UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE...

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  • 2

    UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

    CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS

    PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS

    HENRIQUE JORDEM VENIAL

    AVALIAO DO PERFIL RENAL EM RATOS (Rattus norvegicus) TRATADOS

    COM GLICOCORTICOIDES

    ALEGRE-ES

    2013

  • 3

    HENRIQUE JORDEM VENIAL

    AVALIAO DO PERFIL RENAL EM RATOS (Rattus norvegicus) TRATADOS

    COM GLICOCORTICOIDES

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo, como requisito parcial para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias Veterinrias, linha de pesquisa em Diagnstico e teraputica de enfermidades clnico-cirrgicas. Orientador(a): Profa. Dra. Lenir Cardoso Porfrio

    ALEGRE-ES

    2013

  • 4

    HENRIQUE JORDEM VENIAL

    AVALIAO DO PERFIL RENAL EM RATOS (Rattus norvegicus) TRATADOS

    COM GLICOCORTICOIDES

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo, como requisito parcial para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias Veterinrias, linha de pesquisa em Diagnstico e teraputica de enfermidades clnico-cirrgicas.

    Aprovado em_____de_____________ de 2013.

    COMISSO EXAMINADORA

    _________________________________________

    Prof. Dr. Lenir Cardoso Porfrio Universidade Federal do Esprito Santo

    Orientadora

    _________________________________________

    Prof. Dr. Karina Preising Aptekmann Universidade Federal do Esprito Santo

    _________________________________________

    Prof. Dr. Mariana Drummond Costa Ignacchiti Universidade Federal do Esprito Santo

  • 5

    Aos meus pais, Joo Batista e Eliane, por estarem sempre ao meu lado, fazendo com que eu seguisse em frente e a minha esposa, Mariana por todo apoio nos momentos difceis.

  • 6

    AGRADECIMENTOS

    Agradeo em primeiro lugar a Deus, pela oportunidade da vida e pelas

    conquistas at aqui;

    Aos meus pais e familiares que acreditaram e torceram sempre por mim, por

    estarem comigo nos momentos difceis;

    A minha esposa Mariana C. A. Venial pelo companheirismo, pelas sbias

    palavras em momentos de indeciso e angstia;

    A professora orientadora Dr Lenir Cardoso Porfrio pela oportunidade de

    amadurecimento cientfico e orientao;

    Ao mdico veterinrio Paulo Srgio da Cruz Andrade Jnior, por todo apoio

    nas coletas dos matrias para exame, pelos conselhos e ensinamentos;

    A Dra. Karina Preising Aptekmann e a Dra. Mariana Drummond Costa

    Ignacchiti pela participao na banca de qualificao e de defesa do mestrado;

    Ao bilogo e tcnico responsvel pelo laboratrio de anlises clnicas do

    HOVET-UFES Jorge Pinto da Silva Filho, por todo empenho e ajuda nas anlises

    dos exames laboratoriais.

    Aos funcionrios (Vigias) do HOVET-UFES pelo apoio durante os testes com

    os ratos, sempre se preocupando em ajudar no andamento do projeto.

    As amigas Mdicas Veterinrias Dyeime e Mirleide pela ajuda na coleta de

    material e confeco dos exames.

    Aos colegas do mestrado pela amizade, por estarem sempre presentes;

    A Universidade Federal do Esprito Santo, pelo acolhimento;

    A CAPES pelo concedimento da bolsa;

    A todas as pessoas que de forma direta ou indireta contriburam para meu

    crescimento e me ajudaram nessa conquista, um muito obrigado.

  • 7

    Suba o Primeiro degrau com f. No necessrio que voc veja toda a escada. Apenas d o primeiro passo.

    (Martin Luther King).

  • 8

    RESUMO

    VENIAL, HENRIQUE JORDEM. Avaliao do perfil renal em ratos (Rattus norvegicus) tratados com glicocorticoides. 2013. 49p. Dissertao (Mestrado em

    Cincias Veterinrias) Centro de Cincias Agrrias, Universidade Federal do Esprito Santo, Alegre, ES, 2013.

    Os glicocorticoides representam um grupo de frmacos utilizados para o tratamento

    de diversos sinais clnicos e enfermidades pela sua ao anti-inflamatria e

    imunossupressora. O uso prolongado pode induzir desequilbrios hidroeletrolticos

    devido reteno de fluidos e alteraes laboratoriais a nvel renal. Objetiva-se com

    este trabalho avaliar a atividade enzimtica da gama-glutamiltransferase (gGT),

    creatinina, protena e relao protena/creatinina urinria; ureia e creatinina srica

    para comparar os tratamentos com glicocorticoides em ratos. Para isso, foram

    coletadas amostras de sangue e urina de 21 animais, Rattus norvegicus linhagem

    Wistar, sem alteraes clnicas ou laboratoriais. Os animais foram divididos em 3

    grupos de sete ratos, o grupo 1 (G1), grupo 2 (G2) e grupo 3 (G3). Todos os animais

    do grupo G1 receberam 50,0 mg/kg de succinato de hidrocortisona. Os animais do

    G2 receberam 2,0 mg/kg de metilprednisolona e os animais do G3 receberam 1,0

    mg/kg de dexametasona, a cada 24h, por via intramuscular, durante 7 dias. O

    experimento foi dividido em dois momentos, sendo o momento inicial (M1) antes do

    uso dos frmacos e o momento 2 (M2) aps o final de 7 dias. Para a avaliao

    clnico-laboratorial as amostras de sangue e urina dos animais foram coletadas nos

    dois momentos M1 e M2 para realizao de exames hematolgicos, bioqumicos e

    urinlise. O tratamento com glicocorticoides ocasionou aumento da creatinina srica

    nos grupos tratados. Entretanto, no se pode afirmar que houve leso renal nos

    ratos tratados, visto que os marcadores Pu/Cu, atividade enzimtica da gGT urinria,

    urinlise e ureia srica no sofreram alteraes. No h diferena entre os grupos

    de ratos tratados com os glicocorticoides de curta, mdia e longa durao em doses

    imunossupressoras, por via intramuscular, pelo perodo de 7 dias.

    Palavras-chave: Rins, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Dexametasona.

  • 9

    ABSTRACT

    VENIAL, HENRIQUE JORDEM. Evaluation of renal profile in rats (Rattus norvegicus) treated with glucocorticoids. 2013. 49p. Dissertao (Mestrado em Cincias Veterinrias) Centro de Cincias Agrrias, Universidade Federal do Esprito Santo, Alegre, ES, 2013.

    The glucocorticoids are a group of drugs used for the treatment of various diseases

    and clinical signs for its anti-inflammatory and immunosuppressive action. Prolonged

    use may induce electrolyte imbalances due to fluid retention and laboratory

    abnormalities in the kidney. The objective of this study was to evaluate the enzymatic

    activity of gamma-glutamyltransferase (GGT), creatinine, protein and

    protein/creatinine ratio in urine, urea and creatinine in the serum to compare

    treatments with glucocorticoids in rats. For this, were collected blood samples and urine samples from 21 animals, Rattus norvegicus, Wistar lineage, without clinical or

    laboratory changes. The animals were divided into three groups of seven rats, group

    1 (G1), group 2 (G2) and group 3 (G3). All animals in the G1 received 50,0 mg/kg of

    hydrocortisone succinate. The animals of group 2 received 2,0 mg/kg

    methylprednisolone and G3 animals received 1,0 mg/kg of dexamethasone, every 24

    hours, intramuscularly, for 7 days. The experiment was divided into two moments,

    with the initial moment (M1) before using of drugs and moment 2 (M2) after the end

    of seven days. For the clinical and laboratory evaluation, samples of blood and urine

    of the animals were collected in two moments M1 and M2 to perform hematological,

    biochemical and urinalysis. The treatment with glucocorticoids caused an increase in

    serum creatinine in the treated groups. However, one can not say that there was

    renal injury in rats treated since the markers Pu/Cu, enzymatic activity of urinary

    gGT, urinalysis and serum urea remained unchanged. There is no difference

    between the groups of rats treated with glucocorticoids of short, medium and long

    term in immunosuppressive doses, intramuscularly, for a period of 7 days.

    Keywords: Kidneys, Hydrocortisone, Methylprednisolone, Dexamethasone.

  • 10

    LISTA DE TABELAS

    Tabela Pgina

    Tabela 1- Mdia D.P. dos parmetros hematolgicos e plaquetas de ratos

    hgidos antes de serem submetidos a tratamento com succinato

    de hidrocortisona (G1), metilprednisolona (G2) e dexametasona

    (G3), pelo perodo de sete dias.........................................................

    49

    Tabela 2- Valores mdios D.P. de ureia e creatinina srica de ratos antes

    e aps tratamento com succinato de hidrocortisona (G1),

    metilprednisolona (G2) e dexametasona (G3), pelo perodo de

    sete dias..........................................................................................

