UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período : Agosto/ 2014 a Julho/ 2015

( ) PARCIAL

( X ) FINA

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho):

FILOGENIA MOLECULAR E CONECTIVIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES

DE PEIXES MARINHOS: UM ESTUDO NO ATLÂNTICO OCIDENTAL

Nome do Orientador: MARIA IRACILDA DA CUNHA SAMPAIO

Titulação do Orientador: DOUTORADO

Faculdade: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Unidade: BRAGANÇA

Laboratório: LABORATÓRIO DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Título do Plano de Trabalho: DNA BARCODE DAS ESPÉCIES DE ELEOTRIDAE

(TELEOSTEI: GOBIIFORMES) DA COSTA BRASILEIRA

Nome do Bolsista: ÉRIKA MILA FERREIRA FERNANDES

Tipo de Bolsa: ( X ) PIBIC/CNPq

( ) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/INTERIOR

( ) PIBIC/FAPESPA

( ) PARD

( ) PARD – renovação

( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007

1. INTRODUÇÃO

A família Eleotridae está inserida na subordem Gobioidei, dentro da ordem

Gobiiformes (Wiley& Johnson; 2010). São peixes distribuídos em regiões tropicais,

subtropicais e temperadas de todo o mundo (Nelson, 1976), e podem ser encontrados

em ambientes marinhos, salobros e de água doce, sendo a maioria com hábito estuarino

residente (Thacker & Hardman, 2005; Thacker et al. 2009). Os membros desta família

(Figura 1) usualmente são de tamanho pequeno a médio, e compreendem cerca de 130

espécies distribuídas em 23 gêneros (Eschmeyer, 2008). No Brasil, são popularmente

conhecidos como amorés, enquanto que o termo popular em inglês é sleepers

(dorminhocos), pois muitas vezes ficam imóveis no substrato.

São peixes omnívoros, que se alimentam principalmente de plantas, sedimentos,

pequenos invertebrados e outros peixes, incluindo até peixes da mesma família

(Winemiller & Ponwith 1998; Keith et al. 2000). De uma forma geral, estas espécies

apresentam os seguintes caracteres diagnósticos para identificação: duas nadadeiras

dorsais separadas, a primeira com VI a X espinhos flexíveis, a segunda com I espinho

flexível e 6-15 raios macios; nadadeira anal com I espinho flexível e 6-12 raios macios;

nadadeiras pélvicas sempre separadas, com I espinho e 5 raios macios; coloração

variável, e linha lateral ausente (FAO).

Os levantamentos de trabalhos sobre composição da ictiofauna referem-se à

Guavina guavina (Valenciennes 1837), Erotelis smaragdus Valenciennes 1837,

Dormitator maculatus (Bloch 1792) e Eleotris pisonis (Gmelin 1789) como as únicas

espécies de Eleotridae distribuídas na costa brasileira (Oliveira, 1972; Haimovici &

Klippel, 1999; Barletta et al. 2000; Camargo & Isaac, 2002; Barletta et al. 2005;

Barletta & Blaber, 2007; Andrade-Tubino et al. 2008; Bastos et al. 2013; Di Dario et al.

2013; Gonçalves et al. 2013).

No atlântico ocidental são atualmente reconhecidas três espécies de Eleotris:

Eleotris amblyopsis (Cope, 1871) está distribuído desde à Carolina do Norte, Golfo do

México e Caribe até a Guiana Francesa; Eleotris perninger ( Cope,1871) distribuída no

Caribe, mas também foi identificada no Rio de Janeiro; Eleotris pisonis, com

distribuição desde a Carolina do Sul, Golfo do México, Caribe até o Sul do Brasil

(Pezold & Cage, 2001).

A morfologia de algumas espécies encontradas nas Américas tem sido utilizada

de forma satisfatória para identificação, com exceção das espécies do gênero Eleotris,

pois a falta de caracteres taxonômicos que possam diagnosticar as diferenças entre as

espécies deste gênero do Atlântico Ocidental tornam-seum fator limitantepara distinção

das espécies (Pezold& Cage, 2001).

