UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · Às professoras da banca de qualificação:...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

TICIANA MARIA LÚCIO DE AMORIM

CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE QUE CODIFICA O

INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE Erythrina velutina WILLD. -

CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL

FARMACOLÓGICO

NATAL

2014





FARMACOLÓGICO

Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Orientador: Elizeu Antunes dos Santos. Co-orientadora: Adriana Ferreira Uchôa

NATAL 2014

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de

Biociências

Amorim, Ticiana Maria Lúcio de.

Clonagem e expressão do gene que codifica o inibidor de quimotripsina de

erythrina velutina WILLD.: caracterização e avaliação de seu potencial

farmacológico / Ticiana Maria Lúcio de Amorim. – Natal, RN, 2014.

92 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos.

Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.

1. Mulungu. – Tese. 2. Inibidor recombinante. - Tese. 3. Atividade pró-

inflamatória. – Tese. I. Santos, Elizeu Antunes dos. II. Uchôa, Adriana

Ferreira. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 577.1





FARMACOLÓGICO

Aprovada em : ___/___/___ Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica.

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________ Orientador: Prof . Dr. Elizeu Antunes dos Santos

Departamento de Bioquímica – UFRN

_________________________________________ Coorientadora: Profª Drª Adriana Ferreira Uchôa

Departamento de Biologia Celular e Genética - UFRN

________________________________________ Drª Maria Fátima Grossi de Sá

Pesquisadora Embrapa – CENARGEN

________________________________________ Profª Drª Celina Maria Pinto Guerra Dore

Centro Universitário Maurício de Nassau - UNINASSAU

_______________________________________ Prof. Dr. Eduardo Henrique Cunha de Farias

Centro Universitário do Rio Grande do Norte – UNI-RN

_______________________________________ Profª Drª Janeusa Trindade de Souto

Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN

_______________________________________ Prof. Dr. João Paulo Matos

Departamento de Bioquímica - UFRN

“In this great future, you can’t forget your past”

Bob Marley

Dedico este trabalho aqueles que me apoiaram, me ergueram e torceram pelo meu

sucesso neste percurso, em especial ao professor Maurício Pereira de Sales (in

memoriam) que desde o início me ensinou, à sua maneira, muito além da pesquisa.

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, Gisélia; e às minhas irmãs pelo apoio incondicional, pela

compreensão nas ausências e por sempre se orgulharem de mim. Se tivesse a

oportunidade de escolher uma família, vocês fariam parte da minha vida do mesmo

jeito e eu teria a mesma sorte de ter vocês em minha vida.

Ao meu companheiro, melhor amigo, namorado, Leonardo Henrique, por todo o

apoio, compreensão e paciência inesgotáveis sempre. Tenho a sorte de ter

encontrado em você o que muitos procuram. Pra sempre.

À Professora Adriana Ferreira Uchôa, por todo o apoio e atenção durante a minha

formação na pós graduação, especialmente na orientação desta tese de doutorado.

Apesar dos obstáculos que encontramos, com sua determinação, os deixamos para

trás.

Ao Professor Elizeu Antunes dos Santos que assumiu minha orientação e,

juntamente com a Professora Adriana, me apoiou em todo o processo, aumentando

minha admiração pelo professor e profissional.

À Professora Maria Fátima Grossi de Sá, por ter me recebido em seu laboratório e

ter me feito sentir como um de seus alunos, além de gentilmente participar da banca

de defesa desta tese. Não teria como agradecê-la de forma suficiente.

Ao Professor Paulo Marinho que abriu as portas do seu laboratório para a realização

dos experimentos de expressão.

Às professoras da banca de qualificação: Professora Katia Castanho Scortecci,

Professora Daniella Regina Arantes Martins Salha e Professora Janeusa Trindade

de Souto pelas valiosas contribuições, não só na tese escrita, mas também, e

principalmente, no cotidiano.

Aos professores da banca de defesa: Professor Eduardo Henrique Cunha de Farias,

Professor João Paulo Matos e Professora Celina Dore, por aceitarem participar da

banca de defesa deste trabalho

À Professora Janeusa Trindade de Souto pelas orientações na realização dos

ensaios biológicos e por aceitar participar também da banca de defesa deste

trabalho.

Ao Professor Marcello Bemquerer pela realização do sequenciamento da proteína

em estudo.

Ao amigo Leonardo Lima Pepino de Macêdo por sempre me auxiliar e me orientar

quando mais preciso. Um obrigado é muito pouco para agradecê-lo por tudo que fez

por mim.

À Virgínia Penéllope e Roberta Farias por serem amigas e família em todos esses

anos. A generosidade, apoio, amizade de vocês são presentes que ganhei e que

nunca vou ter como retribuir. As melhores amigas, com quem aprendi tanto e

continuo aprendendo.

Á Gioconda Moura, Katya Anaya e Ariane Lacerda que mesmo à distância não

deixam de se fazerem presentes e não me deixam esquecer do carinho e amizade.

À Vanessa Lima e Anderson Felipe por serem as melhores companhias todo dia, o

dia todo. As risadas, as conversas sobre qualquer assunto inútil e até as discussões

profissionais tornaram os dias mais leves. Muito obrigada aos dois que tornaram o

LQFPB 2 o melhor lab de todos.

À Paula Ivani, Luciana, Jonalson, Raphael Serquiz, Samilly e, em especial, Iana, que

foram essenciais na realização dos experimentos além de fazerem os meus dias

mais felizes.

A todos os alunos do LQFPB que tornam este grupo forte, tranquilo, melhor. Tive a

honra de conhecê-los, os que saíram e os que estão, e compartilhar com vocês

momentos tão importantes da minha vida. Obrigada a todos.

Aos colegas do Departamento de Bioquímica pela ajuda sempre que necessária.

A todos os professores e funcionários do Departamento de Bioquímica pelo apoio

que sempre encontrei quando precisei.

À Capes pelo suporte financeiro durante a minha formação.

A todos que contribuíram de maneira direta ou indireta para a realização deste

trabalho e minha formação acadêmica.

Hoje desaprendo o que tinha aprendido até ontem e que

amanhã recomeçarei a aprender. Todos os dias desfaleço e

desfaço-me em cinza efêmera: todos os dias reconstruo

minhas edificações, em sonho eternas. Esta frágil escola que

somos, levanto-a com paciência dos alicerces às torres,

sabendo que é trabalho sem termo. E do alto avisto os que

folgam e assaltam, donos de riso e pedras. Cada um de nós

tem sua verdade, pela qual deve morrer. De um lugar que não

se alcança, e que é, no entanto, claro, minha verdade, sem

troca, sem equivalência nem desengano permanece

constante, obrigatória, livre: enquanto aprendo, desaprendo e

torno a reaprender.

Cecília Meireles (Hoje desaprendo o que tinha aprendido até ontem)

RESUMO

Proteinases são enzimas amplamente distribuídas em diferentes organismos e que desempenham as mais diversas funções, desde a manutenção da homeostase até o agravamento de algumas doenças como câncer, doenças autoimunes e infecções. As proteínas responsáveis pelo controle e atuação destas enzimas são os inibidores, que são classificados de acordo com suas proteases alvo e são encontrados desde organismos mais simples, como bactérias, aos mais complexos, como plantas de grande porte e mamíferos. Inibidores de proteinases de plantas agem reduzindo ou inativando a atividade de enzimas alvo, dessa forma, estas proteínas vêm sendo estudadas como possíveis ferramentas no tratamento de doenças relacionadas às atividades proteásicas. Neste contexto, um inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina, denominado EvCI, foi previamente purificado e foi observado que esta proteína desempenha atividades anticoagulante in vitro a anti-inflamatória em modelo in vivo. Buscando reduzir o impacto ecológico causado pela purificação de EvCI em grandes quantidades e facilitar o processo de obtenção desta proteína, o inibidor de quimotripsina recombinante de Erythrina velutina foi produzido após clonagem e expressão em células de Escherichia coli. As bactérias foram crescidas em meio LB e após indução da expressão este material foi submetido a procedimentos de lise celular e o produto foi aplicado em uma coluna de afinidade de Níquel. As proteínas ligadas à coluna foram digeridas por trombina, aplicadas em uma coluna de afinidade de Quimotripsina-Sepharose obtendo-se o inibidor purificado, denominado recEvCI. Após eletroforese, o inibidor recombinante apresentou uma massa molecular de, aproximadamente, 17 kDA e reduziu a atividade de quimotripsina e elastase in vitro. O inibidor recombinante foi sequenciado e foi detectada a presença de aminoácidos iguais a outros inibidores depositados em banco de dados, com algumas modificações. recEvCI demonstrou alta estabilidade quando submetido a variações de pH e sob condições redutoras, mantendo sua atividade inibitória em torno de 80%. Esta proteína aumentou o tempo de coagulação sanguínea in vitro por atuação sobre a via intrínseca e não demostrou citotoxicidade contra as linhagens de fibroblasto de camundongo 3T3 e de macrófagos RAW 264.7. recEvCI apresentou atividade microbicida relacionada à liberação de óxido nítrico e consequente ativação de macrófagos, além de possuir efeito pró-inflamatório avaliado pelo aumento da liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que recEvCI pode ser utilizado biotecnologicamente como uma nova ferramenta no controle de doenças relacionadas à coagulação assim como pode vir a ser um agente ativador do sistema imune em indivíduos imunossuprimidos. Palavras-chave: Mulungu. Inibidor recombinante. Anticoagulante. Atividade microbicida. Atividade pró-inflamatória

ABSTRACT

Proteinases are enzymes distributed widely founded in several organisms and perform many different functions, from maintaining homeostasis to the worsening of some diseases such as cancer, autoimmune diseases and infections. The proteins responsible of controlling the action of these enzymes are the inhibitors, that are classified based on their target proteases and are founded since simple organisms, such as bacteria, to higher organisms, such as larger plants and mammals. Plant proteinase inhibitors act by reducing or inactivating the activity of target proteases, thus, these proteins have been studied as potential tools in the treatment of diseases related to protease activities. In this context, an inhibitor of chymotrypsin from Erythrina velutina, called EvCI was previously purified and it was observed that this protein plays in vitro anticoagulant activity and anti-inflammatory activity in in vivo model. Aiming to reduce the environmental impact caused by the purification EvCI in high amounts and to facilitate the process of obtaining this protein, the recombinant chymotrypsin inhibitor from Eryhrina velutina was produced after cloning and expression in Escherichia coli. The bacteria were grown in LB medium and after induction of the expression this material was subjected to procedures for cell lysis and the product was applied on Nickel-affinity column. The proteins adsorbed were digested by thrombin and applied on Chymotrypsin-Sepharose affinity column, obtaining the purified inhibitor, named recEvCI. After electrophoresis, the recombinant inhibitor showed an approximately molecular mass of 17 kDa, and reduced the chymotrypsin and elastase activities in vitro. The recombinant inhibitor was sequenced and was found similar amino acids residues when compared to other inhibitors deposited in the database, with some modifications. recEvCI showed high stability under pH variations and reducing conditions, maintaining its activity around 80%. This protein increased the blood coagulation time in vitro by acting on the intrinsic pathway and did not show cytotoxicity against strains of mouse 3T3 fibroblasts and RAW 264.7 macrophages. recEvCI showed microbicide activity related to release of nitric oxide and consequently the activation of macrophages, futhermore having proinflammatory effects assessed by increased release of TNF-α. These results indicate that recEvCI can be biotechnologically used as a new tool in the control of coagulation-related diseases as well as can be an activating agent of the immune system in immunosuppressed individuals. Keywords: Mulungu. Recombinant inhibitor. Anticoagulant. Microbicide activity. Proinflammatory activity.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- Erythrina velutina - mulungu. A) Sementes de mulungu. B) Árvore.........................................................................................................................16 FIGURA 2- Distribuição de Erythrina velutina no Brasil.............................................17 FIGURA 3- Vias da cascata de coagulação...............................................................31 FIGURA 4- Diapedese e fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos.................................................................................................................35 FIGURA 5 Sequência do inibidor de quimotripsina de E. variegata.....................................................................................................................42 FIGURA 6- Vetor de clonagem pCR 2.1 – Invitrogen.................................................44 FIGURA 7- Vetor de expressão pEt 32a....................................................................48 FIGURA 8- Extração de RNA total de semente de E. velutina...................................57 FIGURA 9- Produtos de PCR das reações para amplificação do gene de interesse.....................................................................................................................58 FIGURA 10- Produtos de PCR das reações feitas a partir de colônias de E. coli transformadas com EvCI/pCR2.1...............................................................................58 FIGURA 11- Análise de sequenciamento BLASTx para Inibidor de Quimotripsina recombinante de E. velutina (EvCI)............................................................................59 FIGURA 12- Digestão da construção EvCI/pCR2.1-2................................................60 FIGURA 13- Produto de PCR de DNA plasmidial de células transformadas com a construção EvCI/pEt32a.............................................................................................60 FIGURA 14- Perfil de eluição de recEvCI, de coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude.....................................................................................................................61 FIGURA 15- Coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude...................................62 FIGURA 16- Perfil de eluição de recEvCI em coluna de quimotripsina-sepharose 4B CnBr-ativada...............................................................................................................63 FIGURA 17- SDS-PAGE 15% revelado com nitrato de prata...........................................................................................................................63

FIGURA 18- Sequência proteica de recEvCI.............................................................64

FIGURA 19 - Estabilidade de recEvCI em condições desnaturantes, testados contra quimotripsina..............................................................................................................65 FIGURA 20- Efeito de recEvCI no prolongamento do tempo de formação de coágulo pelos testes ApTT (via intrínseca) e PT (via extrínseca)............................................66 FIGURA 21- Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de células normais (3T3)...........................................................................................................................67 FIGURA 22- Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de macrófagos...........................68 FIGURA 23- Quantificação da produção de nitrito/nitrato em macrófagos RAW 264.7 induzida por diferentes concentrações de recEvCI....................................................69 FIGURA 24 - Produção de TNF-α por macrófagos....................................................70

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Proteinases: Classificação, sítios ativos e inibidores específicos..............21 Tabela 2. Classes e famílias de inibidores de proteinases........................................23 Tabela 3. Inibidores de proteinases de plantas e seus efeitos contra células tumorais......................................................................................................................27

Tabela 4: Atividade inibitória de recEvCI contra proteases serínicas........................64

LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS

ACN- Acetronitrila. Amp - Ampicilina APTT- Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada. BApNa - N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida. BSA - Albumina sérica bovina. CAT - Cloranfenicol DEMEM - Meio Eagle Modificado por Dulbecco DMSO - Dimetilsulfóxido. DTT - 1,4- ditiotreitol ou 1,4-bis(sulfanil)butano-2,3-diol. EDTA – Ácido etilenodiamino tetraacético EvCI – Inbidor de quimotripsina de Erythrina velutina HNE – Elastase neutrofílica humana IL - Interleucina lFN- ɣ - Interferon gama. iNOS - Ôxido nítrico sintase induzível. IPTG - Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo LPS - Lipopolissacarídeo. MALDI - Ionização e dessorção por laser assistida pela matriz. Miniprep – Extração de DNA plasmidial MS - Espectrometria de massa. NO – Óxido nítrico NOS – Óxido Nítrico Sintase PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida. PAMPs - Padrões moleculares associados a patógenos. PBS - Tampão Fosfato com cloreto de sódio. PT - Tempo de Protrombina. recEvCI – Inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina recombinante ROS - Espécies reativas de oxigênio. SDS - Dodecil sulfato de sódio. SFB - Soro fetal bovino. TCA - Ácido tricloroacético. TEMED - N, N, N’,N’-tetrametiletilenodiamino. TFA - Ácido trifluoroacético. TLR - Receptores tipo toll. TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa. TOF - Analisador de massa por tempo de vôo. Trx – Tiorredoxina. UI – Unidades de Inibição X-GAL - 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranosídeo

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 17 1.1. Erythrina velutina – MULUNGU ........................................................... 17

1.2. ENZIMAS PROTEOLÍTICAS – PROTEASES ...................................... 20

1.2.1. Classificação das Proteinases ....................................................... 20 1.3. INIBIDORES DE PROTEINASES DE PLANTAS ................................. 22

1.3.1. Potencial biotecnológico dos inibidores de proteinases ................. 26 1.3.1.1. Importância agroeconômica .................................................. 26 1.3.1.2. Aplicações farmacológicas .................................................... 27

1.4. COAGULAÇÃO .................................................................................... 29 1.4.1. Via intrínseca ................................................................................. 30 1.4.2. Via extrínseca ................................................................................ 30 1.4.3. Via comum ..................................................................................... 31

1.5. INFLAMAÇÃO ...................................................................................... 33

1.6. JUSTIFICATIVA ................................................................................... 38 2. OBJETIVOS ............................................................................................... 40

2.1. Objetivo Geral: ..................................................................................... 40 2.2. Objetivos Específicos: .......................................................................... 40

3. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 41 3.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS .................................................................. 41

3.1.1. Sementes de Erythrina velutina ..................................................... 41

3.2. REAGENTES ....................................................................................... 41

3.3. MÉTODOS ........................................................................................... 42 3.3.1. Extração de RNA total de sementes de E. velutina ....................... 42

3.3.2. Síntese de cDNA – RT-PCR e 3’ RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ................................................................................... 42

3.3.3. Desenho dos iniciadores (primers) ................................................ 43

3.3.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..................................... 44

3.3.5. Ligação dos insertos ao vetor de clonagem pCR 2.1 ..................... 45 3.3.6. Transformação de células de E. coli por choque térmico para

clonagem ....................................................................................... 46 3.3.7. Extração de DNA plasmidial .......................................................... 46 3.3.8. Sequenciamento completo do gene de inibidor de E. velutina ...... 47

3.3.9. Clonagem e Expressão do inibidor de quimotripsina em E. coli .... 47

3.3.9.1. Clonagem do gene em pCR2.1 ............................................. 47 3.3.9.2. Eletroeluição de DNA a partir de fragmentos de gel de

agarose ................................................................................. 48 3.3.9.3. Ligação do inserto ao vetor de expressão pET32a ............... 48

