corpo estriado (CE) o rebatimento do córtex feito inicialmente
foi desfeito, ou seja, procurando-se reconstituir o contorno dos hemisférios cerebrais, o córtex
foi recolocado em sua posição inicial e, com o auxílio de uma tesoura de microdissecação, foi
removida em sua porção superior e mediana, uma extensão em torno de 3-5 mm, tendo como
limite posterior um plano imaginário que dividia o cérebro em partes iguais, anterior e
posterior. A porção cortical assim retirada corresponde a área motora do córtex fronto-parietal
(ZILLES; WREE, 1985).
Terminada a dissecação, cada área (corpo estriado e córtex motor) foi colocada
em papel alumínio devidamente identificada, pesada e conservada a -70 °C para uso posterior.
Quando necessária a estocagem por um certo período de tempo (no máximo 6 meses a -70 °C)
os tecidos foram considerados como tendo a mesma viabilidade para experimentação que os
ensaiados imediatamente ou 24 h após a dissecação (BURKE; GREENBAUN, 1987;
FIELDER et al., 1987).
3.9 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC
- Método
Para a determinação dos níveis de monoaminas foi utilizado o equipamento de
HPLC (High Performance Liquid Chromatograph). Na cromatografia líquida clássica, um
adsorvente (alumina ou sílica) é empacotado em uma coluna e é eluído por um líquido ideal
(fase móvel). Uma mistura para ser separada é introduzida na coluna e é carregada através da
mesma por um líquido eluente. Se um composto da mistura (soluto) é adsorvido fracamente
pela superfície da fase sólida estacionária, ele atravessará a coluna mais rapidamente que um
outro soluto que seja mais rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível
54
se existem diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a
condutância do eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos solutos. Para
ser capaz de detectar, no primeiro caso os solutos devem ser iônicos e no segundo caso, os
solutos devem ter a característica de serem relativamente fáceis de se oxidarem ou reduzirem.
Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou
oxidação de solutos são chamados detectores amperométricos ou coulométricos. Neste estudo
foi utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor de soluto, em
torno de 1 %. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem a aplicação de um potencial para
um eletrodo (geralmente de carbono vítreo), oxidação da substância que está sendo estudada
próximo à superfície do eletrodo seguindo a amplificação e medida da corrente produzida. As
catecolaminas são oxidadas nos grupos de anel hidroxil para produzir um derivado
ortoquinona com a liberação de dois elétrons.
- Procedimento experimental
Os animais foram decapitados 24 h após a administração intraperitoneal de
iangambina 25, 50 e 75 mg/kg e imediatamente tiveram seus cérebros dissecados sob gelo. O
CE e CM foram utilizados para preparar homogenatos a 10 %. Os tecidos cerebrais foram
sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30 s e centrifugados por 15 minutos em
centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. Uma alíquota de 20 µL do sobrenadante foi, então,
injetada no equipamento de HPLC, para a análise química.
Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS(M) com comprimento de
25 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 µm, da Shimadzu, Japão, foi utilizada. A
fase móvel utilizada era composta por tampão ácido cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido
octanosulfônico sódico, 0,69 M (SOS), como reagente formador do par iônico, acetonitrila 4
% v/v e tetrahidrofurano 1,7 % v/v. Noradrenalina (NA), dopamina (DA), ácido
diidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA), serotonina (5-HT) e ácido 5-
hidroxiindolacético (5-HIAA) foram eletronicamente detectados usando um detector
amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japan) pela oxidação em um eletrodo de
carbono vítreo fixado em 0,85 V relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.
(HALLMAN; JONSSON, 1984).
55
- Soluções reagentes
- Fase móvel
Foram pesados 15,75 g de ácido cítrico (grupo química, R.J., Brasil) e completado
para um volume de 400 mL com água puríssima (Milli-Q). Esta solução foi ajustada para pH
3,0 com hidróxido de sódio 12,5 M (Reagen, R.J, Brasil). A esta solução foi adicionado o
SOS 75 mg (Sigma, MO, USA) e completado o volume para 471,5 mL com água Milli-Q. Em
seguida, foi procedida a filtração e degaseificação, e posteriormente adição de 20 mL de
acetonitrila (Carlo Erba Reagenti, MI, Itália) e 8,5 mL de tetrahidrofurano (Sigma, MO, USA)
para um volume final de 500 mL.
- Ácido perclórico 0,1 M
Adicionou-se 1,8 mL de ácido perclórico (Sigma, MO, USA) em um balão
volumétrico e completo o volume para 300 mL.
3.10 Determinação da densidade dos receptores dopaminérgicos
A determinação dos receptores dopaminérgicos foi feita através de ensaios de
binding in vitro executados em homogenatos cerebrais de camundongos não tratados,
variando os seguintes parâmetros:
- Receptores D1-símile
Foi utilizado o ligante específico [3H]-SCH 23390 (87,0 Ci/mmol - New England
Nuclear, USA), de acordo com método previamente descrito (MELTZER et al., 1989).
56
- Receptores D2-símile
Foi utilizado o ligante específico [3H]-espiroperidol (114,0 Ci/mmol - New
England Nuclear, USA), segundo uma adaptação do método previamente descrito por Meltzer
et al. (1989) e Kessler et al. (1991).
- Método
O [3H]-SCH 23390 é um antagonista dopaminérgico que possui alta afinidade
pelos receptores D1-símile. O ligante [3H]-espiroperidol é um antagonista dopaminérgico que
possui alta afinidade pelos receptores D2-símile, possuindo também afinidade pelos receptores
serotonérgicos do tipo 5-HT2 (TERAI et al., 1989; KESSLER et al., 1991). Para bloquear os
receptores serotonérgicos foi utilizado um antagonista específico, a mianserina.
A dopamina, um agonista dopaminérgico, foi adicionada, na forma não marcada,
nos brancos dos ensaios para receptor D1 para determinar a radioatividade de background ou
ligações não-específicas, em uma concentração elevada para interagir com os mesmos sítios
de ligação do receptor, impedindo assim, a ligação do [3H]-SCH23390, que fica livre. O
mesmo foi feito com relação ao receptor D2. Esses ligantes livres são retirados do filtro
através de lavagens sucessivas, e a radioatividade é, então, contada por cintilação líquida.
- Procedimento experimental
Logo após a dissecação das áreas cerebrais em gelo, como mencionado
anteriormente, foram feitos homogenatos a 10 % em tampão tris-HCl 50 mM, pH 7,4.
Os homogenatos contendo 50-100 µg de proteína foram incubados com
iangambina em diferentes concentrações (0-200 µM) durante 30 minutos em tampão tris-HCl
modificado (50 mM, pH 7,4). No caso dos receptores D1-símile o tampão continha 7,58 nM
de [3H]-SCH 23390. No caso dos receptores D2-símile o tampão continha 10 µM de
mianserina (incubada por 30 minutos à temperatura ambiente) para bloquear os receptores
serotonérgicos e 3,77 nM de [3H]-espiroperidol. Em ambos os ensaios, os respectivos ligantes
57
foram incubados na presença e na ausência de dopamina 100 µM (durante 10 minutos), sendo
o volume final do ensaio de 0,2 mL.
Após incubação a 37 °C durante 60 minutos, a reação foi terminada por filtração a
vácuo através de filtros Whatman GF/B. Os discos de papel de filtro foram lavados três vezes
com 4 mL de solução salina 0,9 % gelada, secos a 60 °C por no mínimo 2 h e colocados em
frascos de vidro (vials) com 3 mL de um coquetel de cintilação líquida contendo tolueno.
A radioatividade foi medida em um contador de cintilação líquida Beckman LS-
6500 com a eficiência de 61 %. O binding específico foi calculado como binding total menos
o binding não-específico feito na presença de dopamina 100 µM para os receptores D1 e D2, e
os resultados foram expressos como fentomoles por miligrama de proteína. A concentração de
proteína foi determinada segundo o método de Lowry (1951), utilizando-se albumina sérica
bovina (BSA) como padrão.
- Soluções reagentes
- [3H]-espiroperidol (114 Ci/mmol, Amersham Life Science, USA)
5 µL de [3H]-espiroperidol foram diluídos em tampão tris-HCl, pH 7,4, de forma a
obter uma concentração final de 43,28 nM.
- [3H]- SCH 23390 (87 Ci/mmol, Amersham Life Science)
5 µL de [3H]-SCH 23390 foram diluídos em tampão tris HCl, pH 7,4 de forma a
obter uma concentração final de 11,5 nM
- Tampão Tris-HCl
6 g de Tris-HCl (trizma base, Sigma, Brasil) foram diluídos em 1000 mL de água
bidestilada, obtendo-se uma concentração de 50 mM. O pH foi ajustado com
solução HCL 0,1 N (MERCK, Rio de Janeiro, Brasil) para pH 7,4.
58
- Tris HCl modificado
NaCl 120 mM; KCl 1 mM; CaCl2 2 mM; MgCl2 1 mM, NaEDTA 1 mM e
ascorbato sódico 1 mM foram dissolvidos em tampão tris-HCl 50 mM pH 7,4.
- Mianserina
Comprimidos de mianserina (Tolvon 30 mg, Organon, SP, Brasil) foram
macerados e diluídos em tampão tris-HCl obtendo-se uma concentração final de 10
µM.
- Dopamina (cloridrato de dopamina)
10 mg de dopamina (Sigma) foram diluídas em 2 mL de tampão tris-HCl não
modificado tendo uma concentração final de 5 mg/mL. A esta solução foi
acrescentado ácido ascórbico 0,1 %.
- Coquetel de cintilação
0,5 g de p-bis-2-(5-feniloxazolil) benzeno, POPOP (Sigma, St. Louis, MO, USA) e
4,0 g de 2,5-difeniloxasol, PPO (Sigma, St. Louis, MO, USA) foram dissolvidos
em 1000 mL de tolueno (Beckman, Fullerton, CA, USA).
3.11 Determinação da densidade dos receptores muscarínicos
A densidade dos receptores muscarínicos foi determinada através de ensaios de
binding in vitro executados em homogenatos cerebrais de camundongos não tratados. Para a
determinação de receptores muscarínicos (M1+M2)-símile foi utilizado o ligante não
específico [3H]-N-metilescopolamina ([3H]-NMS, 85 Ci/mmol - New England), de acordo
com o método previamente descrito (DOMBROWSKI et al., 1983).
59
- Método
O antagonista muscarínico marcado, [3H]-NMS, liga-se a sítios específicos dentre
os quatro primeiros segmentos transmembrana dos receptores muscarínicos (Wheatley et al.,
1988) que existem nos tecidos homogeneizados. Desse modo, o ligante tritiado marca os
receptores presentes no tecido estudado.
A atropina é um outro antagonista clássico utilizado nos brancos dos
experimentos para determinar a radioatividade de background ou ligações não-específicas. A
atropina acrescentada em concentração muito maior do que a [3H]-NMS interage,
seletivamente, com os mesmos sítios de ligação do receptor, deslocando e deixando livre toda
a droga marcada, que é logo depois filtrada. A radioatividade contida no filtro é, então,
determinada por cintilação líquida.
- Procedimento experimental
Terminada a dissecação das áreas cerebrais em gelo, como mencionado
anteriormente, foram feitos homogenatos a 10 % em tampão fosfato de sódio, 150 mM, pH
7,4.
Rapidamente, os homogenatos contendo 50 -100 µg de proteína foram incubados
com iangambina em diferentes concentrações (0- 200 µM) durante 30 minutos em tampão
fosfato de sódio contendo 2,38 nM de [3H]-NMS, na presença ou na ausência de sulfato de
atropina 12,5 µM em um volume final de 0,2 mL.
Após incubação a 37 °C por 30 minutos, a reação foi terminada por filtração a
vácuo através de filtros Whatman GF/B. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL de
solução salina 0,9 % gelada, secos a 60 °C por no mínimo 2 h e colocados em frascos de vidro
(vials) com 3 mL de um coquetel de cintilação líquida contendo tolueno.
A radioatividade foi medida em um contador de cintilação líquida Beckman LS-
6500 com uma eficiência de 61 %. A ligação específica foi calculada como a ligação total
menos a ligação não-específica feita na presença de atropina 12,5 µM os resultados foram
60
expressos como fentomoles por miligrama de proteína. A concentração de proteína foi
determinada segundo o método de Lowry et al., 1951 utilizando-se albumina sérica bovina
(BSA) como padrão.
- Soluções reagentes
- Solução estoque de [3H]-N-metil-escopolamina ([3H]-NMS)
Cloridrato de [3H]-NMS (85 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA, USA),
dissolvido em tampão fosfato de sódio 150 mM, pH 7,4 para obter uma
concentração de 23,52 nM.
- Solução estoque de atropina
Sulfato de atropina (Sigma, St. Louis, MO, USA) foi dissolvido em água
bidestilada, para obter uma concentração de 0,5 mM.
- Tampão fosfato de sódio
NaH2PO4 (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil) foi dissolvido em água bidestilada, para
obter uma solução 150 mM e o pH foi ajustado para 7,4 com solução de HCl 1 N
(Merck, Rio de Janeiro, Brasil).
- Coquetel de cintilação
0,5 g de p-bis-2-(5-feniloxazolil) benzeno, POPOP (Sigma, St. Louis, MO, USA) e
4,0 g de 2,5-difeniloxasol, PPO (Sigma, St. Louis, MO, USA) foram dissolvidos
em 1000 mL de tolueno (Beckman, Fullerton, CA, USA)
61
3.12 Determinação da densidade dos receptores serotonérgicos (5-HT2)
Tecidos cerebrais de 3 áreas formando um pool foram utilizados para os
experimentos. O tecido foi homogeneizado em 2 mL de tampão Tris-HCl 0,05 M pH 7,4. O
homogenato foi centrifugado por 15 min a 20,000 X g, 4 °C. O sobrenadante foi descartado e
o decantado foi lavado por 3 vezes com o mesmo volume de tampão Tris-HCl 0,05 M. O
decantado final foi ressuspenso em 0,3 mL do mesmo tampão para determinação subseqüente
da ligação do [3H]-espiroperidol. Como descrito acima na determinação dos receptores D2-
símile, o referido ligante tem afinidade por receptores D2 e 5-HT2 e foi utilizado para
determinação destes últimos de acordo com o método descrito por Peroutka and Snyder, 1980,
com algumas modificações. O ensaio consistiu das membranas (0,3–0,5 mg de proteína)
incubadas com iangambina (0-100 µM) durante meia hora com tampão Tris- HCl (pH 7,4)
consistindo de ácido ascórbico 0,1 %, NaCl 120 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, na presença de
[3H]-espiroperidol 4,72 nM e dopamina 100 µM para bloquear receptores D2-símile. A
ligação inespecífica foi definida pela adição de ciproheptadina 100 µM. O tempo de
incubação foi 30 min a 37 °C, e o volume final foi 0,2 mL.
