UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · família científica, o LABMAT, o que me...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA

KAREN MYLENNA LUSTOSA PEREIRA

MODELO MURINO - Plasmodium berghei PARA ESTUDOS EM MALÁRIA EXPERIMENTAL

Natal 2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB

Pereira, Karen Mylenna Lustosa.

Modelo murino - Plasmodium berghei para estudos em malária experimental / Karen Mylenna Lustosa Pereira. - Natal, 2016.

45 f.: il.

Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto.

1. Malária - Monografia. 2. Plasmodium sp. - Monografia. 3. Modelo animal - Monografia. I. Andrade Neto, Valter Ferreira de.

II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.936

MODELO MURINO - Plasmodium berghei PARA ESTUDOS EM MALÁRIA

EXPERIMENTAL

por

Karen Mylenna Lustosa Pereira

Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto

Natal

2016

Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

CURSO DE BIOMEDICINA

A Monografia MODELO MURINO - Plasmodium berghei PARA ESTUDOS EM MALÁRIA EXPERIMENTAL elaborada por Karen Mylenna Lustosa Pereira e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de BACHAREL EM BIOMEDICINA Natal, 13 de Dezembro de 2016

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________ Valter Ferreira de Andrade Neto

Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Centro de biociências UFRN

_____________________________________________________ Maria de Fátima de Souza

Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Centro de biociências UFRN

____________________________________________________ Adriana Ferreira Uchoa

Departamento de Biologia Celular e Genética - Centro de biociências UFRN

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, por todo o esforço que fizeram para me manter nesta cidade, e

concluir a minha graduação.

Aos meus irmãos, principalmente a Karla, por aguentar quando eu começava a falar

sobre os assuntos das provas.

Ao professor Valter Ferreira de Andrade Neto, por ter me permitido participar de sua

família científica, o LABMAT, o que me permitiu aprender e evoluir com ela.

Agradeço também a todos os membros dessa família científica, os que ainda estão

presentes e os que já passaram.

Agradeço a todos os colegas de turma, por todas as experiências vividas nesses

quatro anos e meio.

Agradeço aos amigos e familiares, pela compreensão com minha ausência em

vários momentos importantes.

LISTA DE ABREVIATURAS

µL

A. albitarsis

A. aquasalis

A. bellator

A. cruzii

AGM

CID

EPO

Fd

GAF

H/mL

Hi

Hp

Ht

IFN-γ

IgG

IgM

IL1

IL6

IL8

IRA

LABMAT

LUMC

MC

MG

mg/dL

mmHg

NK

NO

OMS

PBS

P. berghei

Microlitro

Anopheles albitarsis

Anopheles aquasalis

Anopheles bellator

Anopheles cruzii

Anemia Grave na Malária

Coagulação Intravascular disseminada

Eritropoietina

Fator de diluição

Fator de ativação de gametócitos

Hemácias por mililitro

Hemácias infectadas contadas

Hemácias parasitadas

Hemácias totais contadas

Interferon gama

Imunoglobulina G

Imunoglobulina M

Interleucina 1

Interleucina 6

Interleucina 8

Insuficiência respiratória aguda

Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose

Leis Universitair Medisch Centrum

Malária cerebral

Malária grave

Miligramas por decilitro

Milímetros de mercúrio

Natural Killer

Oxido nítrico

Organização mundial da saúde

Tampão fosfato-salino

Plasmodium berghei

P. chabaudi

P. falciparum

P. knowlesi

P. malarie

P. ovale

P. vinckei

P. vivax

P. yoelii

SDRA

SIRS

TNF-α

TP

Plasmodium chabaudi

Plasmodium falciparum

Plasmodium knowlesi

Plasmodium malarie

Plasmodium ovale

Plasmodium vinckei

Plasmodium vivax

Plasmodium yoelii

Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo

Síndrome de Resposta Infamatória Sistêmica

Fator de necrose tumoral alfa

Tempo de protrombina

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Casos notificados de malária no Brasil no ano de 2015 (Fonte: DATASUS, 2016)..........................................................................................................................02

Tabela 2: Critérios para definir malária grave (Fonte: Monteiro, 2011).....................07

Tabela 3: Infecção por Plasmodium em diferentes linhagens de camundongos. (Fonte: Queiroz et al.; 2008).......................................................................................11

Tabela 4: cepas de Plasmodium berghei. (Fonte: LUMC, 2014)...............................14

Tabela 5: Média de parasitemia dos camundongos infectados.................................25

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo biológico do Plasmodium sp. (Fonte: CDC, 2014)..........................04

Figura 2: Formas parasitárias das quatro espécies de Plasmodium murino mais utilizadas na pesquisa. Em A trofozoitos de Plasmodium P. chabaudi. Note a sincronicidade da infecção. Em B trofozoito de P. yoelii em reticulócitos. Em C formas parasitarias do P. vinckei. Notar a preferencia desse parasita por células maduras. Em D formas parasitárias do P. berghei (Fonte: Culleton, 2005)...............12

Figura 3: Formas parasitárias de P. berghei ANKA encontradas na circulação (Fonte: LUMC, 2014)..................................................................................................14 Figura 4: Ciclo de desenvolvimento do Plasmodium no mosquito: transformações do Plasmodium e tempo de duração de cada fase (Fonte: Ríos-Velásquez, 2014)..........................................................................................................................18 Figura 5: Câmara de Neubauer. As hemácias devem ser contadas no quadrante central, nos quatro quadrados menores da extremidade e no quadrado menor central.........................................................................................................................21

Figura 6: Formas trofozoitas do Plasmodium berghei ANKA (Fonte: Arquivo

pessoal).....................................................................................................................24

Figura 7: Trofozoitos e esquizontes de P. berghei ANKA (Fonte: Arquivo pessoal,

2016)..........................................................................................................................25

Figura 8: eritrócitos infectados com Plasmodium berghei ANKA. A seta aponta para

um eritrócito com trofozoito e apresentando protuberâncias em sua superfície....................................................................................................................26

viii

RESUMO

A malária é uma doença que apresenta um caráter infeccioso agudo, com picos febris, e possui como agente etiológico protozoários do gênero Plasmodium. Segundo dados da OMS, em 2015 ocorreram 214 milhões de casos em todo o mundo, que acarretaram 438.000 mortes. Dessas mortes, 90% ocorreram na África Subsaariana, e setenta e oito por cento dos óbitos são de crianças com menos de cinco anos de idade. O modelo animal passou a ser utilizado nos estudos de malária grave devido a dificuldades no acompanhamento de casos de malária cerebral humana, assim como a limitação no que concerne na analise dos processos patológicos. O Plasmodium berghei ANKA é utilizado em grande parte dos estudos que tratam da malária cerebral, buscando entender a cadeia complexa de interação parasito-hospedeiro, e as formas de contornar a gravidade gerada nas complicações da doença. O LABMAT trabalha com as cepas NK65 e ANKA do Plasmodium berghei, e as manutenções de infecção são feitas semanalmente utilizando camundongos Swiss. É observado por meio de esfregaços as formas parasitarias, assim como é determinado a parasitemia e a mortalidade dos animais infectados com as duas cepas. Esses animais podem vir a ser utilizados em posteriores estudos envolvendo a doença. Com esse entendimento, é possível chegar à produção de formas de combate ao parasito, seja por meio de desenvolvimento de fármacos eficazes no tratamento de indivíduos contaminados, seja no desenvolvimento de vacinas que podem, não somente gerar uma imunidade duradora, mas também interromper o ciclo biológico do parasito.

