UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · Gonzaguinha. RESUMO Estudo dos marcadores de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRURGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS MÉDICO-

CIRÚRGICAS

EDERSON LAURINDO HOLANDA DE SOUSA

ESTUDO DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA tnpA, tnpB, cagM do

HELICOBACTER PYLORI E SUA ASSOCIAÇÃO COM AFECÇÕES GÁSTRICAS

EM FORTALEZA, BRASIL

FORTALEZA - CEARÁ

2016





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Cirurgia da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Médico-Cirúrgicas.

Orientador: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa

Campelo Braga

FORTALEZA

2016

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

S696e Sousa, Ederson Laurindo Holanda de.

Estudo dos marcadores de virulência tnpA, tnpB, cagM do helicobacter pylori e sua associação

com afecções gástricas em Fortaleza, Brasil / Ederson Laurindo Holanda de Sousa. – 2016.

72 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,

Departamento de Cirurgia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médico-Cirúrgicas, Mestrado

em Ciências Médico-Cirúrgicas, Fortaleza, 2016.

Orientação: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.

1. Helicobacter pylori. 2. Genes. 3. Úlcera Péptica. I. Título.

CDD 616.3075





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Cirurgia da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Médico-Cirúrgicas.

Aprovada em: ___/___/______.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________

Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________

Prof. Dr. Orleancio Gomes Ripardo De Azevedo

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________

Profa. Dra. Maria Aparecida Alves de Oliveira

Universidade Federal do Maranhão (UFMA)

A Deus, por não me deixar fraquejar nos

momentos mais difíceis.

Aos meus pais, irmãs, familiares e amigos pelo

incentivo e confiança.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. LÚCIA LIBANEZ BESSA CAMPELO BRAGA, Professora titular

do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade

concedida, por sua orientação constante, pelo incentivo e competência com que exerce a vida

acadêmica.

Ao Prof. Dr. LUSMAR VERAS RODRIGUES, professor titular do Departamento

de Cirurgia e Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médico-Cirúrgicas da

Universidade Federal do Ceará (UFC), por sua dedicação à Pós-Graduação.

Aos professores participantes da banca examinadora Prof. Dr. ORLEANCIO

GOMES RIPARDO DE AZEVEDO e Profa. Dra. MARIA APARECIDA ALVES DE

OLIVEIRA pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões.

Ao prof. Dr. CÍCERO IGOR SIMÕES MOURA SILVA, pelo companheirismo no

laboratório e dedicação na conclusão deste estudo, além da amizade que construímos ao longo

desta caminhada.

As Sras. KRÍSSIA MARIA ALBUQUERQUE PARENTE e MICHELLE

SOEIRO DE OLIVEIRA, mestrandas em cirurgia, pelo companheirismo, parceria no

laboratório e pela incansável ajuda para a realização deste trabalho.

A Srta. BRUNA DEISE GURGEL MAIA, técnica de laboratório, pela parceria na

rotina laboratorial e, sobretudo, pela amizade que ultrapassa os limites do laboratório.

A todos que compõem a equipe do Laboratório de Gastroenterologia pelo

companheirismo e parceria no laboratório.

As Sras. MARIA LUCIENE VIEIRA DE OLIVEIRA e MAGDA MARIA

GOMES FONTENELE, secretárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médico-

Cirúrgicas da UFC, pela presteza e auxílio no desempenho das atividades letivas deste

programa.

Ao prof. Dr. Said Goncalves da Cruz Fonseca, professor do curso de farmácia da

UFC e meu chefe imediato. A quem devo muitos agradecimentos pelos incentivos de fazer o

curso de mestrado e pela presença de espírito fabulosa que atinge a todos que trabalham com

ele.

A minha família pelo apoio de sempre e aos amigos queridos, família que

escolhemos, por sempre estarem dispostos a me ouvir e oferecer um ombro amigo. A todos e a

todas que, de diversas formas, participaram, contribuíram e viabilizaram a realização deste

trabalho.

Ah! Eu me ofereço esse momento

Que não tem paga e nem tem preço

Essa magia eu reconheço

Aqui está a minha sorte

Me descobrir tão fraco e forte

Me descobrir tão sal e doce

E o que era amargo acabou-se

É bom dizer viver, valeu.

Gonzaguinha

RESUMO

Estudo dos marcadores de virulência tnpA, tnpB, cagM do Helicobacter pylori e sua

associação com afecções gástricas em Fortaleza, Brasil. EDERSON LAURINDO

HOLANDA DE SOUSA. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu

em Ciências Médico-Cirúrgicas. Universidade Federal do Ceará. Orientadora: Profa. Dra.

Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.

O Helicobacter pylori é uma bactéria Gram-negativa que coloniza mais da metade da

população mundial; a infecção por esta bactéria está associada a diversas afecções gástricas,

entre elas: gastrites, úlceras pépticas e câncer gástrico. O grau de lesões e patogenicidade é

muito dependente da diversidade gênica da bactéria. O objetivo do presente estudo foi avaliar

os fatores de virulência tnpA, tnpB e cagM do H. pylori em pacientes com gastrite, úlcera

péptica e câncer gástrico. A genotipagem das cepas de H. pylori oriundas de biópsias gástricas

foi realizada pela técnica de reação em cadeia de polimerase. Foram analisados 147 pacientes,

os quais 50 eram portadores de gastrite, 51 de úlceras péptica e 46 de câncer gástrico; os quais

72 eram do gênero masculino e 75 do feminino com média de idade e desvio padrão de 54,18

± 14,24 anos. A população estudada foi dividida em duas faixas etárias, abaixo e acima de 45

anos; a qual 72,8% estavam acima de 45 anos de idade. A frequência dos genótipos estudados

foi: 70 (47,6%) cepas tnpA; 03 (2,0%) tnpB; 19 (12,9%) cagM. O gene tnpA foi o mais

presente no gênero masculino nas duas faixas etárias estudadas; no entanto, sem associação

estatística do gene com tais variáveis. O gene tnpA apresentou uma associação negativa com o

câncer gástrico; enquanto apresentou associação significativa com a úlcera duodenal (p =

0,002). O gene tnpB foi o de menor prevalência e não obteve nenhuma associação significante.

O gene cagM foi o segundo mais prevalente e apresentou associação significativa com úlcera

duodenal (p = 0,024). Concluiu-se que os genes tnpA, cagM estão correlacionados com o

risco maior de desenvolver úlceras pépticas; sugerindo que tais genes são bons candidatos a

serem marcadores genéticos do H. pylori para a úlcera péptica nestes pacientes de Fortaleza.

Palavras-chave: H. pylori, tnpA, tnpB, cagM, afecções gástricas.

ABSTRACT

Study of the virulence markers tnpA, tnpB, cagM of Helicobacter pylori and its

association with stomach disorders in Fortaleza, Brazil. EDERSON LAURINDO

HOLANDA DE SOUSA. Dissertation (Master Degree). Post-Graduate Program (Stricto

Sensu) in Medical and Surgical Sciences. Federal University of Ceará. Advisor: Profa. Dra.

Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.

Helicobacter pylori is a Gram-negative strain that colonizes more than half the world's

population; Infection by this strain is associated with various gastric diseases, including:

gastritis, peptic ulcers and gastric cancer. The degree of injury and pathogenicity is very

dependent on the genetic diversity of the strian. The aim of this study was to evaluate the

virulence factors tnpA, tnpB and cagM of H. pylori in patients with gastritis, peptic ulcer and

gastric cancer. Genotyping of H. pylori strains arising from gastric biopsies was performed by

the polymerase chain reaction technique. Were analyzed 147 patients, of which 50 had

gastritis, 51 peptic ulcers and 46 gastric cancer; which 72 were male and 75 female, mean age

and standard deviation of 54.18 ± 14.24 years. The study population was divided into two age

groups below and above 45 years; which 72.8% were above 45 years of age. The frequency of

genotypes was: 70 (47.6%) tnpA strains; 03 (2.0%) tnpB; 19 (12.9%) cagM. The tnpA gene

was more prevalent in males in both age groups; however, no statistical association of the

gene with such variables. The tnpA gene showed a negative association with gastric cancer;

while significantly associated with duodenal ulcer (p = 0.002). The tnpB gene had the lowest

prevalence and got no significant association. The cagM gene was the most prevalent second

and showed a significant association with duodenal ulcer (p = 0.024). It was concluded that

the tnpA genes, cagM are correlated with increased risk of developing peptic ulcers;

suggesting that these genes are good candidates for genetic markers of H. pylori in peptic

ulcer disease in these patients Fortaleza.

Keywords: H. pylori, tnpA, tnpB, cagM, gastric disorders.

LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS

Figura 1 Estrutura da ilha de patogenicidade cag do H. pylori. Localização do cag I,

cag II e IS605....................................................................................................... 35

Figura 2 Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpA (344pb) nas

amostras de câncer gástrico................................................................................. 50

Figura 3 Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpB (569pb) nas

amostras de câncer gástrico................................................................................. 50

Figura 4 Gel de agarose para visualização das bandas do gene cagM (586pb) nas

amostras de úlcera gástrica.................................................................................. 51

Gráfico 1 Distribuição dos pacientes em função do gênero................................................ 44

Gráfico 2 Distribuição dos pacientes em função da faixa etária.......................................... 45

Gráfico 3 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com o gênero...................... 46

Gráfico 4 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com a faixa etária................ 47

Gráfico 5 Distribuição dos genótipos do H. pylori nas afecções estudadas........................ 48

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Prevalência de cepas cagA nas diferentes regiões do Brasil............................ 29

Tabela 2 Primers usados na amplificação dos genótipos estudados............................... 42

Tabela 3 Ciclos de amplificação para cada gene............................................................. 43

Tabela 4 Caracterização dos pacientes, por grupos, quanto ao gênero e a idade............. 45

Tabela 5 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com o gênero.................... 46

Tabela 6 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com a faixa etária............. 47

Tabela 7 Prevalência dos genótipos cag-PAI do H. pylori de acordo com as afecções

gástricas............................................................................................................. 49

Tabela 8 Análise Univarida e Multivariada dos genótipos tnpA e cagM com as

afecções gástricas.............................................................................................. 49

Tabela 9 Associação de tnpA com os demais genótipos estudados................................. 52

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ureA – gene codificador da urease

cagA – gene associado à citotoxina A do Helicobacter pylori

CagA – citotoxina A do Helicobacter pylori

vacA – gene da citotoxina vacuolizante

cagE – gene associado à citotoxina E do Helicobacter pylori

CagE – citotoxina E do Helicobacter pylori

oipA – gene de proteínas inflamatórias do Helicobacter pylori

hom – gene da membrana externa do Helicobacter pylori

cag-PAI – ilha de patogenicidade cag

C13

- Carbono 13

C14

- Carbono 14

H. pylori - Helicobacter pylori

IL-1 – Interleucina-1




IL-1β – Interleucina-1 β

TNFα – fator de necrose tumoral α

HUWC – Hospital Universitário Walter Cantídio

T4SS – sistema de secreção do tipo IV

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

HpSA – pesquisa de antígenos do H. pylori nas fezes

DUP – doença ulcerosa péptica

UFC – Universidade Federal do Ceará

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 14

1.1 Histórico sobre o Helicobacter pylori ............................................................... 14

1.2 Epidemiologia do Helicobacter pylori .............................................................. 15

1.3 Microbiologia do Helicobacter pylori................................................................ 17

1.4 Diagnóstico do Helicobacter pylori ................................................................... 18

1.4.1 Métodos invasivos............................................................................................... 18

1.4.2 Métodos não invasivos......................................................................................... 20

1.5 Patogênes do Helicobacter pylori...................................................................... 21

1.6 Afecções Gástricas.............................................................................................. 23

1.6.1 Gastrite................................................................................................................. 23

1.6.2 Úlcera Péptica...................................................................................................... 24

1.6.3 Câncer Gástrico.................................................................................................... 25

1.7 Tratamento do Helicobacter pylori.................................................................. 27

1.8 Diversidades do padrão de algumas cepas do H. pylori no Brasil e suas

correlações clínicas............................................................................................. 27

1.9 Marcadores genéticos do Helicobacter pylori .................................................. 31

1.9.1 Ilha de Patogenicidade cag (cagPAI)................................................................... 32

1.9.2 Sequência de Inserção IS605, tnpA e tnpB.......................................................... 34

1.9.3 Gene cagM........................................................................................................... 36

1.10 Justificativa ........................................................................................................ 37

2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 38

2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 38

2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 38

3 MÉTODO ........................................................................................................... 39

3.1 Casuística ........................................................................................................... 39

3.2 Tipo do Estudo ................................................................................................... 39

3.3 Seleção dos Participantes ................................................................................. 39

3.4 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Endoscopia........................... 40

3.5 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Gastrectomia........................ 41

3.6 Extração do DNA de Helicobacter pylori em Tecido de Biópsia Gástrica.... 41

3.7 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)......................................................... 42

3.8 Análise estatística .............................................................................................. 43

4 RESULTADOS .................................................................................................. 44

4.1 Caracterização da amostra estudada .............................................................. 44

4.2 Distribuição da expressão dos marcadores moleculares cag-PAI do H.

pylori.................................................................................................................... 46

4.2.1 Distribuição dos marcadores por gênero............................................................ 46

4.2.2 Distribuição dos marcadores por faixa etária.................................................... 47

4.2.3 Distribuição dos marcadores por afecções gástricas......................................... 48

4.3 Associação de tnpA com os demais genótipos estudados................................ 52

5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 53

6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 56

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 57

APÊNDICES ..................................................................................................... 69

ANEXOS ............................................................................................................ 71

14

1 INTRODUÇÃO

1.1 Histórico sobre o Helicobacter pylori

O Helicobacter pylori (H. pylori) é um bacilo gram-negativo que coloniza o

estômago humano, causando diversas doenças, como: gastrites, úlceras pépticas e câncer

gástrico. A infecção pelo H. pylori é a segunda principal causa de morte por câncer gástrico

em todo o mundo; contribuindo para outras enfermidades, incluindo: deficiências de ferro e

de vitamina B12, Púrpura Trombocitopênica Idiopática (PTI), e retardo de crescimento em

crianças. A colonização ocorre na infância e persiste durante toda a vida, manifestando as

doenças nos adultos (STASI et al., 2009; ATHERTON; BLASER, 2009; FRANCESCHI et al.,

2014 DARVISHI et al., 2015).

As bactérias do gênero Helicobacter habitam a milhares de anos no trato

gastrointestinal de muitas espécies de mamíferos e aves (FALUSH et al., 2001). Através de

análise de nucleotídeos de várias espécies da bactéria, pode-se estimar que o H. pylori tem co-

evoluido com os seres humanos, pelo menos desde o seu êxodo da África a cerca de 60.000

anos (ATHERTON; BLASER, 2009).

