UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

FLADJANY EMANUELLY FAUSTINO DA SILVA

O EFEITO DA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE NEUROPEPTÍDEO S

NA EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DOS CIRCUITOS DE MEDO EM

CAMUNDONGO SWISS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Biologia

Estrutural e Funcional da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, como pré-requisito

para obtenção do título de mestre em Biologia

Estrutural e Funcional

Natal-RN

2016

2

FLADJANY EMANUELLY FAUSTINO DA SILVA

O EFEITO DA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE NEUROPEPTÍDEO

S NA EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DOS CIRCUITOS DE MEDO EM

CAMUNDONGO SWISS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Biologia

Estrutural e Funcional da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, como pré-requisito para

obtenção do título de mestre em Biologia

Estrutural e Funcional

Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante

Natal-RN

2016

3

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB

Silva, Fladjany Emanuelly Faustino da.

O efeito da injeção intracerebroventricular de neuropeptídeo S

na expressão de Fos em núcleos dos circuitos de medo em

camundongo Swiss / Fladjany Emanuelly Faustino da Silva. -

Natal, 2016.

53 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Biologia Estrutural e Funcional.

1. Neuropeptídeo S - Dissertação. 2. Medo condicionado -

Dissertação. 3. Medo incondicionado - Dissertação. 4. Amígdala -

Dissertação. 5. Hipotálamo - Dissertação. I. Cavalcante, Judney

Cley. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.

Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 612.822

4

TÍTULO: O EFEITO DA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE

NEUROPEPTÍDEO S NA EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DOS CIRCUITOS DE

MEDO EM CAMUNDONGO SWISS

AUTOR: Fladjany Emanuelly Faustino Da Silva

DATA DA DEFESA: 05 / 08 / 2016

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante – Orientador

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Prof. Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

5

Dedico ao meu esposo e amigo Aquiles

Nunes e aos meus pais Francisco

Faustino e Maria das Dores.

6

AGRADECIMENTOS

Impossível seria tentar descrever a satisfação e alegria de ter vencido mais uma

batalha. Ao longo dessa caminhada e processo de maturação intelectual, deparei-me com

pessoas que de uma forma ou de outra me ajudaram na consolidação e construção desse

trabalho. Assim, não poderia deixar de expressar minha eterna gratidão:

A Deus, primeiramente pela sua imensa bondade em me prover a vida, por me

proporcionar forças para continuar a caminhar quando já não as tinha.

Ao meu esposo Aquiles Filgueira Nunes, que acompanhou essa trajetória desde o

início e me incentivou e torceu incansavelmente para que tudo desse certo. Por todo seu amor,

carinho e paciência quando mesmo ao seu lado estava ausente mergulhada em leitura de

artigos e correções de textos. Obrigada meu eterno amor. Amo-te muito.

Aos meus pais Francisco Faustino e Maria das Dores, pelo amor, paciência e

dedicação ao longo de toda minha vida, pelas infindáveis orações e sobretudo pelo cuidado

que têm comigo.

A minha irmã Flávia Emanuelly, que tem sido meu anjo da guarda, que me escuta e

me apóia nas minhas decisões.

Ao meu professor/orientador Judney Cley Cavalcante, por toda paciência empregada

em me ensinar todas as técnicas e experimentos laboratoriais utilizadas neste trabalho, por

todo conhecimento passado e pela confiança em me aceitar como orientanda mesmo ainda

sendo muito imatura no âmbito da ciência e pesquisa. Meu muito obrigada.

Aos professores Expedito Junior, Ruthnaldo Lima, Fernando Ladd e Miriam

Stela pelas inúmeras vezes que sanaram minhas dúvidas, bem como pelas dicas fornecidas e

disponibilidade em me ajudar quando precisei.

Aos meus colegas de laboratório Nayana pela enorme ajuda nos experimentos,

Emanuella e Lucimário, Joacil, Brena, Mayara, Paloma e Nelyane pelos momentos de

descontração e especialmente Melquisedec e Wylqui, por ter me acolhido, ajudado e me

ensinado tantas e tantas vezes. Meu muito obrigada.

A Regina, pelo preparo das soluções.

Ao Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN pelo espaço físico e adequada

execução desse trabalho.

7

A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao tamanho original.

Albert Einstin

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Imagem de campo escuro do tronco encefálico de camundongo de uma

hibridização in situ marcada com Alexa Fluor 555 mostrando a expressão do

RNAm de NPS..............................................................................................................

23

Figura 2 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos à Fos

(Fos-ir) no núcleo medial da amígdala (MeA), núcleo hipotalâmico anterior (AHN),

núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) e núcleo pré-mamilar dorsal (PMD)

.......................................................................................................................................

29

Figura 3 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos a Fos

(Fos-ir) no núcleo central da amígdala (CeA) e basolateral da amígdala (BLA)

.......................................................................................................................................

30

Figura 4. Expressão da proteína Fos em núcleos das vias de medo condicionado e

não condicionado .........................................................................................................

31 e 32

9

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Núcleos cujos neurônios Fos-ir foram contados e suas respectivas

correspondências de áreas de contagem

.......................................................................................................................................

26

10

LISTA DE ABREVIATURAS

AHN Núcleo Hipotalâmico Anterior

BLA Núcleo Basolateral Anterior da Amígdala

CeA Núcleo Central da Amígdala

CHO Células de Óvarios de Hamster Chinês

CRF Fator Liberador de Corticotrofina

Fos-ir Imunorreativo a Fos

GABA Ácido Gama-aminobutírico

GPCR Receptor acoplado à proteína G

icv Intracerebroventricular

IEGs Genes de Transcrição Imediata

KF Kölliker-Fusi

LA Núcleo Lateral da Amígdala

LC Locus Coeruleus

LPB Núcleo Parabraquial Lateral

MeA Núcleo Medial da Amígdala

NMDA N-Metil-D-Aspartato

NPS Neuropeptídeo S

NPSR Receptor do Neuropeptídeo S

PAG Substância Cinzenta Periaquedutal

PMD Núcleo Pré-mamilar Dorsal

Pr5 Núcleo Sensitivo Principal do Trigêmeo

RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro

RT-PCR Proteína C Reativa em Tempo Real

TAG Transtorno de Ansiedade Generalizada

VMH Núcleo Ventromedial do Hipotálamo

11

LISTA DE ANEXO

ANEXO 1 - Protocolo do Comissão de Ética no Uso de Animais ................................. 48

12

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO 14

1.1 O PAPEL DA AMÍGDALA NO DESENCADEAMENTO DO MEDO 16

1.2 O NEUROPEPTÍDEO S E O SEU RECEPTOR NPSR 19

2. OBJETIVOS 22

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 22

3. MATERIAL E MÉTODOS 23

3.1 SUJEITOS 23

3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS 23

3.2.1 CIRURGIA ESTEREOTÁXICA 23

3.2.2 EXPERIMENTO 1: MAPEAMENTO DA EXPRESSÃO DE FOS EM

RESPOSTA AO NPS

23

3.2.2.1 IMUNOISTOQUÍMICA 24

3.2.2.2 COLORAÇÃO DE NISSL 25

3.2.2.3 ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DOS DADOS 25

3.2.2.3.1 ANÁLISE DO TECIDO E CONTAGEM DE NEURÔNIOS

IMUNORREATIVOS A FOS

25

3.2.2.3.2 ANÁLISE DOS DADOS E ESTATÍSTICA 27

4. RESULTADOS 28

5. DISCUSSÃO 33

6. CONCLUSÃO 39

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40

8. ANEXO 48

13

RESUMO

O medo e a ansiedade são emoções adaptativas caracterizadas por um conjunto de

alterações fisiológicas e comportamentais que ocorrem quando os indivíduos se sentem

ameaçados fisicamente e/ou psicologicamente. Apesar dos comportamentos de medo e

ansiedade serem característicos, estudo das últimas duas décadas têm mostrado que diferentes

fontes de medo podem ativar diferentes vias neurais e que há diferenças entre medo

condicionado (aprendido) e medo incondicionado (inato). As vias do medo condicionado

envolvem o córtex frontal medial e os núcleos central e basolateral da amígdala, enquanto o

medo de predador (inato) envolve o núcleo medial da amígdala e núcleos da zona medial do

hipotálamo. Sabe-se que as funções encefálicas são coordenadas por sistemas de

neurotransmissores e seus receptores que são expressos nas mais diversas regiões do sistema

nervoso, exercendo diferentes funções. O Neuropeptídeo S (NPS) é um neurotransmissor cujo

estudos em roedores mostra sua importância como regulador de ansiedade e vigília, reduzindo

a ansiedade, aumentando a vigília e o comportamento locomotor, sendo então um ansiolítico e

estimulante, o que o torna um potencial alvo para estudos farmacológicos e clínicos. Neste

trabalho realizamos a injeção intracerebroventricular (icv) de NPS em camundongos e

mapeamento da expressão de Fos (proteína indicadora de atividade celular) em núcleos

envolvidos nas vias de medo condicionado e incondicionado. A análise dos nossos resultados

mostraram que a administração icv de NPS promoveu uma expressão de Fos diferenciada nos

núcleos central e basolateral da amígdala, indicando um papel no medo condicionado.

