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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIA TOXICIDADE, SINAIS CLÍNICOS, DETECÇÃO E PREVENÇÃO DAS MICOTOXINAS DE INFLUÊNCIA NA AVICULTURA DE CORTE NO BRASIL ALUNA: MARLI ROCHEDO GUAHYBA PORTO ALEGRE 2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIA

TOXICIDADE, SINAIS CLÍNICOS, DETECÇÃO E PREVENÇÃO DAS MICOTOXINAS

DE

INFLUÊNCIA NA AVICULTURA DE CORTE NO BRASIL

ALUNA: MARLI ROCHEDO GUAHYBA

PORTO ALEGRE 2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIA

TOXICIDADE, SINAIS CLÍNICOS, DETECÇÃO E PREVENÇÃO DAS MICOTOXINAS

DE

INFLUÊNCIA NA AVICULTURA DE CORTE NO BRASIL.

Autor: Marli Rochedo Guahyba

Monografia apresentada à Faculdade de Veterinária como requesito parcial para obtenção do grau de Especialista em Análises Clínicas Veterinária

Orientador: Andréia Spanamberg

PORTO ALEGRE 2011

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DEDICATÓRIA

Aos meus queridos filhos João, Rodrigo e Diogo Guahyba pela força que me dão

em tudo que me proponho a realizar. E a todas as pessoas que de uma maneira ou de outra

querem ver o meu crescimento pessoal e profissional.

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AGRADECIMENTO

Agradeço a Deus, aos meus filhos João, Rodrigo e Diogo Guahyba, a minha irmã

Catharina, meus orientadores, aos mestres que tive durante o curso, aos colegas, aos funcioná-

rios, ao senhor Moacir Toledo pela colaboração na realização deste curso,aumentando meus

conhecimentos para melhor desempenhar minhas atividades profissionais como Médica

Veterinária.

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RESUMO

A presença de micotoxinas nos grãos, que servem para alimento humano e animal é

uma realidade mundial, assim como sua toxicidade e determinação de enfermidades por

imuno-supressão, imunodepressão, efeitos carcinogênicos e teratogênicos, tanto no homem,

como nos animais. O que está determinando o aumento nas pesquisas científicas sobre

micotoxinas e os gêneros dos fungos, que as produzem, no mundo inteiro. A limitação

encontrada, porém, é serem as micotoxinas haptenos, o que dificultou até os anos 80 a sua

identificação através de análises clínicas. Sabemos hoje, que na avicultura de corte no

Brasil, as micotoxinas de maior importância são: aflatoxinas, ácido ciclopiazônico,

tricotecenos, fumonisinas e ocratoxina A, também que o método de análises clinicas mais

utilizado é o ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA) , embora já

existam trabalhos sugerindo o uso de cromatografia, para confirmação deste, por ter maior

precisão de resultados. No Brasil, já existem kits baseados em cromatografia de afinidade.

Palavras chave: Detecção; micotoxinas, avicultura de corte, Brasil.

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ABSTRACT

The presence of mycotoxins in grains that are used for human and animal food is a

global reality as well as its toxicity and determination of disease by immunosuppression,

carcinogenic and teratogenic effects, both in humans and animals. What is driving the

increase in scientific research on mycotoxins and the genera of fungi that produce them,

worldwide. The limitation found, however, is that the micotoxins are haptens, with hamperal

until 80 to be identified through clinical testing. We know today that in poultry production in

Brazil, the most important mycotoxins are aflatoxins, cyclopiazonic acid, trichothecenes,

fumonisins and ochratoxin A, beside that the method of clinical analysis most widely used is

the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), although there are studies suggesting the

use of chromatography for confirmation, by having more accurate results. In Brazil, there are

already kits based to affinity chromatography.

Keywords: Detection; mycotoxins, poultry production, Brazil

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................09

2. MICOTOXINAS...........................................................................................................10

2.1. Generalidades................................................................................................................10

2.2. Infestação dos grãos por micotoxinas..........................................................................12

3. MICOTOXICOSES......................................................................................................13

3.1. Fatores pré-disponentes................................................................................................14

4. DANOS CAUSADOS PELAS MICOTOXINAS.......................................................15

4.1. Perdas econômicas........................................................................................................15

4.2. Comprometimento na saúde humana.........................................................................15

5. MICOTOXINAS QUE CAUSAM IMPACTO NA AVICULTURA DE CORTE.16

5.1. Aflatoxinas.....................................................................................................................16

5.1.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................17

5.1.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................18

5.1.3. Lesões pós –mortem.......................................................................................................20

5.2. Ácido ciclopiazônico.....................................................................................................20

5.2.1. Mecanismo de ação........................................................................................................20

5.2.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................20

5.2.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................20

5.3. Tricotecenos...................................................................................................................21

5.3.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................22

5.3.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................22

5.3.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................22

5.4. Fumonisinas...................................................................................................................23

5.4.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................24

5.4.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................24

5.4.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................25

5.5. Ocratoxina A.................................................................................................................25

5.5.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................26

5.5.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................26

5.5.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................27

6. DIAGNÓSTICO DAS MICOTOXICOSES...............................................................28

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7. MÉTODOS DE ANÁLISES CLÍNICAS UTILIZADOS PARA DIAGNÓSTICO

DE MICOTOXINAS.............................................................................................................. 29

7.1. Radioimunoensaio(RIA)..............................................................................................29

7.1.1. Radioimunoensaio direto.............................................................................................. 29

7.1.2. Radioimunoensaio de competição.................................................................................30

7.1.3. Radioimunoensaio de captura........................................................................................30

7.2. Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida(ELISA).................................30

7.3. Cromatografia..............................................................................................................33

7.3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)....................................................................33

7.3.2. Cromatografia gasosa (CG) ..........................................................................................34

7.3.3. Cromatogrfia líquida de alta eficiência (CLAE)............................................................35

7.4. Espectometria de massa movida a gases....................................................................36

7.5. Nested-PCR...................................................................................................................36

7.6. Kits para análise de micotoxinas................................................................................36

7.6.1 Aflacheck.......................................................................................................................36

7.6.2. Afla Teste-P...................................................................................................................37

7.6.3. Afla Teste-B...................................................................................................................38

7.6.4. Afla Teste-WB...............................................................................................................38

7.6.5. DON Test HPLC............................................................................................................39

7.6.6. DONCheck.....................................................................................................................39

7.6.7. Fumoni test/Fumoni Test WB………............................................................................40

7.6.8. Fumoni Test 200............................................................................................................41

7.6.9. Ochra Test……………………………………………………………………………..41

7.6.10.Ochra Test WB………………………………………………………………………...42

7.6.11.AOZ HPLC …………………………………………………………………………...43

7.6.12.AflaOchra HPLC……………………………………………………………………....44

8. MANEJO PROFILÁTICO COM OS GRÃOS.........................................................46

9. CONCLUSÃO..............................................................................................................48

REFERÊNCIAS......................................................................................................................49

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1. INTRODUÇÃO

Estudos demonstram que no Brasil os níveis de micotoxinas são superiores ao

permitido em alimentos e rações, devido a grande extensão do país, a qual dificulta o

controle de obediência as leis, que determinam a quantidade máxima de micotoxinas. As

micotoxinas reduzem a produção, impedem os agronegócios, impedem as exportações e

muitas vezes esses produtos não exportados são usados no país, colocando em risco à saúde

animal e humana. Elas podem entrar na dieta dos animais e do homem de forma direta, ou

seja, quando o alimento torna-se contaminado pelo fungo toxigênico, promovendo a produção

da toxina, ou indiretamente quando à micotoxina permanece no alimento, mesmo após o

processamento e a remoção do fungo produtor. Por isso a ocorrência de micotoxinas é grave,

pois processamentos dos grãos podem eliminar os fungos, mas não as micotoxinas. As

micotoxinas contaminantes podem passar do animal para o homem através da carne, ovo e

leite. O nível de uma micotoxina pode ser baixo, mas quando combinado a um nível também

baixo de outra micotoxina podem causar um efeito duplo que poderá ser desastroso (LEESON

et al., 1995).

A presença de micotoxina depende também do tipo de alimento, pois alguns grãos

são substratos mais aptos que outros para o crescimento de determinados fungos

(SANTURIO, 2000).

Segundo pesquisadores da EMBRAPA 25% dos grãos produzidos no mundo estão

afetados por micotoxinas (FAO, 2007; FREIRE et al., 2007; CORRÊA, 2007). Segundo Word

Bank Repor (1993) a redução na vida média das pessoas nos países em desenvolvimento

deve-se a doenças provocadas por micotoxinas (CORRÊA, 2007).

Este trabalho tem como objetivo demonstrar que através da toxicidade,

sintomatologia, detecção das micotoxinas (através das análises clínicas veterinária) e métodos

preventivos, que podemos evitar grandes perdas na produção de frango de corte, diminuir as

condenações de carcaça, manter e aumentar as exportações do Brasil. Reduzir o sofrimento

dos animais, que uma vez intoxicados por micotoxinas podem ter sua imunidade reduzida ou

suprimida, não reagindo assim a vacinação e contraindo doenças várias. E reduzir o risco de

intoxicação humana por ingestão de carcaças contaminadas por micotoxinas.

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2. MICOTOXINAS

2.1. Generalidades

São substâncias tóxicas produzidas por fungos filamentosos resultante do seu

metabolismo. È, portanto, um metabólito. Ela ocorre após a fase de crescimento do fungo

produtor, por meio das vias metabólicas, catalisadas por reações enzimáticas

(CORRÊA,2007). Micotoxinas não são detectáveis pela visão, olfato ou paladar

(RUPLEY, 1999).São produzidas, principalmente, pelos fungos dos gêneros Aspergillus,

Fusarium e Penicillium (FREIRE et al., 2007).Substâncias essas, que podem ser ingeridas,

inaladas ou absorvidas pela pele. É resultado da atividade metabólica dos fungos e podem

estar no interior de esporos, em seus micélios ou serem liberados por estes nos alimentos.