Palavras-chave: Malária, Plasmodium sp., Modelo animal

ix

ABSTRACT

Malaria is a disease that presents an acute infectious character, with febrile

peaks, and has as etiological agent protozoa of the genus Plasmodium. According to

WHO data, in 2015 there were 214 million cases worldwide, which resulted in

438,000 deaths. Of these deaths, 90% occurred in sub-Saharan Africa, and seventy-

eight percent of deaths are from children under five years of age. The animal model

has been used in the studies of severe malaria due to difficulties in the monitoring of

cases of human cerebral malaria, as well as the limitation in what concerns the

analysis of the pathological processes. Plasmodium berghei ANKA is used in large

part of the studies dealing with cerebral malaria, seeking to understand the complex

chain of host-parasite interaction, and ways to circumvent the severity generated in

the complications of the disease. The Laboratory of Malaria Biology and

Toxoplasmosis works with Plasmodium berghei strains NK65 and ANKA, and

infection maintenance is done weekly using Swiss mice. Parasite forms are observed

by means of smears, as well as the parasitemia and the mortality of the animals

infected with the two strains. These animals may be used in later studies involving

the disease. With this understanding, it is possible to produce ways to combat the

parasite, either through the development of effective drugs in the treatment of

infected individuals or in the development of vaccines that may not only generate

lasting immunity but also interrupt the cycle of the parasite.

Key words: Malaria, Plasmodium sp., Animal model

Sumário LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... iv

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. vi

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vii

RESUMO.................................................................................................................. viii

ABSTRACT ................................................................................................................ ix

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1

1.1 Malária ............................................................................................................................. 1

1.2 Biologia do Plasmodium e ciclo evolutivo ......................................................................... 2

1.3 Aspectos imunológicos .................................................................................................... 5

1.4 Malária grave ................................................................................................................... 6

1.4.1 Complicações clínicas ......................................................................................... 7

1.5 Modelo animal ..................................................................................................... 10

1.6 Introdução aos Plasmodium de roedores ....................................................................... 10

1.6.1 Plasmodium berghei ............................................................................................ 13

1.6.2Ultraestrutura, invasão celular de hospedeiros vertebrados e invertebrados ....... 16

2. OBJETIVOS ................................................................................................... 19

2.1 Objetivo geral ................................................................................................................. 19

2.2 Objetivos específicos ..................................................................................................... 19

3. METODOLOGIA ............................................................................................ 20

3.1 Infecção dos animais ..................................................................................................... 20

3.2 Preparação do inóculo ................................................................................................... 20

3.2.1 Determinação da porcentagem de hemácias parasitadas .................................... 20

3.2.2 Determinação da concentração de hemácias ...................................................... 21

3.2.3 Diluição do inóculo ............................................................................................... 21

3.3 Parasitemia dos animais ................................................................................................ 22

3.4 Congelamento de cepa .................................................................................................. 22

3.5 Descongelamento de cepa ............................................................................................ 23

4. RESULTADOS ............................................................................................... 24

4.1 Identificação de formas parasitárias ............................................................................... 24

4.1.1 Trofozoitos ........................................................................................................... 24

4.1.2 Esquizontes ......................................................................................................... 24

4.2 Crescimento parasitário ................................................................................................. 25

4.3 Mortalidade .................................................................................................................... 26

5. DISCUSSÃO .................................................................................................. 27

6. REFERÊNCIAS .............................................................................................. 29

1

1. INTRODUÇÃO 1.1 Malária

A malária é uma doença que apresenta um caráter infeccioso agudo, com

picos febris, e que é transmitida através da fêmea do Anopheles, no momento em

que o inseto infectado realiza o repasto sanguíneo. Apresenta-se como uma seria

situação problemática no âmbito da saúde publica, que afeta principalmente regiões

tropicais e subtropicais, com elevada taxa de infecção e mortalidade.

A malária possui como agente etiológico protozoários do gênero Plasmodium,

pertencentes ao filo Apicomplexa, família Plasmodiidae. O gênero se apresenta com

mais de 150 espécies que infectam diferentes hospedeiros vertebrados, sendo que

em geral as espécies são hospedeiro-específico (Singha; Daneshvar, 2013). As

espécies responsáveis por causar a infecção em humanos são o Plasmodium vivax,

Plasmodium falciparum, Plasmodium malarie, Plasmodium ovale e, mais

recentemente, o Plasmodium knowlesi passou a ser considerado a quinta espécie

causadora da malária em humanos, sendo que aparece como agente de infecções

principalmente no sudeste asiático. O P. vivax apresenta uma melhor distribuição se

comparado às outras espécies (Lacerda, 2007), enquanto que o P. falciparum

apresenta maior morbidade e mortalidade (Wright, 2010).

Segundo dados da OMS, em 2015 ocorreram 214 milhões de casos em todo

o mundo, que acarretaram 438.000 mortes. Dessas mortes, noventa por cento

sucederam na África Subsaariana, e setenta e oito por cento dos óbitos são de

crianças com menos de cinco anos de idade. Porém, entre os anos de 2000 e 2015

a taxa de mortalidade ocasionada pela malária diminuiu em sessenta por cento a

nível global, com o número de casos de infecção por malária caindo em trinta e sete

por cento.

Já no Brasil, segundo dados do ministério da saúde, em 2015 foi registrado o

menor número de casos de malária dos últimos 35 anos, com a notificação de

143.647 casos em todo o território nacional, sendo que desses 138.697 foram de

casos autóctones e 4.953 importados de outros países (tabela 1). Já o número de

óbitos ficou em 26, uma redução de oitenta e nove por cento se comparado ao ano

de 2000. A área endêmica de transmissão da doença no Brasil compreende a região

da Amazônia legal, atingindo os estados de Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão,

Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins, sendo responsáveis por

2

noventa e nove por cento dos casos de malária autóctone notificados no país.

Mesmo com poucos casos de malária autóctone na região extra-amazônica, a

vigilância é mantida, procurando evitar a reintrodução da doença devido ao fluxo

migratório por áreas susceptíveis, assim como o aumento da letalidade por

diagnóstico tardio (Portal Saúde, 2016).