Palavras-chave: Neuropeptídeo S; medo condicionado; medo incondicionado; amígdala;

hipotálamo.

14

ABSTRACT

Fear and anxiety are emotions featured by a group of physiological and behavioral

changes that occur when subjects feel threatened physically and/or psychologically. For the

last two decades many studies have showed that different sources of fear are able to activate

different neural pathways, where conditioned (learned) and unconditioned (innate) fear run

over different trails. The conditioned fear involves the frontal medial cortex and the central

and basolateral nuclei of the amygdala, when the fear of predator (unconditioned) involves

nuclei of the medial hypothalamus. It is known that the brain functions are coordinated by

neurotransmitter's systems and its receptors that are expressed in many different places around

the brain, having different functions. The Neuropeptide S (NPS) is a neurotransmitter whose

studies have showed its important role as an anxiety and awake regulator. NPS decreases

anxiety and increases awakeness and locomotor behavior, been thus an anxiolytic and

stimulating neurotransmitter, what makes it a potential target for pharmacological and clinical

studies. In the present work we injected NPS icv in mice and looked for the Fos-expressing

neurons in the nuclei of the conditioned and unconditioned pathways. The analysis of our

results showed that the icv NPS promoted the increase in Fos expression in the central and

basolateral amygdala, what indicates its role in the conditioned fear.

Keywords: Neuropeptide S; fear conditioning; unconditioned fear; amygdala; hypothalamus

15

1. INTRODUÇÃO

O conceito de transtorno, segundo o Manual de Diagnóstico e Estatística das Desordens

Mentais (DSM-IV), é um estado de preocupação exacerbado que pode abarcar diversas

atividades ou eventos da vida do indivíduo. De maneira mais ampla, considera-se um

transtorno crônico quando este ocorre na maior parte dos dias em um período de pelo menos

seis meses (American Psychiatric Association, 2002).

Cerca de 450 milhões de pessoas sofrem de distúrbios mentais e do comportamento em

todo o mundo, além disso, estima-se que uma em cada quatro pessoas desenvolverão uma ou

mais destas perturbações durante a sua vida. De um modo geral, condições neuropsiquiátricas

são responsáveis por 13% do total de anos de vida perdidos por incapacidade devido a todas

as doenças e lesões no mundo e estima-se que aumente para 15% até o ano de 2020 (Who,

2004).

Nos últimos anos tem-se observado que os Transtornos de Ansiedade tais como Fobia

Social, Transtorno do Pânico, Transtorno Obsessivo-Compulsivo e Estresse Pós-Traumático,

ganharam maior atenção em função ao seu aumento progressivo de forma veemente.

Referindo-se especificamente ao Transtorno de Ansiedade Generalizada (TAG), este se

evidencia por ser um tipo de transtorno de ansiedade que vem se apresentando cada vez mais

como um importante problema de saúde pública, uma vez que ocupa a segunda posição dos

transtornos mais prevalentes em locais de assistência a saúde pública, atingindo 11,5% dos

atendimentos (Gonçalves e Kapczinski, 2008).

É interessante perceber que, embora a analogia entre ataque do pânico em humanos e o

medo e comportamentos de esquiva nos animais não é perfeita, os comportamentos de medo,

fuga, esquiva e respostas semelhantes ao ataque do pânico ocorrem em toda a filogenia

animal. Nesse sentido, o comportamento de um roedor que evita entrar em um compartimento

onde foi anteriormente submetido a um estímulo adverso se assemelha ao de uma pessoa que

se recusa a atravessar uma ponte sobre a qual já sofreu um ataque de pânico. Isto nos leva a

crer que a execução de comportamentos, mesmo em diferentes espécies, possa apresentar-se

de forma semelhante. De modo muito peculiar, analogamente, um animal apresenta elevação

na frequência cardíaca, pressão arterial e liberação de glicocorticoides quando escuta um

estímulo sonoro que foi anteriormente pareado com um estímulo adverso, demonstrando

várias alterações autonômicas características de um ataque do pânico (Mezzasalma et al.,

2004).

16

Sabe-se que o medo e a ansiedade são emoções adaptativas caracterizada por um

conjunto de alterações fisiológicas e comportamentais que ocorrem quando os indivíduos

entram em contato com uma ameaça em seu ambiente (Gross e Hen, 2004) (Indovina et al.,

2011).

Frente ao ensejo, versamos ainda acerca da fobia social, uma vez que esta encontra-se

entre as principais desordens mentais. Assim, a definição mais clara para a fobia social é a

exibição de um medo intenso e duradouro de uma ou mais situações sociais e de desempenho

em que o sujeito encontra-se exposto à observação dos outros e vivencia o medo de se

comportar de maneira humilhante ou embaraçosa. Desse modo, pode-se perceber que a

ansiedade sentida não é proporcional à ameaça real. As situações sociais e de desempenho são

evitadas ou enfrentadas com grande mal-estar. Porém, é intrigante o fato de a perturbação de

fobia social só conseguir ser diagnosticada quando a ansiedade se torna tão intensa e

generalizada a ponto de ocasionar um sofrimento significativo ou prejudicar a capacidade de

funcionamento do indivíduo (Garcia, 2013).

Nas décadas de 70 e 80 alguns estudos realizados demonstraram a existência de um

sistema denominado de Sistema Encefálico de Aversão, este por sua vez é acionado por

estímulos de perigo e relacionado às respostas inatas de defesa. As estruturas que compõem

tal sistema são o hipotálamo medial, o complexo amigdaloide e a substância cinzenta

periaquedutal dorsal (Graeff, 1981).

Para estudar os mecanismos neurais que medeiam respostas de medo, o medo

condicionado é amplamente utilizado (Sah e Westbrook, 2008). Um estudo demonstrou a

relação do medo condicionado com o medo incondicionado e inferiu que condicionamentos

aversivos que geram respostas de medo condicionado como o comportamento de

congelamento de um rato em um contexto onde anteriormente sofreu choques nas patas,

levam a aprendizagens rápida, duradoura e de difícil extinção (Fendt e Fanselow, 1999).

Frente a esse tipo de aprendizagem que ocorre a um condicionamento Pavloviano, um

estímulo que inicialmente no contexto emocional apresenta-se como neutro para o organismo,

através de associações sucessivas com um estímulo incondicionado aversivo, torna-se

posteriormente um estímulo condicionado, o que possivelmente poderá desencadear mais

tarde e apenas com sua apresentação respostas de medo condicionadas como o congelamento

contextual (Fendt e Fanselow, 1999).

17

1.1 O PAPEL DA AMÍGDALA NO DESENCADEAMENTO DO MEDO

Os primeiros passos para a descoberta da amígdala foi iniciado pelo fisiologista alemão

Karl Friedrich Burdach, em 1819, sendo este um dos primeiros pesquisadores a observar e

classificar o que denomina-se atualmente “Complexo Amigdalóide”. Cortes especiais do

cérebro revelavam uma massa de matéria cinzenta em forma de amêndoa, localizada numa

região subcortical. Burdach denominou tal massa de “Complexo Amigdalar” (Swanson e

Petrovich, 1998).

Sabemos que a amígdala é um complexo de núcleos que se encontra no lobo temporal

anterior de seres humanos e de outros animais (Amaral et al., 1992), e para fins de

classificação pode ser dividida em basicamente três grandes grupos: o basolateral, o centro-

medial e o cortical (Gale et al., 2004). Destes, o maior e mais bem diferenciado é o grupo

basolateral, possuindo uma posição privilegiada no encéfalo, recebendo informações do

neocórtex, tálamo e hipocampo, fazendo com que apresente uma excelente posição para

integração sensorial. Tal grupo é composto pelos núcleos laterais e basais (Fanselow e Gale,

2003).

Além do grupo basolateral, outro grupo fundamental na composição do complexo

amigdalóide é o grupo centro-medial, composto pelos núcleos central e medial, no qual

possuem conexões fundamentais com a estria terminal. As células da estria terminal são

criticamente semelhantes às do grupo centro-medial, o que denominou que ela fosse chamada

de “Amígdala Extendida”. O menor grupo de núcleos da amígdala é o grupo cortical, e é

também conhecida como a “amígdala olfatória”. Estes núcleos recebem informações diretas

do bulbo olfatório (Fanselow e Gale, 2003).

Sabe-se que a principal via de entrada das informações sensoriais que chegam à

amígdala é o seu núcleo lateral, sendo através deste que a amígdala recebe informações do

mundo exterior, enquanto que a estrutura do complexo amigdalóide que funciona

principalmente como a via de saída das informações codificadas na amígdala é seu núcleo

central (Fanselow e Gale, 2003; Gale et al., 2004).

Estudos neuroquímicos da amígdala permitiram revelar os neurotransmissores mais

abundantes nas suas diversas subdivisões (Mcdonald e Augustine, 1993; Sun e Cassel, 1993).

A partir de técnicas imunoistoquímicas para o neurotransmissor inibitório GABA e para

proteínas que convertem o glutamato em GABA (a chamada GAD), observou-se a notável

presença de uma densa população de neurônios GABAérgicos da amígdala que se estendem

de forma ventral e ininterruptamente através do núcleo central e do núcleo medial desta

18

estrutura. É interessante observar que tais núcleos terminam no limite ventromedial do

hemisfério cerebral (Swanson e Petrovich, 1998).

