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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

ANDERSON FELIPE JÁCOME DE FRANÇA

UMA PROTEÍNA DE SEMENTES DE Lachesiodendron viridiflorum: UMA ALTERNATIVA PARA COMBATE DE

AGENTES MICROBIANOS E CÉLULAS TUMORAIS

NATAL-RN

2018

ANDERSON FELIPE JÁCOME DE FRANÇA

PROTEÍNA GLOBULÍNICA DE SEMENTES DE Lachesiodendron

viridiflorum: UMA ALTERNATIVA PARA COMBATE DE AGENTES MICROBIANOS E CÉLULAS TUMORAIS

Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica e Biologia Molecular. Orientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos.

NATAL-RN 2018

FICHA CATALOGRÁFICA

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Dedico esta obra

A todos que entraram na minha vida. À minha esposa, Isabelli, minha

inseparável parceira nesta longa jornada.

À minha filha, Linda.

Ao meu filho, Darwin

E aos meus pais e minha irmã, Elenilson, Helena e Andreilly, que

sempre me apoiaram em tudo.

AGRADECIMENTOS

Aprendi que devemos sempre agradecer por tudo que acontece em nossas vidas, nunca sabemos o que Deus tem pra nos dar, mas

Ele conhece nossos corações, nossos medos e nossas necessidades.

Considerando esta dissertação como resultado de uma caminhada

que não começou na UFRN, agradecer pode não ser tarefa fácil, nem justa. Para não correr o risco da injustiça, agradeço de

antemão a todos que de alguma forma passaram pela minha vida e contribuíram para a construção de quem sou hoje.

E agradeço, particularmente, a algumas pessoas pela

contribuição direta e indireta na construção deste trabalho:

Ao professor Elizeu Antunes, pela discussão teórica nas disciplinas que subsidiaram novas reflexões e construções em

minha prática pedagógica. Por ter sido companheiro na orientação desta tese, nas recorrentes "discussões" que

travávamos dentro e fora dos laboratórios e principalmente, por me mostrar na prática que os alunos se desenvolvem mais e

melhor quando são valorizados.

A todos os professores do programa de pós-graduação em Bioquímica, pelo estímulo acadêmico e pela valorização

cultural que atribuem ao processo pedagógico. Pela convivência que se construiu para além dos espaços das salas de aula da

universidade.

A todos os AMIGOS e AMIGAS que de alguma forma fizeram parte deste trabalho de forma profissional e/ou pessoal. Agradeço a Yago e Gabi por tudo.

Aos funcionários do departamento de Bioquímica.

Ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), pela aquisição das sementes

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos

(FINEP), Banco do Nordeste (BNB) e Fundo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNDECI) que contribuíram com

recursos financeiros para a realização deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pelo apoio financeiro.

O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são. Aristóteles

PROTEÍNA GLOBULÍNICA DE SEMENTES DE Lachesiodendron viridiflorum: UMA ALTERNATIVA PARA COMBATE DE AGENTES MICROBIANOS E CÉLULAS

TUMORAIS

RESUMO

Sementes são reservatórios de moléculas com grande potencial para a obtenção de bioprodutos e por este motivo uma especial atenção tem sido direcionada na busca de proteínas bioativas com ação antimetabólica e outras propriedades farmacológicas. Algumas sementes apresentam proteínas e peptídeos que, sozinhos, desempenham múltiplas funções tais como interações com membranas de bactérias causando disrupção, atividade fungicida e antitumoral, recrutamento de macrófagos e neutrófilos (uma ação definida como imunomodulação) e atividade hemolítica. Neste trabalho, uma prospecção de proteínas com atividade multifuncional foi realizada em extratos de sementes de quatro espécies da família Fabaceae: Senna spectabilis (Cássia-do-nordeste), Anadenanthera colubrina (Angico), Adenanthera pavonina (Carolina) e Lachesiodendron viridiflorum (Jurema-Juquiri). Os extratos foram testados com relação à presença de atividades antitríptica, antipapaínica, hemaglutinante, hemolítica e citotoxicidade sobre linhagem de célula não tumoral e, dentre eles, se destacou o extrato de L. viridiflorum, cuja proteína denominada LvP foi purificada e escolhida para os estudos posteriores. Quando analisada por SDS-PAGE, LvP apresentou uma massa molecular de aproximadamente 17 kDa, com atividades hemolítica e citotóxica para células mononucleares. Não apresentou atividade tóxica para a linhagem celular 3T3, entretanto, em baixas concentrações, LvP foi capaz de afetar a viabilidade celular das linhagens tumorais HeLa, Hep G2, HT29, B16, A-375 e A2058. LvP também foi deletéria para os fungos Candida albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata e C. parapsilosis. Todavia, quando testada contra as bactérias patogênicas Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Staphylococcus aureus resistente à meticilina - MRSA, nenhuma atividade bactericida foi detectada. Quando a LvP foi associada aos antibióticos de referência, e testada novamente contra as bactérias, ela foi capaz de reduzir o CIM do antibiótico em até uma diluição para todas as três espécies, caracterizando assim uma atividade sinérgica da proteína. Baseado nos dados obtidos, a LvP isolada corresponde a uma estrutura proteica multifuncional, e suas propriedades antitumoral, antimicrobiana, fungicida e bactericida precisam ser investigadas com mais detalhes para que seu potencial biotecnológico seja melhor avaliado.

Palavras-chave: Lachesiodendron viridiflorum, proteínas multifuncionais, proteínas promíscuas.

GLOBULINAL PROTEIN OF SEEDS OF Lachesodendron viridiforum: AN ALTERNATIVE FOR COMBATING MICROBIAL AGENTS AND TUMOR CELLS

ABSTRACT Seeds are reservoirs of molecules with great potential for obtaining bioproducts and because of this, a special attention has been directed in the search of bioactive proteins with antimetabolic action and other pharmacological properties. Some seeds present proteins and peptides that play by themselves, multiple roles, such as bactericidal, fungicidal, antitumor, immunomodulatory and hemolytic activities. In this work, a prospection of proteins with multifunctional activities was carried out in seeds extracts from four Fabaceae species: Senna spectabilis (Cassia-do-northeast), Anadenanthera colubrina (Angico), Adenanthera pavonina (Carolina) and Lachesiodendron viridiflorum (Jurema-Juquiri). The extracts were tested for antitriptic, antipapainic, haemagglutinating, hemolytic and cytotoxic on non-tumour cell line activities, highlighting, among them, the extract of L. viridiflorum, whose protein called LvP was purified and chosen for the studies later. When analyzed by SDS-PAGE, LvP had a molecular mass of approximately 17 kDa, with hemolytic and cytotoxic (for mononuclear cells) activities. Even in low concentrations, LvP was able to affect the cell viability of the HeLa, HepG2, HT29, B16, A-375 and A2058 tumor cell lines, but it did not present toxic activity to the 3T3 cell line. LvP was also deleterious for the fungi Candida albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata and C. parapsilosis. However, when tested against pathogenic bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA, no bactericidal activity was detected. When LvP was associated with the reference antibiotics, and tested again against bacteria, it was able to reduce the antibiotic MIC up to one dilution for all three species, thus characterizing a synergistic activity of the protein. Based on the data obtained, the isolated LvP corresponds to a multifunctional protein structure, and its antitumor, antimicrobial, fungicide and bactericidal properties need to be investigated in more detail so that its biotechnological potential is better assessed. Key words: Lachesiodendron viridiflorum, multifunctional proteins, promiscuous proteins.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática da multifuncionalidade das proteínas: níveis,

condições desencadeadoras, mecanismos moleculares e efeitos globais. .............. 22

Figura 2. (A) Micrografia eletrônica de transmissão do endosperma de arroz

mostrando corpos proteicos esféricos (S) e irregulares (IR). Os corpos proteicos

esféricos armazenam prolaminas e os corpos proteicos de forma irregular acumulam

glutelínas. Observe a conexão direta entre o retículo endoplasmático rugoso (ER) e

os corpos proteicos esféricos. (B) Corpos proteicos (PB) nos cotilédones de sementes

em desenvolvimento. Observe a ocorrência de depósitos de proteína (setas) dentro

dos vacúolos (V) amiloplastos grandes (A) também são vistos. .............................. 24

Figura 3. Senna spectabilis. (A) Semente com testa lisa, de cor marrom e pluerograma

sulcado. (B) Fruto câmara. (C) Inflorescência, uma panícula com brácteas lineares

com folhas compostas, paripinadas. (D) Taxonomia da planta. Fonte: Prof. Dr. Rubens

Queiroz, docente da UFPB – imagens, http://rubens-

plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Senna+spectabilis (acesso em 15/07/2018) e

NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018). ........................ 30

Figura 4. Anadenanthera colubrina. (A) e (B) sementes ovadas com valvas lisas e

brilhantes, com fruto na câmara. (C) observa-se uma Inflorescência axilar com folhas

alternas, bipinadas. (D) Taxonomia da planta. Fonte: Prof. Dr. Rubens Queiroz,

docente da UFPB – imagens, http://rubens-

plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Anadenanthera+colubrina (acesso em

15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018). . 30

Figura 5. Adenanthera pavonina. (A) semente obovada, com hilo central e testa dura

lisa, vermelha. (B) Legume típico com valvas lineares e presas a cápsula. (C) Folha

bipinada e inflorescência em botões florais e obovoides. (D) Taxonomia da planta.

Prof. Dr. Rubens Queiroz, docente da UFPB – imagens, http://rubens-

plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Adenanthera+pavonina (acesso em

15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018). .. 31

Figura 6. Lachesiodendron viridiflorum. (A) Fruto seco, semente castanha. (B)

Semente glabra com pleurograma fechado e obovada. (C) Folha composta, bipinada

e face adaxial. (D) Taxonomia da planta. Prof. Dr. Rubens Queiroz, docente da UFPB

– imagens, http://rubens-

plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Piptadenia+viridiflora (acesso em

15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018). . 31

Figura 7. Esquema de extração e fracionamento de proteínas das sementes com

acetona PA. ............................................................................................................. 35

Figura 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de S.

spectabilis (Cássia-do-nordeste). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato

Bruto; F0,5 – Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de

acetona; F2,0 – Fração com 2,0 volume de acetona; SF. – Fração do sobrenadante

final. A – Gel corado com solução de Coomassie blue coloidal; B – Gel revelado com

nitrato de prata. ....................................................................................................... 42

Figura 9. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de A.

colubrina (Angico). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato Bruto; F0,5

– Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de acetona; F2,0

– Fração com 2,0 volume de acetona; SF. – Fração do sobrenadante final. (A)

Eletroforese corado com solução de Coomassie blue coloidal; (B) Eletroforese

revelada com nitrato de prata. .................................................................................. 43

Figura 10. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de A.

pavonina (Carolina). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato Bruto; F0,5

– Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de acetona; F2,0

– Fração com 2,0 volume de acetona; SF. – Fração do sobrenadante final. (A)

Eletroforese corado com solução de Coomassie blue coloidal; (B) Eletroforese

revelada com nitrato de prata. .................................................................................. 44

Figura 11. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de L.

viridiflorum (Jurema-Juquiri). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato

Bruto; F0,5 – Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de

acetona; F2,0 – Fração com 2,0 volume de acetona; Sobre. – Fração do sobrenadante

final. (A) Eletroforese corado com solução de Coomassie blue coloidal; (B)

Eletroforese revelada com nitrato de prata. (*) por motivos desconhecidos o marcador

não acompanhou a corrida eletroforética. ............................................................... 44

Figura 12. Atividade antitríptica das frações de sementes. Sobrenadante Final S.

spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A.

pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv. ................................ 45

Figura 13. Atividade antipapaínica das frações de sementes. Sobrenadante Final S.

spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A.

pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv. ............................... 46

Figura 14. Avaliação do efeito hemolítico das frações de sementes. Sobrenadante

Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante

Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv sobre eritrócitos

humanos. Como controle negativo e positivo foram utilizados tampão fosfato salino

(PBS) e Triton X-100 1%, respectivamente. p<0,05 em relação ao controle positivo.

................................................................................................................................. 47

Figura 15. Avaliação da viabilidade celular das frações finais contra células 3T3.

Linhagem fibroblástica normal de camundongo (ATCC® número CL-173) foram

expostas por diferentes tempos (24, 48 e 72 horas) na concentração de 10,5 µg/mL

avaliadas em ensaio de MTT. p<0,05, em relação ao controle. ............................... 48

Figura 16. (A) Perfil de eluição em cromatografia de troca-iônica de SFLv. A coluna

(DEAE-Sephadex) foi previamente equilibrada com tampão tetraborato de sódio

0,02M, pH 7,5. Foram aplicados 5 mL (0,5 mg/mL) da fração. As proteínas adsorvidas

foram eluídas em gradiente Stepwise em um fluxo constante de 2 mL/min. A

absorbância foi monitorada a 280 e 216 nm. (B) M – Marcador de peso molecular; EB

– Extrato Bruto; LvP – “L. viridiflorum Proteína”. SDS-PAGE do material retido, faixa

que compreende os 10 tubos coletados, na concentração 0,5 M de NaCl denominado

LvP. (C) Eletroforese nativa da LvP. ....................................................................... 51

Figura 17. Avaliação da atividade hemolítica de LvP. Foi testado nas concentrações

de 15 -0,000007 µg/100 µL; Triton-x 100 a 1% foi utilizado como controle positivo

(100% de hemólise), enquanto a solução salina a 0,9% foi utilizada como controle

negativo (sem hemólise) do experimento. (*) P < 0,05. Os valores são expressos como

a média ± desvio padrão quando comparados ao controle positivo. ....................... 51

Figura 18 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células mononucleares do sangue

periférico humano. As células testes foram tratadas com diferentes concentrações

(10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS

(150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das

células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células

controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle. .......................................... 52

Figura 19 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células HeLa. As células teste

(linhagem celular de adenocarcinoma do colo de útero humano) foram tratadas com

diferentes concentrações de LvP (10,5 – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em

microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade

celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da

viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao

controle. .................................................................................................................. 53

Figura 20 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células Hep G2. As células Hep G2

(linhagem celular de hepatocarcinoma humano) foram tratadas com diferentes

concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas

de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A

viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em

relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle. ............. 54

Figura 21 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células HT-29. As células HT-29

(adenocarcinoma colo-retal humano) teste foram tratadas com diferentes




relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle. ............ 56

Figura 22– Efeito da LvP sobre a viabilidade das células B16-F10, linhagem celular de

melanoma de camundongo. As células teste foram tratadas com diferentes





Figura 23 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células A-375. As células A-375

(linhagem celular de melanoma maligno de espécime feminino humano) testes foram

tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e

72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo

à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como

porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em

relação ao controle. ................................................................................................. 58

Figura 24 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células A2058, linhagem celular de

melanoma maligno de espécime feminino humano. As células testes foram tratadas

com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas

em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à

viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem

da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao

controle. ................................................................................................................... 59

Figura 25 – Efeito da LvP sobre a viabilidade dos fungos C. albicans e C. dubliniensis.

