UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Verônica Leite de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Verônica Leite de Holanda Gomes

ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES EM NÉCTARES COMERCIAIS INDUSTRIALIZADOS DE LARANJA E UVA NA REGIÃO

METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL.

Rio de Janeiro 2016


ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES EM NÉCTARES COMERCIAIS

INDUSTRIALIZADOS DE LARANJA E UVA NA REGIÃO METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos em Engenharia Química,

Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.

Orientadora: Karen Signori Pereira, D.Sc.

Rio de Janeiro, RJ

2016


ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES EM NÉCTARES COMERCIAIS INDUSTRIALIZADOS DE LARANJA E UVA NA REGIÃO METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE

JANEIRO, BRASIL.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos em Engenharia Química,

Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.

Aprovada em 29 de setembro de 2016.

_____________________________________________ Karen Signori Pereira, D.Sc., UFRJ

_____________________________________________

Carla da Silva Carneiro, D.Sc., UFRJ

_____________________________________________

Maria Antonieta Peixoto Gimenes Couto, D.Sc., UFRJ

_____________________________________________ Maria Carmela Kasnowski Holanda Duarte, D.Sc., UFF

Dedico

A minha amada avó Linéa (in memoriam) que me criou e fez de mim quem sou hoje.

A minha mãe Nany Leite e ao meu irmão Caíque que são partes fundamentais da

minha vida. E a minhas tias Linelucia, Linelaura e Linelice, pelo amor e carinho

dedicados a mim.

Agradecimento

Agradeço a Deus por tudo o que Ele tem feito na minha vida, pela saúde, pela oportunidade de realizar uma pós-graduação, e pelas pessoas maravilhosas que colocou na

minha vida ao longo desta jornada. A minha família, principalmente minha mãe (Nany) e minhas tias (Luca, Lala e Lili) que

sempre me incentivaram e apoiaram a estudar e ser uma pessoa melhor a cada dia. A minha avó Linéa, que sei que onde quer que ela esteja estará sempre olhando por mim. Também aos

meus tios, minhas primas, meus primos, e meus sobrinhos e cunhado gringo, pelo apoio e carinho dedicados a mim nesta etapa. A minha prima-irmã Babi pela compreensão por todas

as vezes que não pude estar presente na vida dela e dos meus sobrinhos/afilhados, Beatriz e Jonh! Em especial ao meu irmão Caíque que aguentou todo o meu mal-humor e estresse,

demonstrando compreensão e carinho! A minha grande e melhor amiga Shirley Orozco, por estar comigo nos bons e maus

momentos desta etapa, sempre com uma palavra de ânimo e direção, me ajudando a manter o prumo e não perder o foco!

As minhas amigas Avassaladoras (Ana Célia, Bruna, Caroline, Daniele, Katiane, Michele e Rita) que sempre me incentivaram a continuar com meus estudos e crescer

profissionalmente, além da paciência em me ouvirem. A minha amiga Valéria Borges que também sempre me incentivou a continuar os estudos e me indicou o programa de pós-graduação ao qual estou. E a minha amiga Rachel

que sempre me cobrou ter uma titulação. Aos amigos Flávio, Gabi e Romulo, pelo apoio e companheirismo nos momentos finais

dessa jornada. As minhas amigas de turma Ariane, Camilla e Natalia, pelas boas risadas que demos ao

longo da realização das disciplinas e pelo conhecimento que construí ao lado de vocês. Em especial a minha amiga e meu anjinho Camilla, que conheci melhor ao longo do curso e que

sempre me ajudou como um anjo da guarda, se preocupando comigo, e acabou se tornando parte importante dessa minha realização, além de me apresentar a minha orientadora.

A minha orientadora Karen pelo apoio e compreensão total em todos os momentos , mesmo com todas as minhas dificuldades de tempo ela foi imprescindível na concretização

desse sonho. Agradeço também por ter aberto as portas do seu laboratório para mim, me deixando muito à vontade para trabalhar. Muito obrigada por tudo!!

À equipe do laboratório MicroAlim pela compreensão todas as vezes que eu precisava ocupar um equipamento por um mês, atrapalhando meio mundo. E ao João pelo suporte nos

experimentos e pelas conversas de fim de tarde.

A Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) pela oportunidade de ingressar no programa de pós-graduação.

E a todos que contribuíram de determinada maneira para que eu conseguisse chegar onde cheguei, meus sinceros agradecimentos.

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não

é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.

(Madre Teresa de Calcuta)

RESUMO

GOMES, Verônica Leite de Holanda. Isolamento de fungos termorresistentes em néctares comerciais industrializados de laranja e uva na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Rio de Janeiro, 2016. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.

Os néctares são bebidas à base de frutas, sendo susceptíveis ao processo de deterioração por micro-organismos, principalmente por aqueles que resistem ao processo

térmico de fabricação. Embora os fungos sejam sensíveis ao calor, algumas espécies podem produzir estruturas termorresistentes, como ascósporos, que podem sobreviver ao

tratamento térmico em produtos industrializados e se tornarem possíveis deteriorantes dos mesmos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a presença de fungos

termorresistentes em néctares industrializados nos sabores laranja, uva e misto de uva e maçã, comercializados na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro. Foram analisadas

três marcas de néctar de laranja, três de néctar de uva, e uma de néctar misto de uva e maçã destinada ao público infantil, identificadas como X, Y e Z, feitas em triplicata, totalizando 63

amostras. As análises das amostras foram realizadas por meio de medição do pH, choque térmico do néctar seguido de incubação direta em frascos de Erlenmeyer e plaqueamento com meio de cultura à base de batata (Ágar Batata Dextrose) na proporção de 1:1. Tanto a

incubação direta quanto o plaqueamento do néctar ocorreram num período de trinta dias em estufa com temperatura controlada à 30 °C, com verificação de possível crescimento a cada

sete dias. Os valores de pH encontrados nos néctares variaram de 2,42 a 3,57 (± 0,32). Após o período de incubação, não foi observado crescimento fúngico em nenhum dos frascos de

Erlenmeyer. No plaqueamento, houve crescimento em dez das 315 placas analisadas, sendo sete placas de néctar sabor laranja, das marcas X e Z, duas de sabor misto de uva e maçã, da

marca X, e uma de uva, da marca Z, totalizando quinze isolados fúngicos. Apenas a marca Y não teve crescimento em qualquer de suas amostras. Esses quinze isolados foram

identificados macro e microscopicamente em nível de gênero, sendo sete isolados (43,7%) pertencentes ao grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” e oito (53,3%) ao grupo “Penicillium

e gêneros relacionados”.

Palavras-chaves: Fungos termorresistentes, Néctar de Laranja, Néctar de Uva.

ABSTRACT

GOMES, Verônica Leite de Holanda. Isolation of heat-resistant fungi in orange and grape industrialized trading nectars in metropolitan region of Rio de Janeiro State, Brazil. Rio de Janeiro, 2016. Dissertation (Master's degree in Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.

Nectars are beverages from fruit, are susceptible to the process of deterioration by micro-organisms, especially by those who resist thermal manufacturing process. Although

fungi are sensitive to heat, some species can produce heat resistant structures , such as ascospores, which can survive the heat treatment in industrial products and become their

possible spoilage. This study aimed to evaluate the presence of heat-resistant fungi in industrialized nectars in orange, grape and mixed grape and apple flavors, marketed in the

metropolitan region of Rio de Janeiro State. Were analyzed three marks from orange nectar, three from grape nectar, and one from mixed nectar grape and apple aimed at children,

identified as X, Y and Z, made in triplicate, totalizing 63 samples. Analyzes of the samples were performed by measurement of pH, heat shock nectar followed by direct incubation in

Erlenmeyer flasks and plating with potato medium for culture (Potato Dextrose Agar) in a ratio of 1: 1. Direct incubation and plating the nectar occurred in thirty days in an incubator with temperature controlled at 30 °C, possible growth were checked every seven days. The pH

values founded in nectars ranged from 2.42 to 3.57 (± 0.32). After incubation, no fungal growth was observed in any of the Erlenmeyer flasks. In plating, there was growth in ten of

315 plaques analyzed, seven plates of orange-flavored nectar, brands X and Z, two mixed flavor of grape and apple, brand X, and one grape flavor, brand Z, totaling fifteen fungal

isolates. Only brand Y had no growth in any of its samples. These fifteen isolates were identified macroscopically and microscopically at the genus level, with seven isolates (43.7%)

belonging to the group "Aspergillus and their Teleomorphs" and eight (53.3%) to "Penicillium and related genres".

Keywords: Heat-resistant fungi, Orange Nectar, Grape Nectar.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Quadro 1. Condições para identificação macro e microscópica.................................... 41 Quadro 2. Dados da literatura referente aos fungos termorressistentes isolados de

bebidas à base de frutas................................................................................................

54 Gráfico 1. Consumo de sucos e néctares por região, de 2011 a 2015............................ 17

Gráfico 2. Consumo de sucos e néctares no mercado brasileiro, de 2009 a 2012.......... 18 Figura 1. Esquema do ciclo de vida geral do fungo...................................................... 31

Figura 2. Levedura em brotamento. Micrografia de Saccharomyces cerevisae em diferentes fases do brotamento....................................................................................

32

Figura 3. Características da hifa fúngica. (a) Hifa septada, com septo. (b) Hifa cenocítica, sem septo. (c) Hifa crescendo a partir do esporo.........................................

32

Figura 4. Ilustração das estruturas do gênero Aspergillus............................................. 34 Figura 5. Ilustração das estruturas do gênero Penicillium............................................. 35

Figura 6. Diagrama da metodologia.............................................................................. 40 Figura 7. Técnica de microcultivo em lâmina e lamínula............................................... 41

Figura 8. Análise do crescimento fúngico em Erlenmeyer............................................. 45 Figura 9. Crescimento fúngico do néctar plaqueado com meio de cultura BDA............ 46

Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”.........................................................................................................

48

Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e

gêneros relacionados”..................................................................................................

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores de pH das amostras de néctares, com média e desvio padrão para cada marca analisada....................................................................................................

43

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABIR Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e Bebidas Não Alcoólicas AIJN European Fruit Juice Association

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BDA Batata Dextrose Agar

BFP Boas Práticas de Fabricação CITRUS BR Associação Nacional de Exportadores de Sucos Cítricos

CYA Czapeck Yeast Agar G25N 25% Glycerol Nitrate Agar

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística MAPA Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MEA Malt Extratc Agar OIV Organização Internacional da Vinha e do Vinho

RDC Resolução da Diretoria Colegiada UFC Unidade Formadora de Colônia

UE União Europeia UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

USDA United States Department of Agriculture

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 13 2 OBJETIVOS................................................................................................................. 14

2.1 OBJETIVOS GERAIS.................................................................................................. 14 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................................... 14

3 REVISÃO..................................................................................................................... 15 3.1 BEBIDAS À BASE DE FRUTAS.................................................................................... 15

3.2 MERCADOS MUNDIAL E NACIONAL DE BEBIDAS Á BASE DE FRUTAS....................... 17 3.2.1 Laranja................................................................................................................. 19

3.2.2 Uva....................................................................................................................... 20 3.3 MICROBIOLOGIA DE BEBIDAS Á BASE DE FRUTAS................................................... 22

3.3.1 Microbiologia de polpas de fruta......................................................................... 23 3.3.2 Microbiologia de néctares e sucos de fruta......................................................... 25

3.3.3 Principais fungos em frutas e bebidas à base de frutas....................................... 30 3.4 FUNGOS.................................................................................................................. 31

3.4.1 Características gerais........................................................................................... 31 3.4.2 Classificação taxonômica.................................................................................... 33

3.4.2.1 grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”............................................................ 33 3.4.2.2 grupo “Penicillium e gêneros relacionados”..................................................... 34 3.4.3 Fungos termorresistentes................................................................................... 35

3.4.4 Micotoxinas e Fungos Termorresistentes........................................................... 36 4 METODOLOGIA.......................................................................................................... 38

4.1 AMOSTRAS DE NÉCTARES....................................................................................... 38 4.2 ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES................................................... 38

4.3 MEDIÇÃO DO pH..................................................................................................... 40 4.4 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS TERMORRESISTENTES ISOLADOS........ 40

4.5 COMPARAÇÃO DOS FUNGOS ENCONTRADOS COM OS DESCRITOS NA LITERATURA..................................................................................................................