Em contraste às células do núcleo central e medial, robustamente GABAérgicas, em

outras partes da amígdala neurônios GABAérgicos encontram-se apenas dispersos,

provavelmente envolvidos na formação de circuitos locais. Neurônios encontrados em outras

subdivisões da amígdala são provavelmente glutamatérgicos (utilizam o neurotransmissor

excitatório glutamato). Tais evidências são fortes sugestões de que uma parte da amígdala

(seus núcleos central e medial) é subcortical (estriatal), enquanto que suas outras partes são

corticais (Mcdonald e Augustine, 1993; Sun e Cassel, 1993).

O papel da amígdala no desencadeamento do medo foi mais bem estudado durante as

décadas de 1970 e 1980, quando foi descrita a técnica de condicionamento pavloviano do

medo. Essa técnica consistia em oferecer um estímulo emocionalmente neutro, como a

emissão de um tom sonoro (estímulo condicionado), e associá-lo a um estímulo aversivo,

como um choque elétrico (estímulo incondicionado). Depois da aplicação repetida desses

estímulos associados, notou-se que o estímulo condicionado foi capaz de provocar respostas

observadas, tipicamente, na presença de perigo, como comportamento de defesa (respostas de

fuga ou luta), ativação do sistema nervoso autônomo (alterações no fluxo sangüíneo e

freqüência cardíaca), respostas neuroendócrinas (liberação de hormônios hipofisários e supra-

renais), entre outros (Ledoux, 2003).

Desse modo, situação como exposição a sons fortes e súbitos, altura elevada e estímulos

visuais grandes não identificados – que surgem na parte superior do campo visual de modo

repentino – produzem o chamado medo incondicionado, presente em vários animais. Na

espécie humana, o medo incondicionado pode ser produzido, por exemplo, pela escuridão. O

medo condicionado, ou aprendido, e causado pela maioria dos estímulos, que se tornam

“avisos” de que situações ameaçadoras podem acontecer novamente (Lent, 2005).

Após essa descoberta, foi possível a associação desses comportamentos a amígdala,

uma vez que lesões nessa estrutura interferiam na aquisição e na expressão do medo

condicionado (Ledoux, 2003).

Assim, a amígdala é uma estrutura encefálica fundamental para exercer ligação entre as

áreas do córtex cerebral, recebendo informações de todos os sistemas sensoriais (Williams et

al., 2006). Aferências sensoriais da amígdala são recebidas pelo núcleo lateral. As aferências

auditivas provêm do tálamo auditivo e do córtex auditivo e chegam ao núcleo lateral da

amígdala, estimulando-a nos processos de medo condicionado. Além do córtex e do tálamo

auditivos, outras áreas são igualmente importantes, como as áreas ventrais do hipotálamo, que

19

projetam-se para os núcleos basolateral e basomedial da amígdala, havendo, em casos de

lesão dessas áreas, interferência na geração do condicionamento. (Ledoux, 2003). Ademais, o

núcleo central da amígdala é responsável pela interface com o sistema motor,

conseqüentemente lesões desse núcleo revelaram alterações na expressão das respostas ao

medo condicionado (Ledoux, 2003).

Falando-se especificamente do medo condicionado e sua extinção, três regiões do

cérebro estão envolvidas, são elas a amígdala, o córtex pré-frontal e o hipocampo medial. A

amígdala é a estrutura central envolvida tanto no condicionamento do medo quanto na

extinção (Davis, 1992).

Outra característica da amígdala é a sua participação em um circuito neural organizado,

que permite-lhe interagir e coordenar as principais atividades sensoriomotoras atuando

efetivamente nos estados emocionais (Misslin, 2003). Em ambas as situações de medo e

ansiedade, por exemplo, o complexo amigdalóide é a estrutura alvo para os estímulos

ameaçadores, além de ser o local onde o sistema hipocampal age para aumentar o valor

emocional de tais estímulos levando assim a inibição comportamental (Mcnaughton e Corr,

2004).

Para o aprendizado do condicionamento do medo, as vias que transmitem a informação

do estímulo convergem no núcleo lateral da amígdala, de onde parte a informação para o

núcleo central. Este, por sua vez, estabelece conexão com o hipotálamo e substância cinzenta

periaquedutal no tronco encefálico, evocando, por fim, respostas motoras somáticas (Bear et

al., 2002; Berridge, 2004).

Ademais, após a descoberta do papel da amígdala, foi possível a associação desses

comportamentos à amígdala, uma vez que lesões nessa estrutura interferiam na aquisição e na

expressão do medo condicionado (Ledoux, 2003). Além do importante papel da amígdala na

geração do medo, esse processo também parece ser dependente dos sistemas serotoninérgico,

noradrenérgico e GABAérgico centrais, na medida em que se reconhece que o mecanismo de

ação dos fármacos antidepressivos e ansiolíticos depende de interferências na condução

habitual dessas vias, ao alterar a concentração de seus receptores (Lara e Akiskal, 2006).

Como já mencionado anteriormente, pesquisas realizadas nas décadas de 1970 e 1980,

apontaram a existência de um sistema encefálico de aversão acionado por estímulos de perigo

e relacionado as respostas inatas de defesa, tal sistema foi denominado de Sistema Encefálico

Aversivo, além deste, foi descoberto ainda outro sistema neural relacionado à estimulação

aversiva, mas que está relacionada entretanto com as reações condicionadas de medo e com a

aprendizagem contextual aversiva, tal sistema foi descrito como Sistema de Inibição

20

Comportamental (Graeff, 1981; 1994; Gray e Mcnaughton, 2000). Estudos realizando a

técnica de imunorreatividade à proteína Fos demonstraram que as estruturas do Sistema

Encefálico Aversivo são marcadas após a exposição dos animais a uma estimulação ambiental

aversiva, corroborando assim a hipótese de que tais estruturas compõem um sistema que é

acionado por estímulos ameaçadores (Silveira et al., 2001).

Desse modo, estas estruturas são responsáveis por avaliar as informações contextuais

detectando conflitos entre informações já armazenadas e os estímulos provenientes do meio.

Se uma incongruência é detectada, o hipocampo age aumentando a valência negativa da

informação e tornando-a mais ameaçadora do que realmente é. Ocorre assim, uma supressão

das respostas do organismo e uma inibição comportamental (Brandão et al., 2003).

Nesse sentido, estudos tem mostrado que o complexo amigdalóide faz parte de um

circuito neural que modula as respotas do medo inato (Blanchard e Blanchard, 1972)

(Canteras et al., 2001). Foi proposto ainda um papel diferencial das sub-regiões central e

basolateral da amígdala no medo inato (Moreira et al., 2007). Entretanto, ainda não está claro

se o papel do complexo amigdalóide na organização da resposta inata é semelhante à

participação dessa estrutura na aprendizagem de respostas relacionadas ao medo (Antoniadis e

Mcdonald, 2001; Canteras et al., 2001; Muller e Fendt, 2006).

Portanto, dependendo da natureza do evento estressor ou do estímulo incondicionado,

o padrão de respostas defensivas orientadas e organizadas cede lugar a respostas motoras não

coordenadas e incompletas. A amígdala e o hipotálamo medial podem funcionar como uma

espécie de interface comutando os estímulos para os substratos neurais apropriados para

elaboração das respostas defensivas condicionadas ou incondicionadas (Brandão et al., 2003).

É importante citar que diferentes níveis de ameaça evocam distintos padrões de

respostas defensivas, sendo que estímulos que sinalizam uma ameaça potencial, como um

novo ambiente, levam a respostas de avaliação de risco, como uma exploração cautelosa do

local. Assim, temos reações distintas a partir de estímulos que podem ser distais, como a

percepção de um predador a determinada distância ou um contexto que foi previamente

associado com um estímulo aversivo, como choque nas patas, evocando respostas de

imobilidade com o aumento da tensão e tônus muscular, como a resposta de congelamento

condicionado contextual, e estímulos proximais como o contato direto com o predador, que se

traduz em respostas do tipo luta ou fuga (Blanchard e Blanchard, 1986).

Assim, retomando as desordens que aflingem a mente e já citadas anteriormente, estas

se instalam no indivíduo de forma grave ou se prolonga, tornando-se prejudicial de tal forma

que poderá levar ao desencadeamento de doenças psicossomáticas a tais como a Hipertensão

21

Arterial Sistêmica, Doença da Artéria Coronaria e por fim distúrbios mentais como depressão

e insônia (Heravi et al., 2004).

As funções encefálicas estão coordenadas por sistemas de neurotransmissores e seus

receptores que são expressos nas mais diversas regiões do sistema nervoso, dependendo das

funções a serem exercidas. Neurotransmissores clássicos como a noradrenalina, a acetilcolina,

a serotonina, a dopamina, o glutamato e o ácido gama-aminobutírico (GABA) vêm sendo

relacionados com diversas funções e o seu mal funcionamento gera as mais diversas

patologias como as citadas acima (Bear et al., 2002; Lent, 2005). Neuropeptídeos e seus

desbalanços tem sido muito estudados nas últimas décadas como agentes geradores de

transtornos. Como exemplo, o sistema orexinérgico é responsável por regular as funções que

estão afetadas em estados depressivos, como sono, sistema de recompensa, comportamento

alimentar e resposta ao estresse (Nollet e Leman, 2013).

