UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

CAMPUS DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA – PRODUÇÃO VEGETAL

MARIA HERLÂNDIA DE ARAÚJO FERNANDES

TOXICIDADE DE EXTRATOS ORGÂNICOS E ÓLEO

ESSENCIAL DE Annona vepretorum (ANNONACEAE)

SOBRE Tetranychus urticae Koch (ACARI:

TETRANYCHIDAE)

Petrolina - PE

2016

MARIA HERLÂNDIA DE ARAÚJO FERNANDES

TOXICIDADE DE EXTRATOS ORGÂNICOS E ÓLEO

ESSENCIAL DE Annona vepretorum (ANNONACEAE)

SOBRE Tetranychus urticae Koch (ACARI:

TETRANYCHIDAE)

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Agronomia – Produção Vegetal do Campus de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Agronomia – Produção Vegetal.

Orientadora: Rita de Cássia Rodrigues Gonçalves Gervásio Co-orientador: José Eudes de Morais Oliveira

Petrolina - PE

2016

Fernandes, Maria Herlândia de Araújo

F363t Toxicidade de extratos orgânicos e óleo essencial de Annona vepretorum (Annonaceae) sobre Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) / Maria Herlândia de Araújo Fernandes. – Petrolina, 2016.

72 f. : il. ; 29 cm. Dissertação (Pós-graduação em agronomia – Produção vegetal) –

Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Ciências

Agrárias, Petrolina-PE, 2016.

Orientadora: Profª. Drª. Rita de Cássia Rodrigues Gonçalves Gervásio.

Referências.

1. Annonaceae - Planta. 2. Annonaceae – Toxicidade. 3.

Annonaceae – Extrato Vegetal. 3. Sistema de Produção. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 581

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho

Aos meus queridos pais Anastácio do Nascimento Fernandes e

Maria Auxiliadora de Araújo Fernandes.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente ao Pai Celestial, por me conceder a graça da vida e o seu

amor incondicional, por me guiar e me ajudar as superar todos os obstáculos.

A Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), pela

oportunidade de realização do curso.

A Fundação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pela concessão da bolsa de estudo.

A Embrapa semiárido, por disponibilizar a estrutura para o

desenvolvimento da pesquisa.

A minha família, principalmente aos meus pais, Maria Auxiliadora de A.

Fernandes e Anastácio do N. Fernandes, pelas orações e apoio em cada

escolha da minha vida.

Aos meus irmãos Ana Cleide de A. Fernandes, Aneilda de A. Fernandes,

Maria José de A. Fernandes e Ailton de A. Fernandes. E aos meus amados

sobrinhos Fernanda, Mirele, Samuel, Lara, James e Isabella.

Ao meu esposo Weberton Gomes Duarte, pelo amor, colaboração,

paciência e por estar sempre ao meu lado disposto a me ajudar.

A minha orientadora, Profa. Rita de Cássia R. G. Gervásio, pela imensa

paciência, ensinamentos e colaboração no desenvolvimento desse trabalho.

Ao meu co-orientador, Dr. José Eudes de M. Oliveira, pela valiosa

colaboração nesse trabalho, disposição e ensinamentos. Por todas as

oportunidades que me concedeu ao longo de muitos anos e por sempre

acreditar e confiar em mim. Serei eternamente grata.

Ao Prof. Jackson Guedes e Ana Paula Oliveira pela imensa colaboração

nas coletas e extrações, fazendo com que este trabalho fosse realizado.

A Izabel Cristina Casanova Turatti, pela colaboração na identificação dos

compostos químicos dos óleos essenciais.

Aos colegas de turma pelo companheirismo e bons momentos

compartilhados, em especial a Angélica Ricarte, pela amizade e por me ajudar

nos momentos mais difíceis.

A minha amiga Karen Oliveira, por viver comigo muitos momentos bons

e ruins da minha vida, por toda a ajuda prestada e disposição em me ajudar

sempre.

A minha prima querida, Thiara Fernandes, pelo amor e amizade, e as

minhas amigas de infância Blandinalva Pereira e Maria das Graças Moraes.

Aos amigos do Laboratório de Entomologia da Embrapa Semiárido

(Fabiana Soares, Adriana Maria, Tanira Ribeiro, Martin Duarte, Carla Patrícia,

Farah Gama, Victor Hugo, Gedeão Arruda, Diniz da Conceição) pela

colaboração e por todos os momentos de alegria e descontração. Os

momentos com eles, guardarei para sempre.

Enfim, a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram no

desenvolvimento deste trabalho, me apoiando e confiando em sua conclusão.

RESUMO

Tetranychus urticae Koch é considerada uma importante praga para

muitas culturas de importância agrícola. Para o seu controle táticas de manejo tem sido investigas como alternativa aos acaricidas sintéticos. O presente estudo objetivou avaliar a toxicidade de extratos orgânicos e óleo essencial de folhas de Annona vepretorum sobre o ácaro rajado T. urticae. A toxicidade do extrato metanólico foi avaliada através do contato direto (aplicação via torre de Potter) e contato residual (imersão do disco foliar). A toxicidade do extrato hexânico foi realizada apenas através de contato residual. A CL50 do extrato metanólico (por contato direto) foi aplicada sobre as fêmeas do ácaro para avaliar os efeitos subletais. O teste de dupla escolha avaliou a preferência do ácaro para alimentação e oviposição entre o controle e as diferentes concentrações dos extratos. Os compostos químicos dos óleos essenciais de folhas de A. vepretorum, coletados em duas épocas distintas, foram analisados por CG/EM. Para os testes com óleos essências, recipientes de vidro (1,4 L) foram utilizados como câmaras de fumigação. A toxidade por contato foi realizada somente com o óleo da época 2. Os resultados indicam que a CL50 do extrato metanólico foi de 10,96 mg/mL para o efeito de contato direto e 22,07 mg/mL para o efeito de contato residual. A CL50 do extrato hexânico foi de 50,61 mg/mL. A CL50 do extrato metanólico interferiu na fecundidade e longevidade das fêmeas, diferindo significativamente do controle. Porém, não houve diferenças entre os tratamentos quanto a viabilidade de ovos. No teste de dupla escolha, 82 a 99% de T. urticae preferiu o controle para alimentação e 84 a 100% para oviposição. A análise dos óleos essenciais por CG/EM revelou como constituinte majoritário o espatulenol (29,84%) na época 1 (junho/2015) e biciclogermacreno (28,81%) na época 2 (fevereiro/2016). Foi constatado efeito significativo na interação entre as épocas de coleta e as diferentes concentrações do óleo. A ação fumigante dos óleos foi maior após 72 h, na concentração de 40 μL/L, alcançando em média 98,9 e 97,2% de mortalidade nas épocas 1 e 2, respectivamente. No teste de contato, análise de regressão só foi significativa para as concentrações de 200, 600 e 800 µL/mL. A toxicidade por contato foi maior nas primeiras 24 horas, onde a maior mortalidade (96,4%) foi obtida com 800 µL/mL. Os resultados indicam que A. vepretorum tem poder acaricida e revela ser uma alternativa possível no manejo sustentável de T. urticae. Porém, muitos outros trabalhos devem ser realizados, uma vez que, este é o primeiro estudo que avalia a atividade pesticida dessa espécie vegetal.

PALAVRAS-CHAVE: Ácaro rajado. Acaricida botânico. Controle alternativo. Annonaceae.

ABSTRACT

Tetranychus urticae Koch is considered a important pest for many crops

of agricultural importance. Management tactics has been investigated as an alternative to synthetic miticides to control this mite. This study aimed to evaluate the toxicity of organic extracts and essential oil of Annona vepretorum leaves on T. urticae mite. The toxicity of methanol extract was evaluated through direct contact (via application of Potter tower) and residual contact (immersion of leaf disc). The toxicity of hexane extract was carried out only by residual contact. The CL50 of the methanol extract (by direct contact) was applied to the female mite to assess sublethal effects. The test double choice evaluated the preference mite feeding and oviposition between the control and different concentrations of the extracts. The chemical compounds of essential oils from leaves of A. vepretorum collected in two different periods, were analyzed by GC/MS. For tests with essential oils, glass containers (1.4 L) were used as fumigation chambers. The toxicity was performed only by contact with the oil of the time 2. The results indicate that the LC50 of the methanol extract was 10.96 mg/mL for direct contact effect and 22.07 mg/mL to contact the residual effect. The CL50 of the hexane extract was 50.61 mg/mL. The CL50 of the methanol extract interfere on fertility and longevity of females, differing control significantly. However, there were no differences between treatments for the egg viability. In the dual choice test, 82 to 99% of T. urticae has preferred the control for the alimentation and 84 to 100% for oviposition. The analysis of the essential oils by GC/MS has revealed the spathulenol as major constituent (29.84%) at the time 1 (June/2015) and bicyclogermacrene (28.81%) at the time 2 (February/2016). It was noted significant effect on the interaction between collection time and the different oil concentrations. The fumigant action of the oils was greater after 72h, at concentration of 40 µL/L, reaching the average 98.9 and 97.2% of mortality at the times 1 and 2, respectively. In the contact test, regression analysis was only significant at the concentrations of 200, 600, and 800 µL/mL. The toxicity by contact was greater in the first 24 hours, where the highest mortality rate (96.4%) was obtained with 800 µL/mL. The results indicate that A. vepretorum has acaricide power and reveals himself to be a possible alternative in the sustainable management of T. urticae. However, many other work must be performed, since this is the first study evaluating the pesticidal activity of this plant species.