Após incubação a reação foi terminada por filtração a vácuo através de filtros
Whatman GF/B. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL de solução salina 0,9 %
gelada, secos a 60 °C por no mínimo 2 h e colocados em frascos de vidro (vials) com 3 mL de
um coquetel de cintilação líquida contendo tolueno.
A radioatividade foi medida em um contador de cintilação líquida Beckman LS-
6500 com uma eficiência de 61 %. A ligação específica foi calculada como a ligação total
menos a ligação não-específica feita na presença de ciproheptadina 100 µM os resultados
foram expressos como fentomoles por miligrama de proteína. A concentração de proteína foi
determinada segundo o método de Lowry et al. (1951) utilizando-se albumina sérica bovina
(BSA) como padrão.
62
3.13 Dosagem de proteína
- Método
A quantidade de proteína em homogenatos de cérebro foi determinada a 25 °C
utilizando albumina sérica bovina como padrão, de acordo com o método previamente
descrito (Lowry et al., 1951), que utiliza duas reações de formação de cor para analisar a
concentração proteica fotometricamente. Inicialmente é feita uma reação biureto de baixa
eficiência na qual os íons de cobre alcalino produzem uma cor azulada na presença de
ligações peptídicas. Esta cor biureto é característica de todas as proteínas e fornece uma cor
básica de fundo para a próxima etapa de ensaio. Depois o método emprega uma mistura
complexa de sais inorgânicos, o reagente Folin-Ciocalteau que produz uma cor verde azulada
intensa na presença de tirosina ou triptofano livres ou ligados a proteínas. Como as
quantidades desses dois aminoácidos são geralmente constantes nas proteínas solúveis, com
poucas exceções, a cor das reações (verde-azulada) é indicativa da presença de proteína e a
intensidade da cor proporcional à concentração. Esta coloração foi medida em 750 nm,
através de espectrofotômetro Beckman DU 640B.
- Soluções reagentes
- Reagente A: Na2CO3 (Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) a 2 % em NaOH
(Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) 0,1 N;
- Reagente B: CuSO4.5H2O a 0,5 % em NaKC4H4O6.4H2O (Grupo Química, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil) a 1 %;
- Reagente C: Solução de cobre alcalino (24 mL do reagente A com 1 mL do
reagente B, misturados no momento de usar);
- Reagente de Folin - Ciocalteau - Fenol (Labordin, Piraquara, PR, Brasil), 1:1 em
água bidestilada;
63
- Solução de albumina sérica bovina (Sigma, St Louis, MO, USA) 1 mg/mL em
água bidestilada.
3.14 Análise estatística
A análise estatística dos dados foi feita através de um computador Pentium III
utilizando o programa GraphPad Instat tm., GraphPad software V 3.0., Copyright (c). Para
comparações múltiplas foi utilizado Análise de Variância (ANOVA), teste de Student
Newman Keuls ou teste de Dunnett, como teste post hoc. Para os testes não-paramétricos
(número de quedas no rota rod) foi usado teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunns.
As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em p< 0,05.
RESULTADOS
65
4 RESULTADOS
4.1 Testes comportamentais
4.1.1 Teste do campo aberto (vias intraperitoneal e oral)
A atividade locomotora espontânea (ALE), rearing e grooming foram realizados
como descrito no material e métodos. Os resultados são expressos como média ± EPM do
número de travessias, rearings e groomings durante 5 minutos. Como apresentado nas
Figuras 9 e 10 após o tratamento intraperitoneal e oral com iangambina ocorreu redução na
ALE (controle = 67,2 ± 2,7; Iag 25 = 40,0 ± 5,1; Iag 50 = 30,9 ± 2,9; Iag 75 = 47,8 ± 3,2) e
(controle = 67,9 ± 4,4; Iag 25 = 54,5 ± 2,9; Iag 50 = 45,9 ±1,2; Iag 75 = 42,9 ± 3,5)
respectivamente. O diazepam 1 mg/kg i.p., usado como droga padrão, também reduziu a ALE
em relação aos respectivos grupos controles (controle i.p. = 67,2 ± 2,7; controle v.o. = 67,9 ±
4,4; DZP 1 mg/kg i.p. = 40,6 ± 5,0).
A mesma diminuição foi vista com relação ao comportamento de rearing nas duas
vias usadas (controle = 16,4 ± 1,9; Iag 25 = 5,0 ± 1,2; Iag 50 = 7,0 ± 2,1; Iag 75 = 5,0 ± 0,9) e
(controle = 11,8 ± 1,1; Iag 25 = 7,2 ± 0,7; Iag 50 = 4,5 ± 0,6; Iag = 7,9 ± 1,2) respectivamente.
O diazepam também reduziu este parâmetro comportamental em relação aos grupos controles
(controle i.p. = 16,4 ± 1,9; controle v.o. = 11,8 ± 1,1; DZP 1 mg/kg, i.p. = 2,6 ± 0,9) (Figuras
11 e 12).
Conforme as Figuras 13 e 14, o comportamento de grooming foi também
reduzido em ambas as vias (controle = 4,5 ± 0,5; Iag 25 = 3,0 ± 0,4; Iag 50 = 2,2 ± 0,3; Iag 75
= 2,3 ± 0,3) e (controle = 5,5 ± 0,7; Iag 25 = 3,2 ± 0,3; Iag 50 = 3,5 ± 0,5; Iag 75 = 1,2 ± 0,3)
respectivamente. Foi observada uma redução do mesmo comportamento após o tratamento
com diazepam em relação aos grupos controles (controle i.p. = 4,5 ± 0,5; controle v.o. = 5,5 ±
0,7; DZP 1 mg/kg, i.p. = 2,7 ± 0,6).
66
FIGURA 9 - Efeito da iangambina intraperitoneal sobre a atividade locomotora (campo aberto). A atividade locomotora no campo aberto foi medida como o número de travessias de um quadrante para o outro de animais controles e tratados com iangambina (Iag) em doses de 25, 50 e 75 mg/kg i.p.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 6 – 15 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
Controle Iag 25 Iag 50 Iag 75 Diazepam0
25
50
75ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
***
***
*****
Tra
vess
ias
/ 5 m
in
67
FIGURA 10 - Efeito da iangambina via oral sobre a atividade locomotora (campo aberto). A atividade locomotora no campo aberto foi medida como o número de travessias de um quadrante para o outro de animais controles e tratados com iangambina (Iag) em doses de 25, 50 e 75 mg/kg v.o.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 14 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; *p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
Controle Iag 25 Iag 50 Iag 75 Diazepam0
25
50
75ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
*
*** *** ***
Tra
vess
ias
/ 5 m
in
68
FIGURA 11 – Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via intraperitoneal). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via intraperitoneal. Os controles receberam Tween 80 a 5 %. Os valores representam média ± EPM (n = 6 – 15 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
controle iag 25 iag 50 iag 75 diazepam0
5
10
15
20ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
Núm
ero
dere
arin
gs /
5 m
in
***
***
***
***
69
FIGURA 12 – Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via oral). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via oral. Os controles receberam Tween 80 a 5%. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 14 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01; ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
Controle Iag 25 Iag 50 Iag 75 Diazepam0
5
10
15ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
****
******
Núm
ero
de r
eari
ngs
/ 5
min
70
FIGURA 13 – Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via intraperitoneal). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via intraperitoneal. Os controles receberam Tween 80 a 5 %. Os valores representam média ± EPM (n = 6 – 15 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (*p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
Controle Iag 25 Iag 50 Iag 75 Diazepam0
1
2
3
4
5ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
*
* *
*
Núm
ero
degr
oom
ings
/5
min
71
FIGURA 14 – Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via oral). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via oral. Os controles receberam Tween 80 a 5 %. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 14 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
Controle Iag 25 mgIag 50 mgIag 75 mgDiazepam0.0
2.5
5.0
7.5ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg** **
*
***
Núm
ero
degr
oom
ings
/5
min
72
4.1.2 Teste do rota rod (vias intraperitoneal e oral)
Os animais tratados por via intraperitoneal com iangambina nas doses de 25, 50 e
75 mg/kg, não apresentaram alterações significativas (p > 0,05) no número de quedas da barra
(NQ: Iag 25 = 1,30 ± 0,33; Iag 50 = 1,60 ± 0,37; Iag 75 = 1,22 ± 0,40) ou no tempo de
permanência na barra em segundos (TP: Iag 25 = 54,10 ± 3,42 s; Iag 50 = 52,40 ± 2,97 s; Iag
75 = 52,78 ± 2,77 s) em relação ao grupo controle (NQ: 1,83 ± 0,27 e TP: 56,33 ± 0,87 s)
(Tabela 1).
Nenhuma alteração nestes parâmetros foi observada com os animais tratados com
iangambina nas mesmas doses por via oral (NQ: Iag 25 = 1,47 ± 0,25; Iag 50 = 1,85 ± 0,23;
Iag 75 = 1,00 ± 0,19) e (TP: Iag 25 = 51,26 ± 2,47 s; Iag 50 = 46,95 ± 2,83 s; Iag 75 = 56,27 ±
0,70 s) em relação ao grupo controle (NQ: 1,35 ± 0,26 e TP: 48,65 ± 3,22 s) (Tabela 2).
De maneira semelhante, o diazepam 1 mg/kg, i.p., não alterou nenhum dos
parâmetros observados quando comparado ao grupo controle (NQ: 1,6 ± 0,27 e TP: 55,70 ±
0,87 s).
73
TABELA 1 - Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do rota rod
para camundongos.
Grupos
Número de Quedas Tempo de Permanência (s)
Controle
1,83 ± 0,27 56,33 ± 0,87
Iag 25
1,30 ± 0,33 54,10 ± 3,42
Iag 50
1,60 ± 0,37 52,40 ± 2,97
Iag 75
1,22 ± 0,40 52,78 ± 2,77
DZP 1
1,60 ± 0,27
55,70 ± 0,87
Os animais foram tratados por via intraperitoneal com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM do número de quedas da barra ou do tempo de permanência na barra (s). (n = 9 – 12 camundongos por grupo). Foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido por Dunns como teste post hoc (para o parâmetro do número de quedas). Para o tempo de permanência foi utilizado ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc. Os dados foram considerados significativos a partir de p < 0,05.
74
TABELA 2 – Efeito da administração oral da iangambina no teste do rota rod para
camundongos.
Grupos
Número de Quedas Tempo de Permanência (s)
Controle
1,35 ± 0,26 48,65 ± 3,22
Iag 25
1,47 ± 0,25 51,26 ± 2,47
Iag 50
1,85 ± 0,23 46,95 ± 2,83
Iag 75
1,00 ± 0,19 56,27 ± 0,70
DZP 1
1,60 ± 0,27
55,70 ± 0,87
Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM do número de quedas da barra ou do tempo de permanência na barra (s). (n = 10 – 20 camundongos por grupo). Foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido por Dunns como teste post hoc (para o parâmetro do número de quedas). Para o tempo de permanência foi utilizado ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc. Os dados foram considerados significativos a partir de p < 0,05.
75
4.1.3 Teste do nado forçado (vias intraperitoneal e oral)
No teste do nado forçado como mostrado nas Figuras 15 e 16 ocorreram
aumentos significativos no tempo de imobilidade dos animais nas duas vias estudadas em
relação aos respectivos grupos controle após a administração da iangambina intraperitoneal e
oral (via intraperitoneal: controle = 118,10 ± 10,96; Iag 25 = 166,40 ± 2,10; Iag 50 = 187,60 ±
12,40; Iag 75 = 186,67 ± 14,62) e (via oral: controle = 116,70 ± 11,50; Iag 25 = 156,90 ±
10,00; Iag 50 = 163,13 ± 12,80; Iag 75 = 165,08 ± 2,70).
O cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p. (Figuras 15 e
16) reduziu o tempo de imobilidade dos animais em relação aos grupos controle (controle i.p.
= 118,10 ± 10,96; controle v.o. = 116,70 ± 11,50; Clor. de imipramina 10 mg/kg, i.p. = 18,10
± 2,7).
76
FIGURA 15 – Efeito do tratamento agudo com iangambina por via intraperitoneal no tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos. Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via intraperitoneal e 1/2 hora após o último tratamento foram colocados na cuba de acrílico e o teste foi conduzido de acordo com o exposto no material e métodos. O cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 10 camundongos por grupo) do tempo de imobilidade (s). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
ControleIag 25 mIag 50 mIag 75 mClor.Imp0
100
200
300ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/ kgIag 75 mg/kgClor.de Imipramina 10mg/kg
*****
***
***
Tem
po d
e im
obil
idad
e (s
)
77
FIGURA 16 – Efeito do tratamento agudo com iangambina por via oral no tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos. Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via oral e 1 hora após o último tratamento foram colocados na cuba de acrílico e o teste foi conduzido de acordo com o exposto no material e métodos. O cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 15 camundongos por grupo) do tempo de imobilidade (s). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; *p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).
ControleIag 25 mIag 50 mIag 75 mCl. IMP 10
100
200ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgClor.de Imipramina10 mg/kg
* * *
***Tem
po d
e im
obil
idad
e (s
)
78
4.1.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital (vias intraperitoneal e oral)
No teste do tempo de sono induzido por pentobarbital foram observados dois
parâmetros: o tempo de latência (s), que corresponde ao tempo que o animal leva para
adormecer, e a duração do sono (min). Conforme a Figura 17 A e B, após a administração
intraperitoneal da iangambina (Iag) 25 e 50 mg/kg, foi visto uma redução significativa no
tempo de latência do sono (TL) apenas com a maior dose em relação ao grupo controle (TL:
controle = 276,92 ± 14,63; Iag 25 = 247,42 ± 15,51; Iag 50 = 177,00 ± 18,17), e apresentou
aumento significativo na duração do sono (DS) nas duas doses empregadas em relação ao
controle (DS: controle = 37,62 ± 1,64; Iag 25 = 53,45 ± 4,48; Iag 50 = 64,06 ± 6,81).