Tabela 1: Casos notificados de malária no Brasil no ano de 2015

(Fonte: DATASUS,2016)

1.2 Biologia do Plasmodium e ciclo evolutivo

O Plasmodium sp. pertence ao filo Apicomplexa, ou seja, apresenta como

característica a presença do apicoplasto, além de um complexo apical visualizado

nos estágios moveis e infecciosos, utilizado principalmente para a realização da

invasão celular. Das cinco espécies que afetam os humanos, quatro são

especificamente humanas (P. falciparum, P. vivax, P. malarie e P. ovale) e a quinta

infecta também primatas não humanos (P. knowlesi). No Brasil, apenas as espécies

P. falciparum, P. vivax e P. malarie causam infeção, não sendo registrados casos

autóctones por ovale e knowlesi.

O P. falciparum causa doença com maior gravidade, uma vez que multiplica-

se rapidamente na corrente sanguínea, chegando a destruir de dois a vinte e cinco

por cento do total de hemácias, ocasionando grave anemia (Price et al., 2007). Essa

espécie é responsável também pelos casos de malária grave, uma vez que possui a

3

capacidade de remodelar eritrócitos parasitados tornando-os mais agregativos, o

que pode vir a ocasionar tromboses e embolias (Maier et al., 2009).

A doença causada pelo P. vivax e pelo P. malarie são bastante semelhantes,

com um quadro de menor gravidade, apresentando anemia discreta, com alguns

casos de ruptura esplênica e síndrome nefrótica. A mortalidade aqui ocorre

raramente. Nos casos de infecção por P. vivax o tratamento é mais complicado que

na infecção por P. falciparum, uma vez que essa espécie possui a capacidade de

ficar adormecido no fígado sob a forma de hipnozoítos, que são formas

adormecidas, dificultando a eliminação. Porém é importante salientar que, segundo

Naing et al., (2014) o Plasmodium vivax está envolvido em casos de malária severa,

não sendo uma exclusividade somente do P. falciparum.

O gênero Anopheles é o principal transmissor da malária. Esses insetos

pertencem a ordem dos dípteros, família Culicidae. As espécies encontradas no

Brasil são o Anopheles darlingi, A. aquasalis, A. albitarsis, A. cruzii e A. bellator,

sendo que o A. darlingi é o principal vetor no Brasil, por causa de sua ampla

distribuição geográfica, antropofilia e a capacidade de ser infectado por espécies

diferentes. (FIOCRUZ, 2016).

O Plasmodium sp. apresenta ciclo de vida heteroxênico, ou seja, o ciclo

envolve um hospedeiro vertebrado (intermediário) e um invertebrado (definitivo), que

é um mosquito do gênero Anopheles (figura 1). A infecção no vertebrado se inicia

quando a fêmea infectada realiza o repasto sanguíneo e inocula esporozoítos no

hospedeiro. Esses esporozoítos uma vez na corrente sanguínea, seguem até os

hepatócitos, onde invadem essas células, amadurecem em esquizontes hepáticos,

tornando-se posteriormente merozoítos, quando rompem o hepatócito e são

liberados, envolvidos em membrana merossomal, na corrente sanguínea. P. vivax e

P. ovale possuem a capacidade de gerar hipnozoítos, permanecendo no fígado sob

a forma adormecida, e causar a doença semanas ou até anos depois da primeira

picada do mosquito. Uma vez livres do hepatócito, os merozoítos darão inicio a

multiplicação assexuada nos eritrócitos, ligando-se a superfície das hemácias,

passam para o interior, onde ficarão armazenados em vacúolos parasitóforos. Uma

vez nesses vacúolos podem seguir duas vias de desenvolvimento: diferenciar-se em

esquizontes e desenvolver novos merozoítos, que infectam novos eritrócitos, ou

produzir formar sexuais: gametócito masculino e feminino (Castro; Rodríguez, 2009).

4

A parte do ciclo que ocorre no fígado é denominada fase exoeritrocítica, enquanto

que a parte que ocorre nos eritrócitos é a fase eritrocítica. No processo de

diferenciação do merozoítos, os protozoários se diferenciam em trofozoitos e pelo

processo de esquizogonia se replicam até o rompimento das hemácias ocorrendo

assim os picos febris, sendo 24 horas para o P. knowlesi, 48 horas para P.

falciparum, P. vivax e P. ovale e 72 horas para P. malarie (Albrecht, 2008). O ciclo

no inseto ocorre quando a fêmea do mosquito ao realizar o repasto sanguíneo em

um hospedeiro infectado, ingere os gametócitos. Esses gametócitos, uma vez no

intestino dos insetos irão se diferenciar em gametas masculino e feminino, que uma

vez fecundados originam os zigotos. Os zigotos se transformam em oocinetos

móveis, que irão invadir o epitélio intestinal do mosquito até alcançar a lamina basal,

e posteriormente se converterão em esporozoítos, migrando para as glândulas

salivares do inseto, para iniciar um novo ciclo.

Figura 1: Ciclo biológico do Plasmodium sp.

(Fonte: CDC, 2013)

5

1.3 Aspectos imunológicos

Segundo Queiroz et al., (2008), o inicio da resposta imunológica se dá ainda

na fase exoeritrocítica, com a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-γ e

TNF-α, que agem como mediadores na eliminação do parasito através da via óxido

nítrico (NO) e da produção de interleucinas IL1, IL6 e IL8, assim como por meio das

células TCD8+ e TCD4+, que atuam através de ação citolítica ou por meio de

produção de citocinas pró-inflamatórias. Já na fase eritrocítica a resposta passa a

ser mediada por macrófagos e linfócitos TCD4+ auxiliares dos subtipos Th1 e Th2,

com produção de IFN-y, radicais de oxigênio e nitrogênio e produção de citocinas.

A exposição dos antígenos do parasito, no momento da ruptura dos

eritrócitos, é o que inicia as manifestações clássicas da malária, tais como febre

intermitente, náusea, cefaleia. Isso ocorre devido ação das citocinas inflamatórias

que geram danos teciduais e sistêmicos na tentativa de lutar contra a infecção. A

evolução da doença para a malária grave pode ocorrer em casos em que a doença é

negligenciada.

No momento em que ocorrem as primeiras esquizogônias sanguíneas

também da inicio a resposta humoral, devido aos antígenos parasitários lançados na

corrente sanguínea, antígenos estes que podem ser corpos residuais dos

esquizontes, glicoproteínas da superfície externa dos merozoítos, entre outros. A

resposta de fase aguda é direcionada para os diferentes estágios do

desenvolvimento do parasito, e as hemácias parasitadas apresentam em sua

membrana antígenos específicos do Plasmodium sp., o que auxilia no

reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro.