Para realizar a identificação e levantamento das espécies de eleotrídeos e,

pricipalmente para facilitar a identificação das espécies de Eleotrisdo Atlântico Sul

Ocidental faz-se necessário o sequenciamento de DNA e o uso do DNA Barcode como

ferramenta para a identificação.

Figura 1. Espécies representativas da família Eleotridae.

Nas últimas décadas, o código de barras de DNA (DNA Barcode) tornou-se uma

ferramenta potencialmente útil para identificar espécies conhecidas de forma rápida e

confiável, além de auxiliar na descoberta de espécies crípticas com base na sequência de

nucleotídeos de um fragmento de DNA geralmente curto (Hebertet al. 2004a, 2004b;

Ward et al. 2005). Este fragmento consiste numa região padronizada do Citocromo

Oxidase subunidade I (COI) do DNA mitocondrial (mtDNA) (Figura 2), a qual foi

proposta pela primeira vez por Hebert et al. (2003).

A costa norte do Brasil, a qual inclui os estados do Amapá, Pará e Maranhão,

abriga um vasto número de espécies, no entanto, reflete uma grande área pouco

conhecida e amostrada, e abriga o menor número de documentos a respeito da

composição da ictiofauna marinho-estuarina (Marceniuketal. 2013). Os eleotrídeos

fazem parte desta fauna ainda com informações resumidas.

Figura 2. Esquema da molécula de DNA mitocondrial, mostrando a localização do gene

Citocromo Oxidase subunidade I (COI) utilizado para DNA Barcode.

Neste trabalho, o sequenciamento do DNA barcode será empregado para

realizara identificação e levantamento das espécies da família Eleotridae que ocorrem

na costa do Brasil.

JUSTIFICATIVA

As espécies de eleotrídeos na costa brasileira ainda são pouco conhecidas sob

aspectos biológicos, ecológicos e genéticos, uma vez que as abordagens sobre estes

peixes são apenas resultados de estudos sobre a ocorrência, densidade e frequência em

ambientes estuarinos. De um ponto de vista genético e morfológico, é importante

conhecer quais espécies ocorrem na costa brasileira, e como estas estão relacionadas

com os ambientes que vivem.

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Identificar as espécies da família Eleotridae coletadas na região costeira do

Brasil através do método do DNA barcode.

Objetivos Específicos

Coletar espécimes de peixes Eleotridaeem estuários da costa brasileira;

Identificar morfologicamente os espécimes coletados com base em

literatura especializada;

Realizar procedimentos laboratoriais para estudos genéticos nos peixes;

Gerar sequencias de DNA dos marcadores COI, e Zic1 para identificação

dos espécimes;

Realizar comparações entre as sequencias geradas neste trabalho e as

sequencias provenientes do GenBank;

Realizar análises das sequencias para contruir árvores filogenéticas e

matriz de distância nucleotídica entre os espécimes coletados.

MATERIAL E METODOS

Área de amostragem

Para este estudo, as espécies de Eleotridae foram coletados em sete diferentes

localidades da costa norte do Brasil: Santana (Amapá), Curuçá (Pará), Ilha de Marajó

(Pará), Ilha de Mosqueiro (Pará),Bragança (Pará), Estuário do Rio Benevente (Espiríto

Santo) e Delta do Parnaíba (Piauí) (Figura 3).

Figura 3. Localização geral do Brasil à esquerda, e à direita área de localização da costa

norte do Brasil onde os espécimes da Família Eleotridae foram amostrados para este

estudo. Legenda: 1) Santana-Amapá; 2) Ilha do Marajó-Pará; 3) Ilha de Mosqueiro-

Pará; 4) Bragança-Pará; 5) Curuçá-Pará, 6) Delta do Parnaíba; 7) Estuário do Rio

Benevente - Espírito Santo.

Os espécimes foram coletados de forma manual durante a maré vazante, ou com

o auxílio de rede de espera nos furos localizados nas regiões de manguezal.

Posteriormente, os espécimes foram levados ao laboratório, acondicionados em

álcool 90%, e então, foram realizadas identificações morfológicas com base em

literatura específica (FAO, Pezold& Cage, 2001).

