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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS MARINA DAS NEVES GOMES AVALIAÇÃO DO EFEITO GENOTÓXICO DA ELETROTERAPIA EM ASSOCIAÇÃO À NANOTECNOLOGIA Rio de Janeiro 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MARINA DAS NEVES GOMES
AVALIAÇÃO DO EFEITO GENOTÓXICO DA ELETROTERAPIA EM
ASSOCIAÇÃO À NANOTECNOLOGIA
Rio de Janeiro
2015
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MARINA DAS NEVES GOMES
AVALIAÇÃO DO EFEITO GENOTÓXICO DA ELETROTERAPIA EM
ASSOCIAÇÃO À NANOTECNOLOGIA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Orientadores: Profª. Drª. Carla Holandino Quaresma
Prof. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão
Rio de Janeiro
2015
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MARINA DAS NEVES GOMES
AVALIAÇÃO DO EFEITO GENOTÓXICO DA ELETROTERAPIA EM ASSOCIAÇÃO À NANOTECNOLOGIA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Aprovada em: Orientador: ________________________________________
Profª. Drª. Carla Holandino Quaresma Faculdade de Farmácia – UFRJ
________________________________________ Prof. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ Banca Examinadora:
________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Ricci Júnior
Faculdade de Farmácia – UFRJ
_________________________________________ Profa. Marcia Alves Marques Capella
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ
_______________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Soares Fortunato
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ
________________________________________ Prof. Dr. Alexadre dos Santos Pyrrho
Faculdade de Farmácia – UFRJ Revisor
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Dedico este trabalho ao meu saudoso e amado
pai, à minha pequena Heloisa e à minha família.
Eles são o meu apoio, onde sinto calma, paz e amor.
Minhas conquistas só foram possíveis porque eles
estavam lá, me ajudando, trazendo tranquilidade,
me incentivando com cada palavra, gesto e sorriso.
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AGRADECIMENTOS
Meu primeiro agradecimento é para a Profª Drª Carla Holandino, não apenas
por ter sido minha professora na graduação, orientadora no mestrado e no atual
trabalho, mas por ter me aceito no seu laboratório e, principalmente por ter me
apresentado uma série de procedimentos complementares na medicina, o que me
fez “pensar fora da caixa” como se diz popularmente. Para mim ela é uma excelente
pesquisadora, principalmente na área da homeopatia e da eletroterapia, e não sei se
por coincidência, ou por respeitá-la e ter uma grande admiração pelo seu trabalho,
acabei me apaixonando e me envolvendo com as duas áreas.
Agradeço toda a orientação do Prof. Dr. Alvaro Leitão. Considero o Prof.
Alvaro um orientador ideal, aquele que está ao seu lado na bancada, da mesma
forma que está ao seu lado corrigindo seu texto, nos detalhes. Um mestre que em
meio a sorrisos e gritos “à moda italiana” faz de tudo para conseguir o melhor para o
laboratório, e desta forma cativa a todos.
Agradeço ao Prof. Dr. Rodrigo Fortunato e ao MSc. Igor Monteiro todo o apoio
nos ensaios. Vocês foram fundamentais nos ensinamentos, no acompanhamento e
principalmente ao demonstrarem a forma tranquila e eficiente que trabalham.
Ao Prof. Dr. Cristiano Ponte, por todo o treinamento na manipulação de
animais, na construção do micromanipulador, equipamento essencial para o
trabalho, pela ajuda nos ensaios cardíacos, e principalmente pela enorme amizade e
carinho.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Bissagio pela ajuda no tratamento dos animais e na
microscopia e por toda tranquilidade e carinho que tratou nosso trabalho.
A Profª. Drª. Luisa Endres Ribeiro da Silva e ao Prof. Dr. Marcos Telló pela
colaboração com os cálculos.
A Profª. Drª. Helena Zamith que nos ajudou em muitas dúvidas de protocolo
dos ensaios de genotoxicidade, sempre muito atenciosa.
vi
A Profª Drª. Morgana Castelo Branco e ao MSc. Venicio Veiga pela ampla
contribuição em toda a parte de microscopia do trabalho.
Ao veterinário patologista Dr. Nelson Bretas que nos auxiliou com a leitura
das lâminas de microscopia e acrescentou muito com suas colocações e
questionamentos.
Aos meus queridos orientados Ana Carolina de Carlos, Bruno Carneiro, Juan
Martinez, Kelly Abrahão, Maria Luíza Honório e Mariana Maia. Vocês foram
essenciais para o desenvolvimento deste trabalho. Aprendemos, estudamos,
discutimos, rimos e até cantamos durante este tempo. Espero ter ensinado o tanto
quanto aprendi com vocês.
Agradeço a Janine Cardoso, Leonardo Vidal, Gleyce Moreno Barbosa e Bruna
Peçanha técnicos de extrema competência, que mantêm toda organização e
estrutura dos laboratórios e ainda conseguem tempo para ajudar a montar
protocolos, e realizar os experimentos com muita paciência e disposição.
Aos amigos do Laboratório de Radiobiologia Molecular, Gabriela, Jéssica,
Juliana, João, Stephan, Tula, obrigada pelas informações, pelos momentos de
descontração, por terem me recebido tão bem. Um agradecimento especial a
Tatiana que nos auxiliou com alguns questionamentos que geraram novos ensaios e
a Rita de Cássia, a Ritinha, sempre muito carinhosa, atenciosa e animada, um
agradecimento por manter o laboratório funcionando e por ter “dado um jeitinho”
sempre que precisávamos.
A Grethel Mejia, colombiana querida, que me auxiliou com os experimentos
de cometa, com muita calma e disposição.
Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar de Ciências Farmacêuticas, Ana
Paula, Francielle, Fortune, Isadora, Vânia e principalmente a Gleyce e ao Felipe por
toda a ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
A Profa. Drª. Yraima Cordeiro, banca de acompanhamento por todas as
contribuições e ao Prof. Dr. Alexandre Pyhrro que além de me acompanhar nas
bancas de acompanhamento do mestrado e doutorado, fez diversos
questionamentos e correções que somaram muito ao projeto e na finalização deste
trabalho.
vii
Aos velhos e novos amigos por acompanharem mais uma jornada.
Ao Instituto Federal do Rio de Janeiro, onde me formei e hoje sou professora,
por toda colaboração para a realização deste trabalho, pelos editais com os quais
consegui dar andamento ao projeto, e pela equipe de farmácia que compreendeu e
contribuiu no uso do laboratório.
E meu agradecimento maior, a minha família, por terem me apoiado sempre,
em todas as minhas escolhas, pelos conselhos sempre no momento certo, pelo
amor incondicional, devo tudo a vocês. A minha mãe, a pessoa mais incrível que
conheço, lutadora, justa, inteligente, cheia de ideais e idéias maravilhosas,
apoiadora em tudo que faço. Aos meus amados irmãos Luiza, João Paulo, Priscilla e
Bernardo, meu sobrinho Pedro, a pessoinha mais encantadora, a Dita por todos os
cuidados e ajuda e ao meu companheiro de passeios e brincadeiras Alpes.
Agradeço, ao meu esposo, Nelson, pelas palavras de incentivo, pelo amor.
Passamos juntos por esta difícil fase de conclusão de trabalho e unidos nos
esforçamos e nos apoiamos. Te amo e agradeço sempre por ter você na minha vida.
E principalmente um agradecimento cheio, repleto, de muito amor e saudades
ao meu pai, Heitor Flavio, que nos deixou há pouco tempo apenas em matéria, pois,
seus ensinamentos, colocações e principalmente, seu apoio repercutem, e muito,
em nós. Lembrar de suas palavras, de seus gestos, foram incentivos muito
importantes para a conclusão deste trabalho. E claro, um agradecimento especial a
essa filha linda, Heloisa, que carrego comigo, a quem eu já amo tanto e de forma tão
intensa. Mesmo sem saber é a maior incentivadora da conclusão desta jornada!
viii
“E aqueles que foram vistos dançando foram julgados
insanos por aqueles que não podiam escutar a música.”
Friedrich Nietzsche
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa do mundo com os tipos de câncer mais comuns, para o sexo feminino (primeiro gráfico) e para o sexo masculino (segundo gráfico), simbolizados por cor............................................................................................. 25 Figura 2. Mortalidade por câncer, no Brasil, dada em porcentagem, para homens e mulheres, entre os anos de 2002 e 2012............................................. 26 Figura 3. Representação esquemática da corrente contínua, ou seja, corrente que não possui sua polaridade modificada ao longo do tempo............................ 29 Figura 4. Gráfico representando a corrente alternada......................................... 30 Figura 5. Esquema representativo da inserção de eletrodos no tumor por meio da cerclagem......................................................................................................... 36 Figura 6. Esquema representativo dos mecanismos de ação da eletroterapia no tratamento de tumor, separando os fenômenos que ocorrem no tecido em contato com o pólo positivo, ânodo, dos que ocorrem no pólo negativo, cátodo. 40 Figura 7. Representação esquemática do ciclo catalítico da glutationa.............. 46 Figura 8. Eventos da divisão celular.................................................................. 63 Figura 9. Representação esquemática do sistema experimental de 24 poços usado para estímulo elétrico in vitro..................................................................... 71 Figura 10. Foto do micromanipulador, construído para melhor inserção das agulhas nos animais............................................................................................. 78 Figura 11. Imagem ilustrativa dos lóbulos do fígado de um camundongo. Lóbulo mediano, esquerdo, direito e o lóbulo caudado........................................ 79 Figura 12. Sistema experimental para estímulo elétrico in vivo........................... 81 Figura 13. Foto demonstrando a aplicação de ETT em camundongo................. 83 Figura 14. Esquema demonstrando os tempos de cada carga aplicada nos camundongos........................................................................................................ 84 Figura 15. Esquema respresentando a eritropoiese, ou seja, a sequência para a formação de eritrócitos no sangue periférico..................................................... 86 Figura 16. Foto do camundongo, anestesiado e na posição de decúbito dorsal, em placa de isopor, apresentando três eletrodos fixados externamente, por meio de um fio de aço inserido subcutaneamente...............................................
89
x
Figura 17. Camundongo com cateter intravascular inserido na artéria carótida, após anestesia.....................................................................................................
90
Figura 18. O grupamento tiol reage com o DTNB-2, clivando o disulfeto, levando a formação de 2-nitro-5-benzoato (TNB-2) que possui uma cor amarela intensa a 412 nm..................................................................................... 93 Figura 19. Por detecção espectrofotométrica é possível monitorar glutationa, empregando-se como substância cromogênica o ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzóico), DTNB.......................................................................................... 94 Figura 20. Resposta da cepa TA97 para o ensaio de AMES.............................. 100 Figura 21. Resposta da cepa TA98 para o ensaio de AMES.............................. 101 Figura 22. Resposta da cepa TA100 para o ensaio de AMES............................ 102 Figura 23. Resposta da cepa TA102 para o ensaio de AMES............................ 103 Figura 24. Foto das lâminas de histologia do lóbulo do fígado de camundongos C57BL/6.........................................................................................
106 Figura 25. Análise da quantidade de micronúcleos em eritrócitos de sangue periférico de camundongos................................................................................. 107 Figura 26. Gráfico do resultado da medição de pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) e da frequência cardíaca (FC) ao longo do tempo.................. 109 Figura 27. Resultado da leitura das amostras pelo método de Amplex red........ 110 Figura 28. Resultado da leitura das amostras pelo método de quantificação do grupamento Tiol.................................................................................................. 111
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LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1. Relação das cepas de Salmonella typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA102), com caráter genético relevante e o que causam os agentes mutagênicos nestas cepas (MARON & AMES, 1983)........................................................................
68 Quadro 2. Quadro resumindo os quatro tempos de retiradas de alíquotas das cepas TA97, TA98, TA100 e TA102, após passagem de corrente elétrica contínua, na ausência de nanopartículas de L-tirosina e quando acrescentados da suspensão de nanopartículas, nos três fluxos, anódico (FA), catódico (FC) e eletro-iônico (FEI).......
73
Quadro 3. Resumo dos efeitos dos anestésicos xilazina e cetamina, utilizados nos experimentos in vivo (adaptado de Bayer, 2014)..........................................................
76
Quadro 4. Divisão dos grupos de animais para o ensaio de genotoxicidade...............
82
Tabela 1. Ensaio de citotoxicidade das cepas TA97, TA98, TA100 e TA102, após estímulo com cargas de 1,44 C; 2,16 C; 2,88 C e 3,6 C, na ausência de nanopartículas e na presença de nanopartículas de L-tirosina.....................................
98
xii
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1. Reação de eletrólise da água decorrente dos efeitos do polo positivo (ânodo-oxidação): liberação de oxigênio, íons hidrogênio e acidificação do meio eletrolítico...........................................................................
38
Equação 2. Reação de eletrólise da água decorrente dos efeitos do polo negativo (cátodo-redução): liberação de íons hidroxila e de gás hidrogênio....... 38 Equação 3. Sequência de reações que ocorrem no ânodo gerando cloraminas............................................................................................................ 39 Equação 4. Reação de elimação do radical superóxido, catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD), enzima que acelera a dismutação do radical superóxido, quando em pH fisiológico, formando peróxido de hidrogênio e oxigênio........................................................................................... 43 Equação 5. Reação de Fenton, nome dado à oxidação de ferro (II) a ferro (III) pelo peróxido de hidrogênio, produzindo espécies com alto poder oxidante como o radical hidroxil..........................................................................................
43 Equação 6. Reação que representa o equilíbrio entre a glutationa reduzida, GSH e a glutationa oxidada GSSG (dimerizada da GSH)................................... 46
xiii
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Preparo de soluções............................................................................ 144 Anexo 2. Aprovação do Comitê de Ética de no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob o número de referência FARMACIA011-06/16....................................................................................... 147 Anexo 3. Aprovação do Comitê de Ética de no Uso de Animais do Instituto Federal do Rio de Janeiro sob o número de referência 003-2014..................... 148
xiv
SÍMBOLOS E UNIDADES
A ............................ Ampère A/O/A ............................ Água/óleo/água
BPF ............................ Baixo ponto de fusão BSA ............................ Albumina de soro bovino, do inglês bovine serum albumin
C ............................ Coulomb C/cm ............................ Coulomb por centímetro
C/s ............................ Coulomb por segundo CC ............................ Corrente contínua
Cél/mL ............................ Células por mililitro DC ............................ Débito cardíaco
DCM ............................ Diclorometano DDP ............................ Diferença de potencial DNA ............................ Ácido desoxirribonucleico, do inglês deoxyribonucleic acid
EDTA ............................ Etilenodiaminotetracético EMS ............................ Etilmetanosulfonato ERO ............................ Espécie reativa de oxigênio ETT ............................ Eletroterapia
FA ............................ Fluxo anódico FC ............................ Fluxo catódico FEI ............................ Fluxo eletro-iônico
J/m2 ............................ Joule por metro quadrado LB ............................ Lysogeny-Broth
mA ............................ Miliampère MEVB ............................ Meio Vogel-Bonner mg/kg ............................ Miligrama por kilograma
mg/mL ............................ Miligrama por mililitro mM ............................ Milimolar
NCE ............................ Eritroblasto normocromático, do inglês normochromatic
erythrocytes nM ............................ Nanomolar ºC ............................ Graus Celsius p/v ............................ Peso por volume
PAS ............................ Pressão arterial sistólica PAD ............................ Pressão arterial diastólica PBS ............................ Tampão salina fosfato, do inglês phosphate buffered saline
PCE ............................ Eritroblasto policromático, em inglês polychromatic
erythrocyte PCL ............................ Poli-ε-caprolactona PFN ............................ Ponto de fusão normal
pH ............................ Potencial hidrogeniônico PVA ............................ Álcool polivinílico, do inglês polyvinyl alcohol
RVPT ............................ Resistência vascular periférica total UFC ............................ Unidade formadora de colônia
UV-C ............................ Ultravioleta C V ............................ Volts
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RESUMO
GOMES, Marina das Neves. Avaliação do efeito genotóxico da eletroterapia em associação à nanotecnologia. Rio de Janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.
Câncer é uma das principais causas de morte no mundo, e até 2030 estima-
se 21 milhões de mortes por esta doença. O tratamento desta enfermidade pode ser
por método convencional, como com o uso de radioterapia, cirurgia e quimioterapia
ou complementar e/ou alternativo, como, por exemplo, com uso de corrente elétrica
constante. O uso da corrente elétrica constante no tratamento do câncer é chamado
de eletroterapia tumoral (ETT). Na ETT o tecido é tratado com uma corrente
constante de baixa intensidade (20 A a 200 mA), por meio de dois ou mais
eletrodos, colocados dentro do tumor ou próximo ao mesmo. Os eletrodos são
conectados a uma fonte elétrica que gera a energia necessária para assegurar um
fluxo de corrente. A ETT pode ser aplicada em combinação com outras terapias,
como com a adição do ácido aminado L-tirosina, na forma encapsulada de
nanopartículas (Nps) de poli-Ɛ-caprolactona. A reação deste ácido aminado com
derivados de cloro, gerados na estimulação elétrica, leva à geração de cloraminas,
que são agentes indutores de apoptose. O mecanismo de ação da ETT possui
algumas vertentes, mas, ainda não foi completamente elucidado. Por exemplo, não
se tem esclarecido o papel de espécies reativas de oxigênio na ETT. Também não
se tem respostas quanto à sua atividade genotóxica e mutagênica, dado
fundamental para a aceitação do tratamento por agências regulatórias. A ação da
ETT na fisiologia cardíaca também não é explicada. Desta forma, este trabalho se
propõe a ampliar os conhecimentos sobre a ETT, especificamentes nos tópicos
citados. Para tal, avaliou-se a mutagenicidade pelo teste de mutação reversa
bacteriana (teste de AMES) em ensaios in vitro, com cepas de Salmonella
typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA102). A carga utilizada foi de 1,44 C na
ausência de Nps e 2,16 C na presença das mesmas. O resultado do ensaio
demonstrou que a corrente elétrica não leva à mutagenicidade. Foram analisados
danos no cromossomo ou segregação cromossômica através da quantidade de
micronúcleos, em sangue periférico de camundongos C57Bl/6, utilizando-se uma
xvi
carga de ETT de 2,4 C, e, não se observou alterações deste tipo no ensaio.
Examinou-se a resposta cardíaca dos camundongos C57Bl/6 durante a aplicação de
2,4 C por meio de análise eletrocardiográfica e aferição da pressão arterial sistólica,
diastólica e média, onde se observou uma elevação da pressão arterial sistólica
acompanhada da pressão arterial diastólica, além de diminuição da frequência
cardíaca. O estresse oxidativo causado pelo tratamento por ETT foi verificado in
vivo, em camundongos C57Bl/6, pelos ensaios de Amplex Red e de quantificação de
tiol. Estes ensaios indicaram que a passagem de corrente elétrica não aumentou os
níveis de espécies reativas de oxigênio no fígado, em camundongos C57Bl/6.
Alterações histológicas em hepatócitos tratados por ETT, em camundongos C57Bl/6,
foram analisadas por microscopia óptica e foram encontradas alterações histológicas
em hepatócitos tratados com o fluxo catódico, alterações como hiperemia e
degeneração moderada. Um maior número de dados sobre o mecanismo de ação
da terapia é necessário, mas, os resultados obtidos neste estudo são favoráveis à
terapia, demonstrando sua segurança a curto e longo prazo, fator indispensável para
seu uso em larga escala e aprovação por agências regulatórias.
Palavras-chave: Eletroterapia tumoral; Nanotecnologia; Genotoxicidade;
Mutagenicidade; Espécies reativas de oxigênio
xvii
ABSTRACT
GOMES, Marina das Neves. Evaluation of the genotoxic effect of electrotherapy in association with nanotechnology. Rio de Janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.
Cancer is one of the leading causes of death in the world, and it is estimated
that 21 million people will have died of this disease by 2030. This infirmity can be
treated with conventional method, e.g. with use of radiotherapy, surgery and
chemotherapy, or with complementary and/or alternative method, e.g. with use of
constant electric current. The use of constant electric current in the treatment of
cancer is called tumoral electrotherapy (ETT). In ETT, the tissue is treated with a low
intensity constant current (20 A to 200 mA), through one or more electrodes, placed
inside the tumor or next to it. The electrodes are connected to an electrical source
that generates the necessary energy to assure a current flow. The ETT can be
applied in combination with other therapies, e.g. with the addition of amino acid L-
tyrosine, in the encapsulated form of poly-Ɛ-caprolactone nanoparticles (Nps). The
reaction of this amino acid with chlorine derivatives generated in the electric
stimulation produces chloramines, which are apoptosis inducing agents. The
mechanism of action of ETT has some components, but hasn’t yet been completely
elucidated. For instance, the role of reactive species of oxygen in the efficacy of ETT
is unclear. There are no clues as to its genotoxic and mutagenic activities, which is
fundamental information for the acceptance of the treatment by regulatory agencies.
The action of ETT in cardiac physiology remains unexplained as well. Thus, this work
intends to broaden the knowledge of ETT, specifically in the aforementioned topics.
To this aim, mutagenicity was evaluated through bacterial reverse mutation test
(Ames test) in in vitro assays, with Salmonella typhimurium strains (TA97, TA98,
TA100 and TA102). In the absence of Nps, a dose of 1.44 C was used, and a dose of
2.16 C was used in their presence. The result of the assay demonstrated that the
electric current does not lead to mutagenicity. Possible damages to chromosome or
chromosome segregation were analysed through micronucleus frequency, in
peripheral of C57Bl/6 mice, using 2.4 C, and the results were negative. The cardiac
response of C57Bl/6 mice during the application of 2.4 C was examined through
electrocardiographic analysis and systolic, diastolic and average arterial pressure,
and an elevation of the systolic arterial pressure followed by an elevation of the
xviii
diastolic arterial pressure, as well as a lower heart rate, was observed. The oxidative
stress caused by treatment with ETT was verified in vivo, in C57Bl/6 mice, through
Amplex Red and thiol quantification assays. These assays indicated that the passage
of electric current did not increase the levels of reactive oxygen species in the liver, in
C57Bl/6 mice. Histologic alterations in hepatocytes treated with ETT, in C57Bl/6
mice, were analysed through optical microscopy, and histologic alterations, such as
hyperemia and moderate degeneration, were found in hepatocytes treated only with
the cathodic flow. More information on the mechanism of action of this therapy is
necessary, but the results obtained in this study are favorable to the therapy,
demonstrating its safety in short and long term – which is indispensable for its use on
a large scale and its approval by regulatory agencies.
Keywords: Electrotherapy tumoral; Nanotechnology; Genotoxicity; Mutagenicity;
Reactive oxygen species
xix
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO........................................................................................................... 21 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Câncer........................................................................................................ 24 1.1.1 Modalidades convencionais de tratamento contra o câncer........ 26 1.1.2 Tratamento complementar e alternativo contra o câncer............. 27
1.2 Eletricidade - Conceitos Básicos................................................................ 28 1.2.1 Corrente elétrica........................................................................... 29
1.3 Uso da eletricidade na saúde..................................................................... 30 1.4 Eletroterapia tumoral.................................................................................. 31
1.4.1 Pioneirismo da ETT...................................................................... 32 1.4.2 Aplicação da Eletroterapia Tumoral............................................. 33
1.4.2.1 Eletrodos......................................................................... 34 1.4.2.2 Dose................................................................................ 37 1.4.2.3 Mecanismo de ação da eletroterapia.............................. 37
1.4.2.3.1 Espécies reativas de oxigênio .......................... 41 1.4.2.4 Vantagens e desvantagens do tratamento tumoral por eletroterapia................................................................................ 47 1.4.2.5 Alterações cardíacas com tratamento por corrente elétrica........................................................................................ 49 1.4.2.6 Associações da eletroterapia com outras terapias........ 50 1.4.2.7 Aplicação da ETT em animais........................................ 53 1.4.2.8 Resultados da aplicação de ETT em humanos..........,.. 56
1.5 Avaliação do potencial genotóxico............................................................ 61 1.5.1 Ensaio de mutação reversa bacteriana........................................ 61 1.5.2 Micronúcleo ................................................................................. 62
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral........................................................................................... 65 2.2. Objetivos Específicos................................................................................ 65
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material..................................................................................................... 66 3.2 Preparo da suspensão de nanopartículas de L-tirosina............................ 66 3.3 Ensaio de mutagênese in vitro pelo método de AMES.............................. 67
3.3.1 Cepas bacterianas........................................................................ 67 3.3.2 Manutenção das cepas bacterianas............................................. 69 3.3.3 Obtenção das culturas bacterianas para experimentos............... 69 3.3.4 Sistema experimental in vitro....................................................... 70 3.3.5 Ensaio de citotoxicidade celular bacteriana após estímulo elétrico................................................................................................... 71 3.3.6 Ensaio de mutagênese pelo método de AMES............................ 72
3.4 Ensaios in vivo........................................................................................... 74 3.4.1 Animais......................................................................................... 74 3.4.2 Sistema experimental in vivo........................................................ 75
xx
3.4.3 Protocolo e carga de corrente elétrica aplicada............................ 77 3.4.4 Preparo do material para ensaio do micronúcleo........................................................................................... 82 3.4.5 Obtenção de sangue para periférico ensaio de micronúcleo....... 87 3.4.6 Eletrocardiograma....................................................................... 88 3.4.7 Registros da pressão arterial e da frequência cardíaca com cateter intravascular.............................................................................. 89 3.4.8 Avaliação e quantificação de espécies reativas de oxigênio .... 91
3.4.8.1 Tratamento dos animais................................................. 91 3.4.8.2 Manipulação do fígado................................................... 91 3.4.8.3 Dosagem de proteínas................................................... 92 3.4.8.4 Detecção de geração de espécie reativa por Amplex Red............................................................................................. 93 3.4.8.5 Quantificação do grupamento Tiol.................................. 94
3.4.9 Estudo histológico por microscopia óptica................................... 95 3.5 Avaliação estatística.................................................................................. 96
4. RESULTADOS
4.1 Resultados in vitro...................................................................................... 97 4.1.1 Ensaio de citotoxicidade celular bacteriana após estímulo
elétrico ....................................................................................... 97 4.1.2 Ensaio de mutagênese pelo método de AMES.......................... 99
4.2 Resultados in vivo.................................................................................... 104 4.2.1 Escolha da carga de corrente elétrica a ser aplicada nos
ensaios........................................................................................ 104 4.2.2 Estudo histológico por microscopia óptica.................................. 104 4.2.3 Ensaio de micronúcleo com sangue periférico........................... 106 4.2.4 Registros da pressão arterial e da frequência cardíaca com
cateter intravascular.................................................................. 107 4.2.5 Avaliação e quantificação de espécies reativas de oxigênio
total............................................................................................ 109 4.2.6 Detecção de geração de espécie reativa por Amplex
Red............................................................................................. 109 4.2.7 Quantificação do grupamento Tiol................................................ 111
5. DISCUSSÃO 112 6. CONCLUSÃO 121 7. PERSPECTIVAS 123 REFERÊNCIAS 126
21
INTRODUÇÃO
Dentre os vários efeitos da interação de correntes elétricas com o material
biológico destacamos a atividade antitumoral que originou a eletroterapia tumoral
(ETT). Na ETT os eletrodos são colocados de forma invasiva, na região a ser
tratada, por onde ocorre passagem de corrente elétrica contínua constante, de baixa
intensidade, o que resulta em destruição celular (NORDENSTRÖM, 1983, 1984;
TELLÓ et al., 2004; VEIGA et al., 2005).