42

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 43 5.1 ANÁLISE DO pH DOS NÉCTARES............................................................................... 43

5.2 CRESCIMENTO E ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES........................ 45 5.3 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS ISOLADOS DOS NÉCTARES................... 47

6 CONCLUSÕES............................................................................................................. 55 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................ 56

8 REFERÊNCIAS............................................................................................................. 57

APÊNDICE A – CÓDIGO PARA AS MARCAS DE SABOR LARANJA..................................... 64 APÊNDICE B – CÓDIGO PARA AS MARCAS DE SABOR UVA............................................. 65

APÊNDICE C – CÓDIGO PARA AS MARCAS DE SABOR MISTO DE UVA E MAÇÃ............... 66 APÊNDICE D – IDENTIFICAÇÃO E ORIGEM DOS ISOLADOS............................................. 67

ANEXO A – FÓRMULA DO MEIO DE CULTURA BATATA DEXTROSE ÁGAR (BDA)............ 68 ANEXO B – MEIOS DE CULTURA PARA IDENTIFICAÇÃO................................................. 69

ANEXO C – CORANTE PARA IDENTIFICAÇÃO.................................................................. 70 ANEXO D – FICHA DE IDENTIFICAÇÃO - CHAVE GERAL PARA FUNGOS EM ALIMENTOS. 71

13

1 INTRODUÇÃO

A alimentação adequada e balanceada é um dos aspectos fundamentais para se ter

qualidade de vida, além da prática de atividades físicas . E essa busca pela qualidade de vida

tem sido cada vez maior nos últimos tempos, levando ao consumo de produtos alimentícios

com apelo de saudabilidade, como, por exemplo, o consumo de néctares comerciais à base

de frutas em substituição aos refrigerantes.

Os alimentos derivados de frutas são bastante susceptíveis à deterioração por micro-

organismos, como os fungos, principalmente em frutas que crescem próximas ao solo, como

a uva. Com a maturação a fruta fica mais susceptível a entrada do fungo, pois a casca se torna

mais macia, o que facilita essa entrada.

Os fungos descritos como filamentosos apresentam pouca resistência ao calor, sendo

facilmente destruídos por meio de processos térmicos, que são comumente utilizados na

produção de vários alimentos, inclusive naqueles derivados de frutas. Porém algumas espécies

podem produzir estruturas termorresistentes na natureza, os esporos, que podem

permanecer em estado de latência nos alimentos, mesmo após processos térmicos. Além

disso, também podem ser ativados após exposição a altas temperaturas, podendo ocasionar

a deterioração do alimento durante o período de estocagem.

Com base na tendência nacional e mundial, o presente estudo propôs o isolamento e

a identificação em gênero de fungos termorresistentes em néctares comerciais

industrializados nos sabores laranja e uva, adquiridos na região metropolitana do Estado do

Rio de Janeiro.

14

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a ocorrência de fungos termorresistentes em amostras de néctares

industrializados nos sabores laranja, uva e misto de uva e maçã, comercializados na região

metropolitana do Estado do Rio de Janeiro.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Isolar os fungos termorresistentes encontrados;

- Identificar em nível de gênero os fungos termorresistentes encontrados.

15

3 REVISÃO

3.1 BEBIDAS À BASE DE FRUTAS

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por meio do Decreto

nº 6.871, de 4 de junho de 2009, regulamenta a Lei nº 8.918, de 14 de julho de 1994, sobre os

processos de padronização, classificação, registro, inspeção, produção, fiscalização e comércio

de bebidas. E essa lei define bebida como:

Art. 2º Para os fins deste Regulamento, considera -se: [...]

II bebida: o produto de origem vegetal industrializado, destinado à ingestão humana em estado líquido, sem finalidade medicamentosa ou terapêutica; III também bebida: a polpa de fruta, o xarope sem finalidade medicamentosa ou terapêutica, os preparados sólidos e l íquidos para bebida, a soda e os fermentados

alcoólicos de origem animal, os destilados alcoólicos de origem animal e as bebidas elaboradas com a mistura de substâncias de origem vegetal e animal; (BRASIL, 1994)

Ainda de acordo com a Lei nº 8.918/94, nos Incisos I e II do Art. 12º, a bebida pode ser

classificada como não-alcoólica, quando a graduação alcoólica não ultrapassa 0,5% em volume

de álcool etílico potável, a 20 °C, ou alcóolica, quando a graduação alcoólica estiver acima de

0,5% e até 54% em volume de álcool etílico potável, também a 20 °C.

As bebidas não-alcoólicas podem ser classificadas como suco ou sumo, polpa de fruta,

água de coco, néctar, refresco, refrigerante, soda, água tônica, xarope, preparado líquido,

preparado sólido, chá pronto para consumo, bebida composta de fruta, polpa de fruta ou

extrato vegetal, e extrato de guaraná, conforme a Lei nº 8.918/94 (grifo nosso):

Seção II Das Bebidas não-Alcoólicas Art. 18º - Suco ou sumo é a bebida não fermentada, não concentrada [...] e não diluída, destinada ao consumo, obtida da fruta madura e sã, ou parte do vegetal de

origem [...] Art. 19º - Polpa de fruta é o produto não fermentado, não concentrado, obtido de fruta polposa [...] Art. 20º - Água de coco é a bebida obtida da parte l íquida do fruto do coqueiro (Cocus

nucifera) não diluída e não fermentada, extraída e conservada [...] Art. 21º - Néctar é a bebida não fermentada, obtida da diluição em água potável da parte comestível do vegetal ou de seu extrato, adicionado de açúcares,

destinada ao consumo direto. § 1°

16

- Quando adicionado de dióxido de carbono, o néctar será denominado “néctar de

...”, acrescido do nome da fruta ou vegetal, gaseificado. § 2° - Néctar misto é a bebida obtida da diluição em água potável da mistura de partes

comestíveis de vegetais, de seus extratos ou combinação de ambos, e adicionado de açúcares, destinada ao consumo direto. Art. 22º - Refresco ou bebida de fruta ou de vegetal é a bebida não fermentada, obtida pela diluição, em água potável, do suco de fruta, polpa ou extrato vegetal de

sua origem, com ou sem adição de açúcares. [...] Art. 23º - Refrigerante é a bebida gaseificada, obtida pela dissolução, em água potável, de suco ou extrato vegetal de sua origem, adicionada de açúcar. [...] Art. 24º - Soda é a água potável gaseificada com dióxido de carbono, com pressão

superior a duas atmosferas, a vinte graus Celsius, podendo ser adicionada de sais minerais. [...] Art. 25º - Água tônica de quinino é o refrigerante que contiver, obrigatoriamente, de

três a sete miligramas de quinino ou seus sais [...] por cem mili l itros de bebida. Art. 26º - Xarope é o produto não gaseificado, obtido pela dissolução, em água potável, de suco de fruta, polpa ou parte do vegetal e açúcar [...] Art. 27º - Preparado líquido ou concentrado líquido para refresco é o produto que

contiver suco, polpa ou extrato vegetal de sua origem, adicionado de água potável [...] com ou sem açúcares. [...] Art. 29º - Preparado líquido ou concentrado líquido para refrigerante é o produto que contiver suco ou extrato vegetal de sua origem, adicionado de água potável [...]

com ou sem açúcares. [...] Art. 31º - Preparado sólido para refresco é o produto à base de suco ou extrato vegetal de sua origem e açúcares [...]

Art. 32º - Chá pronto para consumo é a bebida obtida pela maceração, infusão ou percolação de folhas e brotos de várias espécies de chá do gênero Thea (Thea sinensis e outras), [...] podendo ser adicionado de outras substâncias de origem vegetal e de açúcares. [...]

Art. 34º - Bebida composta de fruta, de polpa ou de extrato vegetal é a bebida obtida pela mistura de sucos, polpas ou extratos vegetais [...] com produto de origem animal, tendo predominância em sua composição de produto de origem vegetal,

adicionada ou não de açúcares. [...] Art. 35º - Extrato de guaraná é o produto resultante da extração dos princípios ativos da semente de guaraná (gênero Paullinia), com ou sem casca, observados os l imites de sua concentração.

(BRASIL, 1994)

As indústrias de bebidas investiram na diversificação de sua linha de produção,

introduzindo produtos como o néctar de fruta, que ganhou espaço no mercado por apresentar

menor preço em relação aos sucos integrais pasteurizados ou reconstituídos (QUEIROZ;

MENEZES, 2005). Mamede et al. (2013) justificaram que a grande expansão da introdução de

sucos e néctares prontos para serem consumidos ocorreu devido a tendência mundial no que

diz respeito ao consumo de bebidas consideradas saudáveis, convenientes e saborosas.

17

3.2 MERCADOS MUNDIAL E NACIONAL DE BEBIDAS À BASE DE FRUTAS

De acordo com o Relatório de Mercado publicado pela Associação Europeia de Sucos

de Frutas (European Fruit Juice Association – AIJN), em 2012, independente da condição

financeira pela qual a União Europeia (UE) se encontrava, o consumo de sucos e néctares era

mantido por consumidores na região, pois essas bebidas são associadas a saúde e bem-estar.

Na busca por produtos de valor econômico mais acessível, “os néctares se beneficiaram em

alguns países pelo fato dos consumidores terem diminuído o consumo de sucos 100% para

economizar”, segundo o relatório de mercado AIJN (2012).

O consumo de suco de fruta e néctar, em âmbito mundial, foi em torno de 48.500

milhões de litros nos anos de 2011 a 2015, conforme os dados publicados no Relatório de

Mercado da AIJN (2012; 2013; 2014; 2015; 2016). Ainda de acordo com esses relatórios,

nesses cinco anos, a UE consumiu em média 10.150 milhões de litros em cada ano, seguida da

América do Norte, com consumo de 9.500 milhões de litros, Europa Ocidental com 9.200

milhões de litros, região Ásia-Pacífico com 7.750 milhões de litros, Leste Europeu com 5.000

milhões de litros, América Latina com 3.500 milhões de litros, e a região da África e do Oriente

Médio com 3.400 milhões de litros (Gráfico 1).

Gráfico 1. Consumo de sucos e néctares por região, de 2011 a 2015. Fonte: AIJN, 2012; 2013; 2014; 2015; 2016.

Esses dados mostram que os maiores consumidores de suco de fruta e néctar são a UE

seguida da América do Norte, porém o maior consumo per capita, nos últimos cinco anos, está

10.150

9.500

9.200

7.750

5.000

3.5003.400

Consumo de Sucos e Néctares por Região, de 2011 a 2015 (em milhões de litros)

U.E. América do Norte

Europa Ocidental Região Ásia-Pacífico

Leste Europeu América Latina

Região da África e do Oriente Médio

18

na América do Norte, com média de 27,2 litros por pessoa, enquanto que na UE, a média de

consumo é de 19,9 litros por pessoa (AIJN, 2012; 2013; 2014; 2015; 2016).