Podem ter ação direta quando o produto é utilizado diretamente na alimentação dos animais

(SILVA, 2010). Estes ao ingerirem o alimento contendo os microorganismos permitem que

estes ou seus metabólitos invadam seus fluídos causando doenças graves. Podem ter ação

indireta quando subprodutos ou derivados são utilizados. As principais micotoxinas dos grãos

são: Aflatoxinas, Tricotecenos, Zearelenonas, Moniliforminas, Fumonisinas e Ocratoxinas.

Sendo que as que mais ocorrem no Brasil são: Aflatoxinas, Fumonisinas e Ocratoxinas

(CORRÊA, 2007).

Elas são produzidas em determinados ambientes, sobre determinados substratos e

por determinadas linhagens. Seus efeitos tóxicos podem ser agudos ou crônicos, como:

Citotoxidade;

Carcinogenicidade;

Teratogenicidade;

Fitotoxidade;

Mutagenicidade;

Fatores que favorecem a produção de micotoxinas podem ser:

Intrínsecos:

Tipo de alimento;

Conteúdo de umidade;

Sua composição.

Extrínseco:

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Físico:

Temperatura;

Umidade relativa;

Danos mecânicos;

Luz.

Químico:

Fungicida;

pH;

composição do substrato;

variedades de grãos resistentes.

Biológico:

Peculiaridade biológica das linhagens de microorganismos inibidores e competidores;

Presença de insetos e ácaros (LABMICO, 2001; C0RRÊA, 2007).

No continente Sul-Americano são controladas por legislação as seguintes

micotoxinas:

Aflatoxina B1;

Aflatoxina B1/G1;

Aflatoxinas totais B1,B2,G1,G2;

Fumonisinas B1;

Desoxinivalenol;

Ocratoxina A;

Patulina;

Zearalenona;

Alcalóides ergóticos;

(FREIRE et al., 2007; CORRÊA, 2007; FONSECA, 2010).

Dependendo dos teores de micotoxinas ingeridas ou injetadas podem ter quatro

tipos básicos de toxidade:

Aguda;

Crônica;

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Mutagênica;

Teratogênica

(CORRÊA, 2007).

2.2. Infestação dos grãos por micotoxinas

O micro-clima de superfície do grão tanto durante o cultivo, colheita, secagem,

transporte e estocagem favorecem à produção de micotoxinas pelos gêneros Alternaria,

Cladosporidium , Fusarium, Aspergillus e Penicillium (LABMICO, 2010).

Na armazenagem os fungos se desenvolvem quando o micro-clima da superfície

do grão criado pela troca de umidade entre este e o ar esteja em torno de 14 a 22 % de

umidade.

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3. MICOTOXICOSES

É uma intoxicação por ingestão de micotoxinas, ou seja, estados patológicos

causados por toxinas fungicas presentes em alimentos em que os agentes se desenvolvem

(CORREA, 1982; CORREA, 1982). A micotoxicose pode causar no organismo do animal e

dos humanos danos no crescimento, quer seja, afetando as funções do organismo ou

desenvolvendo tumores.

Órgãos mais afetados são:

Fígado;

Rim;

Cérebro;

Músculos;

Sistema nervoso;

Pulmão (OLIVEIRA, 2010).

Doença não transmissível. Drogas e antibióticos não produzem efeitos sobre elas. Ocorrem

em surtos normalmente, pois estão associadas a alimentos ou rações. Deve-se retirar à

alimentação dos animais ou pessoas infectadas. As micotoxinas causam stress às células

imunológicas impedindo que desempenhem sua função normal, que é combater os agentes

infecciosos que invadem o organismo. Quando as micotoxinas são ingeridas em doses baixas

levam à morte prematura das células imunológicas (apoptose) aumentando assim à

suscetibilidade à infecção por microorganismos patogênicos (QUINABRA, 2006).

As micotoxicoses mais comumente observadas são:

Aflatoxicose (Aspergillus);

Ergotismo (Claviceps purpúrea e Claviceps paspalum).

O gênero Aspergillus pode vegetar em alimentos conservados por muito tempo,

ou mal conservados com teor de umidade favorecendo seu desenvolvimento, e produzindo

aflatoxina e sterigmatocistina, ainda mais tóxicas. Essas micotoxinas são muito estáveis,

resistindo à esterilização pelo calor, e são bastante absorvíveis pelo intestino. A aflatoxicose

pode ser crônica ou aguda, levando a insuficiência hepática e a cirrose.

Lesões por aflatoxicose crônica:

Necrose do centro globular no fígado (lagos cheios de sangue e sem hepatócitos);

Rim com necrose tubular na cortical;

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Esteatose dos raios medulares;

Atrofia glomerular.

Pode haver regeneração nodular no fígado, formando hepatotomos (tumor

maligno em que as células parenquimatosas assemelham-se às células hepáticas).

Lesões por aflatoxicose aguda:

Mata principalmente animais jovens em aproximadamente 48 horas.

Apresenta:

Sinais encefálicos como apatia, irritação, marcha em círculo;

Sinais gastroentéricos como diarréia, às vezes sanguinolenta;

Icterícia.

Lesões de necropsia:

Gastroenterite hemorrágica;

Fígado congesto;

Às vezes necrose hepática;

Petéquias renais;

Petéquia e sufusão (extravasamento) hemorrágica pulmonares;

Cérebro amolecido por degeneração gordurosa, ou Síndrome de Reye (CORRÊA,

2007; FONSECA, 2010).

3.1. Fatores pré-disponentes

Ingestão, concentração de micotoxinas dos alimentos, tempo de exposição ao alimento

contaminado, suscetibilidade da espécie animal, idade, sexo, condições sanitárias.

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4. DANOS CAUSADOS PELAS MICOTOXINAS

4.1. Perdas econômicas

Contaminação de produtos agrícolas;

Perdas de animais;

Diminuição da produtividade;

Custos indiretos em sistemas de controle;

Gastos na remoção de micotoxinas para recuperar o produto rejeitado, pela não

aceitação, pelo mercado importador.

4.2. Comprometimento da saúde humana

Pela ingestão direta das micotoxinas contidas nos produtos de origem vegetal e

animal;

Por contato direto

(LABMICO, 2010).

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5. MICOTOXINAS QUE CAUSAM IMPACTO NA AVICULTURA DE CORTE NO

BRASIL

Segundo (FREITAS, 2007), o uso de múltiplas fontes de grãos para alimentação de

frangos de corte pode proporcionar o desenvolvimento de várias espécies de fungos ou

diferentes micotoxinas já sintetizadas. E as interações químicas entre as micotoxinas, podem

ocorrer através de diversos mecanismos, incluindo alterações de absorção, de ligação protéica,

de biotransformação ou de excreção de uma ou de ambas micotoxinas. A resposta do

organismo frente a tal associação pode ser aumentada ou diminuída conforme o sítio de ação

das micotoxinas. Pois os efeitos de duas micotoxinas simultaneamente podem produzir efeitos

sinérgicos ou aditivos.

5.1. Aflatoxinas

São micotoxinas produzidas pelos fungos Aspergillus flavus (50% de suas cepas) e

Aspergillus parasiticus e Aspergillus nomius. São identificadas como: B1, B2, G1, G2, M1,

M2 ( FREIRE et al., 2007; CORRÊA, 2007 ). Na influorescência a micotoxina B fica

azulada, enquanto a micotoxina G fica esverdeada, quando observada sob luz ultravioleta.

Produzem em torno de 17 micotoxinas, porém a micotoxina B1 (AFB1) é a mais

carcinogênica, mutagênica, possivelmente teratogênica e a de maior importância no Brasil (

CORRÊA, 2007; FONSECA, 2010). Os principais substratos são o amendoim, castanha,

nozes, milho e cereais em geral (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009) e

também farelo de peixe (CORRÊA, 2007). As aflatoxinas são absorvidas por difusão passiva

no trato gastrointestinal, principalmente no intestino delgado e daí vai à circulação porta-

hepática (FONSECA, 2010). São bastante solúveis em clorofórmio, metanol e

dimetilsulfóxido (DMSO). Pouco solúveis em água. São destruídas por autoclavação em

presença de amônia e por tratamento com hipoclorito (CORRÊA, 2007).

Dependendo da dose de aflatoxina ingerida a ave pode apresentar:

Se ingerir 0,25 ppm a imunogênese é deprimida;

Se ingerir 0,6 a 1 ppm apresentará resistência diminuída;

Se ingerir 1,5 2,5 ppm terá seu ganho de peso reduzido;

Se ingerir 1 a 10 ppm terá hemorragias, necrose hepática e morte súbita (CORRÊA,

2007).

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Análises de aflatoxinas realizadas no Laboratório de Análises Micotoxicológicas

(LAMIC) da Universidade Federal de Santa Maria, entre os anos de 1986 e janeiro de 2000,

em 15.600 amostras de alimentos destinados principalmente ao consumo animal,

demonstraram que no milho analisado 41,9% das amostras estavam contaminadas por

aflatoxinas (SANTURIO,2000). Elas se desenvolvem entre 25° a 35°C e a uma umidade

acima de 15% (BREDEMEIER, 2006; MUNDSTOCK, 2006; FREITAS, 2007).