1.2 O NEUROPEPTÍDEO S E O SEU RECEPTOR

Dentre os neuropeptídeos com ação neurotransmissora mais recentemente descritos, o

neuropeptídeo S (NPS) foi apontado como um importante regulador da ansiedade e da vigília,

sendo portanto potencial alvo para estudos farmacológicos e clínicos nesta área (Sato et al.,

2002; Xu et al., 2004; Guerrini et al., 2010).

Sua descoberta ocorreu em 2002 utilizando a farmacologia reversa, onde receptores

órfãos acoplados à proteína G (GPCR) foram usados como alvos para descoberta de novos

mediadores (Sato et al., 2002).

NPS é composto por 20 aminoácidos, dotado da seguinte sequência em humanos:

SFRNGVGTGMKKTSFQRAKS; fragmentado a partir de um precursor polipeptídico.

Funcionalmente, o NPS ativa o seu receptor que por meio da estimulação de uma proteína Gs

apresenta efeito estimulatório na célula, bem como da proteína Gq, responsável por elevar a

atividade da fosfolipase C que tem por função a degradação de fosfolipídios da membrana, o

que leva comumente ao aumento da concentração citoplasmática de trifosfato de inositol,

promovendo o aumento da concentração intracelular de cálcio (Xu et al., 2004; Vendelin et

al., 2006).

De acordo com Reinscheid e colaboradores (2005), pesquisas realizadas no GenBank,

um banco de dados de sequências genômicas, revelaram que a estrutura primária de NPS é

significativamente conservada entre humano, chimpanzé, macaco, bovino, cão, elefante,

camundongo, rato, coelho, cobaia, galinha, sapo e gambá. Contudo, sugere-se que o gene

parece estar ausente dos genomas atualmente disponíveis de peixe (zebrafish e fugu),

22

sugerindo que o gene precursor de NPS apareceu tardiamente durante a evolução dos

vertebrados.

O NPS é clivado a partir de uma proteína precursora maior contendo um peptídeo de

sinal hidrofóbico e locais de processamento proteolítico, tal qual é comprovado em outros

neuropeptídeos (Xu et al., 2004).

O receptor de NPS (NPSR) é um receptor acoplado a proteína G (GPCR) típico,

constituído de sete domínios transmembrana. Tal receptor apresenta moderado aspecto

homólogo com os outros membros da família GPCR, sendo os receptores de vasopressina os

parentes mais próximos (Reinscheid e Xu, 2005; Valsalan e Manoj, 2014).

Primariamente, o perfil farmacológico do NPS e do seu receptor foi traçado a partir da

linhagem de células que expressam o receptor humano de NPS, tanto em células de ovário de

hamster chinês (CHO) quanto em células embrionárias de rim humano 293 T células

(HEK293 T) (Xu et al., 2004). O NPS em diferentes grupos como humano, rato e

camundongo induz elevações progressivas de cálcio e dependentes da dose intracelular nas

referidas linhagens celulares evidenciadas anteriormente (HEK293 T e CHO), sugerindo a

relação estabelecida do NPSR acoplado a proteínas Gq (Xu et al., 2004).

Estudos neuropsicofarmacológicos, com o objetivo de determinar as funções de NPS,

mostram que a administração central de NPS produz alguns efeitos como o aumento indutivo

da hiperlocomação e hiperatividade, aumento da vigília, supressão dos estágios do sono,

redução da fome e efeito ansiolítico padrão em animais modelos para ansiedade (Rizzi et al.,

2008; Fendt et al., 2010; Pape et al., 2010; Clark et al., 2011; Zhao et al., 2012). Em suma, o

NPS produz um comportamento de propriedade única: efeito ansiolítico e estimulante (Koob

e Greenwell, 2004).

Sendo assim, os aspectos que abarcam os efeitos comportamentais produzidos através

da administração intracerebroventricular de NPS, como excitação e vigília associado ainda

aos efeitos ansiolíticos, parecem apresentar características singulares, visto que estimulantes,

tais como anfetaminas e cocaína, induzem potencialmente a excitação ao mesmo passo que

são ansiogênico (Roth et al., 2006).

Outros estudos produziram evidências para um papel central da neurotransmissão do

NPS na recompensa e abuso de drogas (Badia-Elder et al., 2008; Ruggeri. B. et al., 2010).

Além desses papeis, o NPS também reduz efeitos de nocicepção em camundongos (Li et al.,

2009). Utilizando a técnica de Proteína C Reativa em Tempo Real (RT-PCR), Xu e

colaboradores (2004) mostraram que o Ácido Ribonucléico mensageiro (RNAm) de NPS e de

seu receptor são expressos em vários tecidos dispersos por todo o corpo com níveis elevados

23

no encéfalo, tireoide, glândulas salivares e mamárias de ratos. Apesar de evidenciada a

elevada expressão do NPS na parte central do sistema nervoso, estudos com hibridização in

situ mostraram que o RNAm de NPS está em neurônios localizados em áreas restritas do

tronco encefálico. Em ratos uma moderada expressão foi vista no núcleo sensitivo principal

do trigêmeo (Pr5) e no núcleo parabraquial lateral (LPB) e uma elevada expressão foi

encontrada numa área entre o locus coeruleus (LC) e o núcleo de Barrington, denominada

então de região peri-locus coeruleus (Xu et al., 2004; Xu et al., 2007).

O complexo nuclear sensitivo do trigêmeo é uma estrutura pontina e originalmente

descrita em 1950 (Olszewski, 1950), que o dividiu em 4 núcleos: principal, oral, interpolar e

caudal. O Pr5 está dividido em uma porção ventral e dorsal, que são citoarquitetonicamente

distintas e têm sido propostos servir as diferentes funções de retransmissão e processamento

de sinais sensoriais da cabeça, como tato e propriocepção trigeminal (Luo e Li, 1991;

Minnery e Simons, 2003). Tais funções podem ser suportadas pelos achados que esta

estrutura recebe entrada primária direta de estruturas intra-orais e possui diversas fibras

aferentes e eferentes que conectam-se com outras áreas do encéfalo (Smith, 1975; Shigenaga

et al., 1986; Moritani et al., 1998). De acordo com Brodal (1984), o Pr5 recebe

majoritariamente axônios de maior diâmetro incumbidos pela transmissão do tato

discriminativo ou epicrítico e, em menor escala, pelo tato protopático e pressão (Brodal,

1984).

O LPB é uma estrutura pontina localizada dorsolateralmente ao pedúnculo cerebelar

superior (Menani et al., 2000). O LPB é um centro relé envolvido na transmissão de vários

tipos de informação sensorial protopática (Nakamura, 2011). Além disso, também está

envolvido com a regulação da temperatura corporal e situações relacionadas ao apetite e

nocicepção (Hermanson e Blomqvist, 1996; Carter et al., 2013). Destes, o papel da

sinalização nociceptiva em LPB tem sido descrita essencialmente em modelos de roedores

(Sato et al., 2015). De acordo com um estudo recente realizado por Sato e colaboradores

(2015), verificou-se que a inativação funcional do LPB prejudica significativamente a

aprendizagem do medo sem afetar significativamente limiares de estímulos sensoriais

aversivos e não aversivos, dessa forma, pode-se inferir que o LPB é necessário para expressão

completa da aquisição da memória relacionada ao medo (Sato et al., 2015).

O LC é um importante núcleo noradrenérgico pontino, que tem por função modular uma

vasta gama de processos relacionados com estado de alerta, respostas induzidas pelo medo,

movimentos rápidos dos olhos durante os estágios do sono, analgesia e excitação (Sabban et

al., 2004; Freitas et al., 2005; Liddell et al., 2005). O LC é o local com o maior número de

24

neurônios noradrenégicos na parte central do sistema nervoso, responsáveis por enviar

extensas ramificações de axônios para muitas outras partes do encéfalo e da medula. Embora

o LC contenha um número pequeno de neurônios (cerca de 10.000 nos humanos), seus

axônios passam pelo feixe prosencefálico medial e fascículo tegmentar central e dorsal e dão

origem a muitos milhões de terminais nervosos em todo o córtex, hipocampo e cerebelo

(Rang e Dale, 2007; Standring, 2008).

O núcleo de Barrington, também referido como o centro pontino da micção, representou

a primeira porção do tronco encefálico em que por meio de modelos animais demonstrou-se a

relação com a atividade de micção (Barrington, 1921). O produto da estimulação deste centro

é o relaxamento do esfíncter uretral e contração detrusora, enquanto situações que provocam

lesão neste, evoluem para abolição da micção e retenção urinária completa. De fato, o centro

pontino da micção representa um ponto de convergência de estímulos pró e antimicção, sendo

sua função primordial: o centro de comando para o início e harmonia do esvaziamento vesical

(Juc et al., 2011).