    40

    Tabela 3- Valores mdios D.P. da atividade da enzima gama

    glutamiltransferase, creatinina e protena urinria, e relao

    (Pu/Cu) de ratos antes (M1) e aps (M2) tratamento com

    succinato de hidrocortisona (G1), metilprednisolona (G2) e

    dexametasona (G3), pelo perodo de sete dias..............................

    41

    Tabela 4- Valores obtidos na urinlise de ratos antes e aps tratamento

    com succinato de hidrocortisona (G1), metilprednisolona (G2) e

    dexametasona (G3) pelo perodo de sete dias...............................

    43

    Tabela 5- Valores mdios D.P. da ureia srica, creatinina srica e

    urinria, atividade da gGT urinria, protena urinria e relao

    protena/creatinina urinria (Pu/Cu) aps tratamento com

    succinato de hidrocortisona (G1), metilprednisolona (G2) e

    dexametasona (G3), pelo perodo de sete dias..............................

    44

  • 11

    SUMRIO

    Pgina 1 INTRODUO............................................................................................ 12

    2 REVISO DE LITERATURA...................................................................... 14

    2.1 Glicocorticoides..................................................................................... 14

    2.1.1 Parmetros farmacocinticos e farmacodinmicos.............................. 15

    2.1.2 Mecanismos de Ao............................................................................ 16

    2.1.3 Efeitos adversos dos glicocorticoides................................................... 18

    2.2 Insuficincia Renal................................................................................ 19

    2.2.1 Gama-glutamiltransferase (gGT) urinria............................................. 20

    2.2.2 Azotemia............................................................................................... 21

    2.2.3 Proteinria............................................................................................. 23

    2.2.4 Relao Protena/Creatinina urinria (Pu/Cu)...................................... 24

    2.2.5 Urinlise................................................................................................ 25

    3 REFERNCIAS.......................................................................................... 26

    CAPTULO 1 Avaliao do perfil renal em ratos (Rattus norvegicus)

    tratados com glicocorticoides....................................................................

    31

    RESUMO....................................................................................................... 32

    ABSTRACT................................................................................................... 33

    4 INTRODUO............................................................................................ 34

    5 MATERIAL E MTODOS........................................................................... 36

    5.1 Seleo do Animais............................................................................... 36

    5.2 Formao dos Grupos........................................................................... 36

    5.3 Coleta de Sangue e Urina...................................................................... 37

    5.4 Hemograma............................................................................................ 37

    5.5 Bioqumica Srica e Urinria................................................................ 37

    5.6 Urinlise.................................................................................................. 38

    5.7 Relao Protena/Creatinina urinria (Pu/Cu)..................................... 39

    5.8 Eutansia dos animais.......................................................................... 39

    5.9 Anlise estatstica.................................................................................. 39

    6 RESULTADOS E DISCUSSO................................................................. 40

    7 CONCLUSO............................................................................................ 45

    8 REFERNCIAS.......................................................................................... 46

    ANEXO........................................................................................................... 49

  • 12

    1. INTRODUO

    Desde sua introduo na prtica clnica, os glicocorticoides ou

    corticosteroides so amplamente utilizados no tratamento de grande variedade de

    doenas sendo alguns dos mais potentes agentes anti-inflamatrios conhecidos.

    Seu uso reduziu consideravelmente a morbimortalidade de animais portadores de

    enfermidades graves, como doenas autoimunes, processos alrgicos, insuficincia

    adrenal, hiperplasia adrenal congnita, entre outras (HOCHBERG, PACAK,

    CHROUSOS, 2003).

    No entanto, a utilizao prolongada de glicocorticoide pode desencadear

    desordem da adrenal, e resultar no hiperadrenocorticismo iatrognico (NELSON e

    COUTO, 2006). Os corticosteroides tambm podem induzir desequilbrios

    hidroeletrolticos por reteno de fluido causado pelo seu efeito mineralocorticoide

    (SCHERK; CENTER, 2005; ANDRADE, 2002; MACDONALD, 2004; COHN, 2006;

    PLOYNGAM et al., 2006).

    Os corticosteroides so sintetizados pelo crtex das glndulas adrenais e

    classificados em: glicocorticoides, mineralocorticoides e andrognios. Os

    glicocorticoides atuam no metabolismo dos carboidratos e provocam acrscimo das

    reservas de glicognio. No metabolismo proteico aumentam o catabolismo e inibem

    o anabolismo, enquanto no metabolismo lipdico aumentam o catabolismo

    (SPINOSA et al., 2002).

    Os glicocorticoides podem aumentar a presso sangunea por meio do

    aumento da concentrao de sdio-potssio adenosina trifosfato na membrana

    celular, podendo aumentar a concentrao de sdio extracelular e

    consequentemente expandir o volume plasmtico (ORTEGA et al., 1996; BROWN,

    2005). Alm disso, os glicocorticoides induzem a produo heptica de

    angiotensinognio, resultando em uma resposta exagerada do sistema renina-

    angiotensina-aldosterona (DUKES, 1992; ACIERNO; LABATO, 2004).

    A elevao da presso arterial renal pode provocar uma degenerao tubular

    e fibrose intersticial, enquanto a hipertenso glomerular resulta em

    glomeruloesclerose, atrofia glomerular e glomerulite proliferativa. Juntas, essas

  • 13

    mudanas esto associadas com hiperfiltrao glomerular e progresso dos danos

    tubulares e glomerulares. O resultado final a piora da hipertenso e,

    eventualmente, falncia renal (ACIERNO; LABATO, 2004). Os corticoides podem

    induzir a hipertenso glomerular pelo aumento do fluxo sanguneo glomerular,

    dilatao das arterolas renais e aumento da taxa de filtrao glomerular dos nfrons

    (ORTEGA et al., 1996).

    O mtodo rotineiramente usado para avaliar a funo renal a mensurao

    da concentrao plasmtica de substncias normalmente excretadas pelos rins. A

    avaliao dos nveis de ureia e creatinina so os testes mais comumente utilizados

    na rotina. Entretanto, a azotemia de origem renal s ocorre quando mais de 75% do

    parnquima renal perdido (SANTIN et al., 2006).

    Dentre outros achados laboratoriais que tambm auxiliam na caracterizao

    da disfuno renal, podemos citar a proteinria moderada a marcante, a qual

    detectada na urina por quantificao e/ou por fita reagente de imerso (GRECO et

    al., 1985). A relao de protena/creatinina (RPC) na urina um teste indicado para

    avaliao de leso aos glomrulos quando ainda no h evidncias clnicas ou at

    mesmo laboratoriais de patologia no sistema urinrio (LANIS et al., 2008).

    A enzimologia clnica de grande importncia diagnstica no que se refere s

    enzimas presentes no sangue e na urina (WESTHUYZEN et al., 2003). As enzimas

    urinrias so utilizadas para teste de deteco precoce de leso renal. Dentre essas,

    a gama glutamil transferase (gGT) urinria a mais facilmente testada (RAMBABU;

    PITTABIRAMAN, 1982; SODR et al., 2007).

    Objetiva-se com este trabalho avaliar a atividade enzimtica da gama-

    glutamiltransferase (gGT), creatinina, protena e relao protena/creatinina urinria;

    ureia e creatinina srica para comparar os tratamentos com glicocorticoides em

    ratos.

  • 14

    2. REVISO DE LITERATURA

    2.1 Glicocorticoides

    Os glicocorticoides ou corticosteroides so esterides lipoflicos derivados do

    colesterol, produzidos endogenamente nas glndulas suprarrenais, ou adrenais,

    possuindo inmeros efeitos benficos atuando sobre o metabolismo e homeostasia.

    Seus representantes endgenos so o cortisol e a cortiscoterona (LONGUI, 2007).

    Nas dcadas de 1930 e 1940 foram desenvolvidos estudos que permitiram

    reconhecer os efeitos dos hormnios adrenocorticais sobre o equilbrio de eletrlitos

    (mineralocorticoides) e sobre o metabolismo dos carboidratos (glicocorticoides)

    (GUYTON, HALL, 2006; SCHIMMER, PARKER, 2006).

    Em 1946, o cortisol foi sintetizado e, em 1948, utilizado pela primeira vez por

    Hench em paciente com artrite reumatoide. Logo a seguir, os efeitos colaterais

    desfavorveis foram reconhecidos, os quais adicionaram limites ao uso teraputico

    dos glicocorticoides. Na dcada de 1950, as modificaes da estrutura do cortisol

    resultaram em novos frmacos, como a prednisona e a prednisolona. Assim, as

    subsequentes modificaes estruturais dos esterides sintticos ampliaram a

    durao e a potncia do efeito glicocorticide, bem como propiciaram diferentes

    afinidades e tempo de ligao ao receptor glicocorticide (LONGUI, 2007).

    Os corticosteroides so classificados em: glicocorticoides, produzidos

    pela zona fasciculada da suprarrenal, os mineralocorticoides representados pela

    aldosterona, produzidos pela zona glomerulosa da suprarrenal, e os andrognios

    produzidos pela zona reticulosa. Todos participam ativamente no metabolismo de

    carboidratos, lipdios e protenas, e os mineralocorticoides (aldosterona), regulam o

    equilbrio hdrico e eletroltico (SCHIMMER, PARKER, 2006).