As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10 µg/mL – 0,078125

µg/mL) por 48 horas em microplacas de cultura. Meio Ágar Sabouraud Dextrose - ADS

foi usado como controle positivo à viabilidade celular e o antibiótico anfotericina (1

µg/mL) como controle negativo. A viabilidade das células tratadas foi expressa como


relação ao controle................................................................................................... 60

Figura 26 – Efeito da LvP sobre a viabilidade dos fungos C. parapsilosis e C. tropicalis.

As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10 µg/mL – 0,078125

µg/mL) por 48 horas em microplacas de cultura. Meio Ágar Sabouraud Dextrose –

ADS foi usado como controle positivo à viabilidade celular e o antibiótico anfotericina

(1 µg/mL) como controle negativo. A viabilidade das células tratadas foi expressa

como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas.

*p<0,05, em relação ao controle. ............................................................................. 61

Figura 27 – Efeito da LvP sobre a viabilidade dos fungos C. glabrata e C. krusei. As

células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10 µg/mL – 0,078125

µg/mL) por 48 horas em microplacas de cultura. Meio Ágar Sabouraud Dextrose - ASD

foi usado como controle positivo à viabilidade celular e o antibiótico anfotericina (1

µg/mL) como controle negativo. A viabilidade das células tratadas foi expressa como


relação ao controle................................................................................................... 61

Figura 28. Ensaio de poço controle com os fungos. C. albicans (A), C. dubliniensis (B),

C. parapsilosis (C), C. tropicalis (D), C. glabrata (E) e C. krusei (F). Os números de 1

a 10 correspondem as concentrações testadas de 10 a 0,01953125 µg/mL

respectivamente. As placas de Petri foram identificadas com algarismo romano de um

I a V. A placa de número IV contaminou com um fungo anaeróbico. ....................... 62

Figura 29. Efeito da LvP sob o crescimento das cepas bacterianas E. coli, S. aureus e

MRSA. A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de LvP (10 a

0,01953125 µg/mL) por 24 horas em microplacas de cultura. Bactéria mais meio e

antibiótico foi usado como controle negativo, controle positivo bactéria mais meio e

controle somente para o meio (CM). O crescimento das células tratadas com LvP foi

expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05,

em relação ao controle. ............................................................................................ 63

Figura 30. Efeito da LvP + tetraciclina sob o crescimento de E. coli. A cepa teste foi

tratada com diferentes concentrações de tetraciclina (1 a 0,03906 µg/mL) e uma

concentração fixa de LvP de 20 µg/mL por 24 horas em microplacas de cultura.

Controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O

crescimento das células tratadas com LvP foi expressa como a porcentagem em


Figura 31. Efeito da LvP + tetraciclina sob o crescimento da cepa bacteriana S. aureus.

A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de tetraciclina (1 a 0,03906

µg/mL) e uma concentração fixa de LvP de 20 µg/mL por 24 horas em microplacas de

cultura. Controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O



Figura 32. Efeito da LvP + tetraciclina sob o crescimento da cepa bacteriana MRSA.

A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de tetraciclina (1 a 0,03906

µg/mL) e uma concentração fixa de LvP de 20 µg/mL por 24 horas em microplacas de

cultura. Controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O


relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle. ............ 65

LISTA DE TABELA

TABELA 1. Proteínas e/ou Peptídeos com outras atividades biológicas ................. 16

TABELA 2. Peptídeos com atividades biológicas .................................................... 21

TABELA 3. Avaliação da atividade hemaglutinante das frações de sementes.

Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc,

Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv.

(UH) – Unidade de Hemaglutinação ........................................................................ 41

TABELA 4. Resumo dos resultados experimentais das frações de sementes..

Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc,

Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv.

................................................................................................................................. 44

TABELA 5. Inibição total do crescimento das leveduras em relação ao poço controle

para todos fungos do gênero Candida testados. ..................................................... 57

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATCC The American type culture collection

IC50 Dose efetiva capaz de inibir 50 % da viabilidade celular

MIC Concentração inibitória mínima

MAP Peptídeo com múltiplas atividades

UFC Unidade formadora de colônia

BSA Albumina sérica bovina

EB Extrato Bruto

F0,5 Fração obtida com acetona equivalente a metade do volume do EB

F1,0 Fração obtida com acetona equivalente à um volume do EB

F2,0 Fração obtida com acetona equivalente à dois volumes do EB

SF Sobrenadante Final

SFSs Sobrenadante Final de Senna spectabilis

SFAc Sobrenadante Final de Anadanathera columbria

SFAp Sobrenadante Final de Adenathera pavonina

SFLv Sobrenadante Final de Lachesiodendron viridiflorum

LvP Lachesiodendron viridiflorum Proteína

Bórax Tetraborato de Sódio

NaCl Cloreto de Sódio

UH Unidade de Hemaglutinação

mg Miligrama

µL Microlitro

µg Micrograma

CMN Células Mononucleares

kDa Quilodalton

M Molar

nm Nanômetro

p:p Relação peso:peso

SDS Dodecil sulfato de sódio

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 20

1.1. Plantas, uma fonte de moléculas bioativas com potencial biotecnológico ...... 20

1.2. Proteínas e/ou Peptídeos Multifuncionais ...................................................... 21

1.3. Proteínas e/ou Peptídeos Multifuncionais em Sementes ............................... 22

1.4. Potencial Medicinal ........................................................................................ 27

2. OBJETIVO ........................................................................................................... 28

2.1. Geral.............................................................................................................. 28

2.2. Específico ...................................................................................................... 28

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 29

3.1. Material .......................................................................................................... 29

3.1.1. Equipamentos ............................................................................................. 29

3.1.2. Reagentes .................................................................................................. 29

3.1.3. Biológico ..................................................................................................... 30

3.1.3.1. Sementes ................................................................................................ 30

3.1.3.2. Sangue Humano ...................................................................................... 31

3.1.3.3. Obtenção de Células Mononucleares (CMN) de Sangue Periférico Humano ................................................................................................................ 32

3.1.3.4. Linhagens Celulares Eucarióticas ............................................................ 33

3.1.3.5. Linhagens Celulares Procariontes ........................................................... 34

3.2. Métodos ......................................................................................................... 34

3.2.1. Preparo da Farinha das Sementes ............................................................. 34

3.2.2. Preparo do Extrato Bruto das Sementes ..................................................... 34

3.2.3. Fracionamento com Acetona ...................................................................... 34

3.2.4. Quantificação das proteínas ....................................................................... 35

3.2.5. Cromatografia Líquida de troca-iônica (DEAE-Sephadex) .......................... 35

3.2.6. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida – “PAGE”, “SDS-PAGE” e revelação com nitrato de prata .............................................................................................. 36

3.2.7. Detecção de Proteínas de Defesa nas Frações .......................................... 36

3.2.7.1. Ensaios de Inibição de Atividade Enzimática ........................................... 36

3.2.7.1.1. Atividade antitríptica.............................................................................. 36

3.2.7.1.2. Atividade antipapaínica ......................................................................... 37

3.2.7.1.3. Ensaio de Hemaglutinação ................................................................... 37

3.2.7.2. Teste de Citotoxicidade Sobre Células Procarionte e Eucarionte ............ 38

3.2.7.2.1. Atividade Hemolítica ............................................................................. 38

3.2.7.2.2. Ensaio de Citotoxicidade contra Células Mononucleares ...................... 38

3.2.7.2.3. Avaliação da atividade do % de redução do MTT ................................. 39

3.2.7.2.4. Teste de Atividade Antifúngica e Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) ...................................................................................... 39

3.2.7.2.5. Teste de Atividade Bactericida e Sinergismo com antibiótico................ 40

3.2.8. Estatísticas ................................................................................................. 41

4. RESULTADO E DISCUSSÃO .............................................................................. 42

4.1. Análise eletroforética dos extratos de sementes. ........................................... 42

4.2. Prospecção de Proteínas e/ou Peptídeos Multifuncionais em Sementes da Família Fabaceae ................................................................................................. 45

4.3. Isolamento e Caracterização de Peptídeos de L. viridiflorum......................... 49

4.3.1. Cromatografia de Troca-iônica, Eletroforese e hemólise de LvP................. 49

4.4. Efeitos da LvP Sobre a Viabilidade de Células Eucariontes e Procariontes ... 52

4.4.1. Citotoxicidade da LvP para Células Mononucleares ................................... 52

4.4.2. Efeitos da LvP Sobre a Citotoxicidade em Linhagens Celulares Tumorais 53

4.4.3. Efeitos da LvP Sobre o Crescimento de Fungos Patogênicos ................... 59

4.4.4. Teste de Citotoxicidade de LvP com Bactérias Patogênicas ...................... 62

6. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 67

7. REFERÊNCIAS.................................................................................................... 68

I n t r o d u ç ã o | 20

1. INTRODUÇÃO

1.1. Plantas, uma fonte de moléculas bioativas com potencial biotecnológico

As plantas estão susceptíveis a uma ampla gama de fatores estressantes em

seu ambiente, uma vez que são organismos sésseis. Além das condições ambientais,

há também a constante ameaça de patógenos e herbívoros. Para lidar com essas

várias condições desfavoráveis, as plantas passaram por múltiplas pressões

ecológicas que propiciaram diversas adaptações evolutivas. Como consequência

disso houve uma elaboração de sofisticadas estratégias de defesa e concomitante a

isso, a síntese de uma diversidade impressionante de compostos bioativos naturais

(DANG; VAN DAMME, 2015; MAAG et al., 2015). Dentro desse arsenal metabólico de

defesa, podemos destacar a síntese de proteínas, que ajudam a planta em sua

contínua batalha pela sobrevivência (CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; DANG; VAN

DAMME, 2015).

As plantas expressam uma variedade de proteínas tóxicas que conferem

resistência contra eventuais injurias causadas por microrganismos e/ou

macrorganismo. Algumas famílias bem conhecidas de proteínas incluem as:

albuminas 2S, proteínas ricas em glicina, vicilinas, patatinas, octatinas, tarinas,

lectinas, proteases inativadoras de ribossomos (RIPs), inibidores de protease e de α-

amilase, ureases, arcelinas e peptídeos antimicrobiano (AMPs). A maioria dessas

proteínas tende a se acumular nas partes vulneráveis da planta, como sementes,

nozes e grãos; parênquima do caule das árvores e algumas raízes e tubérculos. Esses

órgãos são responsáveis pela síntese e armazenamento de proteínas, apresentando

alto teor de proteína. As proteínas armazenadoras compõem uma excelente fonte de

aminoácidos e podem ser mobilizadas e utilizadas para manutenção, defesa e

crescimento de plantas, bem como nos estágios embrionário e de desenvolvimento

(CâNDIDO et al., 2011; CARLINI; GUIMARÃES, 1981; MÜNTZ, 1998; OLSNES, 2004;

OSBORNI et al., 1988). Estudos sobre proteínas vegetais tóxicas evidenciam que a

suas nocividades estão envolvidas na defesa de plantas contra organismos fitófagos

e patógenos de origem fúngica, viral e bacteriana. Dentro do contexto das proteínas

de armazenamento, pode-se afirmar que algumas dessas proteínas apresentam

características de agentes antimicrobianos, atuando na defesa de plantas, e também

estão relacionadas à defesa contra patógenos não-relacionados, como patógenos


humanos (CâNDIDO et al., 2011; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; DANG; VAN

DAMME, 2015).

1.2. Proteínas e/ou Peptídeos Multifuncionais

A visão convencional de que proteínas e peptídeos possuem uma estrutura

absoluta e diretamente relacionada a uma única função vai de encontro com sua

capacidade de desenvolver novas funções. Considerando essa ideia expansiva, a

multifuncionalidade proteica se torna uma realidade, na qual múltiplas funções podem

estar associadas a um único peptídeo ou estruturas proteicas, vem ganhando atenção

em diversos campos de pesquisa (FRANCO, 2011; NOBELI; FAVIA; THORNTON,

2009).