Os estudos da eletroterapia tumoral tiveram início, na década de 70, com um
médico radiologista sueco, Björn E. W. Nordenström. Em 1983, Nordenström
publicou um livro com resultados do tratamento de 26 tumores pulmonares em 20
pacientes (alguns pacientes apresentavam mais de um nódulo nos pulmões).
Nestes, obteve uma regressão em 12 dos tumores, sem sinal de reaparecimento dos
mesmos após um período entre 2 a 5 anos (NORDENSTRÖM, 1983). Em 1987
levou sua experiência para a China e em 1989, a ETT foi aprovada pelo Ministério
de Saúde Pública da China como uma das opções de tratamento para tumores (XIN,
1994, 1998).
Vários têm sido os trabalhos publicados mostrando os resultados positivos da
ETT para o tratamento de tumores em humanos, animais e em cultura de células
(TAYLOR et al., 1994; XIN, 1998; WEMYSS-HOLDEN et al., 2000; HOLANDINO et
al., 2001; FOSH et al., 2003; von EULER et al., 2001, 2003; MORRISON et al., 2004;
VEIGA et al., 2005; JARQUE et al., 2007; TELLÓ et al., 2007; CAMPOS et al.,
2010).
O mecanismo de ação da ETT ainda não foi completamente compreendido.
Entretanto, alguns aspectos importantes foram elucidados. No tratamento
eletroquímico as principais reações anódicas envolvem a formação de oxigênio, a
acidificação do pH, devido aos íons de hidrogênio liberados e a formação de cloro.
No cátodo, o hidrogênio é formado e íons hidroxila são liberados, levando assim, a
alcalinização do meio. Esta variação de pH e os produtos de eletrólise formados
parecem ser os responsáveis pela destruição das células após aplicação da corrente
elétrica de baixa intensidade (VEIGA et al., 2000; von EULER et al., 2002;
HOLANDINO et al., 2014).
22
Detecta-se ainda, a ocorrência de necrose, induzida tanto pela estimulação
anódica quanto catódica e movimento eletroosmótico da água, na direção do cátodo,
causando desidratação na área anódica e edema na catódica (VIJH, 2004).
A estimulação anódica leva também a geração de espécies oxidantes
denominadas de cloraminas. Cloraminas orgânicas são formadas pela reação de
aminas, como as que estão presentes nos ácidos aminados, com ácido hipocloroso
(FURNESS-GREEN et al., 1998; VEIGA et al., 2000, 2005). A cloramina é capaz de
inibir o ciclo celular, de maneira tempo-dose dependente, induzindo a morte celular,
por processo apoptótico (NAITO et al., 1997).
Estudos espectrofotométricos mostram que ao incubar diferentes ácidos
aminados com HOCl, aqueles são convertidos imediatamente (dentro de segundos)
em cloraminas, que tem um pico de absorção característico em 252 nm. Nesta
relação de ácidos aminados para HOCl (4:1), não houve HOCl detectável
remanescente depois de ter sido adicionado as misturas de ácidos aminados
(ENGLERT & SHACTER, 2002). As cloraminas têm diferentes níveis de estabilidade,
dependendo da química do grupo amino modificado; por exemplo, lisina e arginina
podem ser de longa e de curta duração, respectivamente, pois, têm grupos amino
adicionais que podem reagir com HOCl para formar cloramina de diferentes
estabilidades (ENGLERT & SHACTER, 2002).
Durante a ETT não ocorrem variações significativas na temperatura dos
tecidos e órgãos e, portanto, a morte celular não pode ser atribuída a variações
térmicas (DAVID et al., 1985; TELLÓ et al., 2004). Em contrapartida, Jarm e
colaboradores demonstraram que a aplicação de corrente contínua induz danos
vasculares na região tumoral, que levam a diminuição da perfusão sanguínea e da
oxigenação, comprometendo, consequentemente, a nutrição do tumor (JARM et al.,
2003).
Além disso, estudos realizados com culturas de células evidenciaram que a
morte celular pode estar associada a alterações morfológicas significativas,
induzidas pela estimulação elétrica, tais como: modificação de glicoconjugados da
superfície; aparecimento de blebs; rupturas na membrana plasmática; alterações
nas mitocôndrias; inchaço celular; rarefação da matriz extracelular; formação de
debris e condensação da cromatina (HOLANDINO et al., 2000, 2001; 2014; VEIGA
et al., 2000, 2005).
23
A eletroterapia também pode ser associada ao ácido aminado L-tirosina. A
inclusão destes ácidos aminados em sistemas nanoparticulados de poli-ε-
caprolactona potencializou em cerca de 6.000 vezes as taxas de mortalidade de
células tumorais, ao se tratar melanomas murinos resistentes a múltiplas drogas
(linhagem B16F10), no uso associado à estimulação elétrica (CAMPOS et al., 2010).
Os promissores resultados obtidos em modelos in vitro foram extrapolados para
camundongos inoculados com melanoma MDR (B16F10), os quais foram tratados
com ETT associada à nanopartículas de L-tirosina (TEIXEIRA, 2010).
Clinicamente a ETT tem demonstrado ser uma terapia segura, efetiva, de fácil
manuseio e baixo custo, quando comparada a terapêuticas usuais, que pode ser
utilizada em pacientes refratários aos tratamentos convencionais (TELLÓ et al.,
2004). Entretanto, o mecanismo de ação, envolvido com esta atividade antitumoral,
ainda não é totalmente compreendido, apesar dos promissores resultados clínicos.
Desta forma, a avaliação do mecanismo de ação, do potencial mutagênico e do
potencial genotóxico da corrente elétrica contínua é um passo fundamental para a
aceitação do tratamento pelas agências reguladoras de saúde e para consolidação
desta terapêutica anticâncer.
24
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Câncer
Câncer é uma doença provocada por células incapazes de formar estruturas
funcionais estáveis, que se multiplicam de forma anárquica, podendo invadir o
organismo e afetar qualquer órgão do corpo (FLOOR et al., 2012). As populações de
células cancerosas revelam muitas propriedades bioquímicas e biológicas, algumas
comuns à maioria dos tipos de câncer, e outras específicas para os diferentes tipos
de tumores. Entre as características comuns sabe-se que em um processo de vários
passos, adquirem uma sucessão de particularidades, como autossuficiência em
fatores de crescimento, ausência de sensibilidade a fatores de inibição de
crescimento, fuga do fenômeno de apoptose, potencial de divisão ilimitado,
angiogênese, metástase, reprogramação metabólica e evasão do sistema imune
(FLOOR et al., 2012).
No mundo, o câncer é uma das principais causas de morte por doença, e foi
responsável por 7,6 milhões de mortes em 2008 (WHO, 2015). Estes números
deverão aumentar para 21 milhões até 2030 (WHO, 2015). A Figura 1 representa
através de um mapa-múndi os tipos de câncer que ocorrem com maior frequência,
no sexo masculino, que são os de pulmão e brônquios, seguidos de próstata, e no
sexo feminino, onde a maior incidência acontece com câncer de mama (ACS, 2011;
WCRF, 2015). No Brasil, a mortalidade por câncer vem aumentando ao longo dos
anos. A Figura 2 representa um gráfico da taxa de mortalidade por câncer, no Brasil,
dada em porcentagem, por tempo, em anos, no período de 2002 a 2012. Neste
gráfico é possível verificar um aumento de cerca de 2,4 % de novos casos em 10
anos, ou seja, cerca de 4 milhões e 800 mil mortes no país, causadas por câncer
(INCA, 2015a).
25
Figura 1. Mapa do mundo com os tipos de câncer mais comuns, para o sexo feminino (primeiro gráfico) e para o sexo masculino (segundo gráfico), simbolizados por cor. A legenda indica a relação entre a cor apresentada no mapa e o tipo de câncer mais comum no país. Observa-se que no sexo masculino os tipos de câncer mais comuns são os de pulmão e brônquios, apresentados na cor azul, seguidos do câncer de próstata, de coloração roxa e no sexo feminino a maior incidência ocorre para o câncer de mama, visualizada em cor rosa. Fonte: adaptado de ACS, 2011.
26
Figura 2. Mortalidade por câncer, no Brasil, dada em porcentagem, para homens e mulheres, entre os anos de 2002 e 2012. Observa-se um aumento na mortalidade, causada por câncer, em 10 anos (2002 a 2012). Fonte: adaptado de INCA 2015a.
1.1.1 Modalidades convencionais de tratamento contra o câncer
Importantes avanços na abordagem do câncer aconteceram nos últimos anos,
porém, a escolha do tratamento varia de acordo com o estadiamento da doença -
local do tumor primário e tipo celular, tamanho e extensão do tumor, se há
propagação para linfonodos, presença de metástase, e grau de malignidade - as
características biológicas do tumor, bem como das condições do paciente (NCI,
2015). Entre as modalidades convencionais de tratamento do câncer, mais
utilizadas, tem-se a radioterapia, a cirurgia e a quimioterapia (INCA, 2015b).
A radioterapia tem o seu fundamento na destruição de células através da
radiação ionizante. Pode ser utilizada para dar alívio ao paciente e melhorar sua
qualidade de vida, diminuir o tamanho dos tumores, diminuir ou estancar
hemorragias ou atuar sobre outros sintomas, como dor. Nesta terapia existe o risco
de toxicidade tardia, geralmente decorrente de alterações inflamatórias nos locais
que receberam radiação. Este risco depende da dose utilizada e da área acometida,
bem como da aparelhagem e do tipo de energia utilizada (ALMEIDA, 2004).
27
A cirurgia continua sendo uma das principais modalidades de tratamento dentro
da oncologia para a maioria dos tumores sólidos. O câncer, em sua fase inicial, pode
ser controlado e/ou curado, através do tratamento cirúrgico, quando este é o
tratamento indicado para o caso. É um tratamento radical, que compreende a
remoção do tumor primário, com margem de segurança e, se indicada, a retirada
dos linfonodos das cadeias de drenagem linfática do órgão-sede do tumor primário.
A margem de segurança, na cirurgia oncológica, varia de acordo com a localização e
o tipo histológico do tumor. Ao contrário do tumor benigno, cuja margem de
segurança é o seu limite macroscópico, o câncer, pelo seu caráter de invasão
microscópica, exige ressecção mais ampla (INCA, 2015c).
A quimioterapia é o método que utiliza compostos químicos, chamados
quimioterápicos. Quando usados no tratamento de doenças causadas por agentes
biológicos ou quando aplicada no combate ao câncer, a quimioterapia é chamada de
quimioterapia antineoplásica. Estes agentes afetam tanto as células normais como
as tumorais, porém, eles acarretam maior dano às células malignas do que às dos
tecidos normais, devido às diferenças quantitativas entre os processos metabólicos
dessas duas populações celulares. Por também atuarem em células normais, os
quimioterápicos são responsáveis por inúmeras reações adversas e efeitos
colaterais (ALMEIDA, 2004).
1.1.2 Tratamento complementar e alternativo contra o câncer
Tratamento complementar e alternativo referem-se a qualquer prática médica ou
produto que não fazem parte do padrão de cuidados médicos (BONACCHI et al.,
2014). O termo complementar refere-se a tratamentos que são utilizados
concomitantemente ao tratamento padrão e alternativo refere-se aos tratamentos
que são usados no lugar do tratamento convencional. Os tratamentos convencionais
são baseados em evidências científicas, já os tratamentos alternativos e
complementares possuem benefícios, comparados aos tratamentos convencionais,
porém, não se tem dados completos sobre sua segurança e seu mecanismo de ação
(VICKERS, 2004; CASSILETH, 2012).
28
Entre os tratamentos complementares e/ou alternativos podemos citar
abordagens mente-corpo (meditação, relaxamento, hipnoterapia), a acupuntura, a
homeopatia, a terapia nutricional (dieta macrobiótica, vegetarianismo), a medicina
tradicional chinesa, terapias baseadas em eletricidade, envolvendo o uso de campos
pulsados, campos magnéticos, corrente alternada e corrente constante (BONACCHI
et al., 2014; OCCAM, 2015).
Este trabalho abordará a terapia complementar/alternativa baseada em
eletricidade, mais especificamente a terapia que faz uso de corrente elétrica
contínua constante.
1.2 Eletricidade - Conceitos Básicos
A base para que exista um fenômeno elétrico é a carga elétrica. A matéria é
composta de átomos e estes de um núcleo com prótons e nêutrons; em volta do
núcleo, gravitam os elétrons. Portanto, existem em cada átomo dois tipos de carga
elétrica, a carga do próton e a do elétron, que por convenção, foram denominadas
de carga positiva e carga negativa, respectivamente. No Sistema Internacional de
Unidades (S.I.), a unidade de carga é o Coulomb (C) (CHAVES, 2001).
Quando modificado por uma força externa (ex. reações químicas, calor, luz,
campo eletromagnético), um átomo pode perder ou ganhar elétrons, alterando sua
carga e adquirindo propriedades elétricas. Neste processo, passa a ser chamado de
íon. O íon ao adquirir um ou mais elétrons possui carga negativa e recebe o nome
de ânion; quando perde um ou mais elétrons, recebe o nome de cátion, ficando com
carga positiva. Os íons estão presentes em soluções eletrolíticas que compõem os
tecidos biológicos (CHAVES, 2001).
Os íons são livres para se moverem e os tecidos humanos são bons condutores,
ou seja, o corpo humano permite que a eletricidade flua. Este fluxo de íons de um
lugar para o outro através da matéria é denominado corrente elétrica (CHAVES,
2001).
29
1.2.1 Corrente elétrica
O deslocamento de cargas elétricas, íons ou elétrons, constitui uma corrente
elétrica. A intensidade da corrente elétrica é a medida da quantidade de carga que
passa, por unidade de tempo, através de um corpo condutor. No S.I. a unidade de
intensidade da corrente é 1 C / s (1 coulomb por segundo). Esta unidade é
denominada de ampère (A), em homenagem ao físico francês André-Marie Ampère,
que viveu no século XIX e contribuiu significativamente para o desenvolvimento do
eletromagnetismo (MÁXIMO & ALVARENGA, 2000).
A corrente pode ser de uma maneira geral, dividida em contínua ou alternada.
A corrente contínua não tem sua polaridade alterada, flui sempre em um sentido,
podendo ser constante (CC) quando seu gráfico é dado por um segmento de reta
constante, ou seja, não variável, comumente encontrado em pilhas e baterias, ou
pulsante (CP), quando passam periodicamente por variações, não sendo
necessariamente constantes entre duas medidas em diferentes intervalos de tempo
(Figura 3). Já na corrente alternada (CA), ocorre mudança de polaridade; assim, o
fluxo de elétrons que carrega a energia elétrica dentro de um fio, não segue um
sentido único, ora os elétrons vão para frente, ora para trás, mudando de rota 120
vezes / seg (Figura 4). A energia elétrica no caso do Brasil, em geral, é gerada sob a
forma alternada (AMARAL, 2005).
Figura 3. Representação esquemática da corrente contínua, ou seja, corrente que não possui sua polaridade modificada ao longo do tempo. A corrente contínua pode ser do tipo pulsante, quando passa periodicamente por variações em um intervalo de tempo, representada pelo gráfico A, ou contínua, representada, no gráfico B, com um segmento de reta constante, ou seja, não variável. Fonte: autoria própria.
30
Figura 4. Gráfico representando a corrente alternada. Esta corrente é invertida periodicamente, ou seja, ora é positiva e ora é negativa, fazendo com que os elétrons executem um movimento de vai-e-vem. Este tipo de corrente é o que encontramos quando medimos a intensidade na rede elétrica residencial. Fonte: autoria própria.
1.3 Uso da eletricidade na saúde
A energia elétrica, quando aplicada como tratamento para transtornos
médicos, é conhecida pelo nome de eletroterapia. Seu uso remonta de 46 a.C.,
quando Scribonius Largus, médico do imperador romano Claudius, descobriu que o
estimulo elétrico recebido ao encostar em enguias elétricas, aliviava a dor, causando
dormência (HILLS & STEBBING, 2014). Desde então, a eletricidade vem sendo
usada terapeuticamente ao longo da nossa história, passando pela criação de
máquinas eletrostáticas no século XVIII, por Benjamin Franklin e, pelo físico italiano
Luigi Galvani, pioneiro nos estudos da eletrofisiologia (JOHN & REED, 2001). No
entanto, o interesse de seu mecanismo e possível uso terapêutico diminuiu até
1959, quando Humphrey e Seal apresentaram resultados encorajadores com
tratamento de tumores de sarcoma em ratos (HUMPHREY & SEAL, 1959).
Na prática médica atual, o uso de energia elétrica é aceito em uma variedade
de especialidades médicas, como neurologia e psiquiatria, sendo comum em
pacientes com transtorno depressivo, manias e esquizofrenia, na fisioterapia e no
manejo da dor (HILLS & STEBBING, 2014). O uso de eletroterapia para tratamento
de pacientes com Parkinson foi aprovada em 2002 pelo Food Drug Administration
(FDA) - agência que regulamenta medicamentos e alimentos nos Estados Unidos da
América - (HILLS & STEBBING, 2014).
31
Outros efeitos da interação de correntes elétricas, mais especificamente da
corrente elétrica contínua constante, com o material biológico, incluem ação
antibacteriana (TIEHM, LOHNER & AUGENSTEIN, 2009; MAHAPATRA et al., 2011;
WEI, ELEKTOROWICZ & OLESZKIEWICZ, 2011), antifúngica (BARBOSA, 2011) e
antiparasitária (HEJAZI, ESLAMI & DALIMI, 2004; GOMES et al., 2012),
regeneração de lesões cutâneas (HUCKFELDT et al., 2007; TALEBI et al., 2007;
JENNINGS, CHEN & FELDMAN, 2008; ZUZZIA et al., 2013; BEHEREGARAY et al.,
2014), aceleração da cicatrização de fraturas ósseas (WANG et al., 1998; CIOMBOR
& AARON, 2005) e reparo e regeneração de nervos (MENDONÇA, BARBIERI &
MAZZER, 2003; ACKERMANN et al., 2011).
Uma das mais interessantes ações biológicas da corrente elétrica contínua é
seu uso complementar/alternativo no tratamento do câncer. Esta atividade
antitumoral é chamada de eletroterapia tumoral (ETT) (NORDENSTRÖM, 1983,
1984, 1989).
1.4 Eletroterapia tumoral
Na eletroterapia tumoral o tecido é tratado com uma corrente contínua
constante de baixa intensidade (entre 20 A e 200 mA), por meio de dois ou mais
eletrodos, colocados dentro do tumor ou próximo ao mesmo. Desta forma, a CC cria
um fluxo de elétrons entre o ânodo, polo positivo, o qual gera um fluxo anódico e o
cátodo, polo negativo, que gera um fluxo catódico, dentro do tumor. Os eletrodos
são conectados a uma fonte elétrica que gera a energia necessária para assegurar
um fluxo de corrente adequado (NILSSON et al., 2000; VEIGA et al., 2005, CIRIA et
al., 2013; HOLANDINO et al., 2014).
32
1.4.1 Pioneirismo da ETT
Em meados do ano de 1776, Eason sugeriu que a eletricidade poderia ter um
papel no tratamento de tumores, ao relatar o caso de uma paciente com tumor de
mama que teve seu ombro atingido por um raio e após esta ocorrência, apresentou
remissão da doença (DAVID et al., 1985). Durante o século XIX alguns relatos do
efeito antitumoral da corrente elétrica foram documentados e em 1959, Humphrey e
Seal apresentaram resultados encorajadores com sarcomas subcutâneos em ratos
(HUMPHREY & SEAL, 1959). Em seguida a esta publicação, uma série de ensaios
foram conduzidos, com base nos estudos in vitro e em modelos de tumores em
animais, como melanomas, tumores hepáticos e pulmonares, em ratos e suínos.
O médico sueco, radiologista, Björn E. W. Nordenström, na década de 70
tratou pacientes com câncer de pulmão primário pela aplicação de corrente elétrica
entre dois eletrodos de fios de platina. Estes pacientes foram, por várias razões,
impróprios para o tratamento cirúrgico, radioterápico ou quimioterápico. Na
aplicação, o ânodo foi inserido centralmente no tumor e o cátodo a uma distância de
cerca de duas vezes o diâmetro do tumor, a partir do ânodo. A voltagem aplicada foi
de 10 V, sendo a média da carga aplicada de 80 C / cm3 do diâmetro do tumor
(NORDENSTRÖM, 1978).
Os pacientes foram anestesiados antes do tratamento e não indicaram
desconforto durante a aplicação. Com os dados, Nordenström publicou um estudo
em 1978 (NORDENSTRÖM, 1978), relatando o tratamento de cinco pacientes e em
1983, um livro descrevendo os resultados do total de 26 tumores pulmonares em 20
pacientes (alguns pacientes apresentavam mais de um nódulo nos pulmões)
(NORDENSTRÖM, 1983). A regressão foi obtida pelo radiologista em 12 dos 26
tumores e nestes não houve sinais de retorno da doença após acompanhamento de
2 a 5 anos. Nordenström observou neste estudo que tumores com diâmetros
maiores que 3 cm não responderam bem ao tratamento (NORDENSTRÖM, 1983).
Em outro dos seus estudos publicou resultados positivos no tratamento de uma
paciente com câncer de mama. O acompanhamento por mamografia, repetida em
intervalos de 6 meses nos dois anos após o tratamento, não apresentou retorno do
tumor (AZAVEDO, SVANE & NORDENSTRÖM, 1991).
33
Em 1993 Nordenström fundou a International Association for Biologically
Closed Electric Circuits in Medicine and Biology (IABC). O grupo, do qual foi o
primeiro presidente é composto por médicos, biólogos, biofísicos, engenheiros,
educadores e profissionais de negócios. Atualmente, cerca de 300 membros estão
engajados na pesquisa da área, em diferentes países como Alemanha, Austrália,
Brasil, China, Coréia, Cuba, Dinamarca, Estados Unidos, Grã-Bretanha, Hungria,
Indonésia, Japão e Suécia (IABC, 2015a). Uma grande quantidade de dados
clínicos, abrangendo mais de 2.000 casos de vários tipos de tumores, tanto
benignos como malignos, tratados entre os anos de 1987 e 1992, foi discutido, em
1993, na primeira conferência do IABC em Estocolmo, Suécia, e posteriormente
publicado (XIN, 1994).
Um segundo simpósio internacional sobre o tratamento eletroquímico de
câncer foi realizado em Pequim, China, em 1998, onde se relatou que o tratamento
foi estabelecido em 1.260 hospitais em toda a China. O professor Xin Yu-Ling e
colegas de trabalho no The China-Japan Friendship Hospital, em Pequim,
organizaram cursos de pós-graduação sobre ETT e até 1998, mais de 2.000
médicos foram formados na área. Cerca de 10.000 pacientes com diferentes tipos
de tumores tinham sido tratados nos últimos 10 anos, indicando uma substancial
experiência clínica deste método (XIN, 1998).
Björn Nordenström em sua publicação de 1978 sugeriu que os efeitos
antitumorais ocorriam devido aos produtos tóxicos provenientes das reações
eletroquímicas induzidas no mesmo (NORDENSTRÖM, 1978), e que existem
circuitos biologicamente fechados de corrente elétrica no corpo (NORDENSTRÖM,
1984). Nordenström faleceu em 2006 como professor emérito de radiologia
diagnóstica no Instituto Karolinska, na Suécia (IABC, 2015b).
1.4.2 Aplicação da Eletroterapia Tumoral
Vários têm sido os trabalhos publicados mostrando os resultados positivos da
ETT para o tratamento de tumores, em humanos, animais e em cultura de células. A
seguir descrevem-se as características do tratamento, seu provável mecanismo de
ação e os resultados obtidos de aplicações in vitro e in vivo.
34
1.4.2.1 Eletrodos
O eletrodo usado na ETT deve ser inerte e não pode ser susceptível a
oxidações. Alguns materiais como platina, ouro e aço inoxidável, têm sido utilizados
na clínica e, entre estes, a resposta, independe do tipo de material utilizado na
confecção do eletrodo (DAVID et al., 1985; MIKLAVČIČ et al., 1993; KIM et al.,
2007). O uso de eletrodos de ouro pode levar ao acúmulo do metal, porém, a morte
celular não tem relação com a quantidade deste material acumulado (MIKLAVČIČ,
FAJGELJ & SERŠA, 1994).
Na clínica, algumas dúvidas existem sobre a disposição dos eletrodos, assim
como da quantidade a ser usada; a localização; a distância entre os eletrodos,
dentre outros fatores (CIRIA et al., 2013). Nordeströn em seus estudos inseria o
ânodo centralmente no tumor e o cátodo a uma distância de cerca de duas vezes o
diâmetro do tumor, a partir do ânodo. A lógica que Nordenströn utilizava na
disposição dos eletrodos era que o campo elétrico negativo do cátodo empurraria as
células tumorais, que se presume serem carregadas negativamente, para longe do
mesmo e, portanto, impediria a metástase (NORDESTRÖN, 1978).
No início dos estudos na China, Xin e colaboradores modificaram a técnica e
ambos, cátodo e ânodo, foram inseridos no tumor, sendo os ânodos no centro do
tumor e os cátodos na periferia do mesmo. Esta modificação tinha por objetivo
proteger o tecido normal da destruição celular e demonstrou aumentar o efeito
terapêutico (XIN et al., 1997).
Em outro trabalho tratou-se melanoma B-16 e fibrosarcoma SA-I em
camundongos com diferentes configurações de eletrodos. Quando um eletrodo era
inserido centralmente no tumor o outro, de polaridade oposta, era inserido de forma
subcutânea na vizinhança do tumor. Usaram-se três eletrodos no tumor e dois no
tecido subcutâneo. Quando os eletrodos inseridos no tumor eram catódicos, o tumor
regrediu mais rápido, mas não houve diferença estatística entre a eficácia das duas
polaridades em relação à diminuição do tumor (MIKLAVČIČ et al., 1993).
35
Na mesma linha de estudo, tratou-se fibrosarcoma SA-1. Os eletrodos foram
inseridos de duas diferentes formas, um eletrodo no tumor e o outro por via
subcutânea 5 - 8 mm da borda do tumor; ou ambos os eletrodos por via subcutânea
na vizinhança do tumor 5 - 8 mm de distância das bordas. O primeiro foi considerado
como eletroterapia catódica, quando o eletrodo inserido diretamente no tumor foi
negativo e anódica quando a polaridade foi invertida. Em todas as configurações
obteve-se atraso no crescimento do tumor, entretanto, sem diferença
estatisticamente significativa (MIKLAVČIČ, FAJGELJ & SERŠA, 1994). A inserção
dos eletrodos é um parâmetro crucial para o sucesso do tratamento, porém a
distribuição mais adequada ainda não foi determinada (JIMÉNEZ et al., 2011).
A distância entre os eletrodos também não é padronizada nos trabalhos. Xin e
colaboradores afirmaram que o diâmetro de alcance de morte celular pela
eletroterapia era de 3 cm, em torno de cada eletrodo e, portanto, a distância entre os
eletrodos não deveria ser superior a 3 cm (XIN et al., 1997).
Desta forma, nem a geometria do eletrodo, nem sua distribuição são tratadas
de forma adequada, sendo, no geral, a determinação destes dados empírica.
Visando minimizar este problema de padronização quanto à inserção dos eletrodos,
Telló e colaboradores desenvolveram um esquema de disposição dos eletrodos
denominado de cerclagem monopolar (Figura 5). Na cerclagem, o tumor é envolvido
por um fio de aço inoxidável e este é conectado a uma fonte de corrente contínua
constante. O segundo polo (negativo ou positivo) é conectado a uma placa metálica
externa à região do tumor (TELLÓ et al., 2007).