5.1.1. Mecanismo de ação

Por ligarem-se ao DNA das células as aflatoxinas inibem a síntese de proteínas,

enzimas, fatores de coagulação (vitamina K) e de ácidos graxos, além de inibirem o

metabolismo da glicose. Prejudica a síntese de colesterol. Além de serem oncogênicas e

imunosupressivas (SILVA, 2010). Depois de absorvidas as aflatoxinas são distribuídas pelo

organismo e podem ser encontradas no fígado (em maiores concentrações), nos músculos, rins

e tecido adiposo. É no fígado que as aflatoxinas sofrem maior biotransformação por ação das

enzimas microssomais. Sabe-se, que as aflatoxinas precisam sofrer uma ativação metabólica

para se tornarem tóxicas e que no organismo o sistema enzimático microssomal hepático é o

responsável por essa transformação, que é irreversível. Resultando compostos que são

excretados pela bile, urina, leite (aflatoxina M1) e gema do ovo (aflatoxina M1), assim como

aflatoxina B2a cuja principal função é inibir a atividade de enzimas tanto no fígado como em

outros tecidos. Sendo que o processo mais danoso na metabolização da aflatoxina B1 é o

produto resultante da epoxidação, ou seja, 8,9 epóxido de aflatoxina (ou AF-epóxido), mais

potente carcinógeno natural conhecido até o momento. Ele é altamente eletrolítico e capaz de

reagir rapidamente, através de ligações covalentes, com sítios nucleofílicos de

macromoléculas, como o ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA) e

proteínas (WYATT, 1991). A ligação do composto AF-epóxido com o DNA modifica sua

estrutura e sua atividade biológica, originando os mecanismos básicos dos efeitos

mutagênicos e carcinogênicos da aflatoxina. Esta ligação entre o composto formado e o DNA

não é permanente, no entanto,quando desfeita,ocorre a retirada de um par de nucleotídeos do

código genético. Para suprir esta perda, um novo par é colocado no lugar. Entretanto, o par de

bases suprimido da seqüência dificilmente é substituído pelo mesmo par, o que determina a

ocorrência de uma mutação no código da célula.

As reações a que o sistema enzimático microssomal submete a aflatoxina é

irreversível. Entretanto, o sistema redutase citoplasmático converte a aflatoxina em

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aflatoxicol, sendo que esta reação é reversível, tornando a reverter este composto em

aflatoxina (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009). Além

disso, a ingestão de aflatoxinas determina a diminuição da atividade do sistema retículo-

endotelial, da atividade imunogênica, favorecendo a instalação de infecções, bloquear o

sistema complemento, diminuindo a fagocitose (CORRÊA, 2007).

5.1.2. Toxicidade e sinais clínicos

A sensibilidade aos efeitos tóxicos das aflatoxinas varia consideravelmente entre

indivíduos da mesma espécie e a relação dose-resposta pode variar de acordo com raça, sexo,

idade e composição da dieta, entre outros fatores. Os machos são mais susceptíveis que as

fêmeas e os jovens mais susceptíveis que os adultos (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009;

RAUBER, 2009). Entre as três principais linhagens de frangos de corte utilizadas no Brasil há

diferenças de desempenho, quando são alimentadas com ração contaminada com aflatoxinas

(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).As aflatoxicoses caracterizam-se por

destruição parenquimatosa do fígado, hemorragias, alterações das funções nervosas em

combinação com espasmos , nefrotoxidade e carcinomas (FONSECA). As aflatoxinas são

potentes agentes imunossupressores, principalmente em aves jovens, por suprimir diferentes

mecanismos da resposta imune e reduzir o tamanho dos órgãos linfóides, como Bursa de

Fabrício e timo. As aflatoxinas determinam imunosupressão por dois mecanismos: o primeiro

se relaciona com à imunogenese, ou seja, afeta às células T e o timo, os quais possuem

elevada sensibilidade a AFB1 e AFM1; e o segundo mecanismo está relacionado à baixa

resistência às infecções, ou seja, está relacionado com as atividades dos macrófagos e às

deficiências de substâncias humorais não específicas, tais como complemento e interferon

(CHEEKE,1998). As aflatoxinas tem habilidade de inibir a RNA polimerase in vivo e com

isso limitar a síntese protéica, inibindo a síntese de imunoglobulinas. As aflatoxinas também

causam um rápido aumento na atividade das enzimas lisossomais nos músculos esqueléticos e

no fígado das aves, estimulando a degradação lisossomal de imunoglobulinas. Também

inibem o processamento de antígenos, como conseqüência da inibição de células fagocíticas

do sistema retículo endotelial presentes em diversos órgãos e tecidos. Níveis de aflatoxinas

entre 5 a 10 ppm diminuem significativamente a porcentagem de atividade fagocítica de

monócitos, ou seja, em torno de 30% , quer seja, macrófagos maduros, ou seus precursores

monócitos imaturos. A regressão da Bursa de Fabrício e a supressão do processo de

hemaglutinação podem ser indicadores de que está ocorrendo falha vacinal ou infecções

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secundárias antes mesmo que a ave apresente sinais clínicos de aflatoxicose. As aflatoxinas

tem demonstrado capacidade de aumentar a susceptibilidade de aves a salmonelose,

aspergilose, coccidiose e Marek, devido à imunodepressão que primeiramente envolve o

sistema imune mediado por células (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

Reprodutoras expostas à micotoxinas tem seus títulos de anticorpos circulantes diminuídos,

determinando a não transferência de imunidade passiva adequada para a progênie. Também

a variação dos níveis de anticorpos maternos, imposta por doses baixas de micotoxinas, que

podem ocasionar, muitas vezes, o aparecimento de infecções recorrentes no plantel. Animais

com micotoxicose não desenvolvem boa resposta imune, mesmo que vacinados (FREIRE,

1995). Nos animais jovens reduz o consumo de ração, reduz o crescimento por perda de peso

e podem levar à morte (QUINABRA, 2006). Aves com menos de 21 dias sob estresse são

afetadas por menores quantidades de aflatoxinas no que se refere à produção de carne

(DOERRet al., 1983; SANTURIO, 2000). Fatores como desbalanceamento nutricional, erros

de manejo, temperaturas extremas, camas velhas, qualidade dos pintos alojados favorecem

para que baixos níveis de aflatoxinas alterem o desenvolvimento das aves (SANTURIO,

2000). As aflatoxinas também reduzem o consumo de ração, reduzem a conversão alimentar,

reduzem o peso em 27%, determinam a síndrome da má absorção, esteatorréia com até dez

vezes mais gordura, diminuição da lípase pancreática (enzima digestiva das gorduras),

diminui os sais biliares (necessários à digestão e absorção das gorduras), aumentam o tempo

de coagulação sanguinea, podem causar hemorragias petequiais intestinais, reduzem a

imunidade, aumentam a gravidade das infecções, causam anemia, reduzem a capacidade de

metabolizar gorduras, amido e proteínas, causam intoxicação hepática, podendo levar à morte,

causam problemas nas pernas das aves, reduzem a pigmentação da pele, aglomeramento e

redução das penas aumentando os arranhões, cortes e hematomas, aumentam a sensibilidade

para mudanças extremas de meio ambiente, causam letargia, reduzem a fertilidade das

matrizes, reduzem a eficácia dos antibióticos, (SCHAEFER,1991;HAMILTON,1991;

LEESON et al.,1995; SANTURIO,2000; QUINABRA,2006; IMPERATORI,2008;

MALLMANN,2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

Na aflatoxicose crônica a má absorção dos alimentos se manifesta pela presença de

partículas de ração mal digeridas excretadas pelas aves, associada a uma esteatorréia. A qual

pode ser severa com incremento de até dez vezes no teor de gordura das fezes. Com

diminuição nas atividades específicas e totais da lípase pancreática e pela diminuição dos sais

biliares necessários para digestão e absorção das gorduras, levando a esteatose hepática, ou

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seja, fígado gorduroso (SCHAEFER, 1991; HAMILTON, 1991; MALLMANN, 2009;

DILKIN, 2009; RAUBER 2009).

Os sintomas de aflatoxicose em aves são mais severos quando a dieta tem um baixo

nível protéico (SISK, 1972; CARLTON, 1972). Quando a dieta das aves tem um maior nível

do que o normal de proteínas isso confere a elas um efeito protetor contra aflatoxicoses

(SMITH et al., 1970). Aves contaminadas com aflatoxinas devem receber ração com altos

níveis de riboflavina e vitamina D e baixos níveis de vitamina B6 o qual força um aumento da

oxidação dos ácidos graxos depositados em excesso no fígado (SANTURIO, 2000).

5.1.3. Lesões pós-mortem

Aumento do tamanho do fígado até 68%;

Alteração da coloração do fígado (amarelado) por infiltração de gordura;

Fígado friável;

Tumores hepáticos (PATTERSON, 1983);

Hidropericárdio;

Ascite;

Palidez e congestão dos rins;

Bursa de Fabrício diminuída;

Timo diminuído;

Atrofia das vilosidades intestinais;

Necrose intestinal;

Fibrose intestinal;

Glândulas adrenais aumentadas e necrosadas

(MERKLEYet al., 1987; CRUZ,1995; SANTURIO, 2000; IMPERATORI, 2008;

MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.2.Ácido ciclopiazônico

O ácido ciclopiazônico (CPA) é produzido por algumas cepas de Aspergillus

flavus, Aspergillus vesicolor, Aspergillus tamarii, Penicillium cyclopium e Penicillium

commune (WYATT, 1991; CORRÊA, 2007). Seu substrato são o milho e o amendoim.

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Ocorrem, geralmente, associados as aflatoxinas (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009;

RAUBER, 2009).

5.2.1. Mecanismo de ação

Intoxicação

(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.2.2. Toxicidade e sinais clínicos

O ácido ciclopiazônico causa no organismo dos frangos de corte degeneração e

necrose hepática, lesões hemorrágicas no miocárdio, lesões hemorrágicas no proventriculo,

lesões hemorrágicas na moela, lesões hemorrágicas no baço. Sendo os principais sinais

clínicos por intoxicação de ácido ciclopiazônico (CPA) a diminuição no ganho de peso,

vômito, opistótono ( estado no qual a cabeça e os membros inferiores estão recurvados para

trás, enquanto o tronco se arca anteriormente, por um espasmo tetânico dos músculos

dorsais) que é observado em casos de grave irritação meníngea e em outros estados

neurológicos pronunciados (BLAKISTON, 1982), hiperestesia, ou seja, sensibilidade

excessiva da pele (BLAKISTON, 1982), convulsão e morte (MALLMANN, 2009; DILKIN,

2009; RAUBER, 2009).