A denominação de multifuncionalidade pode ser dada para determinado objeto

que realiza sozinho várias funções. No caso de proteínas e peptídeos multifuncionais

essa denominação vem sendo bastante empregada nos últimos anos para proteínas

e peptídeos que sozinhos desempenham múltiplas funções, tais como interações com

membranas de bactérias, causando disrupção, e no recrutamento de macrófagos,

neutrófilos (uma ação definida como imunomodulação). Essas múltiplas funções estão

sempre associadas com uma única estrutura tridimensional, com homólogos

semelhantes, e tem vindo a ganhar a atenção em vários campos de investigação,

incluindo a imunologia e enzimologia (FRANCO, 2011; MIGLIOLO et al., 2012;

NOBELI; FAVIA; THORNTON, 2009). Na tabela 1 são observadas algumas proteínas

e/ou peptídeos com diversas funções biológicas.

TABELA 1 Proteínas e/ou Peptídeos com outras atividades biológicas.

NOMES ESPÉCIES ATIVIDADE

HETEROLOGAS REFERÊNCIAS

Pyrularia Pyrularia pubera AB, CT, AC (EVANS et al.,

1989)

Mastoparam-X Vespula lewisii AB, CM, IM (HIRAI et al., 1979)

Defencina Phyllomedusa bicolor AB, AF, CM (MOR; NICOLAS,

1994)

Magainina-2 Xenopus laevis AB, AV, AF, AP, AC, IM (RAMOS et al.,

2012)

Octatina Oxalis tuberosa AB, AF (FLORES et al.,

2002)

Foulicidina Gallus domesticus AB, AF, AV, IM (XIAO et al., 2006)

LL-37 Homo sapiens AB, AV, AF, CM, IM (INTO et al., 2010)

Cn-AMP1 Cocos nucifera AB, AF, AF, IM (SILVA et al., 2012)


Kalata-b2 Oldenlandia affinis AB, UT, IM (MYLNE et al.,

2010)

Cr-ACP1 Cycas revoluta AB, AF, IM (MANDAL et al.,

2012)

Antibacteriana: AB; antiviral: AV; antifúngica: AF; anticâncer: AC; antiparasitária: AP; Células de mamíferos: CM; Imunomodulatória: IM; Uterotônica: UT e Citotóxica: CT.

Nobeli e colaboradores (2009) definiram que a capacidade multifuncional de

proteínas e peptídeos são manifestações que ocorrem em diferentes níveis no

constructo proteico, sendo desencadeadas por diferentes condições, e que empregam

mecanismos diferentes e provavelmente resultam em efeitos diverso, mas que estes

mecanismos estão disponíveis em qualquer nível, podendo ser desencadeados por

qualquer condições e efeitos fisiológicos (figura 1). Algumas funções alternativas

podem ser associadas da seguintes formas: um único gene (uma sequência única de

DNA); um transcrito (uma sequência única de RNA); uma única proteína (uma

sequência única de aminoácidos), proteínas homólogas próximas (alta identidade na

sequência, membros da mesma família) ou proteínas homólogas remotas (baixa

identidade na sequência, membros da mesma superfamília) na mesma espécie ou em

organismos diferentes (NOBELI; FAVIA; THORNTON, 2009).

Figura 1: Representação esquemática da multifuncionalidade das proteínas: níveis, condições desencadeadoras, mecanismos moleculares e efeitos globais. Fonte: Nobeli et al., 2009. Adaptado.

1.3. Proteínas e/ou Peptídeos Multifuncionais em Sementes


As plantas são uma importante fonte de diversas moléculas com potencial

farmacológico. Elas produzem proteínas e peptídeos como um mecanismo de defesa

natural, que pode ser expresso constitutivamente ou induzido em resposta a um

ataque de patógeno em todos os órgãos. Eles possuem uma abundância de

transcritos, por um único gene, que portanto, requerem menor biomassa e consumo

de energia, nas diferentes espécies de plantas, podendo representar até 3% do

repertório de genes de plantas. A eficiência depende de várias características da

proteína ou peptídeo, incluindo massa molecular, sequência, carga, conformação,

estruturas secundárias e terciárias, presença ou ausência de ligações dissulfeto e

hidrofobicidade (CâNDIDO et al., 2011; GUZMÁN-RODRÍGUEZ et al., 2015; JEAN-

FRANÇOIS et al., 2008; LAY; ANDERSON, 2005; SILVERSTEIN et al., 2007; STOTZ;

THOMSON; WANG, 2009; WANG; LI; WANG, 2009).

As proteínas armazenadas nas sementes, acumulam-se significativamente

durante o desenvolvimento, cuja função principal é atuar como reserva de nitrogênio,

carbono e enxofre, uma das principais características das são seus níveis elevados.

Essas proteínas se acumulam dentro de organelas ligadas à membrana, chamadas

de corpos proteicos (figura 2). A compartimentalização dessas proteínas no interior

corpos proteicos, garante que essas estruturas se mantenham separadas dos

compartimentos metabólicos da célula, sendo recrutadas somente quando

necessárias (KRISHNAN; COE, 2001).

As principais atividades biológicas das proteínas e/ou peptídeos produzidos por

plantas são antifúngicos, antibacterianos e contra insetos herbívoros. Além disso,

também exibem atividades inibitórias enzimáticas e têm papéis na tolerância a metais

pesados, estresse abiótico e desenvolvimento. Com alguns, apresentando atividade

citotóxica contra células de mamíferos e/ou atividade anticancerígena contra células

de câncer de diferentes origens. Nos vegetais, podemos destacar três famílias de

moléculas de origem proteica que contêm membros com propriedades citotóxicas e

anticancerígenas, as defensinas, as tioninas e os ciclotídeos (ALLEN et al., 2007;

BARBOSA PELEGRINI et al., 2011; CARRASCO et al., 1981; GERLACH et al., 2010;

GUZMÁN-RODRÍGUEZ et al., 2015; HE et al., 2011; JOHANSSON et al., 2003;

KOIKE et al., 2002; LI et al., 2002; MIROUZE et al., 2006; MISHRA et al., 2014; NGAI;

NG, 2004; STOTZ; WALLER; WANG, 2013).


Figura 2. (A) Micrografia eletrônica de transmissão do endosperma de arroz mostrando corpos proteicos esféricos (S) e irregulares (IR). Os corpos proteicos esféricos armazenam prolaminas e os corpos proteicos de forma irregular acumulam glutelínas. Observe a conexão direta entre o retículo endoplasmático rugoso (ER) e os corpos proteicos esféricos. (B) Corpos proteicos (PB) nos cotilédones de sementes em desenvolvimento. Observe a ocorrência de depósitos de proteína (setas) dentro dos vacúolos (V) amiloplastos grandes (A) também são vistos. Fonte: Krishnan & Coe, 2001. Adaptado.

Tradicionalmente, as proteínas das sementes são classificadas em quatro

grupos com base nas suas propriedades de solubilidade. Proteínas solúveis em água

são conhecidas como albuminas, em soluções salinas como globulinas, em soluções

alcoólicas como prolaminas, e em meio ácido ou alcalino como glutelínas. Embora

essa classificação não seja absoluta, uma vez que um grupo de proteínas pode ser

solúvel em mais de um solvente, ela ainda fornece um método conveniente para

agrupar proteínas de sementes em diferentes classes. Atualmente, as proteínas

armazenadas em sementes são classificadas com base na função e nas relações

moleculares/bioquímicas. Com base na sua função, as proteínas das sementes são

classificadas como proteínas de armazenamento, estruturais-metabólicas e de

defesa. Essas proteínas de defesa desempenham um papel no fornecimento de

resistência contra pragas, dessecação e patógenos (KRISHNAN; COE, 2001).

A multifuncionalidade de proteínas e/ou peptídeos é relativamente comum, nos

quais uma única alteração estrutural tem poder de gerar múltiplas funções. Como

exemplo, podemos descrever a família de defensinas isoladas de Vigna unguiculata,

nas quais diferentes formas homólogas desses peptídeos podem ter ação antifúngica,

antibacteriana e de inibidores enzimáticos. Dados semelhantes foram obtidos com

peptídeos ciclotídeos que mostram múltiplas atividades. Algumas espécies de plantas

das famílias Violaceae e Rubiaceae são capazes de sintetizar mais de cem peptídeos

cíclicos, de múltiplas funções. Existem relatos similares, encontrados para o complexo

formador de mirosinases de alta massa molecular, que correspondente à faixa entre,


250-1000 kDa, com atividade antibacteriana e antifúngica (CâNDIDO et al., 2014;

CARVALHO; GOMES, 2009; CRAIK, 2010; WEERDEN; ANDERSON, 2012;

WEIDMANN; CRAIK, 2016).

Dentro da composição proteica defensiva das sementes podemos destacar: as

Defensinas, esse peptídeo mostrou-se com atividade multifuncional. Existe uma

diversidade de atividades biológicas descrita para essa família, que incluem atividades

antifúngicas e antibacterianas, além de atividades inibidoras de proteinase ou amilase

classicamente. Em Cp-tionina II, obtida de Vigna unguiculata, popularmente

conhecido como feijão-macáçar, foi avaliada contra bactérias Gram-positivas e

negativas, revelando uma atividades bactericidas excelente contra Staphylococcus

aureus, Escherichia coli e Pseudomonas syringae (FRANCO et al., 2006). O peptídeo

antifúngico e antibacteriano Lunatusina, isolado de Phaseolus lunatus, também inibiu

a proliferação das células epiteliais de glândula mamária de humano (MCF-7) e a

tradução de células reticulares de coelho, e reduziu a atividade da transcriptase

reversa em HIV-1. Mostrando assim a multifuncionalidade deste peptídeo (GUZMÁN-

RODRÍGUEZ et al., 2015; WONG; NG, 2005) (Tabela 2).

Outra família de peptídeos que apresentou várias atividades biológicas são as

Tioninas. Foram descobertas em 1940 enquanto procuravam a substância que estava

causando uma redução na qualidade da panificação da farinha de trigo. Assim que a

substância foi obtida em uma forma cristalina, ela foi testada quanto à toxicidade

contra um número de microorganismos e em concentrações relativamente baixas, ela

é tóxica para leveduras, bactérias e fungos in vitro. Além das atividades descritas,

várias tioninas vegetais apresentam atividade citotóxica e anticâncer. A Pirularia,

tionina obtida de Pyrularia pubera mostrou uma atividade antineoplásica contra células

do câncer cervical (HeLa) e em linhages de célula B16 (linhagem de celular tumoral

de camundongo, Mus musculus, usada como modelo para câncer de pele humana),

entretanto, ela é citotóxica porque causa hemólise. Outro grupo de Tioninas com

atividade anticancerígena e citotóxica são as viscotoxinas de Viscum spp. A visotoxina

B2 mostrou atividade anticancerígena contra o sarcoma semelhante ao osteoblasto

de rato. Por outro lado, as viscotoxinas A1, A2, A3 e 1-PS foram citotóxicas para

linfócitos humanos, devido ao fato de induzirem a produção de espécies reativas de

oxigênio (ROS) e a permeabilização da membrana celular (FLORACK; STIEKEMA,

1994; GUZMÁN-RODRÍGUEZ et al., 2015) (Tabela 2).


A terceira família descrita, quando presente no pool genético da planta, é

principal linha de defesa, e justamente por isso são expressas em grandes

quantidades. Estamos falando do Ciclotídeos, moléculas que ocorrem em plantas das

famílias: Violaceae, Rubiaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae e Solanaceae. Possui uma

excepcional estabilidade o que levou à sua utilização como base para o de desenho

de fármacos. Essa sua estabilidade, permitiu uma excelente defesa natural as plantas

contra eventuais pragas ou patógenos, Entretanto, também observou-se outra

funções biológicas, como antitumorais, anti-HIV, nematicidas, hemolíticas, inseticidas

e antimicrobianas. Todas essas bioatividades tornam os ciclotídeos atrativos e

promissores para fins terapêuticos e diagnósticos (CâNDIDO et al., 2014; GUZMÁN-

RODRÍGUEZ et al., 2015; HENRIQUES; CRAIK, 2015; WEIDMANN; CRAIK, 2016).

Uma das primeiras e principais atividades relatadas para os ciclotídeos foi a

atividade hemolítica, que ocorre apenas na condição cíclica. As cicloviolacinas O2 e

O13 de Viola odorata possuem diferentes atividades hemolíticas. Ambas as moléculas

diferem apenas em um resíduo de aminoácido. A cicloviolacina O2 tem um resíduo de

serina, enquanto a cicloviolacina O13 tem uma alanina na mesma posição. A perda

do grupo hidroxila altera a atividade hemolítica em mais de 3 vezes (GUZMÁN-

RODRÍGUEZ et al., 2015; IRELAND; COLGRAVE; CRAIK, 2006) (Tabela 2).

TABELA 2 Peptídeos com atividades biológicas.

NOMES ESPÉCIES FUNÇÕES

BIOLÓGICAS REFERÊNCIAS

Tioninas Arabidopsis thaliana

Pyrularia pubera Crambe abyssinica

AB, CT, AF, AC, AP

(DANG; VAN DAMME, 2015;

GUZMÁN-RODRÍGUEZ et al.,

2015)

Defensinas

Vigna unguiculata Phaseolus lunatus

P. vulgaris P. angularis

AB, CT, AF, AC

(CâNDIDO et al., 2014; GUZMÁN-

RODRÍGUEZ et al., 2015)

Ciclotídeos

Viola abyssinica V. odorata

Oldenlandia affini Clitoria ternatea

AB, AV, CT, BI, AC

(CâNDIDO et al., 2014; GUZMÁN-

RODRÍGUEZ et al., 2015)

Antibacteriana: AB; antiviral: AV; antifúngica: AF; anticâncer: AC; antiparasitária: AP e Citotóxica: CT.