Um dos primeiros relatos de colonização gástrica foi feita por pesquisadores

europeus em 1906, que relataram a presença de espiroquetas. Porém, tais relatos foram

esquecidos pela sociedade científica devido à falta de dados mais conclusivos, como o

isolamento do microrganismo (KRIENTIZ, 1906; STEER, 1975). Já em 1938, analisando

biópsias gástricas, um estudo relatou a presença de bactéria espiralada em 43% das biópsias

analisadas; sem estudar a relação da infecção com as afecções gástricas (DOENGES, 1938).

Em 1983, os pesquisadores australianos Robin Warren e Barry Marshall

publicaram na revista Lancet sobre a resposta imune humana contra o H. pylori; descrevendo

as características microbiológicas da bactéria, inclusive a similaridade com as espécies do

Campylobacter (GUSTAFSON; WELLING 2010). No mesmo ano de 1983, Marshall

encontrou numerosas colônias de microrganismo semelhantes ao Campylobacter em culturas

de biópsia gástrica incubadas por 5 dias, tempo maior do que as tentativas anteriores de

cultivo (3 dias) (MARSHALL; WARREN, 1983; KONTUREK, 2003; LOPES et al., 2014).

O primeiro nome dado à bactéria recém-descoberta foi de Campylobacter

pyloridis, sendo corrigida posteriormente para Campylobacter pylori. Em 1989, o nome foi

atualizado para Helicobacter pylori após vários estudos taxonômicos e por suas características

bioquímicas e genéticas diferirem do gênero Campylobacter (MARSHALL; GOODWIN,

15

1987; GOODWIN, 1989; KONTUREK, 2003; LOPES et al., 2014).

Em 1985, Marshall ingeriu uma suspensão do H. pylori na tentativa de cumprir o

postulado de Koch, postulado que versa sobre à auto experimentação; promovendo os

sintomas gástricos da infecção e depois tratando com antibióticos e sais de bismuto

(MARSHALL; WARREN, 1984; LOPES et al., 2014).

Desde então, o H. pylori está intimamente ligado a um espectro diversificado de

doenças gastrointestinais (MARSHALL; WARREN, 1984); e devido à magnitude desta

descoberta para a gastroenterologia, é que tais pesquisadores foram agraciados com a

premiação Nobel de Medicina em 2005 (LOPES et al., 2014).

1.2 Epidemiologia do Helicobacter pylori

A infecção por H. pylori está disseminada mundialmente, atingindo pouco mais de

50% da população (FOCK; ANG, 2010), sendo considerado um problema de saúde pública,

principalmente em países em desenvolvimento, onde a prevalência é alta devido às baixas

condições higiênicas e sanitárias (PARSONNET et al., 1997).

A prevalência do H. pylori varia de acordo com as regiões geográficas, etnia,

gênero, idade, condição sócio-econômica, nível de escolaridade, profissão e o ambiente de

vida dos indivíduos (BLASER; BERG 2001). Em países em desenvolvimento, entre adultos

de meia idade, a prevalência é em média de 80 a 90%, enquanto que em países desenvolvidos

é menor que 40% (WANG et al., 2003; PEREZ-TRALLERO; ROTHENBACHER;

BRENNER, 2004). Em contraste com a prevalência média mundial da infecção que está em

torno de 58% (CARTER et al., 2011).

Essa prevalência é muito variável entre os países e entre grupos populacionais

dentro do mesmo país, pois pode ser influenciada pelo grau de exposição ao agente etiológico,

pelo hábito alimentar e fatores ambientais aos quais os indivíduos estão expostos (BARBOSA;

SCHINONNI, 2011).

Na Europa, a prevalência de H. pylori tende a ser inferior nos países do Norte em

relação aos do Sul e Leste. Um estudo randomizado na Holanda avaliou a presença de

anticorpos contra o H. pylori e a proteína CagA em 1550 doadores de sangue holandeses

(excluindo os imigrantes); no qual obteve uma prevalência 32% de infecção, com 28% das

cepas cagA positivas (EUSEBI; ZAGARI; BAZZOLI, 2014). Contrariando a estatística dos

países do norte europeu, Portugal apresentou uma prevalência de 84,2%, com 61,7% das

cepas cagA positivas; sendo um dos países europeus com uma maior prevalência da infecção

16

pelo H. pylori (BASTOS et al., 2013).

Na América do Norte, a prevalência de H. pylori é semelhante ao norte da Europa.

Onde um estudo canadense com 203 pacientes indígenas com dispepsia, revelou taxas de

infecção em 37,9% dos pacientes (SETHI et al., 2013). Já nos EUA, um estudo envolvendo

4145 adultos, evidenciou uma soroprevalência de H. pylori de 30.7% (GRAD; LIPSITCH;

AIELLO, 2012).

Na América Latina, um estudo mexicano relatou uma soroprevalência de 52,2%

em mulheres grávidas que vivem em zonas rurais. Enquanto outro estudo relata taxas de 80%

em zonas rurais no Chile (MENTIS; LEHOURS; MEGRAUD, 2015).

Uma das maiores taxas de infecção pelo H. pylori são encontradas nos países

asiáticos, podendo variar de 54% a 76% (LIM et al., 2013; DORJI et al., 2014). Apenas em

um estudo realizado em indivíduos saudáveis na Arábia Saudita mostrou uma baixa

prevalência de infecção de cerca de 28% (HANAFIA; MOHAMED, 2013).

Na China, um estudo utilizou a técnica do teste respiratório com ureia marcada

com C13

para identificação de pacientes infectados pela bactéria. O qual encontrou

prevalência de 63,4% de pacientes infectados entre 5.417 pacientes assintomáticos de 30 a 69

anos. Prevalências semelhantes são encontrados na Índia, Cazaquistão e Butão. A prevalência

a Índia varia de 58% a 62% em dispépticos. Já no Cazaquistão, a taxa de infecção é de 76,5%

entre sintomático e assintomáticos. Da mesma forma, em Butão, a porcentagem de infecção é

de 73,4% (EUSEBI; ZAGARI; BAZZOLI, 2014).

No Brasil, estudos realizados em São Paulo e Minas Gerais, encontraram

prevalência de H. pylori de 40,7% e 69,7%, respectivamente (ARAF et al., 2010; ROCHA et

al., 2003). Outro estudo na zona rural do Amazona reportou prevalência de 82% na população

geral; destes 53% são crianças e adolescentes e 47% são adultos e idosos (REIS JÚNIOR et

al., 2012). Em 2013, um estudo em Fortaleza encontrou um percentual de 44,3% de pacientes

infectados pelo H. pylori diagnosticados pelo teste rápido de urease; sendo este valor abaixo

da média da região, seja pelo número pequeno de participantes (n = 140) ou pela diminuição

das taxas de infecção (ROCHA, 2013).

Outros estudos sugerem que a prevalência de Helicobacter pylori no contexto

mundial tem uma tendência de queda tanto nos países desenvolvidos como nos

subdesenvolvidos (MIENDJE DEYI et al., 2011).

17

1.3 Microbiologia do Helicobacter pylori

O H. pylori é uma bactéria Gram negativa, de forma espiralada, microaerófila, não

esporulada, medindo cerca de 2,5 µm de comprimento e 0,5 a 1,0 µm de diâmetro. Possui de

quatro a seis flagelos, o que confere motilidade à bactéria, permitindo que ela chegue à

superfície gástrica, onde passa a aderir às células do estômago (MARSHALL; WARREN,

1984; LEVINSON; JAWETZ, 1994; JOSENHANS; SUERBAUM, 2001). Esse

microrganismo coloniza a mucosa gástrica e produz algumas enzimas fundamentais para sua

adaptação a esse ambiente inóspito, entre elas: urease, catalase, oxidase, protease e fosfolipase.

As adaptações provenientes do H. pylori para colonizar o estômago humano vão

desde a evasão da resposta imune do hospedeiro até o desenvolvimento de mecanismos

próprios. A morfologia em espiral e a presença de flagelos conferem mobilidade e permitem

que a bactéria penetre na camada de muco que reveste o epitélio gástrico, protegendo-se assim

da acidez e peristaltismo estomacal. Numerosas adesinas permitem a adesão seletiva ao

epitélio gástrico, impedindo a eliminação da bactéria pelos movimentos peristálticos, além de

promover elevadas concentrações de toxinas em determinadas áreas da mucosa gástrica. A

produção de uréase altera o pH, favorecendo a sobrevivência da bactéria no estômago

(HAZEL et al., 1986; BRUCE, 1993; YAMAOKA et al., 2002; SACHS et at., 2003;

ARGENT et al., 2004).

A urease cliva a ureia, produzindo amônia e CO2. A amônia, por sua vez, atua

como receptor de íons hidrogênio presentes no meio ácido estomacal, gerando pH neutro no

ambiente pericelular bacteriano, proporcionando assim sua sobrevivência em um meio ácido

(MOBLEY, 2001).

O H. pylori possui crescimento lento e facilmente transformam-se em formas

cocoides em meios líquidos; sendo de fácil contaminação por microrganismos de crescimento

rápido, por isso meios líquidos não são utilizados para culturas de rotina

(DZIERZANOWSKA-FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).

O Helicobacter pylori é um microrganismo de difícil cultivo, sendo sua cultura

realizada em meios de ágar sólido (Brain Heart Infusion (BHI) agar, Brucella agar, Columbia

agar) a 37ºC. Tal bactéria é fastidiosa e requer que o meio seja suplementado com sangue e

suplementos (7-10% de sangue de ovelha ou cavalo; vitamina B12; aminoácidos - L-

glutamina e L-cisteína; antibióticos seletivos Dents ou Skirrows). As placas são incubadas em

ambiente de microaerofilia (2-5% de O2; 5-10% de CO2 e 0-10% de H2) a 37°C durante até

7 dias (HOLTON et al., 1999; DZIERZANOWSKA-FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).

18

As colônias do H. pylori atingem um pequeno tamanho (0,5-2,0 mm), são

translúcidas, amareladas ou colônias cinza pálido. É identificado pelos testes de urease,

catalase e oxidase positivos. No entanto, estas enzimas também são produzidas por outras

espécies de Helicobacter, e a urease pode ser sintetizada por algumas cepas de

Campylobacter lari (DZIERZANOWSKA-FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).

Uma amostra contendo a bactéria deve ser inoculada em meios de cultura dentro

de 4 horas após a coleta para melhores resultados de análise. Caso o atraso seja inevitável, a

amostra deve ser transportada para o laboratório em meio de transporte apropriado (meio de

transporte Stuart) a 4ºC por um prazo de até 24 horas (DZIERZANOWSKA-FANGRAT;

DZIERZANOWSKA, 2006).

As colônias formadas após 3 a 5 dias de crescimento são circulares, convexas,

translúcidas e não apresentam hemólise. A identificação após o cultivo deve ser feita

observando-se a morfologia da colônia, coloração de Gram e provas bioquímicas positivas

para urease, oxidase e catalase (NDIP et al., 2003). Tendo em vista que H. felis ou de H.

heilmanii também podem estar presentes em amostras gástricas, normalmente são facilmente

distinguidas das H. pylori devido a longa forma saca-rolhas (DZIERZANOWSKA-

FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).

1.4 Diagnóstico do Helicobacter pylori

Os métodos de diagnóstico da infecção por H. pylori, estão divididos em testes

invasivos ou não invasivos. Os invasivos dependem da realização de endoscopia digestiva alta

(EDA) para coleta de biópsias; os quais incluem o teste rápido da urease, cultura

microbiológica em placa e o exame histopatológico. Os não invasivos dispensam o exame

endoscópico e incluem: os testes sorológicos; pesquisa de antígenos do H. pylori nas fezes

(HpSA); o teste respiratório com uréia marcada com isótopos de carbono (C13

e C14

)

(CUTLER; PRASAD; SANTOGADE, 1998) e, o Enteroteste, proposto pela primeira vez em

1995, por Perez-Trallero et al. (1995), como uma alternativa à endoscopia para obtenção de

suco gástrico.

1.4.1 Métodos invasivos

O exame histopatológico é o método padrão ouro de diagnóstico de H. pylori, o

qual fornece informações quanto a presença da bactéria e características da mucosa (grau de

19

inflamação, presença de metaplasia, atrofia glandular, displasia e neoplasia). Apesar da

importância diagnóstica, é um método não realizado na rotina clínica por se tratar de um

procedimento caro, invasivo e desconfortável para o paciente. Caso não realizado de maneira

correta, pode subestimar a presença da bactéria com erros diagnósticos e falsos negativos

(VELAPATIÑO et al., 2006; MALFERTHEINER et al., 2012; GARZA-GONZÁLEZ et al.,

2014).

A sensibilidade e a especificidade dos exames histopatológicos para o diagnóstico

do H. pylori variam de 53% a 90%, dependendo da experiência do patologista e da densidade

de colonização. O aumento do número de biópsias com o emprego de coloração específicas

podem aumentar a sensibilidade do método (EL-ZIMAITY; GRAHAM, 1999).

Recomenda-se que sejam retiradas biópsias do antro e do corpo. A interpretação

das amostras segue a classificação de Sydney, que indica amostragem de cinco locais

diferentes: I. pequena curvatura do corpo (4 cm próximo à incisura angularis); II. pequena

curvatura do antro; III. grande curvatura do antro e IV. grande curvatura do corpo e V. incisura

angularis (GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).