36
Figura 5. Esquema representativo da inserção de eletrodos no tumor por meio da cerclagem. Em A podemos visualizar uma foto, do fio de aço, que irá circundar o tumor, envolto nos dedos de uma mão, representando a forma que será inserido no tumor. A Figura B transpõe a representação de uma disposição normal dos eletrodos e a figura C a cerclagem do tumor, com estimulação pelo polo negativo. D é uma foto obtida durante o tratamento de câncer de mama de uma gata, por eletroterapia, com cerclagem feita com fios de aço, onde a estimulação foi realizada pelo polo negativo. Fonte: TELLÓ et al., 2007.
37
1.4.2.2 Dose
Na eletroterapia tumoral a dose é calculada como produto da intensidade de
corrente (ampère) vezes o tempo de aplicação (segundos), sendo a carga resultante
dada em coulomb. Existe uma correlação direta entre a carga aplicada e a regressão
do volume tumoral (GRIFFIN et al., 1994; ROBERTSON et al., 1998; YEN et al.,
1999; TURLER et al., 2000; REN et al., 2001). Modelos matemáticos permitem
sugerir que a eficácia do tratamento com corrente elétrica depende da carga e da
susceptibilidade do tumor à ETT (CABRALES et al., 2008).
Pode-se aplicar a carga de duas formas, tendo ambas resultados similares:
por meio de voltagem, ou seja, a voltagem é mantida constante e a intensidade de
corrente é variável, devido à mudança da resistência elétrica do tumor; ou por meio
da corrente, onde esta é mantida com intensidade constante, sendo a voltagem
variável, de acordo com a resistência do tumor (PUPO et al., 2011).
Desta forma, verifica-se que não há ainda um método único, padronizado,
para a aplicação da ETT. A duração do tratamento é uma variável adicional,
podendo durar desde alguns minutos até várias horas (NILSSON et al., 2000), em
função do estado clínico do paciente, do tipo de tumor, dentre outros aspectos.
De uma forma geral, no tratamento clínico de humanos, algumas faixas
específicas são utilizadas, a saber: voltagem, entre 6 e 12 V; faixa de corrente: 80 a
100 mA; tempo de tratamento: 20 a 120 min; carga aplicada: 80 a 1500 C.
Entretanto, todos estes parâmetros dependem da consistência, do tamanho e tipo de
tumor, além do estado clínico do paciente (NILSSON et al., 2000; CIRIA et al.,
2013).
1.4.2.3 Mecanismo de ação da eletroterapia
O mecanismo de ação da ETT ainda não foi completamente elucidado.
Entretanto, alguns aspectos importantes estão bem esclarecidos. Considerando que
ânodo é o local onde ocorre oxidação, isto é perda de elétrons, e o cátodo é o local
das reações de redução, ou seja de ganho de elétrons, a equação de eletrólise da
água indica a geração de gás oxigênio e íons hidrogênio, em cada um dos
respectivos polos. Como consequência, há a acidificação do pH, devido aos íons de
hidrogênio liberados no ânodo (Equação 1).
38
2 H2O(l) O2(g) + 4 H+(aq) + 4 e-
Equação 1. Reação de eletrólise da água decorrente dos efeitos do polo positivo (ânodo-oxidação): liberação de oxigênio, íons hidrogênio e acidificação do meio eletrolítico.
No cátodo, gás hidrogênio é formado e íons hidroxila são liberados, levando
assim, a alcalinização do meio (Equação 2) (VIJH, 2004).
2 H2O(l) + 2 e- H2(g) + 2 OH−
(aq)
Equação 2. Reação de eletrólise da água decorrente dos efeitos do polo negativo (cátodo-redução): liberação de íons hidroxila e de gás hidrogênio.
Nessas condições não fisiológicas, de pH diferenciado, proteínas podem
sofrer desnaturação e precipitar (LI et al., 1997). Além disso, os produtos de
eletrólise colaboram para a destruição das células após aplicação da corrente
elétrica de baixa intensidade em ambos os polos (MORRIS, MARINO & GONZALEZ,
1992; VEIGA et al., 2000; von EULER et al., 2002; VIJH, 2004; HOLANDINO et al.,
2014).
A estimulação anódica leva também a geração de espécies denominadas de
cloraminas (Equação 3), que se formam a partir da reação do ácido hipocloroso,
com o grupo amina dos ácidos aminados presentes no meio eletrolítico (VEIGA et
al., 2000, 2005). O cloro também é um produto gerado da aplicação de CC no ânodo
(VIJH, 2004). O potencial oxidante das cloraminas, assim como a apoptose
decorrente da ação destas espécies foi descrita previamente por outros autores em
diferentes modelos experimentais (ENGLERT & SHACTER, 2002; WAGNER et al,
2002).
A 2 Cl−(aq) Cl2(aq) + 2 e-
39
B Cl2(g) + H2O HClO(aq) + H+
(aq) + Cl-(aq)
C HClO(aq) H+
(aq) + ClO-(aq)
D
Equação 3. Sequência de reações que ocorrem no ânodo gerando cloraminas. Na primeira equação (A) têm-se a formação do átomo de cloro. O ânion cloreto, íon com carga negativa, ao perder um elétron, fica com o número de elétrons igual ao número de prótons, assim, forma-se o cloro. Em uma reação secundária (B), o cloro produzido no ânodo reage com água produzindo o ácido hipocloroso, íons hidrogênio e cloreto. Logo em seguida, o ácido hipocloroso se dissocia formando o ânion hipoclorito (C). A última equação (D) representa a formação de cloramina, agente indutora de apoptose, a partir da reação de um ácido aminado com o ácido hipocloroso, do qual o cloro se combina com o grupo amina do ácido aminado, formando cloramina e água.
A cloramina é capaz de inibir o ciclo celular, de maneira tempo-dose
dependente, induzindo a morte celular (NAITO et al., 1997; ENGLERT & SHACTER,
2002).
Detecta-se ainda, a ocorrência de necrose, induzida tanto pela estimulação
anódica quanto catódica (MORRIS, MARINO & GONZALEZ, 1992), porém, este
processo ocorre de maneira mais intensa durante a estimulação catódica
(MIKLAVČIČ et al., 1993; HOLANDINO et al., 2014).
Verifica-se também o movimento eletroosmótico da água, ou seja, o campo
elétrico faz com que se forme um fluxo de água intersticial, na direção do cátodo,
causando desidratação na área anódica e edema na catódica (NORDESTRÖN,
1983; VIJH, 2004; TELLÓ et al., 2007). Na Figura 6 pode-se ver um esquema
representando os mecanismos de ação da ETT, de forma resumida, diferenciando
os acontecimentos que ocorrem no ânodo e no cátodo.
40
Figura 6. Esquema representativo dos mecanismos de ação da eletroterapia no tratamento de tumor, separando os fenômenos que ocorrem no tecido em contato com o polo positivo, ânodo, dos que ocorrem no polo negativo, cátodo. Podemos distingui-los principalmente pela variação do pH (alcalinização decorrente das reações catódicas e acidificação oriunda das reações anódicas). Além das reações eletrolíticas, destacamos os fenômenos de desidratação e edemaciamento do tecido, detectados no ânodo e cátodo, respectivamente. O potencial oxidante das cloraminas, assim como a apoptose induzida por estas espécies, também contribui com os mecanismos antitumorais da eletroterapia. Fonte: adaptado de Weinberg, 1996.
Durante a ETT não ocorrem variações significativas na temperatura dos
tecidos e órgãos e, portanto, a morte celular não pode ser atribuída a variações
térmicas (DAVID et al., 1985; MIKLAVČIČ et al., 1993; TELLÓ et al., 2004). Em
contrapartida, a aplicação de CC parece provocar uma oclusão vascular
(MIKLAVČIČ et al., 1997a) e induzir danos vasculares na região tumoral, que levam
a diminuição da perfusão sanguínea e da oxigenação, comprometendo,
consequentemente, a nutrição do tumor (JARM et al., 2003).
Além disso, estudos realizados com culturas de células evidenciaram que a
morte celular pode estar associada a alterações morfológicas significativas,
induzidas pela estimulação elétrica, tais como: modificação de glicoconjugados da
superfície; aparecimento de blebs; rupturas na membrana plasmática; alterações
nas mitocôndrias; inchaço celular; rarefação da matriz extracelular; formação de
debris e condensação da cromatina (HOLANDINO et al., 2000, 2001, 2014; VEIGA
et al., 2000, 2005).
41
Em um estudo histológico, realizado por Chou e colaboradores, foram
observadas alterações celulares, em tumores de fibrossarcoma em ratos, após o
tratamento com corrente elétrica. As células tumorais sem tratamento apresentaram-
se em forma de fuso, e os núcleos na forma oval. Após 1 h do tratamento, utilizando
carga de 10 C, notou-se uma estrutura celular anormal, com margens não
demarcadas e com presença de vacúolos, núcleos e nucléolos de formas
irregulares. Vinte e quatro horas após o tratamento havia grande transtorno da
estrutura celular e uma maior vacuolização do citoplasma e do núcleo (CHOU et al.,
1997).
Na revisão de Nilsson é possível analisar alguns estudos, in vitro, utilizando
tratamento com corrente constante, que discutem a influência do próprio campo
elétrico, gerado pela corrente elétrica, na sobrevivência e proliferação das células
(NILSSON et al., 2000). Para melhor compreender a ação do campo elétrico,
Wartenberg e colaboradores aplicaram um campo de cerca de 4 V / m, por meio de
corrente elétrica do tipo pulsante, o que gera cerca de 5 mA de intensidade, por 24
h, em células de mucosa bucal (linhagem UMSCC-14C). Os dados deste estudo
evidenciaram que o tratamento resultou na geração de espécies reativas de oxigênio
(ERO), que por sua vez, podem ter induzido a cascata de sinalização apoptótica
(WARTENBERG et al., 2007). Pupo e colaboradores acreditam que o mecanismo de
ação da eletroterapia pode ser explicado pelas espécies reativas de oxigênio. Os
campos elétricos, por meio destas espécies, oxidariam as membranas e induziriam
quebras no DNA, gerando assim a letalidade celular (PUPO, JIMÉNEZ &
CABRALES, 2011).
1.4.2.3.1 Espécies reativas de oxigênio
A existência de espécies químicas na forma de radicais livres foi descrita pela
primeira vez no ano de 1900, quando a decomposição de hexafenietano em dois
radicais trifenilmetil foi demonstrada. Porém, reações envolvendo radicais livres em
meio biológico só foram consideradas importantes em 1940, com a introdução de
técnicas que permitiam detectá-los e com os estudos de cinética das reações
envolvendo espécies químicas de meia-vida curta (RIBEIRO et al., 2005).
42
Espécie reativa de oxigênio é um termo coletivo que descreve radicais livres
derivados de oxigênio, como o ânion superóxido (O2•-), radical hidroxil (HO•), peroxil
(RO2•), alcoxil (RO•), bem como espécies não radicais, tais como peróxido de
hidrogênio (H2O2) (MATÉS & SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, 2000; RAY, HUANG & TSUJI,
2012).
O radical superóxido (O2
•-)
É a primeira das espécies formadas pela redução do oxigênio por um único
elétron. Pode agir como oxidante ou como redutor, dando origem a outras espécies
reativas. É formado em todas as células aeróbicas por diferentes vias, como no
sistema NADPH citocromo P-450 redutase microssomal, principalmente no retículo
endoplasmático liso, que envolve o metabolismo de xenobióticos. Neste último há
utilização de oxigênio para hidroxilar as moléculas de xenobióticos, aumentando sua
polaridade, e assim, facilitando posteriores reações de conjugação, para excreção
pelas vias biliar ou urinária. O radical superóxido é um intermediário neste processo,
formando um complexo com o átomo de ferro do citocromo (RIBEIRO et al., 2005).
Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Dois radicais superóxido formam peróxido de hidrogênio, por conversão
espontânea e enzimática (Equação 4). Quando em pH fisiológico, a baixa
concentração de prótons reduz a taxa de reação espontânea e o peróxido de
hidrogênio formado é o produto da reação enzimática para eliminação do radical
superóxido pela ação da enzima superóxido dismutase (SOD) (RIBEIRO et al.,
2005).
A SOD é a enzima chave na eliminação de O2•- e para agir requer
oligoelementos como cobre, zinco e manganês (MICHIELS et al., 1994). São
descritas três formas da superóxido dismutase: a CuZnSOD (SOD 1, dependente de
cobre e zinco, presente no citoplasma, no compartimento nuclear e nos lisossomas),
a MnSOD (SOD 2, dependente de manganês, na mitocôndria) e a CuZnSOD (SOD
3, dependente de cobre e zinco, que se localiza no plasma, linfa, ascite e fluído
cérebroespinhal) (ZELHO, MARIANO & FOLZ, 2002).
43
SOD
2O2•-
(aq) + 2H+(aq)
H2O2(aq) + O2(g)
Equação 4. Reação de elimação do radical superóxido, catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD), enzima que acelera a dismutação do radical superóxido, quando em pH fisiológico, formando peróxido de hidrogênio e oxigênio.
Desta forma, as vias que geram superóxido, também podem gerar peróxido
de hidrogênio. Além disso, nos peroxissomos há geração de grande quantidade de
peróxido de hidrogênio, através da atuação de oxidases envolvidas no catabolismo
de ácidos aminados e na oxidação de ácidos graxos (GOUGH & COTTER, 2011).
Radical hidroxil (HO•)
A reação de Fenton (Equação 5) tem sido proposta como a principal via de
geração do radical hidroxil, através da decomposição do peróxido de hidrogênio,
catalisada por metal, principalmente por ferro (DIXON & STOCKWELL, 2014).
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH• + OH-
Equação 5. Reação de Fenton, nome dado à oxidação de ferro (II) a ferro (III) pelo peróxido de hidrogênio, produzindo espécies com alto poder oxidante como o radical hidroxil.
A produção de espécies reativas de oxigênio, entre outras espécies reativas,
é parte integrante do metabolismo humano e é observada em diversas condições
fisiológicas.
Estas espécies tem importante função biológica e, quando sua produção é
exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema antioxidante que consegue
controlar e restabelecer o equilíbrio, ou seja, o balanço entre espécies químicas
oxidantes e redutoras (REDOX) nas células. O estresse oxidativo resulta do
desequilíbrio entre o sistema pró e antioxidante, com predomínio dos oxidantes, com
dano consequente (MATÉS & SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, 2000).
Os danos oxidativos podem se acumular e resultar em vários efeitos
biológicos, como oxidação de biomoléculas, alterações na transdução de sinal,
mutagênese e até morte celular (MATÉS & SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, 2000). Existem
evidências de que a morte celular provocada pelas espécies reativas de oxigênio
pode ocorrer por apoptose (MATÉS & SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, 2000).
44
Para se defender da toxicidade das ERO, o organismo apresenta pelo menos,
três mecanismos de defesa: prevenção da formação das ERO; reparo das moléculas
modificadas; eliminação das espécies reativas de oxigênio.
A prevenção da formação de ERO inclui mecanismos antioxidantes, como,
por exemplo, a quelação de metais, durante transporte e armazenamento, evitando
a reação de Fenton; a organização estrutural do DNA em cromatina (KELL, 2009). O
mecanismo de reparo é feito pelo sistema de reparo do DNA, como, por exemplo, o
reparo por excisão de bases, através do qual, bases danificadas são removidas pela
enzima glicosilase, com restauração da fita de DNA por polimerases e DNA ligase.
Outro mecanismo importante é o de excisão de nucleotídeos que permite o reparo
de lesões de grandes distorções na hélice do DNA, por meio de proteínas que
reconhecem e excisam a área da fita lesada, ressintetizando um novo segmento,
livre de erro (ALBERTS, 1997).
A eliminação destas espécies oxidantes pode ocorrer por mecanismos
enzimáticos ou não enzimáticos. Quando não é enzimático é realizado por
compostos, que protegem moléculas da oxidação, por suprimirem, eliminarem ou
desativarem a formação de radicais livres, formando um produto estável. No
mecanismo enzimático tem-se uma série de enzimas que mantêm a concentração
de ERO dentro dos limites fisiológicos, que regulam o nível de moléculas oxidadas e
catalisam reações geradoras de equivalentes redutores, nos compartimentos
citosólico, mitocondrial e extracelular (RIBEIRO et al., 2005).
Quanto ao mecanismo enzimático de eliminação de ERO, podemos destacar
algumas enzimas antioxidantes como a SOD, a catalase (Cat) e a glutationa
peroxidase (GPx). Como visto anteriormente, a SOD é a enzima chave na
eliminação de O2•-. A Cat está relacionada à conversão de H2O2 em água e oxigênio
molecular, complementando a ação da SOD (MICHIELS et al., 1994). A GPx é uma
enzima que catalisa a redução do peróxido de hidrogênio e peróxidos orgânicos para
seus correspondentes alcoóis, as custas da oxidação de glutationa (LU, 2013).
45
Além das enzimas citadas acima, relaciona-se também com a eliminação de
ERO o sistema tiorredoxina que compreende NADPH, tiorredoxina redutase e a
tiorredoxina. Este sistema pode fornecer elétrons para uma grande variedade de
enzimas sendo importante na síntese de DNA e defesa contra o estresse oxidativo
(LU & HOLMGREN, 2014). Já as peroxirredoxinas que exercem seu papel de
proteção antioxidante por meio da sua atividade de peroxidase, onde o peróxido de
hidrogênio, o peroxinitrito e uma grande variedade de hidroperóxidos orgânicos são
reduzidos (WOOD et al., 2003).
No mecanismo não enzimático os compostos tiólicos (ocorrência do grupo
funcional sulfidrila –SH ligado a uma cadeia carbônica) desempenham um papel
importante na manutenção do estado REDOX das células. Entre estes compostos
estão a glutationa, a cisteina e as proteínas tiólicas.
A homeostase REDOX é particularmente assegurada por glutationa. A
glutationa reduzida (GSH) é um tripeptídeo, formado por glicina, ácido glutâmico e
cisteína e constitui o tiol redutor mais abundante no meio intracelular. Na sua forma
reduzida protege as células de radicais livres, peróxidos e xenobióticos. O conteúdo
de GSH no organismo é um forte indicador do respectivo estado fisiológico, pois, sua
depleção pode ocasionar danos celulares irreversíveis (FORMAN, ZHANG & RINNA,
2009).
A manutenção de níveis de GSH e GSSG é feita às custas de três enzimas: a
glutationa oxidase (GO), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase (GR).
As duas primeiras enzimas catalisam a oxidação de GSH à glutationa oxidada
(GSSG) e a glutationa redutase, utiliza equivalentes redutores do NADPH para
manter a glutationa na forma reduzida, como substrato para glutationa peroxidase
(Figura 7). Este sistema é muito eficiente na proteção antioxidante contra o peróxido
de hidrogênio, o que auxilia na manutenção de níveis baixos do produto da reação
catalisada por SOD (RIBEIRO et al., 2005).
46
Figura 7. Representação esquemática do ciclo catalítico da glutationa. Nas células, a glutationa pode encontrar-se sob a forma de glutationa reduzida (monomérica – GSH) e na forma oxidada (dimérica – GSSG). A GSH precisa ser regenerada através de um ciclo catalítico, onde ocorre a atividade de três grupos de enzimas: a glutationa oxidase (GO), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase (GR). As duas primeiras enzimas, GO e GPx, catalisam a oxidação de GSH à GSSG e a última, GR, é responsável pela regeneração de GSH, a partir de GSSG, na presença de NADPH Fonte: adaptado de HUBER & ALMEIDA, 2008.
O quociente GSH/GSSG reflete o estado redox intracelular. Este ambiente
redox está envolvido na regulação de processos celulares importantes, incluindo a
diferenciação celular, proliferação e apoptose. A capacidade de sinalização redox vai
depender da disponibilidade de grupos tiol ativos. A GSH é o tiol não proteico
dominante no organismo e, como tal, surge como fator essencial na manutenção do
potencial redox celular, representado na Equação 6 (LU, 2009).
Proteína-SSG + GSH Proteína-SH + GSSG
Equação 6. Reação que representa o equilíbrio entre a glutationa reduzida, GSH e a glutationa oxidada GSSG (dimerizada da GSH). Este equilíbrio depende das concentrações existentes entre as duas formas de glutationa, sendo esta, uma reação reversível.
Como esta reação é reversível, o equilíbrio é determinado pelo estado redox
celular, o que vai sempre depender das concentrações existentes de GSH e GSSG
(LU, 2009).
Mudanças na concentração da glutationa reduzida podem ser um indicador
útil na investigação do estresse oxidativo. Na inativação de um agente oxidante
ocorre produção de GSSG e depleção de GSH. Em situações em que o sistema de
oxidorredução está íntegro, haverá recuperação da GSH. Entretanto, em condições
de excesso de agentes oxidantes e/ou deficiência do sistema protetor, haverá
desequilíbrio entre o consumo de GSH e a produção de GSSG, o que também
caracteriza o estresse oxidativo. Desta forma, a diminuição do nível de glutationa
reduzida está associada com estresse oxidativo (WALTHER et al., 2008).
47
Apesar da relação GSH/GSSG ser considerada um indicativo dos efeitos
adversos de danos oxidativos, a sua estimativa não reflete de forma exata o total de
grupamentos tióis reduzidos. O total de grupamentos tióis reduzidos envolve, além
de GSH, cisteina e tióis proteicos (GRINTZALIS et al., 2014).
1.4.2.4 Vantagens e desvantagens do tratamento tumoral por eletroterapia
O tratamento por ETT é adequado para todos os tipos de tumores sólidos
superficiais ou viscerais, malignos ou benignos (PUPO, JIMÉNEZ & CABRALES,
2011). Esta particularidade é interessante, visto que a maior incidência de câncer
para mulheres e homens, é do tipo sólido (Figura 1).
Este tratamento é de baixo custo e, por isso, pode ser utilizado em países
onde o acesso a técnicas mais caras é limitado. Em média, o custo do tratamento
convencional para câncer nos Estados Unidos da América é de cerca de $70.000,00
por caso, e na Europa o valor é de cerca de $ 44.000,00 (PHILIPSON et al., 2012).
Acredita-se que ao utilizar a eletroterapia como tratamento o custo seja reduzido.
Para tal técnica existe a necessidade da aquisição de uma fonte de corrente
contínua, cujo preço é de aproximadamente $1.300,00, a qual poderá ser usada
para um grande número de pacientes e agulhas de aço inox, cuja caixa contendo
100 unidades custa cerca de $ 3,50. Além disso, a aplicação da eletroterapia
algumas das vezes pode ser realizada em uma base ambulatorial, não necessitando
de internação.
Outra vantagem interessante da ETT é a oclusão das artérias e veias, o que
acarreta diminuição da oxigenação e nutrição do tumor (JARM et al., 2003). Após a
aplicação de eletroterapia alguns vasos no interior do tumor tornam-se permeáveis,
o que resulta em acúmulo de sangue no interior do mesmo (JARM et al., 2003).
Além disso, o fluxo de corrente ocorre preferencialmente pelas células tumorais, que
apresentam menor resistência, quando comparadas ao tecido normal; desta forma, a
ETT acaba sendo tumor-específica (VOGL et al., 2007).
48
O tratamento também tem limitações importantes, como a incapacidade para
alcançar remissão completa em alguns casos que foram estudados. Este fato nos
parece normal, visto que, os tumores tratados na maior parte dos estudos são
volumosos, com grande crescimento, o que justifica até não serem operáveis.
Quando o tumor tem mais de 8 cm de diâmetro o prognóstico é pior do que os
tumores de menor tamanho (NILSSON et al., 2000).
Como efeitos colaterais têm-se poucos relatos, como, o aumento de
temperatura no local, embora todos os autores relatem que este efeito térmico seja
insignificante (DAVID et al., 1985; MIKLAVČIČ et al., 1993; TELLÓ et al., 2004).
Nordenström também descreveu febre leve (NORDENSTRÖM, 1983; FOSH et al.,
2003) e dor no local da aplicação durante o tratamento (NORDENSTRÖM, 1983).
Do mesmo modo foi descrito eritema e edema na área tratada, imediatamente após
o tratamento (JARQUE et al., 2007) e aumento nas enzimas hepáticas, que
retornaram aos níveis normais, após uma semana de estimulação (ROBERTSON et
al., 1998; WEMYSS-HOLDEN et al., 2000).
O tratamento não exibe toxicidade local ou sistêmica (MARINO, MORRIS &
ARNOLD, 1986). Porém, Griffin e colaboradores descreveram que uma carga
anódica superior a 10,6 C ou uma carga catódica maior do que 21,6 C, resultem em
100 % de mortalidade de ratos, após 24 a 72 h de aplicação; em contrapartida,
doses mais baixas não foram capazes de induzir mortalidade. As análises
sanguíneas mostraram que a mortalidade estava associada com desequilíbrios de
eletrólitos no soro, sendo este efeito associado à necrose do tumor. Danos
semelhantes foram encontrados em lise tumoral ou em síndromes de esmagamento
cirúrgicos (GRIFFIN et al., 1994).
Uma contraindicação do uso foi observada por Chou e colaboradores ao
aplicar a eletroterapia próxima ao coração. Nesta situação, esta prática foi
considerada não adequada, pois, pode levar a alterações cardíacas (CHOU et al.,
1997).
49
1.4.2.5. Alterações cardíacas com tratamento por corrente elétrica
O uso de eletricidade próxima ao coração é uma contraindicação, pois, sabe-
se que a corrente elétrica pode causar bloqueio cardíaco (HARTHORNE, 1981).
Desta forma, é necessário ter dados da implicação do tratamento por ETT aplicada
próxima ou distante do coração, verificando possíveis influências nas funções
cardíacas, como na pressão arterial, frequência cardíaca ou alteração no potencial
elétrico. Até a presente data, não há estudos sobre a influência da ETT sobre o
sistema cardíaco.
Mudanças no potencial elétrico no miocárdio podem alterar o ritmo cardíaco
(FEHER, 2012). Já a pressão arterial (PA) é calculada pelo produto da resistência
vascular periférica total (RVPT) pelo débito cardíaco (DC). O DC é a intensidade do
fluxo sanguíneo bombeado pelo coração em todo o sistema circulatório e pode ser
alterado por: a) volemia (volume total de sangue); b) contratilidade do miocárdio e c)
pela frequência cardíaca, expressa em bpm (batimentos por minuto), a qual
representa o número de estimulações elétricas geradas pelo coração a cada minuto.
Já a RVPT, que é o impedimento ao fluxo sanguíneo em toda a circulação sistêmica,
depende de um complexo mecanismo de regulação, que envolve balanço de
eletrólitos, sistema renina-angiotensina-aldosterona, substâncias vasoativas,
neurotransmissores, hormônios, quimiorreceptores e barroreceptores que atuam no
controle da PA em curto prazo (JOSEPH et al., 2013).
Os barorreceptores são sensores especializados da pressão, constituídos de
diversas terminações nervosas livres (MICHELINI, 2007). Quando a pressão arterial
eleva-se, acima de seus valores basais, gera estímulo no núcleo do trato solitário e
este então reduz o tônus simpático ao coração e aos vasos, levando a diminuição da
frequência cardíaca, do volume sistólico, da resistência periférica e um aumento da
capacitância venosa. Estes ajustes fisiológicos levam a redução dos níveis
pressóricos mantendo a PA basal (MELO, MARTINHO & MICHELINI, 2003).
50
1.4.2.6 Associações da eletroterapia com outras terapias
A eletroterapia também tem sido aplicada em combinação com outras
terapias, como: ablação por radiofrequência (gera calor local, visando à coagulação
e destruição de lesões malignas, por meio de um eletrodo especial e um gerador de
corrente de radiofrequência); terapia fotodinâmica (ação da luz sob um
fotosensibilizador, que, na presença de oxigênio, causa destruição da célula
hospedeira); imunomoduladores; radioterapia; quimioterapia. Todas essas
associações tem a finalidade de se obter sinergismo e, assim, melhorar a eficácia do
tratamento.