Um dos aspectos mais marcantes da infecção malárica é a

hipergamaglobulinemia, que se caracteriza por uma produção aumentada de IgG e

IgM (Mioto et al., 2012). A resposta imune protetora não é efetiva por causa da

diversidade e estrutura dos antígenos parasitários, o que acaba dificultando a

resposta imune. Além disso, os parasitos apresentam uma grande diversidade

antigênica, aumentando a capacidade de escape à resposta imune, adaptando-se

ao hospedeiro vertebrado.

A base da imunidade celular antimalárica é a hiperplasia do sistema

macrófagolinfóide. O principal dispositivo de defesa do organismo contra esses

6

parasitos é a fagocitose de muitos merozoítos e hemácias parasitadas, que ocorre

logo após cada esquizogonia (Mioto et al., 2012). O baço é o principal local no qual

ocorre essa limpeza, motivo pelo qual aumenta de volume (esplenomegalia), porém

no fígado e medula óssea pode ocorrer também essa limpeza, por meio do sistema

fagocítico mononuclear. As células auxiliares agem ativando linfócitos B e

aumentando resposta humoral, além de ativar macrófagos e células NK.

1.4 Malária grave

A gravidade da malária depende da relação entre hospedeiro (vulnerabilidade

e estado imunológico) e o Plasmodium sp. (espécie infectante e densidade

parasitária), (Gomes et al., 2011). Levando em consideração os aspectos do

hospedeiro, os idosos, as gestantes, crianças e os primoinfectados apresentam

maior chance de desenvolver as formas graves da doença. Ou seja, os fatores de

risco para o desenvolvimento da MG incluem idade superior a 65 anos, sexo

feminino (especialmente quando associado à gravidez), estado não imune,

condições médicas coexistentes, ausência de profilaxia antimalárica, atraso no

tratamento e o estado de gravidade da doença no momento da admissão (Trampuz

et al., 2003). A grande parte dos casos registrados de óbito por malária se deve a

infecção pelo P. falciparum, porém há registros de óbitos ocasionados pela infecção

por P. vivax.

De acordo com a OMS, os critérios utilizados para definir malária grave por P.

falciparum e por P. vivax são os mesmos, com diferença que na malária grave por P

vivax não é considerado o critério de hiperparasitemia e nem a densidade

parasitológica.

De acordo com alguns autores, a MG pode vir a ser definida como doença

multissistêmica, em que predomina resposta inflamatória a infecção, que gera uma

Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS), cuja manifestação clínica se

dá por meio de uma termo-desregulação, taquicardia, taquipineia, leucocitose em

que pode ou não ocorrer desvio a esquerda. Os achados clínicos de uma MG

incluem alguns aspectos, tais como alterações de consciência (em que pode ocorrer

o coma), prostração com fraqueza generalizada, dificuldade em alimentar-se,

respiração acidótica, choque, crises convulsivas múltiplas, icterícia, hemoglobinúria,

hemorragias espontâneas, edemas pulmonares, insuficiência renal. Além de

7

achados laboratoriais que incluem hipoglicemia, acidose metabólica, anemia severa,

hiperparasitemia, hiperlactemia e hipovolemia (Tabela 2).

1.4.1 Complicações clínicas

Entre as complicações decorrentes da MG podem ser citados complicações

neurológicas (malária cerebral), anemia severa da malária, insuficiência respiratória

com acidose metabólica, quadro hiperglicêmico, insuficiência renal, hipotensão,

choque e distúrbios da coagulação.

A malária cerebral (MC) é a apresentação clínica mais comum e causa de

morte em adultos em áreas de baixa endemicidade (Trampuz et al., 2003). Os

sintomas iniciais da MC podem estar incluídos convulsão generalizada ou focal, com

sonolência e confusão mental. Os sintomas podem evoluir, levando o paciente a

apresentar um quadro de coma, que pode durar algumas horas ou até mesmo dias.

Acredita-se que uma das causas para o surgimento da MC e consequente

encefalopatia estão associados com sequestro eritrocítico de eritrócitos parasitados

em vênulas da circulação cerebral.

A Anemia Grave na Malária (AGM) ocorre devido a um conjunto de fatores,

em que a destruição de eritrócitos e a eritropoiese ineficaz exercem fundamental

papel na etiologia. Os eritrócitos são destruídos de modo direto pela infecção

parasitária, em decorrência da lise que ocorre quando os parasitos rompem a célula

após o ciclo de desenvolvimento. Porém não é só o processo de lise mediado pelo

parasito que acarreta toda a anemia. O sistema imune também exerce seu papel,

uma vez que os demais eritrócitos, mesmo não estando parasitados, sofrem

fagocitose e lise mediada pelo completo. Além disso, são observados contagem de

reticulócitos bem baixos, o que condiz com uma produção ineficaz de eritropoietina

(EPO) e em consequência produção insuficiente de células eritroides. Estudos de

Miller et al., (1994) e Casals-Pascual et al., (2006) demonstraram que há uma

associação entre os níveis elevados de TNF-α e IFN-γ, que são citocinas

inflamatórias, e a ineficaz produção de Epo. Estudos in vitro com cultura de células

humanas, mostraram que o TNF-α possui a capacidade de suprimir a proliferação de

células progenitoras da linhagem eritroide. Segunda a OMS o quadro de anemia

grave é confirmado por meio da dosagem de hemoglobina e do hematócrito. Em

8

crianças, a AGM apresenta hemoglobina <5 g/dL e um hematócrito < 15%. Já em

adultos, a hemoglobina se apresenta < 7 g/dL e hematócrito < 20% (OMS, 2004).

A insuficiência respiratória e a acidose metabólica ocorrem frequentemente na

malária grave e apresenta-se como um mau prognóstico da doença. O paciente

desenvolve a Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA), apresentando

sintomas como taquipneia, respiração profunda e ofegante, hipoxemia e por fim a

própria insuficiência respiratória (IRA), que leva ao paciente a necessidade de uso

de apoio ventilatório. Na MG, a IRA é definida como o aparecimento súbito de um

infiltrado pulmonar bilateral com desiquilíbrio da razão ventilação/perfusão < 300

mmHg e uma pressão da artéria pulmonar < 18 mmHg, sem evidências de

hipertensão arterial (Monteiro, 2011). A acidose metabólica severa tem sua origem

explicada na glicólise anaeróbica do hospedeiro e na interferência do sequestro

parasitário na microcirculação, além de produção aumentada de lactato,

hipovolemia, a insuficiência hepática e renal.

A hipoglicemia na MG apresenta-se com uma dosagem de glicose menor que

40 mg/dL. É bastante frequente, principalmente em crianças e grávidas. Tem como

sintomas dispneia, taquicardia, sudação profunda, coma, convulsões, alterações

posturais e ansiedade, sintomas estes que se confundem com a própria MG, o que

acaba gerando certa negligencia quanto ao diagnóstico. Segundo Weatherall et al.,

(2002) e Breman et al., (2010), crianças que apresentam concentrações normais de

insulina, porém desenvolvem quadro de hipoglicemia pode ter uma disfunção na

gliconeogênese hepática e o aumento do consumo de glicose nos tecidos periféricos

e pelos parasitos.