KEY WORDS: Spotted spider mite. Botanical acaricide. Alternative control.

Annonaceae.

Lista de figuras

Capítulo 1 Pág.

Figura 1. Mortalidade de Tetranychus urticae em diferentes tempos de

avaliação (horas) por efeito de contato residual do extrato hexânico de

folhas de Annona vepretorum......................................................................... 28

Figura 2. Figura 2. Mortalidade de Tetranychus urticae em diferentes

tempos de avaliação (horas) por efeito de contato direto (A) e contato

residual (B) do extrato metanólico de folhas de Annona vepretorum.............. 29

Figura 3. Frequência média (%) de fêmeas de Tetranychus urticae na

escolha pelo hospedeiro tratado e não tratado com extrato metanólico de

Annona vepretorum em diferentes concentrações. Avaliação após 24 horas

da liberação das fêmeas. Diferenças significativas analisadas pelo teste

qui-quadrado ao nível de 5% de probabilidade............................................... 32

Figura 4. Frequência média (%) de fêmeas de Tetranychus urticae na

escolha pelo hospedeiro tratado e não tratado com extrato hexânico de

Annona vepretorum em diferentes concentrações. Avaliação após 24 horas

da liberação das fêmeas. Diferenças significativas analisadas pelo teste

qui-quadrado ao nível de 5% de probabilidade............................................... 32

Capítulo 2

Figura 1. Efeito de concentrações do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum e duas épocas de coleta do material vegetal sobre a mortalidade

de Tetranychus urticae, após 24h (A), 48h (B) e 72h (C) de exposição.

Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5%.

****: modelo de regressão significativo (p≤0,0001)........................................... 50

Figura 2. Efeito de concentrações do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum e três tempos (horas) de avaliação sobre a mortalidade de

Tetranychus urticae. NS: modelo de regressão não significativo, **: modelo

de regressão significativo (p≤0,01). ****: modelo de regressão significativo

(p≤0,0001)......................................................................................................... 53

Lista de tabelas

Capítulo 1 Pág.

Tabela 1. Toxicidade por contato direto e contato residual dos extratos,

metanólico e hexânico, de folhas de Annona vepretorum sobre fêmeas

adultas de Tetranychus urticae após 72 horas de exposição............................ 26

Tabela 2. Efeitos subletais (Média ± EP) da CL50 (10,96 mg/mL) do extrato

métanólico de folhas de Annona vepretorum sobre fêmeas adultas de

Tetranychus urticae........................................................................................... 31

Capítulo 2

Tabela 1. Composição química do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum coletas em junho de 2015 (época 1).............................................. 46

Tabela 2. Composição química do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum coletas em fevereiro de 2016 (época 2)......................................... 47

SUMÁRIO

Pág.

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 1

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.................................................................... 3

3 REFERÊNCIAS............................................................................................. 10

4 BIOATIVIDADE DE EXTRATOS ORGÂNICOS DE Annona vepretorum

(ANNONACEAE) SOBRE Tetranychus urticae (ACARI:

TETRANYCHIDAE).......................................................................................... 17

RESUMO......................................................................................................... 17

ABSTRACT...................................................................................................... 18

INTRODUÇÃO................................................................................................. 19

MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 21

RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 25

REFERÊNCIAS................................................................................................ 33

5 COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ACARICIDA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE Annona vepretorum (ANNONACEAE) SOBRE

Tetranychus urticae (ACARI: TETRANYCHIDAE............................................ 38

RESUMO......................................................................................................... 38

ABSTRACT..................................................................................................... 39

INTRODUÇÃO................................................................................................ 40

MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 42

RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 45

REFERÊNCIAS............................................................................................... 55

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS......................................................................... 61

1

1. INTRODUÇÃO

No Brasil, dentre as seis espécies da família Tetranychidae que causam

danos às plantas cultivadas, Tetranychus urticae Koch, 1836 (Acari:

Tetranychidae) é a que possui o maior número de hospedeiros. Essa espécie é

considerada como uma das mais importantes de ácaros-praga em todo o

mundo, atacando frutíferas, hortaliças e plantas ornamentais (VAN LEEUWEN

et al., 2007; MORAES; FLECHTMANN, 2008).

Apesar do controle químico ser o principal método de controle de T.

urticae, a utilização de inimigos naturais tem sido uma prática cada vez mais

frequente. Entretanto, os agentes de biocontrole têm apresentado eficácia

limitada frente a elevados níveis populacionais da praga, além de se mostrarem

suscetíveis à maioria dos pesticidas sintéticos (MIRESMAILLI; ISMAN, 2006).

Os problemas frequentemente relacionados à utilização indiscriminada do

controle químico referem-se à elevada toxicidade dos produtos ao meio

ambiente, bem como aos riscos que representam para a saúde humana. Outro

problema relevante, é que o ácaro T. urticae tem rápida capacidade de

desenvolver populações resistentes a pesticidas, estando entre os grupos de

artrópodes com maior incidência de problemas relacionados à resistência (VAN

LEEUWEN et al., 2010).

O aumento na frequência de indivíduos resistentes a pesticidas, bem

como a compreensão dos efeitos nocivos de sua utilização, tem evidenciado

uma tendência de redução do uso desses produtos químicos (KIM et al., 2004).

Por outro lado, pesquisas envolvendo produtos à base de plantas têm-se

intensificado na busca por alternativas que possam substituir o uso abusivo de

inseticidas/acaricidas sintéticos. Nos últimos 30 anos houve um crescente

aumento no interesse em estudos por pesticidas botânicos (ISMAN;

GRIENEISEN, 2014). É relatado que os biopesticidas estão crescendo 10-15%

ao ano, em comparação com agrotóxicos que crescem por ano a uma taxa de

5-6% (MARONE, 2013).

Estudos envolvendo plantas com atividade biológica contra artrópodes

demonstram que essa característica está relacionada à presença de

metabólitos secundários, alguns dos quais têm sido amplamente investigados

(KIM et al., 2003; ALVAREZ et al., 2007; KRINSKI; MASSAROLI; MACHADO,

2014). Dentre as substâncias botânicas com reconhecida atividade inseticida

2

destacam-se piretrinas, rotenona, nicotina, cevadina, veratridina, rianodina,

quassinoides e azadiractina (ISMAN, 2000).

Nos artrópodes, os metabólitos secundários de plantas podem agir

inibindo a alimentação, interferindo no crescimento, desenvolvimento,

reprodução e comportamento (MENEZES, 2005).

Diversas famílias de plantas, já foram avaliadas quanto ao seu poder

como pesticida. Dentre essas, a família Annonaceae se destaca pelos potentes

metabólitos secundários denominados de acetogeninas, os quais apresentam

bioatividade sobre diversos organismos. Essa classe de substâncias exibe uma

série de propriedades biológicas, tais como atividade citotóxica, antitumoral,

antiparasitária, antimicrobiana, pesticida e imunossupressora (BERMEJO et al.,

2005; SANTOS; PIMENTA; BOAVENTURA, 2007). Produtos derivados de

várias espécies dessa família, como extratos e óleos essenciais, já foram

testados principalmente contra lepidópteros, coleópteros e hemípteros

(KRINSKI; MASSAROLI; MACHADO, 2014).

A família Annonaceae é uma das maiores entre as Angiospermas,

compreendendo cerca de 2.400 espécies descritas no mundo (CHATROU et

al., 2012). Entretanto, a grande maioria dessas ainda não foi estudada,

inclusive como potencial inseticida/acaricida, como é o caso da espécie

Annona vepretorum Mart. Na literatura, existem poucos trabalhos envolvendo

essa espécie, sendo que não há estudo investigando suas propriedades contra

artrópodes.