5.2.3. Lesões pós-mortem

Degeneração e necrose hepática;

Lesões hemorrágicas do miocárdio;

Lesões hemorrágicas do proventriculo;

Lesões hemorrágicas do baço;

Lesões hemorrágicas e erosões na moela (lesão mais característica)

(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

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5.3. Tricotecenos

Os tricotecenos são um grupo de 100 micotoxinas imunosupressoras, as quais

possuem a mesma estrutura básica (tetracíclico 12,13-epoxitricoteceno). São divididos em

dois grupos, denominados macrolíticos e não macrolíticos A e B. São os tricotecenos não

macrolíticos, que contaminam alimentos e rações. Sendo que o tricoteceno não macrolítico A

é o mais tóxico. São produzidos por fungos dos gêneros Fusarium sp, Myrothecium sp,

Stachybotrys sp, Trichotecium sp, Trichoderma sp, Phomosis sp, Cephalosporium. Seus

substratos são o milho, trigo, cevada, aveia e centeio. A produção desta micotoxina ocorre sob

alta umidade e temperatura entre 6 a 24 °C (CORRÊA, 2007). São micotoxinas que contém

tricotecina. São os tricotecenos mais importantes o desoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV),

toxina T2, Toxina HT2, diacetoxiscirpenol (DAS), neosonaliol, fusanonax, desoxivalenol

(FREIRE,2007). A toxina T2, porém, pode desenvolver-se a uma umidade de 25% e a baixas

temperaturas, ou seja, entre 8 a 15 °C (SANTURIO, 1997). Essas micotoxinas inibem a

síntese de proteína eucariótica, no seu estágio inicial, de alongamento e no término da

síntese, pois interferem na atividade da transferase peptídica ( STAFFORD, 1973;

MCLAUGHLIN, 1973; WEI et al., 1974; FREIRE, 2007; CORRÊA, 2007) determinando

alterações no sistema hematopoiético e linfático, aplasia medular nos casos graves e

imunosupressão. Agem, também, sobre as aminas biogênicas do cérebro, o que causa a recusa

de alimentação. Possuem potente ação irritante local, tanto na mucosa como na pele. Tem

atividade teratogênica, a qual já foi demonstrada em camundongos. No Brasil tem baixa

ocorrência (CORRÊA, 2007). A desoxinivalenol (DON) ocorre nos grãos trigo, centeio,

cevada. Causa náuseas, vômito, diarréia, recusa de alimentos e morte celular. É menos tóxica.

(MILLER et al., 2001; Freire, 2007). A desoxinivalenol (DON) e a T2 são encontradas no

Brasil em grãos de milho e trigo (FURLONG et al., 1995; PRADO et al., 1997; OLIVEIRA,

2001; SOARES, 2001; FREIRE, 2007).

O fungo Stachybotrys atra, tem tricoteceno macrolíticos que se localizam tanto nos

esporos (conídeos), como nos próprios fragmentos micelianos. Ocorrem nos fenos mofados e

causam hemossiderose, ou seja, depósito de hemossiderina ou ferro coloidal no pulmão

(BLAKISTON, 1982), que é insolúvel em água e só ocorre em estados mórbidos em excesso

no organismo. Nos agricultores que manipulam esse feno causam hemorragias nasais e

traqueais por pneumonia hemorrágica (FURLONG et al., 1995; PRADO et al., 1997;

OLIVEIRA, 2001; SOARES, 2001; FREIRE et al., 2007). Esse fungo degrada material rico

em celulose como o feno e se mantém em lugares úmidos.

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Outros sintomas causados por tricotecenos são vômitos, recusa de alimentos (ATA-

aleucia tóxica alimentar), redução do ganho de peso, hemorragias, necrose de epiderme,

redução da produção de ovos, interferência no sistema imunológico e morte (FONSECA,

2010; FREIRE et al., 2007).

Os tricotecenos que atingem os frangos de corte são:

Toxina T2;

Diacetoxispernol (DAS);

Desoxinivalenol (DON ou vomitoxina).

Essas micotoxinas são produzidas por diversos gêneros de fungos, sendo o principal produtor

o gênero Fusarium (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,

2009). A toxina desoxinivalenol (DON) é a mais comum nos cereais, porém a toxina T2 é a

mais tóxica (CORRÊA, 2007). A ingestão de 4 ppm de toxina T2 já pode ocorrer necrose oral

e ganho de peso reduzido (CORRÊA, 2007).

5.3.1. Mecanismo de ação

Causam o decréscimo transitório dos níveis de hemoglobina por necrose do tecido

hematopoiético, inibem a rápida proliferação de células do sistema imune por necrose do

tecido linfóide determinando assim uma menor resposta na formação de anticorpos, causam

necrose da mucosa oral e fazem com que haja formação de peróxidos a partir dos lipídios,

diminuindo a concentração de vitamina E nas aves (CORRÊA, 2007; MALLMANN,

2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.3.2. Toxicidade e sinais clínicos

Os tricotecenos causam no organismo dos frangos de corte alteração de mucosa

oral (degeneração hidrópica, ou seja, acúmulo de água entre as células), depressão no

crescimento, distúrbios nervosos, redução da formação de anticorpos, inclusive pós-vacinais,

anemia (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

Os frangos de corte apresentam sintomas como lesões orais de bico, palato e língua

(necrose de ponta de língua, erosões ou ulcerações na base da língua), recusa súbita de

alimentos, perda de peso, posição anormal das asas, diminuição dos reflexos, diminuição da

qualidade de plumagem (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,

2009).

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5.3.3. Lesões pós-mortem

Necrose de ponta de língua;

Erosões ou ulcerações na base da língua;

Lesões orais de bico e palato;

Lesões de pele;

Soluções de continuidade;

Dermatopatias bacterianas (celulite, abcessos e flemegmões)

(CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5,4, Fumonisinas

Descoberta em 1988, formam um grupo de metabólitos fúngicos secundários

produzidos principalmente pelo gênero Fusarium verticillióides (antes chamado

molliniforme) e Fusarium proliferatum. Também pelas espécies Fusarium nygama,

Fusarium napiforme, Fusarium subglutinans, Fusarium poliphialidium, Fusarium

oxysporum, Alternaria alternata (Fusarium lycopersici) (BEZUIDENHOU et al., 1988;

GELDERBLOM et al., 1988; POZZI et al., 2002; BENNET, 2003; KLICH, 2003;

FREIRE, 2007; CORRÊA, 2007). As fumonisinas conhecidas até 1999 eram 16 substâncias

B1 (FB1, FB2, FB3 e FB4), A1, A2, A3, AK1, C1, C3, C4, P1, P2, P3, PH1, PH1b

(MUSSER, 1997; PLATTNER, 1997; HÁ-SEO, 1999; WON LEE, 1999). Atualmente já se

identificou 28 fumonisinas. No entanto as contaminantes naturais do milho e derivados são

as fumonisinas B1 (FB1), B2(FB2), B3(FB3), sendo a mais tóxicas a B1 (FB1), constituíndo

70% do total das fumonisinas, que produzem metabólitos tóxicos aos animais e homem

(CORRÊA, 2007). Pouco se sabe sobre a temperatura ótima para produção de

fumonisinas.Seu principal substrato é o milho. As fumonisinas podem causar câncer de

esôfago em humanos (PERAICA et al., 1999;CORRÊA, 2007), leucoencefalomalacea em

eqüinos (LEME) e em coelhos (MARASA et al., 1988; BUCCI et al., 1996; FADOHAN et

al., 2003), edema pulmonar (HARRISON et al., 1990), hidrotórax (HARRISON et al.,

1990).As fumonisinas são hidrosolúveis, porém apresentam maior solubilidade em

acetonitrila-água. São insolúveis em solventes orgânicos (clorofórmio, metanol),

(BEZUIDENHOUT et al., 1988; SHIER, 1992; MERRIL et al.,1993; FREIRE, 2007;

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CORRÊA, 2007). Não absorvem luz visível ou ultravioleta, pois não são fluorescentes,

precisando que haja derivação química para sua detecção. São estáveis ao calor O

aquecimento das fumonisinas a 100°C ou mais reduz os níveis de

micotoxina(CORRÊA,2007).As fumonisinas inibem a síntese de esfigolipídeos (são lipídeos

de qualquer região) acarretando enormes problemas nas atividades celulares, devido a essa

substância ser necessária para composição da membrana plasmática, para comunicação

célula à célula, para interação intracelular, para a formação da matriz celular e para formar

fatores de crescimento (SHIER, 1992; MERRIL et al., 1993; FREIRE, 2007). Causam um

aumento intracelular da concentração de esfinganina livre e uma diminuição da concentração

de esfingosina livre, isto ocorre devido a similaridade das fumonisinas com essas

substâncias, as quais são responsáveis pela formação da esfingomielina e

glicoesfingolipídeos (CORRÊA, 2007). As fumonisinas fusarenona, ácido fusárico, fusarina

c, moniliformina tem sido encontrada com elevada freqüência nos cereais, participando

principalmente, da cadeia alimentar das aves (SANTIN et al., 2001). O ácido fusarico, por

exemplo, interfere no consumo alimentar das aves, agindo na utilização do triptofano pelo

cérebro, além de atuar sinergicamente, aumentando a toxidade de outras micotoxinas

(BACON et al., 1996). As fumonisinas são caracterizadas como uma potente cardiotoxina

(NAGARA et al., 1996). A moniliformina pode afetar frangos de corte, reduzindo o ganho

de peso e aumentando o volume do coração (KUBENA et al., 1997). As fumonisinas que

afetam os frangos de corte são produzidas principalmente pelo gênero Fusarium

miniliforme. Sendo as de maior ocorrência B1 e B2. Menos de 50 ppm de B1 já causam

diminuição no ganho de peso (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.4.1. Mecanismo de ação

Determinam alteração na relação entre os níveis circulantes de esfingosina e

esfinganina, que são precursores dos esfingolipídeos (esfingomielina e glicoesfingolipídeos).