O efeito da ETT com posterior uso da radioterapia em tumores de carcinoma
de cólon foi estudado em ratos, com a aplicação de uma carga de 37,5 C, com 2
eletrodos de cobre ou de platina, distanciados entre si, cerca de 10 mm,
posicionados no centro do tumor. O tratamento combinado resultou na inibição do
crescimento do tumor e, em 75 % dos casos, os tumores desapareceram. No grupo
que recebeu apenas a radioterapia, 75 % dos tumores permaneceram. Os autores
colocaram a hipótese de que pode ocorrer uma reação inflamatória em torno da
lesão eletrolítica o que poderia gerar um aumento do fluxo sanguíneo e, portanto
maior oxigenação do tumor, tornando-o mais radiossensíveis (NILSSON et al.,
2000). Esta hipótese não é confirmada por Jarm e colaboradores que verificaram
uma diminuição da perfusão sanguínea e da oxigenação na aplicação de ETT
(JARM et al., 2003).
A combinação da ETT com ablação por radiofrequência consiste na aplicação
inicial da ETT e uma subsequente aplicação da ETT em associação a
radiofrequência. O resultado obtido dessa junção de tratamentos foi um aumento na
destruição do tumor com maior volume de coagulação, quando comparada a
radiofrequência sozinha (COCKBURN, MADDERNB & WEMYSS-HOLDEN, 2007).
Uma combinação da ETT e da terapia fotodinâmica foi estudada em sarcoma,
em ratos, onde se observou a remissão completa do tumor em 100 % dos casos,
quando comparado a monoterapia fotodinâmica (MIKHAILOVSKAYA et al., 2009).
51
Imunomoduladores também foram combinados com a ETT, como o interferon
alfa (IFN-α). Neste trabalho, de 1993, administrou-se IFN-α, via intraperitoneal ou via
subcutânea ao redor do tumor, em camundongos com fibrossarcoma SA-I,
diariamente por 5 dias consecutivos, 60 min antes de aplicar a eletroterapia. As
seguintes cargas de corrente foram aplicadas: 0,72; 1,44; 2,16; 2,88 ou 4,32 C,
todas com 1 h de duração, por eletrodos de platina/irídio, inseridos por via
subcutânea, 5 a 10 mm, a partir da margem do tumor, em dois locais opostos. A
eficácia da junção dos dois métodos foi melhor quando o IFN-α foi aplicado por via
intraperitoneal. Os métodos juntos apresentaram eficácia no atraso do crescimento
do tumor, em relação à ETT sozinha; esta eficácia foi diretamente dependente da
intensidade de corrente aplicada. Não foram observados efeitos colaterais do
tratamento (SERŠA & MIKLAVČIČ, 1993).
Em outro trabalho, utilizando interleucina-2 (IL-2) como imunomodulador,
camundongos com sarcoma foram tratados com 2,16 ou 3,6 C por 1 h, de corrente,
com eletrodos de platina-irídio inseridos por via subcutânea, paralelos uns aos
outros, 5 a 8 mm da borda do tumor. A IL-2 foi injetada no tumor ou na vizinhança do
mesmo no dia de aplicação da ETT, 1 a 2 h após o final do tratamento por corrente e
após dois dias subsequentes. A combinação da eletroterapia com imunoterapia
resultou em 28 % e 31 % de curas na aplicação de 0,6 e 1,0 mA de corrente elétrica,
respectivamente, sendo mais eficaz do que qualquer um dos tratamentos sozinhos
(MIKLAVČIČ et al., 1997b).
A eletroterapia quando associada a quimioterápicos antineoplásicos, é uma
técnica que recebe o nome de eletroquimioterapia. Os antineoplásicos cisplatina e
bleomicina, fármacos hidrofílicos, são os mais utilizados, por via intravenosa ou
intratumoral (PARISE et al., 2008). O uso concomitante de medicamento
quimioterápico antineoplásico com a ETT foi estudado em camundongos Balb/c com
tumor ascítico de Ehrlich, e em cães e gatos que apresentavam tumores
espontâneos de cabeça e pescoço, todos tratados com ETT isolada ou associada
aos quimioterápicos, cisplatina ou bleomicina. Como resultado verificou-se que a
ETT potencializa tanto o efeito de cisplatina quanto da bleomicina (PARISE et al.,
2008; PAVLIHA et al., 2012; MALI et al., 2013; CAMPANA et al., 2014).
52
Serša e colaboradores trataram Fibrosarcoma SA-1 em camundongos,
utilizando 250 µg do antineoplásico bleomicina, injetada por veia caudal, 60 min
antes do tratamento por ETT. A carga utilizada foi de 2,16 C, por 1 h e o os eletrodos
eram de platina/irídio, inseridos por via subcutânea, 5 a 10 mm da margem do tumor,
nos dois lados opostos. A combinação dos tratamentos resultou em efeito
antitumoral significativo quando comparado ao controle, feito apenas com
bleomicina. Segundo os autores, parece haver um aumento da permeabilidade dos
capilares, por eletroporação, e desta forma, maior acúmulo do fármaco no tumor
(SERŠA, NOVAKOVIĆ & MIKLAVČIČ, 1993). A eletroporação transitória da
membrana celular resulta em uma melhor eficácia do tratamento, mesmo com o
fármaco em baixas concentrações; porém este mecanismo se encaixa
satisfatoriamente quando se aplica uma corrente elétrica pulsante, não sendo
plausível para correntes elétricas constantes (SERŠA, NOVAKOVIĆ & MIKLAVČIČ,
1993).
Em um estudo realizado em 39 pacientes com câncer de cabeça e pescoço
(pele ou cavidade oral) tratados por eletroquimioterapia constatou-se poucos efeitos
colaterais, como ulceração de pele, mucosite e dor local. A resposta completa da
remissão do tumor foi de 38 % e uma resposta parcial foi obtida em 21 % dos
pacientes tratados (CAMPANA et al., 2014).
Outra possível associação é o tratamento por ETT com adição de ácidos
aminados, já que a reação destes com os derivados de cloro gerados no meio
eletrolítico durante a estimulação elétrica, leva à geração de cloraminas, que são
agentes indutores de apoptose. Esta abordagem foi descrita pela primeira vez por
Holandino e colaboradores, com a testagem de três aminoácidos diferentes, a saber:
glutamina, tirosina e triptofano, a qual resultou numa maior citotoxicidade pela
tirosina, quando células B16F10 foram avaliadas (CAMPOS et al., 2010). Visando
aumentar a citotoxicidade pelo aumento da permeabilidade membranar, L-tirosina foi
encapsulada em nanopartículas de poli-Ɛ-caprolactona, que resultou em morte mais
significativa das células tumorais (CAMPOS et al., 2010).
53
Esta associação da nanotecnologia à eletroterapia foi também avaliada em
camundongos inoculados com a linhagem B16F10 (melanoma murino MDR), com
intensa necrose tecidual e destruição quase total do tumor, após 48 horas de
tratamento (TEIXEIRA, 2010). Este estudo piloto vem motivando outros ensaios in
vivo, os quais se encontram em fase de desenvolvimento no Departamento de
Medicina Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e já
apresentam resultados bastante promissores quanto à remissão de tumores em
animais desta clínica veterinária (AGUIAR et al., 2010; OLIVEIRA, HOLANDINO &
TELLÓ, 2010).
A L-tirosina encapsulada em nanopartículas apresenta maior toxicidade do
que a L-tirosina sob a forma livre, não encapsulada (CAMPOS et al., 2010). Esta
citotoxicidade aumentada pode ser explicada pela possibilidade de interiorização das
Nps pelas células por endocitose. Somado a este processo, já foi descrito que a
associação de CC com fármacos gera um aumento na concentração deste no
interior da célula, porque o estímulo elétrico permeabiliza a membrana plasmática
(JANIGRO et al., 2006; SODEN, 2006; COLOMBO et al., 2007).
1.4.2.7 Aplicação da ETT em animais
Vários grupos de pesquisa na Europa, América do Norte e Japão têm utilizado
ETT através de diferentes abordagens de aplicação de corrente elétrica, em vários
modelos animais e em alguns ensaios clínicos. Dentre as diferenças metodológicas,
encontramos o uso de diferentes eletrodos, de composição e materiais variados,
aplicados em diversas configurações. Outros parâmetros como intensidade e tempo
de tratamento têm sido descritos, como relatado por CIRIA e colaboradores em
recente review publicado (2013).
Samuelsson, em 1981, inoculou adenocarcinoma de cólon em ratos e tratou
por eletroterapia (36 a 144 C, por 1 h), realizando de 1 a 3 aplicações no total, com
eletrodos de platina, sendo o ânodo inserido no centro do tumor e o cátodo na
superfície do mesmo. Compararam este procedimento com a remoção do tumor por
cirurgia. Os autores concluíram que a eficácia desses dois tratamentos, após
acompanhamento de 7 meses, foi aproximadamente a mesma e o tratamento por
eletroterapia não pareceu afetar o número de metástase (SAMUELSSON,1981 apud
NILSSON et al., 2000).
54
Um estudo preliminar foi realizado com um modelo de tumor experimental
desenvolvido a partir de um melanoma amelanótico em hamsters. Por 5 dias os
animais foram tratados com 0,36 a 8,6 C / h / dia, sob efeito de anestesia geral,
utilizando eletrodos de aço inoxidável, ou de platina-irídio. O grupo controle foi
submetido ao mesmo procedimento, porém, sem passagem de corrente elétrica.
Três dias após o término do tratamento os animais foram eutanasiados e
autopsiados, os tumores foram removidos, pesados, e seccionados. Como resposta,
os tumores tratados diminuíram em massa e houve aumento de necrose observada
macro e microscopicamente. Estes resultados foram independentes do tipo de
material usado no eletrodo. Para o grupo, o mecanismo de redução do crescimento
foi desconhecido, mas a hipertermia não mostrou ser um fator relevante (DAVID et
al., 1985).
O crescimento de carcinoma de pulmão de Lewis, implantado em
camundongos C57BL/6, foi inibido após a administração de 7,2 C, cerca de 3 V,
durante 1 hora, em uma frequência de 1 a 3 tratamentos. Os eletrodos utilizados
foram de platina, inseridos paralelamente um ao outro no interior do tumor. A
regressão do tumor foi de 43 %, após 3 aplicações de ETT, sugerindo boa eficácia
do tratamento para estes carcinomas (MARINO, MORRIS & ARNOLD, 1986). Morris
e colaboradores fizeram um estudo semelhante usando valores maiores de carga
(18 C em 15 min) e o mesmo tipo de tumor, porém com maiores dimensões
(superiores a 1 cm). Os camundongos tratados por eletroterapia sobreviveram mais
tempo que o grupo controle, porém, menos que o grupo que fez a cirurgia (MORRIS,
MARINO & GONZALEZ, 1992). Estes dois estudos mostram que o tratamento por
ETT foi capaz de diminuir o tamanho do tumor.
55
Miklavčič e colaboradores em 1993 trataram fibrosarcoma SA-I em
camundongos com uma carga de 2,16 C, por meio de eletrodos de 0,6 mm de
diâmetro e 18 - 20 mm de comprimento, e a duração do tratamento foi de 1 h. Após
uma única aplicação, houve regressão do tumor (MIKLAVČIČ et al., 1993). No
mesmo ano, Miklavčič e Serša publicaram um trabalho onde trataram melanoma B-
16 e fibrosarcoma SA-I em camundongos com eletroterapia. O tratamento único
durou 60 min, com uma carga de 2,16 a 6,48 C, com eletrodo de platina-irídio de 0,7
mm de diâmetro. Ambos os tumores sofreram necrose com a aplicação de ETT,
sendo o melhor efeito tumoral obtido com o maior valor de corrente (MIKLAVČIČ et
al., 1993). Na mesma linha de estudo, tratou-se fibrosarcoma SA-1, por 1 h com
0,36; 0,72; 2,16 e 3,6 C de corrente e os resultados foram atraso no crescimento do
tumor, sendo a eficácia dependente da carga (MIKLAVČIČ, FAJGELJ & SERŠA,
1994).
Griffin e colaboradores utilizaram diferentes intensidades de corrente de 1 a 5
mA, variando também o tempo de aplicação de 30 a 90 min no tratamento de
carcinoma mamário em camundongos. O grupo utilizou duas configurações de
eletrodo, ora o ânodo estava no centro do tumor ora o cátodo. Como resultado,
observaram que o volume de regressão do tumor foi dependente da quantidade de
carga administrada. Além disso, a comparação dos efeitos da polaridade do eletrodo
implantado no tumor demonstra a maior eficácia do ânodo sobre o cátodo (GRIFFIN
et al., 1994).
56
Fibrosarcomas em camundongos e em ratos foram tratados por Chou e
colaboradores. O grupo utilizou de 4 a 7 eletrodos de platina, em diferentes
configurações, todos inseridos na base do tumor. A carga aplicada foi de 5; 8; 10; 15
ou 20 C por 1 h cada, com máxima voltagem de 10 V. Como resultado verificou-se
que a aplicação de ETT gerou necrose e regressão no tratamento de fibrosarcoma
tanto em camundongos quanto em ratos, e que quanto maior o número de eletrodos
inseridos, melhor a resposta. Ao trocar o ânodo pelo cátodo não se obteve diferença
de resposta (CHOU et al., 1997).
Robertson e colaboradores trataram ratos utilizando eletrodos de platina, de
duas formas diferentes, uma colocando ambos os eletrodos no mesmo lobo do
fígado, separados por 2 mm e outra inserindo os eletrodos em diferentes lóbulos
(esquerdo e direito), cerca de 20 mm de distância entre os eletrodos. Após
anestesia, o fígado foi exposto através de uma incisão e uma corrente de
intensidade variando entre 1 a 5 mA foi aplicada. Todos os animais tratados
toleraram bem o tratamento e não houve morte prematura. Quando os eletrodos
foram inseridos no mesmo lobo houve uma correlação entre a quantidade de tecido
necrosado e a intensidade de corrente aplicada, e na aplicação de um eletrodo em
cada lobo esta correlação foi a mesma (ROBERTSON et al., 1998).
Estes estudos nos permite verificar que a eletroterapia tem grande eficácia no
tratamento de vários tipos de tumores, em modelos experimentais animais, como
hamsters, camundongos e ratos. Esta eficácia independente do local de inserção
dos eletrodos e do tipo de material utilizado como eletrodo, porém, a carga
administrada tem efeito diretamente proporcional à redução do tamanho do tumor e
ao aparecimento de tecido necrosado. Estes dados são de grande valia para o
tratamento de tumores em humanos.
1.4.2.8 Resultados da aplicação de ETT em humanos
O alvo principal da eletroterapia são os tumores sólidos externos, porque
estes permitem a inserção direta dos eletrodos garantindo uma aplicação localizada,
porém, tumores internos também podem ser tratados. Aqui relatamos alguns casos
de tratamento de câncer em humanos, por meio da eletroterapia.
57
Em 1983, tratou-se 4 pacientes, em um total de cinco tumores de pulmão (um
era metástase). Sob anestesia local, foram inseridos 2 ou 3 eletrodos de platina,
com cerca de 3 mm de diâmetro, através da parede torácica, todos diretamente no
tumor. A corrente foi de 80 mA e a voltagem de 10 V, aplicada por cerca de 2 a 4 h.
Observações após o tratamento demonstraram 60 a 80 % de destruição da massa
do tumor, porém nenhum teve regressão de 100 %. Os pacientes toleraram bem o
procedimento (NILSSON et al., 2000).
Xin e colaboradores fizeram um estudo piloto, tratando com eletroterapia 386
pacientes com câncer de pulmão, usando uma voltagem de 6 a 8 volts, corrente de
40 a 100 mA, sendo a carga de 100 C / cm de diâmetro do tumor. O número de
eletrodos utilizado foi determinado a partir do tamanho da massa do tumor. Em curto
prazo, após 6 meses do tratamento, o resultado obtido foi de 25,6 % de remissão
completa, 46,4 % de resposta parcial, 15,3 % não obtiveram mudança e em 12,7 %
a doença progrediu. A taxa de sobrevida global em 3 anos foi de 58,8 %. Estes
resultados clínicos mostram que a ETT é simples, segura e eficaz, fornecendo um
método alternativo para o tratamento de câncer de pulmão que são
convencionalmente inoperáveis e que não são sensíveis a quimio ou a radioterapia
(XIN et al., 1997).
De acordo com os dados coletados, por Xin e colaboradores em 156 hospitais
na China, onde foram tratados 8.240 pacientes, de 1987 a 1997, cerca da metade
dos pacientes com câncer tinham tumores malignos superficiais, enquanto os
restantes sofriam de neoplasias viscerais. Como resultado ocorreu remissão total ou
resposta parcial em 22 % dos casos malignos e em 94 % dos casos benignos, 5
anos após o tratamento (XIN, 1998). As características do tratamento aplicado
nestes pacientes foram: eletrodos anódicos e catódicos inseridos alternadamente a
2 cm de distância entre eles, ao longo do tumor. A carga dependeu do tipo de tumor;
por exemplo, tumores sólidos, foram tratados com 80 a 100 C / cm de diâmetro do
tumor, enquanto o hemangioma benigno, que é rico em eletrólitos, foi tratado com 30
a 40 C / cm (XIN, 1998).
Dezesseis pacientes com estenose esofágica maligna inoperável foram
tratados com cerca de 300 a 560 coulombs. A gravidade da disfagia diminuiu com
melhora, inclusive, em 6 pacientes que tinham lesões obstruindo totalmente o
esôfago, porém 2 pacientes foram não responsivos. Não houve complicações
relacionadas com a ETT (WOJCICKI et al., 1999).
58
Na Austrália, um grupo de pesquisadores tratou 9 pacientes com metástases
hepáticas, inoperáveis. A carga variou entre 200 a 1.000 C, de acordo com o volume
do tumor e o tempo variou de 42 a 210 minutos. A platina foi escolhida como o
material do eletrodo. Sete pacientes não apresentaram evidência de recorrência
(FOSH et al., 2002).
Em outro trabalho, um homem, vietnamita, de 68 anos de idade, com cirrose
hepática foi encaminhado com um carcinoma hepatocelular de 4,2 x 4,2 cm,
assintomático, visualizado por tomografia computadorizada. Seu histórico incluía
doença obstrutiva crônica das vias aéreas, diabetes insulina-dependente e hepatite
B. O paciente recusou a quimioterapia sistêmica, mas pediu algum tipo de
tratamento. A eletroterapia foi aplicada, com dois eletrodos de platina inseridos
diretamente no tumor, utilizando uma carga de 1.500 C, por 288 min. Não houve
hemorragia ou extravasamento de bile, mas o paciente evoluiu com colapso
pulmonar com um pequeno derrame pleural. A contagem de células brancas
permaneceu normal. As enzimas hepáticas aumentaram 3 vezes o limite superior do
normal na primeira semana, mas voltaram ao normal após 6 semanas. O paciente
teve alta sete dias após o procedimento. O principal efeito colateral observado após
o tratamento foi febre de curta duração, que voltou ao normal no prazo de 3 dias e
teve o mínimo de interferência com a fisiologia geral do paciente. Um único
tratamento reduziu significativamente a massa do tumor para 3,1 × 3,4 cm após uma
semana do procedimento e para 2,5 × 2,8 cm 3 meses após o procedimento (FOSH
et al., 2003).
59
Li e colaboradores estudaram a aplicação de CE em hemangioma lingual, um
tipo de tumor benigno geralmente encontrado na cavidade oral. Trinta e seis
pacientes com hemangioma lingual foram tratados com agulhas de platina (1 ânodo :
1 cátodo), em número estimado de acordo com a forma e o tamanho do tumor, de
modo a cobrir todo o tumor com um espaço de 1 - 1,5 cm entre uma agulha e outra.
A corrente utilizada foi de 100 a 120 mA e a duração do tratamento foi até que, por
palpação, o tumor estivesse rígido e contraído. O total de energia utilizada foi, em
geral, de 100 C / cm de diâmetro do tumor. Do total de 36 pacientes, 32 receberam
apenas uma aplicação e os outros 4 receberam duas aplicações. Entre os 36
pacientes tratados 80,6 % tiveram 76 % de redução, comparados ao tamanho inicial
e todos os pacientes tiveram a forma e função da sua língua restaurada ao normal.
Todos os pacientes foram acompanhados entre 1 e 2 anos e recaídas ocorreram em
4 pacientes (LI et al., 2006).
Em outro trabalho quarenta e quatro homens, com idade média de 63,1 anos,
com diagnóstico de câncer de próstata foram tratados com CC. O tratamento
consistiu em 3 aplicações, com intervalo de uma semana entre elas, com carga total
de 350 C. O acompanhamento foi realizado em 3, 6 e 12 meses. Todos os pacientes
toleraram a CC e o volume do tumor, determinado por ressonância magnética,
diminuiu em média de 1,90 a 1,12 cm3, o que correspondia a uma redução
significativa de 41 %. Um paciente teve remissão completa e 18 remissão parcial
após 12 meses da terapia. Não houve alteração no tecido normal, e nem nódulos
linfáticos ou metástases ósseas foram detectados nos pacientes (VOGL et al.,
2007).
60
Em Cuba, quatro pacientes foram tratados, sendo três do sexo feminino, duas
com carcinoma ductal invasor e uma com liposarcoma, além de um paciente do sexo
masculino com metástase ganglionar. Todos eram pacientes em estado avançado
da progressão do câncer, impossibilitados de serem operados, nem tão pouco
poderiam receber quimioterapia ou radioterapia. O tratamento foi realizado com
eletrodos de platina e com carga entre 80 e 100 C. O número de eletrodos foi
calculado caso a caso, sendo a distância entre eles de 2 cm. Como resultado, os
quatro pacientes toleraram bem as sessões de tratamento. Após a eletroterapia, no
local de aplicação apareceram células com aspecto amorfo e granular, típico padrão
de necrose, além da presença de líquido purulento. Em uma das pacientes com
carcinoma ductal obteve-se 80 % de redução do volume do tumor após sete meses
da aplicação e para a outra paciente, pelo mesmo tempo, a redução foi de 90 %. O
paciente com metástase ganglionar no sétimo mês após a ETT teve um decréscimo
de 90 % do volume do tumor, porém outra metástase apareceu e o paciente não
resistiu e faleceu. A quarta paciente com liposarcoma faleceu 6 meses após a
aplicação por complicações da doença (JARQUE et al., 2007).
As respostas obtidas do tratamento de tumores benignos e malignos em
humanos nos possibilita concluir que a eletroterapia é um tratamento seguro,
considerando os baixos ou ausentes efeitos colaterais. A resposta completa de
remissão dos tumores não é obtida em uma grande porcentagem dos pacientes
tratados, mas, geralmente estes pacientes já seguem para o tratamento com
eletroterapia em um estágio avançado da doença, possivelmente, tendo já se
submetido a um ou mais tratamentos convencionais. Apesar disso, a porcentagem
de remissões é considerável, sendo maior em tumores benignos do que em
malignos.
1.5 Avaliação do potencial genotóxico
61
Genotoxicidade pode ser considerado um termo geral, que se refere tanto às
alterações na estrutura ou na disposição dos cromossomos (clastogenicidade)
quanto às alterações nas sequências de pares de bases do DNA (mutagenicidade),
após exposição a um agente (AL-SABTI & METCALFE, 1995). Este agente pode
ser, por exemplo, um medicamento ou um tratamento. O FDA, por meio do
International conference on harmonisation of technical requirements for registration
of pharmaceuticals for human use (ICH) preparou um guia com orientações sobre
testes de genotoxicidade e interpretação de dados para produtos farmacêuticos para
uso humano (ICH, 2012).
As características gerais indicadas como teste padrão são as seguintes:
avaliação de mutagenicidade em um teste de mutação reversa bacteriana e de
genotoxicidade em células de mamíferos in vitro e/ou in vivo. No teste in vivo para
danos genéticos podemos obter elementos mais relevantes, devido à absorção, a
distribuição, o metabolismo e a excreção, os quais podem influenciar a atividade
genotóxica de um composto. Os resultados negativos obtidos a partir da aplicação
destes protocolos fornecem uma garantia suficiente da ausência de atividade
genotóxica e excluem a necessidade de testes adicionais. A obtenção de resultados
positivos impõe que tal produto ou técnica seja testada de forma mais ampla (ICH,
2012).
Os testes recomendados pelo ICH são: (i) teste de mutação reversa em
bactérias; (ii) avaliação in vivo da genotoxicidade, geralmente um ensaio de
micronúcleos usando células hematopoiéticas de roedores (ICH, 2012).
1.5.1 Ensaio de mutação reversa bacteriana
Os bioensaios microbiológicos permitem investigar a genotoxicidade e o
potencial carcinogênico de diferentes tratamentos e fármacos. Desta forma,
inúmeros testes microbiológicos foram desenvolvidos visando à elucidação dos
elementos e mecanismos, envolvidos no dano genético (McCANN & AMES, 1976).
Um dos ensaios mais utilizados é o Mutateste, também conhecido como
Teste de Ames. O motivo deste nome é pelo teste ter sido desenvolvido pelo Dr.
Bruce Ames e colaboradores na década de 70.
62
O princípio do teste é o uso de cepas mutantes na produção de histidina, que
se tornam revertentes (reversão de auxotrofia His- para prototrofia His+, ou seja, para
produção de histidina) mediante danos genéticos específicos. As cepas padrão são
TA97, TA98, TA100 e TA102, cada uma destas linhagens é mutada de forma
diferente no operon da histidina, o que permite que tenham especificidade na
detecção de um determinado agente mutagênico.
1.5.2 Micronúcleo
O ciclo celular é tradicionalmente dividido em fases distintas, na fase de
mitose o envelope nuclear da célula se rompe e o conteúdo nuclear se condensa em
cromossomos visíveis e os microtúbulos se reorganizam para formar o fuso mitótico
que irá separar os cromossomos; à medida que a mitose prossegue, os
cromossomos já duplicados são alinhados no fuso mitótico se encontrando prontos
para a segregação na fase chamada metáfase. Os cromossomos então se movem
para os polos do fuso (anáfase) onde são condensados para formar os núcleos
intactos (telófase). Neste ponto a célula é desdobrada em duas por um processo
chamado citocinese, considerada a última fase da mitose (Figura 8). Na maioria das
células a fase mitótica dura cerca de uma hora, um período mais longo leva quando
se vai de uma fase mitótica a outra, fase conhecida como interfase (ALBERTS,
1997).
63
Figura 8. Eventos da divisão celular. A figura representa, de forma resumida, cinco fases que a célula atravessa em seu ciclo de vida até completar sua divisão. Na prófase, ocorre a duplicação do DNA e dos centríolos. A pró-metáfase antecede a metáfase e nesta o DNA alinha-se no eixo central enquanto os centríolos iniciam sua conexão com ele. Na anáfase, a divisão começa com os cromossomos migrando para lados opostos da célula e na ultima fase da mitose, a telófase, a membrana celular se divide em duas partes, formando, assim, duas novas células. Fonte: adaptado de ZHENG, 2010.