Diante dos problemas enfrentados no controle do ácaro T. urticae, é

importante investigar novas táticas de manejo para essa praga. O uso de

produtos naturais derivados de plantas, que sejam eficazes e garantam

sustentabilidade à produção agrícola, despontam como uma alternativa

promissora, sendo os pesticidas oriundos de anonáceas um dos mais

interessantes. O uso integrado de acaricidas botânicos com outras medidas de

controle poderia ser mais uma opção economicamente viável para o controle

dessa praga. Sendo assim, esse trabalho tem como objetivo avaliar a atividade

biológica de extratos orgânicos e óleo essencial de A. vepretorum sobre T.

uticae.

3

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Dentre os inúmeros artrópodes que se alimentam de plantas, destacam-

se ácaros fitófagos, da família Tetranychidae, dentro da qual já foram

catalogados 1.189 espécies filiados a 71 gêneros. Dessas, 54 espécies têm

sido relatadas como pragas de diferentes culturas em todo o mundo

(YANINEK; MORAES, 1991; BOLLAND et al., 1998). No Brasil, apenas seis

espécies apresentam importância econômica e apenas uma, Tetranychus

urticae Koch, 1836 (Acari: Tetranychidae), possui um grande número de

hospedeiros e causa danos severos a muitos deles (MORAES; FLECHTMANN,

2008). Essa espécie de ácaro ataca aproximadamente 1.100 espécies de

plantas, incluídas em mais de 140 famílias, destacando-se culturas de valor

econômico como: tomate, pepino, melão, morango, milho, soja, maçã, uva e

citros (GRBIC et al., 2011; GERSON; WEINTRAUB, 2012).

Tetranychus urticae, conhecido popularmente como ácaro-rajado devido

a presença de duas manchas escuras em cada lado do dorso, é considerada

uma espécie polífaga que apresenta distribuição cosmopolita. Seus danos

estão relacionados, principalmente ao seu habito alimentar, pois ao inserir os

estiletes quelicerais no tecido vegetal, danificam as células epidérmicas e

parenquimatosas das folhas, rompendo-as e removendo sua clorofila,

provocando injúrias como clorose, necrose e, levando, em ataques mais

intensos, à redução de produtividade e risco a sobrevivência da planta

(MORAES; FLECHTMANN, 2008).

No Brasil, essa praga já foi registrada em diversos estados.

Especificamente em Pernambuco, sua primeira ocorrência foi registrada em

1985, após o início do cultivo irrigado no município de Petrolina (MORAES,

2001). Nessa região, a incidência do ácaro rajado tem promovido grandes

prejuízos com inúmeras perdas agrícolas, variando de 30-100% da produção

de culturas, como tomateiro, feijoeiro e mamoeiro (ARAÚJO, 2011).

Um dos desafios enfrentados no controle do T. urticae está relacionado

ao seu curto ciclo de vida, tipo de reprodução e grande potencial biótico

(STUMPF; NAUEN, 2001). Nas condições de 25±2 °C e 65±5 % UR., o

desenvolvimento da fêmea de ovo a adulto, em variedade de feijão Kartica,

dura em média 9,61±0,06 dias e do macho 9,30±0,13. Nessas mesmas

condições e variedade, as fêmeas apresentam um período de oviposição em

4

média de 18,00±0,52 dias, podendo chegar a ovipositar 108,46±1,60 ovos

durante o período reprodutivo. A longevidade das fêmeas é de 21,63±0,54

(UDDIN et al., 2015). É possível que T. urticae complete uma geração entre 1 a

3 semanas, dependendo da planta hospedeira e condições climáticas

(GERSON; WEINTRAUB, 2012).

Durante seu desenvolvimento, os ácaros passam pelos estágios de ovo,

larva, protoninfa, deutoninfa e adulto. A reprodução ocorre por partenogênese

facultativa, sendo haplo-diplóides, onde os machos são produzidos por

partenogênese arrenótoca e as fêmeas por meio de reprodução sexuada

(MORAES; FLECHTMANN, 2008). Assim, uma colônia pode ser originada de

uma única fêmea.

Devido a suas características e grande importância para agricultura, o

manejo integrado do ácaro rajado é fundamental. Seu controle tem sido

realizado sobretudo por meio do uso de acaricidas sintéticos (SATO et al.,

2000; VAN LEEUWEN et al., 2010) e de inimigos naturais (MORAES, 2002;

SATO et al., 2002). O controle biológico dessa praga, no Brasil, é realizado por

ácaros predadores da família Phytoseiidae, como Neoseiulus californicus

(McGregor) e Phytoseiulus macropilis (Banks). Esse controle tem sido utilizado

em culturas como morango, crisântemo, gérbera, maçã e pêssego (COLLIER

et al., 2001; SATO et al., 2007). Porém, em alguns casos, o controle com

acaricidas químicos sintéticos é a única estratégia utilizada pelos produtores

(PEIXOTO et al., 2008) e, embora eficiente, o uso indiscriminado desses

pesticidas pode apresentar uma série de problemas, como contaminação

ambiental, presença de altos níveis de resíduos nos alimentos, desequilíbrios

biológicos, além de selecionar populações resistentes, que, por sua vez, torna

o método ineficiente em várias situações (VAN DE VRIE; MURTRY;

HUFFAKER, 1972).

A resistência de artrópodes a inseticidas tem sido um dos maiores

problemas da produção agrícola (WHALON; MOTA-SANCHEZ;

HOLLINGWORTH, 2008). Na literatura, T. urticae se destaca como o artrópode

com maior número de casos de resistência a uma grande quantidade de

ingredientes ativos (ARAÚJO, 2011). Atualmente são registrados 479 casos de

resistência a 94 ingredientes ativos diferentes (APRD, 2016).

Mediante a necessidade de novas estratégias de manejo do

ácaro-rajado, torna-se indispensável a investigação de novos métodos de

5

controle que sejam eficazes e respeitem os preceitos de sustentabilidade. Nos

últimos anos, a pesquisa com plantas inseticidas e suas propriedades

acaricidas tem se intensificado com o objetivo de se descobrir compostos que

possam substituir acaricidas químicos no controle de ácaros-praga. Alternativas

aos produtos químicos convencionais são necessárias, buscando um controle

que cause menos dano ao ambiente e seja menos tóxico ao homem. Assim, os

produtos de origem vegetal podem ser uma alternativa viável por apresentarem

diversas vantagens quando comparadas aos inseticidas/acaricidas sintéticos.

Esses produtos exibem reduzida persistência e acumulação no meio ambiente,

além de serem, mais seletivos, biodegradáveis e não apresentarem os

conhecidos efeitos colaterais típicos dos inseticidas convencionais

(GIONETTO; CHÁVEZ, 2000).

O uso de extratos vegetais para o controle de pragas agrícolas é uma

tática relativamente antiga, usada há pelo menos dois milênios, sendo

considerada importante para o manejo de pragas na China Antiga (LONG;

HOCK; HUNG, 2006), Egito, Grécia e Índia (ISMAN, 2006). Nos Estados

Unidos e em alguns países da Europa, inseticidas botânicos foram

predominantemente utilizados antes da descoberta dos inseticidas organos-

sintéticos no final dos anos 1930 a início 1940 (ISMAN, 1997). Devido aos

problemas relatados com inseticidas sintéticos, nos últimos 30 anos tem-se

verificado um aumento crescente de pesquisas com extratos de plantas

(ISMAN; GRIENEISEN, 2014), levando ao que pode ser considerado uma

segunda era dos inseticidas botânicos.

As pesquisas com plantas inseticidas são realizadas normalmente

com o objetivo de descobrir novas moléculas que permitam a formulação de

produtos sintéticos ou a obtenção de inseticidas botânicos naturais para uso

direto no controle de pragas (VENDRAMIM,1997). Seu uso vem sendo

investigado na forma de extratos, pós, substâncias puras, óleos emulsionáveis

e óleos essenciais e podem atuar nos insetos por ingestão, contato e

fumigação (ISMAN, 2006; RAJENDRAN; SRIRANJINI, 2008). São geralmente

biodegradáveis, de baixa toxicidade para vertebrados e podem apresentar

seletividade para inimigos naturais (COSME; CARVALHO; MOURA, 2007). Nos

insetos, os efeitos desencadeados incluem mortalidade, redução na

fecundidade e fertilidade, deterrência e repelência (ROEL, 2001; MARTINEZ,

2002).