No quadro de insuficiência renal, a creatinina apresenta-se maior que 265

mmol, e o paciente desenvolve um quadro de oligúria ou anúria, podendo ser

necessário diálises. Apresenta-se comumente em adultos não imunes.

O quadro de colapso circulatório ocorre, segundo a OMS, quando a pressão

arterial sistólica encontra-se menor que 70 mmHG em adultos e 50 mmHg em

crianças. O quadro pode ocorrer de forma súbita, em conjunto com edema

pulmonar, acidose metabólica e hemorragia massiva.



9



Tabela 2: Critérios para definir malária grave

(Fonte: Monteiro, 2011).





Os distúrbios da coagulação constitui outro aparecimento presente nos casos

de MG. Segundo a OMS, a trombocitopenia é um achado que aparece de forma

constante nos casos de malária grave, porem não estão associados a episódios de

hemorragia. Os episódios hemorrágicos são decorrentes de distúrbios de

coagulação, tais como a Coagulação Intravascular Disseminada (CID). Na CID

aparece aumento dos produtos de degradação da fibrina (D-dímero), concentração

10

abaixo do normal de fibrinogênio, TP prolongado, associado com trombocitopenia.

Assim sendo, os indivíduos doentes apresentam hemorragias em mucosas, em

locais de punção e em casos graves podem apresentar necrose tecidual.

1.5 Modelo animal

O modelo animal passou a ser utilizado nos estudos de malária grave devido

a dificuldades no acompanhamento de casos de malária cerebral humana, assim

como a limitação no que concerne na analise dos processos patológicos. O modelo

mais utilizado é aquele que emprega camundongos infectados por diferentes

espécies de Plasmodium murinos adaptados (tabela 3), que acaba permitindo um

melhor estudo e elucidação de aspectos e características patogênicas da doença.

Porém é importante uma melhor analise dos dados obtidos do estudo com o

modelo animal, uma vez que apresentam algumas diferenças. Um exemplo seria

que no modelo murino o tipo predominante de célula sequestrado na microcirculação

cerebral é o leucócito, enquanto que na humana o tipo celular é o eritrócito (Queiroz

et al, 2008).

O Plasmodium berghei ANKA é utilizado em grande parte dos estudos que

tratam da malária cerebral, uma vez que apresenta divisão característica entre os

camundongos que são susceptíveis a infecção e aqueles que apresentam

resistência. Aqueles susceptíveis a infecção pode ocorrer o aparecimento de

angustia respiratória, anemia, nefrite e malária cerebral, achados semelhantes a

malária por P. falciparum. Já as espécies resistentes, não morrem pela MC, uma vez

que não a desenvolvem, morrendo em torno de vinte dias devido a grave anemia. A

infecção por P. berghei ANKA apresenta-se com um intenso processo inflamatório.

Outra espécie de Plasmodium utilizado no estudo de malária cerebral é o P. yoelii

17XL. A infecção por esse parasito se apresenta com um processo inflamatório

menos intenso que o P. berghei ANKA e sequestro de eritrócitos parasitados na

microcirculação. Já infecção por P. chabaudi pode cursar de maneira letal ou não,

dependendo da genética do hospedeiro.

1.6 Introdução aos Plasmodium de roedores

O isolamento da primeira cepa de Plasmodium de roedor foi feito por Vincke e

Lips, em 1948, na África central, mais precisamente no Zaire. O Plasmodium foi

encontrado em glândulas salivares da espécie silvestre de Anopheles dureni, e em

11

1954 foi possível encontrar o parasita na circulação de roedores silvestres

Thamnomys surdaster, Praomys jacksoni e Leggada bela (Garnhan, 1966; Queiroz,

2007). O primeiro isolado foi, então, nomeado de Plasmodium berghei. A cepa NK65

foi isolada em 1964 e a cepa ANKA em 1966, ambas encontradas em Anopheles

dureni. Estudos tem mostrado a capacidade de Anopheles stephensi, Anopheles

gambiae e Aedes aegypti atuarem como vetores de P. berghei (Queiroz, 2007). A

partir de então, varias espécies e subespécies de Plasmodium de roedores foram

isoladas (Peters; Richards, 1984).

A primeira transmissão bem sucedida em laboratório, utilizando-se de

mosquitos Anopheles quadrimaculatus, foi feita em 1964 por Yoeli e colaboradores;

procedimento foi então modificado no ano de 1965 por Vanderberg e Yoeli, e em

1966 foi padronizado.

As espécies e subespécies de Plasmodium são divididas em dois grupos

principais: o grupo berghei, composto por Plasmodium berghei, P. yoelii e P. y.

nigeriensis, e o grupo vinckei contém P. vinckei e P. chabaudi.

Os estágios sanguíneos do grupo berghei apresentam predileção por

eritrócitos imaturos no sangue de roedores de laboratório, diferentemente daqueles

pertencentes ao grupo vinckei, que são caracterizados por não apresentarem tal

preferencia (Killick-Kendrick, 1978).

O P. chabaudi apresenta duas subespécies, o P. chabaudi chabaudi e P.

chabaudi adami. O parasito apresenta fácil repique em camundongos e ratos, tendo

preferencia por parasitar eritrócitos maduros. Possui infecção síncrona, com

periocidade de 24 horas (figura 2A). O P. yoelii apresenta infecção assíncrona, com

periocidade de 22-25 horas, tendo preferencia por eritrócitos imaturos (figura 2B). O

P. vinckei foi isolado primeiramente em 1952, porem só teve seu reconhecimento

como espécie individual em 1975. Possui quatro subespécies reconhecidas, sendo

elas P. vinckei vinckei, P. vinckei petteri, P. vinckei lentum e P. vinckei brucechwatti.

Apresenta preferencia por eritrócitos maduros, com infecção síncrona (figura 2C).

12

Tabela 3: Infecção por Plasmodium em diferentes linhagens de camundongos.

(Fonte: Queiroz et al., 2008)

As particularidades de cada espécie de Plasmodium murino são o que os

torna ideais no estudo e sua relação com a malária humana. Como o P. chabaudi e

o seu uso principalmente no que concerne os mecanismos de resistência a

medicamentos e evasão do sistema imune. Uma das características dessa espécie é

a capacidade de gerar infecção crônica e não-letal. Já o P. berghei, como falado

anteriormente, é capaz de gerar uma infecção grave, por isso é o indicado em

estudos que envolve a malária grave e seus aspectos, como a malária cerebral, por

exemplo. O P. yoelii é mais utilizado em estudos sobre a biologia dos estágios extra

eritrocítico, tais como o estagio hepático e a ação do sistema imune nessas formas

(Otto et al., 2014).