Durante a divisão celular é possível avaliar danos que ocorrem no DNA, por
meio da análise e quantificação de estruturas conhecidas como corpúsculos de
Howell-Joly ou micronúcleos (MN) (HEDDLE, 1973; SCHMID, 1975). Os
micronúcleos são conceituados como corpúsculos extranucleares formados durante
a mitose, resultantes de quebras cromossômicas, formando fragmentos acêntricos,
ou como consequência de cromossomos inteiros que não se prenderam ao fuso
mitótico e dessa forma não chegam aos polos das células durante a mitose
(ALBERTINI et al., 2000). Apresentam-se visivelmente separados do núcleo principal
da célula possuindo um tamanho que corresponde de 1/5 a 1/20 do tamanho deste
núcleo e não ultrapassam em 1/3 o tamanho do núcleo principal. Possuem ainda
bordas distinguíveis e com a mesma refringência do núcleo principal (AL-SABTI &
METCALFE, 1995).
64
A análise dos micronúcleos pode ser feita da medula óssea, de células do
epitélio bucal, dos brônquios e da bexiga e de sangue periférico. Podem-se analisar
linfócitos, eritrócitos nucleados, reticulócitos, pois, estas são populações celulares
capazes de se dividir e a análise deve ser feita após um único ciclo, pois, existe a
incerteza da permanência destas estruturas por mais de um ciclo de divisão
(FENECH, 2000).
O teste do micronúcleo in vivo, referendado pela Organisation for Economic
Co-operation and Development (OECD, 2007) é um método citogenético
relativamente simples e rápido de avaliação de mutagenicidade induzida. Como
princípio, os animais são expostos à substância a ser testada através de uma via
apropriada. Os animais são então eutanasiados em tempos apropriados após o
tratamento e o sangue periférico retirado, preparado e corado (FENECH, 2000).
Desta forma, o ensaio do micronúcleo tem como finalidade identificar
substâncias aneugênicas (produzem segregação cromossômica anormal) e
clastogênicas (produzem dano no cromossomo), que não são passíveis de reparo.
Atualmente, é um dos ensaios mais bem estabelecidos de citogenética in vivo no
campo da toxicologia genética, tendo em vista que detecta mutações
cromossômicas. Este ensaio pode ser considerado como marcador precoce para a
carcinogênese, uma vez que este tipo de dano é encontrado em células de
pacientes com câncer (BONASSI et al., 2007)
65
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar a mutagenicidade, a genotoxicidade e o estresse oxidativo da
aplicação de corrente elétrica contínua de baixa intensidade (CC) associada
ou nao a nanopartículas de L-tirosina, bem como a avaliação cardíaca.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar a mutagenicidade induzida pela CC pelo teste de mutação reversa
bacteriana, na presença e na ausência de nanopartículas de L-tirosina por
ensaios in vitro, em Salmonella typhimurium (cepas TA97, TA98, TA100 e
TA102);
Verificar se a CC, in vivo, provoca danos no cromossomo ou segregação
cromossômica através da quantidade de micronúcleos, em sangue periférico
de camundongos C57Bl/6;
Avaliar a resposta cardíaca dos camundongos C57Bl/6 durante a aplicação
da eletroterapia por meio de análise eletrocardiográfica e aferição da pressão
arterial sistólica, diastólica e média;
Avaliar o estresse oxidativo pelo tratamento com CC, in vivo, em
camundongos C57Bl/6, pelos ensaios de análise da produção de ERO e de
marcadores de dano oxidativo;
Interpretar alterações histológicas em hepatócitos tratados por CC, de
camundongos C57Bl/6, por ETT, por meio de microscopia óptica.
66
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material
As matérias-primas, solventes e os reagentes utilizados possuíam grau
analítico e os equipamentos utilizados foram previamente calibrados. Todas as
soluções e tampões foram preparados com água destilada e deionizada. Os
equipamentos são identificados com seus fabricantes e modelos ao longo do texto e
os reagentes identificados no Anexo 1.
3.2 Preparo da suspensão de nanopartículas de L-tirosina
As nanopartículas foram produzidas na forma de emulsão água/óleo/água
(A/O/A), pelo método de dupla emulsificação e evaporação do solvente, conforme
CAMPOS et al., 2010. A fase interna foi preparada com uma solução de 0,4 mg / mL
do aminoácido L-tirosina, em água destilada, com o auxílio de um banho de
ultrassom por 20 minutos. A esta solução foi acrescido um estabilizante, o álcool
polivinílico (PVA) a 0,5 %. O PVA é um polímero sintético, solúvel em água, atóxico,
hidrofílico e biodegradável (JADHAV et al., 2015). Esta solução aquosa foi
emulsificada com uma fase orgânica composta do polímero poli-ε-caprolactona
(PCL), em quantidade de 100 mg, dissolvido em 5 mL diclorometano (DCM),
formando a fase externa.
Essa primeira emulsão (A/O) foi gotejada por 5 minutos em uma solução
aquosa externa formada de PVA a 0,5 % com L-tirosina a 0,6 mg / mL com o auxílio
de um sonicador (Hielscher UP100H® - Ultrasonic processor). O solvente orgânico,
diclorometano, foi evaporado à temperatura ambiente (28 ºC), com suave agitação,
promovida por um agitador magnético, durante 3 horas.
67
Em seguida, a emulsão foi centrifugada (Sorvall RC-5B – Du Pont
Instruments) a 10.000 rotações por minuto, por 40 minutos a 20 ºC e lavada com
água destilada. Este processo de centrifugação com posterior lavagem foi repetido
mais duas vezes, e o sobrenadante descartado após as centrifugações. As Nps
foram ressuspensas em tampão salina fosfato (PBS) na concentração final de 15 mg
/ mL. Essa concentração de Np é equivalente a 45 μg / mL de L-tirosina encapsulada
(CAMPOS, 2008; CAMPOS et al., 2010).
As nanoparticulas de L-tirosina obtidas pelo método descrito acima, possuem
como características: a) o valor de potencial zeta (potencial elétrico), uma
propriedade física de partícula coloidal em suspensão, eletronegativo, de -1,76 ±
0,19 mV (CAMPOS et al., 2010). O valor do potencial zeta reflete a estabilidade
cinética da suspensão. Quando as Nps apresentam valor muito negativo (inferior a –
30 mV) ou positivo (superior a 30 mV) de potencial zeta, tendem a se repelirem
umas às outras, além disso, como a maioria das membranas celulares são
carregadas negativamente, o potencial zeta muito positivo ou negativo pode afetar a
tendência de uma Np permear a membrana (CAMPOS et al., 2010); b) o índice de
polidispersividade (IP) de 0,130 ± 0,02, indicando que a suspensão de Nps
apresenta uma distribuição monomodal, ou seja, a suspensão possui Nps com uma
distribuição de tamanho numa faixa muito estreita (CAMPOS et al., 2010); c)
diâmetro médio das Nps de 269,00 ± 4,90 nm (CAMPOS et al., 2010).
3.3 Ensaio de mutagênese in vitro pelo método de AMES
3.3.1 Cepas bacterianas
Foram utilizadas, nos experimentos, cepas bacterianas de Salmonella
typhimurium TA97, TA98, TA100 e TA102.
O quadro 1 apresenta a sequência de mutações e o alvo no DNA nas cepas
comumente usadas para o teste de Ames. O resultado é visto a partir da presença
de colônias bacterianas mediante estímulo mutagênico (MARON & AMES, 1983).
68
Quadro 1. Relação das cepas de Salmonella typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA102), com caráter
genético relevante e o que causam os agentes mutagênicos nestas cepas (MARON & AMES, 1983).
Cepa Caráter genético relevante Alvo no DNA Detecta agentes que causam
TA97 hisD6610/hisO1242
ΔuvrB rfa pKM101 (ampR) -C-C-C-C-C-C-
Um ou mais nucleotídeos deletados
ou inseridos, alterando a leitura da
tradução (frameshift mutation)
(LEVIN, YAMASAKI & AMES, 1982).
TA98 hisD3052
ΔuvrB rfa pKM101 (ampR) -C-G-C-G-C-G-C-G-
Um ou mais nucleotídeos deletados
ou inseridos, alterando a leitura da
tradução (frameshift mutation)
(ISONO & YOURNO, 1974).
TA100 hisG46
ΔuvrB rfa pKM101 (ampR) -G-G-G-
Substituição em um dos pares GC
(MORTELMANS & ZEIGER, 2000).
TA102
hisG428
wild type rfa pKM101 (ampR)
pAQ1 (tetR)
Ocre (códon de
ponto final)
Transições (mudanças de base
púrica por outra púrica, ou de uma
pirimídica por outra pirimídica) e
transversões (mudanças de base
púrica por pirimídica ou vice-versa)
(LEVIN et al., 1982).
O ensaio de Ames utiliza cepas de Salmonella typhimurium com mutações
específicas para deficiência de histidina para cada cepa: a) mutação no gene rfa que
acarreta a perda parcial da barreira de polissacarídeos da parede bacteriana,
aumentando a permeabilidade da mesma, facilitando a entrada de moléculas
maiores na célula (AMES, LEE & DURSTON, 1973); b) deficiência de reparo (gene
uvrB), ou seja, deleção do gene responsável pelo reparo por excisão, que remove a
base defeituosa e preenche com a base correta, impedindo que esta via de reparo
ocorra e possibilitando assim, a fixação das possíveis mutações, exceto na TA102
(AMES, LEE & DURSTON, 1973); c) fator de resistência à ampicilina inserido em um
plasmídeo (pKM101), esta resistência é um marcador conveniente para detectar a
presença de plasmídeos (MORTELMANS & ZEIGER, 2000) e d) inserção do
plasmídeo pAQ1 na cepa TA102, que confere resistência a tetraciclina, importante
para detecção da presença do plasmídeo e neste foi inserido uma mutação hisG428,
uma mutação ocre (mutação que bloqueia a transcrição gênica por gerar um códon
de ponto final) com o objetivo de amplificar o número de locais alvo, já que esta
69
mutação é revertida por agentes mutagênicos que causam danos oxidativos (LEVIN
et al., 1982).
3.3.2 Manutenção das cepas bacterianas
As cepas utilizadas neste estudo foram mantidas em estoques tipo slantes,
que consistem de meio Lysogeny-Broth (LB) suplementado com timina 50 g / mL e
solidificado com ágar 0,75 %, à temperatura ambiente. Para utilização frequente das
cepas, as culturas foram transferidas dos slantes com auxílio da alça de platina, para
erlenmeyers contendo meio LB líquido com o antibiótico apropriado (ampicilina 20 g
/ mL para todas as cepas e tetraciclina 10 g / mL para a cepa TA102), mantidas a
37 ºC, sob agitação, por 24 horas e então transferida, para criovials com glicerol 85
%, na proporção de 1:1. As cepas bacterianas foram mantidas nestas condições em
estoque, sob refrigeração de -70 ºC.
3.3.3 Obtenção das culturas bacterianas para experimentos
Para obter as culturas de bactérias utilizadas nos experimentos foram
transferidas alíquotas, com auxílio de pipeta de microvolume, dos estoques a -70 ºC,
para Erlenmeyers contendo 8 mL de meio caldo nutriente líquido, com antibiótico
(ampicilina 20 g / mL para todas as cepas e tetraciclina 10 g / mL para a cepa
TA102). Estas culturas foram incubadas, a 37 ºC, com agitação de 190 rpm, durante
a noite, para que alcançassem a fase estacionária de crescimento
(aproximadamente 109 cél / mL). Em seguida, a suspensão bacteriana foi
centrifugada a 8.000 rpm, por 10 minutos, a 4 ºC e ressuspensa em 8 mL de PBS.
Para os experimentos com nanopartículas de L-tirosina as bactérias foram
ressuspensas com 8 mL de suspensão das nanopartículas (concentração final de Np
de 15 mg / mL) em PBS.
O PBS foi o tampão escolhido para os estudos in vitro por notáveis motivos,
como: (a) presença de cloreto, indispensável no tratamento eletroquímico; (b)
tonicidade semelhante aos meios fisiológicos; (c) trabalhos anteriores do grupo
validando o uso deste tampão; (d) boa condutividade elétrica; (e) faixa de pH
tamponado semelhante aos meios fisiológicos (VEIGA et al., 2000).
70
3.3.4 Sistema experimental in vitro
O sistema experimental de eletroestimulação foi constituído por uma placa de
24 poços, com volume interno de 3 mL cada poço, sendo cada um preenchido com 2
mL da suspensão a ser estudada. Três poços foram interligados por pontes de papel
de filtro (5,3 cm x 0,8 cm), que permitem a passagem do fluxo de elétrons.
A esta placa foi adaptada uma tampa removível, contendo eletrodos de
platina-ródio (90 - 10 %), retangulares, de extensão de 1,0 cm de largura x 1,5 cm de
altura x 0,1 cm de espessura, que ficam imersos na solução a ser tratada, conforme
observado na Figura 9.
Neste sistema experimental a suspensão celular foi exposta separadamente a
três diferentes fluxos, o fluxo anódico (FA), formado pelo poço conectado ao eletrodo
de polo positivo; o fluxo catódico (FC), no poço conectado ao eletrodo de polo
negativo; e o fluxo eletro-iônico (FEI), que está no poço que não tem contato com
eletrodo, mas, somente com o fluxo de elétrons gerado pela corrente e o recebe pela
ponte de papel de filtro (VEIGA et al., 2005). Esta placa foi adaptada a uma fonte de
corrente elétrica contínua (Instruterm – FA-3050) que gera uma diferença de
potencial (ddp), cuja intensidade é monitorada por um multímetro digital (Icel-MD-
6500). A suspensão celular foi adicionada nos três poços, no volume de 2 mL em
cada poço.
71
Figura 9. Representação esquemática do sistema experimental de 24 poços usado para estímulo elétrico in vitro. Os poços foram interconectados por ponte de papel de filtro, umedecidos com tampão eletrolítico PBS. Os eletrodos de platina, com polaridade positiva e negativa foram instalados na tampa da placa e inseridos no conteúdo dos poços, fechando o circuito. Este sistema foi ligado a uma fonte de CC e a um multímetro. A suspensão celular foi distribuída em cada poço, no volume de 2 mL. Este sistema nos permite distinguir entre três fluxos diferentes, o fluxo anódico (FA) presente no poço em contato com o anodo; o fluxo catódico (FC) no poço com o cátodo; e o fluxo eletro-iônico (FEI) no poço onde não há presença de eletrodos. Fonte: adaptado de Gomes et al., 2012.
3.3.5 Ensaio de citotoxicidade celular bacteriana após estímulo elétrico
Para determinarmos a sensibilidade das cepas à corrente elétrica, ou seja, a
carga letal, em coulombs, que leva a 10 % de sobrevivência (DL10) as suspensões
bacterianas de Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100 e TA102, em tampão
PBS, na concentração de 1,0 x 109 cél / mL, foram estimuladas, com 0 C; 1,44 C;
2,16 C; 2,88 C e 3,6 C de corrente elétrica contínua, separadamente.
72
O mesmo procedimento foi realizado para determinação de citotoxicidade das
cepas frente ao uso de nanopartículas de L-tirosina. Porém, neste as suspensões
bacterianas de S. typhimurium TA97, TA98, TA100 e TA102, na concentração de 1,0
x 109 cél / mL, foram ressuspendidas em tampão PBS, acrescentado de 15 mg / mL
de Nps. Esta suspensão foi adicionada nos três diferentes poços da placa do
sistema experimental, no volume de 2 mL e submetida, separadamente, às cargas
de 0 C; 1,44C; 2,16 C; 2,88 C e 3,6 C.
A cada carga aplicada, alíquotas de 20 L eram retiradas de cada situação
experimental (FA, FEI e FC). Destas alíquotas foram feitas diluições seriadas, em
tampão PBS, plaqueadas em meio LB sólido, com espalhamento por pérola de vidro
e incubadas por 24 horas, a 37 ºC. Em seguida, o número de unidades formadoras
de colônia (UFC) era quantificado.
Importante ressaltar que quando da utilização de nanopartículas de L-tirosina,
esta foi deixada em suspensão com as bactérias, por cerca de 30 minutos, antes da
aplicação da corrente elétrica (CAMPOS et al., 2010). Este tempo deveu-se a
necessidade de liberação do ácido aminado encapsulado, do polímero poli-Ɛ-
caprolactona. Este polímero é semicristalino, o que permite a entrada de água
dentro da matriz polimérica; facilitando a liberação de substâncias hidrofílicas por
difusão, através dos poros, riados durante a evaporação do solvente, quando da
preparação das Nps (BERMAN, PEREZ & ZELL, 2006).
3.3.6 Ensaio de mutagênese pelo método de AMES
As suspensões bacterianas de Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100 e
TA102, na concentração de 1,0 x 109 cél / mL, em tampão PBS, com e sem adição
de Np, foram estimuladas, com corrente elétrica contínua. Após obtenção da DL10 a
carga escolhida para os ensaios foi de 1,44 C, sem a presença de nanopartículas, e
de 2,16 C na presença das mesmas.
73
Foram utilizados quatro diferentes pontos de amostragem (no volume de 100
µL cada), das três situações experimentais (FA, FEI e FC), uma retirada de amostra
logo após a passagem de corrente elétrica (0 min) e uma nos tempos de 10, 20 e 30
minutos depois do término da passagem de CC, com a finalidade de manter a
suspensão bacteriana em contato com os produtos de eletrólise e verificar se estes
produtos formados posteriormente à passagem de corrente elétrica poderiam ser
mutagênicos. O Quadro 2 representa de forma resumida os tempos em que as
alíquotas foram retiradas, de cada fluxo (FA, FEI e FC), de cada cepa (TA97, TA98,
TA100 e TA102) após 1,44 C de CC sem o uso de nanopartículas e de 2,16 C de
CC quando as nanopartículas de L-tirosina eram adicionadas.
Quadro 2. Quadro resumindo os quatro tempos de retiradas de alíquotas das cepas TA97, TA98, TA100 e TA102, após passagem de corrente elétrica contínua, na ausência de nanopartículas de L-tirosina e quando acrescentados da suspensão de nanopartículas, nos três fluxos, anódico (FA), catódico (FC) e eletro-iônico (FEI).
Cepa Fluxo Carga Tempo de retirada da amostra
TA97 TA98 TA100 TA102
FA 1,44 C sem Np
ou 2,16 C com Np
0 min (logo após término da ETT)
10 min após ETT
20 min após ETT
30 min após ETT
FEI 1,44 C sem Np
ou 2,16 C com Np
0 min (logo após término da ETT)
10 min após ETT
20 min após ETT
30 min após ETT
FC 1,44 C sem Np
ou 2,16 C com Np
0 min (logo após término da ETT)
10 min após ETT
20 min após ETT
30 min após ETT
Para este experimento foi realizado um grupo controle, por irradiação com luz
ultravioleta C (UV-C), no comprimento de onda de 254 nm, nas seguintes doses:
TA97, TA98 e TA100 foram usadas doses de 2 J / m2 e para TA102 doses de 40 J /
m2. Esta diferença de dose de UV-C entre as cepas ocorre porque as três primeiras
cepas possuem uma mutação no gene uvrB o que leva a uma inativação no reparo
por excisão, ou seja, maior sensibilidade a radiação UV, enquanto a cepa TA102 é
selvagem, portanto, possui resistência a UV, podendo-se aplicar uma dose maior.
74
O volume aliquotado foi adicionado em um tubo de hemólise contendo 2,5 mL
de meio GS acrescentado de solução mista (em banho-maria), homogeneizado e
plaqueado em meio Vogel-Bonner (MEVB). Incubaram-se as placas por 48 h a 37
ºC. Além disso, também foram retiradas alíquotas de 20 µL, de cada situação
experimental, diluídas em tampão PBS, plaqueadas em meio LB sólido, com
espalhamento por pérola de vidro e incubadas por 24 horas, a 37 ºC para se verificar
a sobrevivência. O número de revertentes foi quantificado.
3.4 Ensaios in vivo
3.4.1 Animais
As recomendações são de que, para testes genéticos camundongos, jovens e
saudáveis, sejam preferidos. A preferência por animais do sexo masculino foi
opcional por não se tratar de um tratamento sexo-específico (OECD, 2007).
Desta forma empregamos camundongos, machos, com cerca de 8 a 10
semanas de vida, com peso variando entre 12,0 e 18,0 g (HAYASHI, SOFUNI &
MORITA, 1991). Para todos os ensaios foram utilizados camundongos da linhagem
C57Bl/6, já que esta é muito empregada como modelos fisiológicos ou patológicos,
incluindo os ensaios de genotoxicidade. Além disso, são animais de fácil obtenção,
manutenção, manuseio e baixo custo. Esta é também a primeira linhagem cujo
genoma foi completamente sequenciado em 2005, perdendo apenas para o genoma
humano (JOHNSON, 2012). Outros trabalhos com eletroterapia também utilizaram
esta linhagem (MIKLAVČIČ et al., 1997a, 1997b).
Os camundongos foram mantidos em gaiolas com capacidade para 6 animais
e antes dos experimentos passaram por um período de 5 dias de aclimatação. Os
camundongos receberam ração e água ad libitum. O laboratório de experimentação
foi mantido com temperatura de 22 ± 3º C, ciclo claro-escuro de 12 horas, e umidade
entre 50 e 60 % (OECD, 2007). Os procedimentos foram realizados no período da
manhã/tarde, entre 10: 00 h e 15: 00 h. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética
no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob o número de
referência FARMACIA011-06/16 (Anexo 2) e pelo Comitê de Ética de no Uso de
Animais do Instituto Federal do Rio de Janeiro, sob o número de referência 003-
2014 (Anexo 3).
75
3.4.2 Sistema experimental in vivo
Para todos os tratamentos os animais foram previamente anestesiados com
dois fármacos em conjunto, o cloridrato de cetamina 10 % na concentração final de
100 mg / kg (Dopalen - VETBRANDS) e o cloridrato de xilazina 2 % na concentração
final de 5 mg / kg (Anasedan - VETBRANDS), ambos diluídos 1:10 e 1:20,
respectivamente, em soro fisiológico 0,9 % (p/v) (ARBORETO LTDA). A anestesia foi
administrada via intraperitoneal, com seringa descartável de volume de 1 mL.
O cloridrato de cetamina, quimicamente designado por (RS)-2-(2-clorofenil)-2-
(metilamino) ciclohexanona, é um anestésico geral, não barbitúrico, que age como
um antagonista não competitivo de N-metil-D-aspartato (MIRANDA et al., 2011).
Tem ação rápida e produz um estado anestésico caracterizado por profunda
analgesia, reflexos normais da faringe-laringe, tônus muscular esquelético normal,
com estimulação cardiovascular e respiratória, e, ocasionalmente, uma passageira
depressão respiratória mínima. É o anestésico mais adequado para procedimentos
de curta duração, mas pode ser usado, com doses adicionais, para procedimentos
mais longos (DRUGS, 2014).
O cloridrato de xilazina é utilizado em medicina veterinária para a sedação,
analgesia e relaxamento muscular. É um agonista adrenérgico α-2 e tem efeitos
sobre os receptores pré-sinápticos e pós-sinápticos do sistema nervoso central e
periférico. É um medicamento útil durante a cirurgia, por si só, ou em combinação,
para a redução do estresse e da dor (BAYER, 2014).
Para os experimentos onde houve necessidade de prolongar a anestesia, a
metade da dose de cloridrato de cetamina foi utilizada, uma vez que, o cloridrato de
xilazina age por mais tempo que a cetamina, podendo levar à overdose (MIRANDA
et al., 2011). O uso concomitante dos dois medicamentos tem suas vantagens, já
que existe um complemento dos resultados (Quadro 3) e o tempo de início dos
efeitos é de, no máximo, 3 minutos após a aplicação.
76
Quadro 3. Resumo dos efeitos dos anestésicos xilazina e cetamina, utilizados nos experimentos in vivo (adaptado de Bayer, 2014).
Xilazina Cetamina
Relaxamento muscular Rigidez muscular
Analgesia profunda (visceral) Analgesia superficial (cutânea)
Queda no ritmo cardíaco Aumento da frequência cardíaca
Eliminado mais lentamente do que a
cetamina
Alucinógeno quando o paciente recupera
a consciência
Para anestesia, o animal era manipulado delicadamente para evitar estresse
e era pesado. Qualquer tratamento só era iniciado quando o animal perdia
totalmente o reflexo. A hipotermia era prevenida, pois, os animais eram mantidos à
temperatura de cerca de 25 ºC, com auxílio de um aquecedor de ambiente
(CADENCE AQC412). Para prevenir o ressecamento das córneas aplicou-se
solução de NaCl a 0,9 % (p/v) (CHOU et al., 1997). A aplicação da corrente elétrica
pode causar desconforto e dor ao animal. Desta forma, os animais, quando mantidos
na sala de experimentação, após tratamento, receberam o analgésico e anti-
inflamatório cetoprofeno 100 mg/ 2 mL (PROFENID – SANOFI), por via subcutânea,
na concentração final de 5 mg / kg (MATSUMIYA et al., 2012).
Os tratamentos com corrente elétrica contínua foram realizados com a
inserção de duas agulhas estéreis, inseridas por meio de um aparelho construído,
pelo grupo, para esta finalidade.
Após todos os ensaios, os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical. Para tal, os animais foram previamente anestesiados e após eutanásia
foram verificados os reflexos. No ensaio de micronúcleo os animais foram
eutanasiados por exsanguinação por punção cardíaca, com anestesia prévia e caso
o animal ainda se encontrasse com vida era realizado o deslocamento cervical.
77
3.4.3 Protocolo e carga de corrente elétrica aplicada
O primeiro desafio deste trabalho foi escolher a carga ideal de ETT a ser
aplicada, assim como a forma mais adequada de aplicação.
A primeira questão era qual deveria ser o material dos eletrodos, utilizados na
aplicação da ETT, e qual deveria ser o seu formato físico. O ideal, como visto no
item 2.4.2.1, deste trabalho, seria o uso de eletrodos inertes (DAVID et al., 1985;
MIKLAVČIČ et al., 1993; KIM et al., 2007) e fáceis de introduzir nos animais, sem ser
invasivos a ponto de causarem algum dano. Desta forma, escolhemos agulhas de
aço inoxidável (DAVID et al., 1985; NILSSON et al., 2000). Este aço inoxidável é do
tipo martensítico, formado de ligas de ferro-cromo contendo de 12 a 14 % de cromo,
e com alto teor de carbono (KLOECKNER, 2014). Porém, este material não é
totalmente inerte, desta forma, as agulhas eram descartadas a cada aplicação de
corrente elétrica. Estas agulhas eram estéreis, o que nos dava maior segurança para
aplicarmos nos animais, sem provocar nos mesmos algum tipo de infecção. As
agulhas tinham o tamanho de 13 mm de comprimento x 4,5 mm de diâmetro, ou
seja, finas o suficiente para não causar lesões ao serem inseridas nos animais.
Foi necessário verificar qual a quantidade de eletrodos a ser usada, a distância
entre eles e a posição que deveriam ser inseridos (vertical ou horizontalmente).
Como o objetivo do trabalho é verificar a genotoxicidade e possíveis efeitos da ETT,
os animais devem ser saudáveis (TICE et al., 2000), neste caso, não há um tumor
para tratamento. Desta forma, consideramos o uso de apenas dois eletrodos, o
anodo e o catodo, o mais simples e o mais aplicável para se comparar aos
tratamentos.
A distância entre os eletrodos não é padronizada, sendo na maioria das vezes
empírica nos estudos. Escolhemos a distância de 10 mm, entre o ânodo e o cátodo,
pois, foi o melhor intervalo citado em trabalhos (CHOU et al., 1997; ROBERTSON et
al., 1998; REN et al., 2001; YOON et al., 2007; MIKHAILOVSKAYA et al., 2009).