A coloração celular com hematoxilina e eosina (HE) é o bastante para detectar H.

pylori em biópsia. Já coloração mais utilizada é a Giemsa, que pode aumentar a sensibilidade

e especificidade da técnica (BRADEN, 2012).

Outro método é a cultura do microrganismo, a qual possui sensibilidade menor do

que as biópsias; com sensibilidade de 90% e especificidade de 100%, quando bem realizada.

O H. pylori é muito delicado e necessita ser cultivado logo após a colheita. (VELAPATIÑO et

al., 2006; GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).

Já o teste rápido da urease (TRU), baseia-se na produção de uréase pelo H. pylori,

após a coleta do fragmento de biópsia gástrica. Uma amostra é adicionada em um meio

contendo ureia e um indicador de pH (vermelho fenol). A presença da bactéria é sinalizada

pela coloração do meio de amarelo para rosa; devido à produção da enzima uréase, que

hidrolisa a ureia em amônia e CO2, levando à alcalinização do meio e mudança da cor do

indicador de pH (GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014). Essa mudança deve ocorrer dentro das

primeiras 24 horas para o teste ser considerado positivo (ORNELLAS et al., 2000). É um

teste barato, rápido, amplamente disponível e altamente específico; o qual sendo positivo é

suficiente para iniciar um tratamento de erradicação (MALFERTHEINER et al., 2012).

20

1.4.2 Métodos não invasivos

Vários tipos de ensaios imunológicos foram utilizados para identificar anticorpos

IgG e IgA contra H. pylori. A técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é um

dos métodos mais utilizados; baseia-se na detecção de IgG Anti-Hp, com sensibilidade e

especificidade variando de 60% a 100% (GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).

O teste respiratório com ureia marcada, é outro método que baseia-se na ingestão

de um líquido contendo ureia marcada com 13

C (não radioativo) ou 14

C (pouco radioativo).

Caso haja infeção pelo H. pylori, este irá metabolizar a ureia em amônia e 13

CO2 ou 14

CO2;

estes últimos difundem-se para o sangue e são exalados através dos pulmões, o qual podem

ser medidos no ar exalado. O CO2 coletado em um balão específico segue para análise por

espectrometria de massa (no caso do C13

) ou de cintilação líquida (para o C14

) (COELHO,

1998; GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).

A sensibilidade e especificidade do teste respiratório excedem 90% na maioria dos

estudos. Um estudo com crianças brasileiras mostrou sensibilidade de 95,5% e especificidade

de 99,0% (CARDINALLI; ROCHA; ROCHA, 2003). Outro, com crianças de uma

comunidade urbana de Fortaleza, apresentou sensibilidade e especificidade de 100%

(GONÇALVES, 2010), podendo ser usado em estudos epidemiológicos e como teste de

preferência para o controle da erradicação da infecção, por ser não invasivo (DAHLERUP et

al., 2011).

Outro método não invasivo de grande valor para o diagnóstico da infecção por H.

pylori é a pesquisa de antígenos dessa bactéria nas fezes (HpSA). Baseia-se em um

imunoensaio enzimático para o diagnóstico da infecção ativa e de acompanhamento

terapêutico de erradicação. As amostras podem ser armazenadas durante 24 h em temperatura

ambiente ou até 72 h a 4ºC, mas sem refrigeração sofrem significativa redução em 2 a 3 dias

(GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014). Esse teste é tão acurado quanto o respiratório,

mostrando-se também eficaz no controle da erradicação da bactéria, tendo a vantagem de ser

mais barato, resultado em torno de uma hora, não requer equipamentos sofisticados e ainda

permite estocagem do material para futuras pesquisas (VAIRA; MALFERTHEINER;

MERGRAUD, 2000).

Outra técnica que pode ser utilizada para verificar a presença do H. pylori é a

Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), não sendo ainda utilizada na prática do diagnóstico

clínico, mas de grande importância na pesquisa científica, uma vez que permite conhecer a

virulência das cepas bacterianas circulantes (LEHOURS et al., 2003). O método de PCR

21

permite identificar bactérias em amostras pequenas e de pouca densidade bacteriana; requer

processamento e transporte especiais; as amostras podem ser coletadas por métodos invasivos

e não invasivos; possui menor tempo de análise em relação aos outros métodos. As matrizes

para o PCR podem ser desde as biopsias gástricas, suco gástrico, saliva e até fezes

(LEHOURS et al., 2003; GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).

O PCR baseia-se na amplificação de fragmento específico de DNA, a partir da

sequência de DNA molde. Essa técnica requer a utilização de “primers”, pequenos

fragmentos de DNA, complementares ao DNA de interesse. A partir deles, uma enzima DNA

polimerase (Taq-DNA polimerase) promoverá a síntese de DNA por adição de nucleotídeos

complementares em etapas de termociclador (desnaturação, anelamento e extensão)

(CLAYTON et al., 1992).

Alternativo à endoscopia, o Enteroteste é utilizado para obtenção de suco gástrico

e detecção do H. pylori. Neste método, os pesquisadores cultivam o suco gástrico e fazem

PCR, conseguindo sensibilidade de 75% para cultura de pacientes, sabidamente positivos

(PEREZ-TRALLERO et al., 1995). Nesse teste, o indivíduo ingere um cordão com uma

cápsula contendo um fio no seu interior. Após 1 hora, o fio é retirado e o suco gástrico aderido

ao cordão será utilizado para testes moleculares e cultura (PEREZ-TRALLERO et al., 1995).

Os resultados obtidos com esse método são variáveis, com sensibilidade de 75% a 100%, em

países como Austrália (SAMUELS et al., 2000) e México (TORRES et al., 2001),

respectivamente, e quando comparado com o exame histológico ou cultura da biópsia. Em

Taiwan e no Peru também foi relatada alta sensibilidade e especificidade do método (WANG

et al., 2003; VELAPATIÑO et al., 2006). Na Colômbia, esse método apresentou sensibilidade

de 74% e especificidade de 87% (ARBOLEDA et al., 2013).

1.5 Patogênese do Helicobacter pylori

O H. pylori é um patógeno associado com um aumento de até nove vezes do risco

de desenvolvimento do câncer gástrico. Decorrente disto, em 1994, a Organização Mundial de

Saúde classificou o H. pylori como carcinógeno tipo I para humanos (IARC, 1994; BLASER;

CRABTREE, 1996; KUIPERS, 1998; ATHERTON; BLASER, 2009).

Entre os mecanismos pelos quais o H. pylori produz diferentes quadros clínicos

no estômago e no duodeno dos pacientes, sabe-se que fatores: da bactéria, do hospedeiro e do

meio ambiente (entre eles: tipo de cepa, idade da aquisição da infecção, predisposição

genética do hospedeiro) contribuem para determinar as diversas evoluções clínicas

22

(SUERBAUM; MICHETTI, 2002).

O H. pylori possui 15% do seu teor proteico constituído Urease citoplasmática

pré-formada. Quando o pH externo é inferior a 6,5, um canal específico abre na membrana

citoplasmática bacteriana, permitindo a entrada de ureia. A ureia é hidrolisada em amônia e

CO2, a amônia neutraliza o periplasma, permitindo a manutenção do potencial da membrana

citoplasmática bacteriana (WEEKS et al., 2000).

Além disso, proteínas bacterianas ativam e degranulam mastócitos, liberando

outros ativadores inflamatórios (histamina, prostaglandinas) que aumentam a permeabilidade

vascular, a migração de leucócitos ao sítio da infecção e a expressão de moléculas de adesão

de leucócitos às células endoteliais (CRABTREE et al., 1991; MAEDA et al., 1998;

MOBLEY, 2001).

A presença do H. pylori além de estimular a imunidade inata, estimula fortemente

as respostas imunes humorais e mediadas por células. No entanto, as respostas humorais não

estão envolvidas na proteção; em contraste com as respostas mediadas por células que atuam

na eliminação da bactéria e na patogênese em modelos animais e em seres humanos (EATON;

MEFFORD; THEVENOT, 2001).

Na infecção pelo H. pylori o que predomina é o perfil Th1 das células T humanas,

o qual está associado com a liberação de citocinas pró-inflamatórias e ativação de macrófagos.

Ratos infectados experimentalmente, com forte resposta Th1, desenvolveram intensa gastrite,

mas com baixa carga bacteriana; enquanto que em ratos com perfil Th2 foi observado o

contrário (Th1 – aumento de inflamação e atrofia gástrica; Th2 – inverso dos efeitos do Th1)

(SMYTHIES et al., 2000; FOX et al., 2000).

Dosagens séricas dos níveis das subclasses IgG contra o H. pylori sugere uma

polarização Th2 em partes da população da África e uma polarização Th1 no Japão e do

Reino Unido; possivelmente contribuindo para as baixas prevalências de afecções gástricas na

África em relação aos outros países citados (ROBINSON et al., 2008).

A resposta imunológica desencadeada pela ação do H. pylori nas células gástricas

é acumulada qualitativa e quantitativamente com a idade, levando a uma estimulação dessa

resposta ao longo da vida por uma infecção cronicamente ativa, ocasionando danos a longo

prazo (MICHEL et al., 2014).

No referente à alteração na secreção gástrica do hospedeiro, estudos indicam que

indivíduos infectados com essa bactéria apresentam maior concentração de gastrina

plasmática, elevados níveis de interleucina-1ß (IL-1ß), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6

(IL-6), interleucina-8 (IL-8), Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α) e secreção de ácido que

23

indivíduos não infectados, com esses parâmetros retornando ao normal após a erradicação do

microrganismo (CRABTREE et al., 1991; YAMAOKA et al., 2004).

1.6 Afecções Gástricas

A infecção pelo H. pylori é geralmente adquirida durante a infância, persistindo ao

longo da vida; está usualmente associada com o desenvolvimento das principais doenças

gastroduodenais, como, gastrite, úlcera péptica, carcinoma gástrico e linfoma MALT

(GRANSTRÖM; TINDBERG; BLENNOW, 1997; OLEASTRO et al., 2003; BRAGA et al.,

2007 ATHERTON; BLASER, 2009).

Metade da população mundial está infectada pelo H. pylori, e 80% desses

indivíduos permanecem assintomáticos, sem nenhuma evidência clínica de doença, durante

praticamente toda a vida (WISNIEWSKI; PEURA 1997). Cerca de 10% dos indivíduos

infectados desenvolvem úlcera péptica, e apenas 1-3% progride para o câncer gástrico e 0,1%

desenvolve linfoma MALT; indicando o envolvimento de outros fatores na patogênese dessa

bactéria (HANSSON et al., 1993; WATANABE et al., 1997; WARREN et al., 2000).

1.6.1 Gastrite

A fase inicial da infecção pelo H. pylori induz uma resposta inflamatória aguda

que é assintomática, ou sintomática com manifestações clínicas de curta duração (náuseas e

vômitos), que evoluem para uma gastrite crônica de longa duração (CARRASCO;

CORVALAN, 2013).

O epitélio foveolar produz uma espessa camada protetora epitelial de muco

(mucina), local de colonização inicial do H. pylori. Na infecção crônica, o H. pylori causa um

proeminente dano ao epitélio gástrico pelo contato com a membrana superficial de tais células.

As células epiteliais assumem a forma irregular e cuboides, diminuindo a produção de mucina

e acarretando em buracos na camada de muco (BODGER; CRABTREE, 1998; CARRASCO;

CORVALAN, 2013).

O H. pylori tem tropismo pelo antro gástrico, mas podendo infectar qualquer parte

do estômago. Após tratamento, as bactérias migram do antro para o corpo, diminuindo a

gastrite antral (CARRASCO; CORVALAN, 2013; SUERBAUM; MICHETTI, 2002). No

entanto, mesmo em menor proporção, também há casos de gastrite corpal e disseminada

(pangastrite) com o progresso da infecção. É relatado na literatura que cerca de 50% dos

24

pacientes infectados por H. pylori que apresentam pangastrite crônica evoluem para lesões

precursoras do câncer gástrico (SIPPONEN; PRICE, 2011).

Na gastrite aguda inicial surge um grande infiltrado neutrofílico na região da

mucosa e na lâmina própria. Os neutrófilos e o H. pylori destroem o epitélio gástrico,

induzindo a proliferação celular pelo organismo na tentativa de repor o epitélio lesado. A

regeneração deste tecido é caracterizada por perda de mucina, basofilia citoplasmática,

aumento da mitose e núcleos hipercromáticos; assemelhando com um processo de displasia

(CARRASCO; CORVALAN, 2013).

A inflamação neutrofílica e a presença de folículos linfoides com centros

germinativos são as duas principais alterações histológicas oriundas da infecção pelo H. pylori

e sua erradicação provoca rápido desaparecimento dos neutrófilos; desta forma, a

permanência dos neutrófilos é um bom indicador da falha terapêutica. Após a erradicação da

bactéria, há uma rápida reversão das alterações histológicas e as células voltam as suas formas

normais e reorganização espacial. (KONG et al., 2014).

O sistema de classificação Sydney é o mais utilizado para a gastrite (SIPPONEN;

PRICE, 2011). O sistema Sydney classifica gastrite com base na topografia, morfologia, e,

quando possível, na etiologia, em três grandes categorias: aguda, crônica e especiais (ou

distintivos). Recomenda-se a amostragem de três pontos do estômago (antro, incisura

angularis, e corpo); e que haja uma graduação das características patológicas (densidade de H.

pylori, intensidade de neutrófilos e mononucleares, atrofia do antro e do corpo, metaplasia

intestinal). Para cada parâmetro é atribuído um valor numérico ou descritivo: 0 para ausente; 1

para leve; 2 para moderado e 3 intenso; por fim, é feito a média de cada valor, de cada

amostra separado para cada compartimento anatômica (antro e do corpo) (SIPPONEN;

PRICE, 2011; CARRASCO; CORVALAN, 2013).