13

Figura 2: Formas parasitárias das quatro espécies de Plasmodium de roedor mais utilizadas

na pesquisa.

Em A trofozoitos de Plasmodium chabaudi. Note a sincronicidade da infecção. Em B trofozoito de P. yoelii em reticulócitos. Em C formas parasitarias do P. vinckei. Notar a preferencia desse parasita por células maduras. Em D formas parasitárias do P. berghei (Fonte: Culleton, 2005).

1.6.1 Plasmodium berghei

Após o primeiro isolamento do P. berghei em 1948, varias outras cepas foram

obtidas (tabela 4). Cada uma dessas cepas apresenta característica que as tornam

ideais para linhas de estudos especificas.

As cepas do P. berghei apresentam-se com características semelhantes

entre seus ciclos biológicos, morfologia e duração de desenvolvimento parecidos

(figura 3). As pequenas diferenças encontradas em cada uma das cepas influenciam

diretamente seu uso em determinadas linhas de pesquisa (tabela 3). Essas

variações podem ser, por exemplo, intensidade de infecção gerada, virulência da

cepa, patologia, entre outros.

A B

C D

14

Figura 3: Formas parasitárias de P. berghei ANKA encontradas na circulação.

(Fonte: LUMC, 2014)

As cepas do P. berghei apresentam, em geral, preferência por parasitar

reticulócitos. Ainda que, foi visto que certas cepas apresentam uma maior predileção

por reticulócitos, como as cepas de NK65 em camundongo Swiss se comparadas as

cepas de ANKA (LUMC, 2014). Porém, quando a mudança é feita, e a comparação

ocorre em ratos Wistar, é observado que as cepas de P. berghei ANKA apresentam

maior predileção por reticulócitos que as cepas de NK65. É importante salientar que

o Plasmodium berghei também é capaz de infectar eritrócitos maduros.

O ciclo assexuado é em geral assincrônico, com os diferentes estágios

sanguíneos simultaneamente presentes no sangue no decorrer da infecção. Podem

ocorrer Infecções múltiplas de eritrócitos em que há poliparasitismo extensivo,

apresentando massa citoplasmática com aparência contínua, com aspecto de

esquizonte maduro (Queiroz, 2007).

15

A produção de merozoítos é variada de acordo com o estagio celular

parasitado. De uma forma geral, a infecção em eritrócitos maduros produz de 6 a 12

merozoítos enquanto que em reticulócitos, pode chegar a 18.

Os esquizontes eritrocíticos, principalmente de P. berghei ANKA costumam

desaparecer da circulação sanguínea sendo sequestrados no baço e pulmão,

podendo também ocorrer sequestro no tecido adiposo. Entre uma cepa e outra pode

ocorrer pequenas diferenças na quantidade de esquizontes circulantes. Por

exemplo, cepas de k173 em geral apresentam quantidades maiores de esquizontes

circulantes no sangue periférico que as cepas de ANKA.

O fator virulência da infecção depende em grande parte de fatores genéticos

do animal infectado. Uma infecção com P. berghei causa morte do animal em três

semanas em média, quando os animais podem morrer de complicações da doença,

como anemia grave. Porém, naqueles animais mais susceptíveis, a morte pode

ocorrer em torno de uma semana, devido complicações graves, como malária

cerebral. Outro fator que pode influenciar na infecção é dose de infecção.

camundongos infectados com uma concentração de 107, por exemplo, podem

apresentar evolução da doença mais rápida do que aqueles infectados com 105

células parasitadas. (ANDRADE-NETO, V. F., et al.).

A produção de gametócitos é influenciada por fatores ambientais. Algumas

estirpes aparentemente perdem a capacidade de produzir gametócitos. Tal fato é

visto em animais em que a passagem de cepa é feito por via sanguínea de um

animal para o outro, sem o estimulo do mosquito.

A duração da esporogonia no mosquito depende grandemente da

temperatura ambiental, e a invasão de glândulas salivares é diferente em cada um

dos hospedeiros invertebrados utilizados no laboratório, aja vista que foi observado

que ocorre uma invasão maior em A. stephensi e em A. quadrimaculatos. Já a

invasão de esporozoítos em células hepáticas varia de acordo com o roedor

utilizado, principalmente. Sendo que os roedores podem ser desde resistentes a

altamente susceptíveis a infecção hepática.

16

Tabela 4: cepas de Plasmodium berghei.

(Fonte: LUMC, 2014)

1.6.2 Ultraestrutura e invasão celular de hospedeiros vertebrados e

invertebrados

A estrutura do P. berghei é bastante semelhante aos dos parasitas humanos.

Assim como os esporozoítos humanos, o P. berghei também apresenta a

capacidade de invadir hepatócitos. Resumidamente, a invasão se inicia por meio da

invaginação da membrana plasmática da célula hospedeira, formando um vacúolo

parasitóforo, que engloba o esporozoítos. Em um período que gira em torno de 47-

52 horas os esporozoítos evoluem até esquizonte maduro, podendo gerar 1500 a

8000 merozoítos. Após a ruptura da célula hepática os merozoítos são libertados na

corrente sanguínea passando a invadir glóbulos vermelhos. Estudos não

encontraram formas hipnozoítas de P. berghei no fígado.

Os merozoítos sanguíneos do P. berghei possuem semelhanças morfológica

com os merozoítos de Plasmodium humano, tendo conservadas características

relacionadas a invasão eritrocítica, tais como roptrias, micronemas, grânulos densos

e proteínas de superfície que desempenham importante papel na invasão da célula.

Após invadir o eritrócito, o merozoítos segue o seu desenvolvimento a

trofozoito, apresentando aumento no tamanho celular e citoplasmático. Assim como

na infecção humana, o trofozoito consome a hemoglobina, produzindo hemozoína,

17

que pode ser vista como grânulos pigmentares no citoplasma. O desenvolvimento

até atingir o estagio de trofozoito maduro leva cerca de 16 horas, e no final o

parasita duplica seu DNA, seguindo para a divisão celular, e entra no estagio de

esquizonte. Essa esquizogonia leva cerca de 6 a 8 horas, em que o parasito sofre

seguidas replicações de seu DNA, dividindo seu núcleo, por meio endomitótico, em

diversas vezes, originando uma célula sincicial com 8 a 24 núcleos. A duração total

do desenvolvimento sanguíneo gira em torno de 22 a 24 horas, e esquizontes em

eritrócitos maduros geralmente geram menos merozoítos que aqueles que se

apresentam em reticulócitos.

Já o período de desenvolvimento de gametócito de P. berghei leva em torno

de 36 horas. Há diferenças evidentes entre gametócitos de P. falciparum e P.

berghei, como a forma de banana para o primeiro e formas redondas a ovais no

segundo. De uma forma geral, a morfologia, duração de desenvolvimento e

produção de gametócitos são bastante semelhantes com as de outras espécies que

causam malária em humanos e em primatas não humanos.