1.4. Potencial Medicinal

As proteínas e/ou peptídeos de multifuncionais de plantas estão sendo cada

vez mais considerados como potenciais agentes terapêuticos, devido principalmente

à resistência a múltiplas drogas e infecções hospitalares. Essas moléculas exibem um

amplo espectro de ação contra fungos e bactérias patogênicas, sendo estendidas a

vírus, parasitas, analgésicos, imunomoduladores ou no tratamento de desordens

neurológicas, além das suas aplicações como inseticidas e antimicrobianos

fitopatogênicos na semente silvestre. Alguns se mostraram promissores como

agentes anticâncer devido às suas atividades contra células-alvo e/ou ao fato de

desencadearem uma resposta imune que pode ser eficaz no controle de infecções e

na diminuição do progresso do tumor. Vários estudos mostram excelentes atividades

antitumorais e/ou antivirais combinadas com o tratamento tradicional, assim

mostrando uma sinérgica a tratamentos convencionais. Alguns dessas proteínas e

peptídeos vegetais, como outros de diferentes fontes, estão presentes principalmente

em concentrações muito baixas. Para uso em aplicações farmacêuticas ou biológicas,

é necessária uma quantidade razoável de moléculas purificadas e ativas. Assim, o

isolamento desse material de origem proteica a partir de uma fonte natural é uma

estratégia que não é economicamente sustentável para empresas farmacêuticas,

sendo restrita a universidades e laboratórios de bioprospecção. Entretanto, estas

técnicas são importantes na descoberta de novos peptídeos (ALBA; LÓPEZ-

ABARRATEGUI; OTERO-GONZÁLEZ, 2012; BECKER-RITT; CARLINI, 2012;

CâNDIDO et al., 2014; GONG et al., 2011; LI, 2011; MANDAL et al., 2011; OTERO-

GONZALEZ et al., 2010; SCHROEDER et al., 2012; SCHWARTZ et al., 2012; WANG

et al., 2009; ZELENA et al., 2009).

Neste trabalho, foi realizada uma bioperscrutação nas sementes de Senna

spectabilis (DC.) H.S. Irwin & Barneby, Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan,

Adenanthera pavonina Linnaeus e Lachesiodendron viridiflorum (Kunth) P. G. Ribeiro,

L.P. Queiroz & Luckowi, todas da família Fabaceae. Onde um peptídeo de L.

viridiflorum apresentou resultados satisfatórios contra células tumorais, bactérias e

fungos patogênicos.

O b j e t i v o | 28

2. OBJETIVO

2.1. Geral

Realizar uma bioprospecção de frações proteicas obtidas das sementes da

família Fabaceae, Senna spectabilis (DC.) H.S. Irwin & Barneby (Cássia-do-nordeste),

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan var. colubrina (Angico), Adenanthera

pavonina Linnaeus (Carolina) e Lachesiodendron viridiflorum (Kunth) P. G. Ribeiro,

L.P. Queiroz & Luckowi (Jurema-Juquiri) e investigar o potencial multifuncional de um

peptídeo purificado de uma das sementes.

2.2. Específico

• Obter os extratos proteicos das sementes;

• Fracionar os extratos proteicos e caracterizá-los por eletroforese;

• Avaliar o potencial dos sobrenadantes finais de sementes da família Fabaceae

como fonte de proteínas e/ou peptídeos com atividades multifuncionais;

• Purificar e caracterizar um peptídeo de uma das sementes.

• Verificar a viabilidades celular do peptídeo da semente escolhida contra

diferentes células tumorais e não tumorais in vitro;

• Verificar a viabilidades celular do peptídeo da semente escolhida, contra

bactérias patogênicas;

• Verificar a viabilidades celular do peptídeo da semente escolhida, contra fungos

patogênicos do gênero Candida.

M a t e r i a l e M é t o d o s | 29

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material

3.1.1. Equipamentos

Além dos aparelhos usuais do laboratório, pode-se destacar:

• Banho Maria (Tecnal – Te 056);

• Balança analítica eletrônica - BEL Engineering;

• Balança eletrônica – Tecnal (mod. B-tec 2200);

• Centrífuga refrigerada HITACHI CR G;

• Cuba de eletroforese BIORAD;

• Espectrofotômetro Pharmacia Biotec (mod, ultrospec 2100 – pro);

• Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.);

• FPLC AKTA Purifier (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.);

• Liofilizador Labconco-Freezone com bomba Chemistry Hibrid Pump RC

6;

• Leitor de Microplaca BIOTEK-Epoch;

• Microcentrífuga para eppendorf 5410;

• Microcentrífuga para hematócrito (Modelo spin 1000);

• pHmetro Analyser (pH 300);

• Sistema de eletroforese vertical Amersham Biosciences;

• Moinho Tecnal (TE 631/2);

3.1.2. Reagentes

Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analítico,

adquiridos comercialmente, sendo manuseados segundo recomendação do

fabricante, quando especificado.


3.1.3. Biológico

3.1.3.1. Sementes

As sementes utilizadas neste trabalho, Senna spectabilis (DC.) H.S. Irwin &

Barneby (Cássia-do-nordeste) (Figura 3), Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan var.

colubrina (Angico) (Figura 4), Adenanthera pavonina Linnaeus (Carolina) (Figura 5) e

Lachesiodendron viridiflorum (Kunth) P. G. Ribeiro, L.P. Queiroz & Luckowi (Jurema-

Juquiri) (Figura 6), foram fornecidas pela divisão técnica – setor de sementeiras do

Instituto Chico Mendes de Biodiversidade - Nísia Floresta, RN. Da sua coleta a análise

em laboratório, as sementes foram armazenadas em sacos de papel sob temperatura

e umidade controlada, para não perder sua composição proteica selvagem.

Figura 3. Senna spectabilis. (A) Semente com testa lisa, de cor marrom e pluerograma sulcado. (B) Fruto câmara. (C) Inflorescência, uma panícula com brácteas lineares com folhas compostas, paripinadas. (D) Taxonomia da planta. Fonte: Prof. Dr. Rubens Queiroz, docente da UFPB – imagens, http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Senna+spectabilis (acesso em 15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018).

Figura 4. Anadenanthera colubrina. (A) e (B) sementes ovadas com valvas lisas e brilhantes, com fruto na câmara. (C) observa-se uma Inflorescência axilar com folhas alternas, bipinadas. (D) Taxonomia da planta. Fonte: Prof. Dr. Rubens Queiroz, docente da UFPB – imagens, http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Anadenanthera+colubrina (acesso em 15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018).

A

B

C

A C

B

D

D

http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Senna+spectabilis

http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Anadenanthera+colubrina


Figura 5. Adenanthera pavonina. (A) semente obovada, com hilo central e testa dura lisa, vermelha. (B) Legume típico com valvas lineares e presas a cápsula. (C) Folha bipinada e inflorescência em botões florais e obovoides. (D) Taxonomia da planta. Prof. Dr. Rubens Queiroz, docente da UFPB – imagens, http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Adenanthera+pavonina (acesso em 15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018).

Figura 6. Lachesiodendron viridiflorum. (A) Fruto seco, semente castanha. (B) Semente glabra com pleurograma fechado e obovada. (C) Folha composta, bipinada e face adaxial. (D) Taxonomia da planta. Prof. Dr. Rubens Queiroz, docente da UFPB – imagens, http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Piptadenia+viridiflora (acesso em 15/07/2018) e NCBI – Taxonomy Browser – Taxonomia (acesso em 15/07/2018).

Todas as sementes pertencem à família Fabaceae, sendo três nativas de

biomas brasileiros (S. spectabilis, A. colubrina e L. viridiflorum) e uma amplamente

utilizada na arborização das cidades brasileiras, nativa da América Central (A.

pavonina).

3.1.3.2. Sangue Humano

Os eritrócitos humanos foram obtidos através de doações de bolsas de sangue

pelo HEMOCENTRO DALTON CUNHA BARBOSA – RN. As bolsas fornecidas

encontravam-se fora do prazo de validade para transfusões.

A

B C

A

B

C D

D

http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Adenanthera+pavonina

http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Adenanthera+pavonina

http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Piptadenia+viridiflora

http://rubens-plantasdobrasil.blogspot.com/search?q=Piptadenia+viridiflora


3.1.3.3. Obtenção de Células Mononucleares (CMN) de Sangue Periférico

Humano

Para a obtenção de CMN, 10 mL de sangue venoso foi utilizado. Em tubos

Vacutainer heparinizados, realizou-se a diluição de 20µL de sangue em 400µL de

reagente de Turck para a contagem de leucócitos totais. Foi realizada distensão

celular a partir do sangue total para contagem do diferencial de leucócitos. O sangue

total heparinizado foi centrifugado durante 20 minutos a 2000 x g sob temperatura de

18 ºC para obtenção do anel leucocitário. O anel leucocitário foi extraído, transferido

para um tubo Falcon e adicionada Solução Salina Tamponada (PBS) a fim de

completar 10 mL. Posteriormente, para obtenção das CMN, o homogeneizado foi

aplicado sobre o meio de gradiente de densidade (Ficoll-Paque, densidade = 1, 077

g/L, Amersham). Esta solução foi centrifugada por 20 minutos a 3000 x g sob

temperatura de 18ºC para obtenção da nuvem leucocitária. As células da interfase

foram extraídas com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e lavadas por 3 vezes em

PBS (10 minutos, 2000 x g, 18ºC). Após a última lavagem, as células foram mantidas

em meio RPMI 1640 com 20 mM de HEPES (Gilco-BRLTM, Grand Island, NY, EUA)

acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), 2mM de L-glutamina (GibcoBRLTM).

A avaliação do grau de recuperação ocorreu por meio da correlação entre o

número de CMN presentes na distensão celular realizada com o sangue total, com o

número de CMN presentes após a separação celular contadas na câmara de

Neubauer. O grau de recuperação foi determinado pela relação entre a porcentagem

de CMN antes e após a separação.

Para a realização do teste de viabilidade celular foi utilizado o corante de

exclusão Trypan Blue que apresenta afinidade maior por proteínas do soro do que por

proteínas celulares e onde as células não viáveis ficam coradas de azul. Para tanto,

se utilizou 10 µL da suspensão de CMN diluída em 20 µL do corante, sendo a leitura

realizada na câmara de Neubauer. Foram utilizadas no experimento as suspensões

celulares que apresentaram o grau de viabilidade ≥95%.

O grau de pureza foi determinado a partir da porcentagem de CMN da

suspensão após a separação em relação à presença de polimorfonucleares. Para

tanto, foi realizada uma distensão celular corada pelo Giemsa e realizada leitura em

microscopia ótica comum. Foram contadas 100 células para quantificação percentual

de CMN. A porcentagem aceitável para a realização do experimento foi ≥ 90%.


A partir da padronização do cultivo celular, 2x105 células/mL foram distribuídas

em cada poço da placa de cultivo em meio RPMI, acrescido de 10% de SFB. O cultivo

foi realizado em triplicada com e sem a utilização da amostra.

3.1.3.4. Linhagens Celulares Eucarióticas

As linhagens de células tumorais e não tumorais usadas foram, B16-F10, uma

linhagem celular de melanoma de camundongo (ATCC® número CRL-6475) e 3T3,

uma linhagem fibroblástica normal de camundongo (ATCC® número CL-173), HeLa,

uma linhagem celular de adenocarcinoma do colo de útero humano (ATCC® número

CCL-2), Hep G2, uma linhagem celular de hepatocarcinoma humano (ATCC® número

HB-8065), HT-29, uma linhagem celular de adenocarcinoma coloretal humano

(ATCC® número HTB-38), A-375, uma linhagem celular de melanoma maligno de

espécime feminino humano (ATCC® número CRL-1619) e A2058, uma linhagem

celular de melanoma de espécime masculina humano. Todas as linhas foram obtidas

da American Type Culture Colletion (ATCC®, Rockville, MD, USA). Todas as linhagens

foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium),

suplementadas com 10% de soro fetal bovino. Ao meio DMEM foram adicionados

estreptomicina (5000 µg/mL) / penicilina (5000 ui). As células foram mantidas em

ambiente estéril com 5% de CO2. Os ensaios com células tumorais foram realizados

graças à colaboração do prof. Dr. Hugo de Oliveira Rocha, do Laboratório de

Biotecnologia de Polímeros Naturais – BIOPOL, Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Para atividade antifúngica foram utilizadas: Candida albicans (ATCC® número

90028), C. tropicalis (ATCC® número 13803), C. dubliniensis (CBS® númeor 7987), C.

glabrata (ATCC® número 2001), C. parapsilosis (ATCC® número 22019), C. krusei

(ATCC® número 6258). Os ensaios antifúngicos foram realizados graças à

colaboração do prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves, do Departamento de Análises

Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia - Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.


3.1.3.5. Linhagens Celulares Procariontes

As linhagens celulares bacterianas utilizadas neste estudo foram:

Escherichia coli, linhagem de bactéria gram-negativa aeróbica (ATCC® número

25922), Staphylococcus aureus aureus, linhagem de bactéria gram-positiva aeróbica

(ATCC® número 25923) e Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) BMB

9393. Todas as bactérias foram acondicionadas entre 2 a 8ºC em meio Mueller Hinton

(Sigma-Aldrich número 70192).

3.2. Métodos

3.2.1. Preparo da Farinha das Sementes

As sementes secas de S. spectabilis, A. colubrina, A. pavonina e L. viridiflorum

tiveram seus tegumentos removidos, e em seguida seus cotilédones foram triturados

em moinho elétrico refrigerado para obtenção de uma farinha de granulação fina.

3.2.2. Preparo do Extrato Bruto das Sementes

O extrato bruto da farinha das sementes foi obtido a partir da homogeneização

em tampão tetraborato de sódio 0,02 M, 1% ácido fórmico e 1% de NaCl em pH 7,5

na proporção de 1:10 (m:v) sob agitação constante por 4 h à temperatura ambiente.