1.6.2 Úlcera Péptica

Úlceras pépticas são identificadas como lesões na mucosa com um diâmetro de

pelo menos 0,5 cm, com penetração até a mucosa muscularis. As úlceras gástricas ocorrem,

principalmente, ao longo da curvatura menor do estômago; em particular, na zona de transição

do corpo para o antro. Geralmente, úlceras duodenais ocorrem no bulbo duodenal, região mais

exposta ao ácido gástrico. Nos países ocidentais, úlceras duodenais são cerca de quatro vezes

mais comuns do que úlceras gástricas. Úlceras duodenais ocorrerem entre 20 e 50 anos de

idade, enquanto que úlceras gástricas surgem, predominantemente, em indivíduos com mais

25

de 40 anos (KUSTERS; VAN VLIET; KUIPERS, 2006).

O H. pylori está presente em 95% dos pacientes com úlceras duodenais e em 70%

daqueles com úlceras gástricas; os quais são tipicamente contaminados pela via fecal-oral

durante primeira infância (FASHNER; GITU, 2015). O uso de antiinflamatórios não

esteroides é apontado como a segunda causa direta de úlcera péptica, principalmente em

pacientes idosos, associada a outras afecções do trato gastrointestinal como a Síndrome de

Zollinger-Ellison e doença de Crohn (COELHO, 1998).

A úlcera duodenal, geralmente, é derivada de uma gastrite antral, que é a forma

mais comum de gastrite causada pelo H. pylori. Já, indivíduos que apresentam gastrite corpal

e atrofia multifocal são mais propensos ao desenvolvimento de úlcera gástrica, atrofia gástrica,

metaplasia intestinal e, por último, do carcinoma gástrico (SUERBAUM; MICHETTI, 2002).

Marshall demonstrou a relação entre a infecção pelo H. pylori e a úlcera péptica

ao observar que após a erradicação da bactéria, ocorre um processo de cicatrização da úlcera

sem a necessidade de utilizar medicamentos supressores da secreção ácida (MARSHALL;

WARREN, 1983). A erradicação do H. pylori mudou drasticamente o curso natural da úlcera,

impedindo quase que completo a recorrência da mesma. A recorrência da úlcera após a terapia

pode ser devido à resistência bacteriana, uma reinfecção, uso de AINEs (anti-inflamatórios

não-esteroidais) ou mesmo uma úlcera idiopática (KUSTERS; VAN VLIET; KUIPERS,

2006).

1.6.3 Câncer Gástrico

O Câncer Gástrico possui etiologia multivariável, pela interação dos fatores

genéticos dos pacientes, fatores socioambientais, bem como pelos fatores de virulência das

cepas de Helicobacter pylori (SUERBAUM; MICHETTI, 2002). Indivíduos fumantes,

alcoólatras, com dietas ricas em sal possuem maior risco de desenvolver o câncer gástrico;

enquanto indivíduos com dietas ricas em frutas e verduras, em especial as frutas cítricas,

possuem um menor risco (DHOBI et al., 2013).

Em 1994, o H. pylori foi classificado como agente cancerígeno da classe I

(definitivo) pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (IARC - International

Agency for Research on Cancer), uma divisão da Organização Mundial da Saúde (OMS).

Devido ao H. pylori ser o principal fator de risco para o câncer gástrico em estudos animais,

bem como em estudos clínicos em humanos (IARC, 1994; AHN; LEE, 2015).

A associação entre infecção pelo H. pylori e o câncer gástrico é forte e bem

26

descrita pela literatura mundial (BRENNER et al., 2000); a qual sugere um alto risco de

desenvolver câncer gástrico pela infecção de cepas mais virulentas e positivas para o gene

associado a citotoxina (cagA) e o gene vacuolizante (vacA s1m1) (CAVALCANTE et al.,

2012).

Outro importante fator de risco para o indivíduo desenvolver o câncer gástrico é

história familiar positiva para a doença. Pois estudos epidemiológicos reportam significância

estatística para a referida relação (MARCOS-PINTO et al., 2012).

As úlceras duodenais possuem colonização bacteriana na região antral e está

associada com: altos níveis de gastrina; alta produção de ácido gástrico; e menor risco de

ocorrência do câncer gástrico (DE; ROYCHOUDHURY, 2015; AHN; LEE, 2015). Já no

adenocarcinoma gástrico, a colonização se dá em regiões mais próximas (pangastrite).

Provocando danos em glândulas gástricas, desencadeando gastrite atróficas associada a

hipocloridria ou acloridria; baixos níveis do pepsinogénios I; baixa relação pepsinogénios I/II

e altos níveis de gastrina. Tais alterações gástricas, evoluem em várias etapas incluindo

metaplasia intestinal, displasia e adenocarcinoma, segundo a hipótese de Correa. As quais

podem levar de 70 a 80 anos e que está associado ao adenocarcinoma do tipo intestinal

(AMIEVA; EL–OMAR, 2008; NAM et al., 2011; AHN; LEE, 2015; DE; ROYCHOUDHURY,

2015).

O adenocarcinoma gástrico possui dois tipos histológicos, o tipo intestinal e o

difuso; segundo a classificação de Lauren (SANTORO et al., 2007; NAM et al., 2011). O

adenocarcinoma do tipo difuso tem associação com o H. pylori; possui aspecto histológico

com poucas glândulas gástricas; células não coesivas com infiltrado na parede gástrica e de

maior incidência em pacientes jovens (SANTORO et al., 2007; POLK; PEEK, 2010; AHN;

LEE, 2015). Porém, o tipo Difuso não tem uma sequência de alterações histológicas com o

adenocarcinoma do tipo Intestinal.

Enquanto que a sequência de manifestações clínicas da infecção pelo H. pylori até

o desenvolvimento do câncer gástrico do tipo intestinal são: Gastrite Crônica, presente na

maioria dos paciente e assintomáticos; Úlceras duodenais, ocorre em 10%-15% dos

indivíduos; Úlceras Gástricas/Adenocarcinoma, evoluindo até câncer gástrico em 1% a 3%

dos indivíduos infectados; linfoma MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) que se

desenvolve em 0,1% dos indivíduos (SANTORO et al., 2007; AMIEVA; EL–OMAR, 2008;

AHN; LEE, 2015).

Adenocarcinoma gástrico também é classificado em Tumores Proximais (junção

gastresofágica e cárdia) e Tumores Distais (antro, corpo e fundo gástricos). As duas

27

classificações do câncer possuem fisiopatologia e epidemiologia distintas; sendo o tipo distal

relacionado ao H. pylori (AHN; LEE, 2015).

1.7 Tratamento do Helicobacter pylori

O protocolo de primeira linha de tratamento do H. pylori consiste na combinação

de um inibidor de bombas de prótons (IBP), claritromicina e amoxicilina ou metronidazol; de

acordo com os consensos internacionais (MALFERTHEINER et al., 2012; LOPES et al.,

2014). A terapia dura de 7 a 14 dias, com duas tomadas ao dia. As taxas de erradicação por 14

dias de terapia tríplice é cerca de 70% em pacientes com dispepsia não-ulcerosa e 80% em

pacientes com úlcera péptica (ZULLO et al., 2013).

Na Europa, Ásia e América do Norte são relatadas taxas de erradicação entre 20 a

45%; as quais são distantes das taxas propostas pela Organização Mundial de Saúde (OMS)

como desejável para doenças infecciosas. A principal limitação da eficácia do tratamento é a

falta de adesão terapêutica, devido aos efeitos adversos e desconfortos após altas e múltiplas

doses dos medicamentos propostos; o que contribui para o aumento da resistência bactérias

aos antibióticos disponíveis (MALFERTHEINER et al., 2012; LOPES et al., 2014).

Na busca de superar as limitações do tratamento convencional, novas alternativas

estão sendo propostos, como o uso de: probióticos; fitoterápicos; sistemas de aprisionamento

gástrico de medicamentos; desenvolvimento de vacinas. Entretanto, uma das terapias mais

promissoras baseia-se na utilização de micro e/ou nano partículas com propriedades muco-

adesivas para a administração direta dos fármacos (SELGRAD; MALFERTHEINER, 2008;

VÍTOR; VALE, 2011; LOPES et al., 2014).

1.8 Diversidades do padrão de algumas cepas do H. pylori no Brasil e suas correlações

clínicas

Os genótipos (cagA, cagE, vacA, dupA, babA, oipA) do H. pylori são bastantes

variáveis de acordo com a localidade estudada. Por isso há uma diversidade de prevalência

dos genes das cepas de acordo com as regiões no Brasil, ressaltando a importância do estudo

das cepas circulantes em cada população.

Para o gene cagA, Rasmussen et al. (2012) encontrou a presença geral de 72,0%

de cepas cagA positivas em 62 biópsias gástricas na cidade de São Paulo - SP, dado este

similar ao encontrado em Recife - PE que foi de 70,5% em 61 pacientes H. pylori positivos

28

(BRITO et al., 2003); um percentual um pouco maior foi encontrado em Belo Horizonte - MG

com 79,81% em 208 pacientes (OLIVEIRA et al., 2003). Já em Porto Alegre - RS foi

encontrado valores bem menores, 40,2% de cepas cagA positivas em 87 pacientes (MEINE et

al., 2011) e em Marília, interior do estado de São Paulo, o percentual também foi baixo,

47,8% de cepas cagA positivas em 205 participantes do estudo (PEREIRA et al., 2014).

A proteína CagA é uma das mais importante na patogenicidade da infecção do H.

pylori e a correlação da presença do gene cagA com as afecções gástricas. Por isto é um dos

genes mais estudados no mundo e no Brasil. A Tabela 1 traz uma visão panorâmica da

prevalência deste gene nas diversas regiões do Brasil.

Como observa-se na Tabela 1, a região Sul é a que possui menores valores de

prevalência do gene cagA e com pouca associação com as afecções gástricas; mesmo não

apresentando associações, o estudo de Cogo et al. (2011) difere dos demais para a região.

Enquanto que a regiões Norte e Nordeste possuem os maiores valores de prevalência,

associando o gene às afecções graves com as úlceras e o câncer gástrico.

Para o gene cagE, Módena et al. (2007) obteve 88,9% de cepas cagE em 172

pacientes com diversas doenças gástricas na cidade de Ribeirão Preto - SP. Enquanto que

Oliveira (2014) encontrou 47,4% de cepas cagE positivas em uma amostra de 137 pacientes

com gastrite e úlcera na cidade de Fortaleza - CE; apresentando grande associação deste gene

com a úlcera péptica.

Lima et al. (2010) encontrou a prevalência de 53,2% de cepas cagE positivas em

101 pacientes com câncer gástrico em Fortaleza. Enquanto que Braga Neto (2015) relata que

25/62 (40,3%) são cepas cagE positivas em pacientes com câncer gástrico na mesma cidade,

sem associação do gene com a neoplasia. Com os familiares dos pacientes com câncer

gástrico, Braga Neto (2015) observou que 53/95 (55,8%) destes eram cagE positivos;

associando tal gene como fator de risco para os familiares dos pacientes acometidos pelo

câncer gástrico.

Ao estudar o gene vacA, Pereira et al. (2014) obteve que a combinação alélica

vacA s1m1 do gene vacA é predominante com 50,2% de positividade nas cepas de 205

pacientes da cidade de Marília. Rasmussen et al. (2012) encontrou dados distintos, pois

56,0% das cepas possuem o gene vacA s1m1 em 62 biópsias gástricas na cidade de São Paulo.

Gonçalves et al. (2013) encontrou que 51,5% são cepas vacA s1m1 em 50 crianças

assintomáticas de uma comunidade carente de Fortaleza. Enquanto, Lima et al. (2011) relata

que a prevalência do gene vacA s1m1 é de 75,5% em 94 pacientes com câncer gástrico

infectados pelo H. pylori na mesma cidade. Tais dados sugerem a necessidade de mais estudos

29

sobre os marcadores genéticos desta bactéria em mais regiões e em grupos etários distintos.

Tendo em vista a gravidade da infecção na primeira infância, pois crianças assintomáticas já

estão contaminadas com cepas que expressam genes de maior virulência que podem,

eventualmente, levá-las a desenvolver doenças graves como o câncer gástrico (LIMA et al.,

2011; GONÇALVES et al. 2013).

Tabela 1: Prevalência e associações de cepas cagA diagnosticado pelo PCR nas diferentes regiões do

Brasil

Região/Cidade Prevalência do cagA (%)

na amostra populacionais

estudada

Associação com as

afecções gástricas

Autor e ano

Norte

Belém – PA 78,0 (G, UP) Úlcera MARTINS et al., 2005

Belém/Bragança – PA 76,0/87,0 (G) Gastrite SILVA JÚNIOR et al., 2013

Belém – PA 85,6 (G, UP, CG) Úlcera VINAGRE et al., 2015

Nordeste

Recife – PE 70,5 (G, UP) Úlcera BRITO et al., 2003

Fortaleza – CE 64,9 (CG) Câncer Gástrico LIMA et al., 2010

Fortaleza – CE 82,8 (G, UP, CG) Câncer Gástrico CAVALCANTE et al., 2012

Fortaleza – CE 66,7 (AS) Sem associações* GONÇALVES et al., 2013

Sul

Porto Alegre – RS 40,2 (CG) Câncer Gástrico MEINE et al., 2011

Curitiba - PR 92,0 (G, UP) Sem correlações COGO et al., 2011

Pelotas – RS 45,6 (DP) Sem correlações RAMIS et al., 2013

Porto Alegre - RS 29,6 (DP) Sem correlações* OLIVEIRA et al., 2014

Suldeste

Belo Horizonte - MG 69,1 (UP) Úlcera* ASHOUR et al., 2002

Belo Horizonte - MG 79,81 (G, UP, CG) Gastrite e Câncer OLIVEIRA et al., 2003

Ribeirão Preto - SP 73,4 (G, UP) Úlcera GATTI et al., 2006

São Paulo - SP 72,0 (G) Gastrite RASMUSSEN et al., 2012

Marília - SP 47,8 (DP, G) Gastrite** PEREIRA et al., 2014

Fonte: Elaborada pelo autor.