O desenvolvimento do P. berghei em mosquitos é bastante estudado. Durante

o repasto sanguíneo, os mosquitos ingerem gametócitos masculinos e femininos, e,

uma vez dentro do intestino médio, esses gametócitos se transformam por meio de

gametogênese em microgametas, que são os gametas masculinos, e

macrogametas, gametas femininos. De uma forma geral, os macrogametas saem do

eritrócito e se transformam um único gameta esférico, enquanto os microgametas

sofrem uma serie de três ciclos de replicação do DNA, gerando oito microgametas,

processo esse conhecido por exflagelação (Ríos-Velásquez, 2014). Em pesquisas

foram relatados a presença de pelo menos três gatilhos iniciadores no processo de

diferenciação de gametócitos, que são: queda de temperatura do sangue em pelo

menos 5ºC em relação ao hospedeiro vertebrado, aumento de pH, que vai de 7,3 até

7,8-8,0 e a presença de fatores de ativação de gametócitos (GAF). O processo de

formação do gameta e morfologia são comparáveis nas espécies que infectam

roedores e humanos, além de que proteínas de superfície desses gametócitos são

conservadas nessas espécies (LUMC, 2014).

A fecundação dos macrogametas pelos microgametas e a formação do zigoto

ocorrem de forma rápida, geralmente de 2 a 3 horas após o repasto sanguíneo. Nas

18

seguintes horas, por volta de 10-30 horas, o zigoto se transforma em oocineto

móvel, migrando até as células do epitélio intestinal, e as atravessa, entrando em

contato com a lâmina basal, onde se transforma em oocisto. A formação desses

oocistos começa em torno de 24 horas após o repasto (figura 4). Os esporozoítos

são formados através de esporogonia e quando liberados circulam pela hemocele,

chegando até as glândulas salivares, onde as invade. Uma vez nas glândulas,

alcançam os ductos salivares do inseto, podendo ser inoculadas no hospedeiro

vertebrado no momento de um novo repasto sanguíneo (Ríos-Velásquez, 2014).

Figura 4: Ciclo de desenvolvimento do Plasmodium no mosquito: transformações do

Plasmodium e tempo de duração de cada fase

(Fonte: Ríos-Velásquez, 2014)

19

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Realizar a infecção in vivo de camundongos utilizando Plasmodium berghei.

2.2 Objetivos específicos

Descrever o Plasmodium berghei, espécie usada nas pesquisas in vivo com

malária no LABMAT

Estabelecer rotina de manutenções in vivo das cepas P. berghei NK65 e

ANKA

Identificar formas parasitárias em esfregaços sanguíneos

Observar e determinar curva de parasitemia

Determinar média de sobrevida dos roedores infectados.

20

3 METODOLOGIA

Os animais utilizados pelo LABMAT para o estudo in vivo da malária são

camundongos Swiss fêmeas, com idade em torno de 6-8 semanas, cedidos

principalmente pelo biotério central da UFRN. Foram mantidos no biotério da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde recebiam água e a alimentação

ad libitum. Seu uso foi aprovado pelo comitê de ética para uso de animais (CEUA -

UFRN nº 043/2010).

O laboratório trabalha com duas linhagens do Plasmodium berghei: cepas

NK65 e ANKA. O parasito é mantido por meio de passagens semanais, utilizando-se

de protocolo definido de infecção.

3.1 Infecção dos animais

A infeção para manutenção das cepas ocorre semanalmente, e para a

passagem são utilizados de três a cinco animais por caixa, para cada cepa. Os

animais são inoculados, via intraperitoneal, com uma concentração de 105 hemácias

parasitadas, por Plasmodium berghei NK65 e ANKA.

3.2 Preparação do inóculo

O inóculo que corresponde à concentração de 105 hemácias parasitadas

segue basicamente três etapas para a sua preparação, etapas essas que serão

descritas a seguir.

3.2.1 Determinação da porcentagem de hemácias parasitadas

Para a determinação da porcentagem foram utilizadas alíquota de sangue de

animais infectados obtido por meio de incisão na região terminal da cauda, e

posteriormente foi feito esfregaços sanguíneos, corados pelo método de Giemsa. A

parasitemia foi determinada utilizando o calculo:

%Hp = Hi * 100

Ht

onde Hp corresponde a porcentagem de hemácias parasitadas, Hi é o numero de

hemácias infectadas contadas e Ht é o total de hemácias.

21

3.2.2 Determinação da concentração de hemácias

Alíquotas do sangue analisado (de 3 gotas de sangue extraídas da cauda do

animal), foram diluídas em solução formada por um mL de PBS (tampão fosfato-

salino com pH em 7,4) e 100 µL de Citrato de sódio (3,8%, pH 7,22). As hemácias

foram contadas em câmara de Neubauer (figura 5), e a concentração foi

determinada utilizando-se o seguinte calculo:

H/mL = n*100*10*5*103,

onde H/ml corresponde ao numero de hemácias por mL de sangue, n é o numero de

hemácias contadas nos cinco quadrantes centrais da câmara, 100 é o inverso da

diluição, 10 é o inverso da profundidade da câmara, 5 corresponde a área contada e

103 conversão de mm3.

Figura 5: Câmara de Neubauer

As hemácias devem ser contadas no quadrante central, nos quatro quadrados menores da extremidade e no quadrado menor central.

3.2.3 Diluição do inóculo

Para determinar o numero de hemácias parasitadas, multiplica-se a

concentração de hemácias, pela porcentagem de parasitemia e divide-se por 100.

Cada animal deve receber uma concentração de 200 µL de solução com 105

hemácias parasitadas, por via intraperitoneal. Para tal é feito o calculo do fator de

diluição, que pode ser resumido da seguinte forma:

22

Fd = Hp*107

5*107

Com esse valor é calculado quanto de solução mãe (PBS/Citrato + alíquota de

sangue) deve ser utilizada para produzir uma nova solução com 107 células

infectadas. Para isso o volume final é importante. Por exemplo, para preparar uma

solução de 1 mL, deve-se pegar o valor final da solução e dividir pelo fator de

diluição, chegando a quantidade que seria necessário obter da solução 107.

sol107 = 1000

Fd

Partindo da solução inicial, segue-se uma sequencia de diluições seriadas até atingir

a concentração de 105 células parasitadas.

3.3 Parasitemia dos animais

A parasitemia é acompanhada por meio de esfregaços sanguíneos realizados

nos dias 3, 5, 7 e 9 pós-infecção.

3.4 Congelamento de Cepa

Também é feito no LABMAT o congelamento das cepas, para uso posterior. O

procedimento é simples.