5.4.2. Toxicidade e sinais clínicos

As alterações que as fumonisinas determinam no organismo dos frangos de corte

são lesões orais, inapetência, menor ganho de peso, diminuição na concentração da albumina

sérica, acite, hidropericardite, edema, congestão renal, aumento de peso do fígado, aumento

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do tempo de coagulação sangüinea, petéquias, diarréia e morte (ESPADA et al., 1997;

CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.4.3. Lesões pós-mortem

Coração pálido;

Rim congesto;

Fígado, proventriculo e moela com aumento relativo de peso

(CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.5. Ocratoxina A

Descoberta a ocratoxina A em 1965 como metabólito do Aspergillus ochraceus

(VAN DER MERWE et al., 1965). Produzida também pelos Aspergillus alucatos,

Aspergillus alliaceus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus meleus,

Aspergillus glaucus, Aspergillus auricomus e Aspergillus verrucosum (CIEGLER et al.,

1972; CHU, 1974; PIT, 1987; ABARCA et al., 1994; LARSEN et al., 2001; BAYMANET

et al., 2002; FREIRE, 2007). No Brasil as espécies que mais produzem ocratoxina A são

Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum (CORRÊA, 2007). Encontra-se em

cereais, leguminosas e vinhos (MARQUARDT, 1992; FROHLICH, 1992; EGMOND,

1994; SPEIJERS, 1994; PITT, 2000; FREIRE, 2007). Esta toxina interfere na síntese de

RNA, DNA, na síntese protéica e no metabolismo dos carboidratos, principalmente na

gliconeogenese. Esta micotoxina une-se firmemente à albumina do soro, obtendo meia-

vida longa no organismo do frango de corte. O que provoca o aparecimento de resíduos nos

tecidos dos animais ou fluídos biológicos, incorporando-se a cadeia alimentar humana, se

esses animais forem utilizados na alimentação (CORRÊA, 2007). Promovem também

acúmulo de gordura no fígado, sérios danos renais, onde se acumulam alterando o fenótipo

e a função do rim. E são também imunosupressoras, teratogênica e carcinogênica

(KUIPER-OODDMAN, 1989; SCOTT, 1989; BEARDAL, 1994; MILLER, 1994;

PLÉSTINA, 1996; SCHLATTER et al., 1996; FREIRE, 2007). Causam morte das aves

(HAMILTON et al., 1982; BURNS, 1986; DWIVEDI, 1986; KROGH,

1987;FREIRE,2007). A ocratoxina A é uma substância cristalina, incolor à luz natural e

que sob luz ultravioleta assume fluorescência azul-esverdeada, pouco solúvel em água e

solúvel em clorofórmio e metanol. Seu ponto de fusão é entre 168 a 173°C e seu peso

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molecular é de 403 (CORRÊA, 2007). Atingem o máximo de produção de 20 a 30°C em

grãos com umidade relativa de 39% ou em temperaturas inferiores a 15°C desde que

tenham umidade relativa de 52% (SANTIN, 2000; FREITAS, 2007). A ocratoxina A

(OTA) que atingem os frangos de corte são produzidas por seis espécies de Aspergillus e

seis espécies de Penicillium. São nefrotóxicos, fazem com que o rim aumente de tamanho e

perca a cor por acúmulo de ácido úrico (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,

2009). A ocratoxina A tem efeito sinérgico com as aflatoxinas ,toxina T2 (tricoteceno),

ácido ciclopiazônico (CPA) e com as fumonisinas. Juntas produzem um efeito maior de

toxidez, reduzindo o ganho de peso ao dobro, ficando em torno de 40% e afetam as aves

entre duas a três semanas de idade (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,

2009). A ocratoxina A tem interação antagônica com o diacetoxiscirpenol (DAS) que é um

tricoteceno (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

Dependendo da dose de ocratoxina A ingerida a ave pode apresentar:

Se ingerir 2 a 4 ppm ganho de peso reduzido;

Se ingerir 4 ppm nefropatia tóxica;

Se ingerir 4 a 16 ppm moléstia aguda ,diarréia e morte

(CORRÊA, 2007).

5.5.1. Mecanismo de ação

A ocratoxina A atua no organismo dos frangos de corte produzindo degeneração

e alteração estruturais do epitélio tubular renal dos túbulos proximais, acúmulo de ácido

úrico nos rins, aumento ácido úrico sérico, aumento de triglicerídeos séricos, reduz a

síntese de proteínas hepáticas reduzindo a albumina e as proteínas totais, interfere no

metabolismo dos carboidratos (gliconeogenese), interfere nas atividades dos órgãos

linfóides e interfer nas respostas imunes do frango de corte (SANTIN, 2000; CORRÊA,

2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009;RAUBER,2009).

5.5.2. Toxicidade e sinais clínicos

A ocratoxina causa aumento do tamanho do rim, perda da cor do rim pelo

acúmulo de ácido úrico, aumento da fragilidade intestinal (WAREN, 1980; HAMILTON,

1980; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009). Quando associada com a

ação do ácido ciclopiazônico (CPA) causa alteração do peso relativo do rim, alteração do

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peso relativo do pâncreas, alteração do peso relativo do proventriculo e alteração da

bioquímica sérica (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAU BER,2009).

Os sintomas que apresentam são redução do ganho peso nas primeiras três

semanas de vida, aumento da ingestão de água, tremores, perda de reflexos, problemas

locomotores, danos hepáticos, enterite, redução da pigmentação da pele (por apresentar

menor absorção de pigmentos carotenóides presentes nos alimentos), ou seja, síndrome da

ave pálida. Dificulta a coagulação sanguinea, diminui a defesa do organismo dos animais

contra infecções e causa teratogênese (SANTIN, 2000; CORRÊA, 2007; MALLMANN,

2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

5.5.3. Lesões pós-mortem

Rim pálido;

Rim com aumento relativo de tamanho

(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

Quando associadas às aflatoxinas, toxinaT2, ácido ciclopiazônico (CPA) e

fumonisinas apresentam:

Aumento relativo do tamanho do rim;

Rim pálido;

Aumento relativo do tamanho do pâncreas;

Aumento relativo do tamanho do proventriculo;

Aumento relativo do tamanho do fígado;

Redução do tamanho do baço

(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).

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6. DIAGNÓSTICO DAS MICOTOXICOSES

O diagnóstico se dá pela análise de micotoxinas presentes nos alimentos. Pode-

se chegar erroneamente à conclusão de que a intoxicação não seja por micotoxinas, por

confundirmos os sinais clínicos com os produzidos por outras doenças, deficiências de

manejo, deficiências nutricionais. Por apresentarem redução da eficiência reprodutiva,

diminuição da conversão alimentar, diminuição da taxa de crescimento e de ganho de peso.

Além de que as micotoxinas podem provocar imunodepressão e imunosupressão

permitindo o surgimento de processos infecciosos e parasitários, bem como falhas vacinais

(CORRÊA, 2007). O diagnóstico das micotoxicoses se baseia no achado da micotoxina no

alimento ou no conteúdo intestinal. O fator agravante é que o alimento já tenha sido

consumido e não se encontre disponível para teste (RUPLEY, 1999).

Devemos enviar ao laboratório:

Amostra de ração ou matéria- prima;

Aves vivas ou em gelo (resfriada);

Fragmentos de órgãos em formol (fígado, rim, coração, intestino, baço,

proventriculo)

(FÁBIO, 2009; ROSSINI, 2009).

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7. MÉTODOS UTILIZADOS PARA DIAGNÓSTICO DE MICOTOXINAS

Na atualidade a detecção de micotoxinas é realizada pela análise de grãos,

farelos ou rações através da incidência de luz ultravioleta onde se detecta coloração

característica emitida pela toxina em caso de positividade da amostra, mas vários são os

métodos utilizados para detecção e quantificação de micotoxinas em alimentos ou rações

utilizando tecidos, leite, urina, soro, fezes e sangue.

Esses métodos são;

Radioimunoensaio;

Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA);

Cromatografia em camada delgada (CCD);

Cromatografia gasosa;

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);

Espectometria de massa;

Nested PCR.

7.1. Radioimunoensaio(RIA)

O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para análise quantitativa das

reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas mesmo em preparações

não purificadas. Apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Como

limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional. Os

radioimunoensaios utilizam anticorpos conjugados com radioisótopos para quantificar os

ensaios. E os radioisótopos utilizados são iodo 125 ou 131, cobalto, trítio. Há muitas

variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou

anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não marcado da amostra.

7.1.1. Radioimunoensaio direto

No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a

um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado,

misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contém concentrações

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conhecidas do antígeno não marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno

não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por

interpolação na curva.

7.1.2. Radioimunoensaio de competição

No radioimunoensaio de competição uma quantidade fixa de antígeno é mobilizada

em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpos marcado específico

misturado com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações

variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação o anticorpo marcado que não se

ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se à medida da

radioatividade da fase sólida.

A partir da resposta obtida a concentração do antígeno em teste é estimada por

interpolação na curva.

7.1.3. Radioimunoensaio de captura

No radioimunoensaio de captura uma quantidade fixa de anticorpos é imobilizada

em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções

padrão, com concentrações conhecidas de antígenos são adicionadas. Após incubação

remove-se o antígeno não ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o

antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida.

A partir da resposta obtida a concentração do antígeno em teste é estimada por

interpolação na curva.

Devido à meia-vida dos reagentes utilizados, o risco operacional, a necessidade de

medidas especiais, de elevado custo de biosegurança e descarte de material levam aos

laboratórios optarem por técnicas que empreguem reagentes de maior estabilidade

(TESTONI, 2009).

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7.2. Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA)

O ELISA ( Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay), ou ensaio imunoenzimático

em suporte sólido é uma técnica baseada no princípio da interação específica entre anticorpo e

antígeno (aflatoxinas) (ZHENG et al., 2006).