G = Gastrite; UP = Úlceras pépticas; CG = Câncer gástrico; DP = Dispépticos; AS = Assintomáticos

*Estudos com crianças

**Estudo com adultos e crianças

Gonçalves et al. (2013) encontrou que 51,5% são cepas vacA s1m1 em 50 crianças

assintomáticas de uma comunidade carente de Fortaleza. Enquanto, Lima et al. (2011) relata

30

que a prevalência do gene vacA s1m1 é de 75,5% em 94 pacientes com câncer gástrico

infectados pelo H. pylori na mesma cidade. Tais dados sugerem a necessidade de mais estudos

sobre os marcadores genéticos desta bactéria em mais regiões e em grupos etários distintos.

Tendo em vista a gravidade da infecção na primeira infância, pois crianças assintomáticas já

estão contaminadas com cepas que expressam genes de maior virulência que podem,

eventualmente, levá-las a desenvolver doenças graves como o câncer gástrico (LIMA et al.,

2011; GONÇALVES et al. 2013).

Gomes et al. (2008) foi a primeira pesquisadora a investigar a prevalência do gene

dupA no Brasil, na ocasião encontrou que 92,32% das cepas circulantes em Belo Horizonte

são dupA positivas em uma amostra de 351 adultos e 131 crianças. Apesar da alta frequência,

não encontrou nenhuma relação com as afecções gástricas. Também em 2008, na cidade de

Ribeirão Preto, Pacheco et al. (2008) encontrou 62,0% de cepas dupA positivas em 79 adultos;

também sem relação do gene com alguma afecção gástrica.

Em 2014 na cidade de Baurú - SP, Pereira et al. (2014) encontrou que apenas

41,5% das cepas eram dupA positivas. Ao comparar o trabalho de Gomes et al. (2008), o

próprio pesquisador ressaltou que as discordâncias dos resultados podem ser explicadas pelos

fatores: diferenças geográficas do Brasil; população estudada; método de análise molecular; a

perda ou rearranjo na zona de plasticidade do gene.

Em 2003, na cidade de Belo Horizonte, Oliveira et al. (2003) encontrou 46,15%

das cepas eram babA2 positivas, as quais tiveram correlação com úlceras duodenais e com o

câncer gástrico.

Gatti et al. (2005) relata a presença de 47% das cepas positivas para babA2 em 89

pacientes na cidade de Marília, as quais estiveram associadas à gastrite crônica. Já no ano

seguinte, em 2006, na cidade de Ribeirão Preto, o mesmo autor refere-se a 40,4% de cepas

babA2 positivas em 95 pacientes; mas sem nenhuma correlação com as afecções gástricas

(GATTI et al., 2006). Mattar et al. (2005) obteve 69,3% de cepas babA2 positivas em 150

pacientes na cidade de São Paulo, com correlação estatísticas com o gênero masculino e sem

correlação com as afecções gástricas. A mesma autora, na mesma cidade encontrou a

prevalência de 64,7% de cepas babA2 positivas em 2010 com 64 pacientes, confirmando a

falta de correlação do gene com as afecções gástricas naquela população (MATTAR et al.,

2010).

Em um estudo realizado em 2013 na cidade de Fortaleza, foi obtido a prevalência

geral de 79,8% de cepas babA2 positivas em uma amostra de 183 indivíduos portadores de

gastrite, úlceras e câncer gástrico. Tal gene mostrou-se ter associação com as úlceras pépticas

31

neste estudo (SILVA, 2013). Outro estudo em Fortaleza no ano de 2015 com 94 crianças

assintomáticas de uma comunidade carente, reporta que 21,3% das cepas são babA2 positivas

em 61 crianças infectadas com o H. pylori (MAIA, 2015).

O trabalhado pioneiro no Brasil sobre o gene oipA foi realizado pelo grupo de

estudo em Gastroenterologia, vinculado a Universidade Federal do Ceará. Na ocasião, Silva

(2013) relatou a prevalência de 44,3% de cepas oipA positivas, não havendo correlação com

as afecções gástricas. Já em crianças assintomáticas de uma comunidade carente, a presença

do gene foi de 36,1% oipA positivas, um pouco abaixo em relação a Silva (2013) (MAIA,

2015). Em um estudo subsequente ao de Silva (2013), Gonçalves (2015) sequenciou o gene

oipA da mesma amostra e observou que 42,0% destes genes apresentam o status ativados,

oipA on. Porém, a presença do gene oipA e seu status ativado ou silenciado não apresentou

correlação com as afecções.

Dados os poucos estudos com os marcadores genéticos do H. pylori no Brasil,

assim como a grande variedade gênica desta bactéria, faz-se necessários mais estudos com

uma variedade maior de genes da bactéria e nas diferentes regiões do país para se obter um

melhor perfil epidemiológico dos marcadores gênicos circulantes no Brasil.

1.9 Marcadores genéticos do Helicobacter pylori

Com o avanço na área da biologia molecular, o genoma do H. pylori tem sido

extensamente estudado, auxiliando no entendimento das variações entre as cepas, de seu

mecanismo de adaptação ao ambiente hostil do estômago e da ação dos marcadores de

virulência na patogênese das afecções gástricas. O cromossomo dessa bactéria tem um

tamanho estimado de 1,68-1,73Mb, e acredita-se que as sequências genômicas apresentam

mais pares das bases nitrogenadas adenina e timina e baixo teor de citosina e guanina, em

média 32,5mol% (TAYLOR; SIMONS; CHANG, 1991).

Estudos evidenciam a presença de diversidade genotípica em cepas de H. pylori e

que, dependendo do tipo de cepa, ocorre diferença no processo inflamatório envolvido, com

liberação de mediadores e citocinas específicos, levando a diversos graus de resposta

inflamatória e diferentes desfechos patológicos (FOX; WANG, 2002). Cepas de H. pylori que

apresentam genes pertencentes à ilha de patogenicidade cag (cag-PAI), por exemplo, induzem

resposta inflamatória mais grave, aumentando o risco de desenvolvimento de úlcera péptica e

câncer gástrico (ISRAEL; PEEK, 2001).

Em outras regiões do cromossomo bacteriano e fora a ilha cag-PAI, existem

32

outros genes que também possuem relação com as patologias causadas pela infeção. Com

exemplo: o gene vacA (vacuolating cytotoxin A) e seus alelos (s1, s2, m1, m2) codificam uma

proteína homônima, que é a citotoxina vacuolizante do H. pylori (VacA), que é secretada da

bactéria pelo sistema de T4SS. Essa toxina pode induzir múltiplas atividades celulares,

incluindo vacuolização da célula, formação de canais na membrana, interrupção das funções

endossomais e lisossomais, apoptose e imunomodulação (LIMA; RABENHORST, 2009).

Há outros genes bacterianos que codificam proteínas de membrana, como por

exemplo: O gene babA codifica a proteína BabA que está relacionada aos antígenos de Lewis,

favorecendo a adesão da bactéria no epitélio gástrico. Foram identificados três genes alelos

(babA1, babA2 e babB), mas somente o produto do babA2 é capaz de aderir as células

(OLIVEIRA et al., 2003). Enquanto que o gene oipA (outer inflammatory protein gene)

codifica uma proteína da membrana externa e é relacionado com o processo inflamatório. A

presença do gene oipA funcional foi associada com o aumento da produção de IL-8 em células

de linhagem de câncer gástrico. Está localizado no cromossomo de H. pylori,

aproximadamente a 100Kb da cag-PAI, e pode apresentar-se tanto o gene funcional como não

funcional (LIMA; RABENHORST, 2009).

Outro gene é o dupA (gene promotor de úlcera duodenal) é descrito como um

novo marcador de virulência do H. pylori, associado ao aumento do risco de desenvolver

úlcera duodenal e diminuição do risco de câncer gástrico no Japão e na Coréia (GOMES et al.,

2008).

1.9.1 Ilha de Patogenicidade cag (cag-PAI)

A cag-PAI é um componente do genoma do H. pylori, presente em 60% a 90%

das cepas mundiais, que contém cerca de 30 genes, dentre eles cagA, cagE, cagT, cagL,

homólogos aos de outras bactérias que codificam componentes do sistema de secreção do tipo

IV (T4SS), que tem a função de injetar moléculas efetoras da bactéria na célula hospedeira,

permitindo assim que a bactéria module vias do metabolismo celular dessa célula, incluindo a

expressão de proto-oncogenes (COVACCI; RAPPUOLI, 2000).

A ilha de patogenicidade cag-PAI é um conjunto de aproximadamente 40 kb de

genes no cromossoma do H. pylori; divide-se em duas regiões, cag I e cag II. Existem em

torno de 14 e 16 Open Reading Frames (ORF) no cag I e cag II, respectivamente. Alguns dos

ORFs no cag-PAI codificam proteínas semelhantes a outros sistemas de secreção bacterianas,

tais como o sistema de secreção de toxina da Bordetella pertussis (IKENOUE et al., 2001).

33

A resposta inflamatória da mucosa gástrica inicia-se quando a ilha de

patogenicidade cag-PAI, presente no genoma bacteriano, induz as células hospedeiras a

liberarem agentes quimiotáticos (entre eles, IL-1 e IL-8) que penetram através do epitélio

lesado e induzem a migração de polimorfonucleares para a lâmina própria e o epitélio

(ATHERTON; BLASER, 2009).

Há cepas de H. pylori em que a cag-Pai pode estar presente, ausente, interrompido

(não funcional); mais comum é estar presente e funcional. A região cag-PAI codifica proteínas

do sistema de secreção do tipo IV (T4SS) – é um canal oco que liga os citoplasmas da

bactéria ao da célula epitelial do hospedeiro. É um sistema não-antigênico; a estrutura

proteica (cagY) que reveste a “seringa” é estável em pH ácido, conferindo estabilidade e

permitindo evasão da resposta imune do hospedeiro (DELAHAY et al., 2008; ATHERTON;

BLASER, 2009).

Na constituição do T4SS, o contato da proteína de extremidade (CagL) com a

célula epitelial transfere e ativa a proteína efetora (CagA), a qual inicia a sinalização e os

efeitos deletérios locais. A proteína CagA também possui outros efeitos celulares, incluindo a

ativação do NF-kB; o qual também é estimulado pela presença do próprio T4SS (BRANDT et

al., 2005).

O primeiro gene cepa-específico identificado no H. pylori foi o gene cagA

(cytotoxin associated geneA), localizado na metade direita da ilha e considerado marcador de

cag-PAI (SOZZI et al., 2005). Esse gene possui entre 35 e 40Kb, sendo encontrado em cerca

de 60% das cepas ocidentais, enquanto no Oriente praticamente todas as cepas são cagA

positivas (HATAKEYAMA, 2004). As cepas cagA-positivas tendem a ser mais virulentas e

induzem níveis mais altos de expressão de citocinas, como IL-1 e IL-8 (BLASER; BERG,

2001).

Após a ligação às células do epitélio gástrico, as cepas do H. pylori cagA-

positivas injetam a proteína CagA no citoplasma celular, através do sistema de secreção tipo

IV. A proteína translocada localiza-se, então, na parte interna da membrana plasmática, onde

sofre fosforilação de tirosina, através de uma das enzimas da família quinase (MURATA-

KAMIYA, 2011). Essa fosforilação ocorre nos sítios EPIYA da proteína e ocasiona

modificações dos sistemas de transdução de sinais, provocando uma série de efeitos

intracelulares, incluindo indução de mediadores inflamatórios, rearranjos no citoesqueleto e

indução de proteínas proliferativas e oncogênicas (HATAKEYAMA, 2004).

As cepas de H. pylori que apresentam cag-PAI estão mais relacionadas à úlcera

péptica e ao câncer gástrico do que as que não apresentam. Enquanto que cepas que

34

expressam o gene cagA têm uma probabilidade três vezes maior de desenvolver úlcera

duodenal ou até mesmo carcinoma gástrico. Estudo realizado no Ceará confirmou elevada

prevalência do genótipo cagA em pacientes com câncer gástrico e úlcera péptica

(CAVALCANTE et al., 2012).

Há outros genes pertencentes a ilha cag-PAI; como o gene cagE que codifica

proteínas estruturais do sistema de secreção tipo IV (CHRISTIE et al., 2005). Alguns estudos

indicam o cagE como responsável pelo aumento da secreção de IL-8 (SU et al., 2003;

TOMASINI et al., 2003; PROENÇA et al., 2007).

Já os genes cagT e LEC estão localizados na ilha de patogenicidade cag-PAI na

região de cagII; o cagT está mais próximo do ponto central da ilha, enquanto o LEC está no

extremo esquerdo desta. Os genes cagT e LEC foram relatados como um marcador de úlcera

péptica no Brasil; com um risco de 27 e 4 vezes, respectivamente, de desenvolver a doença

(MATTAR et al., 2007). Enquanto que em Fortaleza, o gene cagT foi associado à gastrites e o

LEC não apresentou nenhuma associação (GONÇALVES, 2015).

O gene cagT codifica a proteína CagT (HP0532), uma proteína homóloga à VirB7

da Agrobacterium tumefaciens. Bastante presente nas cepas de H. pylori, esta proteína está

envolvida com a inserção da proteína CagA e secreção de IL-8. A proteína CagT está na base

de fixação do pilli do T4SS, na membrana interna bacteriana, e é recoberta pela proteína CagY,

uma proteína homóloga à VirB10 (DING et al., 2012).

1.9.2 Sequência de Inserção IS605, tnpA e tnpB

Sequencias de Inserção (IS) são comuns em diversos organismos, e também

conhecidos como Transposons; é um grupo diversificado de segmentos de DNA que fazem a

movimentação de genes dentro do próprio genoma, por mecanismos que não necessitam de

grandes sequências homólogas de DNA (HOOK-NIKANNE et al., 1998). Tais

movimentações acarretam em mutações por inserção, rearranjo no genoma e mudanças na

expressão de genes próximos; bem como, confere mecanismo de desenvolvimento e

transmissão de resistência de micro-organismos intra e interespécies. Sequencias de Inserção

também serve como marcadores em análise genéticas, assim como marcadores em pesquisas

epidemiológicas para traçar o perfil de transmissão e evolução dos patógenos em populações

infectadas (AKOPYANTS et al., 1998).