Primeiro é determinado a parasitemia do animal infectado. Logo após, o

animal é anestesiado com solução de Ketamina e Xilazina numa proporção de 30%

e 70%. A profundidade da anestesia é avaliada utilizando a presença ou ausência de

resposta a um estimulo. Quando o animal não apresenta resposta a um estimulo

doloroso, é feito a crucificação e em seguida o sangue é obtido por meio de punção

cardíaca. A amostra sanguínea é coletada em seringa com citrato de sódio, e

colocada em criotubo contendo 0,5 mL de criopreservante glicerol. A amostra é

então, preservada em nitrogênio líquido, ou em ultrafreezer, até que venha a ser

utilizada no futuro.

Após a punção, os animais são eutanasiados por meio de deslocamento

cervical.

23

3.5 Descongelamento de Cepa

A amostra congelada é deixada em temperatura ambiente até atingir o

completo descongelamento. Em seguida é diluída em PBS em 1:2 e 1:4. Logo após

é administrado 200 µL de solução em cada animal.

24

4 RESULTADOS

4.1 Identificação de fases parasitárias

As formas parasitárias do Plasmodium berghei estão muito bem definidas na

literatura, tendo sua morfologia bastante conhecidas, assim como as características

apresentadas em cada momento da infecção.

4.1.1 Trofozoitos

De uma forma geral, as formas parasitárias das cepas NK65 e ANKA são

semelhantes.

Figura 6: Formas trofozoitas do Plasmodium berghei ANKA.

(fonte: Arquivo pessoal, 2016)

4.1.2 Esquizonte

Entre 16-18 horas pós-infecção é possível encontrar esquizontes na

circulação do animal. Geralmente esses esquizontes possuem em torno de 12 a 24

merozoítos. Os esquizontes de P. berghei ANKA sofrem sequestro e por esse

motivo são vistos bem menos na circulação.

25

Figura 7: Trofozoitos e esquizontes, P. berghei ANKA

(Fonte: Arquivo pessoal, 2016).

4.2 Crescimento parasitário

Os estudos de Vincke e Van de Bulcke em 1949 evidenciaram a capacidade

infectiva do Plasmodium berghei. Foi observado que a parasitemia aumenta

progressivamente, até a morte do animal, apresentando um platô.

A parasitemia dos animais infectados no LABMAT é acompanhada nos dias 3,

5, 7 e 9 pós-infecção, e a porcentagem média de hemácias parasitadas é anotada

(tabela 5).

Tabela 5: Média de parasitemia dos camundongos infectados

Dia pós-infecção Média de

parasitemia

0 dia 0

3º dia 5%

5º dia 10%

7º dia 15%

9º dia 20%

Nas cepas de P. berghei ANKA é observado também a alta capacidade

agregativa dos eritrócitos por meio da produção de knobs (figura 5). Esses knobs

são protuberâncias visíveis na superfície das hemácias parasitadas, que as torna

facilmente aderidas ao endotélio. Essa adesão pode ser vista na prática no momento

26

em que é realizada a punção cardíaca do animal, em que é encontrada certa

resistência na coleta do sangue.

Figura 8: eritrócitos infectados com Plasmodium berghei ANKA

A seta aponta para um eritrócito parasitado apresentando protuberâncias em sua

superfície. 9º dia pós-infecção (fonte: Arquivo pessoal, 2016)

4.3 Mortalidade

Os estudos com mortalidade demonstraram que a sobrevida dos animais

infectados varia de acordo com a susceptibilidade do animal a infecção, assim como

a taxa de infecção parece influenciar.

Os camundongos Swiss, utilizados na manutenção semanal de cepa,

apresentam uma sobrevida em média de 20 dias, quando então morrem devido a

grave anemia. Os animais infectados com a cepa ANKA geralmente não

desenvolvem malária cerebral, porém em animais infectados com elevada

concentração de hemácias parasitadas, o óbito pode ocorrer em 9 dias, quando

então, ele morre de complicações graves, como anemia grave, e alguns podem

apresentar um quadro indicativo de MC, como paralisia.

27

5 DISCUSSÃO

É sabido que a infecção por P. berghei apresenta um aspecto característico,

em que a parasitemia sanguínea tende a apresentar um aumento progressivo até se

chegar a um platô. Thurston, em 1950, demostrou que, independente da via de

infecção (intraperitoneal ou intravenosa) o curso da infecção segue o mesmo

caminho, seguindo o padrão da infecção até a morte do animal. Os estudos dele

demonstraram também que animais infectados com algo em torno de 15 milhões de

parasitas, por via intraperitoneal, e apresentavam parasitemia superior a 20% no

quinto dia pós-infecção evoluíam para a morte (Mercato; Coatney, 1951).

Em relação aos estudos desses autores (gráfico 1), a parasitemia medida em

nossos camundongos segue em concordância com os resultados encontrados. A

infecção segue um curso semelhante, com crescimento parasitário progressivo até o

alcance do platô, no qual a parasitemia se mantém estável. Os camundongos

infectados no LABMAT apresentam parasitemia semelhantes àquelas descritas na

literatura, com a morte dos animais ocorrendo por volta do oitavo dia pós-infecção

nos animais que desenvolviam a doença grave.

Gráfico 1: Percentual médio de parasitemia em Infecção por Plasmodium berghei em camundongos Swiss.

(Fonte: Mercado; Coatney, 1951).

28

Os estudos utilizando-se do modelo murino animal são importantes

ferramentas no auxilio a erradicação da malária no mundo. Tais estudos focam-se

desde o desenvolvimento de fármacos que visam o tratamento de pessoas

infectadas até o desenvolvimento de vacinas. Pesquisas com a malária cerebral têm

como objetivos entender o seu mecanismo e encontrar formas eficazes de

tratamento, seja por meio da utilização de um fármaco ou por meio de uma vacina.

Os estudos com vacinas, buscam formas de produzir imunidade duradora em

hospedeiros vertebrados ou produzir uma interrupção no ciclo do parasito,

interrompendo a transmissão seja para o mosquito, seja para o hospedeiro

vertebrado.

As pesquisas envolvendo os modelos murinos buscam entender a complexa

interação parasito-hospedeiro e as formas de contornar a gravidade gerada nas

complicações da doença. Com esse entendimento, é possível chegar a produção de

formas de combate ao parasito, seja por meio de desenvolvimento de fármacos

eficazes no tratamento de indivíduos contaminados, seja no desenvolvimento de

vacinas que podem, não somente gerar uma imunidade duradora, mas também

interromper o ciclo biológico do parasito. A meta da Organização Mundial da Saúde

é que em 2030, 90% dos casos de malária sejam reduzidas no mundo, e para isso,

os investimentos em pesquisas se fazem extremamente necessários.

29

6 REFERÊNCIAS

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30

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · família científica, o LABMAT, o que me...

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