No entanto, como descrito anteriormente, neurônios que expressam o RNAm de NPS

não estão nem no LC e nem no núcleo de Barrington, mas entre eles na região peri-locus

coeruleus. O que fica evidenciado pelo fato de que neurônios NPS não expressam a tirosina

hidroxilase, enzima precursora da noradrenalina, e nem o Fator Liberador de Corticotrofina

(CRF), neurotransmissor expresso pela maioria dos neurônios do núcleo de Barrington (Xu et

al., 2004; Xu et al., 2007). Ainda em rato, foi verificado que a maioria dos neurônios NPS na

área peri-locus coeruleus são também glutamatérgicos e alguns são colinérgicos (Xu et al.,

2007). Muitos neurônios NPS no Pr5 também são glutamatérgicos, enquanto no LPB eles co-

expressam CRF (Xu et al., 2007).

A distribuição de NPS no encéfalo de camundongo é um pouco diferente da de rato.

Clark e colaboradores (2011), mostraram uma forte expressão de RNAm de NPS e de sua

proteína em duas regiões do tronco encefálico de camundongo, sendo elas a região peri-locus

coeruleus, semelhante a expressão em rato, e o núcleo Kölliker-Fusi (KF), uma divisão do

núcleo parabraquial. Eles não detectaram neurônios NPS no Pr5, no LPB ou qualquer outra

área do encéfalo de camundongo (Clark et al., 2011). A figura 1 é uma adaptação de Clarck e

colaboradores (2011) e mostra a distribuição do NPS usando sonda para marcação. Além

disso, forte marcação do precursor do NPS RNAm foi encontrada em apenas duas regiões do

tronco encefálico de camundongo: o perilocus coeruleus e o núcleo KF. A expressão de NPS

no perilocus coeruleus e núcleo KF foram confirmados por imunomarcação.

25

Figura 1 – Imagem de campo escuro do tronco encefálico de camundongo de uma hibridização in situ marcada

com Alexa Fluor 555 mostrando a expressão do RNAm de Neuropeptídeo S (NPS).

A imagem em A mostra um grupo de células expressando o RNAm de NPS na região perilocus coeruleus. Em B

está a marcação de neurônios expressando RNAm de NPS no núcleo Kölliker-Fusi (KF). Locus coeruleus (LC),

quarto ventrículo (4V). Barra de escala = 500 µm.

Fonte: Adaptada de Clark et al., 2011.

O KF está profundamente envolvidos no controle respiratório, referido muitas vezes

como o “centro pneumotáxico” (Feldman, 1986). As projeções do KF caminham através do

tracto tegmental central para a área hipotalâmica lateral, a área pré-óptica lateral e o núcleo

central da amígdala (Saper e Loewy, 1980). Fibras descendentes do KF viajam principalmente

através da formação reticular medular ventrolateral passando por regiões que dão origem a

fibras pré-ganglionares parassimpáticas dos pares de nervos cranianos VII, IX e X e grupos de

células de catecolaminas A1e A5 (Saper e Loewy, 1980). Todavia, ser o centro pneumotáxico

não é a única função em que o núcleo KF está envolvido. Estudos apontam a relação íntima

deste núcleo com áreas relacionadas com o controle do sistema cardiovascular e ainda na

regulação da dor, como a medula vetrolateral rostral, núcleo cuneiforme, núcleo do trato

solitário, núcleos da rafe, substância cinzenta periaquedutal e a coluna intermediolateral da

medula espinal (Saper e Loewy, 1980; Shafei e Nasimi, 2011).

Ao contrário da distribuição restrita de NPS, o RNAm de seu receptor é amplamente

espalhado no encéfalo de ratos e camundongos (Xu et al., 2007; Clark et al., 2011). O NPSR

está expresso sobretudo em áreas encefálicas que participam da modulação do medo e

ansiedade, como o complexo amigdaloide e hipotálamo, do sono, como o tálamo, hipotálamo

e núcleo pré-óptico, com a aprendizagem e memória, como regiões parahipocampais, córtex

entorrinal, amígdala e subículo e ainda com a excitação e respostas ao estresse, como o núcleo

26

paraventricular do tálamo (Xu et al., 2007; Clark et al., 2011). Estes núcleos quando

estudados em conjunto são importantes indicadores dos efeitos moduladores do NPS.

No entanto, apesar da distribuição do receptor ser ampla, a distribuição de fibras

imunorreativas a NPS, observadas por técnica de imunoistoquímica em camundongo, é bem

restrita (Clark et al., 2011), nos levando a considerar a existência de um outro ligante para tais

receptores.

Devido ao papel do NPS no medo e ansiedade e da distribuição de seu receptor na

amígdala e hipotálamo em detrimento de sua limitada distribuição de fibras, é importante

saber que estruturas podem estar respondendo a transmissão de NPS e se diferentes vias de

controle de medo podem responder de forma diferenciada a injeção intracerebroventricular de

NPS, desta forma melhorando as bases neuroanatômicas dos estudos farmacológicos deste

neurotransmissor.

27

2. OBJETIVOS

Verificar se núcleos ligados as vias de medo condicionado e não condicionado se

tornam ativos em resposta a injeção intracerebroventricular de NPS em camundongo.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Mapear a expressão da proteína Fos nos núcleos medial da amígdala, hipotalâmico

anterior, ventromedial do hipotálamo e pré-mamilar dorsal, núcleos da via de medo inato de

predador (não condicionado), em camundongo, em resposta a injeção intracerebroventricular

de NPS.

Mapear a expressão da proteína Fos nos núcleos basolateral e central da amígdala,

núcleos da via de medo condicionado, em camundongo, em resposta a injeção

intracerebroventricular de NPS.

28

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 SUJEITOS

Para realização deste trabalho foram utilizados 20 camundongos Swiss, machos adultos,

com peso médio de 36 gramas, entre 8 e 12 meses de idade. Estes animais foram mantidos em

condições constantes de temperatura (22ºC), com água e ração ad libitum, sob ciclo claro-

escuro 12:12 com as luzes acesas às 6:00h. Os animais foram comprados da Anilab Animais

de Laboratório (Paulínia - SP) e mantidos no biotério do Departamento de Morfologia antes

do início dos procedimentos experimentais.

Todos os procedimentos estão de acordo com as normas para uso de animais

experimentais e pelo Comitê de Ética para Uso Animal da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (CEUA-UFRN), sendo aprovado pelo mesmo (protocolo 034/2012).

3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.2.1 IMPLANTE DE CÂNULA

A cirurgia de implante de cânula-guia foi feita com a ajuda de um aparelho

estereotáxico com o objetivo de implantá-la no ventrículo lateral direito de camundongos para

administração de NPS ou solução salina.

As cânulas foram produzida a partir de agulhas que são utilizadas para administração de

medicamentos, com diâmetro de 22 gauges e 8mm de comprimento.

Para o procedimento cirúrgico, os camundongos foram levados à sala de cirurgia e

foram anestesiados com ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg i.p. (intraperitonial),

passaram por tricotomia do topo da cabeça e foram levados ao aparelho estereotáxico onde

tiveram a cabeça fixadas pelos meatos acústicos externos e pelo focinho. Administramos

solução salina nos olhos do camundongo para prevenção de possíveis úlceras córneas. Foi

injetado 0,06 ml de um anestésico local (Mepiadre 100) subcutaneamente no topo da cabeça,

seguido de uma antissepsia local utilizando iodoforo (agente antisséptico iodo-povidine) para

que assim realizássemos a incisão cirúrgica. A pele da região craniana foi removida de forma

a abrir um campo para visualização do bregma, trepanação e inserção do parafuso. Em

seguida um parafuso de fixação foi colocado no osso parietal esquerdo. A cânula-guia foi

implantada unilateralmente no ventrículo lateral direito de acordo com as seguintes

29

coordenadas a partir do bregma: AP -0,6 mm; ML 1,1 mm; DV 1,0 mm. A cânula-guia foi

fixada ao osso parietal e ao parafuso com cimento odontológico.

3.2.2 INJEÇÃO

Após 3 dias de recuperação da cirurgia, por 3 dias os animais foram levados no mesmo

horário para uma sala onde cada um passou por uma manipulação com o objetivo de habituá-

los para a injeção. No quarto dia os animais foram novamente levados à mesma sala onde

receberam a microinjeção intracerebroventricular (icv) de 2µl de NPS (1 nmol) ou 2µl de

solução salina 9% durante 1 minuto. A microinjeção ocorreu através de uma agulha (cujo

comprimento excede 1 mm a cânula-guia), que permitiu a administração da droga através da

cânula-guia anteriormente implantada. A agulha estava ligada a um tubo de polietileno, que se

encontrava conectado a uma seringa de Hamilton.

Droga: NPS (gentilmente doada pelo Prof. Dr. Remo Guerrini da Universitá di Ferrara,

Ferrara Itália e pela Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli da UFRN) foi diluído em solução

salina, sendo o pH da solução verificado anteriormente à administração, com adequação aos

níveis biológicos.

3.2.2 MAPEAMENTO DA EXPRESSÃO DE FOS EM RESPOSTA AO NPS

Entre 90 a 120 minutos após a injeção, cada animal foi anestesiado como descrito

anteriormente e sofreu perfusão transcardíaca, tendo o sistema circulatório limpo com solução

salina 9% (50mL) e tendo formaldeído 4% (feito de paraformaldeído) como fixador (350mL).