3.3.9.4. Expressão do inibidor de quimotripsina em pET32a ............. 49 3.3.9.5. Cromatografia de afinidade de Níquel HisTrap FF crude ...... 50 3.3.9.6. Liberação da proteína de fusão Tiorredoxina ........................ 50 3.3.9.7. Purificação de recEvCI .......................................................... 51

3.3.10. Quantificação de proteínas .................................................... 51 3.3.11. Análise do inibidor recombinante........................................... 51

3.3.11.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) ............. 51 3.3.11.2. Sequenciamento de recEvCI ................................................. 52

3.3.11.3. Preparo da solução de azocaseína 1% - Substrato ............... 53 3.3.11.4. Atividade anti-quimotripsina .................................................. 53

3.3.11.5. Atividade anti-tripsina ............................................................ 53 3.3.11.6. Atividade anti-elastase .......................................................... 54

3.3.11.7. Estabilidade térmica .............................................................. 54

3.3.11.8. Estabilidade em diferentes pHs ............................................. 54 3.3.11.9. Estabilidade na presença do agente redutor DTT ................. 55

3.3.12. Ensaios Biológicos ................................................................ 55 3.3.12.1. Cultura de células .................................................................. 55 3.3.12.2. Ensaio de viabilidade celular - MTT ....................................... 56 3.3.12.3. Atividade anticoagulante in vitro ............................................ 56

3.3.12.4. Avaliação da produção de óxido nítrico por macrófagos ....... 57

3.3.12.5. Avaliação da produção de TNF-α e IL-6 por macrófagos ...... 57

3.3.13. Análises Estatísticas .............................................................. 57 4. RESULTADOS ........................................................................................... 58

4.1. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL, SÍNTESE DE CDNA, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UM INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE E. VELUTINA ............................................................................................ 58

4.1.1. Extração de RNA total de semente de mulungu ............................ 58

4.1.2. Reação da Polimerase em Cadeia para amplificação do gene de interesse, Clonagem e Sequenciamento ....................................... 58

4.1.2.1. Amplificação do gene de interesse por PCR ......................... 58 4.1.2.2. Ligação do inserto EvCI ao vetor pCR2.1 e clonagem de

células de E. coli OMNIMAX ................................................. 59 4.1.3. Clonagem e Expressão de recEvCI em Escherichia coli ............... 60

4.1.3.1. Ligação do gene de EvCI ao vetor de clonagem pCR2.1. ..... 60 4.1.3.2. Transformação de células de E. coli BL21 DE3 pLyss .......... 61

4.1.3.3. Expressão do inibidor de quimotripsina recombinante – recEvCI .................................................................................. 62

4.1.3.4. Purificação do inibidor de quimotripsina recombinante – recEvCI .................................................................................. 63

4.1.3.5. Sequeciamento de recEvCI ................................................... 65

5.1.3.6. Atividade de recEvCI contra diferentes proteases serínicas ... 65 4.2. AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE RECEVCI EM DIFERENTES

CONDIÇÕES DESNATURANTES. ...................................................... 65 4.2.1. Estabilidades térmica de recEvCI em diferentes pHs e após

tratamento com DTT ...................................................................... 65 4.3. ENSAIOS BIOLÓGICOS ...................................................................... 67

4.3.1. Atividade anticoagulante ................................................................ 67 4.3.2. Avaliação de citotoxicidade para linhagem de células normais –

3T3 ................................................................................................. 67 4.3.3. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de óxido nítrico por

macrófagos .................................................................................... 69 4.3.4. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de TNF-α e IL-6 ....... 70

5. DISCUSSÃO .............................................................................................. 72

6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 80

17

1. INTRODUÇÃO

1.1. Erythrina velutina – MULUNGU

O gênero Erythrina compreende 115 espécies pertencentes à família

Fabaceae e à subfamília Papilionoidaea. As árvores pertencentes à espécie

Erythrina velutina podem atingir 15 metros de altura (Figura 1), e são conhecidas

popularmente como mulungu, bucaré, mulungá, variando de acordo com a região

(RAMALHO, 2008).

Figura 1. Erythrina velutina - mulungu. A) Sementes de mulungu. B) Árvore.

A) Fonte: Ramalho, 2008. B) Fonte: Disponível em http://olhares.sapo.pt/erythrina-velutina-

foto1465026.html acesso em 26 de março de 2014.

Estas plantas apresentam ampla distribuição no mundo, podendo ser

encontradas desde o sul da África até o sudeste dos Estados Unidos. No Brasil, são

encontradas cerca de doze espécies, das quais oito ocorrem no Nordeste

(RAMALHO, 2008) (Figura 2).

1 2

A) B)

18

Figura 2: Distribuição de Erythrina velutina no Brasil.

Fonte: Ramalho, 2008.

Muitas comunidades dependem de preparos baseados em plantas em

substituição à utilização de medicamentos comerciais (AHMAD et al., 2014). O seu

conhecimento se baseia no fato de que as plantas abrigam uma fonte inesgotável de

ingredientes ativos de valor inestimável no combate a doenças (PAREKH; CHANDA,

2007). Apesar da utilização de plantas na medicina popular ser feita geralmente a

partir do preparo de chás ou infusões, extratos de compostos ativos fitoterápicos

possuem vantagem de, apesar de estarem vinculados a outros compostos, ainda

desempenham a função para a qual são direcionadas (PAREKH; CHANDA, 2007).

No Brasil, as plantas do gênero Erythrina são utilizadas na medicina popular

principalmente no controle de doenças relacionadas ao sistema nervoso (DANTAS

et al., 2004).

Diferentes partes das árvores de Erythrina sp. produzem alcalóides que estão

envolvidos em alguns efeitos observados, tais como, ações tranquilizantes,

anticonvulsivantes, anestésicas, hipotensivas (GARÍN-AGUILAR et al., 2000;

VASCONCELOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2006) e ansiolíticas (RIBEIRO et al.,

19

2006). Algumas plantas possuem atividade semelhante a venenos vegetais

chamados curare, causando paralisia muscular, este efeito é atribuído às grandes

quantidades de alcalóides tetracíclicos encontrados no vegetal (AMER, 1991).

Extratos alcoólicos provenientes da casca da planta de E. velutina foram

avaliados quanto ao seu potencial antibacteriano e foi concluído que as amostras

apresentaram atividade contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes

(VIRTUOSO et al., 2005).Em estudo realizado por Vasconcelos et al. (2011),

extratos hidroalcoólicos da casca de Erythrina mulungu e Erythrina velutina

demonstraram possuir atividade anti-inflamatória em modelos de edema de pata em

camundongos.

Além de aplicações farmacológicas terem sido descritas a partir de extratos

da casca de plantas do gênero Erythrina, folhas e sementes também foram

analisadas. Ozawa e colaboradores (2009) isolaram 7 alcalóides de sementes de E.

velutina e analisaram o potencial citotóxico destas moléculas para células

cancerígenas, quando combinados com um dos membros da família de fator de

necrose tumoral (TRIAL- ligante indutor de apoptose relacionado a TNF) que

seletivamente induz a apoptose em uma variedade de tipos de câncer e células

transformadas sem causar danos às células normais. Entretanto, a aplicação clínica

de TRIAL individualmente é limitada, pois as células cancerígenas são resistentes

ao efeito citotóxico desta molécula.

Diferentes estudos demonstraram o efeito do extrato aquoso de folhas, o qual

causou um efeito anti-nociceptivo em ratos (MARCHIORO et al., 2005), aumentou o

tempo de sono e redução da atividade motora em ratos e camundongos (DANTAS et

al., 2004), assim como aumentou a contração muscular no modelo de indução

elétrica em íleo de Cavia porcellus (CARVALHO et al., 2009) o que indica uma

possível aplicação deste extrato em problemas como insônia e convulsões. Embora

vários efeitos tenham sido comprovados em estudos envolvendo compostos

secundários de plantas do gênero Erythrina, os mecanismos de ação que elucidam

tais efeitos ainda não foram esclarecidos (CARVALHO et al., 2009).

Outras moléculas encontradas em plantas do gênero Erythrina também foram

descritas apresentando atividades farmacológica e inseticida, como observado por

Singh et al. (2009) que purificou uma lectina de E. indica que causa interferência no

desenvolvimento de mosca da fruta (Bractocera cucurbitae). Kimura, Kouzuma e

Yamasaki (1993) purificaram, a partir de sementes de E. variegata, três inibidores de

20

proteases dentre os quais um deles inibia fortemente o ativador de plasminogênio

tecidual (t-Pa), assim como apresentaram ações anti-inflamatória e anticoagulante

(NAKAGAKI et al., 1996). Resultados semelhantes foram encontrados por Machado

et al. (2013), que detectou as mesmas atividades em um inibidor de tripsina de E.

velutina. Nesta mesma espécie também já foi descrita a ação inseticida de uma

vicilina (proteína de armazenamento) contra Plodia interpunctella e Ceratitis capitata

(AMORIM et al., 2008; MACEDO et al., 2008).

1.2. ENZIMAS PROTEOLÍTICAS – PROTEASES

Proteases são enzimas amplamente encontradas em animais, plantas e

microrganismos, perfazendo um total de, aproximadamente, 2% de todo o produto

gênico. Estas enzimas desempenham um papel crucial na fisiologia e patologia de

diferentes organismos por meio do controle da síntese e função de proteínas (FAN;

WU, 2005), participando também em processos biológicos como na coagulação

sanguínea (JACKSON; NEMERSON, 1980), na apoptose (NUNES et al., 2005), e

também como importantes fatores no desenvolvimento de inúmeras doenças

humanas, como câncer (WANG et al., 2013; YADAV et al., 2014), artrite (YADAV et

al., 2014) e infecções parasitárias (SIBLEY, 2013).

O termo peptidase define todas as enzimas que hidrolisam ligações

peptídicas, de acordo com o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de

Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB, 1992). Estas enzimas são subdividas

de acordo com o local de clivagem, sendo classificadas como exopeptidases,

quando a clivagem ocorre nas porções N- ou C- terminais, e endopeptidades (ou

proteinases), quando a hidrólise ocorre em ligações no interior de cadeias

polipeptídicas.

1.2.1. Classificação das Proteinases

As proteinases, ou endopeptidases, são classificadas de acordo com os

resíduos e cofatores envolvidos em seu sítio ativo em cinco classes: Proteinase

serínicas, proteinases cisteínicas, proteinases aspárticas, metaloproteinases e

treonina endopeptidases (NC-IUBMB, 1992).

21

Proteinases Serínicas: Esta classe de enzimas possui duas famílias

distintas, a família das quimotripsinas, que incluem quimotripsina, tripsinas,

elastases e calicreínas; e a família das subtilisinas (FAN; WU, 2005). As enzimas

que pertencem a esta classe são específicas para diferentes substratos, entretanto,

o processo de hidrólise é semelhante para todas. Este ocorre em duas etapas e tem

a participação de três resíduos, os quais formam a tríade catalítica que é essencial

para o processo de clivagem das ligações peptídicas. Esta tríade é formada por

resíduos de Histidina na posição 57, Asparagina na posição 102 e Serina na posição

195 (a numeração é baseada na localização dos resíduos em quimotripsina).

Durante o primeiro passo ocorre a formação de um complexo covalente entre a Ser

do sítio ativo da enzima e a porção acil do substrato, originando um intermediário

tetraédrico, e a ligação peptídica é clivada. Em seguida, no segundo passo, ocorre

uma desacilação onde o intermediário acil-enzima é hidrolisado por uma molécula

de água liberando o peptídeo e restabelecendo a estrutura original da enzima (FAN;

WU, 2005; HAQ; ATIF; KHAN, 2004; HAQ; KHAN, 2003).

Proteinases Cisteínicas: Esta classe inclui as proteases de plantas

(papaínas e bromelaínas), diversas catepsinas de mamíferos e proteases de

parasitas (Trypanossoma, Scistossoma), sendo as papaínas as mais bem estudadas

(FAN; WU, 2005). O processo de catálise ocorre de forma semelhante ao descrito

para proteinases serínicas, há formação de um intermediário covalente e tem a

participação de resíduos de cisteína (Cys 25) e histidina (His 159), que irão

desempenhar o papel antes descrito como sendo, respectivamente, da Ser e His em

serinoproteinases (FAN; WU, 2005; HAQ; ATIF; KHAN, 2004; YOZA, et al., 2002;

KURODA et al., 2001). Proteinases cisteínicas estão envolvidas em diversos

processos biológicos, como o processamento de interleucinas (THRONBERRY et

al., 1992), e também no crescimento, replicação e virulência de protozoários,

incluindo Trypanosoma e Leishmania spp (ORDÓÑEZ-GUTIÉRREZ et al., 2009).

Proteinases Aspárticas: As enzimas que fazem parte da classe de

proteinases aspárticas são divididas em duas famílias, pepsina e proteinases virais

(retropepsina, protease do vírus da imunodeficiência humana - HIV). A primeira

compreende o maior número de proteinases tais como enzimas digestivas tipo

pepsinas, quimosinas, catepsinas D lisossomais e algumas proteases fúngicas

(FAN; WU, 2005).

22

Metaloproteinases: As metaloproteinases são consideradas as mais antigas

classes de endopeptidases descritas encontradas em fungos, bactérias e

organismos superiores. As enzimas que pertencem a esta classe diferem tanto em

relação às suas sequências quanto às suas estruturas, mas a maioria apresenta

uma característica em comum, possui um átomo de zinco em seu sítio ativo,

podendo ser encontrados outros metais como cobalto e níquel (FAN; WU, 2005).

Estas enzimas não são apenas capazes de degradar quase todos os componentes

da matriz extracelular (VIHINEN; KAHARI, 2002) como também participam de

processos fisiológicos e biológicos normais tais quais a embriogênese, a

remodelagem tecidual, a cicatrização e a angiogênese. Entretanto o envolvimento

destas proteinases também ocorre em doenças como artrite, câncer e ulceração

tecidual (SEKHON, 2010; YADAV et al., 2014).

Na tabela 1 estão descritos os diferentes sítios ativos envolvidos na ação

catalítica de cada classe de proteinase, bem como, os seus inibidores específicos,

sintéticos ou naturais.

Tabela 1. Proteinases: Classificação, sítios ativos e inibidores específicos

CLASSES SÍTIOS ATIVOS INIBIDORES

Proteinases Serínicas Serina e Histidina TPCK, TLCK, PMSF, SBTI

Proteinases Cisteínicas Cisteína E-64, Iodoacetamida

Proteinases Aspárticas Envolvimento de resíduos de carboxil

Compostos diazo

Metaloproteinases Dependência de íons metálicos

EDTA, Fenantrolina

Fonte: Adaptado de Fan; Wu, 2005.

1.3. INIBIDORES DE PROTEINASES DE PLANTAS

A biossíntese e a regulação dos compostos químicos das plantas estão

associadas com os mecanismos de defesa. Este mecanismo defensivo natural é

encontrado em vários tecidos vegetais, como componentes constitutivos que fazem

parte do desenvolvimento normal da planta ou são sintetizados em resposta ao

23

ataque de patógenos ou pragas. Dentre estes compostos estão incluídos

antibióticos, alcalóides, terpenos e as proteínas (enzimas, lectinas, inibidores de

enzimas e outras) (MELO et al., 1999).

Os inibidores de proteinases são importantes ferramentas utilizadas pela

natureza para o controle da atividade de suas proteases-alvo. Estas proteínas

formam complexos reversíveis com enzimas alvo, semelhantes aos formados pelas

enzimas e substratos, levando à inativação (MOSOLOV; VALUEVA, 2011). Existem

quatro classes de inibidores de proteinases, separados de acordo com suas

atividades específicas, tais como: Inibidores de Proteinases Serínicas, Inibidores de

Proteinases Cisteínicas, Inibidores de Proteinases Aspárticas e Inibidores de Metalo-

proteinases. Os inibidores conhecidos e caracterizados são, em sua maioria,

inibidores de proteinase serínica, porém nos últimos anos um grande número de

inibidores de proteinase cisteínica tem sido isolado e caracterizado (BODE e

HUBER, 1992). Os inibidores de proteinases aspárticas e de metalo-proteases de

plantas são estudados em menor escala nas plantas (CARRILHO et al., 2009).

Os inibidores de proteinases serínicas de plantas são classificados em 8

famílias: Kunitz, Bowman-Birk, Batata 1, Batata 2, Inibidores de Tripsina de Abóbora,

Família dos Cereais, Inibidores de Tripsina de Mostarda e Serpinas. Os inibidores de

proteinases cisteínas são englobados na família das Fitocistatinas, enquanto que os

inibidores de proteinases aspárticas não possuem uma sub-classificação. Por fim, os

inibidores de metaloproteinases são classificados como Inibidores de

Carboxipeptidases A e B (MOSOLOV; VALUEVA, 2005; RYAN, 1990). Existe uma

ampla variação entre as famílias de Inibidores de proteinases, incluindo o número de

sítios ativos e pontes dissulfeto, como descrito na Tabela 2.

24

Tabela 2. Classes e famílias de inibidores de proteinases

Proteinases alvo

Classe de Inibidores

Famílias de Inibidores

Quantidade de sítios ativos

Quantidade de pontes dissulfeto

Referências

Serínicas Inibidores de Proteinases Serínicas

Kunitz 1 2 Mosolov; Valueva, 2005

Bowman-Birk 2 7 Mosolov; Valueva, 2005

Batata 1 1 1 (Ausente em alguns inibidores)

Mosolov; Valueva, 2005; Mares et al., 1989

Batata 2 2 Variável Mares et al., 1989; Schirra et al., 2009

Inibidores de Tripsina de Abóbora

1 3 Mosolov; Valueva, 2005

Família dos Cereais


Inibidores de Tripsina de Mostarda


Serpinas 1 3 Mosolov; Valueva, 2005

Cisteínicas Inibidores de Proteinases Cisteínicas

Fitocistatinas 1 Não possuem Mosolov; Valueva, 2005

Aspárticas Inibidores de Proteinases Aspárticas

- 1 Variável Ryan, 1990

Metalo-proteinases

Inibidores de Metalo-proteinases

Carboxipeptidases A e B

1 3 Ryan, 1990; Ryan; Hass; Kuhn, 1974

Inibidores de proteinases são proteínas amplamente expressas em plantas

superiores (VILLANUEVA et al., 1998; STEFAN et al., 2009), tendo sido encontrados

inicialmente em órgãos de reserva de plantas como sementes e tubérculos (XAVIER

– FILHO, 1992) e posteriormente em tecidos vegetativos (SHEWRY e LUCAS,

1997), e sua regulação é feita a nível transcricional (BOTELLA et al, 1996). Muitos

destes inibidores são ativos contra proteases de insetos, e sua expressão em

plantas é ativada por dano mecânico ou herbivoria, por isso, é suposta sua

participação em sistemas de defesa de plantas contra ataques de insetos

25

(VILLANUEVA et al., 1998), podendo também ocorrer em resposta a outros eventos,

como a germinação (BOTELLA et al, 1996).