Até o presente estudo, a sequência de inserção IS605 foi a única descoberta e

sequenciada em cepas de referências do Helicobacter pylori associadas a fatores de virulência

35

da bactéria (CENSINI et al., 1996; AKOPYANTS et al., 1998). A IS605 contém duas

sequências iniciais de codificação (Open Reading Frames - ORFs), as quais possuem forte

homologia com genes de transposases em outros IS de outras bactérias (HOOK-NIKANNE et

al., 1998). Os dois ORFs da IS605 são os genes tnpA e tnpB: o tnpA que possui alta

semelhança com o gene da transpoase IS200 da Escherichia coli, Salmonella enterica do

sorotipo Typhimurium e Yersinia pestis; já o tnpB é similar à transposase da Thermophylic

bacterrium PS3 (CENSINI et al., 1996).

O elemento IS605 está inserido na região onde separa as duas partes da ilha cag-

PAI, a parte cag I e cag II e gera cepas do H. pylori com diferentes níveis de virulência (LAI

et al., 2013). Conforme representação esquemática da Figura 1.

Figura 1. Estrutura da ilha de patogenicidade cag do H. pylori. Localização do cag I, cag II e IS605.

Fonte: Adaptado de Lai et al. (2013).

A prevalência da IS605 é baixa nas cepas do H. pylori. Antonio-Rincon et al.

(2011) encontrou uma prevalência de apenas 8% (4/50) em um estudo no México. Enquanto

que outro estudo em Taiwan obteve prevalência de 15,2% do IS605; apresentando associação

significativa com o câncer gástrico (LAI et al., 2013).

Os genes tnpA e tnpB são subunidades do IS605, os quais podem interferir na

virulência do H. pylori. Apesar de ser descrito há 20 anos (CENSINI et al., 1996), são dois

genes pouco estudados quanto ao seu exato papel biológico e sua relevância clínica (ABADI

et al., 2014).

Abadi et al. (2014), estudando a população do Irã, encontrou uma alta prevalência

do gene tnpA em doentes com câncer gástrico, sugerindo um papel do gene no

desenvolvimento do câncer induzido pelo H. pylori; fato não encontrado com o gene tnpB, o

qual não apresentou nenhuma relação com as afecções gástricas.

Outro estudo realizado no Brasil aponta que os genes tnpA e LEC estão associados

com câncer gástrico; enquanto o tnpB não houve nenhuma relação. No entanto, são resultados

36

inconclusivos por se tratar de uma amostra muito pequena; necessitando de estudos futuros e

de maior amostragem para determinar o seu papel dos genes na carcinogênese gástrica

(MATTAR et al., 2010). De acordo com esses resultados inconclusivos a respeito da

relevância clínica dos genes tnpA e tnpB, faz-se necessário mais estudos para investigar

melhor tal relevância e suas variações em diversos grupos populacionais.

1.9.3 Gene cagM

O gene cagM, presente na região do cag I, codifica uma proteína no formato de

“gancho” similar à proteína do tipo 3 do Vibrio parahaemolyticus, com a capacidade de

induzir a produção de IL-8 pelas células epiteliais gástricas (JENKS; MÉGRAUD; LABIGNE,

1998).

A proteína CagM faz parte da constituição da porção periplasmática e extracelular

do pilli do T4SS. Outra ação biológica do produto do gene cagM é o aumento do pH

estomacal no hospedeiro pela inibição da secreção ácida. As proteínas CagA, CagE, CagL e

CagM estão envolvidas no mecanismo de inibição da transcrição do RNAm da subunidade α

da enzima H, K-ATPase (HKα) nas células parietais (SAHA et al., 2010).

Smolka e Backert (2012) também estudou os genes CagA, CagE, CagL e CagM,

genes codificantes do T4SS e confirmou o envolvimento de tais na inibição da transcrição do

HKα e também na ativação do NF-κB. Desta forma, descrevendo o mecanismo de acloridria

na infecção pelo H. pylori.

Um estudo realizado no Brasil em 2007 encontrou que a presença do cagM está

associado com o risco de 8 vezes de desenvolver a úlcera péptica; podendo ser um marcador

útil para identificar indivíduos com risco mais elevado de desenvolvimento de úlcera péptica

no Brasil (MATTAR et al., 2007). Enquanto que a prevalência do cagM gira em torno de 90 a

100% na China; mas sem nenhuma associação da presença do gene com as afecções gástricas

(LAI et al., 2013).

37

1.10 Justificativa

A infeção pelo H. pylori é pandêmica, silenciosa e de consequências desastrosas

para a saúde pública devido ao potencial de virulência desta bactéria. Tal potencial difere em

cada região e em cada população infectada por conta da alta variabilidade genética das cepas.

Por isto a importância deste estudo dos genes tnpA, tnpB e cagM nas cepas circulantes em

Fortaleza, para se obter qual a associação de tais genes com as afecções gástricas na

população estudada; bem como agregar conhecimento aos genes já estudado por este grupo de

estudo da região Nordeste do brasil. Desta forma, tais estudos de perfil genético das cepas

circulantes poderão ajudar na tomada de decisão para o correto diagnóstico, manejo clínico e

tratamento da população infectada pelo H. pylori; além de ajudar na orientação de políticas

públicas para o combate e tratamento.

38

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar os fatores de virulência tnpA, tnpB e cagM de cepas do H. pylori em

pacientes portadores de gastrite, úlcera péptica e câncer gástrico atendidos no Hospital

Universitário Walter Cantídio – UFC.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar a distribuição dos genes da ilha cag-PAI (tnpA, tnpB, cagM) das cepas de H. pylori

nos pacientes do presente estudo.

Analisar a associação da presença dos genótipos do H. pylori com gênero e faixa etária dos

pacientes estudados.

Analisar a associação de tais genes com as afecções gástricas (gastrite, úlcera péptica, câncer

gástrico).

Verificar associação entre os genes estudados da ilha cag-PAI (tnpA, tnpB, cagM).

39

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Casuística

Esse estudo faz parte dos trabalhos do laboratório de Gastroenterologia/UFC. No

qual foram avaliados, prospectivamente, indivíduos portadores de câncer gástrico, úlcera

péptica e gastrite, diagnosticados por meio de endoscopia digestiva alta ou análise

histopatológica de biópsia gástrica, atendidos no serviço de Gastroenterologia do Hospital

Universitário Walter Cantídio (HUWC), da Faculdade de Medicina da Universidade Federal

do Ceará – UFC, que aceitaram participar do estudo e assinaram o termo de consentimento

livre e esclarecido (Apêndice A), perfazendo um total de 147 pacientes, no período de 2012 a

2015. O estudo foi submetido à análise e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa -

Universidade Federal do Ceará (COMEPE/UFC) (ANEXO A).

3.2 Tipo do Estudo

Estudo descritivo transversal. Os pacientes atendidos pelo serviço de

Gastroenterologia foram encaminhados para a realização da endoscopia; e após a coleta da

biópsia gástrica com o laudo endoscópico, foram incluídos no estudo para a realização das

análises genéticas.

3.3 Seleção dos Participantes

Foram critérios de inclusão:

Idade mínima de 17 anos e máxima de 90 anos de ambos os gêneros;

Indivíduos portadores das principais afecções gástricas (gastrite, úlcera péptica ou câncer

gástrico) confirmadas por endoscopia ou exame histopatológico, infectados pelo H. pylori.

Pacientes que aceitaram participar do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e

esclarecido.

Foram critérios de exclusão:

Gravidez ou lactação;

Indivíduos que realizaram cirurgia prévia de ressecção gástrica ou vagotomia, ou

40

apresentando síndrome de Zolliger-Ellison, estenose pilórica;

Portadores de insuficiência renal, insuficiência hepática, insuficiência cardíaca congestiva

ou instabilidade hemodinâmica (variação de pressão arterial, sangramentos e hemorragias)

que contraindicasse a investigação endoscópica.

3.4 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Endoscopia

De todos os participantes do estudo submetidos à endoscopia digestiva alta, foram

colhidos fragmentos de mucosa gástrica. A endoscopia foi realizada com o paciente em jejum

de, no mínimo 8 horas. Antes do procedimento, o paciente recebeu anestesia tópica da

orofaringe com Cloridrato de Lidocaína (Xilocaína spray a 10%) e uma dose de Diazepam (5

mg por via oral). O endoscópio foi submetido a rigoroso processo de assepsia, entre um

procedimento e outro, sendo lavado vigorosamente com água e sabão e mergulhado em uma

solução de glutaraldeído a 2% por 30 minutos.

A coleta dos fragmentos obedeceu ao protocolo validado do Sistema de Sydney

(SIPPONEN; PRICE, 2011), os locais da coleta dos espécimes foram os seguintes: (IA) - 2

fragmentos da Incisura Angularis; (A1) - 2 fragmentos da pequena curvatura do antro; (A2) -

2 fragmentos da grande curvatura do antro; (B1) - 2 fragmentos da pequena curvatura do

corpo; (B2) - 2 fragmentos da grande curvatura do corpo gástrico. Obtendo-se 10 fragmentos

em frascos separados com as seguintes especificações a depender do local da coleta (IA, A1,

A2, B1, B2).

Um fragmento extra foi colhido para a realização do teste da urease. Nele, o

fragmento da região antral é imerso em um tubo contendo uma solução de ureia e indicador

de pH. A análise foi efetuada imediatamente após a coleta do material e uma leitura final foi

realizada vinte e quatro horas após. O teste da urease foi considerado positivo quando houve

mudança da coloração da ureia de “amarelo” para “vermelho”. Nos casos em que a solução

permaneceu “amarela” por vinte e quatro horas após a coleta, o teste foi considerado negativo.

Quando houve dificuldade em estabelecer a mudança de coloração, o teste foi tido como

indeterminado.

O procedimento do exame endoscópico tinha duração de, aproximadamente, 20

minutos. Após na realização do mesmo, as amostras coletadas foram armazenadas,

imediatamente, a 4°C para serem transportadas até o laboratório, onde eram estocadas em

freezer -80ºC, até o seu processamento e análise.

41

3.5 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Gastrectomia

Os fragmentos dos portadores de câncer gástrico foram colhidos no momento da

cirurgia de ressecção do tumor (gastrectomia parcial ou total). Foram coletados, após a

retirada do estômago, 10 fragmentos da peça cirúrgica, sendo 6 fragmentos de tecido distal ao

tumor e 4 fragmentos da região da borda tumoral. Os fragmentos foram colocados em tubos

específicos e armazenados imediatamente a 4°C para serem transportadas até o laboratório,

onde foram estocados em freezer -80ºC, até o seu processamento e análise.

3.6 Extração do DNA de Helicobacter pylori em Tecido de Biópsia Gástrica

A extração do DNA do H. pylori nas amostras de tecido gástrico colhidas dos

pacientes estudados, foi feita a partir da maceração dos fragmentos de biópsia gástrica. O

material genômico foi extraído das amostras seguindo o protocolo de QIAGEN®

, com os

reagentes do QIAamp DNA mini kit, conforme orientação do fabricante.

Primeiramente, efetuou-se a digestão do material tecidual, que foi colocado em

minitubos de 2 mL, com 180μL de tampão ATL e 20μL de Proteinase K, e submetidos a

banho-maria a 56ºC por vinte e quatro horas.

Após a digestão, seguiu-se a lise celular, onde foram adicionados 200μL de

tampão AL, e incubou-se novamente as amostras em banho-maria, a 70ºC, por dez minutos.

Em seguida, adicionou-se 200μL de Etanol 100%.

O conteúdo da lise celular foi transferido para coluna Spin QIAamp®

, para etapa

de eluições com intuito de filtrar o conteúdo celular, o primeiro filtrado foi centrifugado a

8.000 rpm por 1 minuto em tubo de microcentrífuga de 2 mL, depois foi descartado e foram

adicionados 500μL de tampão AW1 (QIAGEN®

), e foi feita eluição por centrifugação a 8.000

rpm por um minuto. Em seguida, foram colocados 500μL de tampão AW2 (QIAGEN®

), com

centrifugação a 14.000 rpm por três minutos.

Por último, adicionaram-se 200μL de tampão AE, centrifugando a 8.000 rpm por

um minuto e repetindo essa última lavagem para uma eficaz extração do material genético.

Após a extração do DNA, as amostras foram estocadas em freezer a -20ºC até o seu

processamento.

42

3.7 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

O DNA do H. pylori extraído das biópsias gástricas foi utilizado para a

amplificação dos genótipos de interesse nesse estudo, a partir das sequências de nucleotídeos

(primers) específicos, previamente descritos na literatura. A solução “Master mix” para

amplificação do DNA, continha: 12,5μL da enzima Taq-DNA polimerase GoTaq green -

Promega®

; 1,0μL dos “primers” específicos para cada gene a ser estudado, partindo da

terminação 5’ para a 3’, em ambos os sentidos (senso e antisenso). Em cada microtubo, foram

acrescentados 5,0μL do DNA extraído em microtubos específicos de 200μL. As reações

ocorreram separadas para cada gene. A Tabela 2 indica os primers que foram utilizados para

cada marcador.

Tabela 2: Primers usados na amplificação dos genótipos estudados

Primer Sequência (5' - 3') Pares de base Referência

cagM – F ACAAATACAAAAAAGAAAAAGAGGC 586 Kidd et al., 2001

cagM – R ATTTTTCAACAAGTTAGAAAAAGCC

tnpA – F ATCAGTCCAAAAAGTTTTTTCTTTCC

344 Kidd et al., 2001 tnpA – R TAAGGGGGTATATTTCAACCAACCG

tnpB –F CGCTCTCCCTAAATTCAAAGAGGGC 569 Kidd et al., 2001

tnpB –R AGCTAGGGAAAAATCTGTCTATGCC

Fonte: Elaborada pelo autor

A amplificação do DNA extraído foi realizada em termociclador (My Cylcler –

Bio-Rad, CA.-USA®), obedecendo ao protocolo de ciclos específicos para cada gene

estudado, conforme Tabela 3.

Após a amplificação de cada gene, procedeu-se à corrida eletroforética em géis de

agarose a 2%, corado com brometo de Etídio, para visualização dos marcadores genéticos do

H. pylori. Foi utilizado tampão Tris Acetato EDTA (TAE) como veículo líquido para a

corrida dos géis. A eletroforese ocorreu nas seguintes condições: 100 volts, 400 miliamperes

por 40 minutos.