Segundo Ren e col. o espaçamento dos eletrodos não é fator importante dentro de
um intervalo menor que 10 mm (REN et al., 2001). Além disso, este tamanho é
adequado para inserção em dois lóbulos diferentes do fígado do camundongo e no
músculo da coxa da pata posterior, ou seja, consiste em uma adequada dimensão
para os órgãos.
78
Para padronizar a distância, a profundidade atingida em cada órgão e a força
exercida para inserção das agulhas, construiu-se um equipamento, utilizando
parafusos micrométricos e macrométricos, uma haste com base, duas seringas,
presilhas e um adaptador para as agulhas (Figura 10). Este equipamento foi
chamado de micromanipulador, baseando-se no trabalho de Chou e colaboradores
(CHOU et al., 1997) e com ele foi possível separar as agulhas, uma da outra, com
distância de 10 mm. O micromanipulador também permitiu que a profundidade que a
agulha atravessa o órgão seja sempre a mesma, assim como a força aplicada para
inserção das agulhas. As agulhas foram inseridas de forma perpendicular ao tecido
(CHOU et al., 1997; CIRIA et al., 2004).
Figura10. Fotos do micromanipulador, construído para melhor inserção das agulhas nos animais. Equipamento construído pela equipe utilizando parafusos micrométricos e macrométricos, uma haste com base, duas seringa, presilhas e um adaptador para as agulhas. A partir deste foi possível separar as agulhas, uma da outra, com distância de 10 mm e padronizar a profundidade que a agulha passa pelo órgão. Fonte: arquivo pessoal.
79
O órgão para aplicação da eletroterapia deveria ter tamanho suficiente para
que fossem inseridas as agulhas, desta forma, escolhemos o fígado e o músculo. O
fígado foi um dos órgãos de escolha, por seu tamanho e por ser possível, separar os
lóbulos. O volume médio do fígado de camundongos machos da linhagem C57BL/6,
entre 8 e 12 semanas, é de 1,39 ± 0,23 cm3 (MELLOUL et al., 2014). O fígado dos
camundongos é composto por quatro lóbulos, o esquerdo, o central, o direito e o
caudado (THOOLEN et al., 2010), conforme pode ser visualizado na imagem
ilustrativa, figura 11. Desta forma, poderíamos separar a aplicação do fluxo anódico
(FA) do catódico (FC), como se estivéssemos aplicando em dois órgãos diferentes e
ter um dos lóbulos, como um controle, com passagem de corrente elétrica, mas sem
contato com os eletrodos (FEI) (ROBERTSON et al., 1998).
Figura 11. Imagem ilustrativa dos lóbulos do fígado de um camundongo. Lóbulo mediano, esquerdo, direito e o lóbulo caudado. A aplicação de um eletrodo em cada lóbulo (direito e esquerdo) nos possibilita estudar de forma diferenciada a resposta do ânodo e do cátodo, além da passagem de corrente elétrica sem contato com eletrodo. No lóbulo esquerdo é aplicado o fluxo catódico (FC), no lóbulo direito o fluxo anódico (FA) e o lóbulo mediano não entra em contato com eletrodos, mas recebe a passagem de corrente elétrica, sendo o fluxo eletro-iônico (FEI). Na imagem também é possível identificar os rins direito e esquerdo, a veia cava inferior e a vesícula. Fonte: adaptado COOK, 2014.
80
Já o músculo escolhido foi da coxa da pata traseira, um músculo do tipo
esquelético, de tamanho relativamente grande, e desta forma de fácil aplicação das
agulhas. Cada ensaio teve seu local mais indicado.
Para os ensaios de espécies reativas de oxigênio, foi escolhido o uso do fígado,
como órgão de aplicação da corrente, pois, o músculo, por ser do tipo esquelético, é
uma fonte de geração de espécies reativas de oxigênio, quando há contração
(JACKSON, EDWARDS & SYMONS, 1985; McARDLE et al., 2001). Como com a
aplicação da CC o músculo contrai, ocorreria formação de ERRO. Desta forma, o
próprio animal estaria gerando as ERO, que poderiam ser confundidas com as
possíveis formadas pela passagem de corrente. Neste caso, não adiantaria ter um
controle, pois, cada animal se movimentaria diferentemente do outro.
Para medir a pressão arterial e realizar o eletrocardiograma, não seria possível
utilizar o fígado como local de aplicação por estar muito próximo do coração (CHOU
et al., 1997), o que poderia gerar alguma interferência por proximidade. Desta forma,
aplicamos a corrente elétrica, para estes ensaios, no músculo. Da mesma forma,
utilizamos o músculo para realizar os ensaios de genotoxicidade.
Depois de verificadas todas as características do modo de aplicação da
eletroterapia verificou-se qual a melhor carga a ser aplicada nos ensaios. Para
escolher o tempo e intensidade recorremos à literatura. A melhor voltagem
encontrada nos trabalhos foi de 10 V (CHOU et al., 1997). Desta forma, aplicamos a
corrente elétrica em dois animais para verificarmos que intensidade de corrente esta
voltagem forneceria. Como resposta, obtivemos o valor de 8 mA.
Para verificar qual a carga ideal para realizarmos os ensaios, escolhemos
uma corrente mais elevada do que a indicada, 16 mA por 10 min e 8 mA por 10 min,
sendo a carga de 9,6 e 4,8 C, respectivamente. Segundo Chou e colaboradores uma
carga maior que 10 C é letal para camundongos (CHOU et al., 1997).
81
Seis camundongos foram pesados, anestesiados e retidos confortavelmente
na posição de decúbito dorsal em placa de isopor. A retirada dos pelos foi feita com
auxílio de uma máquina de tosquiar e, após assepsia, com álcool 70 % (p/p) e gaze
estéril, foram inseridas as agulhas no músculo da coxa da pata traseira direita ou no
fígado. Duas agulhas (descartáveis e estéreis de 13 x 4,5, marca BD) foram
introduzidas de forma transcutânea (verticalmente ao corpo do animal), a uma
distância de 10 mm uma da outra, no músculo supracitado com o auxílio de um
micromanipulador. Estas agulhas estavam diretamente ligadas a uma fonte de
corrente elétrica contínua (Figura 12). Em seguida, a fonte foi ligada.
Figura 12. Sistema experimental para estímulo elétrico in vivo. Os animais são anestesiados e retidos confortavelmente na posição de decúbito dorsal em placa de isopor. Agulhas são introduzidas de forma transcutânea com o auxílio de um micromanipulador. Estas agulhas estão diretamente ligadas a uma fonte de corrente elétrica contínua constante. Também é possível ver na foto um aquecedor de ar que mantém a temperatura em cerca de 25º C. Fonte: arquivo pessoal.
As cargas testadas foram de 4,8 C e 9,6 C em dois animais diferentes, cada,
uma em cada órgão e ambas induziram óbito dos quatro animais. O mesmo ensaio
foi realizado com uma carga menor, de 2,4 C (8 mA por 5 min), onde os animais
sobreviveram.
82
Importante citar que a corrente foi aumentada gradualmente, até a intensidade
desejada. A tensão também foi continuamente monitorada, apresentando variação,
devido a um aumento da resistência. Este aumento da resistência pode ser
decorrente da formação dos gases, cloro e oxigênio, no ânodo, e hidrogênio no
cátodo, que acabam por isolar o eletrodo do tecido (CHOU et al., 1997).
3.4.4 Preparo do material para ensaio do micronúcleo
Os camundongos foram divididos em quatro, cada grupo com um número de
seis animais, conforme Quadro 4.
Neste trabalho seguimos as diretrizes da International Conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for
Human Use (ICH, 2012), que tem o compromisso de promover a agenda 3Rs, ou
seja de substituição; redução; e refinamento das técnicas de analgesia, sedação e
eutanásia, nos ensaios em animais. Para ensaios de genotoxicidade, cada grupo
exposto e seu respectivo controle deve conter pelo menos cinco animais analisáveis;
desta forma, neste trabalho, o número de animais por grupo foi de seis, a fim de ser
o mais próximo do menor número aceitável.
Quadro 4. Divisão dos grupos de animais para o ensaio de genotoxicidade. Cada grupo possui o número de seis animais. Grupo 1 e 2 são os grupos controles positivo e negativo, respectivamente. O grupo controle positivo recebeu a aplicação de uma substância genotóxica, o etilmetanosulfonato e o controle negativo recebeu o mesmo tratamento dos outros grupos, porém sem a passagem de corrente elétrica. Os grupos 3 e 4 receberam tratamento por eletroterapia com duas intensidades de cargas diferentes.
Grupos Metodologia aplicada Número de animais
1 Controle positivo com etilmetanosulfonato 300 mg / kg / dia
6
2 Controle negativo – sem passagem de CC
6
3 Tratamento por CC com carga de 2,4 C
6
4 Tratamento por CC com carga de 1,2 C
6
83
O grupo 1, controle positivo, recebeu oralmente, por gavagem
etilmetanosulfonato (EMS) na dose de 300 mg / kg / dia (Sigma-Aldrich, CAS 62-50-
0). Esta substância é um alquil sulfato, um agente alquilante, com efeito mutagênico
e cancerígeno em mamíferos. Dados genéticos obtidos usando microorganismos
sugerem que a substância EMS pode produzir transições de bases guanina-citosina
(GC) para adenina-timina (AT) e vice-versa, além de inserção de pares de bases ou
exclusão das mesmas, e são capazes de causar rupturas no cromossomo (SEGA,
1984). É aceitável que o controle positivo seja administrado por uma via diferente da
substância de ensaio (OECD, 2010).
No grupo 2, os animais receberam anestesia e aplicação dos eletrodos, mas
não foram submetidos à passagem de corrente elétrica. As aplicações dos eletrodos,
da eletroterapia, dos grupos 2 a 4 foram realizadas no músculo da coxa da pata
traseira (Figura 13). Os animais foram anestesiados e tratados conforme o grupo
que pertenciam. O grupo 3 recebeu uma carga de 2,4 C, a mais alta suportada pelo
animal e o grupo 4, uma dose mais baixa, de cerca de 50 % da dose mais elevada
TICE et al., 2000).
Figura 13. Foto demonstrando a aplicação de ETT em camundongo. Por meio do micromanipulador duas seringas são inseridas no músculo da coxa da pata traseira do animal. O animal, anestesiado, encontra-se contido em placa de isopor preso por agulhas e espuma. Fonte: arquivo pessoal.
84
Todos os tratamentos foram feitos nos tempo 0 h, 24 h e 45 h. Após o
primeiro tratamento os animais foram levados para a sala de animais em
experimentação, onde recebiam água e alimentação ad libitum e eram observados
de tempos em tempos. Este procedimento foi repetido mais duas vezes, um 24
horas após e outro 45 horas após a primeira administração. Três horas após o último
tratamento, ou seja, 48 h após a primeira, os animais foram pesados, anestesiados,
o sangue periférico foi recolhido pela cauda (Figura 14). Após eutanásia por
exsanguinação por punção cardíaca com seringa de 1 mL, observou-se, se
visivelmente, havia sinais de coloração anormal ou anomalias em todos
órgãos/tecidos.
Figura 14. Esquema demonstrando os tempos de cada carga aplicada nos camundongos. Carga 1 no tempo de 0 h, a segunda carga 24 h após a primeira e a carga 3 aplicada 45 h após a primeira carga. Com 48 h após a primeira aplicação retirou-se sangue periférico para ensaio de micronúcleo. Fonte: adaptado de BOWEN et al., 2011.
Na medula óssea, células indiferenciadas se dividem em duas classes, as
linfóides, que irão gerar linfócitos, e as mielóides, que produzirão eritrócitos,
plaquetas, granulócitos e monócitos (LODISH, FLYGARE & CHOU, 2010).
85
Na eritropoiese, processo de produção de eritrócitos (também denominados
como hemácias ou glóbulos vermelhos), as células mielóides se diferenciam em
eritróides megacariocíticas, e estas irão maturando passando pelo estágio de pró-
eritroblasto, onde se tem um núcleo redondo ou ligeiramente ovalado, ocupando
grande parte do citoplasma. Após mitose, se tornam eritroblastos basófilos, tendo no
núcleo, cromatina condensada em grumos e pouca hemoglobina, se corando com
corantes básicos, devido à presença de ácido ribonucleico (MANWANI & BIEKER,
2008; MARK, 2014). Ocorre mais uma mitose e a cromatina vai se condensando
cada vez mais, formando, então, o eritroblasto policromatófilo ou policromático
(PCE) e, posteriormente, o núcleo torna-se pequeno e altamente condensado,
atingindo o estágio de eritroblasto ortocromático ou normocromático (NCE)
(MANWANI & BIEKER, 2008; MARK, 2014).
Posteriormente, ocorre por meio de ondulações citoplasmáticas e contrações,
a expulsão do núcleo e de uma pequena porção do citoplasma; desta forma, a célula
se torna um reticulócito. Estes têm formas irregulares, possuindo RNA e proteínas
que precipitam após fixação e coloração. Os reticulócitos vão maturando, perdem a
forma irregular, ganhando forma bicôncava característica da célula madura, o
eritrócito (MANWANI & BIEKER, 2008; MARK, 2014) (Figura 15).
86
Figura 15. Esquema respresentando a eritropoiese, ou seja, a sequência para a formação de eritrócitos no sangue periférico. Na medula óssea ocorrem as especializações celulares até a liberação do eritrócito no sangue. Fonte: adaptado de https://social.stoa.usp.br/articles/0028/9531/eritropoese_reduzida.pdf
87
Fragmentos de cromossomos ou cromossomos inteiros que são incapazes de
se anexar ao fuso mitótico são deixados para trás como micronúcleos, e isto ocorre
na produção dos eritrócitos policromáticos, pois, a partir deste não há mais divisão
celular (MANWANI & BIEKER, 2008; MARK, 2014).
Logo após ocorre perda gradual de RNA celular e a maturação resulta em um
novo intermediário, ainda imaturo, o eritrócito normocromático, processo que leva de
10 a 30 h. Ao final, são liberados para a circulação do sangue periférico como jovens
reticulócitos (MANWANI & BIEKER, 2008; MARK, 2014).
3.4.5 Obtenção de sangue periférico para ensaio de micronúcleo
O sangue periférico foi obtido da cauda dos animais, sob anestesia, 10 µL
foram colocados em lâmina (duplicata), e realizou-se o esfregaço com auxilio de
lamínula. Depois do esfregaço as lâminas foram secas ao ar livre, por 12 h e fixadas
por imersão em metanol absoluto por 10 min, rinsadas em água destilada e secas ao
ar livre. As lâminas foram coradas com Giemsa (DINAMICA) 5 % (v/v), (diluído em
PBS pH 7,0) por 16 min, lavadas com água destilada para retirar o excesso de
corante e deixadas a temperatura ambiente para secar (HEDDLE, 1973). No
processo de contagem dos micronúcleos foram analisadas 2 mil células (1.000 de
cada lâmina), todas com membranas citoplasmáticas e nucleares intactas, não
sendo analisadas aquelas que estavam sobrepostas ou danificadas (AL-SABTI &
METCALFE, 1995), sob aumento de 1.500 x ao microscópio de campo claro, com
óleo de imersão. As análises foram realizadas em teste cego.
No sangue periférico observam-se os micronúcleos corados nos eritrócitos
anucleados maduros, pois, com a expulsão do núcleo, o eritrócito propriamente dito
cai na circulação sanguínea e os micronúcleos formados ainda permanecem no
citoplasma. Utilizando a coloração Giemsa o micronúcleo apresenta coloração roxa
e o citoplasma celular rosa.
88
3.4.6 Eletrocardiograma
O eletrocardiograma (ECG) é o registro das mudanças no potencial elétrico,
geradas no miocárdio, durante cada fase do ciclo cardíaco. Alterações dos
gradientes iônicos resultam num potencial de ação. A soma dessas cargas elétricas
dá origem a vetores e estas forças vetoriais podem ser detectadas por meio do
eletrocardiógrafo, mediante a colocação de eletrodos na superfície do corpo
(FEHER, 2012). A finalidade deste teste é analisar o ritmo cardíaco, avaliar a
condução do estímulo, a integridade ou anormalidades do sistema de condução e
detectar eventuais sobrecargas das cavidades cardíacas e zonas correspondentes à
ausência de atividade elétrica (FEHER, 2012).
O procedimento da eletroterapia foi realizado com um camundongo sob
anestesia (cetamina 100 mg / kg e xilazina 5 mg / kg). Após constatação da perda
dos reflexos, o camundongo foi posicionado em decúbito dorsal, em uma placa de
isopor. O eletrocardiograma foi monitorado por eletrodos de contato que foram
colocados no membro anterior esquerdo, no membro anterior direito e no membro
posterior esquerdo, presos com auxílio de fio cirúrgico inseridos de forma
subcutânea (Figura 16). Os dados foram obtidos pelo equipamento PowerLabs
(ADInstruments, Austrália) e a detecção, visualização e análise de parâmetros pelo
módulo análise LabChart.
89
Figura 16. Foto do camundongo, anestesiado e na posição de decúbito dorsal, em placa de isopor, apresentando três eletrodos fixados externamente, por meio de um fio de aço inserido subcutaneamente. Dois eletrodos inseridos nos membros superiores e um no membro inferior. Procedimento realizado antes da aplicação de CC. Fonte: arquivo pessoal.
3.4.7 Registros da pressão arterial e da frequência cardíaca com cateter
intravascular
Os animais foram anestesiados e posicionados em decúbito dorsal com os
quatro membros fixados em uma placa de isopor. Após comprovação da sedação
completa do animal, foi realizada a tricotomia, seguida de assepsia do local com
solução de álcool 70 % (p / p).
Posteriormente, foi realizada uma incisão, com a ajuda de um bisturi,
subcutânea de 2 cm na região tricotomizada, através da qual foi possível ter acesso
à artéria carótida esquerda. A artéria foi isolada dos tecidos conectivos e músculos
cervicais, e o cateter de polietileno (MLT0699 (ADInstruments, Austrália) foi inserido
e fixado com nós cirúrgicos para cessar a hemorragia (Figura 17).
90
Figura 17. Camundongo com cateter intravascular inserido na artéria carótida, após anestesia. Fonte: autoria própria.
O conector do cateter foi ligado ao sistema de amplificação e digitalização do
sinal (PowerLab 4/35, ADInstruments, Austrália) para o programa LabChart 8
(ADInstruments, Austrália) arquivar e posteriormente permitir a análise dos dados.
Antes da utilização do cateter, o mesmo era calibrado com o auxílio de manômetro
certificado (ZHAO et al., 2011). Os registros obtidos permitiram então a análise dos
valores, em mmHg, da pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e como cada
pico de pressão arterial se relaciona com um batimento cardíaco, o programa
também calculava o frequência cardíaca em batimentos por minuto.
Após canulação, realizou-se a retirada dos pelos no músculo da coxa da pata
direita e fez-se a assepsia, com álcool 70 % (p/p) e gaze estéril. Foram aguardados
uns 5 minutos para estabilização e depois os camundongos foram submetidos ao
tratamento por eletroterapia com 2,4 C, onde ocorreram os registros de pressão
arterial e frequência cardíaca. O registro foi realizado por 5 minutos antes do
estímulo elétrico, durante os 5 minutos de aplicação do estímulo e por mais 5
minutos depois da retirada dos eletrodos. Após o tratamento os animais foram
eutanasiados. Este experimento foi realizado de maneira independente com 5
camundongos de linhagem C57BL/6.
91
3.4.8 Avaliação e quantificação de espécies reativas de oxigênio
3.4.8.1 Tratamento dos animais
Dezoito camundongos (C57BL/6) foram pesados, anestesiados e retidos
confortavelmente na posição de decúbito dorsal em placa de isopor. Realizou-se o
corte da pele e da membrana peritoneal com auxílio de pinça e tesoura cirúrgica fina
curva, na altura do fígado do animal. O órgão foi exposto e no mesmo introduziu-se,
verticalmente, duas agulhas estéreis e descartáveis, distanciadas 10 mm uma da
outra, com o auxílio de um micromanipulador. Estas agulhas estavam diretamente
ligadas a uma fonte de corrente elétrica contínua, que fornecia ao sistema 2,4 C.
Quatro animais foram utilizados como controle, onde todos os procedimentos acima
foram realizados, exceto pela aplicação da corrente elétrica.
Como o fígado dos camundongos é composto por quatro lóbulos diferentes,
os animais receberam uma agulha em cada lóbulo (direito e esquerdo), de forma a
separar o ânodo do cátodo, e assim, estudá-los, na geração de espécies reativas de
oxigênio, separadamente. Os camundongos foram numerados de 1 a 18 e o lóbulo
que entrou em contato com o fluxo anódico foi chamado de FA, o que teve contato
com o fluxo catódico de FC e o lóbulo que não teve contato com eletrodo de FEI.
3.4.8.2 Manipulação do fígado
Após o tratamento os camundongos foram eutanasiados por deslocamento
cervical, com anestesia prévia e o fígado foi cuidadosamente retirado. Em seguida,
sempre em banho de gelo, os lóbulos foram separados e cortados, em pequenos
pedaços, com cerca de 100 mg cada, com auxílio de bisturi.
92
O tecido foi homogeneizado em potter junto com 1 mL de tampão A2 (0, 160
mL MgCl2 6 M; 4,278 g sacarose 0,25 M; 50 mL tampão fosfato de sódio 50 mM pH
7,2, os três com função de manter a integridade celular e inibidores de protease,
evitando clivagens proteolíticas, como: 500 µL aprotinina 0,1 mg/mL, inibidora
inespecífica da protease serina; 140 µL PMSF (Fenilmetilsulfonilflúor) 14,3 mM,
inibidor de protease que reage com resíduo de serina para inibir tripsina,
quimotripsina, trombina e papaína e 25 µL DTT (Ditiotreitol) 0,5 mM, um agente
redutor de pontes dissulfeto, que pode desnaturar enzimas). O homogenato obtido
foi transferido para eppendorfs, centrifugados a 700 g por 15 minutos e o
sobrenadante armazenado em quatro diferentes eppendorfs armazenados no
freezer a -70 ºC.
3.4.8.3 Dosagem de proteínas
A dosagem de proteínas do homogenato obtido do fígado dos animais
tratados (item 3.4.8.2) foi feita pelo método colorimétrico de Bradford. A escolha
deste método foi principalmente por sua alta sensibilidade, linearidade, e velocidade
de análise. O ensaio de Bradford se baseia em interações entre os resíduos de
ácidos aminados básicos (principalmente arginina, lisina e histidina) com o azul
brilhante de Coomassie. A ligação do corante às proteínas faz com que haja uma
mudança no máximo de absorção do corante de 465 para 595 nm, e é esta
absorção, de 595 nm, que é monitorada (BRADFORD, 1976).
Para a dosagem de proteínas, inicialmente foi feita uma curva padrão de
albumina de soro bovino (BSA) a 0,5 mg / mL, com as seguintes concentrações: 0;
0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10 e 0,12 µg / µL em água destilada. De cada concentração
foram retirados 100 µL e adicionado 1 mL do reagente de Bradford, a mistura foi
homogeneizada e lida em espectrofotômetro (Lambda Bio+, PerkinElmer) em
comprimento de onda de 595 nm. As medidas foram feitas em duplicata e a curva
padrão construída.
As amostras do homogenato de fígado dos animais tratados foram diluídas
1:150 em água destilada. Foram transferidos 100 µL de cada amostra diluída para
um tubo de ensaio de vidro com 1 mL do reagente de Bradford. Após
homogeneização as amostras foram lidas em espectrofotômetro (Lambda Bio+,
PerkinElmer), em comprimento de onda de 595 nm.
93
3.4.8.4 Detecção de geração de espécie reativa por Amplex Red
Uma forma conveniente, sensível e versátil para a detecção de espécies
reativas de oxigênio em células e tecidos é por meio de sondas fluorescentes.
Normalmente, estes compostos não são fluorescentes ou são fracamente
fluorescentes, mas produzem produtos altamente fluorescentes, que podem ser
medidos com um espectrofotômetro, leitor de microplacas, microscopia confocal, ou
por citômetro de fluxo. Amplex Red é um composto fluorescente, incolor, usado para
a medida de peróxido de hidrogênio extracelular, porém, como o peróxido se difunde
facilmente, esta medida é somente uma indicação da produção de peroxido de
hidrogênio celular. O Amplex Red reage com H2O2 catalisado por peroxidase de raiz
forte (HRP) com estequiometria de 1:1 formando um composto colorido e altamente
fluorescente chamado resorufina (ZHAO, SUMMERS & MASON, 2012). Esta reação
ocorre em meio tamponado por tampão fosfato de sódio, na presença da enzima
superóxido dismutase que catalisa a dismutação do superóxido de oxigênio em
peróxido de hidrogênio (ZHAO, SUMMERS & MASON, 2012).
A detecção de espécies reativas de oxigênio foi realizada pela oxidação do
Amplex Red (50 µM), na presença do catalisador peroxidase de raiz forte (HRP)
(0,25 U / mL), ao composto fluorescente resorufina. A fluorescência deste último foi
monitorada em fluorímetro (VICTOR™ X4 PerkinElmer) a 30 ºC. A estequiometria da
reação de oxidação de Amplex Red é de 1:1 com peróxido de hidrogênio (RHEE et
al., 2010).
Primeiramente foi realizada uma diluição de uma das amostras do
homogenato obtido do fígado dos animais tratados (item 3.4.8.2) de 2, 4, 6 e 8 µg /
µL em tampão A2 (0, 160 mL MgCl2 6 M; 4,278 g sacarose 0,25 M; 50 mL tampão
fosfato de sódio 50 mM pH 7,2, 500 µL aprotinina 0,1 mg/mL, 140 µL PMSF 14,3 mM
e 25 µL DTT 0,5 mM) para verificarmos qual a melhor diluição a ser realizada. Após
ensaio verificou-se que a concentração de 50 µg / µL era a ideal para esses
experimentos. Desta forma, as amostras foram diluídas para esta concentração, e
uma alíquota de 10 µL foi adicionada a 10 µL de água destilada, 10 µL de tampão
Na2PO4 50 mM e 70 µL de Mix (62,9 µL Na2PO4 0,3 M; 4,6 µL água destilada, 1 µL
superóxido dismutase (SOD) 20.000 UI/mL, enzima que acelera a dismutação do
radical O2•- formando H2O2; 1 µL HRP 25 UI/mL que é o catalisador e 0,5 µL Amplex
Red 10 mM).
94
Paralelamente, foi preparada uma curva padrão de peróxido de hidrogênio,
onde uma solução de peróxido de hidrogênio 100 µM foi diluída, em água destilada,
a 0,2; 0,4; 0,6 e 0,8 µM e de cada diluição retirou-se 10 µL, que foram adicionados à
placa de leitura com 90 µL de Mix. As amostras e as soluções de peróxido de
hidrogênio adicionadas na placa de 96 poços foram colocadas no fluorímetro. A
fluorescência foi medida e os resultados expressos em nm de H2O2.
3.4.8.5 Quantificação do grupamento Tiol
Existem diferentes métodos analíticos utilizados na determinação de
grupamento tióis reduzidos, procurando correlacionar os níveis desse com o sistema
antioxidante. Estes compostos não possuem cromóforos fortes ou fluoróforos em
sua estrutura, o que torna necessária a derivatização, ou seja, a transformação
desta em outra substância de estrutura semelhante por meio de uma reação
química, para aumentar o limite de detecção, usando-se para tal, fluoróforos, como o
orto-ftalaldeído e o monobromobimano ou cromóforos, como a N-etilmaleiimida e
seus análogos, o ácido monoiodoacético, o ácido 5’,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico),
conhecido como DTNB.