Em relação à ativação da síntese de inibidores promovida pelo ataque de

insetos, acredita-se no envolvimento de hormônios vegetais que atuariam na

indução da síntese de proteínas inibitórias. Um desses hormônios é o jasmonato, o

qual teve sua participação primeiramente detectada em tomate (KOO; HOWE,

2009). Entretanto, a forma como precursores e enzimas envolvidas no metabolismo

deste hormônio são controlados em resposta à dano mecânico ou ataque de insetos

ainda é incerta.

Além da ativação da expressão de inibidores de proteinases em resposta ao

ataque de insetos e patógenos, alguns tipos de estresses abióticos também induzem

a síntese desta classe de proteínas, podendo favorecer o desenvolvimento da planta

em condições adversas (MOSOLOV; VALUEVA, 2011), como o observado em

plantas de arroz transgênicas, as quais foram induzidas a aumentar a expressão de

um inibidor de quimotripsina levando a um aumento na tolerância à seca (HUANG;

XIAO; XIONG, 2007). Resultados semelhantes foram observados quando um gene

que codifica para um inibidor de tripsina e expresso em Arabidopsis thaliana

aumentou a tolerância da planta a altas concentrações de sal (SHAN et al., 2008) e

um inibidor de proteinase cisteínica aumentou a tolerância da mesma planta para

diferentes tipos de estresses abióticos (ZHANG; LIU; TAKANO, 2008).

Em plantas, a função dos inibidores de proteinases, além de defesa, ainda

não foi esclarecida. Tais proteínas representam uma possibilidade para o controle da

atividade proteolítica e existem evidências de que inibidores agem como proteção

para tecidos específicos, atuam como proteínas de armazenamento, regulam a

atividade de proteinases e direcionam a sua liberação (HARTL et al., 2011;

MOSOLOV; VALUEVA, 2005).

Em consequência da capacidade de interação dos inibidores com proteinases

alvo, estas proteínas podem agir contra enzimas proteolíticas no interior do intestino

de insetos e parasitas despertando o interesse biotecnológico, tornando, portanto,

estas moléculas foco de estudos voltados para a sua utilização na agricultura como

inseticidas naturais. Além da importância agroeconômica, os inibidores de

proteinases demonstram outras atividades, como anti-inflamatória e

anticarcinogênica (LIPPMAN; MATRISIAN, 2000), indicando o seu potencial para

tratamentos de doenças (STEFAN et al., 2009).

26

1.3.1. Potencial biotecnológico dos inibidores de proteinases

1.3.1.1. Importância agroeconômica

A frequente necessidade de aumento na produção de alimentos para suprir a

necessidade de consumo depende do desenvolvimento e aplicação de novas

biotecnologias que permitam um fornecimento rápido e eficaz (HAQ; ATIF; KHAN,

2004). Este aumento do consumo vem acompanhado de altas perdas na agricultura,

causadas por diversas pragas e patógenos, fungos, bactérias e vírus. As plantas

possuem certo grau de resistência aos insetos e, apenas um número limitado destes

é hábil para se alimentar de cada espécie individualmente (MELO et al., 1999). Esta

resistência é baseada nos vários mecanismos de defesa desenvolvidos pelas

plantas, durante a evolução, incluindo a síntese de inibidores para enzimas

digestivas (SCHULER et al., 1998; MELO et al., 1999; FÜRSTENBERG-HÄGG;

ZAGROBELNY; BAK, 2013).

Os inibidores de proteases atuam no aparelho digestivo dos insetos

diminuindo a assimilação dos nutrientes, por intermédio de uma ligação específica

com as enzimas proteolíticas do intestino impedindo a realização das funções

primordiais no processo de digestão das proteínas. Quando os insetos são

submetidos a dietas artificiais, contendo inibidores específicos, para a principal

classe de proteinases intestinais, os mesmos além de apresentarem um

desenvolvimento retardado, podem apresentar índices de mortalidade significativos

(MCMANUS e BURGESS, 1995; MELO et al., 1999; MACEDO; FREIRE, 2011).

Diversos estudos demonstram efeitos adversos dos inibidores no

desenvolvimento ou na mortalidade de insetos, como evidenciam os resultados

obtidos por Cruz et al. (2013) e Rufino et al. (2013) nos quais, inibidores de tripsina

do tipo Kunitz foram efetivos tanto em testes in vivo quanto in vitro contra insetos de

diferentes ordens. Entretanto, devido à capacidade de adaptação dos insetos, a

utilização de um inibidor em conjunto com outra proteína, como a toxina Cry1Ac de

Bacillus thuringiensis, se mostrou uma abordagem mais efetiva contra Helicoverpa

armigera (LOMATE; HIVRALE, 2013).

27

1.3.1.2. Aplicações farmacológicas

Nas últimas décadas, inibidores de proteases têm sido investigados como

agentes terapêuticos, especialmente devido à sua comprovada ação no tratamento

de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), na hipertensão (FEAR;

KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007), além de estudos demonstrarem uma ação efetiva

de inibidores contra diferentes linhagens de células cancerígenas (FEAR;

KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007; FERREIRA et al., 2013; GARCÍA-GASCA et al.,

2002; JOANITTI; AZEVEDO; FREITAS, 2010; KOBAYASHI et al., 2004; MARÍN-

MANZANO et al., 2008) e também no controle da proliferação de protozoários,

incluindo L. infantum (ORDÓÑEZ-GUTIÉRREZ et al., 2009).

O uso de inibidores de protease no tratamento da síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS) foi iniciado entre 1995 e 1996 e é feito em

combinação com inibidores da transcriptase reversa, buscando reduzir a carga viral

em indivíduos HIV-positivos (FEAR; KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007; SCHWARCZ

et al., 2000). Atualmente existem 8 inibidores de protease sintéticos com aprovação

para tratamento do HIV, incluindo tipranavir, indinavir, saquinavir e lopinavir (FEAR;

KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007).

Apesar dos benefícios observados na utilização de inibidores em pacientes

soropositivos para HIV, tais como, aumento da longevidade e redução da morbidade

(MARY-KRAUSE et al., 2003), estudos demonstram a associação deste tipo de

tratamento com o aparecimento de efeitos indesejados, incluindo aumento de

resistência à insulina (MURATA; HRUZ, 2000), anormalidades no metabolismo de

lipídios (CARR et al., 1999) e aumento de risco de infarto do miocárdio (MARY-

KRAUSE et al., 2003), tendo sido já descrito o surgimento de variantes de HIV-1

resistentes a diferentes inibidores de protease (CONDRA et al., 1995). Em paralelo,

estudos que utilizam extratos de plantas com atividade inibitória demonstraram

resultados promissores no combate ao HIV (MATSUSE et al., 1999; MODI et al.,

2013).

Além da utilização de inibidores de protease de plantas no controle de

infecções, sejam elas virais ou parasitárias, esta classe de proteínas tem se

destacado em estudos focados em suas aplicações anticancerígenas,

principalmente as proteínas pertencentes à família dos inibidores de serino-

proteinases, devido à importância da atividade de proteinases serínicas no processo

28

de metástase (KOBLINSKI; AHRAM; SLOANE, 2000). A tabela 3 resume os

diferentes tipos de inibidores e o tipo de célula tumoral sobre as quais seus efeitos

foram estudados.

Tabela 3. Inibidores de proteinases de plantas e seus efeitos contra células tumorais.

Enzimas alvo Planta de origem

Linhagem celular cancerígena

Efeito Referência

Proteases Vigna unguiculata

MSF-7 (Câncer de mama)

Indução de apoptose e permeabilização de membrana lisossomal

Joanitti; Azevedo; Freitas, 2010

Proteinase tipo Trispina

Phaseolus acutifolius

3T3/v-mos (Fibroplasto transformado com oncogene)

Antiproliferativo e citotóxico

García-Gasca et al., 2002

Tripsina Glycine max HRA (Câncer de ovário)

Supressão do ativador de plasminogênio tipo-uroquinase

Kobayashi et al., 2004

Tripsina e Fator Xa

Crataeva tapia DU145 e PC3 (Câncer de próstata)

Indução de apoptose

Ferreira et al., 2013

Proteinases serínicas e cisteínicas

Bauhinia bauhinioides

MKN-28 e Hs746T (Câncer gástrico), HCT116 e HT29 (Câncer colorretal), SkBr-3 e MCF-7 (Câncer de mama, THP-1 e K522 (Leucemia)

Redução de viabilidade celular

Nakahata et al., 2013

Tripsina e Quimotripsina

Bel-7402 (Hepatoma) CCD18-Co (Câncer de cólon)

Redução da proliferação Redução da proliferação

Wang et al., 2006 Caccialupi et al., 2010

Inibidores de proteinases vegetais ainda demonstraram possuir atividades

antifúngica (CARRILLO et al., 2011; LOPES et al., 2009; WANG et al., 2006),

anticoagulante e anti-inflamatória (OLIVA et al., 2000).

Inibidores de proteases serínicas vegetais dos tipos Kunitz e Bowman-Birk

têm sido utilizados visando o controle enzimático em diferentes sistemas, contudo os

principais processos estudados têm sido os das reações envolvidas na coagulação,

como observado para um inibidor descrito em Bauhinia ungulata, que inibe o fator de

29

coagulação Xa, calicreína de plasma humano e calicreína tecidual (OLIVA et al.,

1999). A atividade inibitória sobre trombina e aumento no tempo de coagulação

foram descritos para inibidores de quimotripsina obtidos a partir de folhas de

Moringa oleifera (BIJINA et al., 2011) e Maclura pomnifera (LAZZA et al., 2010),

respectivamente.

Muitos estudos evidenciam a relação entre os processos de coagulação e

inflamação (MACHADO et al., 2013; OLIVA et al., 2000). Oliva et al. (2000)

descreveram um efeito anti-inflamatório in vivo quando testaram a ação do inibidor

LITI (inibidor de tripsina de Leucaena leucocephala) em camundongos, utilizando o

modelo de edema de pata, e atribuíram este efeito devido à interferência no sistema

calicreína-cinina, que está relacionado com eventos pró-inflamatórios (MOREAU et

al., 2005). Este sistema em cascata é iniciado pela clivagem do cininogênio de alto

peso molecular (HMWK), que é essencial na via intrínseca da coagulação, pela

calicreína ativada pelo fator XIIa, formando bridicinina. A liberação desta molécula

está relacionada com a intensidade da reação de um organismo à inflamação aguda,

produzindo dois sinais cardinais da inflamação, rubor e calor (MOREAU et al., 2005).

1.4. COAGULAÇÃO

A teoria clássica da coagulação, que direciona os estudos realizados até hoje,

só foi elucidada 1900 anos após as primeiras observações sobre coagulação

sanguínea feitas por Hipócrates (SCHOENMAKERS; REITSMA; SPEK, 2005).

Sabe-se hoje que o processo de coagulação é dividido em duas fases, a

primária e a secundária, tendo como base a atuação das plaquetas. A hemostase

primária ocorre rapidamente depois de dano vascular, havendo acúmulo de

plaquetas e vasoconstrição. A hemostase secundária ocorre após exposição do fator

tecidual (TF) por células danificadas e formação de fibrina em consequência da ação

dos fatores de coagulação, que são, em sua maioria, proteinases serínicas (BATTY,

2010).

Em 1964, McFarlane elucidou o processo de coagulação sugerindo que este

ocorria em “cascata” e o dividiu em 3 vias: intrínseca, extrínseca e comum,

sugerindo que as vias intrínseca e extrínseca atuariam de forma independente na

iniciação da coagulação (BATTY, 2010), entretanto, estudos invalidaram tal

afirmação após a confirmação de que deficiências no fator XII (exclusivo da via

30

intrínseca) não estão associadas com processos hemorrágicos. Além disso, a

ativação do fator IX pode ser feito por fatores de ambas as vias (NORRIS, 2003).

1.4.1. Via intrínseca

A via intrínseca, ou de contato, é iniciada pela autoativação do fator XII (fator

Hageman) em fator XIIa, após a ligação da forma inativa em uma superfície

carregada negativamente, como a superfície de células danificadas que expõem

colágeno. O fator XIIa promove a conversão de pré-calicreína em calicreína, a

ativação do fator XI e a clivagem de cininogênio de alto peso molecular (HMWK).

Estas mudanças culminam na formação do fator IXa. O fator IXa, auxiliado pelo

FVIIIa (que está, sem sua forma inativa, associado ao fator de von Willebrand)

participam da ativação do FX, iniciando a via comum (AUSTIN, 2013; NORRIS,

2003; SCHOENMAKERS; REITSMA; SPEK, 2005). Deficiências na ativação dos

fatores XI e IX levam ao desenvolvimento de hemofilia tipo C e hemofilia tipo B,

respectivamente (FRANCHINI; MANNUCCI, 2011). O fator IX também pode ser

ativado pela formação do complexo TF/VIIa (NORRIS, 2003).

Apesar de não haver modificações relevantes quando há deficiência em

alguma das proteínas da via intrínseca, estudos recentes têm sugerido que estas

moléculas apresentam variadas aplicações no sistema vascular, como o

envolvimento da pré-calicreína e HMWK na regulação da pressão sanguínea e

fibrinólise. Fator XII pode ativar neutrófilos e regular a liberação de citocinas por

monócitos e macrófagos (NORRIS, 2003).

1.4.2. Via extrínseca

Para o início do processo de coagulação pela via extrínseca, o contato dos

fatores de coagulação encontrados no sangue com células que expressam fator

tecidual (TF) na sua superfície é necessário (NORRIS, 2003), por sua vez, estes se

ligam ao fator VII ou VIIa circulantes no plasma (BUTENAS et al., 2007; JOBLING,

2013; NORRIS, 2003). Diferente de outros fatores da cascata de coagulação, o TF

está sempre em sua forma ativada, sendo somente expresso em células lesionadas,

além disso, monócitos e células musculares lisas podem estimular a produção de TF

por meio de citocinas e outros mediadores inflamatórios (CAMERER; KOLSTO;

31

PRYDZ, 1996). A formação do complexo TF/VII possui dois substratos, o fator de

coagulação IX que é convertido em fator IXa, e o fator X (NORRIS, 2003). Na fase

de amplificação, a trombina gerada durante a fase de iniciação se liga ao seu

receptor presente na superfície de plaquetas adjacentes. Isto causa clivagem da

proteína ativadora de protease 1 (PAR-1) resultando na ativação plaquetária e no

processo de degranulação. A trombina também ativa os fatores V, XI e VIII, sendo

este último, dissociado do vWF (BATTY, 2010).

O fator VII é reconhecidamente uma molécula essencial no processo de

iniciação da casca de coagulação. Isso tem levado estudos recentes a utilizarem

fator VIIa recombinante no controle de hemofilia e hemorragia severa (JOBLING,

2013).

1.4.3. Via comum

Na via comum, quando o fator IX é ativado, pela via intrínseca ou pela via

extrínseca, forma um complexo com o fator VIIa, cálcio e fosfolipídios, conhecido

como “complexo tenase”, o qual, por sua vez, converte fator X plaquetário em Xa

(NORRIS, 2003). O fator Xa ligado à membrana de plaquetas forma um complexo

com FVa e cálcio (complexo protrombinase), responsável pela conversão de

protrombina em trombina. Grandes quantidades de trombina clivam fibrinopeptídeos

A e B, provenientes do fibrinogênio, em fibrina. Este processo expõe sítios de

reconhecimento que permitem a polimerização de monômeros de fibrina com o fator

XIII ativado por trombina, tendo como consequência a estabilização do coágulo

(BATTY, 2010; FURIE; FURIE, 2012; MONROE; HOFFMAN, 2006). A figura 3

representa as duas vias envolvidas no processo de coagulação, assim como a via

comum e os testes in vitro (APTT e PT) que quantificam o tempo de coagulação de

cada via.

32

Figura 3: Vias da cascata de coagulação.

Fonte: Adaptado de Austin (2013).

Assim como a ausência dos fatores de coagulação XI e IX levam ao

desenvolvimento de hemofilias, interferências no processo de síntese do fator VIII

causa hemofilia tipo A (FRANCHINI; MANNUCCI, 2011; SCHOENMAKERS;

REITSMA; SPEK, 2005).

Os processos de coagulação sanguínea e de inflamação são respostas

universais para a infecção, estando inter-relacionados, podendo amplificar ou

atenuar os mecanismos envolvidos no sistema de defesa do hospedeiro. Após dano

tecidual, a cascata de coagulação e o sistema fibrinolítico são ativados resultando

em um aumento da permeabilidade vascular e consequente quimiotaxia de

leucócitos (KOZIK et al., 1998; OLIVA et al., 2000). Plaquetas também são

consideradas um elo entre inflamação e coagulação, além do sistema calicreína-

cinina (MOREAU et al., 2005), podendo ser inibidas por óxido nítrico (IBIZA;

SERRADOR, 2008). Esta mesma molécula ainda participa da homeostase

sanguínea e inibe adesão leucocitária à células endoteliais (IBIZA; SERRADOR,

2008). Mediadores da inflamação, como a citocina IL-6, induzem a produção de

plaquetas e estas células geradas são mais sensíveis à ação de trombinas (ESMON,

2004).