A metodologia apresenta dois passos:

O primeiro passo é a reação entre o anticorpo e o antígeno;

O segundo passo é a revelação da reação pela hidrólise enzimática, que ocorre entre o

complexo antígeno-enzima e o substrato (AMARAL, 2006; JÚNIOR, 2006).

O ELISA pode ser feito com anticorpos policlonais ou monoclonais, porém os

monoclonais são mais específicos e reduzem as chances de ocorrência de falsos-positivos

(MOTTA, 2010; DUARTE, 2010). Os anticorpos são extraídos de cobaias (camundongos,

coelhos, galinha, cavalo, etc.) que são induzidos a produzirem anticorpos mediante

inoculação do antígeno. O ELISA é utilizado para detectar aflatoxinas devido a sua

sensibilidade, especificidade, rapidez e facilidade de manuseio ( WHITAKER et al., 1994;

SCOTT, 1995; OLIVEIRA et al., 2000; WHO, 2001; ZHENG et al., 2006; AMARAL, 2006;

JÚNIOR, 2006). É também uma técnica de baixo custo e que não exige mão de obra

especializada (WHO, 2001; ZHENG et al., 2006; LÚCIO et al., 2007).

Atualmente, a recomendação feita é que resultados positivos do teste de ELISA devem ser

acompanhados de técnicas cromatográficas instrumentais mais específicas para devida

confirmação (MOTTA, 2010; DUARTE, 2010). Trata-se de um método eficiente, capaz de

detectar concentrações de aflatoxinas a partir de 2,5ppb (ZHENG et al., 2006). Porém, tem

como desvantagem a alta incidência de falsos-positivos, variabilidade de resultados de 30 a

300%, baixa reprodutibilidade e possibilidade de resultado falso-negativo (AMARAL, 2006;

JÚNIOR, 2006).

O ELISA pode ser:

ELISA de competição ;

ELISA não competitivo.

No ELISA de competição ou competitivo, a substância a ser analisada, nesse

caso a aflatoxina, aparece em concentrações variáveis dentro da amostra a ser analisada, e

ao ser colocada em contato com o anticorpo específico, compete com uma quantidade

constante de aflatoxina previamente imobilizada na fase sólida. A concentração do

anticorpo deve ser limitada para garantir a eficácia da competição.

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No ELISA não competitivo o anticorpo reage proporcionalmente com a

quantidade de aflatoxina contida na amostra.

Para detecção (revelação) do anticorpo ligado a aflatoxina utiliza-se a técnica

direta ou a técnica indireta (MOTTA, 2010; DUARTE, 2010).

Na técnica direta, o anticorpo específico com um título constante é fixado sobre

a placa ou tubo de microtitulação. Em seguida, a solução de amostra e uma quantidade

conhecida constante de conjugado micotoxina-enzima são incubados simultaneamente.

Depois da lavagem, a micotoxina-enzima ligada à placa por intermédio do anticorpo é

revelada por junção de um substrato cromogêneo específico de enzima. A cor obtida é

medida por fotometria ou apreciada visualmente. A intensidade da cor é inversamente

proporcional à concentração de aflatoxina na amostra (ZHENG, 2006).

Na técnica indireta, a revelação ocorre através de um anticorpo conjugado a

uma enzima. A solução da amostra a ser analisada é incubada simultaneamente com uma

quantidade constante de anticorpo conjugado. Se houver aflatoxina na amostra ela irá

reagir com o anticorpo previamente fixado no fundo da cubeta e o segundo anticorpo se

ligará a esse complexo (anticorpo-aflatoxina) e formará outro complexo (anticorpo-

aflatoxina-segundo anticorpo-enzima). Após a lavagem é adicionada uma solução que

reagirá com o complexo tornando o meio colorido. A intensidade da cor é diretamente

proporcional a concentração de aflatoxinas na amostra. Quando adquirimos um kit de

ELISA , a microplaca ou cubeta já vem com antígenos aderidos à parede da mesma.

As enzimas mais utilizadas são a catalase, a glucose-oxidade, a galactosidade,

a fosfatase alcalina e a peroxidase (MOTTA, 2010; DUARTE, 2010). É o ensaio

imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA) competitivo direto o mais utilizado.

Principalmente na detecção de aflatoxinas. Devido a sua praticidade, rapidez e custo

reduzido (WHO, 2001; AMARAL, 2006; JÚNIOR, 2006; ZHENG et al., 2006). Embora

possa resultar falso-positivos por sua sensibilidade para com os compostos interferentes

da matriz ou por ¨deficiente¨ especificidade dos anticorpos (VAN PETEGHEM, 1992),

pois muitas micotoxinas tem estruturas químicas estreitamente afins e por isso, existe a

posibilidade de reações cruzadas entre anticorpos produzidos para uma determinada

aflatoxina, contra outras micotoxinas que podem aparecer ao mesmo tempo, dentro do

mesmo grupo (LINO et al., 1998). Em alguns dos equipamentos comerciais para

aflatoxinas, pode acontecer que o anticorpo mostre uma certa reactividade cruzada com

outras aflatoxinas, o resultado positivo não é seletivo no que se refere à concentração das

aflatoxinas separadas (AMADO, 2001).

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Porém apresenta como vantagens:

A sua sensibilidade;

A enorme quantidade de amostras que se pode manipular num dia, o que se traduz

em baixos custos por análise;

A necessidade de pequenas quantidades de anticorpos diluído, podendo usar-se a

mesma quantidade para um grande número de amostras (AMADO, 2001).

7.3. Cromatografia

7.3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)

Consiste na separação de misturas de compostos moleculares através da

migração diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (estacionária) e outra móvel,

que desliza sobre a primeira. Ou também pode ser expresso como um procedimento de

separação microanalítico no qual os componentes de uma mistura são transportados para

diferentes distâncias em uma placa recoberta com uma fina camada de material poroso. A

espessura da camada pode variar de 100 a 250 mm. A placa que serve de suporte em geral

é de vidro, mas pode ser de plástico ou de alumínio. A camada que recobre a placa recebe

o nome de fase estacionária e em geral é constituída de sílica gel. O mecanismo de

transporte é um solvente, e é conhecido como fase móvel. Primeiro a amostra é dissolvida

em um solvente adequado, então, uma certa alíquota desta solução é aplicada na região de

partida e o conjunto é seco. A placa de TLC/HTLPC é então colocada em uma câmara de

desenvolvimento ou cuba, a qual contém solvente. Se inicía o que chamamos de

desenvolvimento cromatográfico onde os componentes da amostra são influenciados pela

ação de duas forças, opostas entre si:

Capilaridade que é a responsável pelo avanço do solvente ou fase móvel sobre a

fase estacionária que contém a amostra.

Interação tão logo se inicia a migração da fase móvel, a amostra é dissolvida e

começa a ser arrastada pela fase móvel. Neste momento aparecem forças de

interação entre os componentes da amostra e a fase estacionária. Estas forças de

interação se opõem à força de arraste da fase móvel (capilaridade) retardando o

avanço dos componentes da amostra. Este retardo não ocorre da mesma forma para

diversos constituintes presentes na amostra aplicada. Forças de interação como

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dipolo induzido, pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals tomam parte neste

processo, fazendo ocorrer mecanismos de separação como adsorção, dispersão e

troca iônica (ZANELLA, 2011).

7.3.2. Cromatografia gasosa (CG)

A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com poder de resolução excelente,

possibilitando a análise de várias substâncias em uma amostra.

A fase estacionária da cromatografia gasosa é um material, líquido ou sólido, que

propicia a separação da mistura através de processos físicos e químicos. A fase estacionária

líquida, é um líquido pouco volátil, que recobre um suporte sólido, separando as substâncias

presentes na amostra através das diferenças de solubilidade e volatilidade. Como fase móvel

é utilizado um gás, denominado gás de arraste, que transporta a amostra através da coluna de

separação até o detector, onde os compostos separados são detectados.

Os gases mais utilizados são o hélio (He), hidrogênio (H), nitrogênio (N) e argônio

(Ar). Como o He é de difícil obtenção e de alto custo é pouco utilizado no Brasil.

A cromatografia gasosa é uma técnica utilizada na separação de substâncias ou

gases, sendo a fase estacionária de estado sólido ou líquido e a fase móvel, um gás. Mesmo

substâncias, que à temperatura ambiente se apresentem líquidas, podem ser utilizadas nesta

técnica se forem volatilizáveis, ou seja, possam ser transformadas em vapor com o aumento

de temperatura. Essas substâncias se transformam em vapor logo que injetadas no aparelho,

por ação de um vaporizador. Assim, ao serem injetadas amostras líquidas no cromatógrafo,

passarão pelo vaporizador, que as transformam em uma espécie de spray, este por sua vez irá

atravessar a coluna cromatográfica. Mas o vapor não consegue atravessar a coluna apenas

com a força exercida pelo injetor. A fase móvel (um gás de arraste, geralmente hidrogênio,

hélio ou argônio) irá ¨empurrar¨ à amostra vaporizada ao longo da coluna contendo à fase

estacionária de acordo com as propriedades dos componentes da amostra, alguns irão ser

retidos na fase estacionária por tempo maior que os outros. Enfim, de acordo com o tempo

que cada componente leva para atingir o final da coluna, poderá ser determinada sua afinidade

pela fase estacionária, facilitando a sua caracterização e identificação. É importante, que a

fase móvel (o gás) não reaja com a amostra ou com a fase estacionária, além de se apresentar

com alto grau de pureza, impedindo assim que interferentes reajam com a fase estacionária ou

amostra.A coluna cromatográfica fica inserida em um forno que a contém, utilizado na

manutenção da temperatura ótima para o desenvolvimento cromatográfico. É preferível que

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esse forno apresente uma ampla faixa de temperatura para se utilizar (desde à temperatura

ambiente até cerca de 400°C ), esta temperatura não deve ser influenciada por outras partes do

equipamento, que seja alcançada rapidamente e que se mantenha homogênea, ou seja,

constante em toda à região do forno.