Com o objetivo de traçar um panorama no setor de bebidas no Brasil, Rosa, Cosenza e

Leão (2006) concluíram que, na época, o setor de bebidas como sucos ainda possuía grande

capacidade de expansão nos mercados interno e externo, sendo favorecido pelo

desenvolvimento de novos produtos, que levou a mudança de hábitos, em que antes o suco

seria um bem desnecessário, aumentando o consumo do produto no mercado nacional.

Segundo Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de Bebidas Não

Alcoólicas (ABIR), nos anos entre 2002 e 2009 o consumo de sucos e néctares teve um

aumento de 14,5%, sendo consumidos mais de 463 milhões de litros em 2009 (ABIR, 2010).

Esses números aumentaram em 2010, que, ainda segundo a ABIR, alcançou 10,6% somente

naquele ano, com consumo de 513 milhões de litros (ABIR, 2011). E em 2012 o consumo

estimado foi cerca de 800 milhões de litros (4,5 litro/pessoa/ano) (MAMEDE et al., 2013)

(Gráfico 2).

Gráfico 2. Consumo de sucos e néctares no mercado brasileiro, de 2009 a 2012. Fonte: ABIR, 2010; 2011; MAMEDE et al., 2013.

A ABIR, em fevereiro de 2016, publicou uma notícia sobre a indústria de refrigerantes

no Brasil, que apresentou a menor produção no mês de janeiro desde 2012, com queda de

11,7% em referente ao mesmo mês de 2015. A justificativa para essa queda pode estar no

aumento do consumo de outras bebidas, como sucos e néctares, diz a ABIR (ABIR, 2016).

463513

800

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

2009 2010 2012

Ano

Consumo de Sucos e Néctares no Mercado Brasileiro (milhões de litros)

Consumo de Sucos eNéctares (milhões de litros)

19

No Brasil, o sabor laranja para bebidas como sucos e néctares sempre foi considerado

uma “preferência nacional” até final do século XX. Mas desde 2005 a preferência pelos

diferentes sabores tem sido alterada, e em 2010 a liderança dessa preferência foi pelo sabor

de uva (BRONZATO-JUNIOR, 2011).

Em 2014, Carmo, Dantas e Ribeiro (2014), realizaram uma pesquisa para caracterizar

o mercado consumidor de sucos prontos para o consumo, em Viçosa (MG), e concluíram que

esse mercado ainda apresentava grande potencial a ser explorado, já que a maioria dos

entrevistados costumavam consumir o produto de três a cinco vezes por semana. Sendo os

sabores de laranja e de uva os que apresentaram maior intenção de consumo dentre os

entrevistados.

3.2.1 Laranja

A laranja (Citrus sinensis) é considerada um alimento de alto valor nutricional por

possuir alto teor de carboidratos e de vitamina C (ácido ascórbico), que protege contra

oxidação no meio intracelular pelo alto poder redutor. Além disso, contém elementos e

nutrientes essenciais, como carotenoides, folato, potássio, assim como flavonoides,

hesperidina e narirutina com propriedades hipolipidêmicas, anti-inflamatórias e antioxidantes

(SOUZA, 2014).

Na década de 80, a laranja levou o Brasil ao posto de maior produtor da fruta, sendo a

maior parte de sua produção destinada às indústrias de sucos, destacando-se o suco

concentrado congelado (QUEIROZ; MENEZES, 2005).

Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2014) a

produção de laranja atingiu a faixa de mais de 16,4 milhões de toneladas em 2014, o que

equivale a 402,9 milhões de caixas, obtendo um aumento de 0,9% em relação à produção de

2013, tendo o Estado de São Paulo como o principal produtor, responsável por 72% dessa

produção. Sendo a produção nacional aproximada de 16,2 milhões de toneladas em 2015, e a

previsão de produzir em torno de 15,8 milhões de toneladas em 2016 (IBGE, 2016).

Um dos maiores produtores mundial de laranja, os Estados Unidos da América, de

acordo com o relatório do United States Department of Agriculture (USDA), no período 2014-

2015, produziu 6.378 milhões de toneladas de laranja, sendo que o Estado da Flórida produziu

68,3% do total do país (USDA, 2016). Esses dados refletem a redução na produção de laranja

20

pelo país desde a década de 80. E o consumo de suco de laranja na região também acompanha

essa retração, pois o mesmo teve redução nos últimos meses, segundo relatório da Nielsen,

agência que mede o consumo de suco de laranja pelos estadunidenses semanalmente, em

reportagem publicada em maio de 2016, no portal da Associação Nacional de Exportadores

de Sucos Cítricos (CITRUS BR, 2016).

Na determinação dos padrões físico-químicos na produção do néctar, o MAPA, com a

Instrução Normativa Nº42, de 11 de setembro de 2013, fixou uma quantidade mínima de 50%

(m/m) (cinquenta por cento massa massa) de suco de laranja no néctar de laranja, a partir de

31 de janeiro de 2016. Em complemento, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),

com a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) Nº8, de 6 de março de 2013, que “dispõe sobre

a aprovação de uso de aditivos alimentares para produtos de frutas e de vegetais e geleia de

mocotó”, incluiu os néctares, e também determinou funções e limites máximos no uso desses

aditivos nos produtos alimentares.

Em outro estudo, Kim et al. (2013) avaliaram as características sensoriais de sucos de

laranja disponíveis comercialmente, para determinar o impacto de diferentes condições de

processo na preferência do suco de laranja, e identificar direcionadores de preferência nesses

sucos na Coréia. Os mesmos concluíram que existe muita semelhança entre o mercado

coreano e o global no segmento de sucos de laranja, e que a indústria destes deveria manter

elevado o sabor de laranja e doçura em seus sucos para atingir o mercado consumidor.

Considerando a necessidade de uma conformidade entre o produto e a legislação,

Ferrarezi (2008) avaliou a intenção de compra do consumidor e as características físico-

químicas de néctar e suco de laranja pronto para beber, concluindo que ocorreu falta de

homogeneidade entre os lotes e as marcas dos produtos, o que pode caracterizar certa falta

de compromisso dos produtores em atender aos limites exigidos pela legislação.

3.2.2 Uva

A uva (Vitis vinifera) é um produto rico em compostos fenólicos com ação antioxidante,

antiviral e anticarcinogênica comprovada por vários estudos (JAYAPRAKASHA; SINGH;

SAKARIAH, 2001; PONTES et al., 2010). Também possui quantidades expressivas de

resveratrol, substância com ação antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, cardioprotetora,

quimiopreventiva de câncer, e retardo do envelhecimento (ACAUAN, 2007). Além disso, o

21

suco de uva também pode inibir a oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (O’BRYNE

et al., 2002).

No Brasil, aproximadamente 90% da produção de uva e seus derivados está na região

do Rio Grande do Sul. De acordo com dados do IBGE, em 2012, a produção de uva no país

chegou a um pouco mais de 1,4 milhões de toneladas, sendo que 57% dessa produção foi

destinada a produção de vinhos, sucos e derivados, e o restante, 43% para consumo in natura

(MELLO, 2013). Nos anos seguintes, 2013 e 2014, a produção foi mantida em torno de 1,4

milhões de toneladas, com mais da metade da produção para consumo in natura e o restante

para processamento (PROTAS, 2015; MELLO, 2015). Em 2015, a produção foi de

aproximadamente 1,5 milhões de toneladas, e o destino dessa produção foi maior para o

processamento (52%) que para consumo in natura (48%) (MELLO, 2016).

Entre 2001 e 2003 a produção mundial de uva teve crescimento, mas entre 2004 e

2010 essa produção se manteve em torno de 67 milhões de toneladas (MELLO, 2012). Nos

anos de 2011 e 2012 a produção ficou em torno de 70 milhões de toneladas, atingindo a marca

de 77,6 milhões de toneladas em 2013, com uma queda sutil em 2014, em que a produção

mundial de uva ficou em torno de 73,7 milhões de toneladas, de acordo com o Relatório

Estatístico sobre Vitivinicultura da Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV, 2015).

Ainda segundo este relatório, dentre os países com maior produção está a China, com cerca

de 15% da produção mundial, seguida por Estados Unidos da América, França, Itália e

Espanha.

O MAPA, por meio da Instrução Normativa Nº42, de 11 de setembro de 2013, também

fixou uma quantidade mínima de 50% (m/m) de suco de uva no néctar de uva, a partir de 31

de janeiro de 2016, assim como foi feito para o néctar de laranja.

Pontes et al. (2010) realizaram um trabalho para avaliar os atributos sensoriais e a

aceitação de sucos de uva comerciais no Brasil, incluindo o néctar de uva. Estes concluíram

que os néctares possuíam preço reduzido em relação ao suco de uva, bem como embalagens

mais práticas e estavam mais disponíveis no mercado, o que pôde influenciar o consumo do

mesmo, já que este teve aceitação equivalente à do suco de uva integral.

Com o intuito de contribuir para o controle de qualidade, a autenticidade e a tipicidade

de derivados de uva, como o néctar, produzidos no Brasil, Rizzon e Miele (2012)

desenvolveram um trabalho para determinar as diferenças físico-químicas dentre néctares e

bebidas de uva. Os autores concluíram que os sucos de uva integral e adoçado apresentaram

22

valores mais elevados de sólidos solúveis totais, ácidos tartárico e málico, compostos fenólicos

e minerais em relação ao néctar e à bebida de uva, que apresentaram valores mais elevados

da relação °Brix/acidez titulável.

Diante da importância comercial e da preferência do néctar de uva em relação aos

demais sabores, Mamede et al. (2013) realizaram um estudo para traçar o perfil sensorial de

diferentes marcas representativas de néctar de uva, assim como obter medidas de

parâmetros de cor por meio de colorímetro. Concluíram que a preferência do consumidor

estava em amostras que apresentaram alta intensidade de cor vinho e baixa intensidade de

cor marrom, sendo de menor aceitação amostras com aroma de cozido mais intenso. Logo,

esses atributos influenciam na preferência dos consumidores, e que a análise física da cor do

néctar de uva pode ser uma medida importante no padrão de qualidade.

3.3 MICROBIOLOGIA DE BEBIDAS À BASE DE FRUTAS

A bebida, por determinação da Lei 8.918/94, Seção I Art. 13º, “deve conter,

obrigatoriamente, a matéria prima vegetal, animal ou mineral, responsável por sua

característica sensorial, excetuando o xarope e o preparado sólido para refresco” (BRASIL,

1994). O néctar, por ser uma bebida à base de fruta, e com essa necessidade de se ter a fruta

na bebida, sugere uma busca por possíveis micro-organismos presentes nas mesmas, já que a

presença de micro-organismos no produto comercializado foi comprovada por diversos

autores em estudos anteriores.

A RDC nº12, de 2 de janeiro de 2001, da ANVISA, que aprova o Regulamento Técnico

sobre padrões microbiológicos para alimentos, determina apenas padrões para coliformes

termotolerantes que, no caso, devem ser ausentes em bebidas dos tipos refrescos, sucos e

néctares adicionados ou não de conservadores, congelados ou não; mas não faz qualquer

referência a padrões fúngicos.