No ensaio espectrofotométrico com o cromóforo DTNB o grupo tiol quebra a
ligação dissulfeto do DTNB (Figura 18) liberando o ácido 5-mercapto-2-nitrobenzóico
(TNB), que é detectado em 412 nm (HUBER & ALMEIDA, 2008). A oxidação de tióis
é catalisada por metais de transição e a presença de agentes quelantes, como
EDTA, previne a oxidação (YOSHIDA, 1996). Quando o grupo tiol está na glutationa
reduzida verifica-se a quantidade de TNB, resultante da reação de glutationa
reduzida com DTNB (Figura 19).
Figura 18. O grupamento tiol reage com o DTNB-2
, clivando o disulfeto, levando a formação de 2-nitro-5-benzoato (TNB
-2) que possui uma cor amarela intensa a 412 nm. Fonte: adaptado de
RIDDLES, BLAKELEY & ZERNER, 1979.
95
Figura 19. Por detecção espectrofotométrica é possível monitorar glutationa, empregando-se como substância cromogênica o ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzóico), DTNB. A reação de glutationa com DTNB gera o ácido 2-nitro-5-mercapto-benzóico (TNB) de coloração amarela. Fonte: adaptado de VASCONCELOS et al., 2007.
As amostras do sobrenadante do tecido homogeneizado com tampão A2
foram retiradas do freezer -70 ºC e mantidas em gelo durante o ensaio. Em um
eppendorf foram misturados 820 µL de metanol, 150 µL de tampão Tp (Tris HCl 200
mM, EDTA 20 Mm pH 8,2), 10 µL de (ácido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico) DTNB e 20
µL de cada amostra. Todo o procedimento foi realizado em duplicata. Como controle
negativo foi preparada a mesma solução, exceto pela adição de 20 µL de cada
amostra. Os eppendorfs foram incubados por 15 min após homogeneização e então,
centrifugados por 15 min a 3.000 g, à temperatura de 25 ºC. O sobrenadante foi lido
em espectrofotômetro a 412 nm, utilizando metanol como branco.
3.4.9 Estudo histológico por microscopia óptica
Dois camundongos foram tratados com 2,4 C de CC, com eletrodos inseridos
no fígado. Após tratamento os animais foram anestesiados com cetamina e xilazina
e eutanasiados por deslocamento cervical e os lóbulos do fígado retirados e fixados,
separadamente, em formol neutro tamponado a 10 % (v/v). Esta fixação é
importante, porque bloqueia o metabolismo celular, evita a autólise celular e impede
proliferação de microorganismos, preservando assim, as estruturas do tecido.
O tecido foi então cortado em fragmentos menores e submetidos a um
protocolo de desidratação, ou seja, retirada de água, com soluções de álcool etílico
em concentrações crescentes (70, 80, 90 e 100 % (v/v)). Em seguida, sofreu
diafanização (clareamento) pelo xilol. O xilol foi trocado três vezes, após incubações
de tecido por 20 minutos, cada vez. Esta etapa também é conhecida como
clareamento, por tornar o material translúcido.
Por fim, os órgãos sofreram impregnação, em parafina fundida (60 ºC), em
três banhos de 30 minutos cada, e nesta etapa houve a evaporação do xilol. O
96
material foi então embebido em parafina, colocado no molde e resfriado (2 a 8 ºC)
por 40 minutos. O tecido emblocado em parafina foi cortado em micrótomo (7 µm de
espessura), estendido em banho-maria (50 ºC) e colocado em lâmina de vidro.
Os cortes foram corados com hematoxilina, um corante básico, que se liga a
estruturas basófilas dos tecidos, como núcleos pelos grupamentos ácidos dos ácidos
nucleicos, reticulo endoplasmático, os corando na cor azul-roxo. E também corados
com eosina, um corante ácido, que cora, de rosa, estruturas do corte chamadas
acidófilas, como proteínas, citoplasma, mitocôndrias. Após a coloração, as lamínulas
foram fixadas em lamínula, coladas com permount e analisadas em microscópio
óptico.
3.5 Avaliação estatística
Os resultados estão apresentados como média ± desvio padrão (DP).
Diferenças significativas nos experimentos foram avaliadas por análise de variância
– ANOVA, seguida por teste de Dunnet, quando se queria comparar os
experimentos com o controle e Tukey quando se desejou comparar todos os grupos,
usando o programa GraphPad Prism, versão 5.00 para Windows (GraphPad
Software, San Diego, Califórnia, USA).
97
4. RESULTADOS
4.1 Resultados in vitro
4.1.1 Ensaio de citotoxicidade celular bacteriana após estímulo elétrico
Neste ensaio foi calculada a carga letal, em coulombs, que leva a 10 % de
sobrevivência das bactérias após passagem de CC para as cepas de S. typhimurium
TA97, TA98, TA100 e TA102, nos três diferentes fluxos: o anódico (FA), o eletro-
iônico (FEI) e o catódico (FC). Os valores de morte celular foram obtidos pela razão
calculada como o número de células viáveis, após tratamento (N) e o número inicial
de células antes do tratamento (N0), cuja razão é expressa como N / N0. Os valores
foram colocados em escala logarítmica. O objetivo é encontrar a carga de CC
estimada para inativar 90 % da população de bactérias, ou seja, a DL10. Em escala
logarítmica estes 10 % representam N/N0 igual a 0,1; desta forma, os valores que
nos possibilitam o uso da carga a ser utilizada deve estar acima de 0,1.
Os dados obtidos das quatro cepas estudadas (Tabela 1) indicam que o
valor de DL10 para os experimentos sem adição de nanopartículas é de 1,44 C. Já
com a adição de nanopartículas de L-tirosina, a carga aumenta para 2,16 C.
98
Tabela 1. Ensaio de citotoxicidade das cepas TA97, TA98, TA100 e TA102, após estímulo com cargas de 1,44 C; 2,16 C; 2,88 C e 3,6 C, na ausência de nanopartículas e na presença de nanopartículas de L-tirosina. Para todas as cargas encontra-se a análise do fluxo anódico (FA), do fluxo eletro-iônico (FEI), e do fluxo catódico (FC), usando-se nanopartículas de L-tirosina junto com a CC ou na ausência destas nanopartículas. Os dados correspondem a razão N/No, apresentada em escala logarítmica e calculada como o número de células viáveis após tratamento (N) e o número inicial de células antes do tratamento (N0). Resultados expressos como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6).
Cepa Carga Sem nanopartículas Com nanopartículas
FA FEI FC FA FEI FC
TA97
1,44 C 0,60 ± 0,43 0,89 ± 0,43 0,21 ± 0,09* 0,89 ± 0,15 0,59 ± 0,10 0,28 ± 0,02
2,16 C 0,61 ± 0,80 1,15 ± 0,28 0,03 ± 0,01 0,25 ± 0,03 0,42 ± 0,01 0,20 ± 0,04*
2,88 C 0,29 ± 0,42 1,31 ± 0,79 0,05 ± 0,05 0,09 ± 0,03 0,33 ± 0,02 0,07 ± 0,05
3,60 C 0,16 ± 0,27 1,09 ± 0,89 0,02 ± 0,03 0,02 ± 0,02 0,21 ± 0,19 0,00
TA98
1,44 C 0,48 ± 0,44 1,23 ± 0,55 0,22 ± 0,20* 1,15 ± 0,20 0,61 ± 0,06 0,43 ± 0,13
2,16 C 0,39 ± 0,22 0,52 ± 0,60 0,00 0,21 ± 0,06* 1,10 ± 0,41 0,35 ± 0,08
2,88 C 0,11 ± 0,12 0,92 ± 0,85 0,00 0,18 ± 0,11 0,51 ± 0,12 0,03 ± 0,02
3,60 C 0,09 ± 0,12 1,12 ± 0,83 0,00 0,05 ± 0,04 0,57 ± 0,50 0,00
TA100
1,44 C 0,31 ± 0,17 0,96 ± 0,52 0,17 ± 0,07* 1,14 ± 0,34 1,04 ± 0,07 0,84 ± 0,26
2,16 C 0,75 ± 0,65 1,00 ± 0,82 0,05 ± 0,04 0,60 ± 0,26 1,21 ± 0,30 0,39 ± 0,18*
2,88 C 0,00 0,70 ± 0,40 0,00 0,14 ± 0,01 0,62 ± 0,23 0,10 ± 0,01
3,60 C 0,02 ± 0,03 0,68 ± 0,56 0,00 0,05 ± 0,03 0,69 ± 0,03 0,00
TA102
1,44 C 0,32 ± 0,25 0,83 ± 0,01 0,26 ± 0,20* 0,83 ± 0,27 0,69 ± 0,17 0,45 ± 0,14
2,16 C 0,17 ± 0,21 0,87 ± 0,56 0,08 ± 0,08 0,38 ± 0,23 0,64 ± 0,19 0,28 ± 0,03*
2,88 C 0,00 0,59 ± 0,57 0,01 ± 0,01 0,15 ± 0,06 0,56 ± 0,15 0,11 ± 0,06
3,60 C 0,00 1,10 ± 0,34 0,00 0,02 ± 0,01 0,35 ± 0,26 0,00
*Valor mínimo obtido de N/N0, antes de se atingir a DL10. O objetivo é encontrar a carga de CC estimada para inativar 90 % da população de bactérias, ou seja, a DL10. Em escala logarítmica estes 10 % representam N/N0 igual a 0,1; desta forma, os valores que nos possibilitam o uso da carga a ser utilizada deve estar acima de 0,1.
99
4.1.2 Ensaio de mutagênese pelo método de AMES
Usando a carga de 1,44 C de corrente contínua, quando não foi utilizada a
suspensão de nanopartículas de L-tirosina e de 2,16 C quando no uso da
nanopartícula, foi testada a mutagênese pelo ensaio de AMES em bactérias tratadas
com CC. As unidades formadoras de colônias das placas de viabilidade e de
mutagênese foram quantificadas e relacionou-se a viabilidade com a mutagênese,
onde os resultados são dados em incremento. Um incremento 2 vezes maior que o
controle é considerado mutagênico (Figuras 20 - 23).
Nos gráficos apresentados, pode-se observar que não ocorre aumento de
mais de duas vezes, além do valor do controle, ou seja, o espontâneo, indicando
que a estimulação com CC, nas condições estudadas, não apresenta potencial
mutagênico.
Como controle positivo foi feita a irradiação com luz ultravioleta C (UV-C), com
comprimento de onda de 254 nm TA97, TA98 e TA100 foram usadas doses de 2 J /
m2, para TA102 doses de 40 J / m2 o que produziu um incremento de cerca de 27;
28; 34; e 32 vezes na taxa de mutagênese, respectivamente.
100
Figura 8. Resposta da cepa TA97 para o ensaio de AMES. A suspensão bacteriana foi tratada com passagem de corrente elétrica contínua com carga de 1,44 C, quando na ausência de nanopartículas de L-tirosina (A) e com 2,16 C quando as nanopartículas estavam presentes (B). Após passagem de CC as suspensões bacterianas foram deixadas em contato com o meio reacional por 0, 10, 20 e 30 minutos. Para todos os tempos encontra-se a análise do fluxo anódico (FA), representado pela cor preta, do fluxo eletro-iônico (FEI), representado pela cor branca e do fluxo catódico (FC), representado por listras horizontais na cor preta e branca. Também é plotado o valor obtido para o controle negativo (CT – 0 min). Como controle positivo foi feita a irradiação com luz ultravioleta C (UV-C), com comprimento de onda de 254 nm em dose de 2 J / m
2, o que produziu um incremento de
cerca de 27 vezes na taxa de mutagênese. Resultados expressos como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6).
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2FA
FEI
FC
B
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2
FEI
FA
FC
A
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
tes
101
Figura 9. Resposta da cepa TA98 para o ensaio de AMES. A suspensão bacteriana foi tratada com passagem de corrente elétrica contínua com carga de 1,44 C, quando na ausência de nanopartículas de L-tirosina (A) e com 2,16 C quando as nanopartículas estavam presentes (B). Após passagem de CC as suspensões bacterianas foram deixadas em contato com o meio reacional por 0, 10, 20 e 30 minutos. Para todos os tempos encontra-se a análise do fluxo anódico (FA), representado pela cor preta, do fluxo eletro-iônico (FEI), representado pela cor branca e do fluxo catódico (FC), representado por listras horizontais na cor preta e branca. Também é plotado o valor obtido para o controle negativo (CT – 0 min). Como controle positivo foi feita a irradiação com luz ultravioleta C (UV-C), com comprimento de onda de 254 nm em dose de 2 J / m
2, o que produziu um incremento de
cerca de 28 vezes na taxa de mutagênese. Resultados expressos como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6).
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2AF
EIF
CF
A
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2FA
FEI
FC
B
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
102
Figura 10. Resposta da cepa TA100 para o ensaio de AMES. A suspensão bacteriana foi tratada com passagem de corrente elétrica contínua com carga de 1,44 C, quando na ausência de nanopartículas de L-tirosina (A) e com 2,16 C quando as nanopartículas estavam presentes (B). Após passagem de CC as suspensões bacterianas foram deixadas em contato com o meio reacional por 0, 10, 20 e 30 minutos. Para todos os tempos encontra-se a análise do fluxo anódico (FA), representado pela cor preta, do fluxo eletro-iônico (FEI), representado pela cor branca e do fluxo catódico (FC), representado por listras horizontais na cor preta e branca. Também é plotado o valor obtido para o controle negativo (CT – 0 min). Como controle positivo foi feita a irradiação com luz ultravioleta C (UV-C), com comprimento de onda de 254 nm em dose de 2 J / m
2, o que produziu um incremento de
cerca de 34 vezes na taxa de mutagênese. Resultados expressos como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6).
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2FA
FEI
FC
B
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2
FC
FEI
FA
A
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
103
Figura 11. Resposta da cepa TA102 para o ensaio de AMES. A suspensão bacteriana foi tratada com passagem de corrente elétrica contínua com carga de 1,44 C, quando na ausência de nanopartículas de L-tirosina (A) e com 2,16 C quando as nanopartículas estavam presentes (B). Após passagem de CC as suspensões bacterianas foram deixadas em contato com o meio reacional por 0, 10, 20 e 30 minutos. Para todos os tempos encontra-se a análise do fluxo anódico (FA), representado pela cor preta, do fluxo eletro-iônico (FEI), representado pela cor branca e do fluxo catódico (FC), representado por listras horizontais na cor preta e branca. Também é plotado o valor obtido para o controle negativo (CT – 0 min). Como controle positivo foi feita a irradiação com luz ultravioleta C (UV-C), com comprimento de onda de 254 nm em dose de 40 J / m
2, o que produziu um incremento de
cerca de 32 vezes na taxa de mutagênese. Resultados expressos como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6).
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2FA
FEI
FC
A
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
CT -
(0 m
in) 0 10 20 30
0
1
2FA
FEI
FC
B
Tempo (min)
Inc
rem
en
to h
is+ r
ev
ert
en
te
104
4.2 Resultados in vivo
4.2.1 Escolha da carga de corrente elétrica a ser aplicada nos ensaios
Seis animais foram submetidos a três diferentes cargas de correntes: 2,4; 4,8
e 9,6 C, administrados no músculo da coxa da pata traseira esquerda. Nas duas
maiores cargas os animais foram à óbito, e na carga de 2,4 C sobreviveram. Desta
forma, a carga de 2,4 C foi escolhida para realização dos ensaios subsequentes.
4.2.2 Estudo histológico por microscopia óptica
O resultado da visualização do fígado tratado se encontra na figura 24. O
lóbulo do fígado que não teve contato com o eletrodo, ou seja, que recebeu o fluxo
eletro-iônico, assim, como o lóbulo que teve contato com o ânodo apresentaram
hepatócitos organizados em forma de cordões que se irradiaram para o exterior a
partir dos vasos, sem hemorragia e sem inflamação, ou seja, resultados esperados
em um tecido hepático normal. Já no lóbulo que teve contato com o cátodo, nota-se
hiperemia moderada (quantidade de hemácias aumentada), em todos os vasos.
Observa-se ainda degeneração moderada das células, gerando desestrutura nos
cordões de hepatócitos.
105
106
Figura 12. Primeira foto: Foto da lâmina de histologia do lóbulo do fígado de camundongos C57BL/6 que não teve contato com o eletrodo, ou seja, que recebeu o fluxo eletro-iônico (FEI), mostrando aspecto normal dos hepatócitos, com os cordões formados ao redor dos vasos sanguíneos (seta azul). Segunda foto: Foto da lâmina de histologia do lóbulo do fígado de camundongos C57BL/6 tratado com o fluxo anódico (FA), mostrando aspecto normal dos hepatócitos, com os cordões
formados ao redor dos vasos sanguíneos (setas azuis). É possível observar três vasos sanguíneos
com presença de hemácias. Terceira foto:Principais alterações histológicas encontradas no lóbulo do fígado de camundongos C57BL/6 tratado com CC, em contato com o fluxo catódico (FC). É possível visualizar hiperemia, ou seja, aumento da quantidade de hemácias (seta vermelha) dentro do vaso sanguíneo (seta azul) e degeneração moderada, vista nas células, com perda da afinidade pelo corante, desestruturação do citoplasma, levando à desestruturação celular, chegando a afetar a estrutura tecidual e modificando o aspecto normal dos cordões de hepatócitos (seta preta). Aumento da objetiva: 20 X.
4.2.3 Ensaio de micronúcleo com sangue periférico
Foi verificada a frequência de micronúcleos em eritrócitos de camundongos
expostos a ETT de carga 1,2 C e 2,4 C, além do controle negativo e do controle
positivo com EMS. Para a avaliação da frequência de células micronucleadas foram
considerados apenas eritrócitos íntegros com forma arredondada e citoplasma
intacto. E considerados como MN as estruturas dentro do citoplasma, de coloração
roxa e forma arredondada e que se apresentaram no mesmo plano da célula.
Os resultados demonstram que a frequência de micronúcleo não foi
aumentada e não teve diferença significativa (p < 0,05) em relação ao grupo controle
e entre cada um dos grupos, mas entre o controle positivo, feito por
etilmetanosulfonato, a diferença foi significativamente maior (Figura 25).
107
Figura 25. Análise da quantidade de micronúcleos em eritrócitos de sangue periférico de camundongos. No gráfico tem-se o eixo y com a quantidade de micronúcleos contados em 2.000 células de cada animal. No eixo x distingue-se os quatro tipos de tratamento realizados: (CT) camundongos considerados controle, por passarem por todo o experimento, porém sem receber aplicação de corrente elétrica; (1,2 C) animais que foram tratados com ETT na carga de 1,2 C, 50 % da carga máxima; (2,4 C) animais tratados com a carga máxima de ETT sem que ocorra mortalidade e, (EMS) demonstrando os camundongos tratados com o etilmetanosulfonato, agente alquilante, com efeito mutagênico, via gavagem. Resultados expressos como média ± DP (n = 6). (*) Há diferença significativa (p < 0,05) somente entre os três primeiros tratamentos e o controle positivo.
4.2.4 Registros da pressão arterial e da frequência cardíaca com cateter intravascular
No ensaio para pressão arterial e frequência cardíaca, os animais
anestesiados, com xilazina 2 % e cetamina 10 %, e canulados foram submetidos à
corrente elétrica, com carga de 2,4 C. Os dados foram registrados a cada 5 minutos,
da seguinte forma: 5 min antes da aplicação da corrente; 5 min durante a
eletroterapia e 5 min após a retirada da corrente e dos eletrodos, perfazendo um
total de 15 min. Os valores de PAS e PAD, além da frequência cardíaca, deram
origem a um gráfico de pressão (mm Hg) por tempo de estimulação elétrica (Figura
26). Observa-se um aumento da PAS e da PAD durante a eletroestimulação. No
término do tratamento ocorre uma queda no valor, chegando a medir menos do que
os 5 minutos iniciais, antes da aplicação de corrente. A frequência cardíaca
acompanha os valores de PAS e PAD, quando as mesmas tem um aumento a
frequência cardíaca tem uma redução e vice-versa.
CT
1,2
C
2,4
CEM
S
0
40
80
120
*
EMS
1,2 C
2,4 C
CTM
icro
nú
cle
os
2.0
00
cé
l-1
108
A
B
109
Figura 26. Gráfico do resultado da medição de pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) e da frequência cardíaca (FC) ao longo do tempo. A. Dados brutos resultantes da leitura de PAS e PAD antes, durante e após a aplicação de corrente elétrica. B. O eixo y à esquerda, registra a pressão arterial, PAS () e PAD (), dada em mm de mercúrio (mmHg), enquanto o lado direito representa a frequência cardíaca (), dada em batimentos por minuto (bpm). O eixo x representa o tempo em minutos (min). Os valores de tempo de 0 a 5 minutos representam a pressão arterial e a frequência antes da aplicação da eletroterapia. No intervalo entre 5 e 10 minutos foi feita a estimulação elétrica, no músculo da coxa da pata traseira do animal e, entre 10 e 15 minutos, a estimulação elétrica foi interrompida. No gráfico é possível observar o comportamento da pressão arterial, acompanhado da frequência cardíaca ao longo da eletroterapia. Verifica-se um ligeiro aumento na pressão arterial, com queda da frequência cardíaca durante a eletroterapia e depois uma queda da pressão, com consequente aumento da frequência, ao término da aplicação. O experimento foi realizado com n de 5 e os valores são dados como média e DP. Há diferença significativa (p < 0,05) entre os 5 últimos minutos, após a ETT, em relação ao tempo durante a aplicação e o tempo antes do inicio do tratamento, na PAD e PAS. Não há diferença significativa na frequência cardíaca (p < 0,05).
4.2.5 Avaliação e quantificação de espécies reativas de oxigênio total
Para a quantificação das espécies reativas de oxigênio inicialmente foi feita
uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA), com seis diferentes
concentrações, cuja relação foi definida por uma equação da reta: y = 0,0432x -
0,0067. A equação da reta e o coeficiente de correlação obtidos indicaram uma
curva linear, onde as absorbâncias e as concentrações apresentaram uma
correlação de proporcionalidade. O valor de r encontrado foi de 0,9913, indicando
uma grande relação entre as duas variáveis do gráfico (absorbância e
concentração).
Com a equação da reta encontrada e os valores médios das absorbâncias
lidas, foi calculada a quantidade de proteína por amostra.
4.2.6 Detecção de geração de espécie reativa por Amplex Red
Com os valores de dosagem de proteína nos tecidos hepáticos de cada
amostra a fluorescência foi medida e os resultados expressos em nM/h/mg de
proteína de H2O2 (Figura 27).
110
FA
CT F
AFEI
CT F
EI
FC
CT F
C
0
1
2
3
4FA
CT FA
FEI
CT FEI
FC
CT FC
H2O
2 (
nM
/h/m
g d
e p
rote
ína
)
Figura 27. Resultado da leitura das amostras pelo método de Amplex red. O gráfico apresenta para cada tratamento a concentração de peróxido de hidrogênio, em nanomol, encontrada. Os camundongos receberam o tratamento de eletroterapia no fígado, em diferentes lóbulos, que foram nomeados de FA, quando em contato com o ânodo; FC, quando em contato com o cátodo e FEI região do fluxo eletroiônico. Quatro camundongos foram usados como controle, onde os eletrodos foram inseridos da mesma forma, mas sem exposição à corrente elétrica, sendo chamados de CT FA, quando em contato com o polo anódico; de CT FC, quando em contato com polo catódico de FEI região eletroiônica. Resultados expressos como média ± DP (n = 18). Não há diferença significativa (p < 0,05) entre os vários fluxos avaliados e seus respectivos controles, assim como entre todos os grupos.
A quantidade de peróxido de hidrogênio gerada no fígado dos camundongos,
após o estímulo elétrico nos três fluxos estudados, não apresentou diferença
significativa em comparação com a quantidade observada nos camundongos
controles (p < 0,05). Da mesma forma não houve diferença significativa (p < 0,05)
entre os três fluxos (FA, FEI e FC). Isto indica que a corrente elétrica aplicada, no
valor de carga mais alta possível sem levar à mortalidade, não gera aumento de
peróxido de hidrogênio, uma espécie reativa de oxigênio. As ERO são conhecidas
por sua grande reatividade, desta forma, para confirmar o ensaio por Amplex Red foi
realizado um segundo teste utilizando grupamentos tióis como biomarcador.
111
4.2.7 Quantificação do grupamento Tiol
Para confirmar que as espécies reativas de oxigênio não são geradas pela
corrente elétrica, um segundo ensaio foi realizado por meio de quantificação do total
de grupamentos tióis reduzidos. Assim, utilizamos um método onde o grupo sulfidrila
leva DTNB a TNB e este é detectado em 412 nm. Desta forma, a concentração de
TNB obtida será inversamente proporcional à concentração de ERO.
Para o ensaio, uma alíquota de cada amostra diluída a 5 µg/µL, em tampão
A2 foi incubada com DTNB homogeneizada, centrifugada e o sobrenadante foi lido
em espectrofotômetro a 412 nm. Os resultados das leituras podem ser vistos na
Figura 28. O resultado obtido neste ensaio apresentou valores sem diferença
significativa (p < 0,05) entre cada fluxo e seu controle, assim como entre os fluxos
(FA, FEI e FC), ou seja, a quantidade de ERO não aumenta ou diminui com a
aplicação de corrente elétrica.
FA
CT F
AFEI
CT F
EI
FC
CT F
C
0
2
4
6
8FA
CT FA
FEI
CT FEI
FC
CT FC
nm
ol
DT
NB
red
uzi
do
/mg
de p
tn
Figura 28. Resultado da leitura das amostras pela quantificação do grupamento Tiol. Apresenta a quantidade de DTNB reduzido por miligrama de proteína do fígado tratado, no fluxo anódico (FA), fluxo eletro-iônico (FEI) e fluxo catódico (FC). Os respectivos controles de cada fluxo também estão representados (CT-FA, CT-FEI e CT-FC). Resultados expressos como média ± DP (n = 18). Não há diferença significativa (p < 0,05) entre os vários fluxos avaliados e seus respectivos controles.
112
5. DISCUSSÃO
O tratamento eletroquímico de tumores pelo uso de corrente elétrica contínua
de baixa intensidade, denominada de eletroterapia tumoral, possui em sua
metodologia o uso de eletrodos inseridos no local do tumor, objetivando destruir o
tecido tumoral. Esta terapia teve origem nos estudos clínicos realizados por
Nordenström (NORDENSTRÖM, 1983, 1984, 1989) e, desde então, tem sido
aplicada em pacientes com tumores sólidos, principalmente na China (XIN, 1994,
1998). No Brasil, os mecanismos de ação envolvidos com a atividade antitumoral da
ETT vêm sendo elucidados por estudos in vitro (HOLANDINO et al., 1998, 2000,
2001, 2014; VEIGA et al., 2000, 2005; CAMPOS et al., 2008, 2010; BRITO, 2009;
GOMES et al., 2010, 2012) e in vivo (PARISE et al., 2008, TELLÓ et al., 2004,
2007).
Os efeitos antitumorais da ETT são atribuídos a diferentes mecanismos;
porém, não existem trabalhos na literatura que evidenciem os efeitos mutagênicos
ou genotóxicos da corrente elétrica contínua in vivo e os ensaios in vitro não são
conclusivos. Além disso, também não se tem dados sobre a relação da ETT com um
possível mecanismo de ação que seria desencadeado por espécies reativas de
oxigênio e nem sobre sua influência na fisiologia cardíaca durante e após a
aplicação da terapia.
Desta forma, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da
CC no material genético, buscando verificar o potencial genotóxico e mutagênico
deste tratamento, incluindo sua associação com nanopartículas de L-tirosina, a
contribuição de espécies reativas de oxigênio para sua ação e se há interferência no
perfil cardíaco ao se receber o tratamento por ETT.