33

1.5. INFLAMAÇÃO

A inflamação consiste em uma complexa interação molecular desencadeada

por injúrias, tais como patógenos e lesão celular (WU; CHEN, 2014). Em um

indivíduo saudável, este processo atua na remoção do estímulo e promove a

reabilitação do local da lesão. Entretanto, qualquer desequilíbrio na ativação da

inflamação, torna-se a causa do agravamento de diversas doenças, por exemplo,

artrite reumatoide, diabetes, mal de Alzheimer e alguns tipos de câncer (DIAO et al.,

2014; MIHALACHE; SIMON, 2012).

O processo de inflamação envolve aumento de permeabilidade vascular,

migração de células sanguíneas e passagem de constituintes do plasma para o

tecido lesionado (WU; CHEN, 2014), sendo iniciado pelo aumento na produção de

citocinas e quimiocinas por macrófagos locais que agem de diferentes formas: (1) no

recrutamento e ativação de macrófagos adicionais ao local do dano; (2) na produção

de fatores de crescimento que promovem proliferação celular e síntese proteica; (3)

na síntese de proteases e moléculas de matriz extracelular e (4) na liberação de

fatores que podem restaurar o tecido uma vez que o reparo está completo

(DIPIETRO, 1995; WU; CHEN, 2014). As citocinas e quimiocinas promovem

recrutamento de leucócitos, especialmente neutrófilos, para o local da infecção ou

dano. Tanto macrófagos quanto neutrófilos desempenham atividade fagocítica e

causam a morte de patógenos no ambiente intracelular (MIHALACHE; SIMON,

2012).

A produção de citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos, como o fator de

necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina-1, podem levar à indução da expressão de

moléculas de adesão na superfície de células endoteliais vasculares, levando à

diapedese (CARMAN; SPRINGER, 2004), sendo os neutrófilos os primeiros a

atingirem o local da lesão, seguidos por monócitos e linfócitos. Os neutrófilos

produzem uma ampla variedade de proteinases e macrófagos sintetizam espécies

reativas de oxigênio como uma linha de defesa contra microrganismos

contaminantes, além destas células estarem envolvidas na fagocitose de debris

celulares, que é iniciada, aproximadamente, 24 horas após o dano e contribui para a

diminuição da infecção no local (WU; CHEN, 2014). Os neutrófilos só sobrevivem na

circulação por 7 -10 horas mas sua longevidade é estendida pela ação de citocinas

(IL-6, IL-8) e produtos bacterianos, como o LPS (ALESSANDRI et al., 2013).

34

O início da resposta inflamatória ocorre com a detecção por macrófagos

locais de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) ou padrões

moleculares associados a danos (DAMPs). PAMPs são motivos conservados de

patógenos e têm papel essencial na biologia destes organismos, assim, não estando

sujeitos a altas taxas de mutações (ADEREM, 2001; JANEWAY; MEDZHITOV,

1998). O reconhecimento destas assinaturas moleculares por células específicas é

essencial para uma resposta imune efetiva, pois esta interação será a base para a

diferenciação entre próprio e não-próprio. Este processo de reconhecimento é feito

por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) em macrófagos, como os

receptores tipo Toll (TLRs) (TSAI et al., 2014).

Um outro mecanismo que ativa a ação de células de defesa é feito pelo

reconhecimento de padrões moleculares associados a danos (DAMPs), que são

moléculas produzidas a partir de células danificadas ou mortas que irão

desencadear a indução da resposta inflamatória via ativação de PRRs, como visto

para PAMPs, como TLRs e receptores para produtos finais de glicação avançada

(RAGE) (POUWELS et al., 2013; TSAI et al., 2014). A liberação destas moléculas

pode não estar associada a patógenos, como é observado na resposta inflamatória

acionada por danos no miocárdio causando infarto (HAAN et al., 2013).

Receptores tipo Toll (TLRs) são moléculas de sinalização transmembrana que

ativam programas de expressão gênica que resultam na produção de citocinas pró-

inflamatórias e quimiocinas, interferon tipo I e fatores antimicrobianos. Além disso, a

ativação de TLR facilita e orienta a ativação da resposta imune adaptativa por meio

da ativação das células dendríticas (CANADA; MEETING, 2006). Dois membros da

família TLR participam deste processo: TLR 4 que reconhece LPS de bactérias

Gram-negativas; e TLR 2 que ativa a resposta na presença de fungos, e bactérias

Gram-positivas (JONES et al., 2001; OZINSKY et al., 2000; ROCK et al., 1998). Nos

mamíferos, a estimulação de TLR resulta na secreção de citocinas pró-inflamatórias,

tais como TNF-α e interleucina-6 (IL-6), que iniciam uma resposta inflamatória para

eliminar o organismo invasor (PLOWDEN et al., 2004).

Após o reconhecimento de patógenos, ou de danos, os macrofágos atraem e

ativam outras células imunes pela liberação de citocinas e quimiocinas. Na resposta

inflamatória inicial os macrófagos participam ativamente promovendo a captação de

debris teciduais e de células imunes mortas (CHILDS et al., 2011; MOSSER;

EDWARDS, 2009; MARTIN; PETERS; BEHAR, 2014), além de atuar como ponte

35

entre a imunidade inata e adaptativa (SHAPIRO; LUTATY; ARIEL, 2011). Estas

células ainda atuam liberando proteases, como elastase (metaloproteinase 12), que

irão degradar matriz extracelular e ainda estão envolvidas no processo de

remodelagem tecidual (NÉNAN et al., 2005). De forma geral, a função principal dos

macrófagos é manter o ambiente intersticial livre de material celular estranho

(MOSSER; EDWARDS, 2009).

Macrófagos são usualmente classificados, de acordo com o método de

ativação, em classicamente ativados (M1) ou alternativamente ativados (M2).

Células M1 são consideradas pró-inflamatórias e são acionadas por interferon γ,

produzido por células T CD4+ auxiliares - Thelper 1 (Th1), células Natural killers

(NK) ou pelo reconhecimento de moléculas associadas a patógenos (PAMPs). Estas

células após ativadas liberam óxido nítrico (VARIN; GORDON, 2009), leucotrienos e

o fator ativador plaquetário (PAF), sendo os dois últimos ativos em células distantes

e amplificam a reação inflamatória (PEREIRA et al, 1998).

Macrófagos M2 são acionados por IL-4 e/ou IL-13, produzidas por células

Th2, e produzem IL-10 e TGF-β (fator de transformação do crescimento), os quais

possuem atividade anti-inflamatória (ALESSANDRI et al., 2013; VARIN; GORDON,

2009). Nos eventos finais da resposta inflamatória, macrófagos M1 podem ser

convertidos em macrófagos M2 que irão atuar inibindo a inflamação e promovendo

reparo tecidual (ALESSANDRI et al., 2013) por meio da resolução e regeneração

após o evento inflamatório. Estas células liberam citocinas anti-inflamatórias que irão

sinalizar para o início do reparo da lesão (NOACK; MIOSSEC, 2014), além de

poliaminas e prolinas, as quais induzem proliferação e produção de colágeno,

respectivamente (CLASSEN; LLOBERAS; CELADA; 2009; MOSSER, 2003; VARIN;

GORDON, 2009). Os macrófagos ainda removem restos celulares e neutrófilos

apoptóticos, assim como secretam fatores de crescimento angiogênicos e

fibrogênicos que reparam o tecido danificado finalizando a inflamação (Figura 4)

(PLOWDEN et al., 2004; WU; CHEN, 2014).

36

Figura 4: Diapedese e fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos.

Fonte: SERHAN; CHIANG; DYKE (2008).

Assim como citocinas e quimiocinas, o óxido nítrico (NO) produzido e liberado

por macrófagos também tem uma importante participação no combate a patógenos

e no processo inflamatório. O NO é uma radical gasoso de vida curta, originado a

partir do aminoácido L-arginna (FANG; TORRES, 2002), que pode ser sintetizado

por três enzimas diferentes, NOS induzida (iNOS), NOS endotelial (eNOS) e NOS

neuronal (nNOS) (XU et al., 2002). Embora eNOS e nNOS sejam constitutivamente

expressas e dependentes de Ca2+, a NOS expressa pelos macrófagos (iNOS) é

independente de Ca2+ (CHANG; LIAO; KUO, 1998). O óxido nítrico produzido,

quando em contato com água, reage com oxigênio formando ânions

moderadamente estáveis, ânions estáveis, óxidos e superóxidos instáveis

(MACMICKING; XIE; NATHAN, 1997).

O óxido nítrico pode atuar em vários processos biológicos como

vasodilatação, imunidade mediada por macrófagos, atuando em mecanismos

microbicidas de fagócitos (CHI et al., 2003; XU et al., 2002), na regulação da

proliferação de linfócitos T e secreção de citocinas durante a resposta imune

adaptativa (IBIZA; SERRADOR, 2008).

37

Na presença de agentes microbianos o óxido nítrico pode agir de diferentes

formas. Esta molécula danifica enzimas contendo gupo heme, pode inibir a

replicação bacteriana ligando-se diretamente ao DNA de dupla fita causando

desaminação e quebra, assim como podem romper metaloproteínas envolvidas na

síntese de DNA. Frente à infecções virais, NO prejudica a replicação e ativação de

proteases envolvidas na entrada do vírus em células alvo (IBIZA; SERRADOR,

2008). As ações antimicrobiana e citotóxica de NO são reforçadas por outros

produtos dos macrófagos, tais como glutationa, cisteína, peróxido de hidrogénio ou

ânions superóxido (MACMICKING; XIE; NATHAN, 1997).

A ativação de macrófagos e consequente liberação de óxido nítrico envolve

diferentes vias, umas delas se baseia na formação de espécies reativas de oxigênio

(ROS) que desencadeia a ligação de NF-κB (fator nuclear kappa B) ao DNA

ativando a expressão de iNOS (DIAO et al., 2014), podendo também inibir a ligação

deste fator de transcrição ao DNA (IBIZA; SERRADOR, 2008)

Proteinases serínicas desempenham um papel fundamental na resposta

inflamatória, como as enzimas vasoativas, mediadoras na coagulação e fibrinólise e

intermediários no sistema complemento. Quando ocorre excesso na resposta

inflamatória, os inibidores de proteinases de plantas podem ser utilizados como uma

ferramenta farmacológica no restabelecimento da homeostase (FEAR;

KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007), considerando a diversidade observada

relacionada à aplicação de inibidores de proteinase de plantas em estudos voltados

para uma aplicação biotecnológica, em especial, farmacológica (CARRILLO et al.,

2011; HARTL et al., 2011; KOBAYASHI et al., 2004; LAZZA et al., 2010).

Considerando o aumento mundial na utilização de fitoterápicos, e que 25%

dos fármacos utilizados em alguns países são de origem natural, os países que

possuem em seu território uma grande biodiversidade têm a oportunidade de

explorar este potencial e aplicar na produção de medicamentos. A descoberta de

novas moléculas vegetais que demonstrem atividades relacionadas ao controle de

alguma doença ainda não é bem estabelecida no Brasil, ao contrário do visto em

outros países como China, Estados Unidos e Alemanha (FUNARI; FERRO, 2005).

Entretanto, o governo brasileiro está buscando reverter este fato, estabelecendo

programas de apoio às pesquisas que foquem neste aspecto, o que é corroborado

pela fabricação nacional do anti-inflamatório Acheflan, feito a partir de folhas de

Cordia verbenácea (BARREIRO; BOLZANI, 2009).

38

1.6. JUSTIFICATIVA

Embora seja errôneo acreditar que medicamentos à base de plantas sejam

completamente seguros e livres de efeitos colaterais, efeitos adversos de

fitoterápicos são observados em menor escala quando comparados às drogas

comuns (LUIZE et al., 2005). Diversos estudos corroboram estes dados, como

comprovado na utilização de diferentes anticoagulantes em humanos e roedores

(heparina e varfarina) (MORISHIMA et al., 2013; WALENGA; BICK, 1998) e também

no tratamento com anti-inflamatórios (inibidores da COX - ciclooxigenases 1 e 2), os

quais podem causar problemas gastrointestinais, problemas renais e afetar o

processo de coagulação (DINARELLO, 2010; MORISHIMA et al., 2013). Dessa

forma, estudos se concentraram na descoberta de moléculas vegetais visando uma

alternativa segura no controle de doenças.

Plantas do gênero Erythrina se destacaram neste contexto devido à utilização

de extratos com aplicações calmante, anticonvulsivante e anti-inflamatória

conhecidas na medicina popular (DANTAS et al., 2004; VASCONCELOS et al.,

2011), além de proteínas purificadas de sementes também apresentarem

citotoxicidade contra células cancerígenas e atividades anticoagulante e anti-

inflamatória. Esta planta é amplamente distribuída nas regiões Nordeste e Centro-

Oeste podendo ser encontradas nos mais diversificados biomas, desde a mata

atlântica até a caatinga (RAMALHO, 2008).

A utilização de plantas no tratamento de doenças, apesar de ser uma prática

popular comum, ainda não contava com o apoio do Ministério da Saúde, até a

criação do Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais em 1982, tendo sido

precedido pela Portaria 212 (11 de setembro de 1981) que define o estudo das

plantas medicinais com uma das prioridades da investigação clínica, e finalmente

consolidado pela criação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,

de 22 de junho de 2006 (AMARAL et al., 2006). A partir deste evento, a utilização de

fitoterápicos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) foi iniciada unindo o conhecimento

popular de fitoterápicos com experimentos científicos, levando à amplificação do

conhecimento popular e valorização da flora nacional.

As moléculas envolvidas na ação farmacológica das plantas são de diferentes

origens, podendo ser metabólitos secundários (como alcalóides) e proteínas. A

extração e utilização de tais plantas na medicina são regidas por normas

39

estabelecidas pelo Ministério da Saúde (AMARAL et al., 2006), sendo, dessa forma,

extremamente útil a síntese destas moléculas de formas alternativas, as quais

evitariam a degradação do ecossistema e poderiam aumentar a obtenção das

moléculas em sua forma purificada.

Os sistemas de produção tradicionais de proteínas recombinantes, uma

alternativa na produção destas moléculas de maneira heteróloga à sua síntese

natural, que utilizam culturas celulares de mamíferos enfrentam inconvenientes

relacionados ao custo e demanda, e novos sistemas de produção, como culturas

celulares de insetos ou animais transgênicos, são susceptíveis a problemas

relacionados à segurança e autenticidade do produto (BAUR et al., 2005).

Inegavelmente, Escherichia coli tem sido o organismo mais utilizado em estudos de

expressão por apresentar diversas vantagens quando comparado a outros sistemas,

como rápido crescimento, fácil manipulação, expressar proteínas recombinantes em

larga escala, dentre outras vantagens (CHOI et al, 2006; YOON et al, 2010).

Inibidores de proteases provenientes de plantas do gênero Erythrina foram

previamente clonados e expressos em E. coli (KOUSUMA, YAMASAKI e KIMURA,

1997; HUNG et al., 2007; STEFAN et al., 2009), destacando a produção de

inibidores de quimotripsina recombinantes, e foi verificado o seu efeito contra

proteases alvo (KURAMITSU et al., 1996), indicando que a proteína recombinante

preserva as mesmas propriedades da proteína nativa, como também observado no

presente trabalho, no qual, o gene do inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina

(EvCI) foi clonado e expresso em E. coli. Em estudo previamente realizado, este

inibidor possui atividade anticoagulante, atuando sobre a via intrínseca da

coagulação, e atividade anti-inflamatória em modelo de sepse (MONTEIRO, 2011).

O inibidor recombinante, recEvCI, manteve a atividade contra quimotripsina,

além de demonstrar atividade anticoagulante sobre a via intrínseca, de maneira

semelhante ao observado para EvCI, adicionalmente a proteína possui atividade

pró-inflamatória sobre macrófagos, o que não foi testado para o inibidor natural. Com

base nestes resultados, recEvCI pode ser aplicada biotecnologicamente como uma

nova ferramenta na produção de fitoterápicos visando uma ação farmacológica

baseada nos resultados sobre os processos de coagulação e inflamação obtidos

neste estudo, considerando que os atuais meios de tratamento de doenças

relacionados a estes processos são causadores de diversos efeitos colaterais.

40

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL:

Avaliar a atividade bioquímica e o potencial farmacológico do inibidor

de quimotripsina Erythrina velutina recombinante.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Clonar e expressar o inibidor de quimotripsina em Escherichia coli a

partir de cDNA produzido de mRNA de sementes prematuras de E. velutina;

Purificar, determinar a massa molecular e estrutura primária do inibidor

de quimotripsina recombinante;

Identificar a atividade inibitória contra diferentes proteinases alvo;

Caracterizar a proteína quanto à sua estabilidade em condições

desnaturantes (pH, temperatura e tratamento com DTT);

Determinar possível citotoxicidade do inibidor recombinante sobre

linhagens celulares;

Avaliar o efeito e a via de atuação do inibidor purificado sobre a

coagulação sanguínea in vitro;

Identificar a ação microbicida in vitro, através da produção de óxido

nítrico por macrófagos ativados;

Avaliar o potencial de recEvCI no processo inflamatório por meio da

quantificação de TNF-α e IL-6.

41

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS

3.1.1. Sementes de Erythrina velutina

Sementes imaturas de Erythrina velutina foram cedidas pela Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA (CENARGEN – Centro Nacional

de Recursos Genéticos). Estas sementes foram utilizadas por possuírem uma maior

quantidade de mRNA, visto que os inibidores são expressos durante a germinação.

3.2. REAGENTES

Albumina sérica bovina, azocaseína, dimetilsulfóxido (DMSO), ditiotreitol

(DTT), dodecil sulfato e sódio (SDS), quimotripsina pancreática bovina, tripsina

pancreática bovina, trombina do plasma humano, sepharose-4B, TEMED (N, N, N-

tetrametiletilenodiamino), triton X-100, álcool isopropílico, EDTA (Ácido

etilenodiamino tetraacético), azul de bromofenol, coomassie brilliant blue R-250,

ácido trifluoroacético, imidazol e acetonitrila foram obtidos da Sigma-Aldrich. RNAse,

reagentes para a reação de PCR e Trizol. foram adquiridos da Life Technologies e

da Thermo Scientific, respectivamente. Acrilamida, bis-acrilamida e persulfato de

amônio foram obtidos da GE Healthcare.