Os géis foram processados em aparelho transluminador com câmara eletrônica de

ultravioleta para evidenciação dos pares de bases, estabelecendo assim, o resultado positivo

ou negativo para os marcadores genéticos estudados, a partir da presença ou ausência das

bandas de nucleotídeos pertencentes a esses genes.

43

Foi estabelecido o controle da qualidade dos géis corridos, para monitorar

possíveis contaminações, pela presença de controle positivo e controle negativo para cada

marcador genético estudado. Os pesos moleculares dos pares de base foram aferidos por

padrão de bandas de DNA (DNA Ladder), adicionado aos géis.

Tabela 3: Ciclos de amplificação para cada gene

Gene Desnaturação

inicial Desnaturação/ Anelamento/ Extensão Extensão Final Referência

cagM, tnpB 5min – 94ºC (30s - 94˚C/ 30s - 52˚C/ 30s - 72˚C) 40x 10min - 72˚C Kidd et al., 2001

tnpA 5min – 94ºC (30s - 94˚C/ 30s - 55˚C/ 30s - 72˚C) 40x 10min - 72˚C Kidd et al., 2001


Legenda: min – Minutos; s – Segundos; ºC – graus celsos.

3.8 Análise Estatística

Foi utilizado o software SPSS for Windows, versão 16.0; SPSS Inc., Chicago,

Illinois. Os resultados foram analisados através do teste exato de Fisher; do teste do qui-

quadrado de Pearson e realizada análise estatística com regressão logística por multivariada.

O nível de significância considerado foi p ≤ 0.05. O risco foi estimado utilizando-se Odds

Ratio (OR) e o intervalo de confiança de 95%.

44

4 RESULTADOS

4.1 Caracterização da amostra estudada

Foram analisadas 147 amostras de biópsia gástrica de pacientes infectados por H.

pylori atendidos no Hospital Universitário Walter Cantídeo. Sendo, 50 portadores de gastrites,

51 portadores de úlcera péptica e 46 com câncer gástrico. Do total de pacientes, 72 (49,0%)

eram do gênero masculino e 75 (51,0%) do gênero feminino (Gráfico 1).

Gráfico 1: Distribuição dos pacientes em função do gênero

72 (49,0%)

75 (51,0%)

Masculino Feminino

Fonte: Elaborado pelo autor

A idade dos pacientes estudados no geral variou de 17 a 85 anos, com média de

54,18 + 14,24 anos. O grupo foi dividido em duas faixas etárias, menor igual e maior de 45

anos, onde 40/147 (27,2%) eram do grupo menor igual a 45 anos e 107/147 (72,8%) do grupo

maior que 45 anos (Gráfico 2).

No presente estudo, houve 50 pacientes com gastrite, os quais apresentaram

achados endoscópicos em que: 39 (78,0%) eram portadores de gastrite antral, 7 (14,0%)

tinham gastrite corpal e 4 (8,0%) tinham pangastrite. Foi encontrado que 20/50 (40,0%) eram

homens e 30/50 (60,0%) eram mulheres. A idade variou de 17 a 75 anos, com média de 49,3 +

14,3 anos. Não houve nenhuma relação estatística significante entre a presença de gastrite

com o gênero (p = 0,163) nem com a idade dos pacientes (p = 0,434).

45

Gráfico 2: Distribuição dos pacientes em função da faixa etária


O grupo dos portadores de úlcera péptica foi constituído por 51 pacientes, os quais

37/51 (72,5%) possuíam úlcera duodenal e 14/51 (27,5%) portavam úlcera gástrica. Com

relação ao gênero, 25/51 (49,0%) eram homens e 26/51 (51,0%) eram mulheres. A idade

variou de 32 a 85 anos, com média de 54,5 + 12,8 anos. Não houve nenhuma relação

estatística significante entre a presença de úlcera péptica com o gênero (p = 1,000) nem com a

idade dos pacientes (p = 0,699).

Dos pacientes com câncer gástrico, 27/46 (58,7%) eram do gênero masculino e 19

(41,3%) do gênero feminino. A idade variou de 35 a 84 anos, com média de 59,1 + 14,2 anos.

Não houve nenhuma relação estatística significante entre a presença de câncer gástrico com o

gênero (p = 0,154) e com a idade dos pacientes (p = 0,230). A caracterização dos grupos dos

pacientes estudados com relação ao gênero e à idade estão na Tabela 4.

Tabela 4: Caracterização dos pacientes, por grupos, quanto ao gênero e a idade

Afecções Gástricas Masculino

n (%)

Feminino

n (%) valor de p

Média de Idade

(anos) valor de p

Gastrite (n = 50) 20 (40,0) 30 (60,0) 0,163

49,3 + 14,3

0,434

Antral (n = 39) 16 (41,0) 23 (59,0) 0,267 0,837

Corpal (n = 7) 4 (57,2) 3 (42,8) 0,715 0,390

Pangastrite (n = 4) 0 4 (100,0) 0,120 0,62

Úlcera péptica (n = 51) 25 (49,0) 26 (51,0) 1,000

54,5 + 12,8

0,699

Duodenal (n = 37) 15 (40,5) 22 (59,5) 0,259 0,285

Gástrica (n = 14) 10 (71,4) 4 (28,6) 0,96 0,352

Câncer Gástrico (n = 46) 27 (58,7) 19 (41,3) 0,154 58,1 + 14,2 0,230


46

4.2 Distribuição da expressão dos marcadores moleculares cag-PAI do H. pylori.

4.2.1. Distribuição dos marcadores por gênero.

A distribuição dos genótipos cag-PAI do H. pylori mais prevalentes no gênero

masculino foram: tnpA 30/72 (41,6%) e o cagM 11/72 (15,3%); vale salientar que não foi

encontrado nenhum gene tnpB neste grupo. Enquanto no gênero feminino a ordem dos genes

mais prevalentes foi: tnpA 40/75 (53,4%); cagM 8/75 (10,6%); tnpB 3/75 (4,0%). Não

havendo associação significativa entre a presença dos genes e os gêneros. (Gráfico 3)

Gráfico 3: Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com o gênero


Na Tabela 5, pode-se observar a mesma distribuição dos genótipos de acordo com

gênero, informando os valores de p para cada gene.

Tabela 5: Distribuição dos genótipos do H. pylori de

acordo com o gênero

Genes

Masculino

n = 72

Feminino

n = 75 p

n (%) n (%)

tnpA 30 (41,6) 40 (53,4) 0,187

cagM 11 (15,3) 8 (10,6) 0,466

tnpB 0 (0) 3 (4,0) 0,245


47

4.2.2. Distribuição dos marcadores por faixa etária

Os pacientes foram divididos em duas faixas etárias, os com idade menor igual e

maior de 45 anos. Nos pacientes com idade menor igual a 45 anos, os genes mais prevalentes

foram o tnpA 22/40 (55,0%), cagM 8/40 (20,0%) e tnpB 1/40 (2,5%). Nos pacientes com

idade maior que 45 anos, os genes mais prevalentes seguiram a mesma ordem: tnpA 42/107

(44,8%); cagM 11/107 (10,3%) e tnpB 2/107 (1,9%). Não houve associação significante entre

a presença dos genes com as faixas etárias dos pacientes. (Gráfico 4).

Gráfico 4: Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com a faixa etária


Na Tabela 6, pode-se observar a mesma distribuição dos genótipos de acordo com

a faixa etária, informando os valores de p para cada gene.

Tabela 6: Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo

com a faixa etária

Genes

≤ de 45 anos

n = 40

> de 45 anos

n = 107 p

n (%) n (%)

tnpA 22 (55,0) 42 (44,8) 0,354

cagM 8 (20,0) 11 (10,3) 0,165

tnpB 1 (2,5) 2 (1,9) 1,000


48

4.2.3 Distribuição dos marcadores por afecções gástricas

Com relação aos marcadores de virulência das cepas de H. pylori foi encontrado o

seguinte perfil nos 147 pacientes estudados: 70 (47,6%) cepas tnpA; 03 (2,0%) cepas tnpB; 19

(12,9%) cepas cagM.

No Gráfico 5, observa-se à distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com

as afecções estudadas nos 147 pacientes avaliados.

No grupo dos pacientes com gastrite o genótipo mais frequente foi o tnpA 29/50

(58,0%), seguido dos genes: cagM 4/50 (8,0%) e tnpB 2/50 (4,0%). Não houve nenhuma

associação de tais genes com a gastrite (p > 0,05).

Assim como na gastrite, no grupo dos pacientes com úlcera péptica os genótipos

mais frequentes também foram o tnpA 32/51 (62,7%) e o cagM 11/51 (21,6%); enquanto

nenhum tnpB foi encontrado. Houve associação estatística da úlcera duodenal com a presença

dos genes tnpA (p = 0,002; O.R: 3,54; 95% I.C: 1,59-7,90) e cagM (p = 0,024; O.R: 3,21;

95% I.C: 1,19-8,67).

No grupo dos pacientes com câncer gástrico, o genótipo mais frequente foi o tnpA

9/46 (19,6%); cagM 4/46 (8,7%) e tnpB 1/46 (1,2%). A presença do gene tnpA teve relação

inversa com o câncer gástrico (p = 0,001; O.R: 0,16; 95% I.C: 0,70-0,36); devido ao valor

encontrado de Oddis Ratio negativo.

Gráfico 5: Distribuição dos genótipos do H. pylori nas afecções estudadas

Legenda: * p < 0,05 (Estatisticamente significante)

Fonte: Elaborado pelo autor.

Na Tabela 7 pode-se observar a distribuição dos genótipos com a afecções

gástricas, informando os valores de p para cada gene.

49

Tabela 7: Prevalência dos genótipos cag-PAI do H. pylori de acordo com as afecções gástricas

Afecções Gástricas tnpA tnpB cagM

n (%) p n (%) p n (%) p

Gastrites (n = 50) 29 (58,0) 0,083 2 (4,0) 0,267 4 (8,0) 0,300

Antral (n = 39) 24 (61,5) 0,061 2 (5,1) 0,172 2 (5,1) 0,103

Corpal (n = 7) 4 (57,2) 0,709 0 (0,0) 1,000 2 (28,6) 0,224

Pangastrite (n = 4) 1 (25,0) 0,622 0 (0,0) 1,000 0 (0,0) 1,000

Úlcera Péptica (n = 51) 32 (62,7) 0,009 * 0 (0,0) 0,552 11 (21,6) 0,037 *

Duodenal (n = 37) 26 (70,3) 0,002 * 0 (0,0) 0,572 9 (24,3) 0,024 *

Gástrica (n = 14) 6 (42,8) 0,784 0 (0,0) 1,000 2 (14,3) 1,000

Câncer Gástrico (n = 46) 9 (19,6) 0,001 * 1 (1,2) 1,000 4 (8,7) 0,428

Legenda: * p < 0,05 (Estatisticamente significante)


Quando feito análise estatística, o gene tnpA demonstrou associação significativa

com a úlcera, em particular a úlcera duodenal nas análises não ajustadas (univariada) (p =

0,002; O.R: 3,545; 95% I.C: 1,591-7,903). Após análise multivariada, ajustando para gênero e

idade, o gene tnpA permaneceu demostrando associação significativa com a úlcera duodenal

(p = 0,004; O.R: 3,328; 95% I.C: 1,482-7,476), Tabela 8.

O gene cagM também apresentou associação significativa com a úlcera duodenal,

nas análises univariadas (p = 0,024; O.R: 3,214; 95% I.C: 1,190-8,679). Após análise

multivariada, ajustada para gênero e idade, o cagM continuou associado à úlcera duodenal (p

= 0,025; O.R: 3,215; 95% I.C: 1,158-8,922), Tabela 8.

Tabela 8: Análise Univarida e Mutivariada dos genótipos tnpA e cagM com as afecções gástricas

Afecção

gástrica

tnpA

Univariada Multivariada

Úlcera

duodenal

tnpA O.R 95% I.C p O.R 95% I.C p

26/37 3,545 1,591-7,903 0,002 3,328 1,482-7,476 0,004

cagM

Univariada Multivariada

Úlcera

duodenal

cagM O.R 95 % I.C p O.R 95 % I.C p

9/37 3,214 1,190-8,679 0,024 3,215 1,158-8,922 0,025


As figuras 1-3 ilustram alguns dos géis de agarose para os diversos marcadores

avaliados.

50

Figura 2: Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpA (344pb) nas amostras de câncer

gástrico.

Fonte: Arquivos do autor.

Da esquerda para a direita tem-se:

Poço 1: DNA Ladder 600pb Poço 6: tnpA positivo

Poço 2: Controle positivo Poço 7: tnpA positivo

Poço 3: tnpA positivo Poço 8: tnpA positivo

Poço 4: tnpA positivo Poço 9: tnpA positivo

Poço 5: tnpA positivo Poço 10: Controle negativo

Figura 3: Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpB (569pb) nas amostras de câncer

gástrico.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

600 500 400 300 200 100

600 500 400 300 200 100

51


Poço 1: DNA Ladder 600pb Poço 11: tnpB negativo

Poço 2: Controle positivo Poço 12: tnpB positivo

Poço 3: tnpB negativo Poço 13: tnpB negativo







Poço 10: tnpB negativo Poço 20: Controle negativo

Figura 4: Gel de agarose para visualização das bandas do gene cagM (586pb) nas amostras de úlcera

gástrica.



Poço 1: DNA Ladder 600pb Poço 11: cagM negativo

Poço 2: Controle positivo Poço 12: cagM negativo

Poço 3: cagM negativo Poço 13: cagM negativo


Poço 5: cagM negativo Poço 15: cagM positivo



Poço 8: cagM positivo Poço 18: cagM negativo

Poço 9: cagM positivo Poço 19: cagM negativo

Poço 10: cagM negativo Poço 20: Controle negativo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

600 500 400 300 200 100

52

4.3 Associação de tnpA com os demais genótipos estudados

Foi analisado quais amostras eram tnpA positivas e também positivas para os

demais genes do presente estudo. A análise do teste do qui-quadrado de Pearson, buscou

observar se houve alguma correlação da presença de um gene com os outros; e desta forma,

não foi encontrado nenhuma associação significante da presença do tnpA com os demais

genes. Como visto na Tabela 8.