6

Os produtos à base de plantas apresentam uma diversidade de

compostos ativos, que agem sinergicamente, e possuem efeito inseticida

comprovado, além de dificilmente desenvolverem populações de insetos

resistentes. Assim, podem ser empregados em sistemas de manejo integrado

de pragas, como alternativas direcionadas para controle das populações de

insetos e ácaros (NAVARRO-SILVA; MARQUES; DUQUE, 2009). Esses

inseticidas botânicos são produtos derivados de algumas plantas, que, ao

longo de sua evolução, desenvolveram sua própria defesa química contra os

insetos herbívoros, sintetizando metabólitos secundários com propriedades

inseticidas, que apresentam, principalmente, atividade tóxica ou repelente

contra diversos organismos (WIESBROOK, 2004). A aplicação de produtos

derivados de plantas contra insetos têm aumentado nos países

industrializados, e também no Brasil, principalmente pelo fato do país possuir

uma flora rica e diversificada (KRINSKI; MASSAROLI; MACHADO, 2014). O

Brasil é considerado o país com a maior diversidade genética vegetal do

mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas, de um total

estimado entre 350.000 a 550.000 (SIMÕES et al., 2002).

Considerando a valiosa flora brasileira, juntamente com os esforços

desprendidos por pesquisadores, um grande número de inseticidas botânicos

poderia ser desenvolvido (ISMAN; GRIENEISEN, 2014). No entanto, esses

atributos não se refletem em número de registros inseticidas botânicos. Isso,

em grande parte, porque o Brasil tem um dos regimes de regulação de

pesticidas mais complexos em todo o mundo, envolvendo avaliação de três

ministérios distintos (Agricultura, saúde e meio ambiente). Um exemplo claro é

observado com inseticidas botânicos baseados em Annona squamosa.

Enquanto na Índia estes inseticidas já têm sido aprovados e comercializados,

no Brasil, maior centro de biodiversidade do gênero Annona, ainda falta um

adequado desenvolvimento de produtos que possam ser disponibilizados

comercialmente, mesmo havendo informações sobre um grande número de

plantas com atividade inseticida, fungicida e nematicida (ISMAN, 2015;

VASANTHARAJ, 2008).

Na busca por moléculas bioativas de plantas, muitas famílias vêm sendo

estudadas, como, por exemplo, Meliaceae, Rutaceae, Cannellaceae, Labiatae

e Annonaceae. Dentre os grupos de plantas conhecidos por produzirem

metabólitos secundários tóxicos a herbívoros, a família Annonaceae Juss. é

7

uma das que apresentam um maior número de espécies fonte de princípios

ativos com propriedades inseticidas com diferentes modos de ação em relação

a diferentes espécies de insetos (KRINSKI; MASSAROLI; MACHADO, 2014).

As anonáceas compreendem uma família botânica com cerca de 108

gêneros e 2.400 espécies descritas (CHATROU et al., 2012), distribuídas pelo

mundo. Entre estas espécies, aproximadamente 900 estão presentes nas

Américas (JUNIKKA; KOEK-NOORMAN, 2007). No Brasil, foram registrados 29

gêneros, abrangendo aproximadamente 392 espécies (MASS et al., 2016).

Seus representantes são plantas lenhosas, de porte arbóreo ou arbustivo.

Algumas espécies de plantas dessa família produzem frutos comestíveis,

outras têm ação medicinal, efeito inseticida e algumas são utilizadas na

perfumaria (CRUZ-CHACÓN; ESQUINCA, 2015). Entre as anonáceas de

interesse comercial que são cultivadas no Brasil, encontram-se as espécies do

gênero Annona L., composto por aproximadamente 90 espécies, as quais são

conhecidas popularmente como pinha, ata, cherimóia, araticum, fruta-do-

conde, graviola, atemóia e condessa (OLIVEIRA JUNIOR et al., 2014).

Algumas plantas do gênero Annona possuem potencial farmacológico no

que diz respeito às atividades anti-inflamatória, antinociceptiva (SIEBRA et al.,

2009), antioxidante (LIMA; PIMENTA; BOAVENTURA, 2010), antitumoral

(LIMA et al., 2012), antimicrobiana (COSTA et al., 2013), ansiolítica, sedativa e

antidepressiva (DINIZ et al., 2013). Além disso, muitos estudos relacionados a

esse gênero têm sido realizados para avaliar a atividade fitoinseticida no

controle de pragas agrícolas.

Insetos de diferentes ordens têm sido submetidos a testes, principalmente

em condições de laboratório, para demonstrar o potencial das espécies de

Annona no controle de pragas. Dentre os lepidópteros, de grande importância

econômica, já controlados, estão Anticarsia gemmatalis (Noctuidae) (SAITO et

al., 2004; SCHLÜTER, 2006), Anagasta kuehniella (Pyralidae) e Corcyra

cephalonica (Pyralidae) (COELHO; MARANGONI; MACEDO, 2007), Tuta

absoluta (Gelechiidae) (SILVA; PEREIRA; BENTO, 2007), Plutella xylostella

(Plutellidae) (SCHLÜTER, 2006; TRINDADE et al., 2011) e Leucinodes

orbonalis (Pyralidae) (OWOSU, 2012). Como exemplo de insetos da ordem

Coleóptera também controlados nas mesmas condições, destacam-se,

Leptinotarsa decemlineata (Chrysomelidae) (GUADAÑO et al., 2000),

Epilachna vigintioctopunctata (Coccinellidae) (KARUNARATNE; ARUKWATTA,

8

2009), e Oryctes rhinoceros (Dynastidae) (SREELETHA; GEETHA, 2012). E no

grupo dos hemípteros encontram-se Dichelops melacanthus (Pentatomidae)

(SOUZA; CORDEIRO; PEREIRA, 2007), Oncopeltus fasciatus (Lygaeidae)

(ÁLVAREZ et al., 2008), Euschistus heros (Pentatomidae) (MAGALHÃES et al.,

2011; MIKAMI, 2011), Rhodnius neglectus (Reduviidae) (COSSOLIN et al.,

2011), Tibraca limbativentris (Pentatomidae) (KRINSKI; MASSAROLI, 2013) e

Bemisia tabaci (Aleyrodidae) (CRUZ-ESTRADA et al., 2013).

As anonáceas apresentam atividade inseticida devido à presença de

acetogeninas, substâncias naturais bioativas encontradas exclusivamente

nessa família. O gênero Annona é a principal fonte desta classe de compostos,

uma vez que, das 417 acetogeninas conhecidas até 2004, 289 foram isoladas a

partir de 20 espécies deste gênero (BERMEJO et al., 2005). O isolamento

dessa classe de substâncias incentivou, a partir da década de 80, maiores

estudos para investigar uma gama de atividades biológicas. Essas substâncias

quando utilizadas contra insetos, atuam nas mitocôndrias, inibindo a NADH

(Nicotinamida Adenina Dinucleotídio), o que causa a morte destes organismos

(LÜMMEN, 1998). Dentre as diversas substâncias presentes nas anonáceas,

como terpenos, alcaloides e flavonoides, as acetogeninas são relatadas como

as mais importantes por apresentarem bioatividade contra diversas espécies de

insetos (ALALI; LIU; MCLAUGHLIN, 1999). Estudos sobre o mecanismo de

ação têm demonstrado que acetogeninas são os mais potentes inibidores da

cadeia respiratória mitocondrial (BERMEJO et al., 2005).

Na literatura, são relatadas cerca de 42 espécies de Annonaceae com

potencial inseticida, distribuídas em 14 gêneros, com destaque para as

espécies Annona muricata L. (graviola) e Annona squamosa L. (fruta-do-conde,

pinha) que atualmente são as espécies, dessa família, mais utilizadas para

estudos de potencial inseticida (KRINSKI; MASSAROLI; MACHADO, 2014).

Mesmo diante da diversidade de espécies de anonáceas conhecidas em todo

mundo, percebe-se que apenas cerca de 2% dessas espécies possuem

informações a respeito de seu potencial inseticida. Dessa forma, ainda há

muito a pesquisar sobre esse grupo de plantas em relação ao conhecimento de

suas propriedades inseticidas, bem como ampliar os estudos com outras

espécies de artrópodes-praga ainda não estudados, uma vez que a maioria das

pesquisas avalia, sobretudo, a bioatividade nas ordens de insetos Lepidoptera,

Coleoptera e Hemiptera (KRINSKI; MASSAROLI; MACHADO, 2014).

9

Dentre as inúmeras espécies de anonáceas ainda não estudas, Annona

vepretorum Mart. merece destaque, uma vez que, não existe relatos na

literatura científica sobre a atividade inseticida e acaricida de extratos e óleo

essencial extraídos dessa espécie.

Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) é uma espécie

predominantemente tropical, endêmica do Brasil com distribuição na Caatinga

(MAAS; LOBÃO; RAINER, 2016). É um arbusto ou árvore de 2,5-10 m de altura

conhecida popularmente como “bruteira" (DUTRA et al., 2014), “araticum”

(COSTA et al., 2011) e “pinha da caatinga” (DINIZ, 2013). Na literatura, são

poucas as informações a respeito dessa espécie. Os trabalhos existentes estão

relacionados principalmente com sua estrutura química e atividade

farmacológica, como atividade antioxidante, citotóxica e antimicrobiana

(ALMEIDA et al., 2014), estudo fitoquímico (ARAÚJO, 2013), composição

química e bioatividade (COSTA et al., 2012), atividade antinociceptiva e anti-

inflamatória (SILVA, 2013). Porém, não há relatos de estudos com uso dessa

espécie como inseticida botânico.

Diante da potencialidade das anonáceas em apresentar bioatividade no

controle de pragas e a necessidade de desenvolver alternativas aos acaricidas

convencionais, a espécie A. vepretorum se apresenta como uma alternativa

promissora a ser estudada com o propósito de aumentar a disponibilidade de

produtos de origem vegetal e moléculas de plantas capazes de controlar

pragas agrícolas, principalmente o ácaro rajado T. urticae.

10

3. REFERÊNCIAS

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4. BIOATIVIDADE DE EXTRATOS ORGÂNICOS DE Annona vepretorum

(ANNONACEAE) SOBRE Tetranychus urticae (ACARI: TETRANYCHIDAE)1

RESUMO – O uso indiscriminado de pesticidas sintéticos no controle do ácaro

Tetranychus urticae Koch tem acarretado uma série de problemas. Nos últimos

anos, extratos vegetais têm sido bastante explorados como uma alternativa

promissora e menos agressiva. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial

acaricida, através de efeitos letais e subletais, do extrato metanólico e hexânico

de folhas de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) sobre T. urticae. A

toxicidade do extrato metanólico foi avaliada através do contato direto e contato

residual sobre as fêmeas, nas concentrações de 0,9; 1,9; 3,7; 7,5; 15; 30 e 60

mg/mL, as quais foram aplicadas através de torre de Potter (contato direto) e

imersão dos discos (contato residual). Para avaliar a toxicidade do extrato

hexânico, as concentrações (6,2; 12,5; 25; 50 e 100 mg/mL) foram aplicadas

através da imersão de discos de folha de feijão-de-porco (Canavalia ensiformes

L.), por 5 segundos. Para avaliar os efeitos subletais, foi aplicada sobre as

fêmeas a CL50 do extrato metanólico obtida no teste de toxicidade por contato

direto. O teste de dupla escolha avaliou a preferência do ácaro para

alimentação e oviposição entre o controle e as concentrações (1,9; 3,7; 7,5; 15

e 30 mg/mL) do extrato metanólico e hexânico. A estimativa da CL50 do extrato

metanólico foi de 10,96 mg/mL para o efeito de contato direto e 22,07 mg/mL

para o efeito de contato residual. A CL50 estimada para o extrato hexânico foi

de 50,61 mg/mL. A CL50 do extrato metanólico interferiu na fecundidade e

longevidade das fêmeas, diferindo significativamente do controle. No teste de

dupla escolha, 82 a 99% de T. urticae preferiu o controle para alimentação e 84

a 100% para oviposição. Os resultados indicam que A. vepretorum tem poder

acaricida e revela ser uma fonte botânica de potencial no controle de T. urticae.

PALAVRAS-CHAVE: Ácaro rajado. Biopesticidas. Controle alternativo.

1FERNANDES, M.H.A.; MENEZES, K.O.; SOUZA, A.M.; ALMEIDA, J.R.G.; OLIVEIRA, J.E.M.; GONÇALVES-GERVÁSIO, R.C.R. Bioatividade de extratos orgânicos de Annona vepretorum (Annonaceae) sobre Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae). A ser submetido.

18

BIOACTIVITY OF ORGANIC EXTRACTS OF Annona vepretorum

(ANNONACEAE) ON Tetranychus urticae (ACARI: TETRANYCHIDAE)

ABSTRACT – The indiscriminate use of synthetic pesticides to control the

Tetranychus urticae Koch mite has caused countless problems. In the last

years, plant extracts have been widely explored as a promising alternative and

less aggressive. The purpose of this study was to evaluate the acaricide

potential through lethal and sublethal effects of the methanol and hexane

extract of Annona vepretorum Mart leaves (Annonaceae) on T. urticae. The

toxicity of methanol extract was evaluated through direct contact and residual

contact on females at concentrations of 0.9; 1.9; 3.7; 7.5; 15; 30 and 60 mg/ml,

which were applied through Potter tower (direct contact) and immersion of the

disks (residual contact). To evaluate the toxicity of hexane extract, the

concentrations (6.2, 12.5, 25, 50 and 100 mg/mL) were applied through

immersion of leaf discs of pork beans (Canavalia ensiformes L) for 5 seconds.

To evaluate the sublethal effects, it was applied in the females the LC50 of the

methanol extract obtained on toxicity test by direct contact. The dual choice test

has assessed the mite’s preference for food and oviposition between control

and concentrations (1.9, 3.7, 7.5, 15 and 30 mg/mL) of methanol and hexane

extract. The estimate of the LC50 of the methanol extract was 10.96 mg/mL for

direct contact effect and 22.07 mg/mL to residual contact effect. The estimated

LC50 for the hexane extract was 50.61 mg/mL. The CL50 of the methanol extract

interferes in the fecundity and longevity of females, differing of control

significantly. In the dual choice test, 82 to 99% of T. urticae has preferred the

control for food and 84 to 100% for oviposition. The results indicate that A.

vepretorum has acaricide power and reveals to be a potential botanical source

in the control of T. urticae.

KEY WORDS: Two-spotted spider mite. Biopesticides. Alternative control.

19

INTRODUÇÃO

O ácaro Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) é considerado

uma das espécies mais polífaga, dentre os ácaros fitófagos, e apontado como

uma praga-chave para muitas culturas (ROH et at., 2011), anuais e perenes,

tais como tomate, pepino, morango, milho, soja, maçã, uva e citros (GRBIC et

al., 2011). Em altas infestações esse ácaro, pode causar clorose, necrose nas

folhas, perda da capacidade fotossintética e, consequentemente, redução da

produtividade (MORAES; FLECHTMANN, 2008).

O controle de T. urticae é realizado, principalmente por meio da

aplicação de acaricidas sintéticos (VAN LEEUWEN et al., 2010). Porém, o uso

excessivo de produtos químicos tem sido bastante questionado nos últimos

anos, principalmente por ser uma prática que ocasiona sérios problemas, como

contaminação ambiental e toxicidade aos mamíferos, além de promover

elevada mortalidade de inimigos naturais (SILVA et al., 2006) e o rápido

desenvolvimento de populações resistentes (NICASTRO; SATO; SILVA, 2010).

O ácaro T.urticae se destaca como um dos artrópodes mais resistentes a

acaricidas/inseticidas sintéticos (WHALON; MOTA-SANCHEZ;

HOLLINGWORTH, 2008), com registro de resistência a 94 ingredientes ativos

diferentes (APRD, 2016).

Uma alternativa promissora ao emprego de acaricidas sintéticos é a

utilização de pesticidas botânicos. Estes produtos de origem vegetal estão

sendo bastante estudados para fins de controle de pragas agrícolas,

principalmente por apresentarem compostos biodegradáveis, serem menos

agressivos ao meio ambiente, pouco tóxicos às espécies não alvo e, ainda,

evitarem ou retardarem o aparecimento de indivíduos resistentes (KRINSKI;

MASSAROLI; MACHADO, 2014).

Entre as plantas com atividade inseticida/acaricida já estudadas, a

família Annonaceae tem se destacado e atraído a atenção de muitos

pesquisadores desde o ano de 1980. Esse fato está relacionado à descoberta

das acetogeninas, uma classe de produtos naturais exclusiva dessa família,

que promovem uma série de atividades biológicas, destacando-se a atividade

inseticida (OCAMPO; OCAMPO, 2006). As acetogeninas bloqueiam a cadeia

respiratória em NADH-Ubiquinona redutase (complexo I) e causa um

20

decréscimo nos níveis de ATP, afetando diretamente o transporte de elétrons

nas mitocôndrias (ALALI; LIU; MCLAUGHLIN, 1999).

Uma das formas de se conhecer e avaliar as propriedades inseticidas

das plantas é por meio do uso de extratos, que podem variar desde o extrato

aquoso (BOBADILLA et al., 2005) até extratos obtidos com solventes de

diferentes polaridades (BOBADILLA et al., 2002). Os solventes usados para a

extração das acetogeninas podem ser água (PÉREZ-PACHECO et al., 2004),

etanol (BOBADILLA et al., 2002), acetona (KHALEQUZZAMAN; SULTANA,

2006), clorofórmio (PARVIN et al., 2003), éter de petróleo (ALVAREZ et al.,

2008) e hexano (FONTANA et al., 1998). Dessa forma, pode-se compreender

que as acetogeninas podem variar desde muito polares, tais como as extraídas

pela água e etanol, até não polares, aquelas que são extraídas por hexano

(CASTILLO-SÁNCHEZ et al., 2010).