    A secreo do cortisol endgeno no organismo est sob o controle da

    corticotrofina ou hormnio adrenocorticotrfico (ACTH), secretado pela hipfise

    anterior, que, por sua vez, regulado por um hormnio hipotalmico, o fator

  • 15

    liberador de corticotrofina (CRH) (RHEN, CIDLOWSKI, 2005). Ambos, ACTH e CRH,

    so controlados pelo cortisol por meio do mecanismo de retroalimentao, ou seja,

    quanto maior a concentrao plasmtica do cortisol, menor ser a liberao de

    ACTH e CRH, e quanto menores os nveis sricos de cortisol, maior ser a secreo

    do ACTH e CRH (DAMIANI et al., 2001).

    2.1.1 Parmetros farmacocinticos e farmacodinmicos

    Os glicocorticoides podem ser classificados de acordo com sua meia-vida,

    sua potncia e durao de ao. A caracterizao de durao de ao, como curta,

    intermediria e longa, tem como base a durao da supresso do ACTH aps dose

    nica, com atividade anti-inflamatria equivalente a 50 mg de prednisona. So

    considerados glicocorticoides de ao curta a cortisona e a hidrocortisona, pois

    suprimem o ACTH por 8 a 12 horas; glicocorticoides de ao intermediria so a

    prednisona, a prednisolona, a metilprednisolona e a triancinolona, estas suprimem o

    ACTH por 12 a 36 horas; e os glicocorticoides de ao longa, representados pela

    dexametasona e betametasona, que promovem a supresso do ACTH por 36 a 72

    horas. A potncia dos glicocorticoides tambm avaliada pela sua afinidade aos

    receptores citoplasmticos. No Quadro 1 podem ser observadas caractersticas

    farmacolgicas dos principais glicocorticoides utilizados na prtica clnica (JACOBS,

    BIJLSMA, 2005; FARIA, LONGUI, 2006).

    Quando a terapia com glicocorticoide interrompida abruptamente, o eixo

    hipotalmico-pituitrio-adrenal (HPA) no responde eficientemente deficincia do

    hormnio corticotrfico (ACTH) podendo desencadear o hipoadrenocorticismo. O

    tempo necessrio para normalizar os nveis de glicocorticide no sangue depende

    do grau de atrofia dos componentes anatmicos do eixo HPA. Animais que tenham

    recebido tratamento por muitos meses, com altas doses dessas substncias, podem

    levar de seis a nove meses para restaurar a funo normal da adrenal (PINEDA,

    2003). Lien et al. (2006) reportam que a retirada gradual dos corticosteroides a

    forma mais recomendada para animais, o que pode minimizar os efeitos adversos.

  • 16

    Quadro 1- Caractersticas farmacolgicas dos principais corticoides em comparao

    com a hidrocortisona (cortisol).

    Glicocorticoides Potncia Relativa

    Meia vida plasmtica

    (minutos)

    Meia vida

    biolgica

    (horas)

    Anti-

    inflamatria

    Mineralo-

    corticoide

    Hidrocortisona 80-120 8 -12 1 1

    Prednisona 200 210 12 36 3,5 4,0 0.8

    Prednisolona 120 300 12 36 4,0 0.8

    Deflazacort 120 24 36 2,5 3,5 0.25

    Metilprednisolona 200 12 36 5,0 0.05

    Triancinolona 200 12 36 5,0 0

    Dexametasona 300 36 - 72 30 0

    Betametasona 300 36 - 72 30 0

    Fonte: JACOBS; BIJLSMA, (2005)

    2.1.2 Mecanismos de ao

    Em virtude da sua lipossolubilidade, os glicocorticoides so capazes de

    atravessar a membrana celular por difuso passiva e se ligarem aos receptores

    citoplasmticos, migrando para o ncleo e modificando sua expresso gnica

    (ADCOCK; ITO, 2000).

    So rapidamente absorvidos pelo trato gastrintestinal, membrana mucosa e

    pele. Aps alcanar a corrente sangunea, o glicocorticoide se liga a uma protena

    plasmtica especfica chamada Globulina Ligadora de Corticosteroides (CBG), e

    pelo processo de biotransformao heptico a maioria dos compostos sofre

    inativao, com exceo da cortisona e da prednisona, que passam a se tornar

    ativas aps a passagem pelo fgado (JACOBS; BIJLSMA, 2005).

  • 17

    Os glicocorticoides suprimem os processos inflamatrios por meio de diversos

    mecanismos. Eles se ligam a receptores glicocorticoides (GR) especficos no

    citoplasma da clula para formar complexos hormnios-receptores que,

    eventualmente, se deslocam para o ncleo da clula. No ncleo esses complexos se

    ligam a sequncias de DNA e alteram a expresso de genes. Os complexos

    hormnio-receptor podem induzir a transcrio de genes envolvidos na resposta

    inflamatria (KIM et al. 2004).

    A ao anti-inflamatria dos glicocorticoides deve-se, em grande parte,

    inibio da transcrio do gene da enzima cicloxigenase-2 (COX-2) e induo da

    protena lipocortina, inibidora da enzima fosfolipase A2 (ANDRADE, 2002; KIM et al.,

    2004; RANG et al., 2007). Alm disso, reduzem a produo de citocinas pr-

    inflamatrias, tais como TNF e IL-1 (KIM et al. 2004).

    As cicloxigenases so enzimas essenciais para a sntese de prostaglandinas

    a partir da liberao de cido araquidnico (AA) pelas fosfolipases da membrana

    celular. A oxidao e a reduo subsequente do AA so responsveis pela

    produo, respectivamente, de endoperoxidase (PGG2) e hidroxiendoperoxidase

    (PGH2). A PGH2 transformada por meio de mecanismos enzimticos e no

    enzimticos em prostanides primrios, prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina

    F2 (PGF2), prostaglandina D2 (PGD2), tromboxano B2 (TXB2), tromboxano A2

    (TXA2) e prostaciclinas (PENILDON, 2000).

    A sntese de prostanides ocorre de modo gradual, em etapas, por meio de

    um complexo de enzimas microssmicas, sendo que a primeira enzima dessa via

    sinttica a prostaglandina G/H endoperxido sintase (cicloxigenase), em duas

    isoformas distintas. A cicloxigenase 1 (COX-1) expressa de forma constitutiva na

    maioria das clulas, por outro lado, a COX-2 tem sua regulao incrementada por

    citocinas. A COX-2 a principal fonte dos prostanides formados na inflamao e no

    cncer (BRUNTON et al., 2007).

    De acordo com Penildon (2000), provvel que a COX-2 exera algum papel

    na fisiologia renal, de forma que a inibio dessa enzima poder acarretar disfuno

    orgnica dos rins.

  • 18

    2.1.3 Efeitos adversos dos glicocorticoides

    Dentre os efeitos adversos sistmicos da corticoterapia crnica, os mais

    relevantes so induo de diabetes mellitus, hipertenso, osteoporose, miopatias,

    predisposio a infeces, doena pptica, manifestaes psicolgicas, alteraes

    oculares, ganho de peso, sndrome de Cushing e sintomas de deficincia adrenal

    (na retirada rpida aps uso prolongado) (FREITAS; SOUZA, 2007).

    Os glicocorticoides podem aumentar a presso sangunea por meio do

    aumento da concentrao de sdio-potssio adenosina trifosfato na membrana

    celular, podendo aumentar a concentrao de sdio extracelular e

    consequentemente expandir o volume plasmtico. O excesso de cortisol, tambm

    age como um mineralocorticoide no rim, levando a reteno de sdio e gua e,

    consequentemente, aumento do volume de sangue e do dbito cardaco (ORTEGA

    et al, 1996; BROWN, 2005). Tambm aumenta a sensibilidade do miocrdio s

    catecolaminas endgenas, e eleva a resposta vascular aos vasopressores

    endgenos como a angiotensina II e a norepinefrina (ORTEGA et al, 1996). Alm

    disso, os glicocorticoides induzem a produo heptica de angiotensinognio,

    resultando em uma resposta exagerada do sistema renina-angiotensina-aldosterona

    (DUKES, 1992; ACIERNO; LABATO, 2004). Os animais com elevao dos nveis de

    glicocorticoides na circulao tambm sofrem com o excesso de produo de renina,

    que aumenta a resistncia vascular perifrica, contribuindo para o desenvolvimento

    da hipertenso (BROWN, 2005).

    A elevao da presso arterial renal pode provocar uma degenerao tubular

    e fibrose intersticial, enquanto a hipertenso glomerular resulta em

    glomeruloesclerose, atrofia glomerular e glomerulite proliferativa. Juntas, essas

    mudanas esto associadas com hiperfiltrao glomerular e progresso dos danos

    tubulares e glomerulares. O resultado final a piora da hipertenso e,

    eventualmente, insuficincia renal (ACIERNO; LABATO, 2004).