Ao se injetar à amostra, o vaporizador adquire certa temperatura para vaporização,

contudo, esta não deve ser alta demais para não decompor o material. O ideal seria 50° C

acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil.

A partir das análises realizadas pode se identificar os componentes após terem

atingido a saída da coluna. Isso é conseguido com o uso de um aparelho que irá registrar essa

saída, num detector. Tem uma Eletrônica de Tratamento (amplificação) de Sina e o

registrador ou computador que registra a Sina. De acordo com o tempo de arraste poderá se

determinar quais são as substância presentes na amostra.

7.3.3. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

É um método de separação de substâncias de certa amostra. A cromatografia

líquida antigamente era utilizada apenas com uma coluna de vidro sob ação da gravidade.

Atualmente se utiliza bombas para operações a altas pressões e detectores cada vez mais

sensíveis, além do material diferenciado. Isso faz com que essa técnica moderna seja

considerada de alta eficiência.

A amostra a ser analisada deve ser solúvel na fase móvel (líquida), interagindo

tanto com esta, quanto com a fase estacionária.

A Cromatografia Líquida de Fase Sólida (CLAE) se desenvolveu muito nos

últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que sua fase móvel é um

solvente. Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica,

detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou

macromoléculas e compostos termolábeis.

A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características

impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva à

amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza

ou ser de fácil purificação, para que se poça fazer análises de alta sensibilidade, pois as

impurezas podem interferir na detecção do analíto por ultravioleta (UV). A fase móvel deve

ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para

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permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários

solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila.

Está técnica possui aplicabilidade extensa como: em pesquisas científicas, análises

químicas, testes de controle de qualidade de medicamentos e outros compostos, controle de

qualidade do ar e da água, entre outras. É uma técnica altamente sensível; de alta resolução,

mesmo se a amostra possuir misturas complexas de componentes e é um método rápido e

preciso.

7.4. Espectrometria de massa movida a gases

A amostra deve ser uma substância volátil de baixo peso molecular, que é colocada

num sistema de injeção, onde o injetor é super aquecido indo de 40°C até 700°C,

temperatura. Essa que explode à amostra, a qual é canalizada para um sistema de coluna

capilar de vidro recheada de sílica. Medindo este em torno de 30 m. É nesta coluna que ocorre

a separação dos constituintes da amostra, os quais entram no espectômetro onde se dá a

determinação de massa pelo tamanho da resposta que essa massa produz em relação a sua

quantidade. O resultado é registrado num computador. O diagnóstico é feito por ampliação

dos picos e comparação com as quase um milhão de substâncias identificadas com suas

respectivas massas nesse banco de dados. Identificando assim as substâncias presentes na

amostra (MALLMANN, 2011).

7.5. Nested PCR

É o método mais usado. Ocorre a duplicação da parte mais variável da micotoxina

e esse material é usado como primers para uma segunda amplificação e assim garantindo uma

melhor detecção. A limitação existente é que para a micotoxinas de influência nos frangos de

corte apenas temos até o momento primers para amplificação de aflatoxinas e tricotecenos

(FUNGARO, 2011).

7.6. Kits para análise de micotoxinas

7.6.1. Aflcheeck

Este método baseia-se nas duas principais fases de procedimento analítico:

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A extração /clean-up e a quantificação.

Na fase de extração /clean-up emprega-se as colunas de imunoafinidade, que são

cartuchos recheados de anticorpos monoclonais específicos para cada uma das principais

micotoxinas de interesse em saúde pública: aflatoxinas (B,G e M), DON (ou vomitoxina),

fumonisinas, ocratoxina A e zearalenona. O emprego dos anticorpos garante uma extração

mais específica, prática e rápida. O eluato obtido da coluna de imunoafinidade pode ser

quantificado por métodos cromatográficos ou por fluorimetria. Para fase de quantificação,

usa-se o fluorímetro série-4, que é um equipamento capaz de quantificar as micotoxinas do

eluato entre 1 e 5 minutos, fornecendo os resultados impressos em ppb ou ppm.

7.6.2. Afla Teste-P

Rápido. Menos de 10 minutos para prova (excluído a preparação da amostra).

Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 0,1 ppb em CLAE (HPLC) e 1,0 ppb

em fluorímetro.

Amplo alcance, ou seja, pode medir até 300 ppb.

Conveniente, pois se utiliza o mesmo extrato e instrumento para análise de outras

micotoxinas.

Simples, pois não requer técnica especial, à prova pode ser realizada praticamente

qualquer instalação.

Seguro, pois requer menos materiais tóxicos que os métodos convencionais.

Não requer armazenagem especial, podendo ficar em temperatura ambiente até 30°C.

Tem vida média de 18 meses.

Pode ser usado com uma variedade de amostras.

Resultados numéricos precisos.

Metodologia:

Extração da amostra

Moer e pesar à amostra.

Misturar com sal e uma mistura de metanol com água.

Filtrar.

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Diluição e filtração

Passar o filtrado pela coluna de afinidade Afla Teste-P.

Passar água através da coluna.

Eluir as aflatoxinas da coluna com metanol e recolher em um tubo.

Quantificação

Ler as aflatoxinas em fluorímetro, CLAE (CHPL) ou CCD, sendo os resultados em

ppb.

7.6.3. Afla Test-B

Rápido, ou seja, leva-se menos de 10 minutos para sua realização (excluindo a

preparação da amostra).

Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 1 ppb em fluorímetro e de 0,1 ppb em

sistema de CLAE (HPLC).

Tem amplo alcance, podendo medir até 300 ppb.

Conveniente, pois se utiliza o mesmo extrato e instrumento para análise de outras

micotoxinas.

Recuperação superior a 85%.

Seguro, pois requer menos materiais tóxicos que os métodos convencionais.

Não requer armazenagem especial, podendo ficar em temperatura ambiente até 30°C.

Tem vida média de 1 ano.

Pode ser usado com variedade de amostras.

Resultados numéricos precisos.

Usando o Afla Test-B as aflatoxinas B1 e B2 podem ser isoladas, e B1 pode ser

quantificada individualmente por CLAE (HPLC). Com o sistema de medidas por fluorímetria,

o total de B1 e B2 é relatado. Sabe-se que B1 é responsável por 755 do total de B1 e B2

medidos. Os resultados podem ser registrados em fluirímetro digital, em impressora

automática, em CLAE (HPLC) ou por análise em TLC.

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7.6.4. Afla Test-WB

Rápido, menos de 10 minutos (excluindo a preparação da amostra).

Sensível, pois detecta em sistema CLAE (HPLC) níveis tão baixos quanto 0,03;

0,05; 0,05 e 0,11 ppb para as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, respectivamente.

Armazenagem 30°C.

Vida média de 1 ano.

7.6.5. DON Test HPLC

Rápido.

Sensível, pois detecta níveis até de 0,1 ppm.

Amplo alcance até 10 ppm.

Armazenagem até 30°C.

Vida média de 1 ano.

Metodologia:

Extração da amostra

Moer e pesar a amostra.

Misturar a amostra com PEG/água.

Filtrar.

Cromatografia de afinidade

Passe uma porção do filtrado através da coluna de afinidade DON Test HPLC.

Lave a coluna com água.

Recupere a DON da coluna com metanol e colete em uma cubeta.

Quantificação

Evapore o metanol do eluato.

Ressuspenda na fase móvel adequada.

Injete em HPLC com detector UV.

Determine a concentração de DON pelo cromatograma.

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7.6.6. DONCheck

Teste qualitativo para detecção da micotoxina desoxinivalenol (DON).

Resultado em 3 minutos.

Detecta DON acima de 1 ppm.

Podendo ser usado em qualquer lugar.

Longo prazo de validade.

Não requer refrigeração.

Pode ser utilizado em vários tipos de amostra.

7.6.7. FumoniTest/FumoniTest WB

Menos de 15 minutos para a prova (excluindo-se a preparação da amostra).

Detecta níveis tão baixos como 0,25 ppm em fluorímetro e 0.016 ppm em sistema

CLAE (HPLC).

Amplo alcance podendo medir níveis tão alto como 10 ppm.

Vida média de 1 ano.

Resultados numéricos precisos.

Metodologia:

Extração de amostra

Moer e pesar uma amostra de 50g.

Misturar a amostra com 5g de sal e 100 ml de uma mistura de metanol e água destilada

a 80%.

Filtrar.

Diluição e filtração

Diluir uma alíquota do extrato da amostra.

Filtrar.

Cromatografia de afinidade

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Passar o filtrado pela coluna de afinidade Fumoni Test.

Lavar a coluna com buffer para lavado e água destilada.

Eluir as fumonisinas da coluna com 1ml de metanol e recolher em um tubo fluorimé-

trico.

Quantificação

Derivatizar as fumonisinas com o 0-ftaldiadeído (OPA) e 2-mercaptoetanol.

Colocar o tubo fluorimétrico em um fluorímetro calibrado, ou injetar direto em CLAE

(HPLC).

Ler os resultados.

7.6.8. Fumoni Test 200

Detecta níveis baixos de 0,50 ppm no fluorímetro.

Metodologia:

Extração da amostra

Como do Fumoni Test

Diluição e filtração

Como no Fumoni Test

Cromatografia de afinidade

Passar uma parte do filtrado pela coluna de afinidade Fumoni Test 200.

Lavar a coluna.

Eluir as fumonisinas da coluna com metanol e recolher em uma cubeta.

Quantificação

Adicionar revelador à cubeta e eftuar a medição em um fluorímetro calibrado. Ler os

resultados em PPM.

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7.6.9. Ochra Test

Rápido. 10minutos (excluindo a preparação da amostra).

Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 1 ppb no fluorímetro e 0,25 ppb em

sistema CLAE (HPLC).

Amplo alcance, pois mede nível tão alto quanto 100 ppb.