Ácido tricloroacético foi obtido da VETEC Química Fina Ltda, Rio de Janeiro,

Brasil.

Padrão de massa molecular, Coomassie Brilliant Blue G-250 e pepsina de

estômago suíno imobilizada foram obtidos da Fermentas Life Sciences, Bio Agency

Biotecnologia Ltda e Thermo Scientific, respectivamente.

Para os ensaios de avaliação de atividade anticoagulante, foi utilizado kit

fabricado por Wiener Lab Group.

Todos os outros reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analítico e

manuseados segundo as recomendações do fabricante.

42

3.3. MÉTODOS

3.3.1. Extração de RNA total de sementes de E. velutina

A extração de RNA total foi feita seguindo a metodologia descrita por

Chomczynski e Sacchi (1987). Semente de E. velutina foi macerada e pulverizada

mecanicamente em nitrogênio líquido em almofariz e pistilo, mantendo-a sempre

congelada. O pó foi transferido para microtubos de 1,5 mL previamente congelados

em nitrogênio líquido e pesados para uma massa final de 100 mg. Aos tubos foi

adicionado Trizol (Guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio) os quais foram misturados

lentamente por inversão e mantidos por 5 min à temperatura ambiente. O material foi

centrifugado a 12.000 x g por 10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante

contendo o RNA total foi transferido para microtubos novos. Em seguida foram

adicionados 200 µL de clorofórmio e as amostras foram homogeneizadas

vigorosamente em vórtex por aproximadamente 1 min, sendo, em seguida,

incubados à temperatura ambiente por 3 min. O material foi centrifugado a 12.000 x

g por 15 min, a fase aquosa foi transferida para novos eppendorfs e foram

adicionados 500 µL de álcool isopropílico sendo misturado por inversão. A mistura

foi incubada 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugada 12.000 x g por 10 min,

o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 1 mL de etanol a 75%,

centrifugado novamente a 7500 x g por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o

precipitado seco a temperatura ambiente até ficar translúcido. O RNA total foi

ressuspenso cuidadosamente em aproximadamente 100 µL de água ultra pura. A

integridade do RNA foi verificada em gel de agarose 1%.

3.3.2. Síntese de cDNA – RT-PCR e 3’ RACE (Rapid Amplification of

cDNA Ends)

Para a síntese do cDNA correspondente ao mRNA de E. velutina, 1 µg de

RNA total (2 µL), 2 µL de oligonucleotídeo nv_dT e água ultra pura em uma

quantidade suficiente para 11 µL foram incubados a 70 °C por 3 minutos em

termociclador (BioRad) sendo, em seguida, transferidos para gelo por 3 minutos.

Após este período de incubação foram adicionados tampão de reação (Tris-HCl

http://en.wikipedia.org/wiki/Guanidinium_thiocyanate-phenol-chloroform_extraction

43

50mM pH 8,3), ditiotreitol 0,1M, inibidor de RNAse e desoxirribonucleotídeos

fosfatados (dNTP) e o material foi incubado a 42 °C por 2 minutos em termociclador.

Em seguida 1 µL de transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney

(M-MLV - Invitrogen) foi adicionado e incubado a 42 °C por 1 hora em termociclador,

então RNAse H foi adicionada e incubado a 37 °C por 15 minutos, sendo o material

congelado a -20 °C. O iniciador utilizado, nv_dT, é composto por repetições de

Timina, que irão reconhecer a cauda poli-A na região 3’ de mRNAs. A amplificação

do cDNA foi feita por PCR, como descrito no item 4.3.4.

3.3.3. Desenho dos iniciadores (primers)

Amplificação e clonagem: Os iniciadores utilizados para amplificação do

cDNA do inibidor de quimotripsina de E. velutina foram desenhados utilizando-se a

sequência completa do inibidor de quimotripsina de E. variegata depositada no

banco de dados “GenBank” do “National Center for Biotechnology Information” –

NCBI, código de acesso AAB25433.1 (Figura 6) e foram nomeados da seguinte

forma:

I- Iniciador degenerado senso (Inib_Quimtrp_Fw) -

CARCCNYTNGTNGAYYTNGARGG;

II- Iniciador degenerado antisenso (Inib_Quimtrp_Rv1) –

ACNAGYTCNARNGGRTTRTC

III- Iniciador degenerado antisenso (Inib_QuimTrp_Rv2) -

RTCRTCYTCNCGYTGRCARTA

Onde: Y – Representa a adição de qualquer pirimidina; R – adição de qualquer

purina e N – qualquer nucleotídeo.

Figura 5. Sequência do inibidor de quimotripsina de E. variegata

Sequência de ECI depositada no GenBank com código de acesso AAB25433.1. Em lilás: Molde para iniciador senso. Em amarelo: Molde para iniciador antisenso 2. Em verde: Molde para iniciador antisenso 1.

EPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNG

EPIRIASQFLSTFIPDGSPYAIGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTP

EEDDTKFKFQKVSSPNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIRRDAKGYRRLVVT

NDNPLELVLVKANSPSQ

44

Para a clonagem foram utilizadas duas metodologias. Na primeira foram feitas

2 reações consecutivas: Reação 1 teve como molde o cDNA produzido

anteriormente e os iniciadores foram Inib_Quimtrp_Fw e Inib_Quimtrp_Rv1; Reação

2 teve como molde os produtos da reação 2 e os iniciadores foram Ev_AP e

Inib_QuimTrp_Rv2, onde Ev_AP foi utilizado como sequência âncora para o

iniciador Inib_Quimtr_Fw. As reações de PCR foram feitas como descrito

posteriormente no item 4.3.4.

A segunda metodologia foi feita a partir dos resultados obtidos e confirmação

por sequenciamento de que o gene não estava íntegro, foi desenhado um novo

iniciador visando obter a sequência do gene do inibidor de interesse. Dessa forma, o

seguinte iniciador para EvCI foi produzido: Fw2_InibQuimo –

CAGCCGCAGTCGACCTTGAGG e a reação de PCR foi feita utilizando como molde

cDNA. O iniciador antisenso foi nv_dT, conseguindo, assim, o segmento de DNA. A

mesma reação foi feita para confirmação do sucesso na clonagem. As condições de

PCR foram as mesmas dos passos anteriores.

Expressão de recEvCI: Para a etapa de expressão, os seguintes iniciadores

foram desenvolvidos:

I- Iniciador senso (EvCI_Fw_expr) :

GCTAGCATGCAGCCGCTGGTCGACCTTGAGGGCAAC; onde a sequência

GCTAGC corresponde à endonuclease NheI e ATG corresponde à Metionina.

II- Iniciador antisenso (EvCI_Rv_expr):

GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGAGATGGTGAATTAGC; onde a

sequência GTGGTGGTGGTGGTGGTG corresponde a seis resíduos de Histidina

(HisTag), TTA codifica para o códon de parada em E. coli e GAATTC é a região que

codifica para o sítio da enzima EcoRI.

3.3.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Para a amplificação do cDNA as reações de PCR foram realizadas em 2

etapas. Na primeira foi utilizado como molde cDNA sintetizado a partir do RNA total

de sementes de E. velutina. Para a segunda etapa os produtos da primeira reação

foram utilizados como molde. A amplificação na primeira etapa seguiu as seguintes

condições de PCR: 9 4°C por 2 minutos, 94 °C por 45 segundos, 55 °C por 45

45

segundos, 68 °C por 45 segundos (30 ciclos), 4 ºC sem limite de tempo. A

amplificação na segunda etapa seguiu as seguintes condições: 94 °C por 2 minutos,

94 °C por 45 segundos, 55 °C por 45 segundos, 72 °C por 45 segundos (30 ciclos), 4

ºC sem limite de tempo.

Os eventos das reações de PCR realizadas para confirmação da clonagem e

expressão foram as mesmas descritas para a segunda etapa.

3.3.5. Ligação dos insertos ao vetor de clonagem pCR 2.1

Após realização de PCR para aumentar a quantidade de cDNA, confirmação

da presença do gene de interesse e posterior purificação utilizando Kit de

Purificação de Produtos de PCR (QIAGEN), foi feita ligação ao vetor pCR 2.1

(Invitrogen) (Figura 7), seguindo o protocolo do fabricante, gerando a construção

EvCI/pCR2.1.

Figura 6. Vetor de clonagem pCR 2.1 – Invitrogen

46

3.3.6. Transformação de células de E. coli por choque térmico para

clonagem

Células de E. coli competentes da linhagem OMNIMAX (Life Technologies)

foram utilizadas. Foram incubados 10 µL da construção EvCI/pCR2.1 com 50 µL de

células por 30 minutos em gelo. Em seguida o material foi transferido para banho-

maria a 42 °C por 1 minuto e colocados em gelo por, no mínimo, 5 minutos. Após, foi

adicionado LB para um volume final de 500 µL e homogeneizado lentamente, logo

após, 100 µL foram plaqueados em meio LB-ágar adicionado de ampicilina (0,1

mg/mL) e IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo)/X-GAL(5-bromo-4-cloro-3-

indolil-beta-D-galacto-piranosídeo) com o auxílio de alça de Drigalsky, colocados em

estufa a 37 °C por 16 horas para crescimento das colônias transformadas.

As colônias brancas foram repicadas em placas contendo LB-ágar e

incubadas a 37 °C por 16 horas. Após esse período foi feita PCR de colônia para

confirmar a transformação.

3.3.7. Extração de DNA plasmidial

Para a extração do DNA plasmidial das células de interesse transformadas,

foi feito um inóculo, no qual, uma amostra da colônia foi coletada com o auxílio de

uma ponteira e solubilizada em 5 mL de meio LB líquido, colocados sob agitação de

10000 x g a 37 ºC durante 16 horas. Após esse período o material foi centrifugado a

10000 x g, em temperatura ambiente por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e

o precipitado ressuspenso em 300 µL de solução P1 (Tris 150 mM e EDTA 10 mM

pH 8,0) e agitado vigorosamente em vórtex. Em seguida, foi adicionada 300 µL de

solução P2 (NaOH 200 mM e SDS 1%) para provocar a lise das células, sendo, em

seguida, misturados por inversão (10 vezes) e deixados 5 minutos à temperatura

ambiente. Posteriormente, 300 uL de solução P3 (Acetato de potássio 3 M pH 5,0)

foi adicionada e deixada por 30 minutos em gelo. O material foi então centrifugado

por 30 minutos a 10000 x g à temperatura ambiente, o sobrenadante foi coletado e

transferido para um novo tubo de microcentrífuga (BioRad). Foi adicionada uma

solução de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 24:1, agitado

vigorosamente por 1 minuto e centrifugado (5 minutos, 10000 x g à temperatura

47

ambiente). Este passo foi repetido mais uma vez. Em seguida, o sobrenadante foi

coletado e adicionado 1 volume de álcool isopropílico, sendo então centrifugado nas

mesmas condições anteriores, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado

com 500 µL de álcool etílico a 70% e agitado vigorosamente, centrifugado por 5

minutos a 10000 x g à temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. O

precipitado foi seco em concentrador a vácuo e, em seguida, ressuspenso em 100

µL de água ultra pura autoclavada. Para a retirada de qualquer traço de RNA da

amostra, foi adicionado 3 µL de RNAse (10 mg/mL) e incubado por 1 hora a 37 ºC. O

material foi então quantificado por espectrofotometria (NanoDrop 2000 – Thermo

Scientific) e armazenado a -20 °C até o uso.

3.3.8. Sequenciamento completo do gene de inibidor de E. velutina

O sequenciamento dos plasmídeos foi feito utilizando o aparelho ABI 3130xl

da Applied Biosystems para confirmação saequência de recEvCI. Os iniciadores

utilizados foram M13 Fw e M13 Rv (Life Technologies).

3.3.9. Clonagem e Expressão do inibidor de quimotripsina em E. coli

3.3.9.1. Clonagem do gene em pCR2.1

Para a expressão do gene de EvCI foi necessária a adição de caudas de

histidina e sítios para endonucleases aos insertos a serem analisados. Isso foi feito

por meio de uma Reação em Cadeia da Polimerase, utilizando como molde o cDNA

produzido e os iniciadores descritos no item 4.3, e o inserto obtido por PCR foi ligado

ao vetor de clonagem. O produto desta reação foi então purificado utilizando Kit de

Purificação de produtos de PCR (QIAGEN). Os insertos purificados foram ligados ao

vetor de clonagem pCR 2.1 e, em seguida, a linhagem de E. coli OMNIMAX foi

utilizada na transformação por choque térmico como descrito no item 4.9. A nova

clonagem foi confirmada por PCR utilizando os iniciadores específicos

EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr . Foi feita digestão da construção EvCI/pCR2.1-2

pelas enzimas EcoRV e Hind III, como descrito pelo fabricante (Invitrogen) e a

purificação do gene foi feita por eletroeluição (item 4.3.9.2).

48

3.3.9.2. Eletroeluição de DNA a partir de fragmentos de gel de agarose

Os passos seguidos para eluição de bandas do DNA de interesse a partir de

excisão de gel de agarose foram feitos como estabelecido por Sambrook et al.

(1989) com adaptações.

O fragmento do gel de agarose foi colocado em uma membrana de diálise

(cut off 3,5 kDa) com uma quantidade de tampão TBE (Tris-HCl 89 mM, Ácido bórico

89 mM e EDTA 89 mM pH 8,3) suficiente para submergir o gel. A membrana foi

colocada em cuba de eletroforese horizontal e a saída das amostras de DNA do gel

para o tampão foi acompanhada pela visualização do brometo de etídio ligado ao

DNA. Em seguida, o líquido foi transferido para microtubos de 1,5 mL, foi adicionada

uma solução de Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1), a mistura foi agitada

vigorosamente e centrifugada a 10000 x g por 15 segundos à temperatura ambiente.

A fase aquosa foi removida e o procedimento repetido 2 vezes. Em seguida, foi

adicionado 1/10 do volume total de Tampão acetato de Sódio 3 M pH 5 e o material

foi agitado. Foram adicionados 2,5 volumes de Etanol a 4 °C, novamente agitado e

incubado à -20 °C por 16 horas. O material foi centrifugado a 16000 x g por 30

minutos a 4 ºC, o sobrenadante foi descartado e etanol a 70% foi adicionado e uma

nova etapa de centrifugação foi realizada. O sobrenadante foi completamente

removido e descartado e após evaporação o DNA foi ressuspenso em água ultra-

pura estéril.

3.3.9.3. Ligação do inserto ao vetor de expressão pET32a

Após a liberação do fragmento correspondente à recEvCI do vetor de

clonagem, foi feita ligação ao vetor de expressão pET 32a (Figura 6), que também

foi submetido à digestão pelas endonucleases EcoRV e Hind III. A construção

EvCI/pET32a foi inserida na linhagem de E. coli BL21 DE3 pLyss (Promega)

utilizando a técnica de eletroporação (eletroporador - BioRad) e foi observado

crescimento de células transformadas. O DNA plasmidial das colônias foi extraído,

como descrito no item 4.7, foi feita PCR (Item 4.4) e a confirmação da transformação

foi realizada por sequenciamento, sendo a proteína denominada recEvCI. A

expressão neste vetor permite a fusão da proteína de interesse com a tiorredoxina,

49

uma proteína que possui atividades antioxidativa e redutora, além de aumentar a

solubilidade no meio citoplasmático bacteriano.

Figura 7: Vetor de expressão pEt 32a.

3.3.9.4. Expressão do inibidor de quimotripsina em pET32a

A expressão da proteína de interesse foi feita em meio Luria-Bertani estéril

(LB) (Extrato de levedura 0,5%, triptona 1% e Cloreto de Sódio 0,5%) com adição

dos antibióticos Ampicilina (Amp) e Cloranfenicol (CAT), com concentrações finais

de 0,1 mg/mL e 0,025 mg/mL, respectivamente. Previamente à expressão, foi

preparado um pré-inóculo com 30 mL de meio LB adicionado de células de E. coli

transformadas com a construção EvCI/pEt32a; este material foi incubado por 16

horas a 37 ºC sob agitação constante (150 rpm). Decorrido o tempo de incubação, o

pré-inóculo foi adicionado ao meio LB para expressão, deixado sob agitação em

temperatura igual ao passo anterior, até atingir uma absorbância em

espectrofotômetro entre 0.6 e 0.7, à densidade óptica de 600 nm, sendo então uma

alíquota retirada e denominada de não-induzido, Em seguida, foi adicionado

isopropil β-D-1-tiogalactopiranoídeo (IPTG – concentração final de 1 mM) para

50

induzir a expressão por meio da ativação do promotor lac, e, após 4 horas sob

temperatura e agitação constantes, o volume total de meio foi centrifugado a 10000

x g durante 10 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado

solubilizado em Tampão Fosfato de Sódio 20 mM e Cloreto de Sódio 500 mM pH

7,4, em seguida, foi submetido à digestão por Lisozima (concentração final 0,1

mg/mL) por 1 hora a 37 ºC, sonicação e, por último, centrifugação durante 5 minutos

a 4ºC em rotação de 10000 x g. O precipitado foi descartado e o sobrenadante

utilizado nos passos posteriores de purificação do inibidor de quimotripsina

recombinante.

Para verificação da atividade da proteína, ensaios com o material expresso

foram feitos, de acordo com a metodologia descrita no item 4.14.1.

3.3.9.5. Cromatografia de afinidade de Níquel HisTrap FF crude

Após a expressão, o sobrenadante (fração solúvel) proveniente do material

submetido à sonicação foi aplicado em coluna HisTrap FF crude (GE Healthcare) de

5 mL. As moléculas não aderidas à coluna foram eluídas com Tampão Fosfato de

Sódio 20 mM e Cloreto de Sódio 500 mM pH 7,4, o material retido, mas inespecífico,

foi retirado com uma solução de Imidazol a 100 mM e as frações que obtiveram

inibição foram eluídas com Imidazol a 200 mM. O material retido foi dialisado contra

Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e submetido a ensaios de inibição como descrito

posteriormente, para confirmação da presença do inibidor.