Nenhuma alteração no tempo de latência foi vista após administração oral da
iangambina nas mesmas doses usadas (TL: controle = 353,50 ± 27,19; Iag 25 = 317,88 ±
25,79; Iag 50 = 311,13 ± 15,70), contudo, foi observado aumento significativo na duração do
sono em ambas as doses (DS: controle = 26,81 ± 2,19; Iag 25 = 49,56 ± 2,61; Iag 50 = 43,48
± 3,62) Figura 18 A e B.
Como esperado, o diazepam 1 mg/kg, i.p., reduziu o tempo de latência do sono e
aumentou a duração do sono respectivamente (TL: 187,6 ± 9,25 e DS: 74,18 ± 6,82) em
relação aos grupos controle (TL: controle i.p. = 276,92 ± 14,63 e DS:controle i.p. = 37,62 ±
1,64) e (TL: controle v.o. = 353,50 ± 27,19 e DS: = 26,81 ± 2,19) conforme as Figuras 17 e
18 A e B.
79
A
B
FIGURA 17 – Efeito da iangambina intraperitoneal no tempo de sono induzido por pentobarbital em camundongos. Os animais foram tratados por via intraperitoneal com iangambina (Iag) 25 e 50 mg/kg, 30 minutos antes da administração do pentobarbital 40 mg/kg, i.p.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 10 – 12 camundongos por grupo) do tempo de latência em segundos (A) e a duração do sono em minutos (B). Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
Controle Iag 25 mg/kIag 50 mg/kDiazepam 10
100
200
300
ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
*** ***
Tem
po d
e la
tênc
ia (
s)
Controle Iag 25 mg/kIag 50 mg/kDiazepam 10
25
50
75
100
*
*****
Dur
ação
do
sono
(m
in)
80
A
B
FIGURA 18 – Efeito da iangambina via oral no tempo de sono induzido por pentobarbital em camundongos. Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25 e 50 mg/kg, 1 hora antes da administração do pentobarbital 40 mg/kg, i.p. O diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 10 – 12 camundongos por grupo) do tempo de latência em segundos (A) e a duração do sono em minutos (B). Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
Controle Iag 25 mg/kIag 50 mg/kDiazepam 10
100
200
300
400
ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgDiazepam 1 mg/kg ip
***
Tem
po d
e la
tênc
ia (
s)
Controle Iag 25 mg/Iag 50 mg/Diazepam0
25
50
75
100
***
***
**
Dur
ação
do
sono
(m
in)
81
4.1.5 Teste da placa perfurada (vias intraperitoneal e oral)
Neste modelo experimental, após a administração aguda de iangambina nas doses
de 25; 50 e 75 mg/kg, foi observado um significante aumento do número de vezes que o
animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), tanto por via
intraperitoneal como por via oral, quando comparado aos respectivos grupos controle (via
intraperitoneal: controle = 26,5 ± 1,42; Iag 25 = 34,9 ± 1,57; Iag 50 = 34,3 ± 2,84; Iag 75 =
34,3 ± 2,30) e (via oral: controle = 26,4 ± 1,44; Iag 25 = 43,1 ± 4,68; Iag 50 = 38,5 ± 1,39; Iag
75 = 37,6 ± 3,89) conforme evidenciado nas Figuras 19 e 20 respectivamente.
O efeito do diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p., administrado 30 min antes do teste da
placa perfurada é mostrado nas Figuras 19 e 20. Comparado com os grupos controle (i.p. e
v.o.), os animais tratados com diazepam manifestaram um aumento significativo do número
de vezes que o animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), (controle
i.p. = 26,5 ± 1,42; controle v.o. = 26,4 ± 1,44; DZP 1 mg/kg, i.p. = 45,4 ± 1,27).
82
FIGURA 19 – Efeito do tratamento agudo com iangambina via intraperitoneal no teste de placa perfurada para camundongos. Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg e diazepam 1 mg/kg, que foi usado como droga padrão. Os tratamentos com as drogas foram realizados por via intraperitoneal e 1/2 hora após a administração cada animal foi colocado no aparato. Os valores representam média ± EPM (n = 9 – 14 camundongos por grupo) do número de vezes que o animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips) durante 5 minutos de observação. ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
Controle Iag 25 mgIag 50 mgIag 75 mgDiazepam0
10
20
30
40
50ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg
Núm
ero
deH
ead
Dip
s
* ***
***
83
FIGURA 20 - Efeito do tratamento agudo com iangambina via oral no teste de placa perfurada para camundongos. Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, v.o. e diazepam 1 mg/kg, i.p. que foi usado como droga padrão. Após 1 hora e 1/2 hora da administração oral e intraperitoneal, respectivamente, cada animal foi colocado no aparato. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 10 camundongos por grupo) do número de vezes que o animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips) durante 5 minutos de observação. ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
ControleIag 25 mIag 50 mIag 75 mDiazepa0
10
20
30
40
50ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1mg/kg ip
*** ***
** **
Núm
ero
deH
ead
Dip
s
84
4.1.6 Teste de labirinto em cruz elevado (vias intraperitoneal e oral)
Neste modelo, a administração intraperitoneal da iangambina nas doses de 25 e 50
mg/kg, reduziu de maneira significativa apenas o tempo de permanência nos braços abertos
(TPBA) (Iag 25: TPBA = 68,5 ± 10,0 s) e (Iag 50: TPBA = 73,6 ± 12,1 s), com relação ao
grupo controle (TPBA = 115,1 ± 10,1 s). A iangambina nas mesmas doses, não alterou o
número de entradas nos braços abertos (NEBA), a percentagem do número de entradas nos
braços abertos (PEBA) e a percentagem do tempo de permanência nos braços abertos
(PTBA), (Iag 25: NEBA = 5,3 ± 0,4; PEBA = 42,6 ± 1,7 %; PTBA = 33,6 ± 5,5 %) e (Iag 50:
NEBA = 5,8 ± 0,6; PEBA = 44,8 ± 2,5 %; PTBA = 32,3 ± 5,3 %), quando comparado ao
controle (NEBA = 6,6 ± 0,4; PEBA = 42,6 ± 1,7 %; PTBA = 39,6 ± 2,3 %), no entanto na
dose de 75 mg/kg foi observado um aumento significativo nos seguintes parâmetros, PEBA,
TPBA e PTBA (Iag 75: PEBA = 59,7 ± 3,3 %; TPBA = 160,8 ± 17,7 s; PTBA = 67,7 ± 7,0
%), quando comparado ao controle (PEBA = 42,6 ± 1,7 %; TPBA = 115,1 ± 10,1 s; PTBA =
39,6 ± 2,3 %. A iangambina na dose de 75 mg/kg, não alterou o número de entradas nos
braços abertos (NEBA = 5,5 ± 0,7) em relação ao grupo controle (NEBA = 6,6 ± 0,4) (Tabela
3 e Figura 21 A e B).
A administração oral da iangambina nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg produziu
aumento significativo em dois parâmetros, PEBA e PTBA (Iag 25: PEBA = 47,4 ± 1,2 %;
PTBA = 49,5 ± 1,8 %), (Iag 50: PEBA = 48,8 ± 1,6 %; PTBA = 47,2 ± 2,4 %) e (Iag 75:
PEBA = 58,4 ± 3,6 %; PTBA = 67,7 ± 7,0 %), quando comparado ao controle (PEBA = 40,3±
2,0 %; PTBA = 39,7 ± 2,6 %). Foi observado um aumento significativo nas doses de 50 e 75
do NEBA (Iag 50: 8,1 ± 0,5) e do TPBA (Iag 75: 170,2 ± 16,2 s), respectivamente em relação
ao grupo controle (NEBA = 6,2 ± 0,6; TPBA = 115,3 ± 5,7 s). A iangambina nas doses de 25
e 75, não alterou o NEBA (Iag 25 = 7,8 ± 0,5; Iag 75 = 5,3 ± 0,6) comparado ao grupo
controle (NEBA = 6,2 ± 0,6) e nas doses de 25 e 50 não foi observada nenhuma alteração do
TPBA (Iag 25 = 125,9 ± 5,7 s; Iag 50 = 124,6 ± 6,4 s) comparado ao controle (TPBA = 115,3
± 5,7 s) Tabela 4 e Figura 22 A e B).
85
O diazepam (1 mg/kg, i.p.), utilizado como droga padrão, aumentou
significativamente todos os parâmetros observados (NEBA = 16,1 ± 1,2; PEBA = 67,7 ± 4,4
%; TPBA = 204,0 ± 13,1 s; PTBA = 72,3 ± 4,2 %) com relação ao controle intraperitoneal
(NEBA = 6,6 ± 0,4; PEBA = 42,6 ± 1,7 %; TPBA = 115,1 ± 10,1 s; PTBA = 39,6 ± 2,3 %) e
o controle oral (NEBA = 6,2 ± 0,6; PEBA = 40,3± 2,0 %; TPBA = 115,3 ± 5,7 s; PTBA =
39,7 ± 2,6 %) (Tabelas 3 e 4; Figuras 21 e 22 - A e B)
Com objetivo de investigar se o efeito ansiolítico da iangambina poderia ser
mediado pelo receptor benzodiazepínico, flumazenil 2,5 mg/kg,i.p., um antagonista específico
para o reconhecimento deste receptor, foi co-administrado com iangambina 75 mg/kg, v.o. em
camundongos. Conforme a Tabela 4 e Figura 22 - A e B, podemos observar que o tempo de
permanência nos braços abertos (TPBA) e a percentagem do tempo de permanência nos
braços abertos (PTBA) foram revertidos de maneira significativa no grupo tratado com Iag 75
na presença do flumazenil, com relação aos animais tratados com Iag 75 mg/kg, v.o.,
demonstrando que provavelmente a iangambina exerceu seu efeito ansiolítico via receptor
benzodiazepínico, TPBA (Flu + Iag 75 = 111,4 ± 15,7 s) e PTBA (Flu + Iag 75 = 43,7 ± 6,1
%), versus TPBA (Iag 75 = 170,2 ± 16,2 s) e PTBA (Iag 75 = 67,9 ± 5,4 %). O flumazenil
sozinho não alterou os parâmetros observados (NEBA = 5,7 ± 0,5; PEBA = 44,7 ± 3,0 %;
TPBA = 106,3 ± 7,9 s; PTBA = 46,3 ± 3,8 %) com relação ao grupo controle (NEBA = 6,2 ±
0,6; PEBA = 40,3± 2,0 %; TPBA = 115,3 ± 5,7 s; PTBA = 39,7 ± 2,6 %).
86
TABELA 3 – Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do
labirinto em cruz elevado para camundongos
Grupos
NEBA
PEBA
TPBA
PTBA
Controle
6,6 ± 0,4 42,6 ± 1,7 115,1 ± 10,1 39,6 ± 2,3
Iag 25 mg/kg
5,3 ± 0,4 42,6 ± 1,7 68,5 ± 10,0*** 33,6 ± 5,5
Iag 50 mg/kg
5,8 ± 0,6 44,8 ± 2,5 73,6 ± 12,1* 32,3 ± 5,3
Iag 75 mg/kg 5,5 ± 0,7 59,7 ± 3,3** 160,8 ± 17,7* 67,7 ± 7,0**
DZP 1 mg/kg
16,1 ± 1,2** 67,7 ± 4,4** 204,0 ± 13,1** 72,3 ± 4,2**
Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25; 50 e 75 mg/kg, i.p.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p. foi administrado como droga padrão e 1/2 hora após a administração das drogas os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) em segundos e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA). Os valores representam média ± EPM (n = 08 – 20 camundongos por grupo). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; grupos tratados comparados ao controle (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).
87
A
B
FIGURA 21 – Efeito da iangambina intraperitoneal no teste de labirinto em cruz
elevado. Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, i.p. O diazepam
(DZP) 1 mg/kg, i.p. foi administrado como droga padrão e 1/2 hora após a administração das
drogas os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz
elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços
abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de
permanência nos braços abertos (TPBA) e percentagem do tempo de permanência nos braços
abertos (PTBA) o que está expresso como percentagem em relação ao controle. NEBA e
TPBA (A) e PEBA e PTBA (B). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; grupos tratados
comparados ao controle (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).
0
100
200
300
Contro
le
Iag 25
Iag 50
Iag 75
DZP 1
% d
e A
ltera
ção
NEBA
TPBA*** *
*
**
**
0
50
100
150
200
Contro
le
Iag 25
Iag 50
Iag 75
DZP 1
% d
e A
ltera
ção
PEBA
PTBA
****
****
88
TABELA 4 - Efeito da administração oral da iangambina no teste de labirinto em cruz
elevado para camundongos.
Grupos
NEBA
PEBA
TPBA
PTBA
Controle 6,2 ± 0,6 40,3 ± 2,0 115,3 ± 5,7 39,7 ± 2,6
DZP 1 16,1 ± 1,2** 67,7 ± 4,4**
204,0 ± 13,1** 72,3 ± 4,2**
Iag 25 7,8 ± 0,5 47,4 ± 1,2** 125,9 ± 5,7 49,5 ± 1,8**
Iag 50 8,1 ± 0,5* 48,8 ± 1,6** 124,6 ± 6,4 47,2 ± 2,4*
Iag 75 5,3 ± 0,6 58,4 ± 3,6** 170,2 ± 16,2** 67,9 ± 5,4**
Flu 2,5 5,7 ± 0,5 44,7 ± 3,0 106,3 ± 7,9 46,3 ± 3,8
Flu 2,5 + Iag 75 5,8 ± 0,7 54,2 ± 3,3 111,4 ± 15,7a 43,7 ± 6,1a
Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, flumazenil (Flu) 2,5 mg, i.p., seguido por salina (Flu + salina v.o.) ou de Iag 75 (Flu + Iag 75), 15 min após o tratamento com flumazenil. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Após 1 hora e 1/2 hora da administração oral da iangambina e DZP i.p., respectivamente, e 1 hora, após a administração da salina e Iag 75 nos grupos Flu + salina e Flu + Iag 75, os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) em segundos e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA). Os valores representam média ± EPM (n = 10 – 17 camundongos por grupo). *p < 0,05; **p < 0,01; grupos tratados comparados ao controle e ap < 0,05 vs Iag 75 mg/kg (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).