Com o intuito de evitar perdas econômicas com uma possível contaminação do

alimento, torna-se necessária a implementação de práticas preventivas durante sua

fabricação. De acordo com a ANVISA, as Boas Práticas de Fabricação (BPF) podem ser descritas

como:

23

As Boas Práticas de Fabricação (BPF) abrangem um conjunto de medidas que devem

ser adotadas pelas indústrias de alimentos a fim de garantir a qualidade sanitária e a conformidade dos produtos alimentícios com os regulamentos técnicos. A legislação sanitária federal regulamenta essas medidas em caráter geral, aplicável a

todo o tipo de indústria de alimentos e específico, voltadas às indústrias que processam determinadas categorias de alimentos. (site: http://www.anvisa.gov.br/alimentos/bpf.htm)

Para que sejam garantidas as BPF é importante estabelecer os princípios do Sistema

de Análise de Perigos e Pontos Críticos, que permitem a identificação, a avaliação e o controle

dos perigos significativos para a segurança do alimento, desde a sua produção até seu

consumo (CODEX ALIMENTARIUS, 2006).

O tratamento térmico, que é regularmente utilizado na produção de muitos alimentos,

para alimentos ácidos, como frutas e derivados, tem sido tradicionalmente brando, pois

esporos de bactérias raramente são um problema nesses produtos, já que a pasteurização,

realizada com temperaturas em torno de 70 a 75 °C por 15 segundos, é suficiente para inativar

muitas enzimas, as leveduras e os conídios dos fungos. Porém, os ascósporos produzidos por

algumas espécies de fungos são capazes de sobreviver a esse processo de pasteurização

podendo causar deterioração do alimento (PITT; HOCKING, 2009).

3.3.1 Microbiologia de polpas de fruta

Segundo a Lei Nº 8.918/94, em seu Art. 19º, a polpa da fruta pode ser definida como

“produto não fermentado, não concentrado, obtido de fruta polposa, por processo

tecnológico adequado, atendido o teor mínimo de sólidos em suspensão” , que comumente é

utilizada como matéria-prima para a produção de néctares, sucos e outros derivados.

De acordo com a RDC nº12/01, da ANVISA, determina uma tolerância de 102 coliformes

a 45 °C/g e ausência de Salmonella sp/25g, para “polpa de frutas concentradas ou não, com

ou sem tratamento térmico, refrigeradas ou congeladas”.

Em 2004, na Colômbia, García et al. (2004) com o objetivo de avaliar a qualidade

microbiológica de polpa de mamão, relataram a presença de fungos como Aspergillus sp.,

Monilia sp., Cladosporium sp. e Penicillium sp., além da presença de aeróbios mesófilos e

coliformes termotolerantes.

Fazio (2006) em sua dissertação avalia a qualidade microbiológica de mais de sessenta

amostras de polpas congeladas de frutas comercializadas na região de São José do Rio Preto

24

(SP), isolando 136 leveduras de dezenove espécies diferentes, sendo as mais frequentes

Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii var. fabryi e Dekkera bruxellensis, e a

presença dos gêneros Cryptococcus sp. e Rhodotorula sp.

Também avaliando a qualidade microbiológica de polpas de frutas congeladas, Pereira

et al. (2006), em Minas Gerais, obtiveram contagens de fungos filamentosos que variaram de

< 10 a 2,6x104 UFC/g, o que representa um valor maior do que o permitido pela legislação

brasileira, porém não identificou os fungos isolados.

Em Boa Vista (RR), foi analisada a qualidade microbiológica de cem polpas de frutas

congeladas comercializadas na região. Sendo isolado um número significativo de fungos

filamentosos, leveduras e bactérias heterotróficas nas amostras analisadas, em que 78%

estavam em desacordo com os padrões para os mesmos de acordo com a legislação, com uma

média de 5,0x104 UFC/g para fungos filamentosos e leveduras. Os fungos isolados também

não foram identificados (SEBASTIANY; REGO; VITAL, 2009).

Ainda na avaliação da qualidade de polpas de frutas congeladas, Souza, Carneiro e

Gonsalves (2011), relataram que 50% das amostras analisadas pelo grupo apresentaram

valores acima do permitido pela legislação para a presença de fungos filamentosos e

leveduras, em polpas comercializadas no município de Russas (CE).

Com o objetivo de avaliar a qualidade microbiológica de polpas de açaí congeladas

comercializadas na cidade de Pouso Alegre (MG), foram analisadas 36 amostras por realização

de contagem de fungos filamentosos e leveduras, além de bactérias mesófilas, coliformes

totais e termotolerantes e pesquisa de E. coli. Dentre as amostras analisadas, 75%

apresentaram valores acima dos determinados pela legislação para contagem de coliformes

totais, 16,7% das amostras apresentaram coliformes termotolerantes acima do permitido e

13,8% confirmaram presença para E.coli. As contagens de fungos filamentosos e leveduras

também estavam acima dos valores estabelecidos em 8,3% das amostras. E na contagem de

bactérias mesófilas os valores variaram de 3x101 a 3,3x104 UFC/ml (FARIA; OLIVEIRA; COSTA,

2012).

Na cidade de Governador Valadares (MG), Ferreira-Marçal et al. (2014), com o objetivo

de analisar polpas de frutas congeladas comercializadas na cidade quanto aos parâmetros

físico-químicos, microbiológicos e microscópicos, avaliaram dez amostras de nove diferentes

sabores de polpas de frutas congeladas: acerola, cacau, caju, cupuaçu, goiaba, graviola,

mamão, manga e uva. E como resultado, não detectaram o crescimento de Salmonella nem

25

de coliformes totais nas amostras analisadas, mas nas contagens de fungos filamentosos e

leveduras foram observadas de 10 a 2,1x103 UFC/g, destacando a contagem da polpa de

graviola apresentou valor superior ao estabelecido pela legislação, mesmo que todas as outras

tenham se apresentado dentro do limite máximo.

Ainda em 2014, Donzeli et al (2014), publicaram um trabalho que avaliou parâmetros

físico-químicos e microbiológicos de polpas de frutas congeladas comercializadas na região do

Vale de São Francisco, nos municípios de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA), sendo as polpas de

abacaxi, acerola, açaí, cacau, cajá, cupuaçu, graviola, goiaba, manga, maracujá, seriguela e

umbu. De acordo com os resultados obtido pelo grupo, não houve crescimento de coliformes

termotolerantes em nenhuma das amostras avaliadas, e, mesmo que os números de fungos

filamentosos e leveduras estivessem dentro do valor estabelecido pela legislação, estes

apareceram no valor de até 8,2x102 UFC/g.

Gonçalves (2014) avaliou a segurança microbiológica de polpa de cupuaçu processada

termicamente na região amazônica brasileira. Embora não tenha observado a presença de

coliformes ou Salmonella spp., e que os valores para fungos filamentosos e leveduras

estivessem dentro do permitido pela legislação, dois fungos termorresistente foram

identificados: Aspergillus niger e Aspergillus flavus, sendo que o último foi detectado com

potencial de produção de micotoxinas. O que reafirma a necessidade de fiscalização mais

rigorosa na produção de polpa de fruta.

3.3.2 Microbiologia de néctares e sucos de fruta

Os micro-organismos também podem ser encontrados em bebidas à base de frutas,

como em néctares e sucos, e o isolamento de fungos termorresistentes nesses tipos de

bebidas tem sido realizado por diversos autores.

King Jr, Michener e Ito (1969), realizam um trabalho de controle de Byssochlamys e

fungos termorresistentes em uvas e seus derivados, como suco de uva, nos Estados Unidos

(EUA). Os autores concluíram que os ascósporos de B. fulva (NRRL 3493) germinaram mais

prontamente quando tratados termicamente (4 min à 80 °C), em relação à germinação sem o

tratamento. E que esses ascósporos diferem dos esporos bacterianos por terem maior

resistência térmica em baixos valores de pH, como o obtido no suco de uva, no valor

aproximado de 3,8. Foram isoladas cepas de Byssochlamys nivea, Aspergillus sp., Penicillium

26

sp., Paecilomyces varioti e Thermoascus aurantiacum, entre outros fungos termorresistentes ,

em condições de tratamento térmico de 80°C por 30 minutos, sendo que os fungos B. nivea,

Penicillium sp. e T. aurantiacum cresceram também em condições de tratamento térmico de

88°C por 60 minutos.

Em 1998, Hoffmann et al., analisaram a qualidade microbiológica de amostras de

dezenove marcas diferentes de suco de laranja integral comercializadas em São José do Rio

Preto (SP), verificando que mais da metade das amostras não estavam de acordo com os níveis

estabelecidos pela legislação vigente. A contagem de fungos filamentosos e leveduras foi

entre 5,8x101 e 9,1x105 UFC/mL, também identificando a presença de coliformes totais e

termotolerantes.

Sousa et al. (2001) realizaram uma análise microbiológica em suco de laranja integral

e néctar de cupuaçu e de acerola, produzidos em certa indústria de Belém (PA) e

comercializados por ambulantes nesta cidade. A análise mostrou a presença de Salmonella sp.

em 4,2% das amostras, e a presença de coliformes termotolerantes em todas as amostras em

um nível acima do permitido pela legislação em vigor, bem como a presença de fungos

filamentosos e leveduras, chegando a 98% das amostras de sucos .

Cunha (2003) com o objetivo de avaliar o crescimento de fungos termorressistentes,

das espécies Byssochlamys fulva e Neosartorya fischeri, realizou experimentos com o método

de diluição e de plaqueamento, em sucos naturais de abacaxi e maracujá, em duas

temperaturas, 20 °C e 30 °C. Após a inoculação de suspensão de esporos observou-se o

crescimento de B. nivea no suco de abacaxi em três dias (a 20 °C), e em um dia e meio (30 °C).

Já o crescimento deste fungo no suco maracujá ocorreu em 4 dias (a 20 °C), e em um dia (a 30

°C). O estudo de N. fischeri não foi realizado por contaminação da suspensão de esporos.

Marcolino (2003) analisou amostras de bebida de uva pasteurizada e pronta para

beber, de uma indústria localizada no interior do Rio Grande do Sul, obtidas diretamente de

uma linha de processamento asséptico. E como resultado, a autora detectou a presença de

dois fungos termorresistentes identificado como Neosartorya fischeri.

Os gêneros de bactérias Bacillus e Alicylobacillus produzem endosporos que são

capazes de tolerar temperaturas extremas e permanecerem viáveis em sucos concentrados

congelados. Com o objetivo de detectar e quantificar micro-organismos que contaminam

normalmente sucos de laranja concentrados e congelados sem conservantes, Vaccari et al.

(2005) realizaram estudo com 36 amostras destes sucos. Como resultado foram encontrados

27

micro-organismo na maioria das amostras e identificados em cinco espécies do gênero

Bacillus, sendo o B. subtilis identificado em 74% das 80 cepas isoladas. Os resultados mostram

a sobrevivência elevada dos endosporos após a pasteurização ou a contaminação ambiental

pós-pasteurização.

Fernandes et al. (2006) analisaram quinze amostras de sucos tropicais nos sabores

acerola, goiaba e manga, coletadas em supermercados de Fortaleza (CE). Dentre as amostras

analisadas, todas estavam dentro dos padrões estabelecidos pela legislação quanto a

contagem de fungos filamentosos e leveduras e a presença de coliformes totais. Apenas uma

amostra do sabor goiaba apresentou contagem de fungos filamentosos e leveduras de

4,45x103 UFC/mL, além da contagem de micro-organismos aeróbios mesófilos de 6,6x103

UFC/mL. No mesmo ano, o grupo também analisou quinze amostras de sucos tropicais nos

sabores abacaxi, caju e maracujá, adquiridas no mercado local de Fortaleza (CE), em que

apenas uma amostra de maracujá apresentou contagem de leveduras de 2,3x102 UFC/mL e

outra do mesmo sabor apresentou contagem de micro-organismos mesófilos de 9,0x102

UFC/mL (PINHEIRO et al., 2006).