3.3.9.6. Liberação da proteína de fusão Tiorredoxina

A proteína de fusão Tiorredoxina (Trx) foi separada da proteína de interesse

por digestão utilizando Trombina, uma protease que apresenta apenas um sítio de

clivagem (ExPASY – PeptideCutter) na estrutura do inibidor fusionado à Tiorredoxina

(EvCI+Trx), deduzida a partir da sequência nucleotídica. O protocolo seguido foi de

acordo com as instruções do fabricante, com modificações. O material foi incubado

em diferentes concentrações de trombina e EvCI+Trx, obtendo uma proporção de

1:20 w/w (trombina:recEvCI). Após o estabelecimento destas condições, a

temperatura do ensaio também foi estabelecida, 37 ºC, por 30 minutos. Os

resultados foram acompanhados por SDS-PAGE.

51

3.3.9.7. Purificação de recEvCI

Após o estabelecimento das condições de clivagem para a retirada da

tiorredoxina, o produto foi aplicado em coluna de afinidade Quimotripsina/Sepharose

4B (GE Healthcare). As frações retidas foram eluídas com HCl 5 mM e submetido a

ensaio de inibição, como descrito posteriormente, para confirmação da atividade

inibitória, obtendo o inibidor de quimotripsina recombinante purificado, sendo

nomeado recEvCI.

3.3.10. Quantificação de proteínas

As proteínas foram quantificadas pelo método do ácido bicinconínico (BCA),

seguindo as instruções do fabricante (Thermo-Scientific), utilizando albumina sérica

bovina (Sigma Aldrich) como padrão.

3.3.11. Análise do inibidor recombinante

3.3.11.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

A metodologia desenvolvida por Laemmli (1970) foi utilizada para caracterizar

o perfil eletroforético das amostras em todos os passos de purificação do inibidor. O

gel de separação a 15% foi preparado com 3,75 ml de acrilamida-bisacrilamida

30%; 1,950 ml de tampão Tris-HCl 1,5M pH 8,8; água destilada (1,8 ml), 75 l de

SDS 10%; 3,75 l de TEMED concentrado e 37,5 l de solução de persulfato de

amônio 30%. O gel de concentração continha 0,495 ml de acrilamida-bisacrilamida

30%; 938 l de tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 2.250 ml de água destilada; 37,5 l de

SDS 10%; 3,75 l de TEMED concentrado e 18,75 l de persulfato de amônio 30%.

A corrida foi feita em sistema de eletroforese vertical miniVE (GE Healthcare). As

amostras foram misturadas com tampão de amostra (azul de bromofenol 0,002%,

SDS 2% e sacarose 10%). A solução corante foi preparada contendo Azul de

Coomassie R-250 (Sigma-Aldrich) a 1%, metanol 40%, ácido acético 10% em água

destilada.

52

3.3.11.2. Sequenciamento de recEvCI

Para obtenção da sequência do inibidor, uma solução deste foi submetida à

tripsinização em gel. A hidrólise foi realizada em gel de poliacrilamida a 12% de

acordo com protocolo estabelecido por Shevchenko (1996). As bandas proteicas do

gel após processo de coloração com azul de coomassie foram excisadas e

transferidas para tubo de microcentrifuga (BioRad). O corante foi retirado do gel

após três lavagens com solução de etanol a 30% até descorar completamente,

seguida de mais uma lavagem com solução de acetonitrila 50% e 25 mM de

bicarbonato de amônio por 15 minutos, sendo retirados e acetonitrila foi adicionada e

o gel foi incubado por 10 min sob agitação vigorosa. Após esta etapa o gel foi seco

em concentrador a vácuo por 20 min, sendo, em seguida, adicionada solução de

tripsina (33 ng/µL) em volume suficiente para cobrir o gel e foi mantido em banho de

gelo por 30 min. Um volume de 40µL de solução de bicarbonato de amônio a 50 mM

foi adicionado e depois o material foi incubado por 19 horas a 37 ºC.

Os peptídeos gerados por hidrólise enzimática foram liofilizados e misturados

com uma solução de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (5 mg em 250 µL de

acetonitrila, 200 µL de água ultrapura e 50 µL de solução aquosa de ácido

trifluoroacético a 3%) em proporção de 1/3 (v/v), depositadas em uma placa do tipo

Anchorchip (Bruker Daltonics, Bilerica, EUA) e cristalizadas à temperatura ambiente.

Os fragmentos foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do

tipo MALDI-TOF/TOF em espectrômetro Ultraflex III (Bruker Daltonics, Billerica,

EUA). A estrutura primária dos peptídeos foi interpretada por sequenciamento de

novo dos espectros obtidos nas análises de MS/MS, com fragmentação conduzida

pela metodologia LIFT-TM (SUCKAU et al., 2003).

As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com sequências de

inibidores de quimotripsina depositadas no banco de dados do NCBI (National

Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov), usando BLASTp

(ALTSCHUL et al., 1997). Em seguida, as que apresentaram maior identidade com o

recEvCI foram alinhadas com outros inibidores no programa computacional BioEdit

v. 7.0.9.0, por meio da ferramenta ClustalW (THOMPSON et al., 1994).

53

3.3.11.3. Preparo da solução de azocaseína 1% - Substrato

Azocaseína a 1% foi preparada pesando-se 1 g de azocaseína que foi

dissolvido em 100 mL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e fervido até completa

solubilização. Após resfriamento, o volume foi completado com água destilada. A

solução foi conservada no congelador até sua utilização.

3.3.11.4. Atividade anti-quimotripsina

Para determinar a atividade do inibidor de quimotripsina recombinante

ensaios de inibição de quimotripsina foram feitos. A atividade inibitória das amostras

foi determinada pré-incubando em tubos de hemólise alíquotas de 5 µL de uma

solução de quimotripsina (0,5 mg/mL em Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 – Sigma

Aldrich) com 50 µL da amostra e tampão Tris-HCI 50 mM CaCl2 20 mM, pH 7,5 para

completar um volume de 500 µL, a 37 °C por 15 minutos. Em seguida, foram

adicionadas alíquotas de 200 µL de solução de azocaseína como substrato a 1%.

Após 30 minutos da adição de azocaseína, a reação foi interrompida pela adição de

300 µL de solução de ácido tricloroacético (TCA - Vetec) a 20%. Decorridos 5

minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g por

10 minutos. Dos sobrenadantes obtidos após centrifugação, foram retiradas alíquota

de 500 µL e adicionados 500 µL de Hidróxido de Sódio 2 N. A atividade

azocaseinolítica foi medida pela absorbância dos peptídeos diazotizados produzida

a 440 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata e provas em branco foram

feitas. Uma unidade de atividade inibitória (UI) foi definida como a quantidade de

inibidor que diminui a atividade do substrato em 0,01 (Xavier-Filho, 1989).

3.3.11.5. Atividade anti-tripsina

A atividade anti-tríptica foi determinada utilizando BApNA como substrato.

Alíquotas de 8 µL de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em tampão Tris-HCl 50

mM, pH 7,5 – Sigma Aldrich) foram pré-incubadas, por 10 minutos a 37 ºC, com 120

µL de HCl 2,5 mM, 375 µL de tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5 e 50 µL das amostras

(20 µg). Após esse período a reação foi iniciada adicionando-se 500 µL do substrato

– BapNA (N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida. A reação prosseguiu por mais 15

54

minutos nas mesmas condições de incubação, sendo interrompida adicionando-se

120 µL de ácido acético 30%. A formação de p-nitroanilida foi monitorada em

espectrofotômetro a 405 nm. Controles foram realizados e os ensaios foram feitos

em triplicata. Os resultados foram expressos em UI (unidades de inibição) por

miligrama de proteína (Xavier-Filho, 1989).

3.3.11.6. Atividade anti-elastase

A atividade inibitória para elastase foi avaliada pela pré-incubação de 60 µL

dessa enzima, com de 735 µL de PBS, pH 7,4 e 20 µL contendo 20 µg de inibidor

por 10 minutos a 37 ºC. A reação foi iniciada após adição de 50 µL de solução de

susbtrato de N-metoxi-succinil-Ala-Ala-ProVal-4-nitroanilida - SAAVNA a 5mM

(STEIN, 1983). O tempo de reação do ensaio foi de 1 hora, a 37 ºC. A reação foi

interrompida com a adição de 120 µL de solução aquosa de ácido acético 30%. A

formação de 4-nitroanilida foi monitorada a 405 nm. Os ensaios foram realizados em

triplicata, foram conduzidos três experimentos independentes e provas em branco

foram realizadas como controle.

3.3.11.7. Estabilidade térmica

A avaliação da manutenção da atividade inibitória de recEvCI em diferentes

temperaturas foi feita após alíquotas do inibidor, contendo 20 µg, serem incubadas

durante 30 minutos em diferentes temperaturas: 20 ºC, 37 ºC e 100 ºC. Decorrido o

tempo de incubação, as amostras foram resfriadas a 4 °C até o uso. Provas em

branco foram realizadas. Os ensaios foram feitos em triplicata de acordo com o item

4.3.11.4.

3.3.11.8. Estabilidade em diferentes pHs

A estabilidade estrutural de recEvCI após tratamento em diferentes pHs foi

feita como descrito a seguir. Alíquotas do inibidor (20 µg) foram incubadas em

diferentes tampões com valores de pH diferentes, durante 16 horas. Os tampões

utilizados no ensaio foram Glicina-HCl 100 mM pH 2, Acetato de Sódio 50 mM pH 5,

55

Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e pH 9 e Glicina-NaOH 100 mM pH 12. Após esse período,

as amostras foram transferidas para tampão de ensaio Tris-HCl 50 mM CaCl2 20 mM

pH 7,5 durante 16 horas. Alíquotas do inibidor foram utilizadas nos ensaios de

inibição contra quimotripsina, como descrito no item 4.3.11.4.

3.3.11.9. Estabilidade na presença do agente redutor DTT

Para avaliar a estabilidade do inibidor de quimotripsina recombinante de

sementes de E. veluntina (recEvCI) na presença de agente redutor seguiu-se a

metodologia adaptada por CRUZ et al. (2013), onde alíquotas de inibidor (20 µg)

foram incubadas a 37 °C em solução de DTT em uma concentração final de 100 mM

por 60 minutos. A reação foi parada pela adição de iodoacetamida, na quantidade

duas vezes superior à concentração final de DTT. Após o período de incubação, a

mistura foi submetida ao ensaio de atividade anti-quimotríptica. Os estudos para

avaliação da estabilidade de recEvCI na presença de DTT foram realizados em

triplicata (item 4.3.11.4.), com provas em branco e acompanhados por controle sem

DTT.

3.3.12. Ensaios Biológicos

A análise da ação de recEvCI sobre células foi feita por meio de avaliação de

ensaios de viabilidade celular.

3.3.12.1. Cultura de células

Linhagem 3T3 (Fibroblasto de camundongo): As células foram cultivadas em

meio de cultura DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, a 37 ºC, em

atmosfera úmida de 5% de CO2. Em seguida foram semeadas em microplacas de

cultivo de 96 poços (5 x 103 células/mL por poço), incubadas por um período de 72

horas com concentrações de recEvCI que variaram de 0,03 a 30 μg/mL.

Linhagem de Macrófagos: Os macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram utilizados

em ensaios de avaliação de atividade microbicida. Foram mantidas em meio DMEM

suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, nas mesmas condições da linhagem

3T3. O número de células por poço foi de 2,4x104 alocadas em uma placa de 96

56

poços por 24 horas para sedimentação das células. Os testes foram feitos utilizando

diferentes concentrações de recEvCI (0,1; 0,3; 1; 3 e 10 μg/mL), por 24 horas, na

ausência e na presença de Lipopolissacarídeo (adicionado após 1 hora do início do

teste) a uma concentração final de 100 ng/mL (Sigma).

3.3.12.2. Ensaio de viabilidade celular - MTT

A viabilidade de células 3T3 e macrófagos foi determinada pelo teste de

redução enzimática do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil brometo de

tetrazolina (MTT) em formazam, pela ação de desidrogenases mitocondriais. Após o

período de tratamento de 72 horas com as diferentes concentrações das amostras,

as células foram incubadas em meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 3

horas e posteriormente lavadas com etanol por 5 minutos para solubilização do

formazan. A determinação da viabilidade celular foi obtida pela leitura das

absorbâncias das amostras a 570 nm (MOSMANN, 1983).

3.3.12.3. Atividade anticoagulante in vitro

O plasma utilizado nos testes de atividade anticoagulante foi obtido a partir de

doação de voluntários saudáveis. O sangue após a coleta foi misturado com citrato

de sódio a 3,8%, na proporção de 9:1 de citrato de sódio (v/v), em seguida o material

foi centrifugado por 3000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. O plasma foi

removido e congelado até o momento de utilização. Para os testes de APTT e PT foi

utilizado kit e foram seguidas as instruções do fabricante (Wiener Lab Group). Os

ensaios foram realizados em tubos fornecidos pelo fabricante.

APTT (Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada): Este ensaio avalia o

tempo de formação do coágulo pela via intrínseca. Para isso, diferentes quantidades

de recEvCI (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1,5; 3,0 e 6,0 µg) foram diluídas em tampão PBS

150 mM, pH 7,4. Plasma humano citratado (90 µL) foi misturado com 10 µL de cada

solução de recEvCI. Heparina, nas mesmas condições do inibidor, foi usada como

controle positivo. Para controle negativo, tampão PBS 150 mM, pH 7,4 foi

adicionado ao plasma. Posteriormente, adicionou-se 100 µL de cefalina (substituta

dos fosfolipídios plaquetários – necessários para a formação do coágulo) à mistura e

incubado por 3 minutos a 37ºC, decorrido este tempo adicionou-se cloreto de cálcio

57

(CaCl2) 0,025 M e o tempo de coagulação foi determinado em coagulômetro

CLOTimer (MedLab). Todos os pontos foram realizados em triplicata.

PT (Tempo de Protrombina): Este teste mede o tempo de coagulação pela

via extrínseca. Foram utilizadas as mesmas concentrações de recEvCI e heparina

do APTT, assim como também foram aplicados os mesmo controles positivo e

negativo. Decorrido o tempo de incubação de 3 minutos a 37 ºC adicionou-se 200 µL

de tromboplastina cálcica de cérebro de coelho (ativadora do fator VII) pré-aquecida

a 37 ºC e o tempo necessário para a coagulação foi determinado em coagulômetro

automático CLOTimer (MedLab). Todos os pontos foram realizados em triplicata.

3.3.12.4. Avaliação da produção de óxido nítrico por macrófagos

A dosagem indireta de óxido nítrico foi feita pela relação de nitrito e nitrato em

solução. Os ensaios foram feitos em placas de 96 poços utilizando o kit

Nitrate/Nitrite colorimetric assay (Cayman Chemical Company) e foram seguidas as

instruções do fabricante. Foram adicionados 80 µL de amostra, juntamente com 200

µL de tampão de reação, 10 µL de cofator e 10 µL da enzima Nitrato redutase. A

mistura foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Após este período, o

reagente de Griess foi adicionado, o material foi novamente incubado por 10 minutos

e em seguida lido a 540 nm. O ensaio foi feito em triplicata.

3.3.12.5. Avaliação da produção de TNF-α e IL-6 por macrófagos

A quantificação das citocinas foi feito por ELISA (Enzyme Linked Immuno

Sorbent Assay) utilizando o kit produzido por BD Bioscience e foram seguidas as

instruções do fabricante.

3.3.13. Análises Estatísticas

Todos os dados representam pelo menos três experimentos independentes e

foram expressos com média ± DP (Desvio Padrão). As diferenças entre os grupos

foram comparadas pelo teste ANOVA e pelo teste de Tukey. Foram consideradas

diferenças significativas quando o valor de p foi inferior a 0,05.

58

4. RESULTADOS

4.1. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL, SÍNTESE DE cDNA, CLONAGEM E

EXPRESSÃO DE UM INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE E. velutina

4.1.1. Extração de RNA total de semente de mulungu

A figura 8 mostra o gel de agarose a 1% referente à extração de RNA total de

semente de E. velutina. Na linha 2 podem ser observadas 3 bandas referentes às

subunidades 28S, 18S e 5S de RNA ribossômico de eucariotos.

Figura 8: Extração de RNA total de semente de E. velutina.

Gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. RNA total extraído de sementes imaturas de E. velutina pelo método Fenol-Clorofórmio.

4.1.2. Reação da Polimerase em Cadeia para amplificação do gene de

interesse, Clonagem e Sequenciamento

4.1.2.1. Amplificação do gene de interesse por PCR

A figura 9 corresponde ao gel dos produtos de PCR para amplificação do

gene de interese. Na linha 2 da são observados os produtos de PCR quando o

molde da reação foi cDNA (reação 1), enquanto que na linha 3, a banda em

destaque corresponde ao produto da segunda reação, que teve como molde os

produtos da reação 1. O numero de nucleotídeos da banda na linha 2,

aproximadamente 500 bp, corresponde ao gene de EvCI.

2

3S 1

6S

5

S

28S 18S

5S

59

Figura 9: Produtos de PCR das reações para amplificação do gene de interesse.

Gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. Linha 1: Marcador 1kb Plus DNA Ladder Invitrogen. Linha 2: Produto de PCR da reação 1 - Inib_Quimtrp_Fw X Inib_Quimtrp_Rv1. Linha 3: Produto de PCR da reação 2 - Ev_AP X Inib_QuimTrp_Rv2.

4.1.2.2. Ligação do inserto EvCI ao vetor pCR2.1 e clonagem de células

de E. coli OMNIMAX

O processo de ligação do inserto ao vetor de clonagem foi confirmado por

PCR e por sequenciamento da construção EvCI/pCR2.1. Após a PCR, foram

verificadas no gel bandas em todas as colônias com tamanhos correspondentes ao

inserto (Figura 10).

Figura 10: Produtos de PCR das reações feitas a partir de colônias de E. coli transformadas com EvCI/pCR2.1.

Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. PCR de colônias de E. coli transformadas com o vetor de clonagem pCR2.1, utilizando os primers Ev_AP X Inib_QuimTrp_Rv2. Linha 1: Marcador 1kb Plus DNA Ladder Invitrogen. Linhas 2 a 11: Colônias de E. coli transformadas com EvCI/pCR2.1.