  • 19

    2.2 Insuficincia Renal

    O rim um rgo de fundamental importncia com um conjunto diversificado

    de funes para manter a homeostasia corprea. Nos mamferos, os dois rins

    recebem aproximadamente 25% do dbito cardaco. O rim responsvel em filtrar o

    sangue no s para excretar os resduos metablicos, como tambm, para

    recuperar as substncias filtradas requeridas pelo organismo, incluindo protenas de

    baixo peso molecular, gua e eletrlitos (SINGRI; AHYA; LEVIN, 2003).

    Doena renal definida como a ocorrncia de leses morfolgicas renais de

    qualquer extenso ou severidade ou qualquer anormalidade bioqumica relacionada

    funo renal (GREGORY, 2003), ou seja, indica a existncia de leso renal sem

    qualificar a causa, a gravidade, a distribuio ou estgio da funo renal (NELSON;

    COUTO, 2001). Devido extensa reserva funcional do rim, uma doena renal

    severa pode estar presente mesmo na ausncia de sinais clnicos ou alteraes

    laboratoriais que indiquem insuficincia renal (GREGORY, 2003). A reserva

    funcional do rim pode ser considerada como um percentual dos nfrons no

    necessrios para manter a funo renal e esta reserva pode variar de um animal

    para outro, mas maior do que 50% em animais sadios (NELSON; COUTO, 2001).

    A insuficincia renal comea quando a reserva funcional perdida. uma

    condio de decrscimo da funo renal; refere-se a um nvel de funo do rgo e

    no a doena especificamente (NELSON; COUTO, 2001). Est presente quando h

    sinais clnicos ou alteraes laboratoriais causados pela reduo da funo renal, o

    que s ocorre aps a perda considervel de nfrons (GREGORY, 2003), isto ,

    aproximadamente 75% dos nfrons de ambos os rins (NELSON; COUTO, 2001). O

    resultado da insuficincia renal a intoxicao denominada uremia (CONFER;

    PANCIERA, 1998).

    Para avaliar a funo renal, o mtodo frequentemente utilizado a

    mensurao da concentrao plasmtica de substncias normalmente excretadas

    pelos rins. A avaliao dos nveis de ureia e creatinina so os biomarcadores mais

    comumente utilizados na rotina. Entretanto, a azotemia de origem renal s ocorre

    quando 75% do parnquima renal afetado, dessa forma, o conhecimento e a

  • 20

    utilizao de outros mtodos que permitam o reconhecimento mais precoce da

    patologia renal (SANTIN et al., 2006) como a atividade enzimtica da gGT

    (HENNEMANN et al., 1997), tornam-se muito importantes para um melhor

    prognstico da insuficincia renal (SANTIN et al., 2006).

    2.2.1 Gama-glutamiltransferase (gGT) urinria

    A enzimologia clnica de grande importncia diagnstica no que se refere s

    enzimas presentes no sangue e na urina (WESTHUYZEN et al., 2003). Os estudos

    de enzimologia iniciaram-se em 1901 com Vitor Henri e foram intensificados a partir

    de 1910 com Leonor Michaelis. Na dcada de 1960 foi iniciado o uso da enzimologia

    no diagnstico na medicina humana e apenas na dcada de 1980 seu uso foi

    ampliado no diagnstico na medicina veterinria (RODRIGUES, 2005).

    As enzimas urinrias so utilizadas para teste de deteco precoce de leso

    renal. Dentre estas, a gama-glutamiltransferase (gGT) urinria a mais facilmente

    testada (SODR et al., 2007). Elevaes na atividade enzimtica urinria ocorrem

    antes mesmo de mudanas na depurao de creatinina, na concentrao srica de

    ureia e creatinina ou na frao de eletrlitos eliminada pela urina (MEYTS et al.,

    1988; MELCHERT et al., 2007).

    Os maiores avanos na identificao de nefrotoxicidade so as avaliaes

    das enzimas. Devido ao tamanho molecular, enzimas sricas tendem a no passar

    para a urina na ausncia de leso glomerular. J as enzimas liberadas pelos rins

    tendem a no passar para o soro, mas sim para a urina (LOEB, 1998).

    O prognstico e a sobrevida do animal esto diretamente relacionados ao

    correto diagnstico da doena e o conhecimento das alteraes laboratoriais

    relacionadas diminuio da funo renal e ao diagnstico da fase inicial da

    insuficincia renal (MELCHERT et al., 2007).

    A gGT uma enzima microssomal e de membrana, de vasta distribuio nos

    tecidos envolvidos em processos secretrios e absortivos, particularmente no canal

    biliar e na borda em escova dos tbulos renais (TASCI et al., 2005). composta por

  • 21

    uma subunidade pesada, com 62-68 KDa, e por uma leve, com 22 KDa (YU et al.,

    2007), e est presente no pncreas, fgado, bao, corao, crebro, vesculas

    seminais e rins (TATE; ROSS, 1977; FRIELLE; CURTHOYS, 1982; CABRERA-

    ABREU; GREEN, 2002; ELIAS et al., 2004), alm de ser essencial na manuteno

    do balano homeosttico, no que diz respeito ao estresse oxidativo (YU et al., 2007).

    A gGT urinria reflete a leso na borda em escova dos tbulos proximais com

    perda da estrutura da microvilosidade (KANEKO et al., 2008; MENEZES et al., 2010;

    SANTIN et al., 2006) e pode ser encontrada na urina em condies lesivas, antes

    mesmo de outros elementos (RAMBABU, PATTABIRAMAN, 1982), alm de persistir

    por maior tempo (YU et al., 2007).

    De acordo com Hennemann et al., (1997), a mensurao da atividade da

    gama-glutamiltransferase na urina um sensvel indicador de leso tubular renal,

    possibilitando o diagnstico precoce, juntamente com a urinlise, em ces.

    2.2.2 Azotemia

    A azotemia ocorre quando h excesso de componentes nitrogenados no

    sangue (NELSON; COUTO, 2001; STOCKHAM; SCOTT, 2003; HOSTETTER;

    ANDREASEN, 2004; FINCO, 1995), que so rotineiramente detectados pelo

    aumento de ureia e creatinina srica (STOCKHAM; SCOTT, 2003). As causas de

    azotemia podem ser pr-renal, renal ou ps-renal. A uremia ocorre quando os sinais

    da insuficincia renal esto presentes (NELSON; COUTO, 2001; STOCKHAM;

    SCOTT, 2003; HOSTETTER; ANDREASEN, 2004). Na ausncia de sinais clnicos o

    animal azotmico, no urmico (NELSON; COUTO, 2001). Os sinais clnicos

    associados uremia incluem anorexia, vmito, diarria, hemorragia gastrointestinal,

    estomatites ulcerativas, letargia, tremores musculares, convulses, coma, (NELSON;

    COUTO, 2001) hipertenso, perda de peso (HOSTETTER; ANDREASEN, 2004) e

    hlito com odor amoniacal (STOCKHAM; SCOTT, 2003).

    Na azotemia pr-renal a causa inicial do aumento da excreo de uria ou

    creatinina envolve um processo que ocorre antes dos rins (STOCKHAM; SCOTT,

    2003). Qualquer processo que diminua o fluxo de plasma renal (como desidratao

  • 22

    ou diminuio do volume sanguneo) vai causar diminuio da taxa de filtrao

    glomerular e, portanto diminuir a depurao de uria e creatinina. A hipovolemia

    causa no tbulo contorcido proximal aumento da reabsoro de Na+ e gua e

    reabsoro passiva de ureia, pois o fluxo mais lento permite maior tempo para

    reabsoro. A hipovolemia tambm estimula a liberao de hormnio antidiurtico

    (ADH) o qual causa aumento da reabsoro de ureia nos tbulos coletores

    medulares. Se a diminuio do fluxo de plasma renal for severa e persistente

    permite o desenvolvimento de hipxia renal, dano renal agudo e insuficincia renal

    aguda (IRA). Nesses animais a azotemia pode estar tendo origem pr-renal e renal

    (STOCKHAM; SCOTT, 2003).

    A azotemia de origem renal ocorre quando h qualquer doena renal com

    dano glomerular suficiente para causar grande diminuio da taxa de filtrao

    glomerular. Uma doena renal (aguda ou crnica) que resulte em perda de pelo

    menos 65% a 75% da capacidade funcional dos nfrons causa reduo da taxa de

    filtrao glomerular, o que provoca inadequada excreo de uria e creatinina e,

    consequentemente, h aumento desses metablicos no plasma. As doenas renais

    que podem causar a azotemia incluem doenas inflamatrias renais como

    glomerulonefrite, pielonefrite, nefrite tbulo-intersticial, amiloidose, nefrose txica

    (hipercalcemia, etileno glicol, mioglobina, gentamicina, fenilbutazona), isquemia ou

    hipxia renal, hipo ou aplasia congnita, hidronefrose e neoplasia (STOCKHAM;

    SCOTT, 2003).