89
A
B
FIGURA 22 – Efeito da iangambina via oral no teste de labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, flumazenil (Flu) 2,5 mg, i.p., seguido por salina (Flu + salina v.o.) ou de Iag 75 (Flu + Iag 75), 15 min após o tratamento com flumazenil. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Após 1 hora e 1/2 hora da administração oral da iangambina e DZP i.p., respectivamente, e 1 hora, após a administração da salina e Iag 75 nos grupos Flu + salina e Flu + Iag 75, os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) o que está expresso como percentagem em relação ao controle. NEBA e TPBA (A) e PEBA e PTBA (B). *p < 0,05; **p < 0,01; grupos tratados comparados ao controle e ap< 0,05 vs Iag 75 mg/kg (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).
a
0
50
100
150
200
250
300
Controle
DZP 1Ia
g 25
Iag 5
0
Iag 7
5
Flu 2,5
Flu 2,5
+ Iag 75
% d
e A
ltera
ção NEBA
TPBA
***
**
**
a
0
50
100
150
200
Controle
DZP 1Iag
25
Iag 50
Iag 75
Flu
Flu + Iag 7
5
% d
e A
lter
ação
PEBA
PTBA
** ** ** ***
**** **
90
4.1.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol (vias intraperitoneal e oral)
Os animais tratados por via intraperitoneal e por via oral com iangambina nas
doses de 25, 50 e 75, não apresentaram alterações em suas latências de convulsão quando
comparados ao controle (via intraperitoneal: Iag 25 = 85,3 ± 5,9 s; Iag 50 = 82,4 ± 8,2 s; Iag
75 = 64,6 ± 1,8 s; controle = 68,2 ± 3,8 s) e (via oral: Iag 25 = 89,2 ± 4,0 s; Iag 50 = 81,7 ±
6,8 s, Iag 75 = 72,3 ± 3,9 s; controle = 73,9 ± 3,9 s) (Tabela 5 e 6).
A latência de morte aumentou de forma significativa apenas na dose de
iangambina 75 mg/kg, i.p (320,8 ± 16,8 s; controle = 268,3 ± 26,9 s). Nas outras doses usadas,
tanto por via intraperitoneal como por via oral, não houve modificação neste parâmetro em
relação ao controle (via intraperitoneal: Iag 25 = 284,2 ± 29,7 s; Iag 50 = 264,6 ± 26,7 s;
controle = 268,3 ± 26,9 s) e (via oral: Iag 25 = 216,0 ± 28,0 s; Iag 50 = 201,2 ± 28,6 s; Iag 75
= 227,8 ± 27,2 s; controle = 221,3 ± 23,3 s) (Tabela 5 e 6).
A percentagem de animais tratados por via intraperitoneal e oral com iangambina
que apresentaram convulsão, assim como de animais que morreram foi de 100 % para todos
os grupos.
O diazepam 1 mg/kg, i.p., usado como droga padrão, aumentou de forma
significativa a latência de convulsão (controle i.p. = 68,2 ± 3,8 s; controle v.o. = 73,9 ± 3,9 s;
DZP 1 = 190,1 ± 17,2 s). Todos os animais tratados com diazepam sobreviveram durante o
tempo do teste (Tabela 5 e 6).
91
TABELA 5 – Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via
intraperitoneal, no modelo de convulsão induzida com pentilenotetrazol em
camundongos
Grupos
Latência de convulsão (s)
Latência de morte (s)
Controle
68,2 ± 3,8 (17) 268,3 ± 26,9 (17)
Iag 25 mg/kg
85,3 ± 5,9 (14) 284,2 ± 29,7 (14)
Iag 50 mg/kg
82,4 ± 8,2 (16) 264,6 ± 26,7 (16)
Iag 75 mg/kg
64,6 ± 1,8 (13) 320,8 ± 16,8 (13)*
DZP 1 mg/kg i.p.
190,1 ± 17,2 (18)*** -
Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., 30 minutos antes da administração de pentilenotetrazol 100 mg/kg, i.p.. O diazepam (DZP) 1,0 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM da latência de convulsão e morte dos animais em segundos. Em parênteses o número de animais por grupo. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. *p < 0,05; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
92
TABELA 6 – Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via oral., no
modelo de convulsão induzida com pentilenotetrazol em camundongos
Grupos
Latência de convulsão (s) Latência de morte (s)
Controle
73,9 ± 3,9 (20) 221,3 ± 23,3 (20)
Iag 25 mg/kg
89,2 ± 4,0 (13) 216,0 ± 28,0 (13)
Iag 50 mg/kg
81,7 ± 6,8 (10) 201,2 ± 28,6 (10)
Iag 75 mg/kg
72,3 ± 3,9 (13) 227,8 ± 27,2 (13)
DZP 1 mg/kg i.p.
190,1 ± 17,2 (18)*** -
Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, via oral., 1 hora antes da administração de pentilenotetrazol 100 mg/kg, i.p. O diazepam (DZP) 1,0 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM da latência de convulsão e morte dos animais em segundos. Em parênteses o número de animais por grupo. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
93
4.2 Estudo neuroquímico
4.2.1 Dosagens de monoaminas
Os níveis das monoaminas e seus metabólitos em córtex motor de camundongos
após 24 horas da administração aguda de iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) estão
apresentados nas Figuras 23 e 24.
Nos grupos tratados com iangambina nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg houve uma
redução em torno de 73, 84 e 63 %, respectivamente, nos conteúdos de dopamina, (Iag 25 =
48,5 ± 5,2; Iag 50 = 27,9 ± 5,5; Iag 75 = 65,4 ± 7,1) e em cerca de de 50, 47 e 70 % nos
conteúdos de HVA (Iag 25 = 56,6 ± 7,5; Iag 50 = 60,1 ± 7,8; Iag 75 = 33,2 ± 4,4) quando
comparado aos seus respectivos controles (DA = 176,9 ± 18,7 e HVA = 113,6 ± 13,7).
Nenhuma diferença significativa foi vista com estas doses com relação aos níveis de DOPAC
(Controle = 35,2 ± 4,1; Iag 25 = 29,5 ± 3,7; Iag 50 = 24,1 ± 3,4; Iag 75 = 25,4 ± 3,3).
O tratamento com iangambina na dose de 75 mg/kg, aumentou cerca de 70% os
conteúdos de noradrenalina, (Iag 75 = 557,9 ± 42,6) quando comparado ao controle (327,3 ±
47,3), entretanto nas doses de 25 e 50 mg/kg não foi observada nenhuma diferença
significativa (Controle = 327,3 ± 47,3; Iag 25 = 257,3 ± 32,6; Iag 50 = 265,1 ± 37,3).
A Figura 24 mostra um aumento de 288, 90 e 64 % nos níveis de serotonina em
camundongos tratados com iangambina 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente (Iag 25 =
521,1 ± 22,5; Iag 50 = 256,5 ± 12,7; Iag 75 = 220 ± 42,6), quando comparado ao controle
(134,4 ± 16,8), acompanhado de uma redução de 24, 46 e 35 %, nos níveis de 5-HIAA para as
doses de 25, 50 e 75 mg/kg, respectivamente (Iag 25 = 211,0 ± 28,7; Iag 50 = 148,7 ± 8,68;
Iag 75 = 179,4 ± 14,3) com relação ao controle (278,0 ± 28,2).
A Figura 25 apresenta o efeito da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, ip),
administrada de forma aguda, 24 horas após o tratamento sobre as taxas de DOPAC/DA,
HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em córtex motor.
94
Houve um aumento significativo de 244, 372 e 100 % nas taxas de DOPAC/DA
com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,62 ± 0,07; Iag 50 = 0,85
± 0,15; Iag 75 = 0,36 ± 0,05), quando comparado ao controle (0,18 ± 0,02). Foi observado,
apenas com as doses de 25 e 50 mg/kg, i.p., um aumento significativo de 121 e 326 % nas
taxas de HVA/DA, respectivamente (Iag 25 = 1,35 ± 0,25; Iag 50 = 2,60 ± 0,34) quando
comparado ao controle (0,61 ± 0,08), embora, nenhuma diferença significativa tenha sido
vista com a maior dose (controle = 0,61 ± 0,08; Iag 75 = 0,54 ± 0,11). Houve uma redução
significante de 79, 72, 54 %, nas taxas de 5-HIAA/5-HT, para as doses de 25, 50 e 75 mg/kg,
i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,41 ± 0,06; Iag 50 = 0,55 ± 0,03; Iag 75 = 0,91 ± 0,17)
quando comparado ao controle (1,98 ± 0,14).
As Figuras 26 e 27 mostram os níveis das monoaminas e seus metabólitos em
corpo estriado de camundongos, após 24 horas da administração aguda de iangambina 25, 50
e 75 mg/kg, i.p..
Nenhuma diferença significativa foi vista nos níveis de dopamina após o
tratamento com iangambina nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg, (Controle = 2041,0 ± 184,9; Iag
25 = 2030,0 ± 244,1; Iag 50 = 2409,0 ± 289,8; Iag 75 = 2060,0 ± 250,2), no entanto,
apresentou aumento significativo nos conteúdos de DOPAC de 145, 107 e 266 % para as
doses de 25, 50 e 75 mg/kg, respectivamete (Iag 25 = 1180,0 ± 87,2; Iag 50 = 996,5 ± 73,9;
Iag 75 = 1764,0 ± 188,2) quando comparado ao controle (481,2 ± 41,5) e aumentou os níveis
de HVA em torno de 44 %, apenas com a dose de 75 mg/kg (Iag 75 = 1268,0 ± 49,8) quando
comparado ao controle (882,1 ± 79,3). Não houve diferença significativa entre os grupos 25 e
50 mg/kg com relação aos níveis de HVA (Controle = 882,1 ± 79,3; Iag 25 = 1080,0 ± 105,7;
Iag 50 = 767,8 ± 26,8).
Os conteúdos de noradrenalina foram reduzidos em torno de 68, 76 e 74 % para as
doses de iangambina 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente (Iag 25 = 410,9 ± 29,8; Iag 50 =
305,2 ± 25,3; Iag 75 = 328,2 ± 32,8) quando comparado ao controle (1286,0 ± 80,2).
Nenhuma alteração significativa foi evidenciada entre quaisquer dos grupos com
relação aos níveis de serotonina (Controle = 684,6 ± 62,5; Iag 25 = 719,5 ± 36,3; Iag 50 =
95
667,5 ± 76,6; Iag 75 = 724,1 ± 73,4), no entanto houve aumento significativo nos conteúdos
de 5-HIAA em torno de 229, 278 e 111 %, para as doses de 25, 50 e 75 mg/kg,
respectivamente (Iag 25 = 537,6 ± 55,3; Iag 50 = 618,1 ± 61,5; Iag 75 = 344,3 ± 42,7),
quando comparado ao controle (163,1 ± 16,2).
A Figura 28 apresenta o efeito da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, ip),
administrada de forma aguda, 24 horas após o tratamento sobre as taxas de DOPAC/DA,
HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em corpo estriado.
Houve um aumento significativo de 134, 73 e 203 % nas taxas de DOPAC/DA
com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,61 ± 0,05; Iag 50 = 0,45
± 0,08; Iag 75 = 0,79 ± 0,09), quando comparado ao controle (0,26 ± 0,02). Foi observada,
apenas com a maior dose, um aumento significativo de 59 % nas taxas de HVA/DA, (Iag 75 =
0,70 ± 0,12), quando comparado ao controle (0,44 ± 0,03), entretanto, nenhuma alteração
significativa foi vista com as doses de 25 e 50 mg/kg,i.p.,(controle = 0,44 ± 0,03; Iag 25 =
0,54 ± 0,07; Iag 50 = 0,36 ± 0,04). Houve aumento significante de 225, 320, 70 %, nas taxas
de 5-HIAA/5-HT, para as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,78 ±
0,09; Iag 50 = 1,01 ± 0,15; Iag 75 = 0,41 ± 0,05) quando comparado ao controle (0,24 ± 0,02).
96
FIGURA 23 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em córtex motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 5 – 10). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.
con25 D50 D75 Despcon25 D50 D75 Despcon25 H50 H75 H0
100
200ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg
DA DOPAC HVA
******
*** ** ***
***
ng/g
de
teci
do
97
FIGURA 24 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em córtex motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 4 – 8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Noradrenalina (NA), serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.
con25 50 N75 Nespcon5-H5-H5-Hespcon5-H5-H5-H0
250
500
750ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75mg/kg
NA 5-HT 5-HIAA
ng/g
de
teci
do
*****
* * **** **
98
FIGURA 25 – Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em córtex motor de camundongos determinado 24 horas depois da última administração. As medidas foram realizadas em 4-7 áreas de cada grupo. N = 5-7 para DOPAC/DA; N = 5-6 para HVA/DA e N = 4-6 para 5-HIAA/5-HT. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC); ácido homovanílico (HVA); serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
DODODODOESHVAHVAHVAHVAES5HI5HI5HI5HIESP0
1
2
3ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg
DOPAC/DA HVA/DA 5HIAA/5HT
*****
*
*
**
Tax
a de
Met
abol
izaç
ão
******
***
99
FIGURA 26 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em corpo estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 5 – 9). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.
con25 D50 D75 Despcon25 D50 D75 Despcon25 H50 H75 H0
1000
2000
3000
ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg
DA DOPAC HVA
***
***
**
ng/g
de
teci
do
100
FIGURA 27 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em corpo estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 5 – 12). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Noradrenalina (NA), serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.
con25 50 N75 Nespacon5-H5-H5-Hespacont5-H5-H5-H0
500
1000
1500ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg
NA 5-HT 5-HIAA
*********
******
*ng/g
de
teci
do
101
FIGURA 28 – Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em corpo estriado de camundongos determinado 24 horas depois da última administração. As medidas foram realizadas em 5-11 áreas de cada grupo. N = 6-7 para DOPAC/DA; N = 5-8 para HVA/DA e N = 5-11 para 5-HIAA/5-HT. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC); ácido homovanílico (HVA); serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
DODODODOESPHVAHVAHVAHVAESP5HI5HI5HI5HIESP0.0
0.5
1.0
1.5ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg
***
*** * **
***
*
DOPAC/DA HVA/DA 5HIAA/5HT
Tax
a de
Met
abol
izaç
ão
102
4.2.2 Ensaios de binding
4.2.2.1 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em homogenatos de
córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).