Extração de DNA, amplificação e sequenciamento

O DNA total de cada espécime foi isolado a partir do protocolo proposto pelo

DNA Kit WizardGenomicPurification. Foram sequenciadas as regiões parciais do gene

CO1 (LCO1490 5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’ - HCO2198 5’-

TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’) (Folmer et al. 1994 e

respectivamente foram sequenciadas as regiões dos genes o Zic 1 (zic1_F9 5'-GGA

CGC AGG ACC GCA RTA YC-3' - zic1_R967 5' CTG TGT GTG TCC TTT TGT

GRA TYT T -3'). As amplificações foram realizadas para um volume final de 25 µl

contendo 4 µl de DNTP (1,25mM), 2,5 µl de solução tampão (10X), 1 µl de MgCl2 (25

Mm), 0,25 µl de cada iniciador (200 ng/µl), 1-1,5 µl de DNA genômico (100 ng/µl), 1U

de Taq DNA Polimerase (5U/µl) e água purificada para completar o volume final de

reação.

O protocolo de PCR utilizado foi: 1 ciclo de 4 minutos a 94 °C; 35 ciclos de 40 s

a 94°C, 30 s a 52 - 65 °C, e 1 minuto a 72 °C; 1 ciclo de 2 minutos a 72 °C; e hold

a4°C.

Os produtos da amplificação foram purificados com a enzima ExoSAP-IT, e em

seguida, os produtos purificados foram submetidos às reações de sequenciamento,

utilizando Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) no

sequenciador automático ABI 3500 (AppliedBiosystems).

Foram obtidas do GenBank, sequências de COI de eleotrídeos que ocorrem na

costa ocidental do Atlântico Sul: Eleotris amblyopsis (AY722154), G. guavina

(JQ840516.1) e D. maculatus (JQ840473.1). Devido a sequencia de E.pisonis não estar

disponível no GenBank para o gene COI, foi obtida da internet a sequencia de ZIC 1

para esta espécie (KF415953.1) proveniente do trabalho de Agorreta et al. (2013)

(Tabela 2).

Foram também inseridas sequencias de COI do GenBank de outras espécies de

Eleotris do oeste do Indo-Pacífico (Eleotris fusca) e do Hawaii (Eleotris sandwicensis),

bem como da espécie Eleotris picta coletada no estado de Sinaloa (México),

Microphilypnus sp. coletada na bacia Amazônica para complementar as análises dos

dados mostradas na Tabela 2. A espécie Odontobutis obscura foi escolhida como grupo

externo.

Análises das sequencias

As sequencias foram alinhadas automaticamente no ClustalW (Thompson et al.,

1994), e editadas no programa Bioedit 7.0.9 (Hall, 1999).

O programa MEGA 6.0 (Tamura et al. 2007) foi utilizados para calcular as

divergências entre as linhagens sob o modelo de Kimura 2-parameter (K2P) (Kimura

1980). Uma árvore do gene CO1 sob o métodode Agrupamento de Vizinhos foi

construídas no MEGA 6.0 com modelo K2P, e a análise de bootstrap foi implementada

utilizando 1000 réplicas.

Foi gerada uma árvore concatenada com as sequências do gene mitocondrial

COI e de dois nucleares ZIC1 e Rodopsina com a finalidade de mostrar a

verossimilhança da diferença entre as linhagens.Foi utilizada a sequência do gene

ZIC1da espécie de Eleotris pisonis, essa sequência foi comparada com os outros

espécimes de Eleotris.

As relações filogenéticas foram avaliadas utilizando inferência Bayesiana (BI)

realizadas no MrBayes 3.1, utilizando os modelos HKY+G e parâmetrospreviamente

definidos no jModeltest(Posada, 2008). Quatro cadeias Markovianas foram utilizadas

para amostrar a probabilidade espacial em duas corridas simultâneas para 10000000

gerações, e 10% das árvores iniciais serão descartadas como burn-in. Para avaliar se as

corridas representaram com precisão a distribuiçãode probabilidade a posteriori de

todos os parâmetros, o Effective Sample Size (ESS) foi avaliado utilizando o software

Tracer 1.5.