A suspensão foi centrifugada a 12.000 x g por 30 minutos a 4 °C. O sedimentado foi

descartado e o sobrenadante filtrado em lã de algodão foi denominado de Extrato

Bruto (EB).

3.2.3. Fracionamento com Acetona

O extrato bruto foi fracionado por precipitação com acetona PA em três faixas

de volumes. Após cada etapa de fracionamento, as soluções permaneceram a 4 °C

por aproximadamente 16 horas e, posteriormente foi centrifugada a 12.000 x g durante

30 minutos, a 4 °C. Os precipitados resultantes de cada fracionamento foram

dissolvidos em tetraborato de sódio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,5 e

submetidos à diálise, com poros de 1 kDa, para exclusão de proteínas de baixa massa,


durante 48 horas a 4 °C contra o mesmo tampão. Após diálise, as frações resultantes

foram denominadas: F0,5; F1,0; F2,0, de acordo com o volume de acetona na qual

precipitaram e o Sobrenadante Final - SF (Figura 7).

Figura 7. Esquema de extração e fracionamento de proteínas das sementes com acetona PA.

3.2.4. Quantificação das proteínas

A concentração de proteínas foi determinada pelo método colorimétrico

(BRADFORD, 1976). Para o ensaio, 10 µL de amostra proteica foram conjugados com

200 µL com Reagente de Bradford. A reação foi incubada em temperatura ambiente

por 10 min. As leituras das amostras foram realizadas à absorbância a 595 nm. A

concentração proteica das amostras foi calculada a partir da equação da curva obtida

para Albumina Serica Bovina - BSA.

3.2.5. Cromatografia Líquida de troca-iônica (DEAE-Sephadex)

A fração denominada SF da semente de L. viridiflorum foi dialisada contra

tetraborado de sódio (bórax) 0,02 M, pH 7,5 e foi aplicada na coluna de troca-iônica

DEAE-Sephadex (A25120 aniônica) com volume de 9,15 cm³. O material não-retido

da coluna foi retirado da coluna com o tampão Bórax 0,02 M, pH 7,5. Já as proteínas


retidas na matriz, por sua vez, foram eluídas de forma “stepwise” com concentrações

fixas e crescentes de NaCl: 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1 e 2M, a um fluxo de 2 mL/min. O

material eluído foi novamente dialisado contra água destilada, quantificado e liofilizado

para experimentos posteriores.

3.2.6. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida – “PAGE”, “SDS-PAGE” e revelação

com nitrato de prata

Para avaliar o perfil proteico e o grau de pureza das amostras, as mesmas

foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida de 12% e 20% na presença

e ausência de agentes desnaturantes e redutores (LAEMMLI, 1970). Em seguida os

géis de poliacrilamida foram submetidos a revelação com nitrato de prata (ZHAO et

al., 2012).

3.2.7. Detecção de Proteínas de Defesa nas Frações

A presença de outras proteínas de defesa de plantas foi monitorada ao longo

do processo de purificação. As frações obtidas em todas as etapas de purificação

foram submetidas a ensaios inibitórios contra enzimas digestivas do tipo serínicas e

cisteínicas. Para detecção da presença de possíveis lectinas, também foram

realizados ensaios de hemaglutinação em todos os passos de purificação.

3.2.7.1. Ensaios de Inibição de Atividade Enzimática

3.2.7.1.1. Atividade antitríptica

A atividade antitríptica do extrato bruto e das frações obtidas pelo

fracionamento com acetona foram determinadas utilizando uma solução de

azocaseína 1% como substrato. Alíquotas de 10 µL de solução de tripsina bovina (0,3

mg/mL em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) foram pré-incubadas por 15 minutos a 37

ºC, com 120 µL de HCl 0,0025 M, 320 µL de tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 e 50 µL

do inibidor. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 200 µL de

azocaseína 1%. A reação prosseguiu por mais 30 minutos nas mesmas condições de

incubação, sendo interrompida adicionando-se 300 µL de ácido acético 20%. A


formação de p-nitroanilina foi monitorada em espectrofotômetro a 440 nm. Provas em

branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicata e repetidos três vezes.

Os resultados foram expressos em UI (unidade de inibição)/mg de proteína ou em

percentual de inibição (XAVIER-FILHO et al., 1989).

3.2.7.1.2. Atividade antipapaínica

A atividade antitríptica do extrato bruto e das frações obtidas pelo

fracionamento com acetona, foram determinadas utilizando uma solução de

azocaseína 1% como substrato. Alíquotas de 20 µL de uma solução de papaína (0,2

mg/mL em tampão fosfato de sódio monobásico 0,25 M em pH 6,0) foram pré-

incubadas com 0,002 M de EDTA e 0,003 M de DTT, com 440 µL de fosfato de sódio

monobásico 0,25 M em pH 6,0 e 50 µL das frações, por 10 min, a 37 °C. Após o tempo

de pré-incubação foram adicionados 200 µL de solução de azocaseína 1%, e a mistura

de reação permaneceu por mais 20 minutos nas mesmas condições. A reação foi

parada pela adição de 300 µL de solução de TCA 20%. O material foi centrifugado por

15 min a 10.000 x g e alíquotas de 700 µL do sobrenadante foram alcalinizadas com

o mesmo volume de NaOH 2 N. O efeito das proteínas sobre a atividade proteolítica

a pH 7,5 foi observado pela medida da absorbância a 440 nm originada dos peptídeos

diazotizados. Realizados em triplicatas e provas em branco foram feitas. Os

resultados foram expressos em UI (unidade de inibição)/mg de proteína ou em

percentual de inibição (XAVIER-FILHO et al., 1989).

3.2.7.1.3. Ensaio de Hemaglutinação

A atividade hemaglutinante foi testada em placas de microtitulação de fundo

em V de 96 poços, por meio de diluição seriada das amostras testes (DEBRAY et al.,

1981). Foram testados contra eritrócitos, lavados com solução de NaCl 0,15 M, sem

tratamento e tratados enzimaticamente com tripsina e papaína (BENEVIDES et al.,

1998). Em volume final de 50 µL foram adicionados 25 µL de uma suspensão de 4%

de eritrócitos humanos dos tipos A, B e O e 25 µL de solução contendo proteínas. A

reação foi incubada a temperatura ambiente (25 ºC). Após uma hora a aglutinação foi

observada, e o título expresso em unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido

como o inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação


(MOREIRA; PERRONE, 1977). A atividade hemaglutinante específica foi obtida pela

razão entre UH e a quantidade de proteína (mg) existente na alíquota de 25 µL

testada.

3.2.7.2. Teste de Citotoxicidade Sobre Células Procarionte e Eucarionte

3.2.7.2.1. Atividade Hemolítica

A atividade hemolítica da foi avaliada sobre células do sangue periférico

humano. Hemácias humanas foram separadas do plasma por sedimentação e lavadas

três vezes com solução salina (NaCl 0,9%). A mesma solução foi utilizada para

preparar uma suspensão 1% (v/v) de hemácias e solubilizar as amostras. Em tubos

de 1,5 mL, 100 µL da suspensão de hemácias foram incubados com 100 µL da

amostra por 60 minutos, à temperatura ambiente. As referências de 100% e de 0% de

hemólise foram feitas incubando-se 100 µL da suspensão de hemácias com 100 µL

Triton X-100 1% (v/v) ou com 100 µL da solução salina, respectivamente. Após a

incubação, os tubos foram centrifugados a 3000 x g por 2 minutos e alíquotas de 100

µL dos sobrenadantes foram transferidas para microplacas de 96 poços e analisadas

em leitura de 405 nm (JOHANSSON et al., 2002).

3.2.7.2.2. Ensaio de Citotoxicidade contra Células Mononucleares

O ensaio de citotoxicidade foi realizado utilizando o corante Trypan Blue nas

soluções. A concentração celular utilizada foi 2 x 105 células/mL em cada poço da

placa de cultivo celular, juntamente com 20 µL das diferentes concentrações das

amostras: 10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL em triplicata. As CMN expostas ou não as

amostras foram incubadas e visualizadas em diferentes períodos: 24, 48 e 72 horas.

Realizou-se a homogeneização das células de cada poço antes da retirada de uma

alíquota de 10 µL, sendo esta posteriormente homogeneizada com 20 µL de Trypan

Blue para contagem em câmara de Neubauer. A visualização da viabilidade celular foi

determinada uma vez que as CMN vivas possuem a membrana celular intacta, não

permitindo que as mesmas sejam coradas. Assim, as células coradas indicaram morte

celular.


3.2.7.2.3. Avaliação da atividade do % de redução do MTT

As linhagens celulares foram tratadas e avaliadas pelo método colorimétrico de

MTT ([brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]) (MOSMANN, 1983). 5

X 103 células foram cultivadas em placas de Elisa estéril de 96 poços para um volume

final de 100 μL de meio DMEM 10% de soro fetal bovino. Posteriormente, as células

foram incubadas com diferentes concentrações do inibidor purificado. Após 24, 48 e

72 horas, o reagente MTT (1 mg/mL) foi adicionado às células, e incubado por mais 4

horas. Após este período, o meio foi aspirado e foram adicionados 100 μL de

dimetilsulfóxido P.A. para dissolução dos cristais de formazan precipitados. A

quantificação da absorbância foi realizada em leitor de microplacas, em um

comprimento de onda de 570 nm. O cálculo de inibição da proliferação celular foi

realizado em comparação com o controle contendo células não tratadas com o inibidor

de protease, conforme a fórmula a seguir: Onde: I%, percentual de inibição; A570C,

absorbância a 570 nm do controle e A570A, absorbância a 570 nm da amostra.

Onde: I%, percentual de inibição; A570C, absorbância a 570 nm do controle e A570A,

absorbância a 570 nm da amostra.

3.2.7.2.4. Teste de Atividade Antifúngica e Determinação da Concentração

Fungicida Mínima (CFM)

A Concentração Inibitória Mínima foi baseada no protocolo clínico M27-A2 do

Laboratory Standards Institute (CLSI) com adaptações para produtos naturais. Os

inóculos de todas as estirpes testadas, descritas no item 3.1.3.4., foram obtidos com

48 h de cultivo em SDA a 35ºC e uma suspensão inicial preparada de acordo com a

escala McFarland de 0,5 (1,5 x 108 unidades formadoras de colônias - UFC/mL). Em

seguida, foram realizadas duas diluições seriadas, a primeira em solução salina (1:50)

e a segunda em meio de crescimento Mueller-Hinton (Difco) (1:30). Em seguida,

alíquotas de 100 μL da solução final do inóculo foram distribuídas em placas de

microtitulação de 96 poços contendo 100 μL de várias concentrações da amostra. A

faixa testada foi de 10000 µg/mL a 19,53 µg/mL. Finalmente, as placas foram


incubadas a 37°C e a leitura do teste foi feita após 48 h de incubação. A CIM foi

considerada a menor concentração da amostra capaz de inibir 50% do crescimento

de cada espécie, tomando como referência o respectivo controle positivo (tratado da

mesma maneira, mas sem adição da amostra às células de levedura) e controle

negativo onde foi adicionada anfotericina na concentração de 1 mg/mL (REX et al.,

2008).

Após a realização da atividade antifúngica foi verificado a inibição total do

crescimento das leveduras em relação ao poço controle para todas as espécies de

Candida testadas. Com base nisso, foi determinou-se a concentração fungicida

mínima.

Tomou-se uma alíquota de 100 µL de cada poço onde não foi possível detectar

crescimento visual, bem como dos poços dos controles positivo e negativo de

crescimento, e semeou-se em meio de cultura Ágar Sabouraud Dextrose (Sigma-

Aldrich) na forma de spots. A ausência de crescimento no spot foi considerada como

a concentração fungicida mínima do composto para cada espécie de Candida spp

(REX et al., 2008).

3.2.7.2.5. Teste de Atividade Bactericida e Sinergismo com antibiótico

A concentração inibitória mínima foi determinada somente para as amostras

das sementes 50 mg/ml e tetraciclina 1 mg/ml, ambos em diluição seriada. O ensaio

foi realizado para três linhagens bacterianas, descritas no item 3.1.3.5., em microplaca

de 96 poços com fundo reto. Em cada poço foi aplicado 158 μL de meio Mueller Hinton

(MH) líquido esterilizado em autoclave (121º C por 20 min), 2 μL de suspensão

bacteriana, ajustada para turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Isto

significa que há aproximadamente 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias

(UFC)/mL, 20 μL de amostra e 20 μL de Antibiótico. Para as duas linhagens foi

realizado o controle positivo (198μL de meio MH + 2μL de suspensão bacteriana),

controle negativo (178μL de meio MH + 2μL de suspensão bacteriana + 20μL de

antibiótico) e o controle veículo (200μL de meio MH). A placa foi incubada em estufa

bacteriológica por 24h a 37ºC. O resultado foi determinado pelo método com

Resazurina (20μL).


3.2.8. Estatísticas

Todos os dados representam pelo menos três experimentos independentes e

foram expressos com média ±DP (Desvio Padrão). Quando identificado uma diferença

nos tratamentos pela análise de variância (ANOVA). As análises dos dados foram

feitas pela análise de variância não paramétrica, Kruskal-Wallis, seguido do teste de

hipótese de Dunn, utilizando-se o programa GraphPad Prism versão disponível

gratuitamente.

R e s u l t a d o s e D i s c u s s ã o | 42

4. RESULTADO E DISCUSSÃO

4.1. Análise eletroforética dos extratos de sementes.

Os materiais fracionados oriundos das sementes S. spectabilis, A. colubrina e

L. viridiflorum e A. pavonina foram submetidos a dosagem proteica, constatando a

eficiência da extração e orientando o fracionamento posterior com acetona, já que em

todas as frações foi possível observar a presença de constructos proteicos. As frações

foram analisadas por eletroforese, sendo possível observar a presença de diversas

bandas proteicas globulínicas com variada faixa de massa molecular (figuras 8 a 11).