Em seguida os encéfalos foram removidos, pós-fixados no mesmo fixador por 2 horas e

acondicionados em solução sacarose 30% até microtomia. Os encéfalos foram

microtomizados por congelamento (30µm) em micrótomo de deslizamento e os cortes foram

divididos em 4 séries de cortes alternados.

3.2.2.1 IMUNOISTOQUÍMICA

Uma das séries passou pelo procedimento de imunoistoquímica para marcar a proteína

Fos. A técnica consistiu de uma imuperoxidase padrão pelo método ABC, onde, após

lavagens em tampão fosfato 0,1M (PB), os cortes free floating foram submetidos a um pré-

tratamento com uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% em tampão fosfato 0,1M com

Triton X-100 (TXPB) durante 30 minutos em agitador orbital para inativação da peroxidase

30

endógena, para então serem incubados em TXPB com anticorpo primário anti-Fos obtido em

coelho (Jackson Laboratories; 1:10.000), acrescido de soro de jumento (1:1000; Jackson

Laboratories) overnight. No dia seguinte, os cortes foram lavados em PB e incubados em

anticorpo secundário anti-coelho feito em jumento (Jackson Laboratories; 1:1000) diluído em

TXPB por 2 horas, novamente lavados em PB e incubados por 2 horas em solução de avidina-

biotina-peroxidase (kit ABC, Vector, 1:333) diluídos em PB. Os cortes foram novamente

lavados em PB antes de passarem por uma solução de PB contendo os cromógenos

diaminobenzidina (DAB) 0,05% e sulfato de amônio e níquel (NAS) 0,05%, acrescidos de

peróxido de hidrogênio 0,01% por aproximadamente 5 minutos. A reação foi parada com

lavagens em PB em agitador orbital. Os cortes então foram montados em lâminas

gelatinizadas, desidratados em uma sequência crescente de alcoóis, deslipidificados em xilol e

cobertos com ERV-Mount e lamínula.

3.2.2.2 COLORAÇÃO DE NISSL

Uma outra série foi submetida a coloração de Nissl, para análise da citoarquitetura,

usando tionina como corante. Neste procedimento, os cortes foram lavados em PB e

montados em lâminas gelatinizadas. Após período de secagem do material as lâminas

passaram por banhos de 3 minutos cada por uma bateria de alcoóis etílicos de concentrações

crescentes (70%, 95% e 100%). Ao final da bateria, as lâminas foram mergulhadas em xilol,

num primeiro banho de 3 minutos e sequencialmente imergidos num segundo banho de xilol

por 30 minutos. Na sequência, os cortes foram reidratados em banhos em alcoóis etílicos de

concentrações decrescentes (a mesma utilizada na primeira bateria, em sentido inverso),

emergidos em água por 30 segundos e posteriormente imergidos em tionina por 40 segundos,

para novamente serem desidratados e deslipidificados como descrito acima. Ao final, foram

cobertos com lamínula como descrito anteriormente.

3.3 ANÁLISE DOS DADOS

3.3.1 ANÁLISE DO TECIDO E CONTAGEM DE NEURÔNIOS

IMUNORREATIVOS A FOS

Todo o tecido foi analisado em microscópio óptico de campo claro. O local de injeção

foi verificado pela presença de uma lesão cortical causada pela cânula-guia e pela micropipeta

31

chegando próximo ou até o ventrículo lateral. As áreas encefálicas de interesse foram

identificadas nas lâminas coradas pela tionina com o auxílio do Atlas Estereotáxico de

Encéfalo de Camundongo (Paxinos e Franklin, 2008). Estas estruturas foram analisadas e

tiveram suas áreas medidas bilateralmente em 1 ou 2 níveis utilizando o programa NIS

(Nikkon). As áreas de cada núcleo de interesse foram então somadas resultando em uma área

total que foi usada como uma forma de correção proporcional da contagem. A tabela 1

descreve as áreas de interesse e suas correnspondências aproximadas com o Atlas

Estereotáxico de Encéfalo de Camundongo (Paxinos e Franklin, 2008).

Na sequência, as mesmas áreas das lâminas imunocoradas para Fos foram analisadas e

tiveram suas células imunorreativas para Fos contadas bilateralmente utilizando o programa

NIS (Nikkon). Apenas os neurônios cuja marcação estivesse bem acima da coloração de

fundo foram contados. Alguns núcleos foram contados em apenas 1 nível enquanto outros

foram contados em 2, e o resultado está expresso em neurônios Fos por mm2, usando como

base as áreas previamente medidas em colorações de Nissl.

Tabela 1 - Núcleos cujos neurônios Fos-ir foram contados e suas respectivas correspondências de áreas de

contagem com Paxinos e Franklin (2008).

Núcleos Nível 1 Nível 2

Núcleo Medial da Amígdala (MeA) Pranchas 43/44 Pranchas 45/46

Núcleo Hipotalâmico Anterior (AHN) Pranchas 37/38 Pranchas 39/40

Núcleo Ventromedial do Hipotálamo (VMH) Pranchas 43/44 Pranchas 45/46

Núcleo Pré-mamilar Dorsal (PMD) Prancha 52 -

Núcleo Central da Amígdala (CeA) Pranchas 39/40 Pranchas 43/44

Núcleo Basolateral Anterior da Amígdala (BLA) Pranchas 41/42 Pranchas 45/46

Fonte: Elaborada pelo autor

32

3.3.2 ESTATÍSTICA E FIGURAS

Para análise estatística dos grupos NPS e Salina, utilizou-se o teste t de Student

considerando a margem de erro de 5% (p<0,05%), executados no programa Sigma Plot 10,

mesmo programa utilizado para construção de gráficos, forma na qual os dados são

apresentados, com a Média Aritmética + Erro Padrão Médio (S.E.M.).

As figuras foram montadas utilizando-se o Adobe Photoshop CS3 e tiveram apenas o

brilho e o contraste alterados.

33

4. RESULTADOS

Dos 20 animais que tiveram a cânula implantada no ventrículo lateral verificamos que

em 12 deles a cânula-guia foi implantada com sucesso (n=6 para cada grupo), então apenas

estes foram considerados na contagem de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir).

4.1 EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DA VIA DO MEDO

INCONDICIONADO

Foram 4 os núcleos analisados na via do medo incondicionado: núcleo medial da

amígdala (MeA), núcleo hipotalâmico anterior (AHN), núcleo ventromedial do hipotálamo

(VMH) e núcleo pré-mamilar dorsal (PMD). Nenhum deles apresentou diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos (Fig. 2).

AHN apresentou uma média de 113,1 ± 23,2 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que

receberam salina icv, enquanto os animais que receberam NPS 1nM icv apresentaram 136,5 ±

9,5 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,375; Fig. 4A-C). Os animais que receberam salina icv

apresentaram no VMH 87,1 ± 28 neurônios Fos-ir/mm2, enquanto os animais que receberam

NPS apresentaram 41,3 ± 10,4 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,157; Fig. 4D-F). PMD apresentou

uma média de 171,1 ± 28,8 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina, enquanto

os animais que receberam NPS apresentaram 275 ± 73,9 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,217; Fig.

4G-I). MeA apresentou uma média de 170 ± 51,1 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que

receberam salina icv contra 227 ± 48,9 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,430) nos animais que

receberam NPS 1nM icv (Fig. 4J-L).

34

Figura 2 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir) no núcleo medial da

amígdala (MeA), núcleo hipotalâmico anterior (AHN), núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) e núcleo pré-

mamilar dorsal (PMD).

Fonte: Elaborada pelo autor

4.2 EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DA VIA DE MEDO

CONDICIONADO

Foram dois os núcleos analisados na via do medo condicionado: núcleo central da

amígdala (CeA) e núcleo basolateral da amígdala (BLA). Em ambos os núcleos houve

diferença estatisticamente significantes entre os grupos (Fig. 3).

CeA apresentou uma média de 48,4 ± 11,8 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que

receberam salina icv contra 219 ± 42,6 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,005) nos animais que

receberam NPS 1nM icv (Fig. 4J-L). BLA apresentou uma média de 29,4 ± 11,3 neurônios

Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina icv, enquanto os animais que receberam NPS

1nM icv apresentaram 128,2 ± 19,5 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,002; Fig. 4J-L).

35

Figura 3 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir) no núcleo central da

amígdala (CeA) e basolateral da amígdala (BLA). * Diferença estaticamente significativa em relação ao animal

com injeção icv de salina.

Fonte: Elaborada pelo autor

36

Figura 4. Expressão da proteína Fos em núcleos das vias de medo condicionado e não condicionado.