Avaliando a qualidade de sucos de fruta pasteurizados em supermercados de

Washington (DC), nos EUA, Tournas, Heeres e Burgess (2006) identificaram a presença de

fungos filamentosos (Fusarium spp., Geotrichum spp. e Penicillium spp.) em sucos de uva e

leveduras (Candida sake, C. lambrica e Kloeckera apis) em sucos de cenoura, laranja e uva.

Em 2007, Mattietto, Lopes e Menezes, publicaram um trabalho sobre a avaliação da

conservação das características de néctar misto de cajá, proveniente de Belém (PA), e umbu,

de Salvador (BA), adquiridos em feiras livres, durante o armazenamento em temperatura

ambiente. O tratamento térmico empregado foi eficiente por 60 dias de estocagem, pois, após

esse período, houve modificação nas propriedades sensoriais assim como o desenvolvimento

de fungos. De acordo com os autores, as características observadas ao microscópio eram

semelhantes ao de fungo do gênero Byssochlamys, em particular B. fulva, porém não foram

realizadas técnicas específicas de identificação.

Salomão, Massaguer e Aragão (2008) verificaram a ocorrência de fungos

termorresistentes em etapas do processo produtivo de néctar de maçã na região sul do Brasil,

sendo encontrados os fungos Neosartorya fischeri, Byssochlamys fulva e Eupenicillium sp.

Neste caso, os fungos das espécies Neosartorya fischeri e Byssochlamys fulva foram os mais

28

termorresistentes, pois sobreviveram ao choque térmico de 95°C por 20 minutos, tempo

muito superior ao aplicado a produtos de maçã.

Com o mesmo objetivo de verificar a ocorrência de fungos termorresistentes em sucos

de maçã concentrados, em uma indústria processadora de suco no Rio Grande do Sul (RS),

Welke et al. (2009) isolaram fungos do gênero Byssochlamys, identificando três cepas como

B. fulva e uma cepa como B. nivea, sendo esta produtora de patulina nas condições testadas.

De acordo com os autores, a presença destes fungos no suco durante seu armazenamento

pôde ser a causa de deterioração e possível produção da micotoxina.

Analisando fungos isolados de néctares de maracujá e abacaxi comerciais

pasteurizados, Ferreira et al. (2011) buscaram caracterizar a termorresistência desses fungos,

assim como verificar a produção de patulina pelos mesmo, quando inoculados nestes

néctares. Como resultado, isolaram os fungos termorresistentes Byssochlamys fulva em

néctar de maracujá e Byssochlamys nivea em néctar de abacaxi, sendo este último mais

termorresistente. E não foi observada a produção de patulina quando os fungos foram

inoculados diretamente nos néctares estudados.

Na análise micológica de quinze amostras de suco natural de laranja preparados e

comercializados em cinco pontos de venda, na cidade de Franca (SP), Soares et al. (2011)

isolaram e identificaram crescimento de leveduras em todas as amostras numa média de

7,25x103 ± 3,2 UFC/mL. Com 82% das leveduras sendo do gênero Candida (C. albicans, C.

guilliermondii, C. krusei, C. pelliculosa e C. tropicalis), 9% do gênero Rhodotorula (R. glutinis) e

9% do gênero Geotrichum (G. candidum). O grupo concluiu que boas práticas higiênico-

sanitárias devem ser implantadas, já que as espécies C. albicans e C. krusei, isoladas nos sucos

estudados, são importantes agentes de infecções, principalmente em indivíduos

imunodeficientes.

Com o objetivo de apresentar estudos sobre o desenvolvimento de fungos

termorresistentes em sucos de fruta concentrado, Nunes et al. (2012) fizeram uma revisão

incluindo métodos recomendados para enumerar esses fungos assim como a influência da

constituição do suco na sobrevivência dos ascósporos após o tratamento térmico. Por meio

do estudo foi possível concluir que as principais medidas de controle para evitar o

aparecimento de fungos termorresistentes e outros micro-organismos nos sucos

concentrados está no uso de matéria-prima de boa qualidade assim como a adoção de Boas

Práticas de Fabricação.

29

Em estudo realizado por Fukumoto (2012), que resultou em sua monografia, foram

avaliados néctares de uva industrializados comercializados na cidade do Rio de Janeiro na

busca por fungos termorresistentes. Como resultado, o autor detectou a presença de dois

fungos termorresistentes dentre as 68 amostras analisadas, sendo um identificado como

pertencente ao gênero Penicillium, e o outro sendo possivelmente do gênero Aspergillus,

tendo o último a termorresistência comprovada.

Silva (2013), em sua dissertação, avaliou a qualidade microbiológica de sucos de laranja

com baixo e médio teor de polpa, no Brasil, além de parâmetros físico-químicos. De acordo

com o autor, os tratamentos térmicos utilizados na análise foram suficientes para destruir

micro-organismos patogênicos nos sucos de laranja, sendo observada contagem de fungos

filamentosos e leveduras inferior a 10 UFC/mL, porém, o suco com médio teor de polpa

apresentou contagem de 10x101 UFC/mL.

Um estudo realizado nas cidades de Barra Mansa e Volta Redonda (RJ), por Brum et al.

(2014), avaliou a qualidade microbiológica de refrescos acondicionados em refresqueiras, nos

sabores caju e laranja. Dentre as sete amostras analisadas, duas estavam acima do padrão

estabelecido pela legislação brasileira quanto à presença de coliformes a 45°C ou

termotolerantes. O que evidencia que essas amostras estariam impróprias para o consumo.

Com o objetivo de identificar a presença de fungos, incluindo os termorressitentes, e

Alicyclobacillus spp. durante o processo de concentração de suco de maçã no Brasil, Salomão

et al. (2014) conseguiram isolar bactéria A. acidoterrestris e 19 fungos, identificando 12 desses

como pertencentes ao gênero Penicillium, em que metade pertencia a espécie Penicillium

expansum. Dentre os fungos termorresistentes isolados e identificados, obtiveram as espécies

Neosartorya fischeri, Byssochlamys fulva e também os gêneros Eupenicillium sp., Talaromyces

sp. e Eurotium sp. Concluindo que seus resultados refletem a necessidade de métodos para

eliminar ou prevenir a presença de micro-organismos no suco de maçã, bem como evitar a

produção de micotoxinas pelos fungos.

Mahgoub e El-Shourbagy (2015) analisaram a qualidade de diversos sucos de frutas

comercializados no Egito, utilizando parâmetros microbiológicos, físico-químicos e a

prevalência de esporos bacterianos. Na pesquisa foram isoladas, predominantemente,

espécies bacterianas como Alicyclobacillus acidoterrestris, Bacillus coagulans, B. licheniformis

e B. mycoides, e leveduras dos gêneros Candida spp. e Saccharomyces spp. Os autores

30

concluíram que existe a necessidade de padrões de higiene para a fabricação de sucos no país,

de acordo com os micro-organismos isolados e identificados.

Os estudos observados corroboram com a ideia de que a relação entre frutas, micro-

organismos e bebidas à base de frutas é muito estreita, considerando que os fungos

encontrados nas frutas, na sua maioria, são provenientes do solo e podem chegar à bebida

durante seu processamento. Esses estudos também mostram que a prevalência de fungos,

especialmente os termorresistente, são uns dos principais contaminantes de bebidas

processadas termicamente e comercializadas.

3.3.3 Principais fungos em frutas e bebidas à base de frutas

A deterioração microbiológica de frutas e seus derivados ocorre, na maioria das vezes,

por fungos, já que a fruta tende a ser ácida, com valores de pH entre 1,8 a 2,2 (como em

maracujá e limão) e 4,5 a 5,0 (como em tomates e figos), sendo mais resistente a invasão por

bactérias. E com o amadurecimento, as frutas se tornam ainda mais susceptíveis a invasão

pelo fungo, pois com o aumento de pH, a casca se torna levemente macia, enfraquecendo sua

defesa e permitindo a instalação do fungo (PITT; HOCKING, 2009).

Vários fungos podem causar deterioração em frutas, mas os gêneros comumente

relacionados a esse processo são pertencentes aos grupos “Aspergillus e seus teleomorfos”,

como o gênero Aspergillus, e “Penicillium e gêneros relacionados”, como o gênero Penicillium,

segundo Pitt & Hocking (2009), com destaque em uvas e frutas cítricas, como a laranja.

Nas bebidas à base de frutas, que são produtos submetidos a processos como

pasteurização e redução de pH, por exemplo, são considerados, como regra, estáveis

microbiologicamente. Porém, alguns fungos produzem esporos termorresistentes que

resistem ao processo de pasteurização e chegam ao produto final, como, por exemplo, fungos

dos gêneros Byssochlamys e Neosartorya (PITT; HOCKING, 2009).

31

3.4 FUNGOS

3.4.1 Características gerais

Os fungos são organismos constituídos de células eucarióticas com parede celular,

podem ser unicelulares, como as leveduras, ou multicelulares, como os fungos filamentosos e

os cogumelos, são quimio-heterótrofos e absorvem o alimento do ambiente, e podem se

reproduzir de forma sexuada, por meio de esporos, ou assexuada, por meio de conídios

(Figura 1). São amplamente distribuídos na natureza, podendo ser encontrados nos mais

diversos ambientes, como em geleiras ou nas raízes de plantas (TORTORA; FUNKE; CASE,

2010).

Figura 1. Esquema do ciclo de vida geral do fungo. Fonte: MORAES; PAES; HOLANDA, 2010, p. 402.

As leveduras são as formas não filamentosas e unicelulares dos fungos, são ovais ou

esféricas e maiores que as bactérias. Possui reprodução, normalmente por brotamento, em

que a célula forma uma protuberância na sua superfície que se alonga, a célula parental sofre

divisão nuclear e um núcleo migra para o broto. O material da parede celular fecha a

comunicação entre a célula parental e o broto, que se destaca dando origem a uma nova célula

(Figura 2) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2010).

32

Figura 2. Levedura em brotamento. Micrografia de Saccharomyces cerevisae

em diferentes fases do brotamento. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2010, p. 332.

Os fungos filamentosos têm seu crescimento a partir de esporos ou conídios com a

formação de finos filamentos, as hifas, resultando em uma massa filamentosa, denominada

micélio, que constitui a estrutura vegetativa, responsável pelo desenvolvimento do fungo e

pela absorção de nutrientes. As hifas vegetativas, por sua vez, se diferenciam para dar origem

a estruturas reprodutivas que formarão novos esporos ou conídios, garantindo a

disseminação e perpetuação do organismo. Essas hifas podem ser apocíticas ou septadas,

quando possui uma parede ou um septo dividindo a hifa em duas unidades de célula, ou

cenocíticas, sem septo (Figura 3) (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).

Figura 3. Características da hifa fúngica. (a) Hifa septada, com septo. (b) Hifa cenocítica, sem septo. (c) Hifa crescendo a partir do esporo.

Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2010, p. 331.

33

Conforme o tipo de reprodução que o fungo filamentoso realiza, este pode ser

classificado dentro de três grupos: 1. anamorfo, quando realiza apenas a reprodução

assexuada em seu ciclo de vida; 2. teleomorfo, quando realiza apenas a reprodução sexuada

em seu ciclo de vida; 3. holomorfo, quando realiza tanto a reprodução sexuada quanto a

assexuada em seu ciclo de vida (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).