A Tabela 7 mostra o efeito da iangambina em homogenatos de córtex motor e
corpo estriado, diretamente sobre o binding de [3H]-SCH 23390 (experimento in vitro). Em
córtex motor, a iangambina não produziu efeito em nenhuma das doses usadas, no entanto, em
corpo estriado, ocorreu uma inibição em torno de 40 % do binding de [3H]-SCH 23390
quando incubado com iangambina em todas as doses estudadas (Iag 5 µM = 181,2 ± 22,9; Iag
10 µM = 183,6 ± 27,4; Iag 50 µM = 143,7 ± 8,4; Iag 100 µM = 166,2 ± 9,8 fmoles/mg de
proteína) quando comparado ao controle (280,1 ± 17,6 fmoles/mg de proteína).
103
TABELA 7 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em homogenatos
de córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).
Iangambina
(µM)
Córtex Motor
D1-símile
Corpo Estriado
D1-símile
0 118,1 ± 5,9 (6) 280,1 ± 17,6 (4)
5 - 181,2 ± 22,9 (4)**
10 - 183,6 ± 27,4 (4)**
50 114,9 ± 10,3 (6) 143,7 ± 8,4 (4)***
100 125,9 ± 15,7 (6) 166,2 ± 9,8 (4)**
200 143,8 ± 9,5 (6) -
Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 200), na presença de [3H]-SCH 23390, para os receptores D1-símile. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos como média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
104
4.2.2.2 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença de
mianserina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo
(experimentos in vitro).
O efeito da iangambina diretamente sobre o binding de [3H]-espiroperidol em
presença de mianserina apresentou inibição no binding D2 nas duas áreas cerebrais estudadas
apenas com as duas maiores doses. Em córtex motor a inibição foi maior que em corpo
estriado, em torno de 45,5 % e 29 %, respectivamente, do binding de [3H]-espiroperidol
quando incubado com iangambina (córtex motor: Iag 100 µM = 165,3 ± 17,3; Iag 200 µM =
114,4 ± 11,7; controle = 256,3 ± 22,7 fmoles/mg de proteína) e (corpo estriado: Iag 100 µM =
165,1 ± 17,7; Iag 200 µM = 154,7 ± 6,4; controle = 224,8 ± 11,8 fmoles/mg de proteína), não
ocorrendo nenhum efeito nas outras doses usadas em ambas áreas cerebrais (Tabela 8).
105
TABELA 8 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença
de mianserina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo
(experimentos in vitro).
Iangambina
(µM)
Córtex Motor
D2-símile
Corpo Estriado
D2-símile
0 256,3 ± 22,7 (5) 224,8 ± 11,8 (6)
5 266,6 ± 31,4 (4) 188,7 ± 9,9 (4)
10 288,4 ± 27,9 (5) 198,6 ± 20,4 (4)
50 256,5 ± 23,1 (5) 187,2 ± 18,1 (4)
100 165,3 ± 17,3 (6)** 165,1 ± 17,7 (5)*
200 114,4 ± 11,7 (5)*** 154,7 ± 6,4 (6)**
Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 200), sobre o binding de [3H]-espiroperidol na presença de mianserina, para os receptores D2-símile. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos como média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
106
4.2.2.3 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em homogenatos de córtex
motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).
Em córtex motor, a iangambina produziu efeito no binding muscarínico, onde
apresentou uma inibição de 63 % do binding de [3H]-NMS apenas na presença de 200 µM
(107,8 ± 19,9 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle (291,6 ± 25,1 fmoles/mg
de proteína), não ocorrendo nenhum efeito nas outras doses usadas. Com relação a outra área
cerebral estudada, o corpo estriado, ocorreu uma inibição em torno de 42 % do binding de
[3H]-NMS quando incubado com iangambina (Iag 10 µM = 179,4 ± 21,3; Iag 50 µM = 158,6
± 5,6; Iag 100 µM = 173,6 ± 21,3 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle
(292,1 ± 20,9 fmoles/mg de proteína) (Tabela 9).
107
TABELA 9 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em homogenatos de
córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).
Iangambina
(µM)
Córtex Motor
(M1+M2)-símile
Corpo Estriado
(M1+M2)-símile
0 291,6 ± 25,1 (5) 292,1 ± 20,9 (10)
5 - 296,5 ± 27,2 (4)
10 - 179,4 ± 21,3 (4)**
50 324,4 ± 21,0 (5) 158,6 ± 5,6 (4)**
100 256,5 ± 19,5 (5) 173,6 ± 21,3 (4)**
200 107,8 ± 19,9 (7)*** -
Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 200), na presença de [3H]-NMS, para os receptores muscarínicos. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos com média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
108
4.2.2.4 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença de
dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo
(experimentos in vitro).
A Tabela 10 mostra o efeito da iangambina diretamente sobre o binding de [3H]-
espiroperidol em presença de dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de
camundongo. Em córtex motor ocorreu inibição de 47,5 %, 63,5 % e 77,8 %,
respectivamente, do binding de [3H]-espiroperidol em presença de dopamina quando incubado
com iangambina (Iag 10 µM = 35,28 ± 1,51; Iag 50 µM = 24,49 ± 0,69; Iag 100 µM = 14,89
± 0,73 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle (67,18 ± 1,00 fmoles/mg de
proteína). Em corpo estriado houve inibição de 48 % apenas na presença de iangambina 100
µM (45,42 ± 4,82 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle (87,55 ± 1,51
fmoles/mg de proteína), não ocorrendo efeito nas outras doses usadas.
109
TABELA 10 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença
de dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo
(experimentos in vitro).
Iangambina
(µM)
Córtex Motor
5-HT2-símile
Corpo Estriado
5-HT2-símile
0 67,18 ± 1,00 (4) 87,55 ± 1,51 (5)
10 35,28 ± 1,51 (4) *** 71,44 ± 6,46 (4)
50 24,49 ± 0,69 (4) *** 89,09 ± 5,43 (4)
100 14,89 ± 0,73 (4) *** 45,42 ± 4,82 (5)***
Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 100), sobre o binding de [3H]-espiroperidol na presença de dopamina, para os receptores 5-HT2-símile. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos com média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. ***p < 0,001 quando comparado ao controle.
DISCUSSÃO
111
5 DISCUSSÃO
Ocotea duckei Vattimo, popularmente conhecida como “louro de cheiro”, “louro
pimenta” e “louro canela” é encontrada no Nordeste do Brasil (BARRETO, 1990). Da casca
do caule desta planta foram isoladas algumas lignanas furofurânicas, entre elas a iangambina
(CASTRO-FARIAS-NETO et al., 1995a; MORAIS et al., 1996; MORAIS et al., 1998;
MORAIS et al., 1999; BARBOSA-FILHO et al.,1999). Alguns trabalhos (Herbert et al., 1997;
Serra et al., 1997; Araújo et al., 2001) mostraram que a iangambina possui propriedades
farmacológicas. Castro-Farias-Neto et al., (1995 a,b) mostraram que a iangambina é um
antagonista seletivo do receptor do fator ativador de plaquetas (PAF) e Serra et al. (1997)
mostraram um efeito anti-alérgico da lignana furofurânica. Almeida et al. (1995) e Pachú et
al. (1993) observaram um aumento no tempo de sono induzido por pentobarbital e efeito
anticonvulsivante em animais pré-tratados com iangambina sugerindo atividade sobre o
sistema nervoso central.
O interesse do Laboratório de Neurofarmacologia em estudar compostos
biologicamente ativos, aliados a dados anteriores de possíveis efeitos centrais da iangambina,
levou-nos a investigar esta substância. Neste trabalho, os efeitos da iangambina foram
estudados em vários modelos de comportamento animal, tais como o campo aberto, rota rod,
nado forçado, tempo de sono induzido por pentobarbital, placa perfurada, labirinto em cruz
elevado, bloqueio da convulsão induzida por pentilenotetrazol. Estes testes são modelos
clássicos para screening de atividades sobre o sistema nervoso central em animais e fornece
informações tais como desempenho psicomotor, locomoção, atividades ansiolítica,
miorelaxante, depressora e anticonvulsivante. O flumazenil, um antagonista
benzodiazepínico, foi usado para investigar o possível envolvimento da iangambina no
sistema gabaérgico. Foram exploradas também possíveis alterações neuroquímicas causadas
pela iangambina, usando ensaios de binding in vitro com o fim de verificar interferência com
os sistemas dopaminérgico, colinérgico e serotonérgico bem como dosagem de monoaminas
em córtex motor e corpo estriado de camundongos para ver alterações no sistema
monaminérgico.
Estudos neurofarmacológicos, neuroquímicos e neuroanatômicos demonstraram
anteriormente interações dinâmicas entre vários neurotransmissores no sistema nervoso
112
central. Existem indicações (Arnt et al., 1987) de que os receptores D1 e D2 interagem em
sinergismo ou antagonismo. Assim, agonistas dos receptores não são efetivos separadamente,
mas atuam sinérgicamente estimulando a locomoção e induzindo estereotipia. A locomoção
depende da ativação dos receptores D1 (Starr et al., 1989), enquanto o comportamento
estereotipado depende do receptor D2 (USHIJIMA et al., 1995). Sousa et al. (1999)
demonstraram em trabalhos anteriores que o mazindol, agonista dopaminérgico, aumentou a
atividade locomotora em animais sugerindo que o efeito estimulante do mazindol pode ser
mediado pela ativação dos receptores D2, desde que, na presença de antagonista D2, tais como
pimozide e sulpiride, o efeito do mazindol foi atenuado significativamente indicando que a
ativação deste receptor é necessária para ocorrer esta resposta comportamental. Além disso,
sabe-se que o tratamento com o haloperidol, antagonista dopaminérgico, diminui a atividade
locomotora em ratos (Vasconcelos et al., 2003) enquanto a anfetamina induz comportamento
de hiperatividade (VANOVER, 1998).
O corpo estriado, junto com o pallidum, substância negra e núcleos subtalâmico
fazem parte do gânglio basal. Observações clínicas sugerem que o gânglio basal está
envolvido no controle das desordens do movimento, podendo resultar tanto na redução do
movimento, como observado na doença de Parkinson, ou movimento excessivo, como
acontece na doença de Huntington. Como foi mencionado antes, o gânglio basal faz parte do
sistema motor extra-piramidal que está envolvido com o movimento voluntário. As ações
motoras do gânglio basal são, em grande parte, conectadas ao córtex prémotor e motor via
sistema piramidal (DeLONG, 2000). No presente trabalho uma redução na atividade
locomotora no teste do campo aberto foi detectada com todas as doses de iangambina
estudadas. Foi observada também redução no comportamento de rearing e grooming.
Nossos dados dos experimentos de binding in vitro mostraram que a iangambina
interagiu com os receptores D2 em córtex motor e D1 e D2 em corpo estriado, mostrando a
participação destes receptores na locomoção. Além disso, tem sido relatado que a redução da
atividade locomotora é causada pela diminuição da dopamina, de forma que a locomoção
depende do aumento ou redução desta monoamina (HSICH et al., 1994). Nossos resultados
corroboraram com estes estudos, desde que, foi observado que os níveis de dopamina foram
reduzidos no córtex motor, e apesar de não terem sido alterados em corpo estriado,
apresentaram aumento na taxa DOPAC/DA e HVA/DA, indicando a redução do fluxo desta
monoamina nesta região (HJORTH; MAGNUSSON, 1988). Desta feita, estas observações
113
associadas, com a redução da atividade locomotora induzida pela iangambina sugere que a
substância possa atuar por mecanismos dopaminérgicos, desde que houve uma interação da
droga com estes receptores nas duas áreas cerebrais, córtex motor e corpo estriado, áreas
conhecidas por seu envolvimento no comportamento motor.
O teste de campo aberto também é amplamente usado como medida de
emocionalidade em roedores (Broadhurst, 1958; Broadhurst, 1978; Albonetti; Farabollini,
1984), além de ser utilizado para estudar os efeitos de ansiolíticos e outras classes de drogas
sobre o comportamento em um novo ambiente. Desta forma, a locomoção, rearing e
grooming em roedores, observados no campo aberto, são os parâmetros comportamentais
mais usados para descrever influências dos eventos da vida ou da administração de drogas
(MONTGOMERY, 1955; ARAKAWA; IKEDA, 1991; REX et al., 1996). Angrini et al.,
(1998) mostraram que o clordiazepóxido, um ansiolítico de referência, o propranolol, um β-
bloqueador com atividade antagonista serotonérgica (Costain; Green, 1978), usado
freqüentemente no tratamento clínico da ansiedade humana (Wheatley, 1981) e a buspirona,
um agonista parcial 5-HT1A (Simeon et al., 1994), amplamente prescrita no tratamento da
ansiedade humana, apresentaram efeitos comportamentais semelhantes no campo aberto.
Todas essas drogas reduziram o comportamento locomotor.
Em um outro estudo com ratos, usando um tipo diferente de campo aberto (Hine,
1995) foi observado que houve maior movimento em ratos de raças que geralmente
mostraram maior emocionalidade, e isto é consistente com o trabalho anterior que mostrou
uma redução na locomoção com o clordiazepóxido e as outras drogas com ação ansiolítica.
Nossos resultados mostraram que a iangambina reduziu a atividade locomotora nas três doses
usadas, tanto por via intraperitoneal como oral, sugerindo uma ação ansiolítica. O diazepam
na dose usada também reduziu a locomoção dos animais. Dados na literatura demonstraram
que a redução na atividade locomotora espontânea dá uma indicação do nível de
excitabilidade do sistema nervoso central (Mansur et al., 1971) e esta redução pode estar
relacionada a sedação resultante da depressão do sistema nervoso central (OZTURK et al.,
1996; PEREZ et al., 1998).
A atividade de rearing também esta relacionada com a hiperatividade
dopaminérgica. Estudos apontam que o aumento da atividade dopaminérgica elícita um maior
comportamento de rearing (SWANSON et al., 1997). Nossos estudos mostraram que a
114
iangambina interagiu com receptores D2 em córtex motor e em D1 e D2 em corpo estriado e
apresentou redução nos níveis de dopamina e aumento da taxa metabólica deste
neurotransmissor em córtex motor e corpo estriado, respectivamente. A redução do
comportamento de rearing induzido pela iangambina vem corroborar com estas observações.