Não precisa mão de obra especializada.

Armazenagem em até 30°C.

Vida média de 1 ano.

Resultados numéricos precisos.

Metodologia:

Extração da amostra

Moer e pesar a amostra.

Misturar a amostra com sal e uma mistura de metanol e água.

Filtrar.

Diluição e filtração

Diluir uma alíquota do extrato da amostra com água.

Filtrar.

Cromatografia de afinidade

Passar parte do filtrado por uma coluna de afinidade Ochra Test.

Lavara coluna com diluente e depois com água.

Eluir as ochratoxinas da coluna com solução de hidróxido de sódio (fluorímetro) ou

metanol (HPLC) e recolher em um tubo fluorimétrico.

Quantificação

Colocar um tubo no fluorímetro calibrado ou injetar o extrato num HPLC.

Ler os resultados em ppb.

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7.6.10. Ochra Test WB

Semelhante ao Ochra Test, só que sua eluição é apenas com metanol e sua

quantificação é apenas no HPLC.

7.6.11. AOZ HPLV

Rápido, 15 minutos.

Sensível, pois detecta níveis médios de aflatoxinas tão baixos quanto 0,01

microgramas por Kg; 0,25 microgramas por Kg para OTA e 5,0 microgramas por Kg

para zearalenona.

Amplo alcance, pois pode alcançar níveis de 100 microgramas por Kg para aflatoxinas

e OTA, e 1000 microgramas por Kg par zearalenona.

Índice de recuperação maiores que 85%.

Vida média de 1 ano.

Resultados numéricos precisos.

AOZ HPLC emprega uma única coluna simultâneamente para isolamento de

aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, OTA e zearalenona. Usando uma coluna de imunoafinidade

monoclonal e um HPLC. Esta prova produz resultados numéricos precisos em microgramas

por quilograma (Kg) ou partes por bilhão ( ppb).

Metodologia:

Extração da amostra

Moer e pesar a amostra.

Misturar com solução de metanol/água.

Filtrar.

Diluição e filtração

Diluir uma alíquota do extrato com PBS/Tween.

Filtrar.

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Cromatografia de afinidade

Passar uma parte do extrato pela coluna de afinidade AOZ HPLC.

Lavar a coluna com PBS/Tween.

Lavar a coluna com água.

Eluir as aflatoxinas, ochratoxinas A e zearalenona da colunha com metanol.

Quantificação

Injetar o eluato em sistema CLAE (HPLC).

Determinar as concentrações das aflatoxinas, ochratoxina A e zearalenona.

AOZ HPLC

Leitura somente em HPLC.

Não exige armazenamento especial, nem refrigeração.

Leitura do total de aflatoxinas B1, B2, G1, G2, ochratoxina A e zearlenona.

Tem uma vida longa de prateleira.

Não afetado por calor e umidade até 30°C.

Pode ser usado com uma variedade de amostras incluindo: arroz, cevada, milho,

centeio, trigo e rações.

7.6.12. AflaOchra HPLC

Rápido, pois amostra fica pronta em menos de 10 minutos para análise em CLAE

(HPLC); excluindo a preparação da amostra.

Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 0,25 ppb em CLAE (HPLC).

Amplo alcance, pois pode medir níveis tão altos como 100 ppm.

Recuperação maior que 70%.

Pode ficar à temperatura ambiente até 30°C.

Vida média de 1 ano.

Leitura total para os quatro tipos de aflatoxinas: B1, B2, G1, G2, e ochratoxina A e

seus estereoisomeros.

Resultados numéricos precisos.

Metodologia:

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Extração da amostra

Moer e pesar a amostra.

Misturar com sal e uma mistura de metanol com água.

Filtrar.

Diluição e filtração

Diluir uma alíquota do extrato da amostra com água.

Filtrar.

Cromatografia de afinidade

Passar o filtrado pela coluna de afinidade AflaOchra HPLC.

Lavar a coluna com água.

Eluir as aflatoxinas e ochratoxinas da coluna com metanol e recolher em tubo.

Quantificação

Injetar o eluato em CLAE (HPLC) e determinar a concentração de aflatoxina.

Injetar o eluato em CLAE (HPLC) e determinar a concentração de ochrtoxina A.

Após isolar as micotoxinas nas colunas de afinidade precisamos colocar as

amostras no fluorímetro para fazer a leitura por fluorescência em ppm ou ppb. Que é simples

de operar. Com um toque de um botão, identificamos a micotoxina a ser medida. O resultado

é impresso numa impressora integrada. De forma simples e eficiente, o flourímetro é capaz de

medir os níveis totais de micotoxinas em amostras preparadas usando as colunas de afinidade.

Une rapidez, sensibilidade e simplicidade de operação. Por conter um relógio interno,

monitora o tempo de sua última calibração e o alerta quando é necessária nova calibração.

Possui visor de electroluminiscência para guiar-nos na leitura. Pode ser usado a campo.

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8. MANEJO PROFILÁTICO COM OS GRÃOS

Realizar a colheita, tão logo seja atingido o teor de umidade, que permita proceder a

operação.

Ajustar os equipamentos de colheita para proceder à máxima limpeza da massa dos

grãos e evitar danos mecânicos.

Desinfetar as instalações e os equipamentos de colheita. Limpar os silos e graneleiros

removendo pó, lixo e outros materiais.

Proceder de forma correta às operações de pré-limpeza e limpeza removendo impu-

rezas, grãos danificados, finos e materiais estranhos. Pois estes podem ser utilizados

como substrato no desenvolvimento dos fungos.

Proceder à operação de secagem de forma correta garantindo a redução e

uniformidade do teor de umidade a níveis que não permitam o desenvolvimento dos

fungos.

Monitorar a temperatura da massa de grãos e aerar sempre que necessário, para

uniformizar a temperatura.

Adotar técnicas para o controle de insetos e roedores, pois geralmente a proliferação

dos fungos está associada ao ataque dessas pragas.

Devemos considerar que as micotoxinas são termo estáveis, por isso são mais fáceis

de combatê-las do que os fungos que as produzem, uma vez, que ele se encontram em

abundância no ambiente.

Devemos usar plantas resistentes a colonização fúngica.

Tempo de estocagem dentro do limite de vitalidade dos grãos.

Irradiação dos grãos se necessário com radiação gama.

Uso de adsorventes de micotoxinas a base de aluminosilicatos de cálcio ou sódio,

bentonitas sódicas nas rações, que se unem a micotoxina e a impossibilita de ser

absorvida pelo tratogastrointestinal. E o uso de adsorventes mistos derivados de

saccharomyces cerevisae, zeolitas, que adicionados de enzimas como epoxidases e

lactonases, degradam as micotoxinas (SANTURIO, 1995; DAWEGOWDA et al.1998;

FREITAS, 2007).

Uso de certos polissacarídeos como adsorventes, os quais reduzem significativa-

mente a biodisponibilidade de muitas micotoxinas (DAWSON, 2004; FREITAS, 2007).

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Degradação química, ou seja, uso de amônia gasosa sob elevadas temperaturas e

pressão, buscando detoxificar os grãos.

Degradação biológica, ou seja, utilização de bactéria flavumbacterium aurantiacum

que age removendo totalmente as aflatoxinas do milho.

Tratamento térmico. As aflatoxinas podem ser degradadas a certa porcentagem pelo

calor. A degradação é maior em ambiente úmido.

Remoção seletiva, que é a seleção eletrônica ou manual, que separa os grãos cujas

características estejam relacionadas à maior contaminação por aflatoxinas, como os

grãos descoloridos de amendoim. Mesas gravitacionais que separam os grãos mais

leves (contaminados).

Utilização de ácidos orgânicos (ácido propiônico e seus derivados os propionatos,

ácido acético, ácido sórbico e ácido benzóico) e seus sais de cálcio, sódio e potássio

(FREITAS, 2007; CORRÊA, 2007; SILVA, 2010).

A simples presença ou detecção das micotoxinas na ração de aves não determina

que ocorrerá intoxicação. A dose tóxica está relacionada com o grau de sensibilidade das aves

e com seu grau de conforto, como é o caso da aflatoxicose, ou seja, menos estresse suporta

níveis mais elevados de aflatoxinas (SANTURIO, 2000). A melhor maneira de controlar a

contaminação de micotoxinas nos alimentos é controlando o crescimento dos fungos. Até o

momento, os adsorventes existentes não tem capacidade de adsorver todas as micotoxinas e

nenhum adsorvente tem capacidade de adsorver micotoxinas de maneira significativa, quando

colocado diretamente sobre os grãos em silos, pois a adsorção ocorre em meio líquido

(FREITAS, 2007).

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9. CONCLUSÃO

Devido à presença de micotoxinas nos grãos e em conseqüência nos farelos e rações

ser uma realidade brasileira, faz-se, necessário, alternativa, para controlar, se possível evitar, a

sua presença nos farelos e grãos de maneira mais precisa e a baixo custo. Pois a presença de

micotoxinas impede exportações e deixa para o mercado interno um produto, que irá compro-

meter a produção, o ganho dos produtores, a saúde dos animais e do homem. Por isso é

importante, que se realizem monitorias de qualidade em relação às condições de estressse dos

animais, adquirir grãos mais resistentes ao crescimento fúngico, armazenar e manejar os silos

adequadamente, usar inibidores ao crescimento fúngico (quando necessário e viável eco-

nomicamente) e realizar análises clínicas precisas. O que não era possível até os anos 80.

Segundo BERGERE, 1991 devido as micotoxinas serem haptenos, o que significa que não

são imunógenas, tendo que conjugar-se com uma proteína antes de ocorrer a imunização ,

para obter-se o antisoro. E estas conjugações podem complicar-se, porque a maioria das

micotoxinas não tem um grupo reactivo adequado na molécula, para se unirem à proteína

suporte. Por isso faz-se necessário maiores estudo sobre as micotoxinas, sua sintomatologia,

detecção e prevenção.

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