1 2 ----------------------------------------------------- 11

1 2 3

100bp

200bp

300bp

400bp

500bp

650bp

850bp

1000bp

1650bp

2000bp

650bp

100bp

500bp

1650bp

2000bp

60

O resultado do sequenciamento mostrou que o inserto correspondia a um

inibidor de quimotripsina, pois foi estabelecida uma relação de 96% de identidade

com o inibidor de quimotripsina de Erythrina variegata (ECI), depositada no banco de

dados “GenBank” do “National Center for Biotechnology Information” – NCBI, código

de acesso P34952.1 GI:462388, quando analisado pela ferramente BLASTx. Os

aminoácidos que não coincidiram foram destacados (Figura 11), foi observada

susbtituição de 11 aminoácidos. Na figura 11, em amarelo ocorreu susbstituição por

aminoácidos de classes diferentes e em verde a substituição ocorreu com

aminoácidos de uma mesma classe.

Figura 11: Análise de sequenciamento por BLASTx para o Inibidor de Quimotripsina recombinante de E. velutina (EvCI)

Comparação da sequêncoa de recEvCI com a sequência depositada do Inibidor de Quimotripsina de Erythrina variegata (ECI). Aminoácidos diferentes foram destacados: em amarelo- susbstituição por aminoácidos de classes diferentes. Em verde- substituição por aminoácidos de uma mesma classe.

4.1.3. Clonagem e Expressão de recEvCI em Escherichia coli

4.1.3.1. Ligação do gene de EvCI ao vetor de clonagem pCR2.1.

Para a segunda etapa de clonagem foram utilizados os iniciadores

EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr, que foram desenhados tendo como base o

resultado obtido no sequenciamento (fig 11). A construção EvCI/pCr2.1-2 foi

submetida à digestão pelas endonucleases EcoRV e HindIII, que flanqueavam a

região do inserto obtendo-se uma banda correspondente ao vetor linearizado e a

segunda banda correspondente ao inserto liberado, com tamanho aproximado de

600bp (Figura 12). Este aumento no tamanho do gene EvCI, quando comparado à

banda obtida observada na figura 10 é referente à adição dos sítios das

recEvCI 1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA 180

ECI 1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA 60

recEvCI 181 SQFLSTVIPDGSTVALGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDMKFKFQK 360

ECI 61 SQFLSTFIPDGSPYAIGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDTKFKFQK 120

recEvCI 361 VSSSNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIHRDARGNRRLVVTNNNPLQLVLVKANSPSQ 537

ECI 121 VSSPNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIRRDAKGYRRLVVTNDNPLELVLVKANSPSQ 179

61

endonucleases e à cauda de histidina. A digestão do vetor de expressão pET32a foi

feita com as mesmas endonucleases utilizadas previamente. Em seguida foi feita a

ligação do gene de EvCI ao vetor pET 32a utilizando a metodologia indicada pelo

fabricante.

Figura 12: Digestão da construção EvCI/pCR2.1-2

Digestão da construção EvCI/pCR2.1-2 com as endonuceases EcoRV e HindIII durante 16 horas a 37 ºC, em banho-maria. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio.. Linha 1: Marcador 100bp DNA Ladder Invitrogen. Linha 2: EvCI/pCR2.1-2 digeridos com as endonucleases EcoRV e HindIII para liberação do gene de EvCI.

4.1.3.2. Transformação de células de E. coli BL21 DE3 pLyss

O DNA plasmidial das colônias transformadas com EvCI/pET32a resistentes

(antibióticos Amp/CAT) foram submetidas à PCR. Dentre as 16 colônias obtidas, 11

possuíam sequências que amplificaram em PCR, quando utilizados os iniciadores

EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr, e tamanho das bandas foi de aproximadamente

550bp, como apresentado na Figura 13

Figura 13: Produto de PCR de DNA plasmidial de células transformadas com EvCI/pEt32a

Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. PCR feita utilizando os iniciadores EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr. Linha 1: Marcador 1kb Plus DNA Ladder Invitrogen. Linhas: 2 a 16: DNA plasmidial de colônias de E. coli transformadas. As bandas em destaque indicam a presença da banda correspondente ao gene do inibidor de quimotripsina de mulungu.

1 2

pCR2.1

Gene de EvCI

1

100bp

600bp

100bp

600bp

62

4.1.3.3. Expressão do inibidor de quimotripsina recombinante – recEvCI

A figura 14 mostra o perfil de eluição do sobrenadante da expressão pós-lise

celular utilizando diferentes concentrações de imidazol (50, 100, 200, 300 e 400

mM). Foi aplicado na coluna uma quantidade total de proteínas de 213 mg. A

liberação do inibidor foi acompanhada por leitura em espectrofotômetro a 280nm e

confirmada por meio de ensaios de inibição contra quimotripsina utilizando

azocaseína 1% como substrato. As frações correspondentes ao pico eluído com 200

mM de imidazol mostraram inibição de 71%. As setas indicam o momento onde

houve troca das soluções de lavagem.

Figura 14: Perfil de eluição de recEvCI, de coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude.

Aplicado na coluna de afinidade de Níquel 213 mg de proteínas totais após lise celular bacteriana. O perfil de eluição foi determinando utilizando diferentes concentrações de Imidazol (50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM e 400 mM). Em azul: Perfil cromatógráfico acompanhado a uma leitura de 280 nm em espectrofotômetro. Em vermelho: Taxa de inibição de quimotripsina avaliado por ensaio in vitro.

Estabelecidas as condições eluição, tendi sido aplicado na coluna 198 mg de

proteínas totais, as repetições posteriores desta metodologia foram feitas com a

retirada de proteínas contaminantes com Imidazol 100 mM, seguida pela retirada da

proteína de interesse com 200 mM de Imidazol em solução aquosa as quais

obtiveram inibição de 68% de quimotripsina (Figura 15).

63

Figura 15: Coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude.

Eluição de proteínas ligadas à coluna de afinidade de níquel Histrap FF crude. Foi aplicado uma quantidade de proteínas de aproximadamente 198 mg. A eluição do material retido foi feita com soluções de Imidazol - 100mM e 200mM. Em azul: Perfil cromatógráfico acompanhado a uma leitura de 280 nm em espectrofotômetro. Em vermelho: Taxa de inibição de quimotripsina avaliado por ensaio in vitro.

4.1.3.4. Purificação do inibidor de quimotripsina recombinante – recEvCI

As frações retidas na coluna de Níquel que apresentaram atividade inibitória

foram dialisadas, concentradas e submetidas à digestão com trombina. Este

procedimento de clivagem por trombina permite a separação do inibidor

recombinante da tiorredoxina, que foi expressa fusionada à proteína de intresse. O

produto deste evento foi aplicado em coluna de afinidade de quimotripsina-

sepharose (7,3 mg de proteínas retidas em coluna de níquel) para captura do

inibidor recombinante. A figura 16 representa o perfil cromatográfico do material

digerido. O pico obtido após lavagem da coluna com solução aquosa de HCl 5mM

mostrou de 100% atividade inibitória contra quimotripsina nas frações 13 a 17.

64

Figura 16: Perfil de eluição de recEvCI em coluna de quimotripsina-sepharose 4B CnBr- ativada.

Foi Aplicado na coluna 7,3 mg de proteínas provenientes das frações retidas e eluídas com 200 mM de imidazol da coluna de Níquel. A eluição foi feita com HCl 5 mM. Em vermelho: Perfil cromatógráfico acompanhado a uma leitura de 280 nm em espectrofotômetro. Em azul: Taxa de inibição de quimotripsina avaliado por ensaio in vitro.

A confirmação da purificação de recEvCI foi feita por SDS-PAGE (figura 17),

que mostra os passos que levaram ao completo isolamento do inibidor, como

tamanho aproximado de 17 kDa.

Figura 17: SDS-PAGE 15% revelado com nitrato de prata.

Foi aplicado 15 µg de proteínas, aproximadamente, para todas as amostras. Linha 1: Não Induzido.

Linha 2: Induzido após 4 horas. Linha 3: Retido em coluna de níquel. Linha 4: retido em coluna de quimotripsina. Linha 5: Marcador de massa molecular – 10 kDa, 15 kDa, 25 kDa, 35 kDa, 40 kDa, 55 kDa, 70 kDa, 100 kDa, 130 kDa, 170 kDa (PageRuler Prestained Protein Ladder – ThermoScientific).

1 2 3 4 5

recEvCI

HCl 5mM

15kDa

35kDa

65

4.1.3.5. Sequeciamento de recEvCI

Foram identificados 19 resíduos de aminoácido após o sequenciamento de

recEvCI, destacados na figura 18. Quando comparada com a sequência do inibidor

de quimotripsina de E. variegata, todos os resíduos identificados coincidem.

Figura 18. Sequência proteica de recEvCI.

Análise do sequenciamento de recEvCI e comparação com a sequÇencia de ECI depositada em banco de dados

5.1.3.6. Atividade de recEvCI contra diferentes proteases serínicas

Para determinar a atividade de recEvCI contra tripsina e elastase ensaios de

inibição foram feitos utilizando BapNA e SAAVNA como substratos,

respectivamente. Não foi detectada inibição de recEvCI quando testado com tripsina,

e o inibido reduziu a atividade de elastase em 81% (Tabela 4).

Tabela 4: Atividade inibitória de recEvCI contra proteases serínicas

Protease Inibição em %

Tripsina ND*

Elastase 81%

* Não detectada

4.2. AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE recEvCI EM DIFERENTES

CONDIÇÕES DESNATURANTES.

4.2.1. Estabilidades térmica de recEvCI em diferentes pHs e após

tratamento com DTT

Para avaliar a estabilidade da atividade inibitória em condições desnaturantes,

alíquotas de recEvCI foram submetidas a tratamentos com diferentes pHs,

recEvCI 1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA 180

ECI 1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA 60

recEvCI 181 SQFLSTVIPDGSTVALGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDMKFKFQK 360

ECI 61 SQFLSTFIPDGSPYAIGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDTKFKFQK 120

recEvCI 361 VSSSNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIHRDARGNRRLVVTNNNPLQLVLVKANSPSQ 537

ECI 121 VSSPNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIRRDAKGYRRLVVTNDNPLELVLVKANSPSQ 179

66

temperaturas e incubação com DTT. Para análise de estabilidade em variados pHs

alíquotas do inibidor foram incubadas nos seguintes tampões: Glicina-HCl 100 mM

pH 2, Acetato de Sódio 50 mM pH 5 e pH 9 e Glicina-NaOH 100 mM pH 12, a qual

foi comprovada seguidas de ensaios de inibição contra quimotripsina, onde não

verificou-se redução na ação do inibidor, comprovando sua alta estabilidade em

diferentes pHs. O tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 foi utilizado como controle (Figura

19A).

Não foi observada alteração na atividade inibitória de recEvCI contra

quimotripsina quando submetido a tratamento prévio com 100 mM de DTT. O

controle foi feito sem adição de DTT (Figura 19B).

A estabilidade térmica de recEvCI foi observada após prévia incubação do

inibidor a 20°C e 100°C durante 30 minutos. Houve redução da atividade inibitória

em ambas as temperaturas testadas, obtendo-se 12% e 2%, respectivamente

(Figura 19C).

Figura 19. Estabilidade de recEvCI em condições desnaturantes, testados contra quimotripsina

Estabilidade de recEvCI avaliada após ensaios de inibição contra quimotripsina utilizando azocaseína 1% como substrato. A: Estabilidade após incubação por 16 horas em diferentes pHs. B: Estabilidade após incubação com 100mM de DTT por 30 min. C: Estabilidade térmica de recEvCI após incubação por 30 min nas temperaturas testadas.

A

B

C

67

4.3. ENSAIOS BIOLÓGICOS

4.3.1. Atividade anticoagulante

O efeito anticoagulante do inibidor recombinante de quimotripsina, recEvCI,

foi avaliado buscando elucidar qual via de ativação da coagulação poderia ser

afetada pela ação de revEvCI. Para isso foram realizados os testes APTT e PT que

são específicos para as vias intrínseca e extrínseca, respectivamente. Como

observado na figura 20 A, recEvCI foi capaz de aumentar em aproximadamente 2,5

vezes o tempo de coagulação para APTT, de maneira dose-dependente, quando

comparado ao controle negativo feito com PBS, atingindo tempo máximo de 80

segundos. Entretanto, o mesmo efeito não foi observado para a via extrínseca da

coagulação (Figura 20 B).

Figura 20: Efeito de recEvCI no prolongamento do tempo de formação de coágulo pelos testes ApTT (via intrínseca) e PT (via extrínseca).

Os testes foram feitos utilizando kit para avaliação do tempo de coagulação fabricado por Wienr Lab. A: Efeito de recEvCI na via intrínseca – APTT. B: Efeito de recEvCI na via extrínseca – PT.

4.3.2. Avaliação de citotoxicidade para linhagem de células normais –

3T3

Atividade citotóxica de recEvCI foi avaliada em diferentes concentrações do

inibidor e testada em células 3T3 de fibroblasto de camundongo e macrófagos RAW

264.7. A influência de LPS foi avaliada para macrófagos. Para a linhagem normal

3T3 foi observado que não há efeito negativo exercido pelo inibidor em nenhuma

das concentrações testadas, havendo, um aumento na atividade mitocondrial

A

B

68

detectada por MTT, indicando um possível efeito mitogênico em células normais,

independente da dose (Figura 21).

Figura 21: Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de células normais (3T3)

As células foram incubadas com diferentes concentrações de recEvCI por 72 horas de incubação e avaliadas por MTT.

Quando diferentes concentrações de recEvCI foram incubadas com

macrófagos, tanto na ausência quanto na presença de LPS (ativador de

macrófagos), não houve redução na viabilidade das células, como pode ser

observado nas figura 22. Foi observado um aumento da viabilidade na ausência de

LPS em todas as concentrações de recEvCI, exceto com 0,1 µg/mL, que não teve

diferença significativa em relação ao controle positivo feito com PBS. Na presença

de LPS, em comparação ao resultado anterior, foi detectada redução, mas que ainda

não diferiu do controle positivo.

69

Figura 22: Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de macrófagos

Viabilidade de macrófagos da linhagem RAW 264.7, avaliada por MTT, quando as células foram incubadas com recEvCI em diferentes concentrações na ausência e presença de LPS, durante 24 horas. C: Controle PBS. Testes contendo * ou ** diferem estatisticamente do Controle positivo pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

4.3.3. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de óxido nítrico por

macrófagos

A produção de NO induzida por recEvCI foi avaliada pela quantificação de

nitrito/nitrato produzidos pelos macrófagos incubados com diferentes concentrações

da proteína recombinante. Na ausência de LPS, em todas as concentrações, houve

aumento na produção de NO, indicando a ativação dos macrófagos (Figura 23A). Na

presença de LPS, as concentrações de 0,1; 0,3; 1 e 3 µg/mL reduziram sutilmente,

mas de maneira significativa, a liberação de NO, entretanto este mesmo efeito não

foi observado para a concentração de 10 µg/mL (Figura 23B).

70

Figura 23: Quantificação da produção de nitrito/nitrato em macrófagos RAW 264.7 induzida por diferentes concentrações de recEvCI.

A – Quantificação da produção de Nitrito/nitrato em macrófagos na ausência de LPS quando submetido por 24 horas à incubação com recEvCi em diferentes concentrações. B - Quantificação da produção de Nitrito/nitrato em macrófagos na presença de LPS. Testes contendo * diferem estatisticamente do Controle positivo referente ao LPS 100ng/mL pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

4.3.4. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de TNF-α e IL-6

Quando recEvCi foi testado para avaliação da liberação de TNF-α e IL-6 foi

visto que a proteína recombinante não teve efeito relacionado à IL-6 enquanto

aumentou a produção de TNF-α, tanto na ausência de LPS quanto na presença. No

ensaio sem adição de LPS foi observado um aumento dependente da dose (Figura

24A), enquanto que na presença de LPS as concentrações de 0,3 µg, 1 µg e 3 µg

potencializaram o efeito do lipopolissacarídeo bacteriano (Figura 24 B).

A

B

71

Figura 24. Produção de TNF-α por macrófagos

Quantificação por ELISA de citocinas produzidas por macrófagos quando LPS não foi adicionado ao ensaio (A) e após adição de LPS (B).

A B

72

5. DISCUSSÃO

As proteinases serínicas são enzimas amplamente distribuídas e

desempenham importantes funções em diferentes organismos, tanto na manutenção

da homeostase quanto no desenvolvimento de diversas patologias, como fibrose

cística (GIFFORD; CHALMERS, 2014), metástase (KOBLINSKI; AHRAM E

SLOANE, 2000), crescimento tumoral (KOOP et al., 1994) e na infecção por

protozoários (SIBLEY, 2013). Dessa forma, inibidores de proteases poderiam agir

como ferramentas alternativas no tratamento destas doenças, como vem sendo

estudado (BIJINA et al., 2011), além de suas já estabelecidas atividades inseticidas

(MACEDO; FREIRE, 2011) e, mais recentemente, como conservante para alimentos

de origem marinha (BIJINA et al., 2011). Entretanto, o baixo rendimento na

purificação de inibidores diretamente da planta é um fator limitante na utilização

heteróloga destas proteínas, portanto, a expressão é uma ferramenta útil pois

produz uma quantidade maior de proteínas, e mesmo estas sendo recombinantes,

mantêm as mesmas funções da proteína natural (CHOI et al., 2006).

Inibidores de quimotripsina vêm sendo estudados e apresentaram uma ampla

variedade de aplicações, seja inseticida, adaptativa em plantas ou farmacológica. A

ação inseticida de inibidores se baseia na redução da assimilação de nutrientes por

meio da redução da atividade proteolítica podendo causar a morte do inseto, como

observado nos resultados obtidos por Pereira et al. (2007) quando testaram um

inibidor de quimotripsina contra H. hampei, enquanto Soares et al. (2013)

identificaram um inibidor de quimotripsina com atividade negativa sobre Aedes

aegypti e Bhattacharyya et al. (2007) que purificaram um inibidor bifuncional (tripsina

e quimotripsina) com atividade contra enzimas digestivas de S. litura in vitro. Por

outro lado, na planta, foi detectada a intervenção de um inibidor de quimotripsina

como resposta adaptativa a diferentes tipos de estresses abióticos (MOSOLOV;

VALUEVA, 2011) como, por exemplo, à seca (HUANG; XIAO; XIONG, 2007).