Em alguns estudos o rearing tem sido focalizado como um aspecto de comportamento
exploratório (Johansson; Ahlenius, 1989; Hine, 1995), mas outros sugerem que agentes
ansiolíticos diminuem o número de rearing (HUGHES, 1972; STOUT, 1994).
No presente trabalho, como mencionado anteriormente, a iangambina reduziu o
número de rearing em todas as doses usadas em ambas vias administradas. A dose de
diazepam usada neste estudo também reduziu o número de rearing. Estes achados são
consistentes com estudos anteriores que mostraram que ratos de raça mais emocional
apresentaram maior número de rearing em campo aberto que uma raça menos emocional
(Hine, 1995), e com outros achados anteriores que apresentaram uma redução no número de
rearing em campo aberto produzido por ansiolíticos (GRAY, 1982). A atividade de rearing
em roedores é também descrita como um comportamento estereotipado complexo
(DANDIYA et al., 1969). Assim sendo, a redução de rearing, induzida pela iangambina, pode
também ser devido a redução da excitabilidade do sistema nervoso central por esta substância,
desde que, o sistema nervoso central é conhecido facilitar o rearing (GUPTA et al., 1971).
Desta forma, a redução do rearing observada em camundongos tratados com iangambina
associado a redução da atividade locomotora no campo aberto sugere a atividade depressora
da iangambina, considerando que, o rearing está relacionado com os níveis de excitabilidade
do sistema nervoso central (CUNHA; MASUR, 1978).
De acordo com MacFarland e Reeder, 1974 quase todos os animais gastam uma
significante parte do tempo no comportamento de grooming. Embora vários transmissores
possam modular a expressão deste comportamento (Moody et al, 1988; Traber, et al., 1988
apud Serafim; Felício, 2001), a dopamina está particularmente envolvida (COOLS; SPRUIJT;
ELLENBROEK, 1988 apud SERAFIM; FELÍCIO, 2001; DRAGO, 1999). Nossos resultados
apresentaram redução de grooming em campo aberto, assim como uma interação com
receptores dopaminérgicos nas duas áreas cerebrais estudadas, acompanhada de uma redução
da dopamina em córtex motor e elevação da sua taxa metabólica em corpo estriado. O
aumento de grooming é observado em roedores apreensivos (Archer, 1973), e em um grande
número de estudos, pesquisadores observaram que drogas ansiolíticas reduzem o grooming
115
em campo aberto (BARROS et al., 1994; DUNN et al., 1981; MOODY et al., 1993). Então,
corroborando com trabalhos anteriores que observaram redução de grooming com drogas
ansiolíticas, podemos a partir da redução do grooming induzida pela iangambina em campo
aberto, sugerir possível efeito ansiolítico desta substância o qual pode ter sido produzido pela
combinação de efeitos originados em outros receptores no sistema nervoso central, incluindo
o receptor D1/D2 (LEUNG et al., 2003). Vale salientar que a redução da atividade locomotora,
rearing e grooming também foi observada nos animais tratados com o diazepam, que foi
usado como droga ansiolítica de referência.
O teste de rota rod é amplamente usado para medir o desempenho da coordenação
motora nos animais (SEDELIS et al., 2001). Desta forma, pode-se dizer que é um modelo
simples que serve para detectar déficits neurológicos em ratos e camundongos (DUNHAM;
MIYA, 1957). A iangambina não causou alteração na coordenação motora no teste de rota
rod no protocolo estudado, sugerindo que a redução da ação locomotora observada, pode não
ter sido exercida através do bloqueio neuromuscular periférico, mas preferivelmente os efeitos
devem envolver neurônios que controlam atividade depressora central (ADZU et al., 2002).
O teste do nado forçado estabelecido por Porsolt et al. (1977a) é um modelo
animal amplamente usado para avaliar efeitos antidepressivos, e a atividade antidepressiva
neste teste, pode ser avaliada tanto em ratos como em camundongos (PORSOLT et al, 1977a;
PORSOLT et al., 1979; BORSINI, 1995). É bem estabelecido que a depressão está
relacionada a redução de noradrenalina e serotonina e que inibidores seletivos da recaptação
de noradrenalina e ou serotonina melhoram a depressão (BLIER; MONTIGNY, 1994). Foi
sugerido que a dopamina também participa na depressão e está implicada na regulação do
humor (BROWN et al., 1993). Estes achados são evidenciados em modelos animais de
depressão, que mostraram níveis de dopamina extracelular reduzidos (ROSSETTI et al.,
1993).
Recentemente foi considerado que a dopamina pode estar relacionada com os
efeitos antidepressivos (JOCA et al., 2000). De acordo com estudos anteriores, o teste do nado
forçado provocou um aumento significativo na concentração de dopamina durante este teste
(RENARD et al., 2003). A tendência por uma correlação inversa entre os níveis de dopamina
e os efeitos antidepressivos foi encontrada particularmente com a paroxetina, que apresentou
alta magnitude de efeitos antidepressivos e produziu uma baixa concentração de dopamina,
116
enquanto, a tranilcipromina mostrou menores efeitos antidepressivos, e altas concentrações de
dopamina (RENARD et al., 2004). De qualquer modo esta correlação é limitada, desde que,
outros elementos, além da concentração da dopamina deveriam ser considerados, em
particular, a atividade antidepressiva que caracteriza cada uma dessas drogas.
Foi evidenciado em nossos resultados que a iangambina aumentou o tempo de
imobilidade nas três doses usadas, tanto por via intraperitoneal como oral, e as concentrações
de dopamina foram reduzidas em córtex motor e corpo estriado. Esses resultados corroboram
dados obtidos no estudo de Renard et al. em 2004, que mostraram que drogas ansiolíticas, tais
como a buspirona e o diazepam não apresentaram atividade antidepressiva no teste do nado
forçado, embora as concentrações de dopamina induzidas por ambas as drogas fossem
consistentes com as concentrações reduzidas deste neurotransmissor obtidas com fármacos
que apresentaram efeito antidepressivo neste modelo experimental. De outra forma, a
atividade antidepressiva da bupropiona, um inibidor seletivo da recaptação da dopamina, não
deve estar ligada com a concentração da dopamina no teste do nado forçado (RENARD et al.
2004). Assim, estudos envolvendo a participação dos receptores dopaminérgicos no
mecanismo de ação deste fármaco, foram mostrados por Yamada et al. (2004). Neste estudo
foi observado que o SCH 23390, um antagonista do receptor D1, e o sulpiride, um antagonista
do receptor D2, antagonizaram os efeitos anti-imobilidade da bupropiona, sugerindo que a
participação dos receptores D1 e D2 podem potencialmente melhorar a depressão.
Dados na literatura mostram um aumento nos níveis de DOPAC (ácido 3,4-
diidroxifenilacético) em córtex préfrontal (Claustre et al., 1986) e no núcleo caudado
acompanhado de um aumento do 5-HIAA (ácido 5-hidroxindolacético) (Ikeda; Nagatsu,
1985) decorrente do estresse induzido pelo nado forçado. Em nossos resultados foi observado
que a iangambina também aumentou esses dois metabólitos (DOPAC e 5-HIAA) em corpo
estriado, região que contém o núcleo caudado, mostrando provavelmente, um efeito depressor
da droga a nível de sistema nervoso central, desde que, o teste do nado forçado induziu
depressão em animais expostos a este modelo. Além disso, conforme nossos resultados a
iangambina, interagiu com os receptores dopaminérgicos D1, em corpo estriado, e D2 em
córtex motor e corpo estriado, provavelmente produzindo um efeito antagonista em ambos
receptores, aumentando a imobilidade dos animais, como evidenciado previamente com
drogas como o SCH 23390 e o sulpiride, que reverteram o efeito antidepressivo da
bupropiona.
117
Porsolt et al., (1979) sugeriram que a imobilidade de ratos no teste do nado
forçado, reflete atividade do sistema central de catecolaminas. Eles observaram que a
imobilidade foi reduzida por drogas que elevam a atividade dopaminérgica e α-adrenérgica e
aumentada por agentes que as reduzem. Observaram também que, a imobilidade não foi
afetada por drogas β-adrenérgicas e foi relativamente insensível a drogas que atuam
seletivamente sobre a serotonina.
Em nossos resultados observamos que, em córtex motor e corpo estriado, houve
uma redução de dopamina induzida pela iangambina, o que é consistente com a redução da
atividade locomotora evidenciada no campo aberto e seu efeito depressor visto em ambos
modelos (campo aberto e teste do nado forçado). No entanto, em córtex motor, houve
aumento da concentração de noradrenalina e serotonina, e a iangambina não reduziu o tempo
de imobilidade no teste do nado forçado. Assim sendo, o aumento da noradrenalina e
serotonina influenciando o efeito antidepressivo depende da área cerebral estudada. Na outra
área estudada, ou seja, o corpo estriado, houve diminuição no fluxo de serotonina,
evidenciado pelo aumento da sua taxa metabólica, acompanhado da redução de noradrenalina.
Sabendo que, o corpo estriado consiste em três importantes subdivisões: o núcleo caudado, o
putamen e o estriado ventral, o qual inclui o nucleus accumbens, uma região envolvida com a
emoção e memória (DeLong, 2000), a redução da noradrenalina e serotonina induzida pela
iangambina nesta região, pode também indicar seu efeito depressor no nado forçado. Nossos
resultados também mostraram que a imipramina, uma droga antidepressiva clássica, e usada
neste modelo como droga de referência, como esperado, diminuiu o tempo de imobilidade, no
teste do nado forçado indicando um efeito antidepressivo.
O efeito depressor da iangambina sobre o sistema nervoso central foi também
avaliado pelo teste do tempo de sono induzido por pentobarbital. A redução da latência para o
sono bem como o prolongamento no tempo de sono são classicamente relacionados a drogas
que deprimem o sistema nervoso central (WILLIANSON et al., 1996). Os resultados
mostraram que a iangambina reduziu a latência do sono, com a maior dose usada por via
intraperitoneal, e foi observado, tanto por via intraperitoneal como oral, aumento na duração
do sono com todas as doses empregadas. Entretanto vale salientar que este teste não é
específico, visto que compostos que interferem com a biotransformação do pentobarbital pelo
citocromo P450 podem mostrar o mesmo efeito de drogas que deprimem o sistema nervoso
central (GOLOUBKOVA et al., 1998). Ou seja, o prolongamento da hipnose pelo
118
pentobarbital pode ser devida as propriedades sedativas e/ou hipnóticas (Fujimori, 1965)
atribuídas a inibição do metabolismo do pentobarbital (Kaul; Kulkarni, 1978) ou mecanismos
centrais envolvidos na regulação do sono (N’GOUEMO et al., 1994).
No entanto, no presente trabalho, foi avaliada também a atividade locomotora dos
animais no campo aberto, e a iangambina reduziu de forma significativa a atividade
locomotora. A literatura enfatiza que a redução deste comportamento é indicativo de sedação
(Ozturk et al., 1996), como resultado da redução da excitabilidade do sistema nervoso central
(Mansur et al., 1971) e drogas que suprimem esta atividade, podem estar ligadas a atividade
depressora central. Assim sendo, os efeitos da iangambina na potenciação do sono induzido
pelo pentobarbital e a redução da atividade locomotora sugerem muito bem efeito depressor
central (PEREZ et al., 1998). Além do mais a coordenação motora dos animais não foi afetada
pela iangambina, avaliada no teste de rota rod, sugerindo que a mesma não exerceu bloqueio
neuromuscular periférico, mas preferencialmente elicitou uma ação central (Perez et al.,
1998), indicando que esta substância pura pode provavelmente atuar como uma droga
neurosedativa (CAPASSO et al., 1996).
A ansiedade, diferente de outras condições psiquiátricas, tais como, esquizofrenia
e depressão, é uma emoção normal e também uma desordem psiquiátrica. Muitas vezes é
difícil separar a condição normal da patológica, no entanto, quando os sintomas são
freqüentes e mal adaptados, interferindo com o funcionamento normal do indivíduo, a
ansiedade é considerada patológica e requer terapia farmacológica (BHATTACHARYA;
SATTYAN, 1997). O aparecimento dos benzodiazepínicos, contribuiu para uma melhor
compreensão das bases da ansiedade. Essas drogas foram introduzidas na clínica médica há
mais de quatro décadas e são os agentes ansiolíticos de escolha devido a sua efetividade e
relativa segurança. Entretanto, essas drogas podem induzir tolerância e dependência física
(WALKER, 1990). Isto tem direcionado a pesquisa para novos e melhores agentes
ansiolíticos. Drogas que reduzem a atividade serotonérgica central, tais como, o agonista
parcial do receptor 5-HT1A, buspirona, e o antagonista 5-HT3, ondansetron, tem desviado a
atenção dos benzodiazepínicos.
Desde que as plantas possuem múltiplas ações farmacológicas por conterem
numerosos constituintes de natureza química diversa, tem sido uma importante fonte da
medicina. Desta maneira, na pesquisa de novos ansiolíticos efetivos e seguros, os
119
farmacologistas investigam na natureza, e esforços são realizados na busca de fármacos para
ansiedade originados do reino vegetal (PETKOV; STANEVA, 1963). O teste da placa
perfurada (Hole board), foi estudado para explorar o potencial ansiolítico da iangambina.
Neste teste é medido o comportamento exploratório em roedores (FILE; WARDILL, 1975). O
número de vezes que o animal coloca a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), tem
sido registrado como um parâmetro para avaliar as condições de ansiedade em animais. Neste
modelo, doses não-sedativas de benzodiazepínicos e outras drogas ansiolíticas, aumentaram o
número de head dips em camundongos, enquanto seus antagonistas o reduziram (CRAWLEY,
1985).
Estudos realizados por Takeda et al. (1998) demonstraram que, ansiolíticos
benzodiazepínicos, tais como, o diazepam e o clordiazepóxido, apresentaram efeitos
consistentes no comportamento de head dips no teste da placa perfurada, ou seja, ambos
aumentaram o número de head dips em doses que estes compostos não produziam sedação.