Nos últimos anos, extratos brutos de sementes, folhas, cascas, galhos e

frutas de Annonaceae têm sido amplamente testados para verificar bioatividade

em vários grupos de artrópodes, tanto de importância agrícola quanto médica

(ISMAN; SEFFRIN, 2014). Seus efeitos nos artrópodes incluem mortalidade,

redução na fecundidade e fertilidade, inibição na oviposição, deterrência e

repelência. (ISMAN, 2006; OLIVEIRA; PEREIRA, 2009; CARNEIRO; PEREIRA;

GALBIATI, 2011) A bioatividade desses extratos, porém, pode variar

significativamente em função da espécie e do solvente utilizado na extração

(SHAALAN et al., 2005).

A família Annonaceae compreende um grande número de gêneros e

espécies, sendo a maioria nativa de regiões tropicais ou subtropicais. No Brasil,

são registrados 29 gêneros, abrangendo aproximadamente 392 espécies

(MAAS; LOBÃO; RAINER, 2016). Muitas dessas, principalmente as do gênero

Annona, já foram amplamente investigadas para controle de pragas (KRINSKI;

MASSAROLI; MACHADO, 2014). Porém, para tal finalidade, não foram

encontrados relatos de estudos do potencial da espécie Annona vepretorum

Mart. Esta é uma espécie endêmica do Brasil, conhecida popularmente como

“araticum” e “pinha da caatinga”, amplamente distribuída na região da Caatinga

e por todo o semiárido brasileiro. É um arbusto que apresenta flores amarelas e

perfumadas, folhas coriáceas, glabras com frutos muricados e verdes (DINIZ,

2013).

21

Como não há estudos disponíveis sobre a bioatividade dessa espécie e

considerando o potencial de plantas da família Annonaceae, enquanto fonte de

inseticidas botânicos, e a necessidade de encontrar alternativas aos acaricidas

convencionais, este trabalho teve como objetivo avaliar a bioatividade dos

extratos orgânicos, hexânico e metanólico, de A. vepretorum sobre o ácaro T.

urticae em condições de laboratório.

MATERIAL E MÉTODOS

O processo para obtenção dos extratos foi realizado no Laboratório de

Bioquímica da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) e os

experimentos foram conduzidos no Laboratório de Entomologia da Embrapa

Semiárido.

Material vegetal. As folhas de A. vepretorum foram coletadas no mês de

junho de 2015 em área de caatinga no campus de Ciências Agrarias da

Universidade Federal do Vale do São Francisco (latitude 09º19’37,50’’’

longitude 040º33’01,40’’ e altitude 385 m). A exsicata da espécie está

depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) na Universidade

Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o número #18350.

Obtenção dos extratos de A. vepretorum. As folhas foram

acondicionadas em saco de papel Kraft e postas para secar em estufa com ar

circulante à temperatura média de 40ºC durante 72 horas. Após a secagem e

completa estabilização (eliminação de água e inativação de enzimas), realizou-

se a moagem do material em moinho de facas para a obtenção do pó de baixa

granulometria. A partir de 1.148 g de folhas frescas foi obtido 448 g de pó seco.

Para o preparo dos extratos, o pó foi macerado em hexano em

percolador de aço inoxidável, durante 72 horas, e posteriormente filtrado

utilizando algodão hidrófilo. Ao resíduo foi adicionado mais hexano, sendo esse

procedimento repetido seis vezes para garantir um bom rendimento da

extração. A fase liquida foi submetida à evaporação do solvente com o auxílio

de um rotavapor a 50°C sob pressão reduzida. Após esse procedimento, o

extrato hexânico foi colocado em frasco de vidro, previamente pesado e

etiquetado, e acondicionado aberto em capela para evaporação máxima do

solvente. Após a obtenção do extrato hexânico, sobre a torta resultante da

extração com hexano, foi realizado a extração com metanol seguindo a mesma

22

metodologia anterior, sendo modificando apenas o solvente. Ao final, foram

obtidas 14,25 g de extrato hexânico e 43,53 g de extrato metanólico, os quais

foram mantidos em refrigerador a, aproximadamente, 2 a 8 oC.

Criação do ácaro T. urticae. Os ácaros utilizados para os ensaios

foram oriundos da criação estabelecida no laboratório de Entomologia da

Embrapa Semiárido. Os ácaros foram criados em plantas de feijão-de-porco,

Canavalia ensiformes L. (Leguminosae), sob temperatura de 25 ± 1oC,

umidade relativa de 70 ± 10% e fotofase de 12 horas. Essas mesmas

condições foram adotadas na condução de todos os experimentos.

Toxicidade do extrato metanólico. Foram realizados pré-testes com

algumas concentrações para determinar valores que causassem

aproximadamente 100% de mortalidade, sendo assim possível determinar uma

curva de concentração. O extrato metanólico foi solubilizado em água destilada

e acetona (10%). As concentrações testadas foram 0,9; 1,9; 3,7; 7,5; 15; 30 e

60 mg/mL. Utilizou-se como controle água destilada e acetona (10%). O

acaricida Diafentiurom (Polo® 500 SC, Syngenta S.A) na concentração de 2

mg/mL foi utilizado como controle positivo.

A toxicidade do extrato metanólico foi avaliada através do contato direto

desse extrato sobre os ácaros e do contato residual. Inicialmente, foram

confeccionadas arenas a partir de placas de Petri (9 cm) contendo uma

esponja de polietileno umedecida com água e sobre esta, um disco de papel de

filtro nas mesmas dimensões. Para os testes de contato direto, discos de folhas

de feijão-de-porco de 3 cm de diâmetro foram colocados sobre as arenas com

as bordas cobertas com pedaços de papel toalha para evitar a fuga dos ácaros.

Em seguida, 10 fêmeas adultas de T. urticae foram transferidas para os discos

de folha com um auxílio de um pincel (n°000). Foi realizada a aplicação de 2

mL por disco de folha de cada concentração do extrato e do controle, através

de torre de Potter a uma pressão de 5 psi/pol². Para avaliar a toxicidade por

contato residual, as aplicações foram realizadas através da imersão de discos

de folha de feijão-de-porco (3 cm), por 5 segundos, em um Becker que

continha o controle (água destilada e acetona) e as concentrações do extrato.

Em seguida, os discos foram acondicionados nas arenas. Após a secagem do

solvente, por volta de uma hora, as bordas dos discos foram cobertas com

pedaços de papel toalha para evitar a fuga dos ácaros e, logo após, foram

transferidas 10 fêmeas adultas para cada disco tratado.

23

Nos dois experimentos foram igualmente realizadas 15 repetições por

concentração, totalizando 150 ácaros por tratamento. As placas de Petri foram

mantidas em câmara climatizada (B.O.D.) a 25 ± 1ºC, U.R. 70 ± 10% e fotofase

de 12 horas. Diariamente, nessas placas era adicionada água para manter a

turgescência do disco de folha. Com auxílio de microscópio estereoscópio, foi

avaliada a mortalidade dos ácaros após 24, 48 e 72 horas da pulverização,

sendo considerados mortos, aqueles que não conseguiam se mover a uma

distância equivalente ao comprimento de seu corpo, quando tocados com o

pincel.

As concentrações letais (CLs) foram estimadas pela análise de Probit

(Finney 1971) através do programa Polo-PC (LeOra Software 1989). Os

valores da CL50 e CL90 foram estabelecidos com a mortalidade obtida com 72

horas de avaliação. Os dados da mortalidade acumulada obtidos ao longo das

avaliações foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas

pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade através do programa estatístico

SAS (SAS Institute 2002).

Toxicidade do extrato hexânico. Foram realizados pré-teste para

determinar uma curva de concentrações. Para condução desse bioensaio,

foram confeccionadas arenas semelhantes às descritas no teste anterior. As

concentrações do extrato hexânico utilizadas foram de 6,2; 12,5; 25; 50 e 100

mg/mL, as quais foram solubilizadas apenas em acetona, pois devido as

características físico-químicas desse extrato, apenas a acetona apresentou

melhor capacidade de solubilização. A aplicação foi realizada através da

imersão de discos de folha de feijão-de-porco de 3 cm de diâmetro, por 5

segundos, em um Becker contendo o controle (acetona) e as concentrações do

extrato. Após a imersão, os discos foram colocados sobre o papel de filtro nas

arenas, onde permaneceram secando a temperatura ambiente, por

aproximadamente uma hora. As bordas do disco foram cobertas com pedaços

de papel toalha para evitar a fuga dos ácaros. Nas placas foram adicionadas

água para manter a turgescência do disco foliar. Para cada unidade

experimental, constituída por uma placa de Petri, foram transferidas 10 fêmeas

adultas de T. urticae. Foram realizadas 15 repetições por tratamento,

totalizando 150 ácaros. As avaliações foram realizadas após 24, 48 e 72 horas

da imersão dos discos, contando-se o número de fêmeas mortas.