No presente estudo, um inibidor de quimotripsina de E. velutina (recEvCI) foi

clonado e sua expressão heteróloga foi induzida em E. coli. Após sua purificação,

recEvCI inibiu quimotripsina em 100% e elastase neutrofílica em 81%, testes de

avaliação de atividade anticoagulante e ação no processo microbicida foram feitos,

indicando que o inibidor recombinante aumenta o tempo de formação de coágulo

73

atuando especificamente na via extrínseca, e exerce influência no processo de

ativação de macrófagos.

A clonagem do inibidor foi feita tendo como molde a sequência do inibidor de

quimotripsina de E. variegata, o que se mostrou eficaz, sendo comprovada a

semelhança após o sequenciamento do vetor de clonagem, que indicou 96% de

identidade entre as proteínas. Segundo a literatura há ampla conservação entre as

classes de inibidores do tipo Kunitz, principalmente na região P1 envolvida na

ligação com a enzima alvo (IWANAGA et al., 2005; KHAMRUI et al., 2005), havendo

também conservação entre inibidores do gênero Erythrina (IWANAGA; YAMASAKI;

KIMURA, 1998; SONG; SUH, 1998).

A expressão de revEvCI foi feita no vetor pET32a, que conecta a expressão

da proteína de interesse com uma proteína que possui atividade redutora, a

tiorredoxina (Trx). Para a retirada da Trx fusionada foi feita digestão da proteína

expressa com trombina, obtendo-se o inibidor de quimotripsina de E. velutina

recombinante, recEvCI. A tiorredoxina é encontrada em diferentes organismos,

desde bactérias (LILLIG et al., 1999) a plantas e mamíferos. Em plantas, a

tiorredoxina atua na regulação da fotossíntese (BUCHANAN, 1991), enquanto que

em mamíferos desempenha diferentes funções como a ativação de fatores de

transcrição (SCHENK et al., 1994), impedindo a apoptose (SAITOH et al., 1998) e

atuando de forma semelhante à citocinas (NAKAMURA; NAKAMURA; YODOI, 1997)

e quimioatraentes de neutrófilos no processo inflamatório (BERTINI et al., 1999).

Uma das principais funções desta enzima é impedir a formação de agregados

causados por interações dissulfeto entre proteínas citosólicas (LILLIG et al., 1999).

A estrutura primária de recEvCI e a confirmação da sua integridade após

digestão por trombina foi determinada por MALDI-TOF/TOF, que é uma técnica

amplamente utilizada no sequenciamento de proteínas (HARDOUIN, 2007; CANTÚ

et al., 2008). Este resultado mostrou que o inibidor de quimotripsina recombinante de

E. velutina, mesmo após digestão enzimática, mantém tanto a integridade de sua

sequência primária quanto as características do inibidor de quimotripsina natural,

EvCI, que foi caracterizado por Monteiro (2011). Além de apresentar grande taxa de

similaridade com a sequência proteica de ECI (KIMURA; KOUZUMA; YAMASAKI,

1993).

A verificação da especificidade de recEvCI por outras proteases serínicas foi

feita por meio de ensaios de inibição utilizando tripsina e elastase como enzimas-

74

alvo. recEvCI não reduziu a atividade proteolítica de tripsina, quando avaliada a

degradação de azocaseína, enquanto obteve uma taxa de inibição de 81% contra

elastase neutrofílica, utilizando o substrato sintético específico. Uma importante

característica de inibidores do tipo Kunitz é a capacidade destas proteínas de

possuírem mais de uma enzima-alvo, como foi observado em Cajanus cajan

(inibição de tripsina e quimotripsina) (HAQ; KHAN, 2003), para CbTI (inibidor de

tripsina e quimotripsina de Caesalpinia bonduc) (BHATTACHARYYA; RAI; BABU,

2007), para PmTKI (inibidor de tripsina, quimotripsina e papaína de Piptadenia

moniliformis) (CRUZ et al., 2013), PdKI-4 (inibidor de tripsina e quimotripsina de P.

dumosum) (RUFINO et al., 2013), para rusvikunin (proteína de Daboia russelii

russelii que inibe tripsina e plasmina) (MUKHERJEE; MACKESSY; DUTTA, 2014).

A inibição de elastase neutrofílica também já foi observada para outros

inibidores como EvCI e EvTI que inibiram HNE in vitro e também reduziram a

resposta inflamatória em modelo de sepse (MONTEIRO, 2011; MACHADO et al.,

2013), assim como um inibidor do tipo Bowman-Birk que reduziu drasticamente a

atividade desta enzima (ROCCO et al., 2011) e CeEI, proveniente de Caesalpinia

echinata, que inibiu a atividade elastásica in vitro e reduziu os efeitos inflamatórios

de zymosan quando administrado em pulmões de ratos (CRUZ-SILVA et al., 2013)

Inibidores de protease do tipo Kunitz são descritos na literatura como

proteínas resistentes quando submetidas a condições desnaturantes como variação

de temperatura, de pH e tratamento com agentes redutores, como ditiotreitol (DTT)

ou 2-mercaptoetanol, sendo, provavelmente, a presença de pontes dissulfeto a

responsável por esta estabilidade (MELLO et al., 2001).

Quando submetido a variações de pH e incubação com o agente redutor DTT,

recEvCI manteve sua atividade inibitória, não diferindo do controle. A estabilidade

conformacional da proteína recombinante após incubação em diferentes pHs foi em

concordância com outros inibidores de quimotripsina descritos (BHATTACHARYYA;

BABU, 2009; LAM; NG, 2010; PRASAD; DUTTA-GUPTA; PADMASREE, 2010). Os

resultados obtidos após o tratamento de recEvCI com 100 mM de DTT por 30

minutos indicam que o inibidor não é dependente de pontes dissulfeto, para

realização de sua atividade, apesar da presença de 4 resíduos de cisteína em sua

sequência, o que corrobora os resultados do mesmo teste realizado com o inibidor

natural (VARELA, 2010), assim como para o inibidor de quimotripsina de

Schizolobium parahyba (SOUZA et al., 2000), enquanto que o inibidor PFTI teve sua

75

atividade reduzida em 50% quando tratado com 1mM de DTT por 15 minutos

(RAMOS et al., 2008). Estes resultados indicam que recEvCI é uma proteína estável

quando submetida a condições desfavoráveis à sua atividade ótima.

Em relação à estabilidade térmica, recEvCI teve sua atividade reduzida, a

20ºC (12%) e 100ºC (2%), em relação ao controle, 37ºC. Os inibidores de tripsina de

Dimorphandra mollis (DMTI-II) (MELLO et al., 2001) e de Inga laurina (ILTI)

(MACEDO et al., 2007) também sofreram redução em sua atividade inibitória quando

testada a estabilidade térmica, divergindo do observado para o inibidor de

quimotripsina de Vigna mungo, que se manteve estável até 80ºC (PRASAD; DUTTA-

GUPTA; PADMASREE, 2010).

Após a purificação e determinação das características físico-químicas de

recEvCI, foram avaliadas possíveis aplicações farmacológicas da proteína, como

uma atividade anticoagulante e efeito microbicida.

A cascata de coagulação é um processo que envolve a ativação de diversos

zimogênios, em sua grande parte, serinoproteases, que levam à formação do

coágulo e fim da hemorragia, e é dividido em três vias, a via intrínseca, ou via de

contato, a via extrínseca e a via comum. Disfunções em algum ponto das vias de

coagulação podem levar ao surgimento de diversas doenças, especialmente as

hemofilias e trombofilias. Diversas proteínas vegetais têm sido estudadas devido ao

efeito anticoagulante ou indutor da formação de coágulo, como o inibidor LITI que

atua sobre tripsina, quimotripsina, plasmina e calicreína (OLIVA et al., 2000); CTI

que inibe fatores da via intrínseca (Fator XIIa) (YAU et al., 2012); cMol, uma lectina

de Moringa oleifera, que atua tanto sobre a via intrínseca quanto a via extrínseca

(ANDRADE et al., 2013). Sampaio et al. (1996) investigou a ação de inibidores das

famílias Kunitz e Bowman-Birk e observou que todos os inibidores tipo Kunitz

testados exerceram atividade inibitória contra calicreína plasmática. recEvCI, que

pertence a esta família de inibidores, aumentou o tempo de formação de coágulo

quando utilizando o teste APTT, que avalia a via intrínseca, e não teve efeito sobre a

via extrínseca. Resultados semelhantes foram encontrados para o inibidor natural,

EvCI (MONTEIRO, 2011) e para outros inibidores de quimotripsina de plantas

(LAZZA et al., 2010; SAMPAIO et al., 1996), e apresentou um tempo maior do que o

observado para LITI, que foi de 60 seg utilizando o dobro da quantidade de proteína

(OLIVA et al., 2000) e AaTI que foi de 50 seg (WATANABE et al., 2010).

76

Estudos demonstraram que a inativação do fator XII não impede a formação

do coágulo (FURIE; FURIE, 2012), indicando que a principal função da via intrínseca

é amplificar os processos de formação do coágulo (NORRIS, 2003). Inibidores de

tripsina e quimotripsina de E. variegata foram testados para as vias intrínseca e

extrínseca e apenas os inibidores de tripsina prolongaram a coagulação em ambas

as vias, diferente do inibidor de quimotripsina, que não teve efeito neste processo

(NAKAGAKI et al., 1996). Apesar da semelhança estrutural observada no

sequenciamento de recEvCI e ECI, estas proteínas mostraram resultados opostos

para APTT, onde recEvCI aumentou o tempo de coagulação, podendo ser utilizado

em estudos que avaliem o seu efeito em doenças relacionadas à via intrínseca de

coagulação, como regulação da pressão sanguínea e fibrinólise (NORRIS, 2003).

A heparina de origem suína e bovina, um importante carboidrato

anticoagulante, é amplamente utilizada na inibição da formação de

tromboembolismo venoso apesar de resultados comprovarem que esta molécula

causa diversos efeitos colaterais como processos hemorrágicos, reações alérgicas e

problemas ósseos, este último também observado no tratamento com varfarina em

ratos (MORISHIMA et al., 2013; WALENGA; BICK, 1998), portanto, a descoberta de

moléculas alternativas que possam substituir esta atual abordagem é de grande

importância.

Os processos de coagulação e inflamação estão relacionados por diferentes

eventos (HARTMAN; FRISHMAN, 2014), por meio do fator XII, por exemplo, que

ativa neutrófilos e regula a liberação de citocinas (NORRIS, 2003), ou após dano

tecidual que ativa a cascata de coagulação para a formação do coágulo e promove a

diapedese (KOZIK et al., 1998) assim como células endoteliais ativadas e plaquetas,

que estão ativamente envolvidas na inflamação aguda e crônica. Estas células

podem liberar mediadores pró-inflamatórios, expor moléculas de adesão e

receptores, produzir fatores de coagulação e recrutar leucócitos (WU; CHEN, 2014).

Os sinais cardiais da inflamação, calor, dor, edema e vermelhidão, estão

intrinsicamente associados com vasodilatação e migração de leucócitos para o local

de origem da inflamação (ALESSANDRI et al., 2013). Se não for controlada pode

levar a danos teciduais e agravar doenças crônicas, como fibrose cística (GIFFORD;

CHALMERS, 2014), asma (CHUNG, 2012), câncer, doenças degenerativas e

autoimunes (NATHAN; DING, 2010).

77

Neste trabalho, o efeito de recEvCI foi avaliado em relação ao processo de

ativação de macrófagos in vitro por meio de dosagem de metabólitos de óxido nítrico

e a viabilidade das células foi verificada por MTT. Quando recEvCi foi incubado em

diferentes concentrações com células de fibroblasto de camundongos (3T3) não foi

observado efeito citotóxico em nenhum concentração testada, pelo contrário, foi

visto um aumento na viabilidade das células. A avaliação da viabilidade de

macrófagos na presença de recEvCI, assim como, com de LPS, indicou que, na

ausência do ativador (LPS) as células apresentaram um aumento na conversão de

MTT em formazan, em relação aos controle positivo nas concentrações de 1, 3 e 10

µg/mL, não havendo efeito citotóxico em qualquer concentração testada. Também

não foi observado citotoxicidade quando LPS foi adicionado. A quantificação da

viabilidade celular de macrófagos feita por MTT foi primeiramente verificada por

Ferrari, Fornasiero e Isetta (1990).

A avaliação do efeito de recEvCI sobre a ativação de macrófagos, produção

de óxido nítrico, TNF-α e IL-6 foi feito e foi visto que na ausência de LPS houve uma

significativa ativação de macrófagos em todas as concentrações testadas, quando

comparado ao controle negativo. Por outro lado, na presença do lipopolissacarídeo,

as concentrações 0,1; 0,3; 1 e 3 µg/mL, reduziram significativamente a conversão de

MTT, quando comparado ao controle com LPS, indicando que atuam na inibição da

produção de óxido nítrico, consequentemente, na ativação de macrófagos.

O aumento na ativação de macrófagos e, por sua vez, aumento na liberação

de óxido nítrico, é umas das vias que ativam o sistema imunológico (LI et al., 2012).

A produção de óxido nítrico é feita após ativação do fator de transcrição NF-κB na

presença de LPS, que irá induzir a síntese de iNOS (DIAO et al., 2014). Em trabalho

realizado por Xiong et al. (2013), a presença de um polissacarídeo de

Cipangopaludina chinensis atua como imunoestimulador, podendo ser utilizado em

indivíduos imunossuprimidos, como em tratamento quimioterápicos. A mesma ação

ativadora poderia ser útil em conjunto com vacinas anti-virais, como por exemplo,

uma vacina anti-HIV, aumentando a possibilidade de reconhecimento do agente viral

pelos receptores Toll de macrófagos (PERDIGUERO et al., 2013). Entretanto, Sinha

et al., (2013) observaram que a interação de NO liberado com um receptor celular,

aumenta a resistência de células cancerígenas ao tratamento quimioterápico de

células provenientes de melanoma. Esses resultados indicam que a aplicação de

78

diferentes moléculas ativadoras do sistema imunológico deve ser estudada visando

uma aplicação específica.

A ação microbicida, quantificada pela dosagem de metabólitos de NO,

observada para recEvCI na presença de LPS pode ser atribuída a diferentes

mecanismos. Diao et al. (2014) propuseram duas vias alternativas, ambas ativadas

pela ligação do antígeno EPS ao receptor TLR 4, que culminam na ativação de

iNOS. Lee et al. (2009) investigaram o efeito de uma lignana que inibe a síntese de

NO e TNF-α inibindo a ação de NF-κB na ativação gênica. Uma outra via de ativação

de iNOS foi observada pela produção de glutationa, um importante agente

antioxidante, na presença de LPS (BUCHMULLER-ROUILLER et al., 1995).

Foi observado que recEvCI potencializa a liberação d TNF- α, e não interfere

na produção de IL-6. A indução da ativação de macrófagos e monócitos por LPS

envolve a produção de mediadores pró-inflamatórios incluindo TNF- α, interleucina-

1β (IL-1β), IL-6 e óxido nítrico. A regulação da liberação destes mediadores é um

importante alvo para o tratamento de várias doenças inflamatórias (DIAO et al.,

2014).

O tratamento com anti-inflamatórios está associado à ocorrência de efeitos

colaterais. Um dos mais utilizados inibidores da inflamação é o inibidor de

ciclooxigenases (1 e 2), enzimas associadas à síntese de prostaglandinas

(DINARELLO, 2010). Apesar de ser um efetivo anti-inflamatório, os inibidores destas

enzimas podem causar problemas gastrointestinais e renais (SÜLEYMAN;

DEMIRCAN; KARAGÖZ, 2007), assim como podem inibir a ativação de plaquetas na

coagulação (DINARELLO, 2010). Tem sido descrito na literatura o efeito de diversas

proteínas vegetais na modulação do processo inflamatório (AKLA; PRATT; ANNABI,

2012; ALENCAR et al., 2010; BATISTA et al., 2012; LEE et al., 2009), podendo

recEvCI ser uma abordagem alternativa no combate a patógenos ou na modulação

da inflamação.

Em resumo, o inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina recombinante,

recEvCI, reduziu as atividades enzimáticas de quimotripsina e elastase neutrofílica,

demonstrou alta estabilidade quando submetido a condições desnaturantes e

redutoras, aumentou o tempo de coagulação pela via intrínseca e não demonstrou

citotoxicidade para células normais, assim como também não afetou a viabilidade de

macrófagos, tendo demonstrado uma possível ação microbicida, ativando estas

células, ou protetora, reduzindo a produção de óxido nítrico por macrófagos

79

ativados. Portanto, recEvCI pode ser utilizado como uma nova ferramenta na

biotecnologia, para isso, experimentos adicionais precisam ser feitos.

80

6. CONCLUSÃO

Um inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina, denominado recEvCI, foi

clonado e expresso em Escherichia coli. recEvCI teve suas atividades

multifuncionais avaliadas. O inibidor recombinante se mostrou ativo contra

quimotripsina e elastase neutrofílica, demonstrando alta estabilidade estrutural em

relação ao pH e desnaturação de pontes dissulfeto, preservando as atividades

apresentadas pelo inibidor natural de quimotripsina de E. velutina – EvCI. recEvCI

também apresentou massa molecular semelhante ao inibidor natural EvCI de

aproximadamente 17 kDa. Não foi observada citotoxicidade (para células normais

3T3 e macrófagos) e possui atividades anticoagulante e pró-inflamatória em modelos

in vitro. Portanto, a obtenção do inibidor recombinante representa um importante

passo para torná-lo um candidato no desenvolvimento de fármacos que atuem em

doenças relacionadas aos processos de coagulação e inflamação.

81

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