Esta observação é consistente com resultados anteriores, que mostraram aumento na
freqüência de head dips seguida de injeções de doses não sedativas de diazepam. No entanto
este efeito foi revertido com doses maiores de diazepam, o qual induziu sedação (SUZUKI et
al., 1990). Estudos realizados com compostos ansiogênicos, tais como, FG7142 e β-CCM,
ambos derivados β-carbolina, mostraram que estas drogas reduziram o número de head dips
(TAKEDA et al., 1998). Estes efeitos sugerem que a redução no comportamento de head dip
pode refletir estado ansiogênico do animal, e que ambos os estados ansiolíticos e ansiogênicos
podem ser estimados usando o teste da placa perfurada (TAKEDA et al., 1998). Com base
nestes estudos e, em informações que a expressão de um estado ansiolítico em animais pode
ser refletida por um aumento no comportamento de head dip, nossos resultados forneceram
evidências que a iangambina apresentou efeito ansiolítico, desde que, nas doses de 25, 50 e 75
mg/kg, tanto por via intraperitonal como oral, mostrou aumento deste comportamento.
Nos últimos anos o labirinto em cruz elevado (LCE) tem sido amplamente usado
como um procedimento rápido e simples para detectar ambos efeitos ansiolítico e ansiogênico
de drogas em ratos e camundongos (PELLOW et al., 1985). Quando confinados nos braços
abertos, ratos mostram manifestações comportamentais e fisiológicas de medo, tais como
freezing, defecação, e aumento de corticosteróides no plasma (PELLOW et al., 1985; TREIT
et al.,1993). Drogas ansiolíticas aumentam o número e o tempo de permanência nos braços
abertos, enquanto agentes ansiogênicos fazem o oposto (HANDLEY; MITHANIM, 1984;
120
PELLOW et al., 1985; PELLOW; FILE, 1986; TRULLAS; SKOLNICK, 1991). Este modelo
experimental é muito sensível para determinar a influência do receptor
GABAA/Benzodiazepínico no processo de ansiedade, visto que, outras drogas como a
buspirona, que envolve receptores serotonérgicos, tem resultados muito variáveis em relação a
esse teste. Portanto, o labirinto em cruz elevado é uma excelente ferramenta para detectar
compostos que tenham relação com o complexo receptor GABAA/Benzodiazepínico
(RODGERS et al., 1997).
No presente estudo, o LCE foi usado para confirmar o efeito ansiolítico da
iangambina, evidenciado no teste da placa perfurada, em adição aos seus efeitos sedativos e
depressores demonstrados nos testes do tempo de sono induzido por pentobarbital e nado
forçado, respectivamente. Como esperado, o diazepam, usado como droga ansiolítica de
referência, produziu significante aumento em todos os parâmetros analisados, ou seja, número
de entradas nos braços abertos (NEBA), percentual do número de entradas nos braços abertos
(PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) e percentual do tempo de
permanência nos braços abertos (PTBA). Estes aumentos foram acompanhados por alterações
significativas na atividade locomotora.
Estes resultados foram consistentes com vários estudos anteriores, os quais
mostraram que o diazepam e outros benzodiazepínicos produziram efeitos ansiolíticos em
uma variedade de procedimentos para screening de atividade ansiolítica, incluindo modelos
de conflito (Vogel, 1971), labirinto (Pellow; File, 1986), outros modelos não-punitivos (File,
1980; Winslow; Insel, 1991) e modelos de discriminação de drogas (ANDREWS;
STEPHENS, 1990). Usando o teste de labirinto em cruz elevado, a iangambina por via
intraperitoneal nas doses de 25 e 50 mg/kg , reduziu significativamente apenas um parâmetro
observado, o tempo de permanência nos braços abertos, indicativo de efeito ansiogênico,
embora na dose de 75 mg/kg, pela mesma via, tenha aumentado o percentual do número de
entradas nos braços abertos, o tempo de permanência nos braços abertos e o percentual do
tempo de permanência nos braços abertos, indicando efeito ansiolítico. No mesmo modelo, a
administração oral da iangambina, apresentou efeito ansiolítico, desde que, com as três doses
estudadas, apresentou aumento no percentual de entrada e no percentual do tempo de
permanência nos braços abertos e com as doses de 50 e 75 mg/kg foi observado também
aumento no número de entradas e no tempo de permanência nos braços abertos,
respectivamente. A redução aversiva aos braços abertos é resultado de efeito ansiolítico
121
expresso por um aumento no número de entradas e no tempo de permanência nos braços
abertos do labirinto em cruz elevado.
Desta forma, nossos resultados mostraram que a iangambina apresentou efeito
ansiogênico com as duas menores doses (25 e 50) por via intraperitoneal, embora, com a dose
de 75 mg/kg, i.p., e com estas mesmas doses administradas por via oral, as alterações
comportamentais induzidas pela iangambina no LCE foram consistentes com efeito
ansiolítico, semelhante ao produzido pelo diazepam. Assim sendo, a iangambina apresentou
efeitos diferentes no LCE dependendo da via de administração. A injeção pela via
intraperitoneal induziu efeito ansiogênico, pelo menos com as duas menores doses. Por outro
lado, quando foi administrada por via oral e com a maior dose i.p., foi observado efeito
ansiolítico. Estas observações poderiam ser explicadas por parâmetros farmacocinéticos,
desde que, em seguida à administração não parenteral da droga, uma significativa porção da
dose pode ter sofrido metabolismo de primeira passagem gerando um metabólito ativo que
sinérgicamente pode ter atuado com a droga original potenciando seus efeitos (De-PARIS et
al., 2000). O efeito ansiolítico da iangambina foi também acompanhado, por uma redução na
atividade locomotora com as três doses usadas no campo aberto.
Sabe-se que muitas drogas tais como os benzodiazepínicos e o fenobarbital
possuem efeitos ansiolíticos e sedativos (TREIT, 1985). Neste estudo, como mencionado
anteriormente, a iangambina administrada por via intraperitoneal e oral, prolongou a duração
do sono no teste da indução do sono por pentobarbital. A redução da latência para a perda dos
reflexos foi vista apenas com a maior dose oral de iangambina. Semelhantes resultados foram
obtidos com o diazepam, no que se refere a duração do sono, mas, no caso do diazepam, o
tempo requerido para perder os reflexos foi muito menor que a iangambina, indicando que o
efeito sedativo do diazepam é bem maior (RABBANI et al., 2003). O efeito depressor da
iangambina foi também evidenciado no teste do nado forçado, onde a substância aumentou o
tempo de imobilidade dos animais, como já descrito anteriormente.
Um dos principais achados no presente estudo foi a caracterização do efeito
ansiolítico da iangambina, no teste do labirinto em cruz elevado, em adição ao seu efeito
sedativo apresentado no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital. Todos estes
efeitos, freqüentemente, são mediados por receptores GABAA (LEUNG et al., 2000). Modelos
comportamentais em roedores têm sido realizados com antagonista do receptor
122
benzodiazepínico, flumazenil, para explorar o mecanismo de ação das drogas. Agentes
ansiolíticos, aumentam e agentes ansiogênicos reduzem a entrada e o tempo gasto nos braços
abertos do labirinto em cruz elevado (PELLOW et al., 1985). De fato, trabalhos anteriores
mostram que o flumazenil preveniu os efeitos ansiolíticos dos benzodiazepínicos no LCE
(Luscombe et al., 1991) e inibiu o efeito ansiolítico do diazepam no LCE (KURIBARA;
MARUYAMA, 1996; KURIBARA et al., 1998). Com a finalidade de esclarecer o mecanismo
de ação do efeito ansiolítico produzido pela iangambina, usamos o flumazenil. Nossos
resultados mostraram que o tratamento com flumazenil associado a iangambina 75 mg/kg,
v.o., em camundongos, foi capaz de reverter dois parâmetros comportamentais observados no
labirinto em cruz elevado, o tempo de permanência e percentagem do tempo de permanência
nos braços abertos, indicando reversão da atividade ansiolítica da iangambina, e sugerindo
que locais de ligação no receptor benzodiazepínico GABAA podem estar envolvidos no
desenvolvimento do efeito ansiolítico desta substância. Observamos também que o flumazenil
sozinho não alterou nenhum dos parâmetros observados no LCE (NEBA, PEBA, TPBA e
PTBA) em relação ao grupo controle.
Um outro teste usado para avaliar efeitos sedativos sobre o sistema nervoso
central incluiu o teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (ELISABETSKY et al.,
1999). As convulsões são freqüentemente propostas como resultado do desequilíbrio das
atividades excitatória ou inibitória neuronais, seguidas do aumento da excitação
glutamatérgica ou redução da inibição gabaérgica (ELISABETSKY et al., 1999). Convulsões
experimentais podem ser induzidas pela ativação e suprimidas pela inibição dos receptores de
glutamato (OBRENOVITCH et al., 1996). Antagonistas glutamatérgicos, agindo sobre
receptores NMDA ou não-NMDA, mostraram possuir propriedades anticonvulsivantes em
vários modelos animais (MELDRUM, 1992). No entanto, as convulsões induzidas por
pentilenotetrazol estão também relacionadas com a inibição da transmissão GABAérgica
(GIORGI et al., 1991). O aumento do potencial promovido pelo neurotransmissor GABA,
pode ser obtido de diversas maneiras, envolvendo tanto uma ação direta no complexo receptor
GABAérgico (Benzodiazepínicos, barbituratos e possivelmente topiramato) ou ação na
recaptação ou metabolismo do GABA (tiagabina e vigabatrina) (PORTER; MELDRUM,
1998).
O pentilenotetrazol (PTZ) é o agente protótipo das substâncias químicas
sistêmicas convulsivantes (PAPY et al., 1971). É um derivado tetrazólico (Stone, 1970), com
123
ação convulsivante em camundongos, ratos, gatos e primatas e quando administrado por via
parenteral, produz inicialmente abalos mioclônicos, que se mantêm sustentados, evoluindo
para convulsões generalizadas do tipo tônico-clônica. A nível sináptico, o PTZ parece
interagir com o complexo GABA receptor-benzodiazepínico-canal de cloro (Olsen, 1981),
provavelmente de algum modo diminuindo a potência de inibição e causando convulsões.
Sabe-se que os benzodiazepínicos produzem seus efeitos sedativos, hipnóticos, ansiolíticos e
anticonvulsivantes pela sua interação com receptores GABAA (GOODCHILD 1993;
SHADER; GREEBLAT, 1993).
Foi demostrado neste trabalho que o diazepam, usado como droga de referência,
aumentou de forma significativa a latência de convulsão induzida por PTZ e os animais
sobreviveram durante o tempo do teste. No entanto, apesar de nossos resultados terem
mostrado que o efeito ansiolítico da iangambina no teste de labirinto foi revertido pelo
flumazenil, um antagonista do receptor benzodiazepínico, a mesma não protegeu das
convulsões induzidas por pentilenotetrazol. No entanto, sabemos que, quando a dose do
benzodiazepínico é aumentada, os efeitos ansiolíticos são produzidos primeiro, seguido pelos
efeitos anticonvulsivantes e posteriormente ocorre redução do tônus muscular, seguido por
sedação e hipnose (RAO et al., 1999).
O diazepam na dose usada neste trabalho, apresentou efeito ansiolítico e
aumentou a latência de convulsão induzida pelo PTZ, sem apresentar efeito miorelaxante,
como evidenciado no teste do rota rod. Desta forma as doses administradas da iangambina
neste trabalho, não foram suficientes para proteger os animais contra as convulsões. No
entanto, Pachú et al. (1993) mostraram que a iangambina na dose de 125 mg/kg, i.p. reduziu
de forma significativa as convulsões induzidas por pentilenotetrazol em camundongos,
sugerindo um possível efeito anticonvulsivante, o qual pode ser indicativo de um efeito mais
específico devido sua ação sobre o sistema GABAérgico (COOPER et al, 1996). Desta forma,
é possível que o efeito anticonvulsivante da iangambina, dependa também da dose usada.
Os neurônios noradrenérgicos ascendentes originados do locus ceruleus inervam
estruturas cerebrais tais como o córtex, hipocampo e tálamo (FILLENZ, 1990). De acordo
com Handley e Mithani, (1984) drogas que interferem com a neurotransmissão
noradrenérgica tais como α2-agonistas seletivamente aumentam a exploração dos braços
124
abertos e então foram considerados como ansiolíticos, enquanto α2-antagonistas, tais como a
ioimbina, seletivamente reduzem a exploração dos braços abertos e foram considerados como
ansiogênicas. Similarmente, a cafeína e anfetamina, dois estimulantes comportamentais que
têm também mostrado possuir atividade ansiogênica no homem e em outros modelos animais,
possuem atividade ansiogênica no labirinto (PELLOW et al., 1985).
O efeito ansiolítico da iangambina, foi acompanhado por uma redução dos níveis
de noradrenalina no corpo estriado, região cerebral que inclui o nucleus accumbens, local que
envolve as emoções (DeLONG, 2000). O aumento induzido pela iangambina na exploração
dos braços abertos, corroborou com esses estudos, que sugerem, que drogas que reduzem este
neurotransmissor, aumentam a exploração dos braços abertos no labirinto. No entanto, em
córtex motor a iangambina induziu aumento deste neurotransmissor apenas com a dose de 75
mg/kg, demonstrando que estas observações dependem da área cerebral estudada.
Além da noradrenalina, outros neurotransmissores estão envolvidos na ansiedade,
por exemplo GABA e serotonina. As inervações serotonérgicas originadas do núcleo dorsal
da rafe (NRD) e núcleo medial da rafe (NRM) localizam-se no tronco cerebral (MOLLIVER,
1987). Regiões tais com o estriado e córtex frontal recebem preferencialmente inervações
serotonérgicas do NRD (McQUADE; SHARP, 1997). Pesquisadores têm demonstrado que
manipulações na neurotransmissão serotonérgica produzem efeitos inconsistentes sobre a
ansiedade.
Assim sendo, vários modelos de ansiedade aguda em ratos estão associados com
aumento dos níveis de serotonina no hipocampo (MARSDEN et al., 1993 apud VOIGT et al.,
1999). Isto foi observado em experimentos de microdiálise nos quais ratos foram expostos em
diferentes testes de ansiedade como por exemplo o teste de Vogel (Matsuo et al., 1996),
labirinto (Wright et al., 1992) e interação social (CADOGAN et al., 1994).