24

As concentrações letais (CLs) foram estimadas pela análise de Probit

(Finney 1971) através do programa Polo-PC (LeOra Software 1989). Os

valores da CL50 e CL90 foram estabelecidos com a mortalidade obtida com 72

horas de avaliação.

Efeito subletal do extrato metanólico sobre parâmetros

reprodutivos. Para avaliar os efeitos subletais do extrato sobre as fêmeas de

T. urticae, foi utilizada a CL50 (10,96 mg/mL) obtida anteriormente no teste de

verificação do efeito de contato do extrato metanólico. Em cada arena,

confeccionada a partir de placa de Petri (9 cm), foram colocados três discos

foliares (2 cm) e uma fêmea sobre cada um deles para ovipositar por um

período de 24 horas. Em seguida, as fêmeas e o excesso de ovos foram

retirados, deixando apenas três ovos por disco. Após a eclosão dos ovos,

apenas um indivíduo foi escolhido para ser acompanhado até a fase adulta.

Esse procedimento foi necessário para que todas as fêmeas utilizadas nesse

teste tivessem a mesma idade. Foram realizadas aplicações via torre de Potter

de 2 mL por placa do extrato na concentração correspondente à CL50 e do

tratamento controle, composto por água destilada e acetona (10%). As

aplicações ocorreram sobre fêmeas com aproximadamente dois dias de idade

adulta. Após a aplicação, um macho proveniente da criação de manutenção foi

liberado em cada disco, tomando-se o cuidado de que o mesmo fosse

substituído em caso de morte. Para cada tratamento foram utilizadas 41

fêmeas, sendo cada uma considerada uma repetição. As avaliações de

fecundidade, viabilidade de ovo e longevidade das fêmeas foram realizadas

diariamente. Para acompanhar a viabilidade dos ovos, arenas foram

preparadas com discos foliares identificados de acordo com o número de cada

fêmea. Os ovos colocados pelas fêmeas eram contados e, posteriormente,

transferidos cuidadosamente com auxílio de um pincel fino para suas

respectivas arenas. Essas arenas eram avaliadas diariamente e, caso

houvesse ninfas, essas eram contadas e descartadas. A data da mortalidade

das fêmeas foi registrada para determinar a longevidade das mesmas.

Os dados foram analisados através do teste t de Student, a 5% de

probabilidade, comparando-se as médias observadas nos dois tratamentos.

Utilizou-se o programa estatístico SAS (SAS Institute 2002).

Teste de dupla escolha. Os bioensaios foram realizados com os dois

extratos orgânicos, hexânico e metanólico, nas mesmas concentrações (1,9;

25

3,7; 7,5; 15 e 30 mg/mL). O extrato hexânico foi solubilizado apenas em

acetona, enquanto o extrato metanólico em água destilada e acetona (10%).

Discos de folha de feijão-de-porco, com 5 cm de diâmetro, foram divididos em

áreas iguais com um espaço neutro de 0,3 cm entre elas. Uma das áreas foi

imersa por 5 segundos na solução controle, contendo apenas acetona nos

testes com extrato hexânico e a outra área foi imersa na solução preparada do

extrato. Nos testes com o extrato metanólico uma das áreas foi imersa em

água destilada e acetona (10%) e a outra área foi imersa na solução preparada

a partir do extrato diluído. Em seguida, os discos foram dispostos

individualmente em papel de filtro sobre uma espuma de polietileno umedecida

com água e mantidos em placas de Petri (9 cm). Os discos tratados

permaneceram durante um período de uma hora ao ar livre para a completa

evaporação do solvente. As bordas dos discos foram cobertas com pedaços de

papel toalha para evitar a fuga dos ácaros. Em seguida, 10 fêmeas adultas do

ácaro foram liberadas no centro de cada disco, na área neutra. Para cada

tratamento foram realizadas 15 repetições, totalizando 150 ácaros por

tratamento. As avaliações foram realizadas após 24 horas, contando-se o

número de ácaros e ovos nas áreas tratadas e não tratadas do disco.

Os resultados foram submetidos à análise de frequência de escolha e

avaliados pelo teste qui-quadrado, mediante o programa estatístico SAS (SAS

Institute 2002).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos indicam que extratos orgânicos de A. vepretorum

são capazes de causar níveis elevados de mortalidade em T. urticae. Essa

bioatividade observada nos extratos pode estar relacionada à presença de

metabólicos sencundários, conhecidos como acetogeninas, presentes em

espécies de plantas da família Annonaceae. Nos artrópodes, as acetogeninas

bloqueiam a cadeia respiratória em NADH-Ubiquinona redutase (complexo I) e

causa um decréscimo nos níveis de ATP, afetando diretamente o transporte de

elétrons nas mitocôndrias (ALALI; LIU; MCLAUGHLIN, 1999).

O extrato metanólico das folhas de A. vepretorum foi considerado nesse

estudo o mais tóxico para T. urticae. A aplicação direta sobre as fêmeas, para

avaliar o efeito de contato, foi mais tóxica (CL50 10,96 mg/mL) do que a

26

aplicação para avaliar o efeito residual do extrato (CL50 22,07 mg/mL). A CL50

estimada para o extrato hexânico foi de 50,61 mg/mL. Dessa forma, quando

comparado às estimativas das CL50 e CL90 dos dois extratos orgânicos,

verifica-se que o extrato metanólico é bem mais tóxico que o extrato hexânico

(Tabela 1).

Tabela 1. Toxicidade por contato direto e contato residual dos extratos,

metanólico e hexânico, de folhas de Annona vepretorum sobre fêmeas adultas

de Tetranychus urticae após 72 horas de exposição.

Extratos N1 GL

2 Inclinação ±

EP3

CL504

(IC 95%)

CL90

(IC 95%)

2 5

Metanólico

(contato)6

1030 5 3,03 ± 0,29 10,96

(7,16-14,19)

29,04

(21,78-51,06)

15,47

Metanólico

(residual)7

1025 5 2,44 ± 0,22 22,07

(18,07-26,39)

73,79

(56,33-112,10)

5,91

Hexanico

(residual)

719 3 4,18 ± 0,52 50,61

(30,13-65,59)

102,54

(76,72-264,15)

7,49

FONTE: FERNANDES, M.H.A. 1Número total de ácaros usados nos bioensaios.

2Graus de liberdade para teste de qui-quadrado.

3Inclinação da reta e erro padrão da média.

4Concentração letal (mg/mL) e intervalo de confiança a 95%.

5Valor de qui-quadrado.

6Efeito de contato direto sobre as fêmeas.

7Efeito de contato residual.

Neste estudo, utilizaram-se dois solventes com polaridades distintas na

extração dos compostos de A. vepretorum, pois se pressupõe que as

acetogeninas presentes nas anonáceas podem variar de muito polar, tal como

aquelas extraídas pela água, álcool etílico e metanol a não polares como as

extraídas pelo hexano (BOBADILLA et al. 2005). Porém, há evidências de que

os extratos obtidos com solventes de baixa e média polaridade são mais

eficientes.

Kamaraj et al. (2011) utilizaram extratos da casca de Annona squamosa

a partir de diferentes solventes (hexano, clorofórmio, acetato de etila, acetona e

metanol) para avaliar a atividade larvicida sobre Anopheles subpictus Grassi e

Culex tritaeniorhynchus Giles (Diptera: Culicidae). Todos os extratos

27

apresentaram efeitos moderados, no entanto, o extrato metanólico se mostrou

mais tóxico para as duas espécies avaliadas, apresentando para A. subpictus

CL50 93,80 mg/L e 104,94 mg/L para C. tritaeniorhynchus. Concentrações

maiores do extrato hexânico de semente Annona muricata foram necessárias

para causar a mortalidade de 50% da população de T. urticae em relação ao

extrato etanólico (MACIEL, 2014). Em outro estudo, realizado por Rodrigues et

al. (2006), mostra que para Aedes Aegypti a CL50 do extrato etanólico da casca

do caule de Annona crassiflora foi de 23,06 µg/mL, enquanto que a CL50 do

extrato hexânico foi de 264,15 µg/mL.