A semente de S. spectabilis apresentou uma ampla diversidade proteica,

entretanto, notoriamente observa-se uma ou duas bandas majoritárias em

praticamente todas as frações. A exceção foi observada na fração sobrenadante final

que apresentou bandas proteicas minoritárias, vista de maneira mais clara, na

revelação com prata. Na fração F2,0 foi vista uma banda majoritária, abaixo do

marcador de massa molecular de 38 kDa (figura 8).

Figura 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de S. spectabilis (Cássia-do-nordeste). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato Bruto; F0,5 – Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de acetona; F2,0 – Fração com 2,0 volume de acetona; SF. – Fração do sobrenadante final. A – Gel corado com solução de Coomassie blue coloidal; B – Gel revelado com nitrato de prata.

A semente de A. colubrina apresentou também uma ampla diversidade

proteica, entretanto, não foram observadas bandas majoritárias nas frações obtidas.


O sobrenadante final, semelhante às outras frações, mostrou bandas proteicas

minoritárias, ressaltando claramente a variedade delas (figura 9).

Figura 9. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de A. colubrina (Angico). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato Bruto; F0,5 – Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de acetona; F2,0 – Fração com 2,0 volume de acetona; SF. – Fração do sobrenadante final. (A) Eletroforese corado com solução de Coomassie blue coloidal; (B) Eletroforese revelada com nitrato de prata.

A semente de A. pavonina apresentou uma ampla diversidade proteica,


praticamente todas as frações. A fração sobrenadante final apresentou várias bandas

proteicas minoritárias, vista de maneira mais clara somente na revelação com prata,

entretanto, entre os marcadores de massa molecular 31 e 38 kDa, foi possível ver uma

proteína majoritária, vista também na fração F2,0 (figura 10).

A semente de L. viridiflorum apresentou uma baixa diversidade proteica,


praticamente todas as frações. A fração sobrenadante final apresentou uma única

banda proteica majoritária, vista em ambas as condições de visualização (coloração

com comassie e revelação com prata). Essa banda mostrou uma alta capacidade de

difundir além das margens do poço referente à sua corrida eletroforética. Condição

essa, que é típica de constructos proteicos de baixa massa molecular (figura 11).


Figura 10. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de A. pavonina (Carolina). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato Bruto; F0,5 – Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de acetona; F2,0 – Fração com 2,0 volume de acetona; SF. – Fração do sobrenadante final. (A) Eletroforese corado com solução de Coomassie blue coloidal; (B) Eletroforese revelada com nitrato de prata.

Figura 11. Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) das frações da semente de L. viridiflorum (Jurema-Juquiri). M – marcador de peso molecular (kDa); EB – Extrato Bruto; F0,5 – Fração com 0,5 volume de acetona; F1,0 – Fração com 1,0 volume de acetona; F2,0 – Fração com 2,0 volume de acetona; Sobre. – Fração do sobrenadante final. (A) Eletroforese corado com solução de Coomassie blue coloidal; (B) Eletroforese revelada com nitrato de prata. (*) por motivos desconhecidos o marcador não acompanhou a corrida eletroforética.


4.2. Prospecção de Proteínas e/ou Peptídeos Multifuncionais em Sementes da

Família Fabaceae

As frações denominadas sobrenadante final (SF) por apresentar proteínas de

baixo peso molecular foram selecionadas para análises futuras quanto à sua

capacidade multifuncional. As frações ricas em proteínas de natureza globulínica,

foram testadas com relação à presença de atividades antitríptica (figura 12) e

antipapaínica (figura 13), hemaglutinante (tabela 3), hemolítica (figura 14) e avaliação

da toxicidade das frações finais sobre células não tumorais (figura 15).

A análise dos sobrenadantes finais revelou a presença de inibidores de tripsina

nas frações SFSs e SFAc, em valores de 96,2 (± 20) e 156,86 (± 5) UI/mg de proteína,

respectivamente (figura 12). As frações SFAp e SFLv não apresentaram resultado

inibitórios para tal teste.

A análise dos sobrenadantes finais quanto à atividade antipapaínica revelou a

presença de inibidores nas frações SFAc e SFAp, em valores de 2250,98 (± 150) e

826,77 (± 200) UI/mg de proteína, respectivamente (figura 13). As frações SFSs e

SFLv não apresentaram resultado inibitório para tal teste.

F ra ç ã o

Ati

vid

ad

e E

sp

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UI/

mg

de

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SF

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SF

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0

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1 0 0

1 5 0

2 0 0

Figura 12. Atividade antitríptica das frações de sementes. Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv.


F ra ç ã o

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1 0 0 0

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3 0 0 0

Figura 13. Atividade antipapaínica das frações de sementes. Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv.

A análise dos sobrenadantes finais quanto a presença da atividade

hemaglutinante revelou a presença de aglutinação nas frações SFAc e SFAp, nas

diluições 1:2 e 1:4 respectivamente. Com atividade específica de 0,36 UH/mg para

SFAc e 0,31 UH/mg para SFAp. As frações SFSs e SFLv não apresentaram atividade

aglutinante para eritrócitos.

TABELA 3 Avaliação da atividade hemaglutinante das frações de sementes. Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv. (UH) – Unidade de Hemaglutinação

FRAÇÃO TOTAL DE PROTEÍNAS

(mg) ATIVIDADE TOTAL

(UH-1) ATIVIDADE ESPECIFICA

(UH/mg)

SFSs 7,9 0 0

SFAc 5,625 2 0,36

SFAp 12,7 4 0,31

SFLv 3,9 0 0


A análise dos sobrenadantes finais quanto a presença da atividade hemolítica

revelou a presença de lise em uma única na fração SFLv. Esta fração mostrou um

potencial hemolítico extremamente alto, com um percentual por volta de 91,1 (± 5)

(figura 14).

Ati

vid

ad

e H

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tic

a

(%

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X-1

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SF

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Ac

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Figura 14. Avaliação do efeito hemolítico das frações de sementes. Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv sobre eritrócitos humanos. Como controle negativo e positivo foram utilizados tampão fosfato salino (PBS) e Triton X-100 1%, respectivamente. p<0,05 em relação ao controle positivo.

A análise dos sobrenadantes finais quanto à redução do MTT na presença da

linhagem celular 3T3, mostrou que somente a fração SFAc, quando comparada com

o controle negativo (DMEM), causou uma diminuição da viabilidade celular nos

tempos de 24, 48 e 72 horas, em valores de 40, 53 e 50%, respectivamente (figura

15). As demais frações analisadas, quando comparadas com o controle, não

apresentaram diferença significativa, revelando, assim, ausência de toxicidade sobre

a linhagem 3T3.


H o ra s

% d

e r

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do

MT

T

24

48

72

24

48

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24

48

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0

5 0

1 0 0

D M E M

S F S s

S F A c

S F A p

S F Lv

Figura 15. Avaliação da viabilidade celular das frações finais contra células 3T3. Linhagem fibroblástica normal de camundongo (ATCC® número CL-173) foram expostas por diferentes tempos (24, 48 e 72 horas) na concentração de 10,5 µg/mL avaliadas em ensaio de MTT. p<0,05, em relação ao controle.

A análise conjunta dos parâmetros testados das quatro frações finais (tabela 4)

foi utilizada como critério para selecionar qual delas seria mais indicada para dar

continuidade aos estudos posteriores. A fração denominada SFSs apresentou

somente atividade antitríptica e uma viabilidade celular intermediária. A fração SFAp

apresentou baixa atividade antitríptica, hemaglutinante e viabilidade celular. A fração

SFAc apresentou uma alta atividade antitríptica e antitríptica, baixa atividade

hemaglutinante, e alta viabilidade celular e obtenção regular dos eventuais peptídeos.

A fração SFLv não exibiu toxicidade para células 3T3 (embora tenha sido hemolítica)

e apresentou um alto rendimento de obtenção. Considerando, ainda, o grau de pureza

(determinada pela análise eletroforética) das proteínas nas diversas frações, julgou-

se a fração SFLv como a mais promissora para obtenção de uma proteína com menos

passos de purificação.

Uma serie proteínas constitutivas/defesa podem ser observadas em sementes.

As atividades antitríptica e antipapaínica, vistas nas frações SFSs, SFAc e SFAp,

provavelmente se devam à presença de inibidores de protease, que possivelmente

são da família Kunitz e Bowman-Birk, obtida em sementes, possui atividade contra

serinoproteinases, tais como tripsina, quimotripsina, elastase e subtilisina. Eles

também inibem outras classes de proteinases, incluindo as proteinases aspárticas e


cisteínicas, como catepsina D e papaína, respectivamente (MIGLIOLO et al., 2010).

Já em relação à capacidade de aglutinar eritrócitos, podemos destacar a presença

das Lectinas, também denominadas de aglutininas, por terem a capacidade de

aglutinar células, graças à existência um domínios não catalíticos de ligação a

carboidratos específico na superfície celular. Estas possuem uma grande amplitude

de massa molecular, que pode ir de 11 a 110 kDa (WRIGHT, 1997).

TABELA 4 Resumo dos resultados experimentais das frações de sementes. Sobrenadante Final S. spectabilis – SFSs, Sobrenadante Final A. colubrina – SFAc, Sobrenadante Final A. pavonina – SFAp e Sobrenadante Final L. viridiflorum – SFLv.

Parâmetros Analisados SFSs SFAc SFAp SFLv

Obtenção do Peptídeo + + +++

Ativ. Antitríptica + +++

Ativ. Antipapaínica +++ +

Ativ. Hemaglutinante + +

Ativ. Hemolítica +++

Viabilidade Celular ++ + +++ +++

(+) Baixa, (++) Média e (+++) Alta.

A fração SFLv mostrou, exclusivamente, atividade hemolítica (figura 14) e não

apresentou toxicidade para célula 3T3, linhagem fibroblástica normal de camundongo

(figura 15), essa mesma condição observada para linhagens não tumorais foi

observada em outras proteínas em concentrações semelhantes a utilizada neste

experimento (RABELO et al., 2012). Há vários relatos de extratos e frações proteicas

de sementes, que demonstram a presença de atividade hemolítica, dentre eles

podemos destacar o extrato proteico de Bauhinia acuminata e as proteínas obtidas de

Croton tiglium, Glycine max e Clitoria ternatea (BANERJEE; SEN, 1981;

GESTETNER; BIRK; TENCER, 1968; NGUYEN et al., 2011; PHANSRI et al., 2011).

4.3. Isolamento e Caracterização de Peptídeos de L. viridiflorum.

4.3.1. Cromatografia de Troca-iônica, Eletroforese e hemólise de LvP

Frequentemente, as cromatografias de troca-iônica são uma das categorias de

técnicas mais usadas para obtenção de moléculas de origem proteica carregadas

eletricamente e com baixa massa molecular (MOTOYAMA et al., 2007; RECIO;

VISSER, 1999). Então, tendo sido escolhida para as análises avançadas, a fração


denominada sobrenadante final de S. viridiflorum foi submetida a uma cromatografia

de troca-iônica, utilizando a resina aniônica DEAE-Sephadex. O material não-retido

na matriz foi eluído com o tampão de aplicação tetraborato de sódio 0,02 M, pH 7,5

com um volume de fracionamento de 4 mL a um fluxo de 2 mL/min, enquanto o

material aderido à matriz foi eluído em sistema de “Stepwise” em concentrações

crescentes de NaCl: 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 2 M. O acompanhamento por absorção

em u.v. (280 e 216 nm) e eletroforese em poliacrilamida 20% dos eluatos (figura 16),

permitiu selecionar a fração de NaCl 0,5 M, que correspondeu a uma faixa de dez

tubos coletados, entre os tubos 181 a 191 (indicado pela linha negra horizontal no

cromatograma da figura 16A), utilizada para eluir o material retido na matriz. A fração,

observada em eletroforese, mostra-se como uma banda proteica majoritária com

aproximadamente 17 kDa, determinado por migração em eletroforese (SDS-PAGE)

(figura 16.B). A eletroforese nativa da fração, quando revelada com prata, mostrou

uma única banda, indicando que a mesma provavelmente se trate de uma única

proteína com as respectivas atividades biológicas, citadas anteriormente, atribuída a

ela. Desse ponto em diante a proteína obtida foi denominada LvP – “L. viridiflorum

Proteína”. Em vários trabalhos podemos observar uma série de proteínas de massa

molecular baixa, que corresponde a diversas famílias de proteínas e/ou peptídeos

multifuncionais (CâNDIDO et al., 2011, 2014; FELÍCIO et al., 2017; FRANCO, 2011;

NOBELI; FAVIA; THORNTON, 2009).


Figura 16. (A) Perfil de eluição em cromatografia de troca-iônica de SFLv. A coluna (DEAE-Sephadex) foi previamente equilibrada com tampão tetraborato de sódio 0,02M, pH 7,5. Foram aplicados 5 mL (0,5 mg/mL) da fração. As proteínas adsorvidas foram eluídas em gradiente Stepwise em um fluxo constante de 2 mL/min. A absorbância foi monitorada a 280 e 216 nm. (B) M – Marcador de peso molecular; EB – Extrato Bruto; LvP – “L. viridiflorum Proteína”. SDS-PAGE do material retido, faixa que compreende os 10 tubos coletados, na concentração 0,5 M de NaCl denominado LvP GEL DE 20%. (C) Eletroforese nativa da LvP.

O mesmo foi submetido a ensaios de hemólise, onde constatou-se a alta

capacidade de lise celular da LvP (Figura 17).