3.4.2 Classificação taxonômica

O Reino Fungi, que pertence no Domínio Eukaria, é constituído pelos fungos, e está

dividido em sete filos Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota, Chytridiomycota,

Glomeromycota, Microsporidia, e Neocallimastigomycota, e um grupo que reúne os fungos

anamórficos, porém este grupo não tem valor taxonômico, sendo seus representantes

relacionados aos filos Ascomycota ou Basidiomycota (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).

O grupo constituído pelos fungos anamórficos possuem, predominantemente, a

reprodução assexuada, com estrutura de propagação na forma de conídios, pois acredita-se

que a reprodução sexuada seja ausente, desconhecida ou essa capacidade tenha sido perdida.

A relação desse grupo com fungos pertencentes aos filos Ascomycota ou Basidiomycota está

na comparação de sequências gênicas (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).

Os fungos que possuem maior interesse em estudos de micro-organismos

deteriorantes de alimentos são aqueles pertencentes aos filos Ascomycota e Glomeromycota

(que inclui os representantes do antigo filo Zygomycota), e poucos do filo Basidiomycota (PITT;

HOCKING, 2009).

3.4.2.1 grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”

O grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”, segundo Pitt & Hocking (2009), é

caracterizado como, pelo menos, tolerantes a elevadas temperaturas, e espécies de

Aspergillus, e seu teleomorfo Eurotium, são os mais encontrados em deterioração de

alimentos por fungos. As três espécies teloeomorfas de Aspergillus mais significativas em

alimentos são: Eurotium, Neosartorya e Emericella.

Ainda segundo Pitt & Hocking (2009), Aspergillus é um gênero de Hyphomycetes

caracterizados, em termos gerais, pela formação de conidióforos com estipes largas e de

34

paredes grossas com uma vesícula, normalmente esférica, no ápice, por onde surgem fiálides,

ou métulas e fiálides, sendo a fiálide a célula conidiogênica. Além disso, o gênero Aspergillus

é caracterizado especificamente pela presença de célula podal com estipes, que,

normalmente, não são septadas (Figura 4).

Figura 4. Ilustração das estruturas do gênero Aspergillus. Fonte: PITT; HOCKING, 2009 – com modifica-ções.

3.4.2.2 grupo “Penicillium e gêneros relacionados”

De acordo com Pitt & Hocking (2009), o grupo “Penicillium e gêneros relacionados” são

gêneros que produzem conídios em uma estrutura chamada penicillus, que em Latim significa

pequena escova. O grupo consiste essencialmente de um grupo bem definido de fiálides ou

células similares, unicelulares, com conídios em cadeia. As fiálides podem estar tanto presas

diretamente a estipe quanto através de um ou mais estágios de ramificação (Figura 5). São

quatro os principais gêneros com essas características: Penicillium, Geosmithia, Paecilomyces

e Scopulariopsis.

35

Figura 5. Ilustração das estruturas do gênero

Penicillium. Fonte: PITT; HOCKING, 2009 – com modifica-ções.

Pitt & Hocking (2009) também relacionam os gêneros teleomorfos associados aos

gêneros anamórficos descritos. O gênero Byssoclamys é o teleomorfo de certas espécies de

Paecilomyces, enquanto que o gênero Eupenicillium está associado a espécies de Penicillium,

e o gênero Talaromyces está associado a espécies de Geosmithia, Paecilomyces e Penicillium,

mas de Paecilomyces não são encontrados em alimentos, assim como o teleomorfo do gênero

Scopulariopsis. Os autores enfatizam que a produção dos teleomorfos por quaisquer gêneros

anamórficos é mais exceção do que regra.

3.4.3 Fungos termorresistentes

A influência da temperatura tanto na preservação quanto na deterioração dos

alimentos está dividida entre as temperaturas durante o processo e aquelas durante a

estocagem. Os esporos de fungos termorresistentes podem persistir após o processo de

pasteurização aplicado aos alimentos ácidos. Os ascósporos de fungos filamentosos e de

leveduras, assim como células vegetativas, também são considerados es truturas

termorresistentes (PITT; HOCKING, 2009).

36

De acordo com Houbraken e Samson (2006) os fungos termorresistentes podem ser

definidos como aqueles capazes de sobreviver a temperatura igual ou superior a 75 °C por 30

minutos ou mais.

Em uma pesquisa realizada por Slongo e Aragão (2006), foram analisados fatores que

influenciam na ativação de ascósporos de Neosartoria fischeri em néctares aquecidos de

abacaxi e mamão, como meio de aquecimento, temperatura de produção e idade dos

ascósporos. A análise mostrou que a temperatura de produção é um fator que influencia na

ativação desses ascósporos, e consequentemente o desenvolvimento do fungo.

No ano seguinte, Slongo e Aragão (2007) publicaram um trabalho usando suco de

abacaxi para estudar a capacidade de resistência térmica de ascósporos de Byssochlamys

nivea e Neosartorya fischeri em três diferentes temperaturas (85, 90 e 92 °C). Seus resultados

mostraram que a resistência térmica de B. nivea em sucos de abacaxi é superior à de N.

fischeri, embora as duas espécies tenham se mostrado termorresistentes.

Outro estudo realizado para analisar a sobrevivência de ascósporos de Neosartorya

fischeri isolados de néctar de maçã, usando diferentes meios e diferentes temperaturas (80,

85 e 90 °C), mostrou que altas temperaturas são essenciais para eliminar os ascósporos de

sucos de fruta. Porém, essa prática pode causar alterações nas propriedades comerciais

desejadas para o produto (SALOMÃO; SLONGO; ARAGÃO, 2007).

Dentre os fungos pertencentes ao filo Ascomycota, o gênero Byssochlamys é notório

na deterioração de produtos derivados de frutas no tratamento com calor, destacando os

ascósporos das espécies B. fulva e B. nivea. Os ascósporos da espécie Neosartorya fischeri

possuem termorresistência semelhante aos da espécie B. fulva. Outras espécies de fungos

como Talaromyces e Eupenicillium também apresentam termorresistência e podem ser

isoladas de suco de frutas, polpas e concentrados (PITT; HOCKING, 2009).

O tratamento térmico ao qual os produtos derivados de frutas são submetidos pode

ativar as estruturas termorresistentes, desencadeando o desenvolvimento fúngico, e,

consequentemente, possíveis deterioração e produção de micotoxinas.

3.4.4 Micotoxinas e Fungos Termorresistentes

As micotoxinas podem ser definidas como produtos naturais de baixo peso molecular

produzidos como metabólitos secundários por fungos filamentosos. Esses metabólitos

37

constituem uma coleção química e toxigenicamente heterogênea que são agrupados somente

pelo fato de que seus membros são causadores de doenças e/ou morte em humanos e outros

vertebrados. Enquanto que todas as micotoxinas são de origem fúngicas, nem todos os

compostos tóxicos produzidos por fungos são chamados de micotoxinas (BENNETT; KLICH,

2003).

Espécies de fungos produtoras de micotoxinas são muito comuns e podem crescer em

uma ampla variedade de substratos e condições ambientais, e a micotoxina ocorre, com

determinada variação de severidade, em produtos agrícolas por todo o mundo. As

micotoxinas podem entrar no alimento quando o mesmo está no campo, ou durante a

estocagem, ou até ao longo de seu processamento (BENNETT; KLICH, 2003).

Várias pesquisas têm apontado para o fato de que a presença de fungos em bebidas à

base de frutas pode levar a ocorrência de micotoxinas nas mesmas , considerando que os

fungos, frequentemente encontrados, são potenciais produtores de determinadas

micotoxinas.

Segundo Tournas (1994), as espécies fúngicas mais comuns que levam a deterioração

de frutas e seus derivados são Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Neosartorya fischeri,

Talaromyces flavus, e Eupenicillium brefeldianum. Mas além da deterioração, esses fungos

termorresistentes são capazes de produzirem vários metabólitos secundário tóxicos.

Dentre as espécies do gênero Byssochlamys podem ser destacadas B. fulva e B. nivea

por serem citadas por vários autores como deteriorantes e produtoras de micotoxinas em

produtos pasteurizados, sendo as principais micotoxinas produzidas patulina, byssotoxina A e

ácido bissoclâmico (HOUBRAKEN; SAMSON, 2006; NUNES et al., 2012).

A espécie de Neosartorya fischeri, que tem como anamorfo Aspergillus fischerianus,

possui algumas cepas capazes de produzir fumitremorginas A e C e verruculogena (NIELSEN;

BEUCHAT; FRISVAD, 1988). As espécies Talaromyces flavus e Eupenicillium brefeldianum não

têm sido relatadas como produtoras de micotoxinas.

38

4 METODOLOGIA

4.1 AMOSTRAS DE NÉCTARES

As amostras de néctares de laranja e uva analisadas foram adquiridas em diferentes

supermercados localizados na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro, no período

de janeiro de 2014 a abril de 2014, estando todas com seus envases em bom estado e dentro

do prazo de validade.

Foram analisadas três marcas diferentes de néctar de laranja, três de néctar de uva, e

uma de néctar misto de uva e maçã destinada ao público infantil. Essas análises foram feitas

de três lotes em triplicata, totalizando 63 unidades amostrais, que foram armazenadas em

temperatura ambiente, como nos supermercados, no Laboratório de Microbiologia de

Alimentos (MircAlim) da Escola de Química/UFRJ, até que fossem realizados os experimentos.

Para preservar a identidade das marcas dos néctares analisados, cada marca diferente

de néctar foi identificada por uma letra, sendo o sabor identificado com sua letra inicial, e os

lotes e a replicata identificados por algarismos arábicos (Apêndices A, B e C).

Todas as demais etapas dos processos experimentais foram realizadas no Laboratório

de Microbiologia de Alimentos (MircAlim) da Escola de Química/UFRJ, utilizando os aparelhos

do próprio laboratório.

4.2 ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES

O isolamento de fungos termorresistentes a partir de néctares de laranja, uva e misto

de uva e maçã foi feito seguindo a metodologia de Houbraken e Samson (2006), com algumas

modificações.

O método proposto por Houbraken e Samson (2006), sugere banho-maria em

temperatura de 75 °C e uso de meio de cultura a base de extrato de malte com adição de

antibiótico (cloranfenicol). No trabalho realizado, essas condições foram modifi cadas,

utilizando temperatura de 80 °C para o banho-maria, como proposto por Pitt e Hocking (2009),

e meio de cultura a base de batata, por ser um meio de cultura mais rico em nutrientes quando

comparado ao meio a base de extrato de malte, oferecendo condições melhores para o

39

possível crescimento fúngico, e sem a adição de qualquer antibiótico, o que poderia permitir

o crescimento de outros micro-organismos.

As amostras dos néctares se encontravam em embalagens do tipo cartonada, com

volume total de 200 mL. Em uma capela de fluxo laminar (VECO®, BIO SEG 09), 150 mL do

néctar foram vertidos em frascos do tipo Erlenmeyer com tampa de rosca de 500 mL

esterilizados para realizar o tratamento térmico, no qual esses frascos foram colocados em

banho-maria (QUIMIS®) à 80 °C por 30 min, depois deste tempo, foram colocados em banho

frio (0 °C), para um rápido resfriamento das amostras. Os outros 50 mL de néctar não tratado

termicamente foram utilizados para a medição do pH, e depois descartados adequadamente.