RESULTADOS

Um total de 623 pb do gene COI, 418 pb do gene Rodopsina e 797 pb de ZIC 1

foram obtidos para as análises de todos os espécimes de Eleotridae obtidos para este

estudo.

Nas localidades amostradas, foram capturados um total de 27 espécimes

divididos em três gêneros e quatro espécies Eleotris sp1, Eleotris, sp2, Eleotris sp3, G.

guavina e D. maculatus. A Tabela 1 mostra as localidades com as respectivas espécies e

número de indivíduos capturados.

Tabela 1. Localidades e número de espécimes capturados para este estudo.

Localidade N Espécie Latitude Longitude

Santana - Amapá 3 Eleotris sp1 -0,057078 -51,186195

Mosqueiro - Pará 1 Eleotris sp1 -1,065246 -48,332710

Curuçá - Pará 4 Eleotris sp2 -0,730991 -47,844739

Ilha do Marajó - Pará 2 Eleotris sp2 -0,334248 -48,385857

Bragança - Pará 2 Eleotris sp2 -0,844745 -46,600207

Bragança - Pará 3 Guavina guavina -0,844745 -46,600207

Bragança - Pará 4 Dormitator maculatus -0,844745 -46,600207

Luiz Correa - Piauí 2 Eleotris sp3 -2,774285 -41,848885

Estuário do Rio Benevente- Espírito Santo 6 Eleotris sp3 -2,0634338 -40,691454

Na topologia de CO1, as espécies G. guavina e D. dormitator formaram clados

com 100% de similaridas com suas espécies correspondentes provenientes do GenBank.

Nas topologias que foram obtidas, os espécimes do gênero Eleotris amostrados na costa

brasileira formaram três diferentes linhagens genéticas as quais foram altamente

suportadas por valores de bootstrap.

Na topologia de CO1, os espécimes de Santana e Ilha de Mosqueiro formaram a

Linhagem Norte 1, e apresentaram uma divergência nucleotídica de 10,7% com a

espécie E. amblyopsis e 13,3% com as amostras que correspondem a seu grupo-irmão,

formado por espécimes de Bragança, Curuça e Ilha do Marajó (Linhagem Norte 2).

As espécimes da Linhagem Norte 2 formaram um clado com a espécie

E.amblyopsiscoletada no Panamá, com uma média de divergência genética de 6,5%.

Os espécimes coletadas no Espírito Santo e Piauí formaram um terceiro o clado

Linhagem Nordeste-Sudeste,mostrando uma divergência nucleotídica de 15,3% com E.

amblyopsis, 15,8% com a linhagem Norte 1, e 18,2% com a linhagem Norte 2 (Figura 4

e Tabela 2) .

Figura 4: Topologia de Agrupamento de Vizinhos mostrando as espécies de Eleotridae e

as três diferentes linhagens de Eleotris capturados na costa brasileira.

Tabela 2: Matriz de divergência nucleotídica (K2P) do gene CO1, entre as espéciesde

Eleotridae e os diferentes grupos (linhagens) de Eleotris coletados na costa do Brasil

(marcadas em cinza).

1 2 3 4 5 6 7 8

1 Linhagem Norte 1

2 Linhagem Norte 2 13,3

3 Linhagem Nordeste - Sudeste 15,8 18,2

4 Eleotris amblyopsis 10,7 6,5 15,3

5 Guavina guavina 22,7 19,3 26,6 21,8

6 Guavina guavina GenBank 22,6 19,5 26,4 21,3 0,4

7 Dormitator maculatus 24,1 19,0 23,9 20,6 15,0 15,0

8 Dormitator maculatus GenBank 23,8 18,4 24,0 20,3 14,8 14,7 0,5

A topologia concatenada de Inferência Bayesiana com o marcador mitocondrial

COI e o nuclear ZIC1, mostraram a separação das três linhagens (Norte 1, Norte 2 e

Nordeste-Sudeste) (Figura 5), suportadas por altos valores de probabilidade. A matriz

de divergência nucleotídica baseada no gene Zic 1 é mostrada na Tabela 3.

Figura 5: Árvore concatenada de Inferência Bayesiana, com os marcadores CO1 e Zic 1,

mostrando a separação entre a espécie E.pisonis (GenBank) e as linhagens de Eleotris

capturadas na costa brasileira.