Fonte: Elaborada pelo autor

37

Figura 4. Continuação

A, D, G e J Fotomicrografias de campo claro de cortes do hipotálamo e amígdala corados com tionina (Nissl)

mostrando a citoarquitetura do sistema nervoso de camundongo. B e C Fotografias de campo claro mostrando a

expressão de Fos em neurônios do núcleo hipotalâmico anterior (AHN) em camundongos com injeção icv de

salina (B) ou NPS 1nM (C). E e F Fotografias de campo claro mostrando a expressão de Fos em neurônios do

núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) em camundongos com injeção icv de salina (E) ou NPS 1nM (F). H

e I Fotografias de campo claro mostrando a expressão de Fos em neurônios do núcleo pré-mamilar dorsal (PMD)

em camundongos com injeção icv de salina (H) ou NPS 1nM (I). K e L Fotografias de campo claro mostrando a

expressão de Fos em neurônios da amígdala em camundongos com injeção icv de salina (K) ou NPS 1nM (L).

Barra: 100m. Fonte: Elaborada pelo autor

38

5. DISCUSSÃO

Nossos resultados mostraram que a administração icv de NPS promoveu a expressão de

Fos em diversas áreas do encéfalo de camundongo. Dentro das vias de medo, a injeção icv de

NPS promoveu um aumento de Fos somente em núcleos da via de medo condicionado (CeA e

BLA).

Fos é uma ferramenta imunocitoquímica eficaz para mapeamento neuroanatômico dos

neurônios encefálicos que sofrem ativação genômica em resposta a estímulos discretos

fisiológicos ou farmacológicos (Morgan e Curran, 1991).

Sabe-se que uma maneira de se estudar a ativação neuronal é utilizando alguns genes de

transcrição imediata (IEGs), também chamados de protocongenes, que são expressos em

resposta a atividade celular. A expressão da proteína ou do RNAm derivados destes genes são

excelentes ferramentas neuroanatômicas indicadoras de atividade celular e vem sendo usadas

em uma gama de estudos que incluem a administração de drogas, estímulos sensoriais e/ou

comportamentos (Herrera e Robertson, 1996; Kovacs, 1998; Rajkumar et al., 2013).

O c-fos e o c-jun são IEGs e codificam, respectivamente, as proteínas Fos e Jun (Curran

e Morgan, 1987). Essas proteínas tendem a formar heterodímeros ou homodímeros e, dessa

maneira, apresentam afinidade de ligação ao DNA, provocando a ativação de seus genes alvos

(Angel et al., 1988; Ryzeck e Bravo, 1991).

Após a formação do dímero, através de um zíper de leucina (Landshultz et al., 1988), o

complexo se liga a uma seqüência gênica específica, o sítio AP-1, reconhecido como essencial

para a transcrição basal ou ativada de vários genes (Curran e Franza, 1988). Simultaneamente,

ao interagir com outros fatores de transcrição, o heterodímero das proteínas Fos e Jun forma

uma ligação entre sistemas de segundos mensageiros independentes (Hai e Curran, 1991;

Hagmeyer et al., 1993). Essas proteínas atuam, portanto como “terceiros mensageiros”

nucleares, ligando eventos mediados pelos segundos mensageiros a alterações subseqüentes

na expressão gênica (Morgan e Curran, 1988).

A presença da proteína Fos no encéfalo de rato adulto foi descrita pela primeira vez por

Dragunow e seus colaboradores (1987) que perceberam sua ativação após estimulação elétrica

levando a inflamação (Dragunow e Robertson, 1987a). A partir daí muitos estudos passaram a

utilizar a expressão de Fos ou seu RNAm como uma técnica que sinaliza a atividade neuronal.

Fos tem vantagens em relação a outros IEGs, pois Fos apresenta uma baixa expressão basal,

uma expressão rápida com pico do RNAm de 30 minutos e da proteína de 1 a 3 horas após o

estímulo, e transitória, com queda da expressão da proteína por volta de 6 horas após o

39

estímulo (Hunghes et al., 1992); (Sonnenberg et al., 1989; Chan et al., 1993; Kovacs e

Sawchenko, 1996). Portanto, escolhemos Fos como ferramenta para o mapeamento de

atividade neuronal em resposta a presença do NPS.

Evidências a partir de modelos de roedores indicam que o sistema de NPS é

criticamente envolvido na regulação de comportamentos condicionados e medo condicionado

(Xu et al., 2004; Jüngling et al., 2008; Pañeda et al., 2009).

As sensações de medo e raiva estão relacionadas com as conexões entre a amígdala, o

hipotálamo e a PAG. A amígdala é responsável pela detecção, geração e manutenção das

emoções relacionadas ao medo, bem como pelo reconhecimento de expressões faciais de

medo e coordenação de respostas apropriadas à ameaça e ao perigo (Phan et al., 2002; De

Gelder et al., 2004; Lee et al., 2006). A lesão da amígdala em humanos produz redução da

emocionalidade e da capacidade de reconhecer o medo. Por outro lado, ao sofrer estímulo a

amígdala pode levar o estado de vigilância ou atenção aumentada, além de ansiedade e medo

(Graham et al., 2006; Lee et al., 2006).

Segundo Carlson (2007), os neurônios individuais em vários núcleos da amígdala se

tornam ativos quando estímulos emocionalmente relevantes são apresentados (Carlson, 2007).

Dentro do medo condicionado 2 são os principais núcleos: a BLA, que recebe informações

sensoriais sobre os estímulos condicionados e incondicionados; e o CeA, que recebe

informação processada na BLA e outros núcleos da amígdala. Projeções neuronais do CeA

para o hipotálamo e para a substância cinzenta periaquedutal (PAG) evocam as respostas

comportamentais e fisiológicas que constituem o medo (Sah et al., 2003). Como descrito

anteriormente, a aprendizagem de medo envolve o pareamento de um estímulo neutro

(condicionado) a um estímulo aversivo (estímulo incondicionado), o que leva ao aumento da

atividade neuronal que são induzidos pelo estímulo condicionado e mediadas por receptores

de glutamato N-Metil-D-Aspartato (NMDA) (Sah e Westbrook, 2008). Esta plasticidade

sináptica resultante do estímulo condicionado evocam um aumento da resposta em neurônios

da BLA que projetam para o CeA e deste para a PAG levando a uma saída do circuito de

medo condicionado (Sah e Westbrook, 2008). Lesões da CeA abolem tanto as respostas

somato-motoras (congelamento) como vegetativas relacionadas à resposta condicionada

(Ledoux, 2003).

Um estudo realizado por Henry (2009) para examinar a conectividade dos neurônios do

medo e neurônios de extinção, sugeriu que os neurônios do medo recebem entradas do

hipocampo e projetam para o córtex pré-frontal medial. Neurônios de extinção, por outro

lado, estão ligados ao córtex pré-frontal medial em ambas as direções (Henry et al., 2009).

40

Assim, se o CeA está preservado, a apresentação isolada do estímulo neutro ou do contexto,

previamente pareado ao estímulo aversivo, irá provocar uma reação comportamental muito

característica de congelamento motor, bem como alterações autônomas diversas, no conjunto

consideradas como sendo a resposta de medo condicionado (Ledoux, 2000). A extinção

resulta de alterações na amígdala que bloqueiam os efeitos da potenciação a longo prazo,

possivelmente por ativação de neurônios locais que secretam o neurotransmissor inibitório

GABA. O córtex pré-frontal medial medeia a consolidação da extinção, bem como a

subsequente ativação destes neurônios secretores de GABA pelo estímulo condicionado (Sah

e Westbrook, 2008). Mas como a memória do medo condicionado é armazenada, como ela é

extinta e como elas se traduzem em resultados comportamentais, são situações ainda mal

compreendidas.

Como mencionado anteriormente, lesões ou bloqueio farmacológico do CeA previnem a

expressão do medo condicionado (Ledoux, 2000; Maren, 2001; Wilensky et al., 2006;

Johansen et al., 2011), mas não interfere com medo incondicionado para um predador

(Martinez et al., 2011). De modo contrário, lesões do MeA que bloqueariam respostas de

medo de um predador não bloqueiam respostas condicionadas a choque nas patas (Blanchard

et al., 2005). No entanto, as características inerentes ao medo condicionado não está restrita

apenas ao núcleo CeA. O BLA também participa desse tipo de emoção adaptativa. Evidências

sugerem que o BLA é um local crítico de plasticidade do medo condicionado e também é

necessário para a aquisição e armazenamento da extinção da memória (Blair et al., 2001;

Quirk e Mueller, 2008; Pape e Pare, 2010).

Estudos de mapeamento de atividade e de lesão neuronal em roedores mostram que

diferentes tipos de estímulos de ameaça ativam e dependem de diferentes partes da amígdala.

Em roedores, pistas olfativas têm um papel crucial na sinalização da presença de um predador

e estes sinais são transmitidos através de ligações diretas dos núcleos olfativos principal e

acessório para o MeA. Assim, os ratos expostos a um predador natural ou seu odor mostram

expressão diferenciada de Fos nesse núcleo (Dielenberg e Mcgregor, 2001).

Diversos estudos das últimas 2 décadas tem demonstrado que o medo da dor, do

predador e da agressão de membros da mesma espécie (medo social) são processadas em três

vias neurais independentes que incluem os núcleos da amígdala, hipotálamo e PAG (Gross e

Canteras, 2012).