    Na azotemia ps-renal a causa inicial est distal aos nfrons. Uma obstruo

    no trato urinrio (urolitase, plugs uretrais em gatos, neoplasia, doena prosttica)

    causa a liberao de substncias vasoativas (protaglandinas, angiotensinas) que

    causam a constrio das arterolas glomerulares, isso reduz o fluxo plasmtico renal,

    a taxa de filtrao glomerular e consequentemente h diminuio da depurao de

    uria e cretinina. A azotemia ps-renal tambm ocorre quando h a liberao da

    urina para a cavidade abdominal (trauma, neoplasia), pois a uria e creatinina da

    urina so absorvidas passivamente pelo endotlio peritoneal e chegam ao plasma. A

    ureia na cavidade peritoneal se equilibra com a do plasma mais rapidamente que a

    creatinina. Se a excreo de ureia e cretinina no compensar a excreo urinria

    diminuda, tambm ocorrer azotemia (STOCKHAM; SCOTT, 2003).

  • 23

    A ureia um dos ndices que avaliam a filtrao glomerular, pois a maior

    parte da ureia excretada na urina atravs da filtrao nos glomrulos. Assim, a

    reduo na filtrao tem como consequncia o aumento da concentrao de ureia.

    Entretanto, esta concentrao afetada tanto pela taxa de produo de ureia no

    fgado como pela excreo da mesma pelas vias renais e extrarrenais (FETTMAN;

    REBAR, 2004).

    O aumento de creatinina no soro ou plasma geralmente est associado a

    processo patolgico relacionado diminuio da taxa de filtrao glomerular (pr-

    renal, renal ou ps-renal). O aumento pode acontecer tambm por aumento na

    produo e liberao por micitos lesionados (STOCKHAM; SCOTT, 2003).

    2.2.3 Proteinria

    Em circunstncias normais, uma pequena parte da albumina do plasma e

    praticamente nenhuma globulina plasmtica, passam pela barreira de filtrao

    glomerular e chegam ao espao de Bownman e tbulos renais. As protenas filtradas

    so quase totalmente reabsorvidas no tbulo contorcido proximal e apenas pequena

    quantidade observada na urina. A fita reagente de urinlise detecta nveis de

    albumina acima de 30mg/dl (SENIOR, 2005).

    A leso de clulas tubulares induz o escape de enzimas e microprotenas

    para a luz tubular, e a magnitude da elevao dos biomarcadores na urina vai

    depender da natureza do insulto e da gravidade da leso das clulas tubulares.

    Outro mecanismo para o aparecimento desses biomarcadores na urina a

    diminuio da reabsoro de protenas de baixo peso molecular normalmente

    filtradas no glomrulo e reabsorvidas totalmente pelas clulas tubulares proximais

    (GLEADHILL; MICHELL, 1996).

    A excreo de protena pode ser um importante indicador de inadequada

    funo renal, apesar de haver causas no renais. A proteinria grave geralmente

    indica aumento da permeabilidade glomerular, mas tambm pode ocorrer quando h

    presena de sangue ou exsudatos de qualquer parte do trato urinrio (GLEADHILL;

  • 24

    MICHELL, 1996). Entre os achados laboratoriais que tambm auxiliam na

    caracterizao da disfuno renal est a proteinria moderada a marcante,

    detectada na urina (GRECO et al., 1985).

    2.2.4 Relao Protena/Creatinina Urinria (Pu/Cu)

    A relao (Pu/Cu) um teste indicado para avaliao de leso aos glomrulos

    quando ainda no h evidncias clnicas ou at mesmo laboratoriais de patologia no

    sistema urinrio. A creatinina e a ureia somente se elevam quando 75% ou mais dos

    nfrons foram lesados, enquanto a relao (Pu/Cu) aumenta a partir de 25% de

    comprometimento ao tecido renal. Portanto, este teste pode ser utilizado como

    indicativo de leso aos rins em casos iniciais, o que melhora o prognstico do

    paciente (LANIS et al., 2008).

    Molculas de protena so significativamente grandes para ultrapassar os

    glomrulos, no entanto molculas de creatinina so bem menores, passam

    facilmente e so liberadas em grande quantidade na urina. Fisiologicamente

    esperado que a creatinina esteja elevada na urina, mas a protena no. Quando a

    quantidade de protenas na urina encontra-se persistentemente elevada, esta

    condio sugere leso glomerular. Assim, quanto mais protena h na urina, maior a

    RPC urinria e maior o indcio de gravidade na leso aos glomrulos (HEINE, 2008).

    Algumas drogas podem interferir na protena urinria, tais como

    acetaminofen, aminofilina, aspirina, anfotericina B, ampicilina, bacitracina, captopril,

    carbamazepina, cefaloridina, cefalotina, corticosterides, ciclosporina, gentamicina,

    ferro, kanamicina, rifampicina, tobramicina, tetraciclina, vancomicina, vitamina K

    (ROSENFELD, 2009).

    Portanto, quando se descarta as causas de proteinria no-renal e esto

    ausentes hemorragias ou inflamaes, a relao (Pu/Cu) pode ser interpretada da

    seguinte forma: Pu/Cu < 0,5 considerada normal; Pu/Cu entre 0,5 e 1,0

    questionvel para proteinria renal; Pu/Cu > 1,0 indicativa de proteinria renal

    (TRIPATHI, 2011).

  • 25

    2.2.5 Urinlise

    A urinlise um teste laboratorial simples, de baixo custo, e amplamente

    utilizado. Este exame responsvel pela deteco de processos patolgicos

    intrnsecos ao sistema urinrio, e tambm auxiliam no acompanhamento ou

    diagnstico de patologias sistmicas, como anomalias endcrinas ou metablicas.

    Atravs do exame de urina pode ser acompanhada a progresso de uma patologia,

    a eficcia do tratamento e constatar a cura sem causar nenhum estresse ao

    paciente (DALMOLIN, 2011).

    Existem atualmente trs tipos importantes de urinlise: a fita reagente

    (Dipstick) que proporciona mltiplas informaes fisioqumicas da urina, a urinlise

    bsica que utiliza o exame microscpico do sedimento urinrio junto com a fita

    reagente e o exame citopatolgico especializado do sedimento urinrio (HENRY,

    2008).

    Esta anlise pode auxiliar o clnico a visualizar problemas quando o paciente

    for assintomtico, assim preconizando o diagnstico e proporcionando uma melhor

    sobrevida ao paciente (DALMOLIN, 2011). Uma avaliao urinria consiste em dois

    componentes importantes, determinaes fisioqumicas e exame microscpico com

    o objetivo de evidenciar presena dos elementos figurados da urina, como

    hemcias, picitos, cilindros, cristais etc. Na urinlise de rotina observam-se quatro

    componentes: avaliao da amostra, exame fsico, triagem bioqumica e exame do

    sedimento. No exame pr-analtico observado a devida identificao da amostra e

    do paciente, se tem condies para o exame solicitado, conservao adequada e

    sinais de contaminao. No exame analtico, observa-se o aspecto, cor, densidade e

    volume. A triagem bioqumica avalia o pH, protena, glicose, cetonas, hemoglobina,

    bilirrubina, presena de nitrito e leuccitos na urina. A avaliao do sedimento deve

    ser feita com microscopia de luz e os resultados devem ser interpretados juntamente

    com o exame qumico e fsico (HENRY, 2008).

  • 26

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  • 31

    CAPTULO 1

    AVALIAO DO PERFIL RENAL EM RATOS (Rattus norvegicus) TRATADOS

    COM GLICOCORTICOIDES

  • 32

    Avaliao do perfil renal em ratos (Rattus norvegicus) tratados com

    glicocorticoides

    Henrique Jordem Venial; Paulo Srgio da Cruz Andrade Jnior; Jorge Pinto da Silva Filho; Mirleide de

    Arajo Co; Lenir Cardoso Porfrio.

    RESUMO

    Os glicocorticoides representam um grupo de frmacos utilizados para o

    tratamento de diversos sinais clnicos e enfermidades pela sua ao anti-inflamatria

    e imunossupressora. O uso prolongado pode induzir desequilbrios hidroeletrolticos

    devido reteno de fluidos e alteraes laboratoriais a nvel renal. Objetiva-se com

    este trabalho avaliar a atividade enzimtica da gama-glutamiltransferase (gGT),

    creatinina, protena e relao protena/creatinina urinria; ureia e creatinina srica

    para comparar os tratamentos com glicocorticoides em ratos. Para isso, foram

    coletadas amostras de sangue e urina de 21 animais, Rattus norvegicus da linhagem

    Wistar, sem alteraes clnicas ou laboratoriais. Os animais foram divididos em 3

    grupos de sete ratos, o grupo 1 (G1), grupo 2 (G2) e grupo 3 (G3). Todos os animais

    do grupo G1 receberam 50,0 mg/kg de succinato de hidrocortisona. Os animais do

    G2 receberam 2,0 mg/kg de metilprednisolona e os animais do G3 receberam 1,0

    mg/kg de dexametasona, a cada 24h, por via intramuscular, durante 7 dias. O

    experimento foi dividido em dois momentos, sendo o momento inicial (M1) antes do

    uso dos frmacos e o momento 2 (M2) aps o final de 7 dias. Para a avaliao

    clnico-laboratorial as amostras de sangue e urina dos animais foram coletadas nos

    dois momentos M1 e M2 para realizao de exames hematolgicos, bioqumicos e

    urinlise. O tratamento com glicocorticoides ocasionou aumento da creatinina srica

    nos grupos tratados. Entretanto, no se pode afirmar que houve leso renal nos

    ratos tratados, visto que os marcadores Pu/Cu, atividade enzimtica da gGT urinria,

    urinlise e ureia srica no sofreram alteraes. No h diferena entre os grupos

    de ratos tratados com os glicocorticoides de curta, mdia e longa durao em doses

    imunossupressoras, por via intramuscular, pelo perodo de 7 dias.