L v P (µ g /1 0 0 µ L )

Ati

vid

ad

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tic

a

(%

)

Tr i

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4 0

6 0

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1 0 0 T r ito n X -1 0 0

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1 .8 7 5

0 .2 3 4 3 7 5

0 .0 1 4 6 4 5

0 .0 0 0 0 4 5

0 .0 0 0 0 0 7

P B S

Figura 17. Avaliação da atividade hemolítica de LvP. Foi testado nas concentrações de 15 -0,000007 µg/100 µL; Triton-x 100 a 1% foi utilizado como controle positivo (100% de hemólise), enquanto a solução salina a 0,9% foi utilizada como controle negativo (sem hemólise) do experimento. (*) P < 0,05. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão quando comparados ao controle positivo.

A atividade hemolítica observada na fração, manteve-se mesmo quando

submetida a um novo passo de purificação. Esse comportamento citotóxico manteve-

se alto até a concentração de 0,014645 µg/100 µL, ficando por volta de 90 %, quando

comparada com o controle positivo. Entre a concentração de 0,000045 e 0,000007

µg/100 µL, a faixa de atividade hemolítica ficou entre 40 e 60%. Isso representou uma

queda praticamente pela metade da atividade. Essa evidência demonstra uma das

principais características observada para este peptídeo, que uma alta capacidade de

lisa eritrócito humano em baixíssima concentração. Fato esse que não é incomum,

haja vista, que outros trabalhos já demonstraram tal função para diferentes famílias

de proteínas e peptídeos multifuncionais, como: Tioninas, Defensinas, Ciclotídeos,


Knotinas, Albuminas 2S e Proteínas Ricas em Glicinas (CâNDIDO et al., 2011, 2014;

GUZMÁN-RODRÍGUEZ et al., 2015)

4.4. Efeitos da LvP Sobre a Viabilidade de Células Eucariontes e Procariontes

4.4.1. Citotoxicidade da LvP para Células Mononucleares

A alta atividade hemolítica da LvP observada na figura 17, nos levou a testar a

capacidade da proteína em reduzir MTT quando analisada em células mononucleares

de sangue periférico (figura 18).

H o ra s

(%)

de

re

du

çã

o d

e M

TT

24

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0

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1 0 0 P B S

1 0 .5 g /m L

2 .1 g /m L

0 .4 2 g /m L

0 .0 8 4 g /m L

0 .0 0 1 6 8 g /m L

0 .0 0 0 3 3 6 g /m L

Figura 18 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células mononucleares do sangue periférico humano. As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Os resultados indicam que todas as concentrações se mostraram bastante

citotóxicas, quando comparadas com o controle negativo. Sendo o máximo de

redução do MTT em cerca de 30%, em todos os tempos testados, na menor

concentração analisada, que foi de 0.000336 µg/mL (figura 18). Essa toxicidade alta,

provavelmente tem relação com a alta capacidade hemolítica da proteína.

Evans e colaboradores (1989) observaram essa mesma condição em uma

proteína da família das tioninas. Ao contrário de outros trabalhos (BASAK et al., 2016;

RABELO et al., 2012), o ensaio de viabilidade das células mononucleares de sangue

periférico, mostrou uma capacidade citotóxica para LvP para tal célula.


4.4.2. Efeitos da LvP Sobre a Citotoxicidade em Linhagens Celulares Tumorais

Mesmo apresentando toxicidade para eritrócitos e células mononucleares de

sangue periférico a LvP foi testada contra linhagens de células tumorais, devido ao

seu alto potencial deletério.

Para a linhagem celular HeLa, a LvP mostrou-se muito citotóxica nas cinco

primeiras concentrações em 24, 48 e 72 horas (figura 19). A única concentração de

0,00336 µg/mL, e não apresentando toxicidade a célula tumoral então testada (figura

19), quando comparada ao controle. A IC50 calculada para 24 horas foi de 2,97 µg/mL,

para 48 horas, 3,58 µg/mL e para 72 horas, 4,04 µg/mL.

H O R A S

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e r

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D M E M

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0 .0 1 6 8 g /m L

0 .0 0 3 3 6 g /m L

Figura 19 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células HeLa. As células teste (linhagem celular de adenocarcinoma do colo de útero humano) foram tratadas com diferentes concentrações de LvP (10,5 – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Uma tionina multifuncional isolada de Arabidopsis thaliana apresentou uma

viabilidade celular de 61,7% na concentração 2,5 µg/mL em 24 horas (LOEZA-

ÁNGELES et al., 2008). Entretanto, neste trabalho foi observado para o mesmo tempo,

na concentração de 0,0168 µg/mL, viabilidade celular de apenas 30,4%. Já em

Capsicum chinense, uma defensina apresentou inibição de viabilidade celular de

100% na concentração de 1,8 µg/mL, em 24 horas (ANAYA-LÓPEZ et al., 2006).

Neste trabalho, em 24 horas, a viabilidade celular de LvP, na concentração de 0,42

µg/mL, foi de 6,6%. Isso demonstra a eficiência da LvP quando comparado com os


resultados encontrados por Anaya-lópez e colaboradores (2006), a concentração

utilizada é aproximadamente 4,3 vezes inferior a utilizadas por eles.

A linhagem celular Hep G2, diferentemente das anteriores, se mostrou

vulnerável a LvP nas concentrações de 10,5 a 2,1 µg/mL em 24, 48 e 72 horas (figura

20). A concentração de 0,084 µg/mL, não foi muito eficiente em seu efeito deletério

quando comparada às três concentrações iniciais e ao controle. Entretanto,

apresentou, em média, uma citotoxicidade na faixa de 50% nos três tempos

analisados. Nas concentrações 0,0168 e 0,00336 µg/mL, LvP se mostrou inerte para

a célula tumoral então testada, quando comparada ao controle. A IC50 estimada para

24 horas foi de 2,50 µg/mL, para 48 horas, 2,80 µg/mL e para 72 horas, 3,45 µg/mL.

H O R A S

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0 .0 1 6 8 g /m L

0 .0 0 3 3 6 g /m L

Figura 20 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células Hep G2. As células Hep G2 (linhagem celular de hepatocarcinoma humano) foram tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Duas defensinas, uma de Phaseolus vulgaris e outra de Gymnocladus

chinensis, foram eficientes em inibir o crescimento de células de hepatoma humano,

assim como a descrita neste trabalho (LIN; WONG; NG, 2010; WONG; NG, 2003). Um

concentrado de peptídeos, obtido de fracionamento de milho, foi testado com células

de hepatoma humano. Os melhores resultados foram obtidos na concentração de

5120 μg/mL em 96 horas, com inibição do crescimento celular em 61,66% (LI et al.,

2013). Comparativamente, a eficiência de LvP foi observada em três parâmetros

analisados: (1) tempo, onde o fracionado de milho mostrou atividade relativa em 96


horas. Em contrapartida, a LvP mostrou-se eficiente em 72 horas. (2) Viabilidade

celular, o fracionado de milho apresentou 38,34%, a LvP mostrou uma viabilidade

celular de apenas 16,13%. (3) Grau de pureza da amostra, o trabalho de Li e

colaboradores foi realizado com uma fração proteica, que provavelmente continha

uma diversidade de moléculas. Ao contrário da LvP, que se mostra, claramente em

eletroforese de poliacrilamida com uma proteína majoritária.

Na linhagem celular HT-29, foi observado um padrão bem semelhante ao

descrito para Hep G2. Mostrando que a LvP nas concentrações de 10,5 a 2,1 µg/mL

em 24, 48 e 72 horas foi citotóxica para estas linhagens. Na concentração de 0,084

µg/mL, também não foi muito eficiente em seu efeito deletério quando comparada às

três iniciais e ao controle. Demonstrou viabilidade celular por volta de 63% para o

tempo de 24 horas, 42% para 48 horas e 24% em 72 horas. Nas concentrações 0,0168

e 0,00336 µg/mL LvP foi inerte para a célula tumoral (figura 21), quando comparada

ao controle. A IC50 calculada para 24 horas foi de 8,80 µg/mL, para 48 horas, 12,12

µg/mL e para 72 horas, 12,73 µg/mL.

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0 .0 1 6 8 g /m L

0 .0 0 3 3 6 g /m L

Figura 21 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células HT-29. As células HT-29 (adenocarcinoma colo-retal humano) teste foram tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Três ciclotídeos, dois obtidos de Oldenlandia affinis e um de Viola odorata, bem

como uma defensina de Phaseolus vulgaris e um inibidor de tripsina e quimotripsina


da família das proteinases Bowman-Birk, isolado de Pisum sativum, mostraram-se

eficientes na inibição do crescimento celular da linhagem HT-29, assim como descrito

para este trabalho (BURMAN et al., 2011; CLEMENTE et al., 2005; LIN; WONG; NG,

2010). Entretanto, as concentrações nas quais a LvP foi testada foi muito inferior às

empregadas para as proteínas citadas anteriormente.

Todas a linhagens testadas até o presente momento, foram linhagens que para

uma ação efetiva da LvP em um organismo, necessita que a mesma, seja ministrada

por alguma via sistêmica. E devido à alta citotoxicidade demonstra a importância de

uma amenização dos efeitos da proteína, para torná-la mais eficiente em sua proposta

para um eventual fármaco.

Os testes que se seguem foram realizados com linhagens tumorais de

melanomas. O que evidencia o potencial da LvP para uso tópico. Os resultados

indicam que a LvP mostrou-se citotóxica para a linhagem B16-F10 entre as

concentrações de 10,5 µg/mL e 0,0168 µg/mL, em 48 e 72 horas (figura 22). No tempo

de 72 horas somente a concentração de 0,00336 µg/mL não afetou o crescimento da

célula tumoral testada. A IC50 estimada para 24 horas foi de 0,62 µg/mL, para 48 horas,

0,77 µg/mL e para 72 horas, 2,25 µg/mL.

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0 .0 1 6 8 g /m L

0 .0 0 3 3 6 g /m L

Figura 22– Efeito da LvP sobre a viabilidade das células B16-F10, linhagem celular de melanoma de camundongo. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.


Uma tionina obtida da semente de Pyrularia pubera, denominada Pyrularia,

mostrou-se tóxica em 48 horas com uma IC50 de 50 µg/mL, uma concentração, pelo

menos, cinco vezes superior à testada com LvP (EVANS et al., 1989). Em outro

trabalho, realizado com Moringa oleifera, uma lectina apresentou IC50 de 250 µg/mL

em 48 horas todos para B16-F10. Novamente evidenciando uma concentração em

muito superior à obtida neste trabalho para o mesmo tempo teste e para todas as

concentrações testadas (LUZ et al., 2017).

Resultados semelhantes aos da linhagem B16-F10 foram obtidos para A-375,

outra linhagem de melanoma. LvP mostrou-se citotóxica em cinco concentrações

(10,5 µg/mL a 0,0168 µg/mL) em 24, 48 e 72 horas (figura 23). Nos tempos 24, 48 e

72 horas somente a concentração de 0,00336 µg/mL não afetou o crescimento da

célula tumoral testada. A IC50 para 24 horas foi de 0,71 µg/mL, para 48 horas, 1,11

µg/mL e para 72 horas, 2,54 µg/mL.

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0 .0 1 6 8 g /m L

0 .0 0 3 3 6 g /m L

Figura 23 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células A-375. As células A-375 (linhagem celular de melanoma maligno de espécime feminino humano) testes foram tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

A-375 foi testada com uma lectina de Polygonatum cyrtonema, por 24 horas,

exibindo uma IC50 de 15 µg/mL (LIU et al., 2009a). Já a Concavalina A, ConA, uma

lectina isolada de Canavalia ensiformis, quando testada com a linhagem tumoral A-

375 apresentou uma IC50 de 25 µg/mL em 24 horas (LIU et al., 2009b). No presente

trabalho, em 24 horas de experimento, a IC50 foi de 0,71 µg/mL, aproximadamente 21


vezes menor que o descrito para a lectina de P. cyrtonemaI e 35 vezes para ConA.

Tais resultados reforçam o potencial citotóxico da LvP.

Já na linhagem celular A2058, foi observado um padrão de citotoxicidade da

LvP bem estabelecido para a concentração 10,5 µg/mL em 24, 48 e 72 horas (figura

24). Nas demais concentrações, no tempo de 24 horas, houve uma baixa redução do

crescimento celular na faixa de concentração que compreende de 2,1 a 0,0168 µg/mL.

O tempo de 48 horas apresentou uma viabilidade celular inferior a 50% na faixa de

concentração de 10,5 a 0,0168 µg/mL. Em 72 horas de ensaio a concentração 10,5

µg/mL mostrou-se como melhor resultado para a referida linhagem, com as

concentrações subsequentes diminuindo sua ação sucessivamente. Na concentração

de 0,00336 µg/mL, LvP foi inerte para a célula tumoral testada, quando comparada ao

controle, nos três tempos do ensaio. A IC50 estimada para 24 horas foi de 1,05 µg/mL,

para 48 horas, 1,21 µg/mL e para 72 horas, 4,54 µg/mL.

Até a presente data não foi possível encontrar trabalhos científicos que

fornecessem embasamento teórico, relacionado ao objetivo e objeto do então

trabalho, contudo podemos destacar o pioneirismo deste trabalho em testar proteínas

oriundas de sementes com a linhagem celular A2058.

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Figura 24 – Efeito da LvP sobre a viabilidade das células A2058, linhagem celular de melanoma maligno de espécime maculino humano. As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10,5 µg/mL – 0,000336 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.