Após o tratamento térmico, foram retirados 50 mL da amostra de néctar e misturados

em outro frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura à base de batata

(Batata Dextrose Agar – BDA) em dupla concentração (Anexo A), também esterilizados,

totalizando 100 mL no volume final, que foram vertidos em cinco placas de Petri esterilizadas.

Tanto as placas de Petri, com a solução de meio de cultura e néctar, quanto os outros 100 mL

de néctar tratado termicamente foram incubados em estufa (QUIMIS®) à 30 °C por 30 dias,

com observações semanais para verificação de possível crescimento.

Dessa forma, as amostras foram analisadas por dois métodos, segundo Houbraken e

Samson (2006): método da placa de Petri ou plaqueamento, e método de incubação direta

(Figura 6).

40

Figura 6. Diagrama da metodologia.

Fonte: HOUBRAKEN; SAMSON, 2006, com modificações.

Os fungos isolados dos néctares foram repicados para tubos de ensaio com meio de

cultura BDA (Anexo A) e, após crescimento em estufa à 25 °C por sete dias, os mesmos foram

armazenados em geladeira (CONSUL®, BIPLEX, CRD36), à 5°C, para posterior identificação.

4.3 MEDIÇÃO DO pH

A medição do pH das amostras foi obtida por meio de um medidor de pH (TECNOPON®,

PA210), realizada de acordo com as etapas da Figura 6, sem a submissão do néctar ao choque

térmico.

4.4 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS TERMORRESISTENTES ISOLADOS

Os fungos termorressitentes encontrados foram isolados por meio da técnica de

repique para um tubo de ensaio, e identificados através da observação e descrição de suas

características macro e microscópicas, segundo a técnica de Pitt e Hocking (2009).

41

Após o isolamento das culturas, estas foram analisadas macroscopicamente por meio

da técnica de ponto de inóculo, em que o isolado foi inoculado no centro das placas de Petri

com meios de cultura específicos para identificação. Foram feitas cinco placas de cada isolado,

em câmara de fluxo laminar, em três temperaturas diferentes, mas todas com o mesmo tempo

de incubação, e com placa invertida (Quadro 1). Os meios de cultura utilizados foram: Czapeck

Yeast Extract Agar (CYA), 25% Glycerol Nitrate Agar (G25N), e Malt Extract Agar (MEA) (Anexo

B).

Meio de Cultura Temperatura de Incubação Tempo de Incubação

CYA

5°C 7 dias

25°C 7 dias

37°C 7 dias

G25N 25°C 7 dias

MEA 25°C 7 dias

Quadro 1. Condições para identificação macro e microscópica.

Fonte: PITT; HOCKING, 2009.

Para a incubação em temperaturas diferentes foram utilizadas estufas climatizadas

para as temperaturas de 25°C e 30°C, e geladeira para a temperatura de 5°C.

A análise microscópica foi feita por meio da técnica de microcultivo em lâmina e

lamínula (Figura 7), em câmara de fluxo laminar, com as mesmas condições de meios de

cultura, temperaturas e tempo de incubação utilizadas para as características macroscópicas

(PITT; HOCKING, 2009).

Figura 7. Técnica de microcultivo em lâmina e lamínula. Fonte: PITT; HOCKING, 2009 – com modificações.

42

Após o tempo de incubação de sete dias nas temperaturas determinadas , as placas

foram então separadas para observação das características macroscópicas e microscópicas.

As características macroscópicas foram feitas com auxílio de uma lupa (PHOENIX

LUFERCO®, CP608). O tamanho da colônia foi medido através do diâmetro da colônia com

régua. As cores do anverso e do reverso da colônia também foram observadas, bem como

suas texturas, sendo a textura do anverso das colônias classificada como aveludada,

algodonosa ou flocosa, e a do reverso, em lisa ou sulcada. Também foi verificada a presença

ou a ausência de exsudatos.

As características microscópicas foram feitas com auxílio de um microscópio óptico

comum (NIKON, ECLIPSE, E200). Foram observadas características como septação da hifa;

tamanho, forma e cor dos esporos maduros; e presença ou ausência de fiálides, métulas e

vesículas. Para a observação das lâminas ao microscópio as mesmas foram coradas com

corante lactofucsina (Anexo C), segundo metodologia de Pitt e Hocking (2009).

As características observadas foram anotadas em uma ficha de identif icação

organizada de acordo com a chave geral para identificação de fungos (Anexo D). A partir da

reunião de todas essas características, estas foram comparadas em uma chave dicotômica

para a identificação do gênero (PITT & HOCKING, 2009, p.55).

4.5 COMPARAÇÃO DOS FUNGOS ENCONTRADOS COM OS DESCRITOS NA LITERATURA

Após a identificação dos fungos termorressistentes isolados das amostras de néctares

de laranja, uva e misto de uva e maçã, estes foram comparados com dados obtidos através da

pesquisa em literatura específica.

43

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 MEDIÇÃO DO pH DOS NÉCTARES

Na medição do pH dos néctares foram observados valores de pH que variaram entre

2,9 e 3,57 no sabor laranja, entre 2,42 e 2,89 para o sabor uva, e entre 2,64 e 2,8 para o misto

de uva e maçã, considerando as três marcas analisadas (Tabela 1).

Tabela 1. Valores de pH das amostras de néctares, com média e desvio padrão para cada marca analisada.

SABOR LARANJA

MARCA CÓDIGO pH MARCA CÓDIGO pH MARCA CÓDIGO pH

X

XL 11 3,10

Y

YL 11 3,12

Z

ZL 11 3,56

XL 12 3,12 YL 12 3,12 ZL 12 3,57

XL 13 3,11 YL 13 3,12 ZL 13 3,56

XL 21 3,00 YL 21 2,9 ZL 21 3,5

XL 22 3,00 YL 22 2,9 ZL 22 3,5

XL 23 3,00 YL 23 2,9 ZL 23 3,5

XL 31 3,05 YL 31 2,98 ZL 31 3,37

XL 32 3,06 YL 32 2,98 ZL 32 3,37

XL 33 3,05 YL 33 2,98 ZL 33 3,37

Média pH ± Desvio padrão

3,05 ± 0,05


3,00 ± 0,09


3,48 ± 0,08

SABOR UVA

X

XU 11 2,54

Y

YU 11 2,57

Z

ZU 11 2,7 XU 12 2,55 YU 12 2,56 ZU 12 2,7

XU 13 2,55 YU 13 2,55 ZU 13 2,7

XU 21 2,73 YU 21 2,43 ZU 21 2,7 XU 22 2,73 YU 22 2,44 ZU 22 2,7

XU 23 2,72 YU 23 2,44 ZU 23 2,7

XU 31 2,72 YU 31 2,42 ZU 31 2,89 XU 32 2,72 YU 32 2,42 ZU 32 2,88

XU 33 2,72 YU 33 2,43 ZU 33 2,88


2,66 ± 0,08


2,47 ± 0,06


2,76 ± 0,09

SABOR MISTO DE UVA E MAÇÃ

X

XUm 11 2,8 X

XUm 21 2,69 X

XUm 31 2,65 XUm 12 2,8 XUm 22 2,64 XUm 32 2,66

XUm 13 2,8 XUm 23 2,66 XUm 33 2,65

Média pH ± Desvio padrão 2,71 ± 0,07

Os valores observados no presente estudo para o pH dos néctares sabor laranja estão

abaixo dos descritos na literatura, que relatam valores de pH 3,46 (SILVA et al., 2012) e até pH

44

4,5 (RAMIREZ; SILUPU; CRUZ, 2010) para os néctares desse sabor. O mesmo aconteceu com

os néctares de sabor uva, que também apresentaram valores abaixo dos descritos na

literatura, como pH 2,92 (RIZZON; MIELE, 2012) e pH 2,9 (SILVA et al., 2012), e ainda mais

distantes do valor obtido por Santana et al. (2012), que relatam valores de pH 3,28, porém

ficando próximo dos resultados mostrados por Gurak et al. (2008), que obtiveram valores de

pH que variaram de 2,6 a 3,49.

Na análise para o sabor misto de uva e maçã, os valores obtidos estão abaixo do que

se tem descrito na literatura, como mostrado no trabalho de Silva et al. (2012), em que foram

analisadas amostras de néctares também destinadas ao público infantil, que obtiveram um

valor de pH 3,59 para o sabor uva, e ainda destacam que duas marcas de néctar de uva

apresentaram acidez mais elevada que os demais sabores analisados, fato esse demonstrado

tanto pelo baixo pH quanto pela elevada capacidade tampão intrínseca. Para esses autores,

as bebidas caracterizadas como ácidas são potenciais causadoras da erosão dental pela

dissolução do esmalte.

De acordo com os valores de pH encontrados nos néctares, que variaram de 2,42 a

3,57, poderia haver crescimento fúngico em qualquer uma das amostras analisadas,

considerando que os fungos podem crescer em meios com pH que varia de 2 a 11 (TOURNAS,

1994). Já que os micro-organismos deteriorantes em sucos de frutas conseguem se reproduzir

mesmo em pH considerado baixo, igual ou inferior a 3, como os encontrados nestes sucos

(MARCOLINO, 2003).

Mesmo assim, não houve crescimento de fungos nas marcas analisadas, possivelmente

por não apresentarem formas fúngicas termorresistentes, como ascósporos, em seus

néctares, correspondendo a boa prática de fabricação do produto, como ocorrido com a

marca Y, que apresentou os menores valores de pH dentre as marcas analisadas.

Uma análise da medição do pH do néctar tratado termicamente e adicionado ao meio

de cultura em dupla concentração, na proporção de 1:1, feita com fita medidora de pH,

mostrou valores de pH acima daqueles obtidos do néctar sem o tratamento térmico e sem a

adição do meio de cultura, sendo os valores de pH 3 para o sabor uva e pH 4 para o sabor

misto de uva e maçã. Não houve análise para o sabor laranja. Mostrando que a diluição do

néctar em meio de cultura pode elevar o valor do pH, fato que favoreceria o crescimento de

fungos filamentosos.

45

5.2 CRESCIMENTO E ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES

A técnica utilizada para o isolamento dos fungos termorresistentes nos néctares

envolveu dois processos de incubação após o choque térmico: néctar direto em Erlenmeyer e

plaqueamento do néctar diluído em meio de cultura de dupla concentração na proporção de

1:1.

Após o período de 30 dias não foi observado crescimento fúngico, ou de qualquer

outro micro-organismo, em nenhuma das marcas nem dos sabores dos néctares que foram

incubados nos frascos de Erlenmeyer (Figura 8).

Figura 8. Análise do crescimento fúngico em Erlenmeyer.

O possível não crescimento de fungos termorresistentes nos Erlenmeyers pode ser

devido ao baixo pH das amostras, ou estresse celular, ou injúria causados pela exposição a

alta temperatura, pois, dentre os fungos considerados deterioradores, sendo os mais

frequentes Neosartoria fischeri e Byssochlamys spp., crescem melhor em pH superiores a 3,0

(SOUZA; PEÑA; FIOROTTI, 2011; NUNES et al., 2012).

Porém foi observado crescimento fúngico em 10 placas, nas quais o néctar foi incubado

diluído em meio de cultura de dupla concentração, sendo sete placas de néctar sabor laranja,

de duas marcas X e Z, duas de sabor misto de uva e maçã, da marca X, e uma de uva, da marca

Z, com um total de 15 isolados fúngicos (Figura 9). Dentre as três marcas analisadas, nenhum

fungo cresceu na marca Y.