    Palavras-chave: Rins, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Dexametasona.

  • 33

    Evaluation of renal profile in rats (Rattus norvegicus) treated with

    glucocorticoids

    Henrique Jordem Venial; Paulo Srgio da Cruz Andrade Jnior; Jorge Pinto da Silva Filho; Mirleide de

    Arajo Co; Lenir Cardoso Porfrio.

    ABSTRACT

    The glucocorticoids are a group of drugs used for the treatment of various diseases

    and clinical signs for its anti-inflammatory and immunosuppressive action. Prolonged

    use may induce electrolyte imbalances due to fluid retention and laboratory

    abnormalities in the kidney. The objective of this study was to evaluate the enzymatic

    activity of gamma-glutamyltransferase (GGT), creatinine, protein and

    protein/creatinine ratio in urine, urea and creatinine in the serum to compare

    treatments with glucocorticoids in rats. For this, were collected blood samples and

    urine samples from 21 animals, Rattus norvegicus, Wistar lineage, without clinical or

    laboratory changes. The animals were divided into three groups of seven rats, group

    1 (G1), group 2 (G2) and group 3 (G3). All animals in the G1 received 50,0 mg/kg of

    hydrocortisone succinate. The animals of group 2 received 2,0 mg/kg

    methylprednisolone and G3 animals received 1,0 mg/kg of dexamethasone, every 24

    hours, intramuscularly, for 7 days. The experiment was divided into two moments,

    with the initial moment (M1) before using of drugs and moment 2 (M2) after the end

    of seven days. For the clinical and laboratory evaluation, samples of blood and urine

    of the animals were collected in two moments M1 and M2 to perform hematological,

    biochemical and urinalysis. The treatment with glucocorticoids caused an increase in

    serum creatinine in the treated groups. However, one can not say that there was

    renal injury in rats treated since the markers Pu/Cu, enzymatic activity of urinary

    gGT, urinalysis and serum urea remained unchanged. There is no difference

    between the groups of rats treated with glucocorticoids of short, medium and long

    term in immunosuppressive doses, intramuscularly, for a period of 7 days.

    Keywords: Kidneys, Hydrocortisone, Methylprednisolone, Dexamethasone.

  • 34

    4. INTRODUO

    Os glicocorticoides assumem na atualidade uma das classes farmacolgicas

    mais empregadas na medicina veterinria. Desde a sua introduo na prtica clnica,

    os glicocorticoides tm representado importante e, muitas vezes decisivo

    instrumento teraputico no manejo de diferentes doenas (CALDAS; SCHRANK,

    2001). So os mais potentes agentes anti-inflamatrios conhecidos, o que os tornam

    agentes importantes no tratamento de numerosos distrbios inflamatrios, alrgicos,

    hematolgicos, entre outros (KATZUNG, 2003; DAMIANI et al., 2007). Essas

    aplicaes teraputicas tm estimulado o desenvolvimento de muitos esterides

    sintticos com atividades anti-inflamatrias e imunossupressoras (KATZUNG, 2003).

    Apesar dos benefcios gerados em determinadas enfermidades, o uso

    prolongado dos glicocorticoides pode desencadear uma srie de efeitos com

    capacidade de promover alteraes clnicas e laboratoriais. Estas alteraes podem

    variar de acordo com o frmaco especfico utilizado, a dose, a durao da terapia de

    glicocorticoides e sensibilidade individual do paciente (ANDRADE, 2002; SCHERK;

    CENTER, 2005).

    O uso prolongado de glicocorticoide pode induzir desequilbrios

    hidroeletrolticos pela reteno de fluido causado pelo efeito mineralocorticoide e

    tambm alteraes laboratoriais (SCHERK; CENTER, 2005; ANDRADE, 2002;

    MACDONALD, 2004; COHN, 2006; PLOYNGAM et al., 2006). Podem aumentar a

    presso sangunea por meio do aumento da concentrao de sdio-potssio

    adenosina trifosfato na membrana celular, podendo aumentar a concentrao de

    sdio extracelular e consequentemente expandir o volume plasmtico (ORTEGA et

    al, 1996; BROWN, 2005). Alm disso, os glicocorticoides induzem a produo

    heptica de angiotensinognio, resultando em uma resposta exacerbada do sistema

    renina-angiotensina-aldosterona (DUKES, 1992; ACIERNO; LABATO, 2004).

    A elevao da presso arterial renal pode provocar degenerao tubular e

    fibrose intersticial, enquanto a hipertenso glomerular resulta em

    glomeruloesclerose, atrofia glomerular e glomerulite proliferativa. Juntas, essas

    mudanas esto associadas com hiperfiltrao glomerular e progresso dos danos

  • 35

    tubulares e glomerulares. O resultado final a piora da hipertenso e,

    eventualmente, insuficincia renal (ACIERNO; LABATO, 2004).

    O mtodo rotineiramente usado para avaliar a funo renal a mensurao

    da concentrao plasmtica de substncias normalmente excretadas pelos rins. A

    avaliao dos nveis de ureia e creatinina so os testes mais comumente utilizados

    na rotina mdica veterinria. Entretanto, a azotemia de origem renal s ocorre

    quando cerca de 75% do parnquima renal perdido (SANTIN et al., 2006).

    Dentre outros achados laboratoriais que tambm auxiliam na caracterizao

    da disfuno renal, pode-se citar a proteinria moderada a marcante, a qual

    detectada na urina por quantificao e/ou por fita reagente de imerso (GRECO et

    al., 1985). A relao de protena/creatinina na urina (Pu/Cu) um teste indicado para

    avaliao de leso aos glomrulos quando ainda no h evidncias clnicas ou

    laboratoriais do sistema urinrio (LANIS et al., 2008).

    A enzimologia clnica de grande importncia diagnstica no que se refere s

    enzimas presentes no sangue e na urina (WESTHUYZEN et al., 2003). As enzimas

    urinrias so utilizadas para teste de deteco precoce de leso renal. Dentre essas,

    a gama glutamiltransferase (gGT) urinria a mais amplamente testada (RAMBABU;

    PITTABIRAMAN, 1982; SODR et al., 2007).

    Objetiva-se com este trabalho avaliar a atividade enzimtica da gama-

    glutamiltransferase (gGT), creatinina, protena e relao protena/creatinina urinria;

    ureia e creatinina srica para comparar os tratamentos com glicocorticoides em

    ratos.

  • 36

    5. MATERIAL E MTODOS

    A presente pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica e Biossegurana da

    Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de Alegre - FAFIA com o protocolo nmero

    0200021/2010.

    5.1 Seleo dos Animais

    Foram utilizados 21 animais, Rattus norvegicus linhagem Wistar, fmeas, com

    idade entre 5 e 6 meses com mdia de pesos de 250g. Todos os animais foram

    originados das colnias implantadas no Biotrio Central da Universidade Federal do

    Esprito Santo, ES.

    Ao chegarem ao biotrio do CCA-UFES, passaram por perodo de dois dias

    de adaptao antes do incio das avaliaes laboratoriais e aplicao dos frmacos

    selecionados. Os animais foram alocados em caixa de polipropileno com lotao de

    dois animais por caixa, mantidos em temperatura de aproximadamente 210C a 230C,

    umidade e luminosidade controladas em foto perodo de 12 horas claro/escuro por

    28 dias, foram alimentados com rao especfica para a espcie e gua ad libidum.

    O experimento foi dividido em dois momentos, sendo o momento inicial (M1),

    antes do uso dos frmacos, e o momento final (M2), aps 7 dias do incio do

    tratamento.

    5.2 Formao dos Grupos

    Os animais foram divididos em 3 grupos com sete ratos cada um. Os animais

    do grupo G1 receberam 50 mg/kg de succinato sdico de hidrocortisona, os animais

    do G2 receberam 2 mg/kg de metilprednisolona e os animais do G3 receberam 1

    mg/kg de dexametasona. Todos os animais receberam as medicaes em doses

    imunossupressoras, por via intramuscular, a cada 24 horas, durante 7 dias.