113
A associação da ETT com ácidos aminados tem como alvo potencializar os
efeitos antitumorais. Desta forma, a encapsulação em nanopartículas do ácido
aminado L-tirosina, junto à CC, nos fornece além de maior formação de cloraminas,
o acúmulo do sistema de liberação nanoparticulado na célula tumoral, isso gera uma
citotoxidade específica, reduzindo possíveis efeitos colaterais. Para este trabalho, o
ácido aminado L-tirosina foi encapsulado em nanopartículas de poli-Ɛ-caprolactona,
através da técnica de dupla emulsificação e evaporação de solvente (CAMPOS et
al., 2010).
Para realizar o ensaio de AMES foi necessário determinar a sensibilidade das
cepas, utilizadas no ensaio, à corrente elétrica. Neste ensaio verificou-se a
sensibilidade de cada cepa a CC e os resultados indicaram o valor de 1,44 C para
os experimentos sem adição de nanopartículas e de 2,16 C com a adição de
nanopartículas de L-tirosina. Esta maior resistência das bactérias ao estímulo
elétrico, pode estar relacionada a algum tipo de proteção física induzida pela
suspensão de nanopartículas que induziria menor susceptibilidade das bactérias à
corrente elétrica, quando na presença das Nps.
Com estes dados, as bactérias foram tratadas com 1,44 C e 2,16 C, na
ausência e na presença de Np, respectivamente. E verificou-se a viabilidade e
mutagenicidade. Estes dados foram relacionados em um gráfico que é dado em
incremento. Um incremento 2 vezes maior que o obtido no controle é considerado
mutagênico. Observamos que em todos os tempos não houve aumento de mais de
duas vezes, além do valor do controle, ou seja, o espontâneo, indicando que a
estimulação de CC não apresenta potencial mutagênico. O controle positivo feito
com irradiação de UV-C, apresentou um incremento, bem acima de 2 na taxa de
mutagênese.
Os dados negativos para mutagenicidade corroboram com os dados obtidos
por GOMES, 2010, onde se analisou a mutagenicidade de uma carga de 1,08 C em
bactéria Escherichia coli tipo selvagem AB1157 e duas com deficiência em
mecanismo de reparo, AB1886 (uvrA6) deficiente no reparo por excisão e AB2463
(recA13) deficiente no reparo recombinacional, por análise da citotoxicidade e pelo
ensaio de resistência a rifampicina, com a cepa AB1157. Em ambos os ensaios o
resultado foi negativo para mutagênese (GOMES, 2010).
114
O polímero utilizado no sistema nanoparticulado, poli-Ɛ-caprolactona, já teve
sua mutagenicidade e genotoxicidade estudada em ratos na forma de complexo de
poli(Ɛ-caprolactona)-poli(etilenoglicol)-poli(Ɛ-caprolactona). Neste ensaio os animais
não apresentaram qualquer mortalidade ou sinais clínicos de toxicidade, após
injeção intravenosa de 2,4 g / kg de peso corporal. O polímero apresentou resultado
negativo nos seguintes ensaios de genotoxicidade, por ensaio de AMES, aberração
cromossômica e no ensaio de micronúcleos de medula óssea (HUANGA et al.,
2010). Em outro trabalho, formulações de nanocápsulas de PCL, contendo
herbicidas apresentaram menor genotoxicidade quando comparados a herbicidas
livres (GRILLO et al., 2012; PEREIRA et al., 2014). Estes dados corroboram com
nossos resultados de ausência de mutagenicidade, pelo ensaio de Ames no
tratamento de CC com nanopartículas de poli-Ɛ-caprolactona.
Os ensaios de genotoxicidade, in vivo, devem ser feitos com a dose mais alta
possível, ou seja, a que produz sinais de toxicidade tais que, com base no mesmo
regime de administração, níveis mais elevados produziriam mortalidade, sinais
inaceitáveis de toxicidade animal, ou citotoxicidade excessiva (TICE et al., 2000).
Além disso, é recomendado que uma dose mais baixa, de cerca de 50 % da dose
mais elevada, também seja testada (TICE et al., 2000). Desta forma, após os
ensaios verificou-se que a carga mais alta, que não apresenta mortalidade foi a de
2,4 C, carga esta, que está de acordo com outros trabalhos da literatura
(MIKLAVČIČ et al., 1997a, 1997b; JARM et al., 2003).
O ensaio de genotoxicidade foi realizado em sangue periférico, retirado da
cauda dos animais. A quantidade de micronúcleos nas células sanguíneas não foi
alterada com os tratamentos por ETT, quando comparados ao controle negativo. Ou
seja, a corrente elétrica não foi capaz de produzir quebras ou perdas
cromossômicas, não sendo, portanto, nestas condições, considerada genotóxica. A
quantidade de micronúcleos após a administração de etilmentanosulfonato
aumentou consideravelmente. Este é um composto muito utilizado como controle
positivo em testes genotóxicos (BOWEN et al., 2011).
115
Os dados de genotoxicidade obtidos pelo teste de micronúcleo com sangue
periférico confirmam os resultados obtidos em ensaios de genotoxicidade realizados
com 1,08 C, por meio de reativação de bacteriófagos pela célula hospedeira, com E.
coli AB1157, AB1886 e AB2463 e indução lisogênica com a cepa de Escherichia coli
WP2s(). Em ambos os ensaios, nas condições experimentais utilizadas, a ETT não
apresentou efeito genotóxico (GOMES, 2010).
Para avaliar as alterações histopatológicas presentes no fígado, após
aplicação de corrente elétrica contínua, foram feitas lâminas histológicas de
fragmentos deste órgão. A histologia do fígado foi realizada separando-se os
lóbulos, tratados pelo ânodo, cátodo e pelo fluxo eletro-iônico. Foi verificada
alteração histológica, identificada como hiperemia, apenas no lóbulo que teve
contato com o fluxo catódico. Jarm e colaboradores trataram fibrosarcoma Sa-1 em
camundongos A/J e fibrosarcoma LPB em camundongos C57Bl/6, por eletroterapia
tumoral, com carga de 2,16 C; porém foram inseridos os dois pólos, anódico e
catódico, juntos, em paralelo e em lados opostos do tumor, ou seja, não houve
separação dos resultados quanto ao tipo de polaridade. Os autores detectaram
hiperemia, mas, com um extenso extravasamento de células sanguíneas (JARM et
al., 2003), provavelmente, devido à estimulação simultânea com ambos os pólos. A
aplicação de corrente contínua, em fígados sadios de ratos e de porcos levaram à
trombose vascular nos vasos adjacentes à inserção dos eletrodos (ROBERTSON et
al., 1998; WEMYSS-HOLDEN et al., 2002).
116
Na histologia do presente trabalho também foi possível observar degeneração
moderada do tecido em contato com o cátodo. von Euler e colaboradores ao
aplicarem a eletroterapia tumoral, em ratos, com uma carga de 10 C, obtiveram
resultados mais severos, onde a necrose em torno do cátodo, foi do tipo liquefativa,
com o tecido necrosado amolecido ou liquefeito, sem preservação nenhuma da
arquitetura celular. Já o tecido em contato com o polo anódico apresentou necrose
coagulativa, sendo um padrão comum de necrose, onde se observou preservação
da estrutura celular (von EULER et al., 2004). Nossos resultados não chegaram a
induzir uma necrose no fluxo catódico, uma vez que a degeneração encontrada é
reversível: onde, a interrupção do estímulo pode permitir a retomada da normalidade
das células tratadas. O dano provocado no tratamento foi um tanto inicial, com
possibilidade de recuperação. Com o estímulo mais intenso ou muito persistente,
podemos passar para um processo irreversível, gerando morte celular, que é a
necrose.
Robertson e colaboradores também observaram necrose coagulativa, quando
aplicaram corrente elétrica contínua no fígado de ratos, com carga de 1 a 5 C,
porém, sem separar o tecido que entrou em contato com os fluxos anódico e
catódico (ROBERTSON et al., 1998). Da mesma forma, ao aplicar eletroterapia
tumoral no fígado de suínos encontrou-se extensa área de necrose, com perda de
toda a estrutura celular, porém, sem divisão de tecidos de acordo com o eletrodo em
contato (WEMYSS-HOLDEN et al., 2002; HINZ et al., 2008).
Neste trabalho procurou-se não apenas dados genéticos, mas também
possíveis alterações cardíacas decorrentes da aplicação da eletroterapia. Para tal,
buscou-se verificar irregularidades na atividade do coração através de parâmetros
de pressão arterial, frequência cardíaca e eletrocardiograma.
117
Para o eletrocardiograma um animal foi testado. Para registrar um sinal com
precisão no módulo de análise utilizado (LabChart) é importante que a amplitude
máxima do canal do módulo seja maior que a amplitude do sinal. No equipamento
utilizado, a amplitude máxima é mais segura se usada em um intervalo de 1 V ou 2
V, acima desses valores há perda crítica de informações. Por utilizarmos para a
eletroterapia uma carga de 2,4 C que correspondem a 10 V, não foi possível verificar
os dados neste ensaio, pois, o intervalo seguro para leitura do eletrocardiógrafo foi
ultrapassado. Desta forma, este ensaio não teve dados conclusivos sobre a
atividade elétrica do coração durante a aplicação da eletroterapia.
A pressão arterial é utilizada para representar a pressão exercida contra a
parede arterial durante o ciclo cardíaco. É representada pela pressão sistólica e pela
pressão diastólica. A PAS representa a mais alta pressão nas artérias durante a
contração do ventrículo esquerdo, quando é ejetado sangue para a artéria aorta. Em
um camundongo saudável, a PAS é, em média, de 147 mmHg. A pressão arterial
diastólica representa a fase de relaxamento do ciclo cardíaco, quando o sangue está
preenchendo as cavidades ventriculares. Nesta os valores de pressão arterial se
reduzem, em camundongos, para valores em torno 106 mmHg, indicando a
resistência periférica ou a facilidade com que o sangue flui das arteríolas para os
capilares (CHORILLI, MICHELIN & SALGADO, 2007).
Nossos resultados de PAS e PAD antes da aplicação da eletroterapia, foram
em média, 103 mmHg por 66 mmHg. Estes valores, menores do que o esperado se
devem ao uso dos anestésicos xilazina e cetamina. Estes anestésicos induzem uma
diminuição da pressão arterial em cerca de 46 ± 5 mmHg (JANSSEN et al., 2004).
Da mesma forma, a frequência cardíaca que deveria ser de 663 ± 21 bpm foi, em
média, 228 bpm, valor esperado após o uso destes anestésicos, que também levam
ao decréscimo da frequência cardíaca em cerca de 55 ± 6 bpm (JANSSEN et al.,
2004).
118
Durante a estimulação elétrica percebe-se uma elevação da PAS
acompanhada da PAD. Este aumento da pressão arterial pode ser uma resposta
aguda ao estresse, que gera o reflexo de estiramento muscular (reflexo miotático).
Este reflexo gera contração da musculatura levando ao aumento da atividade
simpática generalizada e assim, liberação de noradrenalina. A noradrenalina induz
vasoconstrição por meio da ativação dos receptores α-adrenérgicos, o que pode
acarretar um aumento da pressão arterial sistólica e diastólica (RUMI et al., 2002;
TAKADA et al., 2005). Este tipo de resposta é encontrada em estudos de avaliação
da função cardíaca durante eletroterapia anticonvulsiva (MANN et al., 1990; RUMI et
al., 2002; TAKADA et al., 2005).
Estas elevações súbitas durante a aplicação da eletroterapia não foram letais
para os animais tratados, mas, poderiam aumentar o risco de eventos
cardiovasculares, como infarto do miocárdio, derrame cerebral e acidente vascular
cerebral. Desta forma, a partir dos resultados, recomenda-se uma avaliação da
pressão arterial dos pacientes, durante a aplicação da eletroterapia, a fim de que,
qualquer situação de maior alteração cardíaca, procedimentos médicos possam ser
realizados sem prejuízos ao paciente. O aumento da PA pode estar gerando um
estímulo dos barorreceptores.
A PA é calculada pelo produto da resistência vascular periférica total pelo
débito cardíaco e a RVPT depende de um complexo mecanismo de regulação que
inclui os barroreceptores (JOSEPH et al., 2013). Estes receptores são sensores
especializados da pressão e quando a pressão arterial eleva-se estes geram
redução da frequência cardíaca, do volume sistólico, da resistência periférica e
aumento da capacitância venosa. Desta forma, os níveis de pressão diminuem.
Assim que a estimulação elétrica é retirada, os valores de PA caem abaixo do nível
basal, o que foi observado antes da aplicação de corrente, provavelmente devido à
atuação dos barroreceptores que estariam atuando com o intuito de diminuir a
pressão arterial.
A frequência cardíaca é diminuída devido ao estímulo do trato solitário
(CAMPAGNOLE-SANTOS & HAIBARA, 2001; IRIGOYEN, CONSOLIM-COLOMBO
& KRIEGER, 2001). Esta resposta também é encontrada quando se verifica função
cardíaca durante a eletroterapia anticonvulsiva (RUMI et al., 2002).
119
Estes dados de PA e de FC são inéditos na aplicação da eletroterapia, em
animais e em humanos, e os resultados parecem mostrar que o efeito do tratamento
influencia em ambos os parâmetros, mas não de forma irremediável ou danosa ao
sistema circulatório.
Este trabalho também teve o objetivo de verificar se a formação de espécies
reativas de oxigênio poderia ser um dos mecanismos envolvidos com morte celular
decorrente da eletroterapia. Para tal, avaliamos e quantificamos as espécies reativas
de oxigênio totais após a passagem de corrente elétrica. Neste ensaio foram
tratados dezoito animais, utilizando o fígado como órgão de aplicação.
Como resultado do ensaio por Amplex Red, obtivemos um gráfico indicando a
quantidade de peróxido de hidrogênio em nanomol por tratamento realizado.
Nenhum dos tratamentos apresentou valor maior que os respectivos controles, ou
seja, a passagem de corrente elétrica não aumentou os níveis de espécies reativas
de oxigênio nos tecidos onde ocorreu a aplicação. Porém, o H2O2 é facilmente
convertido para o radical hidroxila (OH•), este altamente reativo, através da reação
de Fenton, na presença de ions Fe2+ (Equação 5).
Desta forma, o peróxido de hidrogênio medido em nossos ensaios pelo Kit
Amplex Red pode não ser o valor real, visto que da aplicação de corrente até o
ensaio, o peróxido de hidrogênio pode ter sido convertido. Por isso, o ensaio de
quantificação do grupamento Tiol foi realizado de maneira complementar visando
sanar as dúvidas destes experimentos.
120
Este ensaio confirmou o resultado anterior, com Amplex Red, no qual não
detectamos diferença significativa entre os animais tratados e os respectivos
controle, ou seja, a aplicação de corrente elétrica não gerou espécies reativas de
oxigênio. Estes dados indicam que outros mecanismos devem estar envolvidos com
a morte celular induzida por corrente elétrica em modelos in vivo, porém é
necessário verificar com outros marcadores de ERO, como por peroxidação lipídica.
Importante verificar também que os diferentes lóbulos do fígado, em um mesmo
animal, pode apresentar, previamente, uma quantidade de espécies reativas, visto
que cada lóbulo recebe oxigenação diferenciada, o que é possível verificar pela
diferença encontrada entre os diferentes controles de cada lóbulo (FA, FEI e FC).
Além disso, o estudo foi realizado apenas com camundongos machos, e deve-se
considerar o estudo também em fêmeas, visto que a diferença entre os dois não é
apenas pelo sexo, mas em distintas vertentes como gordura corporal, hormônios,
entre outros.
121
6. CONCLUSÃO
A carga letal, em coulombs, que leva a 10 % de sobrevivência das suspensões
bacterianas de Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100 e TA102 é de 1,44 C
e de 2,16 C quando se adiciona nanopartículas de L-tirosina na suspensão.
A presença de nanopartículas de L-tirosina nas suspensões bacterianas de
Salmonella typhimurium pode estar relacionada a algum tipo de proteção física
induzida pelas nanopartículas ou devido a algum efeito captador de radicais
livres.
O teste de mutação reversa bacteriana (AMES), na presença e na ausência de
nanopartículas de L-tirosina por ensaios in vitro, em bactérias Salmonella
typhimurium TA97, TA98, TA100 e TA102 demonstrou que a corrente elétrica
não leva à mutagenicidade.
A carga máxima, em coulombs, que não leva à mortalidade em camundongos da
linhagem C57Bl/6 é de 2,4 C.
Pelo ensaio de micronúcleo, em sangue periférico, de camundongos C57Bl/6, foi
verificado que o tratamento por ETT não provoca danos no cromossomo ou
segregação cromossômica.
Não é possível utilizar a análise eletrocardiográfica, durante a aplicação de 2,4 C
em camundongos C57Bl/6, pois, nestas condições o intervalo seguro para leitura
do eletrocardiógrafo é ultrapassado.
A aplicação de 2,4 C em camundongos C57Bl/6 gera uma elevação da pressão
arterial sistólica acompanhada da pressão arterial diastólica. Este aumento pode
ser decorrente de uma resposta aguda ao estresse. Este aumento não é letal,
mas deve-se considerar um acompanhamento da pressão arterial durante o
tratamento por eletroterapia.
122
A aplicação de 2,4 C em camundongos C57Bl/6 gera uma diminuição da
frequência cardíaca, mas não de forma irremediável ou danosa ao sistema
circulatório.
Os ensaios para avaliar o estresse oxidativo, utilizando o teste de Amplex Red e
de quantificação de tiol, indicaram que a passagem de corrente elétrica não
aumentou os níveis de espécies reativas de oxigênio no fígado, em
camundongos C57Bl/6.
Não foram encontradas alterações histológicas em hepatócitos de camundongos
C57Bl/6 tratados com 2,4 C de corrente elétrica, no fluxo anódico e no fluxo
eletroiônico, porém, no fluxo catódico identificou-se hiperemia, e degeneração
moderada.
123
7. PERSPECTIVAS
1. Realizar os ensaios de genotoxicidade in vivo associando a eletroterapia a
nanopartículas de L-tirosina, complementando assim, o ensaio de Ames
realizado in vitro.
2. Verificar se a CC, in vivo, provoca danos no cromossomo ou segregação
cromossômica através da quantidade de micronúcleos, em medula óssea de
camundongos C57Bl/6 e identificar possíveis lesões genômicas provocadas
pelo tratamento elétrico, pelo ensaio Cometa in vivo, em sangue de
camundongos C57Bl/6;
A fim de complementar os ensaios de genotoxicidade in vivo, estão sendo
realizados dois ensaios complementares ao ensaio de micronúcleo em sangue
periférico. São eles, o ensaio de micronúcleo em medula óssea e o cometa.
É recomendado o uso concomitante do ensaio cometa e o de micronúcleo,
isto porque, o teste do micronúcleo está diretamente relacionado com o surgimento
de danos permanentes no cromossomo, enquanto o teste do cometa detecta injúrias
reparáveis no DNA, ou seja, avaliação da genotoxicidade para compostos de vida
muito curta (BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005), sendo, desta forma, testes
complementares em relação à genotoxicidade.
No micronúcleo formado na medula óssea o alvo são os eritrócitos
policromáticos, que passaram pela última replicação dos cromossomos (HEDDLE,
1973; SALAMONE et al., 1980).
124
Para obtenção da medula óssea, após eutanásia do animal tratado, o fémur
esquerdo e o direito são removidos, descolados do tecido aderente e as epífises
retiradas. Com auxílio de uma seringa contendo 1 ml de soro fetal bovino, transfere-
se o material da medula diretamente para um eppendorf. E este é centrifugado a 200
x g por 5 min. O soro é aspirado com auxílio de pipeta de microvolume e o pellet
levemente ressuspendido no sobrenadante. Esta suspensão final é adicionada em
uma lâmina, onde é feito esfregaço e coloração (AL-SABTI & METCALFE, 1995). Na
medula óssea verifica-se a relação PCE/NCE em 200 células contadas e os
micronúcleos presentes em 1.000 células PCE, por lâmina. Desta forma avalia-se a
frequência de micronúcleos, além da relação PCE/NCE em medula óssea.
O ensaio Cometa ou Single Cell Gel assay (SCG) evidencia a migração de
fragmentos de DNA em relação ao núcleo principal. Para isso, as células nas quais
se deseja verificar o dano ao DNA, são suspensas em agarose de baixo ponto de
fusão e colocadas em lâminas de vidro para microscopia, previamente cobertas com
agarose normal. Estas lâminas contendo as células são submetidas a uma corrente
eletroforética, produzindo figuras semelhantes a um cometa (BRENDLER-
SCHWAAB et al., 2005). A finalidade é identificar danos ao DNA em células
individualizadas (BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005).
O princípio desta técnica se baseia no fato de que o DNA da célula, que não
tiver dano, migrará em conjunto, formando um círculo. Já o DNA fragmentado,
resultado de quebras induzidas pelo agente genotóxico, migra durante a corrida para
fora do núcleo, sendo que os fragmentos menores tenderão a migrar mais
rapidamente do que os maiores (TICE et al., 2000; COLLINS, 2004). As células são
então analisadas e classificadas conforme a extensão da cauda do cometa. A
medida da extensão da cauda permite classificar as células em diferentes classes,
em função das lesões genômicas induzidas pelo agente genotóxico em questão. A
avaliação relaciona o raio do núcleo e a extensão da cauda formada pelo DNA em
migração (classificados como classe 0 – nenhum dano, até classe 4 – máximo
dano). Esta classificação se baseia em valores arbitrários e expressa o dano
genético geral de uma população (HARTMANN et al., 2003; KUMARAVEL et al.,
2007). Este ensaio pode detectar quebras de fitas duplas, sítios alcali-lábeis, quebra
de cadeias simples associadas com reparação incompleta, e ligações cruzadas
DNA-DNA ou DNA-proteína (adutos) (BOWEN et al., 2011).
125
Para o ensaio cometa o sangue é obtido por punção cardíaca, coletado em
seringa heparinizada, mantido em gelo e no escuro até uso para o ensaio. A técnica
utilizada está descrita por Singh e colaboradores (SINGH et al., 1988).
Estes dois ensaios podem ser integrados levando à redução do número de
animais utilizados (RECIO et al., 2010; VASQUEZ, 2010; BOWEN et al., 2011).
126
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144
ANEXO 1
Preparo de soluções
1.1 Preparo do Meio Lysogeny-Broth (LB)
10, 0 g de cloreto de sódio (Merck)
10, 0 g de bacto triptona (Difco Laboratories)
5,0 g de extrato de levedura (Difco Laboratories)
15, 0 g de ágar (Difco Laboratories)
água destilada (qsp 1000 mL). Adicionar todos os componentes em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e autoclavar a 121 °C por 30 minutos. Após autoclavagem distribuir em placas de Petri. Para o meio LB líquido não adicionar ágar.
1.2 Meio Caldo Nutriente
25,0 g de meio caldo nutriente nº 2 (OXOID LTD)
água destilada (qsp 1000 mL) Adicionar todos os ingredientes em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e autoclavar a 121 °C por 30 minutos. Armazenar em frasco de vidro a temperatura ambiente.
1.3 Preparo do Tampão PBS (Tampão salina fosfato)
1 frasco PBS (Laborclin)
água destilada (qsp 1000 mL). Adicionar o conteúdo do frasco em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e autoclavar a 121 °C por 30 minutos. Armazenar em frasco de vidro a temperatura ambiente.
1.4 Meio GS
0,5 % de cloreto de sódio (Merck)
0,6 % de ágar Difco (Difco Laboratories)
água destilada (qsp 1000 mL) Adicionar todos os ingredientes em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e autoclavar a 121 °C por 30 minutos. Armazenar em frasco de vidro a temperatura ambiente. Antes de usar adicionar ao frasco de GS: solução mista (10,0 mL) a cada 100,0 mL de GS.
1.5 Solução Mista
11,0 mg de monocloridrato de L-histidina monohidratada (Sigma)
12,36 mg de D-biotina (Sigma)
água destilada estéril (qsp 100 mL) Adicionar todos os ingredientes em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e esterilizar por filtração em filtros milipore 0,22 μm.
1.6 Preparo do meio MEVB 50 X
145
10,0 g de sulfato de magnésio (Reagen)
100,0 g de ácido cítrico (Reagen)
500,0 g de fosfato de potássio dibásico (Merck)
175,0 g de fosfato de sódio e amônio (General Purpon Reagent)
água destilada (qsp 1000 mL) Adicionar todos os ingredientes em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e autoclavar a 121 °C por 30 minutos. Armazenar em frasco de vidro a temperatura ambiente.
1.7 Preparo do meio MEVB
15,0 g de agar (Difco Laboratories)
20,0 mL de MEVB-50x
1 L de glicose 40% (Merck) Adicionar todos os componentes em recipiente adequado, homogeneizar,
avolumar e autoclavar a 121 °C por 30 minutos. Após autoclavagem distribuir em placas de Petri.
1.8 Tampão A2
0,160 mL da solução estoque de MgCl2 6 M para MgCl2 2 mM (PM = 203,3) (Merck)
4,278 g Sacarose 0,25 M (PM = 342,3) (Merck)
50 mL Tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,2 qsp (Reagen) Adição de inibidores de protease (adicionar no momento do uso para cada 10 mL
de tampão A2):
500 µL Aprotinina 0,1 mg/mL (Sigma)
140 µL PMSF (Fenilmetilsulfonilflúor) 14,3 mM (Sigma)
25 µL DTT (Ditiotreitol) 0,5 mM (Sigma)
Aprotinina é uma molécula inibidora de proteases e foi preparada na concentração de 0,1 mg/mL (2,5 mg de aprotinina em 25 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4). Sua concentração no tampão A2 é de 5 µg/mL. O PMSF também é uma molécula inibidora de proteases e foi preparada na concentração de14,3 mM (0,01742g de PMSF em 7 mL de DMSO). Sua concentração no tampão A2 é de 0,2 mM. O DTT é um agente redutor de pontes dissulfeto, que são responsáveis pela estrutura nativa da proteína, preparado na concentração de 0,5 mM (0,03g de DTT em 1 mL do tampão A2 sem as adições).
1.9 Mix
62,9 µL Fosfato de sódio 0,3 M, pH 7,2 (Reagen)
4,6 µL Água destilada
1 µL Superóxido dismutase (SOD) 20.000 UI/mL (1:2 em fosfato de sódio 50 mM) (Sigma)
1 µL HRP 25 UI/mL (1:100 em fosfato de sódio 50 mM) (Sigma)
0,5 µL Amplex Red 10 mM (1:1 em fosfato de sódio 50 mM) (Sigma) Adicionar todos os ingredientes em recipientes adequados, homogeneizar.
1.10 Tampão Tp
146
2,42 g de Tris HCl 200 mM (PM: 121,19) (Invitrogen)
0,74 g de EDTA 20 mM (PM: 374,24) (Merck)
água destilada (qsp 100 mL) Adicionar todos os ingredientes em recipiente adequado, homogeneizar, levar o
pH a 8,2.
1.11 Formol neutro tamponado 10 %
100 mL Formol 37 % PA (Merck)
4 g Fosfato de sódio monobásico (Reagen)
6,5 g Fosfato de sódio dibasico (Reagen)
água destilada (qsp 1000 mL) Adicionar todos os ingredientes em recipiente adequado, homogeneizar.
147
ANEXO 2
Aprovação do Comitê de Ética de no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob o número de referência FARMACIA011-06/16
148
ANEXO 3 Aprovação do Comitê de Ética de no Uso de Animais do Instituto Federal do Rio de Janeiro sob o número de referência 003-2014