Tabela 3: Matriz de distância nucleotídica (distância p) do gene Zic1 mostrando as

divergências entre a espécie Eleotris pisonis e as linhagens de Eleotris coletadas na

costa do Brasil (marcadas em cinza).

1 2 3 4 5 6 7

1 Linhagem Norte 1 - 161

2 Linhagem Norte 2 - 92 0,4

3 Linhagem Nordeste Sudeste - 286 0,4 0,0

4 Eleotris pisonis (GenBank) 2,0 1,6 1,6

5 Eleotris picta - 2880 2,0 1,6 1,6 0,4

6 Eleotris picta (GenBank) 2,0 1,6 1,6 0,4 0,0

7 Odontobutis obscura 6,5 6,1 6,1 6,9 7,1 7,1

DISCUSSÃO

Segundo (Hebert et al. 2003), o gene mitocondrial, citocromo oxidase

subunidade I (CO1), pode servir como o núcleo de um sistema global para

bioidentificação de espécies animais.

No presente estudo observou-se através das análises moleculares que o gene

CO1 foi eficaz para o reconhecimento das espécies de Eleotridae coletadas na costa do

Brasil, pois as divergências entre as linhagens foram muito altas quando comparadas ao

valor interespecífico de 2% proposto pelo DNA Barcode de Herbert et al. (2003).

Estas análises revelaram três desconhecidas linhagens evolucionárias dos

Eleotriscoletados neste estudo, com valores de distância observados que variaram entre

6,2% e 19%,e que equivalem aos valores que separam as espécies como E. amblyopsis,

E. pisonis, E. picta e E. fusca.

A topologia de CO1 foi exata em mostrar que tanto a Linhagem Norte 1

(Santana e Ilha de Mosqueiro), a Linhagem Norte 2 (Curuçá, Bragança e Ilha do

marajó) e a Linhagem Nordeste-Sudeste (Espírito Santo) até então são desconhecidas,

devido ao fato de mostrarem alta divergência genética (>2%) com a espécie E.

amblyopsis.

Foi gerada a topologia concatenada de Inferência Bayesiana, utilizando o gene

mitocondrial CO1 e o gene nuclear Zic 1, os quais mostrou a separação das três

linhagens (Linhagem Norte1, Linhagem Norte 2 e Linhagem Nordeste-Sudeste), e a

diferença com a típica espécie conhecida na costa brasileira E. pisonis, diferenças

suportadas por altos valores de probabilidade.

Verificou-se que os três morfotipos do presente estudo foram segregados de

acordo como tipo de ambiente onde foram coletados; os Eleotris da linhagem Norte 1,

foram coletados em ambientes de várzea, com baixa salinidade influenciada pelas

descargas do rio Amazonas e Pará, respectivamente. Os Eleotris da linhagem Norte 2,

foram capturados em manguezais de macromaré super úmidos típicos das localidades de

Bragança, Curuçá e Ilha de Marajó, enquanto que os Eleotris pertencentes à linhagem

Nordeste-Sudeste dos estados do Piauí e Espírito Santo correspondem a ambientes de

maguezais tropicais.

Segundo Marceniuket al (2013) a respeito da conservação e conhecimento dos

peixes marinhos e estuarinos da costa norte do Brasil, os principais estudos com tais

peixes são provenientes das região nordeste e sudeste; logo, a grande e rica diversidade

marinha da costa norte brasileira pode evidenciar uma fauna desconhecida, ainda que

trabalhos estejam sendo produzidos para o conhecimento a respeito da composiçãoe

distribuição espaço-temporal dos peixes marinhos-estuarinos (Barletta et al., 2000;

Barletta - Bergan et al., 2002; Camargo & Isaac, 2002; Barletta etal., 2003, Giarrizzo et

al., 2006).

Os peixes que pertencem à família Eleotridae mesmo sendo citados como

ocorrentes nessas devidas áreas ainda é um grupo não conhecido em seus detalhes, tanto

pela sua taxonomia quanto pelos seus termos genéticos.

REFERÊNCIAS

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