  • 37

    5.3 Coleta de Sangue e Urina

    As amostras de sangue foram coletadas em jejum alimentar de 24 horas, nos

    dois momentos M1 e M2 para realizao de hemograma e exames bioqumicos.

    Foi colhido 0,7 mL de sangue com seringa descartvel de 1,0mL, por puno

    intra-cardaca, armazenado em frascos a vcuo da marca Labor Import, sem

    anticoagulante, e em tubos contendo anticoagulante EDTA na concentrao de 10%.

    Coletou-se urina nos momentos M1 e M2 para anlise bioqumica urinria e

    urinlise. Foi coletada cerca de 1,0 mL de urina por mico espontnea e/ou

    compresso da bexiga e acondicionadas em frascos estreis.

    Os materiais foram devidamente identificados, refrigerados e encaminhados

    para anlise no Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Veterinrio do CCA-

    UFES.

    5.4 Hemograma

    O hemograma foi realizado por tcnica manual segundo tcnicas de rotina do

    Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Veterinrio da UFES, como critrio de

    incluso de animais hgidos no experimento.

    Foram avaliados o hematcrito, contagem de hemcias e leuccitos totais,

    com a cmara de Newbauer e dosagem de hemoglobima pela tcnica de

    cianometemoglobina, clculo dos ndices eritrocitrios, quantificao de protena

    plasmtica total pela tcnica de refratometria e plaquetas.

    5.5 Bioqumica Srica e Urinria

    As amostras de sangue coletado em frascos sem anticoagulantes foram

    centrifugadas a 2991 g durante 5 minutos, para obteno do soro. As anlises

    bioqumicas foram realizadas em analisador bioqumico manual Biospectro SP-22

    utilizando kits comerciais especficos.

  • 38

    A uria srica foi mensurada pelo teste enzimtico colorimtrico de ponto

    final (Labtest - Ref. 27). A creatinina srica e urinria foi quantificada pelo mtodo

    cintico de ponto final - Jaff modificado da marca Labtest (Ref. 35-100).

    Para o exame da protena urinria foi utilizado o mtodo cintico de vermelho

    pirrolidol com kit Sensiprot da marca Labtest (Ref. 36-50). A gama

    glutamiltransferase (Gama GT Liquiform) urinria foi quantificada pelo mtodo

    cintico contnuo de Szasz modificado da marca Labtest (Ref. 105-2). As tcnicas

    utilizadas para todas as dosagens sricas e urinrias seguiram os protocolos dos

    kits comerciais utilizados, Labtest.

    5.6 Urinlise

    A urinlise foi realizada no experimento nos momentos inicial e final (M1 e

    M2). Para realizao do exame, as amostras, em temperatura ambiente, foram

    utilizadas para execuo do exame fsico, com determinao da densidade urinria

    pela tcnica de refratometria, exame qumico semiquantitativo com tiras reagentes e

    sedimentoscopia.

    Cerca de 1,0 mL foi centrifugado em centrfuga de macrotubos marca Digilab

    durante 5 minutos a 1077 g, conforme Osborne et al. (1995) em tubos cnicos e

    graduados. Foi separado o sobrenadante ficando o sedimento com quantidade

    aproximada de 0,3 mL.

    Para o exame microscpico foram utilizadas alquotas de 10L do sedimento,

    entre lmina microscpica e lamnula de 20 x 20mm, com contagem mdia de 5

    campos aleatrios, sem o emprego de corantes especficos para identificao dos

    elementos figurados da urina.

    O sobrenadante foi utilizado para as determinaes bioqumicas, com imerso

    das tiras reagentes para exame semiquantitativos de protena, glicose, hemoglobina,

    corpos cetnicos, bilirrubina e urobilinognio e para quantificao dos compostos

    nitrogenados no proteico, ureia, creatinina e determinao da atividade urinria da

    enzima gama glutamiltransferase.

  • 39

    5.7 Relao Protena e Creatinina Urinria (Pu/Cu)

    A relao protena urinria e creatinina urinria (Pu/Cu) foi obtida por meio de

    clculo aritmtico, aps a obteno dos valores numricos pelas dosagens

    quantificadas.

    5.8 Eutansia dos animais

    Ao trmino do projeto, os animais foram submetidos eutansia de forma

    humanitria, com dose letal de barbitrico, recomendado para espcies

    convencionais de laboratrio. Para tanto se utilizou dose excessiva de anestsico, o

    Pentobarbital Sdico na dose de 100mg/Kg.

    5.9 Anlise estatstica

    A estatstica foi realizada utilizando o programa BioEstat 5.0 pelo teste

    paramtrico T pareado entre o momento inicial (M1) e final (M2) de cada grupo.

    Foram obtidos valores mdios e respectivos desvio padro de cada varivel. A

    comparao entre os tratamentos dos trs grupos foi realizada por meio de anlise

    de varincia (ANOVA) e as mdias foram submetidas ao teste de Tukey, assumindo-

    se 5% de probabilidade.

  • 40

    6. RESULTADOS E DISCUSSO

    Na anlise estatstica dos valores mdios hematolgicos (Tabela 1),

    constataram-se nveis dentro das variaes permitidas para os animais,

    concordando com os valores referenciais de FIOCRUZ (2005) e com a anlise de

    varincia (ANOVA) entre os grupos (p0,05), e por estarem hgidos, foram includos

    no projeto (Anexo).

    Os valores mdios e desvios-padro (Tabela 2) de ureia srica no

    apresentaram alteraes significativas (p0,05) aps o tempo de tratamento por 7

    dias. Estes dados no so compatveis com estudos de Moreira et al. (2009) e

    Ortega (1996), pois relatam que o aumento dos nveis de glicocorticoides aumentam

    a diurese, resultando em maior perda urinria de nitrognio ureico e diminuio do

    valor de ureia srica.

    Porm, os valores sricos obtidos para creatinina srica apresentaram

    aumento significativo (p0,05) em todos os grupos tratados com glicocorticoides.

    Segundo Nelson (2001), o aumento dos nveis de creatinina srica pode estar

    presente em casos de aumento de glicocorticoide sanguneo (Tabela 2).

    TABELA 2 - Valores mdios D.P. de uria, creatinina srica de ratos antes e aps

    tratamento com succinato de hidrocortisona (G1), metilprednisolona (G2) e

    dexametasona (G3), pelo perodo de sete dias.

    US ureia srica CS creatinina srica

    * Valores que ocorreram alterao (nvel de significncia 95%)

    Grupos Tratados

    Parmetros G1 G2 G3

    M1 M2 P M1 M2 P M1 M2 P

    US (mg/dL) 35,6 7 45,0 15,7 0,21 38,2 11 44,1 13,5 0,06 53,7 4,6 47,5 7,8 0,17

    CS (mg/dL) 0,7 0,1 2,3 0,63 0,001* 0,8 0,2 1,5 0,6 0,02* 0,6 0,2 2,1 0,23

  • 41

    A creatinina o produto da degradao no enzimtica da fosfocreatina no

    msculo, que est envolvida no metabolismo energtico, particularmente na

    estabilizao de ligaes de fosfato de alta energia no necessrias para uso

    imediato. A produo diria de creatinina no corpo determinada em grande parte

    pela massa muscular do indivduo e no afetada consideravelmente pela dieta

    (DiBARTOLA, 1997; KERR, 2003).

    As alteraes nos valores de creatinina srica podem ser decorrentes de

    mudanas hemodinmicas e pelo catabolismo, visto que os animais permaneceram

    em jejum por 24 horas e receberam a medicao por via intramuscular. Segundo

    Stockham e Scott (2003), o aumento de creatinina no soro ou plasma geralmente

    est associado a processo patolgico relacionado diminuio da taxa de filtrao

    glomerular (pr-renal, renal ou ps-renal). Porm, o aumento tambm pode

    acontecer por aumento na produo e liberao por micitos lesionados, o que

    poderia justificar o aumento dos valores de creatinina.

    Na anlise dos resultados da atividade enzimtica de gGT, creatinina e

    protena na urina, no houve alteraes estatisticamente significativas em nenhum

    dos grupos (p>0,05) aps tratamento com corticoides de curta, mdia e longa

    durao (Tabela 3), o que indica no haver leso renal.