46

Sabor Laranja

Marca X XL 31 Placa I

XL 33 Placa I

XL 33 Placa II

XL 33 Placa III

XL 33 Placa IV

Marca Z

ZL 31 Placa I

ZL 32 Placa I

Sabor Uva – Marca Z ZU 13 Placa I

Figura 9. Crescimento fúngico do néctar plaqueado com meio de cultura BDA.

47

Sabor Misto de Uva e Maçã – Marca X XUm 11 Placa I

XUm 11 Placa II

Figura 9. Crescimento fúngico do néctar plaqueado com meio de cultura BDA (continuação).

O crescimento fúngico em algumas placas pode ser devido ao aumento do valor do pH,

pois o mesmo se torna levemente elevado com a adição do meio de cultura. Esse crescimento

foi lento, em relação ao tempo médio de crescimento em condições normais para fungos

filamentosos, em torno de sete dias em temperatura ambiente, e se deu próximo às bordas

das placas, sugerindo certa demanda de oxigênio para que esses fungos pudessem crescer

naquele ambiente.

Os resultados obtidos corroboram com a ideia de que os baixos valores de pH não

caracterizaram um fator limitante para o crescimento fúngico, desde que se tivesse a presença

de formas de resistência, como esporos ou ascosporos, do mesmo nos néctares analisados,

como ocorreu nas marcas X e Z.

Os fungos que cresceram nas placas foram isolados em tubos de ensaio com meio de

cultura BDA, e após setes dias foram armazenados em geladeira a temperatura de 5 °C para

posteriormente serem identificados.

5.3 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS ISOLADOS DOS NÉCTARES

Dentre os fungos isolados, foram identificados sete pertencentes ao grupo dos

“Aspergillus e seus teleomorfos”, e oito ao grupo dos “Penicillium e gêneros relacionados”, de

acordo com a chave geral para fungos deteriorantes proposta por Pitt e Hocking (2009)

(Apêndice D).

Todos os sete fungos do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” foram isolados de

néctar sabor laranja, tanto da marca X quanto da marca Z. As características macroscopia e a

48

microscopia dos isolados foram observadas e analisadas de acordo com as descrições de Pitt

e Hocking (2009) (Figura 10).

XL 31 IA MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XL 31 IB MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XL 31 IC MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”.

49

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XL 31 ID MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XL 33 IIA MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

ZL 32 IA MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” (continuação).

50

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

ZL 32 IC MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” (continuação).

Os fungos do grupo “Penicillium e gêneros relacionados”, foram isolados dos três

sabores, sendo cinco do sabor laranja (marcas X e Z), um de uva (marca Z) e dois do misto de

uva e maçã (marca X). E suas características macroscopia e a microscopia também foram

observadas e analisadas de acordo com as descrições de Pitt e Hocking (2009) (Figura 11).

XL 33 IA MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados”.

51

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XL 33 IIIA MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XL 33 IV MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XUm 11 A MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados”

(continuação).

52

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

XUm 11 B MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

ZL 31 IA MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados” (continuação).

53

ZL 32 IE MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

ZU 13 I MACROSCOPIA

CYA 5°C

CYA 25°C

CYA 37°C

G25N 25°C

MEA 25°C

MICROSCOPIA

CYA 25°C

CYA 37°C

MEA 25°C

Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados” (continuação).

Para Pitt e Hocking (2009), espécies de Aspergillus competem com espécies de

Penicillium e Fusarium pela dominância no mundo da flora fúngicas. Aspergilli normalmente

crescem mais rápido que Penicillia, embora eles levem mais tempo para esporular, e

geralmente produzem esporos que são mais resistentes a luz e substâncias químicas. Dessa

forma pode-se dizer que espécies de Aspergillus dominam a deterioração nos trópicos

enquanto que as espécies de Penicillium dominam nas regiões temperadas.

Os estudos realizados por King, Michener e Ito (1969), Hoffmann et al. (1998), Sousa

et al. (2001), Marcolino (2003), Tournas, Heeres e Burgess (2006), Fukumoto (2012), e Silva

54

(2013), relatam a presença de fungos em bebidas à base de frutas, como laranja e uva, como

pode ser observado no Quadro 2.

Fungo Isolado Produto Referência

Aspergillus sp.

Penicillium sp.

Uva e suco de uva King, Michener e Ito (1969).

Fungos filamentosos

(sem identificação)

Suco de laranja integral Hoffmann et al. (1998);

Sousa et al. (2001).

Neosartorya fischeri Bebida de uva pasteurizada Marcolino (2003).

Penicillium spp. Suco de uva Tournas, Heeres e Burgess (2006).

Aspergillus sp.

Penicillium sp.

Néctar de uva Fukumoto (2012).

Fungos filamentosos

(sem identificação)

Suco de laranja Silva (2013).

Quadro 2. Dados da literatura referente aos fungos termorressistentes isolados de bebidas à base de frutas .

Os resultados relativos à identificação dos fungos isolados corroboram os resultados

descritos na literatura, pois os fungos isolados e identificados como pertencentes aos grupos

“Aspergillus e seus teleomorfos” e “Penicillium e gêneros relacionados”, no presente trabalho,

são os mesmos grupos já descritos na literatura específica.

55

6 CONCLUSÕES

A avaliação para a presença de fungos termorresistentes em néctares industrializados

nos sabores laranja e uva comercializados na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro

identificou fungos pertencentes aos grupos “Aspergillus e seus teleomorfos” e “Penicillium e

gêneros relacionados” em seis amostras das 63 analisadas, equivalendo a 9,5% do total de

amostras do estudo.

Dentre os quinze fungos termorresistentes isolados, 46,7% (sete isolados) pertencem

ao grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”, e 53,3% (oito isolados) pertencem ao grupo

“Penicillium e gêneros relacionados”.

56

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os baixos valores de pH nas amostras, não seriam um fator limitante, pois fungos

deteriorantes em bebidas conseguem se reproduzir nessas condições . Porém, não houve

crescimento em todas as marcas analisadas, possivelmente por não apresentarem formas

termorresistente, como esporos e ascosporos, indicando boa prática de fabricação do produto

e boa manipulação na análise. Sendo a marca Y, a única que não teve crescimento em

qualquer de suas amostras, mas também foi a que apresentou os menores valos de pH.

Uma análise da medição do pH do néctar tratado termicamente e adicionado do meio

de cultura, feita com fita de pH, mostrou valores de pH acima daqueles obtidos do néctar sem

tratamento térmico e sem adição do meio de cultura, no sabor misto de uva e maçã.

Isso poderia justificar o crescimento fúngico em placas com o néctar diluído em meio

de cultura, que poderia ser devido ao pH ter sido levemente elevado, sendo esse crescimento

lento e próximo às bordas da placa. Já o não crescimento fúngico em frascos de Erlenmeyers,

poderia ser atribuído ao baixo pH, ou estresse celular, ou injúria causados pela exposição a

alta temperatura, desfavorecendo o desenvolvimento do fungo.

57

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64

APÊNDICE A

Códigos para as marcas de sabor laranja.

MARCA SABOR LOTE REPLICATA CÓDIGO

X

Laranja (L)

1

1 XL 11

2 XL 12 3 XL 13

2

1 XL 21 2 XL 22

3 XL 23

3

1 XL 31 2 XL 32

3 XL 33

Y

Laranja (L)

1

1 YL 11

2 YL 12 3 YL 13

2

1 YL 21

2 YL 22 3 YL 23

3

1 YL 31 2 YL 32

3 YL 33

Z

Laranja (L)

1

1 ZL 11

2 ZL 12

3 ZL 13

2

1 ZL 21

2 ZL 22

3 ZL 23

3

1 ZL 31

2 ZL 32

3 ZL 33

65

APÊNDICE B

Códigos para as marcas de sabor uva.


X

Uva (U)

1

1 XU 11

2 XU 12 3 XU 13

2

1 XU 21 2 XU 22

3 XU 23

3

1 XU 31 2 XU 32

3 XU 33

Y

Uva (U)

1

1 YU 11

2 YU 12 3 YU 13

2

1 YU 21

2 YU 22 3 YU 23

3

1 YU 31 2 YU 32

3 YU 33

Z

Uva (U)

1

1 ZU 11

2 ZU 12

3 ZU 13

2

1 ZU 21

2 ZU 22

3 ZU 23

3

1 ZU 31

2 ZU 32

3 ZU 33

66

APÊNDICE C

Códigos para as marcas de sabor misto de uva e maçã.


X

Uva + Maçã (Um)

1

1 XUm 11

2 XUm 12

3 XUm 13

2

1 XUm 21

2 XUm 22

3 XUm 23

3

1 XUm 31

2 XUm 32

3 XUm 33

67

APÊNDICE D

Identificação e origem dos isolados.

Grupo de Identificação Isolados Origem

“Aspergillus e seus teleomorfos”

XL 31 IA XL 31 IB

XL 31 IC XL 31 ID

Marca X; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 1

XL 33 IIA Marca X; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 3

ZL 32 IA ZL 32 IC

Marca Z; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 2

“Penicillium e gêneros relacionados”

XL 33 IA

XL 33 IIIA XL 33 IV

Marca X; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 3

XUm 11 I XUm 11 II

Marca X; Sabor Misto Uva e Maçã; Lote 1; Replicata 1

ZL 31 IA Marca Z; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 1

ZL 32 IE Marca Z; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 2

ZU 13 I Marca Z; Sabor Uva; Lote 1; Replicata 3

68

ANEXO A

Fórmula do meio de cultura Batata Dextrose Ágar (BDA):

Batata Dextrose Ágar (BDA): Meio BDA em pó (Merck) 39g Água destilada 1000mL

Batata Dextrose Ágar (BDA) em dupla concentração:

Meio BDA em pó (Merck) 78g Água destilada 1000mL

69

ANEXO B

Meios de cultura para identificação (PITT & HOCKING, 2009):

Czapek Yeast Extrac Agar (CYA) K2HPO4 1g Concentrado Czapek*1 10mL Solução de metal traço*2 1mL

Extrato de levedura 5g Sacarose 30g

Ágar 15g Água destilada 1000mL

Ágar Glicerol Nitrato 25% (G25N):

K2HPO4 0,75g Concentrado Czapek*1 7,5mL

Extrato de levedura 3,7g Glicerol, grau analítico 250mL

Ágar 12g Água destilada 750mL

Ágar Extrato de Malte (MEA): Extrato de Malte 20g Peptona 1g Glicose 20g Ágar 20g Água destilada 1000mL

*1 Concentrado Czapek:

NaNO3 30g KCl 5g MgSO4 . 7H2O 5g FeSO4 . 7H2O 0,1g Água destilada 100mL

*2 Solução de metal traço:

CuSO4 . 5H2O 0,5g ZnSO4 . 7H2O 1g Água destilada 100mL

70

ANEXO C

Corante para identificação (PITT & HOCKING, 2009):

Lactofucsina: Fucsina ácida (1%) 0,1g

Ácido lático 85% 100mL

71

ANEXO D

Ficha de Identificação – Chave Geral para Fungos em Alimentos

(Pitt & Hocking, 2009 – p.55)

Nome da Cepa: ___________________________________

Origem: ________________________________________________________________________________ _ __ _

Data de Isolamento: __________________ Data de Identificação: ___________________

Característica CYA 5°C CYA 25°C CYA 37°C G25N 25°C MEA 25°C

Tamanho da

colônia (7 dias)

Cor da colônia

Hifa sepatada

ou asseptada

Esporos madu-

ros (7 dias)

Cor dos

esporos

Tamanho e for-

ma do esporo

(conídio)

Presença de

fiálides

Presença de

métulas

Presença de

vesícula

Observações:

___________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________________

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