Tabela 9: Associação de tnpA com os demais genótipos estudados

Genes

tnpA (n = 70)

n p

tnpB 3 0,106

cagM 10 0,806


53

5. DISCUSSÃO

O presente estudo buscou identificar os fatores de virulência tnpA, tnpB e cagM

da ilha cag-PAI das cepas de Helicobacter pylori em amostras circulantes na cidade de

Fortaleza - Ceará, no nordeste brasileiro. Tais genes são importantes no sistema de secreção

do tipo IV da bactéria e os mesmos estão associados às diversas afecções gástricas, segundo a

literatura científica mundial (MATTAR et al., 2007; LAI et al., 2013; ABADI et al., 2014).

Foi estudado o perfil genotípico de 147 cepas de H. pylori, as quais foram

oriundas de 50 pacientes portadores de gastrite, 51 portadores de úlcera péptica e 46

portadores de câncer gástrico atendidos no Hospital Universitário Walter Cantídio – UFC.

Foi observado que o desenvolvimento das afecções gástricas mais graves esteve

acompanhado de um aumento de idade dos pacientes; onde a média de idade dos pacientes

com gastrite foi de 49,3 anos, enquanto que os pacientes do grupo de úlcera péptica e câncer

gástrico foi de 54,5 e 58,1 anos, respectivamente. Neste estudo, os pacientes portadores de

câncer gástrico apresentaram uma maior prevalência do gênero masculino (27/46; 58,7%) e de

idade mais avançada, média de 58,1 anos. Este perfil está de acordo com os trabalhos da

literatura científica mundial, a qual relata que a prevalência de câncer gástrico é cerca de duas

vezes maior entre os homens do que entre as mulheres e mais frequente na faixa etária de 50-

70 anos (BRENNER, ROTHENBACHER, ARNDT, 2009; JAMAL et al., 2011; SEKER et al.,

2013).

Apesar de descrito a mais de 20 anos, são poucos os estudos de prevalência dos

genes tnpA, tnpB, cagM; o mecanismo dos genes no desenvolvimento das afecções gástricas e

as correlações com tais afecções ao redor do mundo (CENSINI et al., 1996; ABADI et al.,

2014).

No presente estudo, o gene tnpA teve maior frequência nas amostras de úlceras

pépticas; em especial nas úlceras duodenais 26/37 (70,3%) (p = 0,002; O.R: 3,54; 95% I.C:

1,59-7,90). Desta forma, na população estudada, a presença de tal gene confere um risco de

3,5 vezes maior de desenvolver a úlcera duodenal. Enquanto que no grupo da gastrite, a

frequência do gene tnpA foi de 58,0% (29/50), mas sem nenhuma associação significativa

com tal afecção gástrica.

Mattar et al. (2007) realizou um trabalho pioneiro ao investigar os genes tnpA e

tnpB no Brasil. Na ocasião, a autora comparou 150 pacientes portadores de úlceras pépticas

com 65 pacientes dispépticos na cidade de São Paulo. Foi encontrado a presença de tnpA em

70,0% dos pacientes com úlcera péptica; a qual houve diferença significativa com o grupo

54

controle (p < 0,01). Desta forma, os achados do presente estudo estão de acordo com os de

Mattar et al. (2007) para a úlcera péptica, mesmo em regiões diferentes do país. Tendo em

vista que 32/51 (62,7%) das cepas deste estudo são portadoras do gene tnpA e esteve

associado com a úlcera péptica (p = 0,009; O.R: 2,57; 95% I.C: 1,277-5,175).

A frequência do gene tnpA nos pacientes com câncer gástrico foi de apenas 9/46

(19,6%). Na análise estatística, encontrou-se uma relação inversa significante entre a presença

do gene e o câncer gástrico (p = 0,001; O.R: 0,16; 95% I.C: 0,70-0,36). Desta forma, na

amostra de Fortaleza, o gene tnpA não está associado ao desenvolvimento do câncer gástrico;

sugerindo que a presença de tal gene seja um fator protetor para esta população.

A associação do gene tnpA e o câncer gástrico também é descrita em outras

localidades. Estudando pacientes com gastrite e com câncer gástrico no Perú, Kersulyte et al.

(2002) relatou a presença do gene tnpA em 15/45 (33,3%) e 9/14 (64,3%) dos pacientes,

respectivamente. Havendo associação significativa do gene com a afecção (p = 0,04).

Entretanto, tal estudo possui um número muito pequeno de amostras (n = 14) o que pode

gerar incertezas quanto ao dado.

Em 2010 na cidade de São Paulo, Mattar et al. (2010) encontrou outros resultados

para a presença do gene tnpA. A autora comparou 34 pacientes com câncer gástrico com 34

pacientes dispépticos; encontrando a presença do gene em 25/34 (73,5%) no grupo com

câncer, com associação significativa (p < 0,0001). No entanto, são resultados inconclusivos

por se tratar de amostras muito pequenas; necessitando de estudos futuros e de maior

amostragem para determinar o real papel do gene na carcinogênese gástrica.

Abadi et al. (2014), analisou 360 pacientes contaminados com o H. pylori no Iran.

95 pacientes com gastrite, 200 com úlceras e 65 com câncer gástrico. Encontrou 39/65 (60,0%)

cepas tnpA positivas nos pacientes com câncer gástrico, com risco relativo de 1,45 (95% I.C:

1,04-1,93). Tal estudo foi o de maior proporção devido ao seu grande número de amostras;

sugerindo uma forte correlação da presença do tnpA com o desenvolvimento do câncer

gástrico.

O presente estudo obteve apenas 03 cepas portadoras do gene tnpB dentre as 147

amostras estudadas. As quais 2/50 (4,0%) tnpB positivas no grupo dos pacientes com gastrite

e 1/46 (1,2%) tnpB positivas no grupo com câncer. Não foi encontrada nenhuma relação

significativa do gene tnpB com nenhuma outra variável (gênero, idade, afecções gástricas e

outros genes).

Assim como os achados deste estudo, outros trabalhos também não encontraram

nenhuma correlação do gene tnpB com alguma afecção gástrica. Abadi et al. (2014) também

55

relata que a maior porcentagem do tnpB também foi no grupo dos pacientes com gastrite,

16/95 (16,8%); mas sem nenhuma relação significante.

Mattar et al. (2007) obteve 24/150 (16,0%) cepas tnpB positivas em pacientes

com úlcera péptica e 5/65 (7,7%) tnpB positivas em dispépticos. Mesmo com um número

maior de achados, não obteve associação estatística entre o gene e as afecções gástricas (p =

0,129). Em outro estudo, Mattar et al. (2010) obteve 2/34 (5,9%) cepas tnpB positivas em

pacientes com câncer gástrico (p = 0,551); reforçando a falta de relação do gene com as

doenças gástricas. Desta forma, os dados encontrados em Fortaleza estão em consonância

com os dados de outras localidades, relacionados à baixa expressividade do gene tnpB.

Em relação ao outro gene da ilha cag-PAI, a frequência do gene cagM no presente

estudo foi maior e significante nas amostras de úlceras pépticas (11/51; 21,6%; p = 0,037;

O.R: 3,025; 95% I.C: 1,130-8,096); em especial nas úlceras duodenais 9/37 (24,3%) (p =

0,024; O.R: 3,21; 95% I.C: 1,19-8,67). Dados estes de acordo com Mattar et al. (2007) que

encontrou 117/150 (78,0%) cepas cagM positivas em úlceras pépticas (p < 0,01). A autora

afirma que o cagM está associado com o risco de 8 vezes do desenvolvimento de úlceras

pépticas nos pacientes infectados com cepas portadores deste gene; podendo ser considerado

um marcador genético para identificar indivíduos com altos riscos de desenvolver úlceras

pépticas no Brasil. Da mesma forma, o presente estudo encontrou um risco de 3,2 vezes de

desenvolver úlceras duodenais e 3,0 vezes de úlceras pépticas quando infectadas com cepas

cagM positivas em Fortaleza.

Na população chinesa, o gene cagM apresenta uma frequência muito maior,

variando de 90 a 100% (93,8% na gastrite; 100,0% úlcera duodenal; 96,8% úlcera gástrica e

95,0% no câncer gástrico). Porém, não foi encontrada nenhuma correlação da presença do

cagM com as afecções gástricas (LAI et al., 2013).

Há poucos estudos que analisam a presença dos genes tnpA, tnpB, cagM com os

desfechos clínicos causados pela infecção de cepas portadoras de tais genes. Desta forma, faz-

se necessários mais estudos em diversas populações para melhor entender a relação desses

genes com as afecções gástricas. É necessário que os estudos deste grupo de pesquisa sobre o

H. pylori na região Nordeste possa expandir-se ainda mais em abrangência e variedade. Desta

forma, agregar mais conhecimentos e informações sobre o perfil genético das cepas

circulantes na região. Além de se reafirmar como um centro de referência em tais estudos e

alicerçar o processo de tomada de decisão no desenvolvimento de políticas públicas de saúde

na prevenção, diagnóstico e tratamento do Helicobacter pylori.

56

6. CONCLUSÃO

O presente estudo obteve como perfil genotípico das cepas de H. pylori na

amostra estudada de Fortaleza as seguintes frequências: 47,6% de cepas tnpA; 2,0% de tnpB;

12,9% de cagM. O gene tnpA foi o mais presente no gênero masculino e de maior prevalência

nas duas faixas etária estudada; no entanto, não se observou associação estatística do gene

com tais variáveis. O gene tnpA apresentou uma associação negativa com o câncer gástrico;

enquanto apresentou associação significativa com a úlcera duodenal. O gene tnpB foi o de

menor prevalência e, consequentemente, não apresentou associação com nenhuma variável

(gênero, idade, afecções gástricas e outros genes). O gene cagM foi o segundo mais

prevalente em todas as afecções gástricas; e assim como o tnpA, apresentaram associação

significativa com úlcera duodenal. Concluiu-se que os genes tnpA, cagM estão associados ao

risco maior de 3,5 e 3,2 vezes, respectivamente de desenvolver úlceras pépticas; sugerindo

tais genes como bons marcadores genéticos para a úlcera péptica nas amostras coletadas na

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69

APÊNDICE A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título: Estudo clínico, epidemiológico e caracterização dos genótipos do H. pylori no Ceará.

Introdução: Você (ou seu filho) está sendo convidado a participar de uma pesquisa. Sua

participação é importante, portanto é fundamental que você compreenda as explicações sobre

os procedimentos propostos. Esta declaração esclarece o objetivo, procedimentos, benefícios,

riscos, desconfortos, precauções do estudo e o seu direito de desistir do estudo a qualquer

momento.

Resumo: O H. pylori é uma bactéria que causa gastrite e úlcera péptica e atualmente existem

fortes evidências de que a infecção é adquirida na infância. Como a infecção pelo H. pylori

acomete cerca de 50% das crianças, é muito importante esclarecer os aspectos relacionados

com a transmissão da infecção e determinação dos fatores envolvidos na aquisição da bactéria.

Objetivo: Esse trabalho tem como objetivo avaliar a infecção e os tipos de cepas de

Helicobacter pylori, através do Teste Respiratório e do Enteroteste (deglutição de uma

cápsula contendo um fio de algodão).

Procedimento: Você irá responder a um questionário. Será realizado o Teste Respiratório,

onde você irá soprar em um balão, em seguida tomará 200ml de suco de laranja contendo uma

substância, ureia marcada com C13

, que não é radioativo, podendo ser utilizado por qualquer

pessoa, inclusive crianças e gestantes. Após 30 minutos, você soprará outro balão. Outro teste

que será realizado é o Enteroteste, onde você irá deglutir uma cápsula, que contém um fio de

algodão estéril medindo 90cm de comprimento e 05mm de largura (semelhante a uma linha

que se usa para fazer trabalhos manuais de crochê). Uma pequena porção ficará para fora da

boca e fixada à bochecha com uma fita adesiva. A cápsula será deglutida com um copo de

água (200ml) e, após 01 hora, o fio será removido. Ambos os testes necessitam de pelo menos

08 horas de jejum prévio. Serão incluídos nesse estudo aqueles que aceitarem participar

voluntariamente do estudo e concordarem em realizar os testes. E será excluído do estudo

aquele que não aceitar, ou não conseguir realizar o teste.

Riscos: Esse método é confiável e não apresenta riscos, apenas causa um leve desconforto

pela sensação de um fio na garganta.

Benefícios: A sua participação será muito importante para o conhecimento da infecção pelo

Helicobacter pylori e poderá contribuir no futuro para melhoria do controle da infecção em

nosso país.

Confidencialidade: Os seus resultados serão mantidos em sigilo. Qualquer publicação dos

dados não identificará o participante.

Desligamento: Poderá se afastar a qualquer momento do estudo sem prejuízo para sua saúde.

Contato com o pesquisador: Dra. Lúcia Libanez B. C. Braga pode ser feito pelos telefones 85

33668444 ou 8865-2042. Caso tenha alguma dúvida sobre os seus direitos como paciente de

pesquisa, você deverá ligar para o Comitê de Ética em Pesquisa da UFC no número 85

33668338.

Consentimento: Li e entendi as informações acima. E estou ciente de que não haverá nenhum

pagamento pela participação no estudo. Tive oportunidade de fazer perguntas e todas as

minhas dúvidas forma respondidas. Este formulário está sendo assinado voluntariamente por

mim, indicando o meu consentimento para que meu filho participe do estudo, até que eu

decida o contrário. Receberei uma cópia assinada deste consentimento.

70

Nome do participante Assinatura

_______________________________ ______________________________

Nome do Responsável Assinatura

_______________________________ ______________________________

Nome do Pesquisador Assinatura

_______________________________ ______________________________

Nome de quem obteve o TCLE Assinatura

_______________________________ ______________________________

71

ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · Gonzaguinha. RESUMO Estudo dos marcadores de...

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