    TABELA 3 - Valores mdios D.P. da atividade da enzima gama

    glutamiltransferase, creatinina e protena urinria, e relao (Pu/Cu) de ratos antes

    (M1) e aps (M2) tratamento com succinato de hidrocortisona (G1),

    metilprednisolona (G2) e dexametasona (G3), pelo perodo de sete dias.

    gGT gama glutamiltransferase urinria CU creatinina urinria PU protena urinria Pu/Cu relao protena/creatinina urinria *Valores que ocorreram alterao (nvel de significncia 95%)

    Grupos Tratados

    Parmetros G1 G2 G3

    M1 M2 P M1 M2 P M1 M2 P

    gGT (U/L) 7,5 2,2 9,89 2,8 0,06 12,6 6,1 17,4 9,9 0,1 11,7 8,4 9,9 5,5 0,5

    CU (mg/dL) 77,7 39,7 72,50 33,4 0,7 77,2 41,2 70,3 36,0 0,7 78,7 19,9 70,5 22,2 0,6

    PU (mg/dL) 13,7 0,9 13,0 0,8 0,64 12,0 1,5 12,6 0,5 0,5 13,0 0,6 13,0 0,6 1,0

    Pu/Cu 0,16 0,02 0,17 0,02 0,6 0,17 0,02 0,16 0,01 0,5 0,17 0,01 0,18 0,02 0,6

  • 42

    A gGT urinria reflete leso na borda em escova dos tbulos proximais com

    perda da estrutura da microvilosidade (KANEKO et al., 2008; MENEZES et al., 2010;

    SANTIN et al., 2006) e pode ser encontrada na urina em condies lesivas, antes

    mesmo de outros elementos clssicos (RAMBABU, PATTABIRAMAN, 1982), alm

    de persistir por maior tempo (YU et al., 2007).

    A relao (Pu/Cu) um teste indicado para avaliao de leso aos glomrulos

    quando ainda no h evidncias clnicas ou at mesmo laboratoriais de insuficincia

    no sistema urinrio. A creatinina e a ureia srica somente se elevam quando 75% ou

    mais dos nfrons estiverem lesados, enquanto a relao (Pu/Cu) aumenta a partir de

    25% de comprometimento ao tecido renal de acordo com Lanis et al. (2008).

    Portanto, este teste pode ser utilizado como indicativo de leso aos rins em casos

    iniciais, o que melhora o prognstico do paciente.

    Os valores mdios desvios-padro da relao (Pu/Cu) dos 3 grupos foram

    obtidos pelo clculo aritmtico da protena e creatinina urinria e que no sofreram

    alteraes significativas (p>0,05), obtendo-se valor mdio de 0,17 0,02 no G1; 0,16

    0,01 no G2 e 0,18 0,02 no G3. Em ces, Tripathi (2011) descreve que quando se

    descarta as causas de proteinria no-renal e esto ausentes hemorragias ou

    inflamaes, a relao protena/creatinina urinria interpretada da seguinte forma:

    relao (Pu/Cu) < 0,5 considerada normal; relao (Pu/Cu) entre 0,5 e 1,0

    questionvel para proteinria renal; relao (Pu/Cu) > 1,0 indicativa de proteinria

    renal.

    Segundo Menezes et al. (2010), a avaliao da relao (Pu/Cu), bem como a

    atividade da gGT urinria so provas mais sensveis para detectar leso tubular

    aguda que o exame de urina de rotina. No foi observado aumento da atividade da

    enzima gGT e nos valores da relao (Pu/Cu) na urina de ratos tratados com

    glicocorticoides.

    O exame de urinlise (Tabela 4) foi feito nos dois momentos, no havendo

    alteraes significativas comparadas aos valores de referncia da urinlise de ratos

    criados no Biotrio Central da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (2012)

    aps tratamento com glicocorticoides por 7 dias. A presena de protena (+) pode ter

    ocorrido pela presena de clulas de descamao, hemcias e leuccitos, no

    sedimento, mesmo em quantidade reduzida, pois segundo Senior (2005), as

  • 43

    protenas filtradas nos glomrulos so quase totalmente reabsorvidas no tbulo

    contorcido proximal e apenas pequena quantidade observada na urina.

    Os glicocorticoides podem aumentar a velocidade de filtrao glomerular e

    inibir os efeitos do hormnio antidiurtico nos tbulos renais, resultando em

    isostenria, poliria e polidipsia, o que leva a diminuio da densidade urinria. Os

    valores da densidade urinaria no presente estudo no apresentaram alteraes aps

    corticoterapia, no sendo compatveis com relatos de Moreira et al. (2009).

    TABELA 4 - Valores obtidos na urinlise de ratos antes e aps tratamento com

    succinato de hidrocortisona (G1), metilprednisolona (G2) e dexametasona (G3) pelo

    perodo de sete dias.

    *Valores de referncia da urinlise de ratos, criados no Biotrio Central da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, MS, 2012.

    Na anlise de varincia (ANOVA) entre os grupos tratados com classes

    diferentes de glicocorticoides no foram verificadas alteraes significativas (p>0,05)

    nos valores da ureia srica, creatinina srica e urinria, gGT urinria, protena

    urinria e relao (Pu/Cu) entre os tratamentos (Tabela 5).

    Parmetros Grupos Tratados

    G 1 G 2 G 3 Referncia*

    M1 M2 M1 M2 M1 M2 Cor Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Densidade 1.048 1.040 1.039 1.041 1.033 1.032 1.030 pH 8,0 7,0 8,0 8,0 7,0 8,0 7,0 Glicose Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente C. Cetnicos Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Bilirrubina Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Urobilinognio Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Hemoglobina Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Cl. Descama. 1 p/c 1 p/c 1 p/c 1 p/c 1 p/c 1 a 2 p/c Raras Cilindros 0 0 0 0 0 0 0 Protenas + + + + + + Raras Hemcias 1 p/c 2 p/c 1 p/c 2 p/c 1 p/c 1 p/c 1 a 2 p/c Leuccitos 1 p/c 2 p/c 1 p/c 1 p/c 1 p/c 2 p/c 2 a 3 p/c

  • 44

    TABELA 5 - Valores mdios D.P. da ureia srica, creatinina srica e urinria,

    atividade da gGT urinria, protena urinria e relao protena/creatinina urinria

    (Pu/Cu) aps tratamento com succinato de hidrocortisona (G1), metilprednisolona

    (G2) e dexametasona (G3), pelo perodo de sete dias.

    Parmetros

    Grupos Tratados (M2)

    G1 G2 G3 p

    Uria Srica (mg/dL) 45,0 15,7 44,1 13,5 47,5 7,8 0,19

    Creatinina Srica (mg/dL) 2,3 0,63 1,5 0,6 2,1 0,23 0,055

    gGT Urinria (U/L) 9,89 2,8 17,4 9,9 9,9 5,5 0,08

    Creatinina Urinria (mg/dL) 72,50 33,4 70,3 36,0 70,5 22,2 0,22

    Protena Urinria (mg/dL) 13,0 0,8 12,6 0,5 13,0 0,6 0,6

    Pu/Cu 0,17 0,02 0,16 0,01 0,18 0,02 0,6

  • 45

    7. CONCLUSO

    O tratamento com succinato de hidrocortisona, metilprednisolona e

    dexametasona ocasiona aumento da creatinina srica nos grupos tratados.

    Entretanto, no se pode afirmar que h leso renal nos ratos tratados, visto que os

    marcadores Pu/Cu, atividade enzimtica da gGT urinria, urinlise e ureia srica no

    sofreram alteraes.

    No h diferena entre os grupos de ratos tratados com os glicocorticoides de

    curta, mdia e longa durao em doses imunossupressoras, por via intramuscular,

    pelo perodo de 7 dias.

  • 46

    8. REFERNCIAS

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  • 48

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  • 49

    ANEXO

    TABELA 1 - Mdia D.P. dos parmetros hematolgicos e plaquetas de ratos

    hgidos antes de serem submetidos a tratamento com succinato de hidrocortisona

    (G1), metilprednisolona (G2) e dexametasona (G3), pelo perodo de sete dias.

    *Fonte: FIOCRUZ. Centro de Criao de Animais de Laboratrio da Fundao Oswaldo Cruz (2005)

    Parmetros Grupos Referncias*

    G1 G2 G3 p

    Hemcias (x106/L) 6,4 0,4 6,4 0,5 6,8 4,7 0,23 3,30 8,30

    Hb (g/dL) 14 0,8 14 0,8 14 0,9 0,92 7,2 - 16

    Ht (%) 48 2,6 48 4,0 47 2,1 0,62 28 - 50

    VGM (fL) 75 2,0 75 1,0 68 3,2 0,1 46 - 80

    CHGM (%) 28 1,0 29 0,9 29 1,5 0,56 26 - 35

    PPT (g/dL) 8 0,4 8 0,8 8 0,5 0,26 6 - 9

    Plaquetas (x104/L) 116,7 10 112,7 9,2 110,2 7,8 0,3 83,7145,5

    Leuccitos (x103/L) 6,5 2,0 6,5 3,2 7,4 1,3 0,21 4,0 - 12,0

    Bastes (%) 0 0 0,4 0 0,53 0 - 3

    Neutrfilos (%) 34 12,3 38 10,9 29 5,9 0,12 10 - 45

    Linfcitos (%) 56 11,9 53 9,9 57 9,9 0,22 40 - 82

    Eosinfilos (%) 3 1,6 6 1,6 4 2,6 0,39 0 - 7

    Moncitos (%) 5 2,6 3 1,2 5 2,8 0,6 0 - 8

    Basfilos (%) 0 0 0 0,91 0 - 1