Enquanto alguns estudos demonstraram uma associação da ansiedade a um
aumento de serotonina no hipocampo, outros mostraram que não existe uma simples relação
entre as ações ansiolíticas e os efeitos de ansiolíticos sobre o aumento de serotonina
(MARSDEN et al., 1993). Por exemplo, Rex et al. (1993) encontraram aumento dos níveis de
serotonina em córtex frontal de cobaio exposto ao labirinto. Eles observaram que este efeito
foi atenuado pelo diazepam, um ansiolítico benzodiazepínico. Demonstraram também que o
125
antagonista do receptor benzodiazepínico, flumazenil, reverteu ambos efeitos
comportamentais e neuroquímicos do diazepam. Surpreendentemente, o flumazenil sozinho,
como o diazepam, reduziu o aumento extracelular da serotonina, mas não afetou o
comportamento.
Nossos resultados apresentaram que, o efeito ansiolítico da iangambina
evidenciado nos testes de labirinto em cruz elevado e placa perfurada, foi acompanhado por
uma redução da serotonina em corpo estriado, no entanto, em córtex motor, houve um
aumento de 5-HT e redução do seu metabólito, indicando provavelmente síntese deste
neurotransmissor nesta região. Estes resultados mostraram que o efeito ansiolitico associado a
redução de serotonina depende da área cerebral estudada. Além disso, nossos resultados
também mostraram que apesar da iangambina ter reduzido o fluxo de serotonina com as três
doses usadas e mostrado efeito ansiolítico no LCE, apresentou perfil ansiogênico no mesmo
modelo com as doses de 25 e 50 mg/kg i.p..
Estes resultados vêm corroborar com as observações feitas por Marsden et al.,
(1993) que mostraram que não existe uma simples relação entre as ações ansiolíticas e os
efeitos de ansiolíticos de drogas sobre o aumento de serotonina. Além disso, teorias
tradicionais têm defendido que a ansiedade é ocasionada preferencialmente por um aumento
mais do que por uma redução da função serotonérgica ou que a depletação de serotonina
produz desinibição comportamental mais que alguma ação específica sobre a ansiedade
(SOUBRIE, 1986; TYE et al.,1977). Tais teorias são desconfortáveis com observações que
mostram ótimos tratamentos das desordens da ansiedade humana que envolve intervenções
que aumentam a serotonina sináptica, justificando a interferência, de que, em algum caminho
a redução da função serotonérgica está implicada nas desordens da ansiedade. Além disso,
existem algumas evidências obtidas de modelos animais mostrando que manipulações que
reduzem a serotonina cerebral podem aumentar o comportamento de ansiedade (GURTMAN
et al., 2002).
Recentemente, Hall et al., (1999) mostraram que duas semanas após a
administração de doses baixas da neurotoxina serotonérgica 5,7-d-hidroxitriptamina (5,7-
DHT) em ratos, ocorreu um significante aumento no comportamento da ansiedade no labirinto
seguida da redução nos níveis de serotonina cerebral. Ricaurte et al., (2000) mostraram que a
administração de doses altas de 3,4-methlyenedioxymethampthetamine (MDMA) em animais
de laboratório causou destruição dos terminais serotonérgicos, redução da concentração de
126
serotonina no cérebro e redução na densidade de locais transportadores de serotonina.
Resultados de análise bioquímica revelaram que dez semanas depois da administração do
MDMA os ratos tiveram significativamente menos serotonina que os controles na amígdala,
hipocampo e caudado-putamem. Estes pesquisadores examinaram o comportamento da
ansiedade, nos animais, na 4a, 6a e 9a semana seguida ao MDMA e encontraram aumento da
ansiedade nos testes de emergência, interação social e labirinto respectivamente (GURTMAN
et al., 2002). Adicionalmente, os usuários de MDMA, particularmente os usuários de grande
quantidade, têm sido associados com elevada ansiedade (GAMMA et al., 2000; McGUIRE,
2000 apud GURTMAN et al., 2002; PARROTT et al., 2000; SCHIFANO et al., 1998;
VERKES et al., 2001; WAREING et al., 2000).
Portanto, não são incoerentes nossos resultados obtidos com as duas menores
doses de iangambina por via intraperitoneal, que apresentou perfil ansiogênico no modelo de
labirinto em cruz elevado acompanhado do aumento da taxa de 5-HIAA/5-HT em corpo
estriado. O que pode também ter acontecido, é que por esta via e nesta concentração de
iangambina, não houvesse ainda o metabólito ativo suficiente para agir sinergicamente com a
substância original, e que, apesar de ter sido evidenciado redução no fluxo de serotonina em
corpo estriado, não foi acompanhado de efeito ansiolítico no modelo de labirinto, embora
tenha ocorrido este efeito, no teste de placa perfurada. Essa divergência nestes modelos
provavelmente deve-se a sensibilidade específica de cada um ao comportamento animal.
Estudos da interação do sistema neurotransmissor dopaminérgico com o
gabaérgico tem sido de muito interesse recentemente (LEUNG et al., 2003). Drogas atuando
sobre o receptor GABAA exercem alteração na concentração extracelular da dopamina no
nucleus accumbens (MOTZO et al., 1997). Por exemplo, imidazenil e diazepam manifestaram
marcada redução na concentração extracelular da dopamina (Finlay et al., 1992), enquanto um
aumento da liberação deste neurotransmissor foi elicitada em nucleus accumbens pelo
antagonista benzodiazepínico, flumazenil. Além disso, trabalhos anteriores indicaram
interação entre os receptores dopaminérgicos D1 e os mecanismos do ácido γ-aminobutírico
na substância negra (Trevitt et al., 2002) e que, drogas que apresentam efeito sedativo-
tranquilizante geralmente possuem ação antagonista sobre os receptores D1/D2 no cérebro
(JIN et al., 1986).
127
Nossos resultados mostraram que a iangambina reduziu a concentração da
dopamina no córtex motor e apesar de ter apresentado estabilização nos níveis deste mesmo
neurotransmissor em corpo estriado, aumentou DOPAC e HVA, acompanhado de um
aumento nas taxas de DOPAC/DA e HVA/DA, o que é consistente com a maior utilização da
dopamina, indicando portanto, uma maior taxa metabólica deste neurotransmissor
(ROBINSON; WISHAW, 1988; HATIP-AL-KHATIB et al., 2001). Foi observado também,
que a iangambina agiu sobre os receptores dopaminérgicos D1/D2 no cérebro de camundongos
e que pode atuar sobre o receptor GABAA no local dos benzodiazepínicos, desde que seu
efeito ansiolítico foi revertido pelo flumazenil. Então, o efeito ansiolítico-hipnótico da
iangambina pode ser gerado por uma combinação de efeitos originados de vários receptores
no sistema nervoso central incluindo os receptores D1/D2 e GABAA.
Estudos comportamentais e neuroquímicos têm esclarecido interações entre os
sistemas dopaminérgico e colinérgico em áreas cerebrais associadas com o movimento
(STEELE et al., 1996). Tem sido demonstrado (Gongorra-Afaro et al., 1996), por exemplo,
que neurônios colinérgicos pedunculares os quais inervam a substância negra pars compacta,
modulam o comportamento motor pelo aumento da atividade dopaminérgica nigroestriatal. A
atividade locomotora é um comportamento claramente dependente da transmissão
dopaminérgica nas áreas nigroestriatal e mesolímbica de cérebros de mamíferos (FRUSSA-
FILHO et al., 1992). Estes modelos podem ser usados para estudar interações de
neurotransmissores incluindo dopamina/acetilcolina.
A regulação dopaminérgica de neurônios colinérgicos pós-sinápticos possui um
importante papel na mediação do comportamento motor (DECSI, 1988; WICKENS, 1990).
Drogas anticolinérgicas induzem ativação motora e têm efeitos sinérgicos com estimulantes
psicomotores sobre o estímulo motor (SOUSA et al., 2001). Em contraste, agonistas
colinérgicos antagonizam o efeito comportamental ativado por agonistas dopaminérgicos.
Estes resultados sugerem uma relação oposta dopaminérgica-colinérgica com respeito a
regulação das estruturas cerebrais que controlam a função motora. Então, neurônios
dopaminérgicos nigroestriatais ou agonistas dopaminérgicos (Jackson et al, 1993) exercem
ação inibitória sobre os neurônios colinérgicos estriatais que podem ser bloqueadas por
antagonistas do receptor D2 (JACKSON; ZIGMOND, 1990; DE BOER; ABERCROMBIE,
1996).
128
Com base nestes conceitos, nossos resultados mostraram que a iangambina ativou
receptores D1 e D2 em corpo estriado e D2 em córtex motor. Apresentou também, redução nos
níveis de dopamina em córtex motor e apesar de não ter alterado os níveis desta monoamina
em corpo estriado, mostrou uma redução do fluxo da mesma, desde que, houve um aumento
significativo da sua taxa metabólica nesta região. Assim, a redução do fluxo da dopamina em
corpo estriado, acompanhado da diminuição da atividade locomotora observada no teste de
campo aberto, indicam que provavelmente a iangambina apresentou atividade antagonista
dopaminérgica. Observamos também que a mesma interagiu com receptores muscarínicos em
córtex motor e corpo estriado. Então, podemos sugerir que o bloqueio sobre os receptores
dopaminérgicos induzido por esta substância é sinérgico à sua ação agonista sobre os
receptores colinérgicos, haja visto que a redução da atividade locomotora dos animais foi
mantida no modelo de campo aberto.
Nossos resultados corroboram com um estudo realizado por Sousa et al. (2001)
que mostraram que o pimozide, antagonista dopaminérgco D2 e o carbacol, agonista
muscarínico, diminuíram a atividade locomotora, e a atropina, antagonista muscarínico,
reverteu este comportamento indicando que estes dois sistemas neurotransmissores atuam em
direção oposta. Além disso, estudos mostraram que drogas anticolinérgicas, incluindo a
atropina, aumentam a atividade locomotora (SYPOS et al., 1999). Foi evidenciado também
(Brudzynski et al., 1991) que injeções intracerebrais de carbacol no mesencéfalo basal
reduzem a atividade locomotora, e este efeito foi revertido pelo pré-tratamento com a
atropina. Também foi mostrado (Wang et al., 1993) que a ativação de receptores D2 com o
agonista D2, quinpirole, ou de receptores muscarínicos com carbacol induziu inibição da
liberação da [3H]-ACh no estriado.
Baseada nas observações obtidas no nosso trabalho e levando em consideração
que um dos grandes desafios da indústria farmacêutica é a busca do desenvolvimento de
novos fármacos ansiolíticos que venham produzir pouca ou nenhuma sedação, sugerimos que
a iangambina apresentou perfil de droga ansiolítica. Este efeito foi evidenciado nos modelos
do campo aberto, placa perfurada e labirinto em cruz elevado, apresentando como vantagem
em relação ao diazepam, menos sedação conforme observado no modelo do tempo do sono
induzido por pentobarbital. Desta maneira, é importante continuar a investigar esta substância,
pois acreditamos que a mesma possui um grande potencial ansiolítico e provavelmente este
efeito deve envolver a participação dos receptores GABAA, D1 e D2.
129
Além disso, nossos resultados neuroquímicos mostraram que a iangambina
reduziu os níveis de noradrenalina em corpo estriado, consistentes com estudos que apontam
que drogas que reduzem este neurotransmissor, aumentam a exploração dos braços abertos no
LCE, indicando perfil ansiolítico. No entanto, em córtex motor a iangambina induziu aumento
deste neurotransmissor, demonstrando que estas observações depende da área cerebral
estudada.
A serotonina também é um outro neurotransmissor envolvido na ansiedade.
Observamos que a redução de serotonina em corpo estriado induzida pela iangambina foi
acompanhada de efeito ansiolítico nos testes do LCE e placa perfurada. No entanto, em córtex
motor, houve aumento de serotonina. Estes resultados mostraram que o efeito ansiolítico
associado a redução de serotonina depende da área cerebral estudada.
Observamos também que a iangambina alterou alguns parâmetros
comportamentais envolvidos com o sistema dopaminérgico, tais como atividade locomotora,
rearing e grooming. Estudos mostram que drogas antagonistas dopaminérgicas, em geral,
reduzem a atividade locomotora dos animais, e este efeito foi observado no modelo do campo
aberto, e além disto, aumentou a imobilidade dos animais no modelo do nado forçado, uma
característica de drogas que produzem bloqueio dos receptores dopaminérgicos, sugerindo
que a iangambina apresentou ação antagonista nestes receptores podendo portanto também ser
investigada quanto a uma possível atividade neuroléptica.
CONCLUSÕES
131
6 CONCLUSÕES
O estudo dos efeitos da administração da iangambina em vários modelos
comportamentais e sobre as alterações neuroquímicas permitiu as seguintes conclusões:
• A iangambina reduziu a atividade locomotora dos animais, indicando uma
provável atividade antagonista dopaminérgica;
• A coordenação motora dos animais não foi alterada no teste do rota rod;
• Nos modelos do nado forçado e no teste do tempo de sono induzido por
pentobarbital, apresentou efeito depressor central;
• Indicou efeito ansiolítico nos modelos de campo aberto, placa perfurada e
labirinto em cruz elevado;
• O efeito ansiolítico da iangambina sugere envolver a participação dos
receptores GABAA, D1 e D2;
• O efeito ansiolítico da iangambina associado a redução de noradrenalina e
serotonina depende da área cerebral estudada;
• A iangambina apresentou efeito ansiogênico nas doses de 25 e 50 mg/kg, i.p.
no modelo do labirinto em cruz elevado, que pode ser explicado por
parâmetros farmacocinéticos;
132
• A iangambina não protegeu os animais contra as convulsões induzidas por
pentilenotetrazol, este efeito parece depender da dose usada;
• Houve interação entre os sistemas dopaminérgico, colinérgico, serotonérgico e
GABAérgico, sugerindo a importância da iangambina em doenças que alteram
estes sistemas de neurotransmissão;
• As alterações comportamentais e neuroquímicas induzida pela iangambina
foram consistentes com um efeito ansiolítico-like desta substância;
• A iangambina apresentou grande potencial ansiolítico com a vantagem de
produzir menos sedação que o diazepam, conforme evidenciado no modelo do
tempo de sono induzido por pentobarbital.
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