Predadores e membros da mesma espécie agressivos provocam respostas de medo inato

(incondicionado) através da ativação de núcleos distintos da amígdala, que são, por sua vez

ligado a regiões distintas do AHN, VMH, PMD e PAG para produzir comportamentos

41

defensivos de forma apropriada. Assim, o medo de predadores envolve um circuito que inclui

a divisão posteroventral do MeA, a divisão dorsomedial do VMH, a parte ventrolateral do

PMD e a divisão dorsolateral da PAG (Gross e Canteras, 2012). Enquanto que o medo da

agressão de co-específicos envolve uma via que inclui a divisão posterodorsal da MeA, a

divisão ventrolateral do VMH, a parte dorsomedial do PMD e a divisão dorsomedial da PAG

(Gross e Canteras, 2012). Por outro lado, sinais que estão associados com estímulos dolorosos

ativam a CeA para induzir o comportamento defensivo através de sua projeção para a divisão

ventrolateral da PAG. Assim, diferentes classes de estímulos ameaçadores recrutam circuitos

paralelos e independentes para produzir medo (Gross e Canteras, 2012).

Acerca do hipotálamo, estudos utilizando ratos mostraram que existem duas redes de

núcleos altamente interconectados no hipotálamo medial (Canteras, 2002). Uma compreende

o AHN, a divisão dorsomedial do VMH e o PMD. E a outra inclui o núcleo pré-óptico medial,

a divisão ventrolateral do VMH, o núcleo tuberal e o núcleo pré-mamilar ventral (Swanson e

Petrovich, 1998; Swanson, 2000; Canteras, 2002). A exposição a um predador ou seu odor

ativa o primeiro circuito (Dielenberg et al., 2001; Cezario et al., 2008), que foi então chamado

de circuito hipotalâmico medial responsivo ao predador. Lesões ou bloqueio farmacológico de

um de seus componente, o PMD, reduz drasticamente respostas de medo a um predador ou ao

seu odor (Canteras et al., 1997; Blanchard et al., 2003; Blanchard et al., 2005; Canteras,

2008; Cezario et al., 2008). Este componente do circuito de defesa hipotalâmico recebe

densas projeções dos outros elementos deste sistema e ocupa uma posição estratégica para

acionar a PAG (Canteras et al., 1997; Blanchard et al., 2003).

No presente estudo mostramos que a expressão de Fos, após injeção icv de NPS, em

neurônios que compõem os núcleos que participam da via do medo incondicionado não foi

diferente do grupo controle, demonstrando que neurônios desta via não são ativados na

presença deste neurotransmissor. Dentre os núcleos da via de medo incondicionado estudados

aqui o MeA, o AHN e o VMH tem de moderada a alta expressão de NPSR, o que nos leva a

pensar que eles naturalmente se tornariam ativos na presença de NPS e expressariam Fos. No

entanto, o nosso achado caminha em concomitância com dados do trabalho de Zhao e

colaboradores (2012), onde o objetivo foi investigar em ratos os efeitos da injeção icv de

NPS, acompanhada pelo eletroencefalograma, do ciclo sono-vigília e da expressão de Fos em

núcleos do hipotálamo posterior relacionados ao sono. Apesar do objetivo do trabalho citado

acima ser diferente suas figuras do hipotálamo posterior de animais que receberam injeção icv

de NPS mostram claramente que não há um aumento de Fos no PMD e VMH (Zhao et al.,

2012). Isto não quer dizer que NPS não tenha um papel no medo incondicionado. Todas as

42

evidências apontam pra um papel ansiolítico de NPS, portanto o NPS pode estar fazendo um

papel de inibidor destes núcleos, reduzindo assim sua atividade e consequentemente o medo

de predador, o que levaria a uma redução ou não elevação da expressão de Fos. Contudo,

nenhum trabalho usando NPS e o paradigma presa-predador foi publicado até o momento. No

entanto, além de ansiolítico, o NPS parece ser panicolítico (Pulga et al., 2012), o que o

aproxima ainda mais de um efeito também na via de medo de predador, já que o medo de

predador tem sido considerado mais como um comportamento de pânico do que de medo

(Campos et al., 2013). Vale salientar que embora o MeA, o AHN e o VHM tenham de

moderada a alta expressão de NPSR, apenas o VMH tem moderada expressão de fibras

imunorreativas a NPS (NPS-ir) em camundongo, o que pode indicar que o NPSR pode ser

responsivo a outros neurotransmissores (Clark et al., 2011).

Ao contrário do papel de NPS na via de medo incondicionado, já existem alguns

trabalhos mostrando o papel de NPS e amígdala no medo condicionado. Marens e Quirk

(2004) mostraram que injeção de NPS diretamente no BLA antes do primeiro teste de medo

condicionado ou antes de um retorno ao contexto levaram a uma diminuição nas respostas de

medo condicionado mas não na aprendizagem, indicando que o NPS influencia na expressão

motora do medo (Maren e Quirk, 2004). Jüngling e colaboradores (2008) observaram a

redução de comportamento ansiolítico em testes como campo aberto e labirinto em cruz

elevado em camundongos que receberam injeção de NPS diretamente no BLA e no núcleo

lateral da amígdala (LA) (Jüngling et al., 2008). Injeção de NPS no BLA/LA também

facilitou a extinção do medo condicionado (Jüngling et al., 2008). Fendt e colaboradores

(2010) mostraram por meio de testes tais como estímulo luminoso e sonoro, choque nas patas

e campo aberto que o NPS dentro da amígdala desempenha um papel importante na expressão

do medo condicionado, provocando aumento do comportamento exploratório e ainda que os

efeitos de redução do medo do NPS são independentes dos efeitos NPS na atividade

locomotora, uma vez que esse peptídeo poderia se espalhar por outras áreas envolvidas na

modulação do comportamento locomotor (Fendt et al., 2010).

Concordando com o papel de NPS na modulação do medo condicionado diretamente na

amígdala, nosso trabalho mostra que injeção icv de NPS leva a um aumento da expressão de

Fos em dois dos principais núcleos amigdaloides que fazem parte da via de medo

condicionado, o CeA e BLA. Dentre eles o BLA apresenta alta expressão de NPSR e algumas

fibras NPS-ir, enquanto o CeA não apresenta expressão de NPSR e nem fibras NPS-ir (Clark

et al., 2011). No entanto, está claro que o papel de NPS é o de inibidor da via de medo,

causando assim redução do comportamento de medo condicionado. Pape e colaboradores

43

(2010) em uma revisão esquematizam sobre como o NPS age na amígdala para modular. De

acordo com eles o NPS age no córtex endopiriforme, que se projeta para o BLA, e no núcleo

intercalado medial, que se projeta para o CeA (Pape et al., 2010). Neurônios glutamatérgicos

do córtex endopiriforme excitariam interneurônios GABAérgicos do BLA que inibiriam seus

próprios neurônios de saída, enquanto que o LA ativariam os neurônios GABAérgicos do

núcleo intercalado medial que em seguida inibiriam CeA (Pape et al., 2010). Não sabemos

que neurônios do BLA expressam NPSR e não temos como afirmar que tipo de neurônios do

BLA estão expressando Fos em resposta a injeção icv de NPS, mas existe grande

possibilidade de serem justamente os seus interneurônios GABAérgicos. Quanto ao aumento

de Fos no CeA, mesmo ele recebendo uma projeção GABAérgica do núcleo intercalado

medial, o próprio possui uma população de aproximadamente 25% de interneurônios

GABAérgicos (Pape et al., 2010) que podem estar recebendo projeção direta do LA para fazer

uma inibição interna e estes podem ser os neurônios a estar expressando Fos em resposta a

injeção icv de NPS.

44

6. CONCLUSÃO

Nossos achados mostraram que a administração icv de NPS promoveu a expressão de

Fos em núcleos da via de medo condicionado, mas não em núcleos da via de medo

incondicionado. O papel de NPS na modulação do medo condicionado já tem sido

comprovado e dentro da via deste tipo de medo o BLA apresenta alta expressão de NPSR e

moderadas fibras NPS-ir. Além disso, apresenta interneurônios GABAérgicos que estão

ativos na inibição do medo e hipotetizamos que são estes a apresentar aumento da expressão

de Fos mediante a injeção de um neurotransmissor ansiolítico e panicolítico como o NPS. Já o

CeA não apresenta expressão de NPSR, nem tampouco fibras NPS-ir, no entanto ele também

tem interneurônios GABAérgicos dentro dele que podem estar ativos durante a inibição do

medo, justificando a expressão de Fos após injeção icv de NPS. Quanto aos núcleos

envolvidos na via de medo incondicionado, apenas alguns expressam RNAm de NPSR e a

inervação por fibras NPS é escassa, mas nenhum deles apresentou aumento de Fos após

injeção icv de NPS. Isto não quer dizer que NPS não tenha papel no medo incondicionado,

apenas que não ativa os neurônios dos núcleos de tal via quando injetado icv. Não podemos

deixar de especular que a concentração de NPS injetada em nossos experimentos possa ser

insuficiente para gerar uma ativação de tal via e que possivelmente o NPSR possui outros

ligantes que estão intereferindo na ligação de NPS nos diversos núcleos que expressam

NPSR. No entanto, nossos resultados apontam pra um papel modulador de NPS mais intenso

no medo condicionado que no medo incondicionado.

45

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8. ANEXO