4.4.3. Efeitos da LvP Sobre o Crescimento de Fungos Patogênicos

A LvP mostrou-se extremamente eficiente na inibição do crescimento dos

fungos: C. albicans (IC50 1,25 µg/mL), C. dubliniensis (IC50 1,56 µg/mL), C. tropicalis

(IC50 6,25 µg/mL), C. krusei (IC50 1,56 µg/mL) e C. glabrata (IC50 1,56 µg/mL), nas

concentrações de 10 e 5 µg/mL (Figuras 25, 26 e 27). Já para C. parapsilosis (IC50

0,39 µg/mL) a inibição ficou abaixo de 20% na faixa de concentração que corresponde

entre 10 a 1,25 µg/mL (Figura 26). Das sementes de Pisum sativum e P. guajava foram

isolados peptídeos, que testados contra C. albicans apresentaram uma citotoxicidade

moderada (CâNDIDO et al., 2014; OARD; ENRIGHT, 2006). Lin e colaboradores

(2010) isolaram uma defensina que se mostrou extremamente tóxica para vários

fungos, inclusive C. albicans. Resultado semelhantes ao encontrados para LvP, foram

relatados para a defensina isolada da pele de sapo, Phyllomedusa sauvugii, que inibiu

o crescimento celular de C. albicans em 100% (CIM de 60 µg/mL) em 48 horas. Em

uma concentração menor, 5 µg/mL, e no mesmo tempo, a LvP mostrou uma inibição

do crescimento celular de aproximadamente 92%.

Em Trapa natans, um peptídeo inibiu 50% do crescimento de C. tropicalis, na

concentração de 16 µg/mL, em 48 horas (MANDAL et al., 2011). No mesmo tempo, a

LvP em uma concentração inferior, 5 µg/mL, inibiu em aproximadamente 90% a

viabilidade celular.

Na verificação da inibição total em poço do crescimento de todas as espécies

de leveduras testadas, observou-se uma repetição dos resultados obtidos em

microplaca, como podemos ver na figura 27 e tabela 4. Foi possível observar

macroscopicamente a inibição do crescimento fúngico para todas espécies testadas

nas maiores concentrações testadas.


Via

bil

ida

de

Ce

lula

r

(%

)

C. alb

icans

C. dublin

iensis

0

5 0

1 0 0

A D S

1 0 g /m L

5 g /m L

2 .5 g /m L

1 .2 5 g /m L

0 .6 2 5 g /m L

0 .3 1 2 5 g /m L

0 .0 7 8 1 2 5 g /m L

A n tib ió tic o

Figura 25 – Efeito da LvP sobre a viabilidade dos fungos C. albicans e C. dubliniensis. As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10 µg/mL – 0,078125 µg/mL) por 48 horas em microplacas de cultura. Meio Ágar Sabouraud Dextrose - ADS foi usado como controle positivo à viabilidade celular e o antibiótico anfotericina (1 µg/mL) como controle negativo. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r

(%

)

C. para

psilo

sis

C. tr

opic

alis

0

5 0

1 0 0

A D S

1 0 g /m L

5 g /m L

2 .5 g /m L

1 .2 5 g /m L

0 .6 2 5 g /m L

0 .3 1 2 5 g /m L

0 .0 7 8 1 2 5 g /m L

A n tib ió tic o

Figura 26 – Efeito da LvP sobre a viabilidade dos fungos C. parapsilosis e C. tropicalis. As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10 µg/mL – 0,078125 µg/mL) por 48 horas em microplacas de cultura. Meio Ágar Sabouraud Dextrose – ADS foi usado como controle positivo à viabilidade celular e o antibiótico anfotericina (1 µg/mL) como controle negativo. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.


Via

bil

ida

de

Ce

lula

r

(%

)

C. gla

bra

ta

C. kru

sei

0

5 0

1 0 0

A D S

1 0 g /m L

5 g /m L

2 .5 g /m L

1 .2 5 g /m L

0 .6 2 5 g /m L

0 .3 1 2 5 g /m L

0 .0 7 8 1 2 5 g /m L

A n tib ió tic o

Figura 27 – Efeito da LvP sobre a viabilidade dos fungos C. glabrata e C. krusei. As células testes foram tratadas com diferentes concentrações (10 µg/mL – 0,078125 µg/mL) por 48 horas em microplacas de cultura. Meio Ágar Sabouraud Dextrose - ASD foi usado como controle positivo à viabilidade celular e o antibiótico anfotericina (1 µg/mL) como controle negativo. A viabilidade das células tratadas foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

TABELA 5 Inibição total do crescimento das leveduras em relação ao poço controle para todos fungos

do gênero Candida testados.

Espécies de Fungos MIC

(µg/mL)

Candida albicans 2500

Candida dubliniensis 2500

Candida parapsilosis 1250

Candida tropicalis 1250

Candida glabrata 1250

Candida krusei 1250


Figura 28. Ensaio de poço controle com os fungos. C. albicans (A), C. dubliniensis (B), C. parapsilosis (C), C. tropicalis (D), C. glabrata (E) e C. krusei (F). Os números de 1 a 10 correspondem as concentrações testadas de 10 a 0,01953125 µg/mL respectivamente. As placas de Petri foram identificadas com algarismo romano de um I a V. A placa de número IV contaminou com um fungo anaeróbico.

Por carência de resultados oriundos de estruturas de constituição proteica e

originaria de sementes para efetuar as correlações necessárias, não foi possível

realizar tal comparação. A ausência de dados na literatura científica de proteínas de

sementes capazes de inibir o crescimento de leveduras, demonstra a importância e

pioneirismo do presente trabalho.

4.4.4. Teste de Citotoxicidade de LvP com Bactérias Patogênicas

Os ensaios de citotoxicidade foram feitos com três cepas de Escherichia coli,

(bactéria gram-negativa aeróbica, ATCC® 25922), Staphylococcus aureus aureus,

(gram-positiva aeróbica, ATCC® 25923) e Staphylococcus aureus resistente a

meticilina (MRSA) (BMB 9393). Previamente à realização dos ensaios, os inóculos

foram testados quanto à sua viabilidade após 60 minutos de incubação a 37 ºC com

solução salina (NaCl 0,9%). Após este tempo, repiques foram feitos em placa de petri

com ágar nutriente e incubado por 24h a 37 ºC. Para o teste, a mensuração do

crescimento das cepas foi realizado com concentrações variadas da LvP (10 a

I II III

IV V


0,01953125 µg/mL), utilizando como controle positivo a bactéria mais o meio e como

controle negativo, a bactéria mais o meio e o antibiótico e um terceiro controle só com

o meio. O teste indicou que a incubação por até 1 hora sem meio de cultura não altera

a viabilidade das cepas bacterianas utilizadas.

Para as três cepas citadas anteriormente, não foi observada inibição do

crescimento, não obstante, algumas concentrações foram capazes de causar um

aumento deste crescimento num percentual praticamente igual (figura 29).

H O R A S

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r

(%

)

S. aure

us

E. coli

MR

SA

0

5 0

1 0 0

C tr l +

1 0 g /m L

5 g /m L

2 .5 g /m L

1 .2 5 g /m L

0 .6 2 5 g /m L

0 .3 1 2 5 8 g /m L

0 .1 5 6 2 5 g /m L

0 .0 7 8 g /m L

0 .0 3 9 0 6 g /m L

0 .0 1 9 5 3 1 2 5 g /m L

C tr l -

C M

Figura 29. Efeito da LvP sob o crescimento das cepas bacterianas E. coli, S. aureus e MRSA. A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de LvP (10 a 0,01953125 µg/mL) por 24 horas em microplacas de cultura. Bactéria mais meio e antibiótico foi usado como controle negativo, controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O crescimento das células tratadas com LvP foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Teste do efeito sinérgico de LvP com tetraciclina foi realizado, mostrando uma

redução na CMI para todas as cepas empregadas. Enquanto o antibiótico, sozinho,

só promove redução do crescimento de E. coli com 0,125 µg/mL, na presença da LvP

(20 µg/mL) a concentração para obter o mesmo resultado caiu para 0,0625 µg/mL

(figura 30).


Via

bil

ida

de

Ce

lula

r

(%

)

Tetr

acic

llin

a

Tetr

acic

lin

a +

LvP

0

5 0

1 0 0 1 g /m L

0 .5 g /m L

0 .2 5 g /m L

0 .1 2 5 g /m L

0 .0 6 2 5 g /m L

0 .0 3 9 0 6 g /m L

C tr l +

C M

Figura 30. Efeito da LvP + tetraciclina sob o crescimento de E. coli. A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de tetraciclina (1 a 0,03906 µg/mL) e uma concentração fixa de LvP de 20 µg/mL por 24 horas em microplacas de cultura. Controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O crescimento das células tratadas com LvP foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Nas cepas de S. aureus e MRSA também foi mostrada uma ação sinérgica de

LvP com o antibiótico, reduzindo a CMI para ambas. Nas duas cepas foi observada

uma redução da concentração de 0,25 µg/mL, quando tratadas apenas com o

antibiótico, para 0,125 µg/mL, quando na presença de LvP (figuras 31 e 32).

Via

bil

ida

de

Ce

lula

r

(%

)

Tetr

acic

llin

a

Tetr

acic

lin

a +

LvP

0

5 0

1 0 0 1 g /m L

0 .5 g /m L

0 .2 5 g /m L

0 .1 2 5 g /m L

0 .0 6 2 5 g /m L

0 .0 3 9 0 6 g /m L

C tr l +

C M


Figura 31. Efeito da LvP + tetraciclina sob o crescimento da cepa bacteriana S. aureus. A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de tetraciclina (1 a 0,03906 µg/mL) e uma concentração fixa de LvP de 20 µg/mL por 24 horas em microplacas de cultura. Controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O crescimento das células tratadas com LvP foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Via

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ida

de

Ce

lula

r

(%

)

Tetr

acic

llin

a

Tetr

acic

lin

a +

LvP

0

5 0

1 0 0 1 g /m L

0 .5 g /m L

0 .2 5 g /m L

0 .1 2 5 g /m L

0 .0 6 2 5 g /m L

0 .0 3 9 0 6 g /m L

C tr l +

C M

Figura 32. Efeito da LvP + tetraciclina sob o crescimento da cepa bacteriana MRSA. A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de tetraciclina (1 a 0,03906 µg/mL) e uma concentração fixa de LvP de 20 µg/mL por 24 horas em microplacas de cultura. Controle positivo bactéria mais meio e controle somente para o meio (CM). O crescimento das células tratadas com LvP foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, em relação ao controle.

Os antibacterianos derivados de plantas são sempre novas fontes terapêuticas.

Uma rápida olhada no modo como a natureza, especialmente as plantas, está lidando

com a questão da infecção fornecerá uma compreensão mais profunda da

metodologia, que precisa ser adotada para o projeto e desenvolvimento de novos

agentes antiinfecciosos altamente eficazes e em geral antimicobacterianos em

particular. A escassez de doenças infecciosas em plantas silvestres é, por si só, uma

indicação dos mecanismos de defesa bem-sucedidos. Uma gama de compostos

secundários, terpenoides, glicosteroides, flavonoides e polifenóis, produzidos pelas

plantas já mostraram sua eficiência em eliminar eventuais patógenos

(HEMAISWARYA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008; LAHMAR et al., 2017).

As sementes possuem um papel extremamente importante na natureza, sendo

elas responsáveis pela manutenção da vida e consequentemente da sua respectiva


espécie. Como se trata de uma estrutura inerte, quando desprendida da planta mãe,

faz-se necessário armazenamento prévio, em seus estágios embrionário, de

estruturas de origem proteica que vão lhe fornecer uma fonte excelente de

aminoácidos e quando requisitado, que podem ser mobilizadas e utilizadas para

defesa e crescimento da planta (MÜNTZ, 1998). Diante dessa perspectiva e ciente

que as sementes são fontes importantes de proteína e peptídeos multifuncionais fez-

se necessário uma investigação, mesmo que superficial, dessa associação entre

fármacos tradicionais e algumas estruturas proteicas com potencial para tratamento

tradicionais de eventuais patógenos.

C o n c l u s ã o | 67

6. CONCLUSÃO

O sobrenadante final obtido pelo fracionamento dos extratos brutos de

diferentes sementes se mostrou uma potencial fonte de proteínas e/ou peptídeos com

atividade multifuncional. Do sobrenadante final de L. viridiflorum foi purificada um

peptídeo de origem globulínica, contendo aproximadamente 17 kDa (determinada por

SDS-PAGE). A proteína, denominada LvP, com alta atividade hemolítica, se mostrou

citotóxica para células mononucleares. Embora não tenha apresentado atividade

tóxica para a linhagem celular 3T3, LvP foi muito eficiente em reduzir a viabilidade

celular das linhagens tumorais HeLa, Hep G2, HT29, B16, A-375 e A2058, mesmo em

baixas contrações. O mesmo foi observado para fungos C. albicans, C. tropicalis, C.

dubliniensis, C. glabrata e C. parapilosis, que, na presença da LvP, tiveram redução

do seu crescimento. Contom tudo, quando testada contra bactérias patogênicas S.

aureus, E. coli e MRSA, nenhuma atividade bactericida foi detectada nas

concentrações testadas. Quando associada aos antibióticos de referência, e testada

novamente contra as bactérias, LvP foi capaz de reduzir o CIM do antibiótico em até

uma diluição para todas as três espécies, caracterizando assim uma atividade

sinérgica da LvP. Baseado nos dados obtidos, a LvP isolada corresponde a um

peptídeo multifuncional, e suas propriedades anti-tumoral, antimicroniana, fungicida e

bactericida, precisam ser investigadas mais aprofundadamente para que seu potencial

biotecnológico seja explorado.

R e f e r ê n c i a s | 68

7. REFERÊNCIAS

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