Potenza et al., (2005) trabalhando com extrato hexânico, etanólico e

aquoso de folhas de várias espécies de plantas, dentre elas uma espécie de

anonácea, A. squamosa, afirmou que o tipo de solvente usado na extração

interferiu na eficiência dos produtos naturais para o controle do ácaro

Oligonychus ilicis (McGregor) (Acari: Tetranychidae) devido ao fato dos

solventes utilizados extraírem diferentes grupos de substâncias químicas, de

acordo com a polaridade dos mesmos.

Além do mais, a biotividade dos extratos de plantas ainda pode variar de

acordo com a espécie e a estrutura vegetativa da planta. (SHAALAN et al.

2005). É comum que diferentes partes da planta manifestem diferenças

qualitativas e quantitativas em relação aos seus constituintes químicos

(BERNAYS; CHAPMAN, 1994). As acetogeninas, são encontrados em folhas,

galhos, raízes e principalmente em sementes das anonáceas (BERMEJO et al.,

2005; SILVA; PEREIRA; BENTO, 2007; CASTILLO-SÁNCHEZ et al., 2010;

RIBEIRO et al., 2013). Dessa forma, presume-se que utilizando outras

estruturas de A. vepretorum, como sementes, podem-se obter resultados ainda

mais satisfatórios, com doses letais menores. Esta hipótese pode ser aceita

devido aos resultados obtidos por Maciel et al. (2015), que investigou extratos

de sementes de A. muricata e mostrou que a CL50 para T. urticae foi de 3,29

mg/mL.

Neste trabalho, os ensaios de toxicidade por contato direto e contanto

residual mostraram que houve 100% de mortalidade das fêmeas de T. urticae

após 48 horas da aplicação do acaricida sintético Diafentiurom (2mg/mL),

enquanto que com o extrato metanólico e hexânico de A. vepretorum a

mortalidade dos ácaros aumentou em função do tempo de avaliação e da

concentração desses extratos (Figuras 1 e 2). Percebe-se que o extrato

28

metanólico foi mais tóxico aos ácaros, pois apresentou, na avaliação de 72

horas, 90% de mortalidade por contato residual na concentração de 60 mg/mL

(Figura 2B). Já o extrato hexânico atingiu apenas 68% de mortalidade com uma

concentração maior (100 mg/ml) no mesmo período de avaliação (Figura 1).

Figura 1. Mortalidade de Tetranychus urticae em diferentes tempos de

avaliação (horas) por efeito de contato residual do extrato hexânico de folhas

de Annona vepretorum.

FONTE: FERNANDES, M.H.A.

Com 72 horas, na maior concentração utilizada (60 mg/mL) do extrato

metanólico, a mortalidade por contato direto foi de 98% e por contato residual

foi de 90%. Essa mortalidade avaliada após 72 horas indicou que não houve

uma diferença tão expressiva entre as metodologias de aplicação (contato

direto e contato residual). Entretanto, a toxicidade do extrato por contato direto

agiu de forma mais rápida, pois nas primeiras 24 horas de avaliação

apresentou índice de mortalidade de 93%, enquanto que por contato residual

essa mortalidade foi de apenas 65%, no mesmo período. Esse efeito que

garantiu uma mortalidade mais rápida pode ter ocorrido devido o extrato ter

sido aplicado sobre o acaro e o alimento (disco de folha), podendo-se presumir

que o ambiente estava totalmente saturado, dificultando ao máximo que esta

praga escapasse da ação do extrato. Além disso, nesse caso, a ação do

extrato pode ter ocorrido de forma simultânea, por ingestão e contato,

penetrando no corpo do ácaro através da cutícula.

29

Figura 2. Mortalidade de Tetranychus urticae em diferentes tempos de

avaliação (horas) por efeito de contato direto (A) e contato residual (B) do

extrato metanólico de folhas de Annona vepretorum.

FONTE: FERNANDES, M.H.A.

Outro estudo avaliou a toxicidade por contato direto e contato residual

de extrato metanólico de seis espécies de plantas famílias Asteraceae,

Solanaceae, Verbenaceae e Apiacea em T. urticae. Os resultados mostraram

que houve uma mortalidade muito superior nos tratamentos quando foi avaliada

a toxicidade por contato. Observou-se que o tratamento com o extrato de

Baccharis tola (Asteraceae) na concentração de 2,5% provocou uma

mortalidade de 94% em teste por contato direto, enquanto que por contato

residual a concentração de 10% causou apenas 23% de mortalidade

(MERCADO; CHUNG; MESINA, 2014). Alguns autores argumentam que a

ação por contato é mais rápida do que a ação por ingestão, pois este último

30

para agir sobre o organismo alvo depende do processo de digestão para

incorporação e ação nos sistemas vitais da praga (KATHRINA; ANTONIO,

2004; AGUIAR-MENEZES, 2005; ISMAN 2006).

Uma grande variedade de espécies de plantas, na forma de extrato,

mostrou ser tóxica para T. urticae, como: extratos aquosos de Dieffenbachia

brasiliensis (Araceae), Ruta graveolens (Rutaceae) e Allium cepa (Alliaceae)

(POTENZA et al., 2006); extrato etanólico de Datura stramonium (Solanaceae)

(KUMRAL; ÇOBANOGLU; YALCIN, 2010); extrato etanólico de Croton sellowii

(Euphorbiaceae) (PONTES et al., 2011); extrato etanólico e hexânico de

Syzygium cumini (Myrtaceae) (AFIFY et al., 2011); extrato metanólico de Ammi

visnaga (Apiaceae) (PAVELA, 2015) e extrato etanólico e hexânico de Annona

muricata (Annonaceae) (MACIEL et al., 2015);

Os metabólicos secundários de plantas agem de diversas formas sobre

os artrópodes, além de causar mortalidade, podem provocar repelência,

inibição de oviposição e da alimentação, distúrbios no desenvolvimento,

deformações e infertilidade (ROEL, 2001). Por esses motivos, esse trabalho

avaliou os efeitos subletais da CL50 do extrato metanólico de A. vepretorum e

verificou-se que em dois parâmetros analisados, fecundidade e longevidade,

houve efeito negativo do extrato quando comparado com a testemunha.

O número de ovos por fêmea no tratamento controle foi em média 54,95

e no tratamento com o extrato foi em média 22,85 ovos. A inibição da

oviposição ou a redução do número de ovos são importantes efeitos de

extratos vegetais sobre a reprodução dos artrópodes (COSTA; SILVA; FIUZA,

2004). Entende-se que quando esse indivíduo é incapaz de alimentar-se da

folha tratada, o número de os ovos deve ser reduzido como uma resposta ao

estresse provocado pelo extrato (PONTES et al., 2011). Quando comparada a

viabilidade de ovos nos dois tratamentos, constatou-se que não houve

diferença significativa, pois, o tratamento controle apresentou 87,80% de

viabilidade e no tratamento com o extrato esse índice foi de 88,66%. Quanto à

longevidade das fêmeas, no tratamento controle estas viveram em média 15,41

dias, enquanto no tratamento com o extrato esse número caiu para 6,92 dias

(Tabela 2). A diferença observada na longevidade das fêmeas pode estar

relacionada à nutrição do ácaro, que o faz reduzir seu tempo de vida quando

exposto ao extrato.

31

Tabela 2. Efeitos subletais (Média ± EP) da CL50 (10,96 mg/mL) do

extrato métanólico de folhas de Annona vepretorum sobre fêmeas adultas de

Tetranychus urticae.

Tratamento Número de

ovos/fêmea

Viabilidade de ovos

(%)

Longevidade das

fêmeas (dias)

Controle 54.95 ± 2.36 a1 87.80 ± 0.99 a 15.41 ± 0.78 a

DL50 22.85 ± 3.07 b 88.66 ± 1.76 a 6.92 ± 0.70 b

T 8.27 0.42 8.02

P< 0.0001 0.6753 0.0001 FONTE: FERNANDES, M.H.A. 1Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste

T (P<0,05).

Todos os bioensaios realizados até o momento têm demonstrado que o

extrato de A. vepretorum atua na mortalidade e também em aspectos

biológicos de T. urticae. O próximo experimento foi realizado com o intuito de

avaliar o efeito desse extrato no comportamento do ácaro. O teste de dupla

escolha permitiu avaliar a preferência do ácaro, entre o controle e o extrato,

para alimentação e oviposição. Esses testes foram realizados com extrato

metanólico e hexânico, e estes demonstraram resultados semelhantes, onde

todas as concentrações testadas do extrato foram significativamente diferentes

do controle.

Quando as fêmeas tiveram chance de escolha entre o controle e extrato

metanólico, nas concentrações de 1,9, 3,7, 7,6, 15 e 30 mg/mL, verificou-se,

respectivamente, que após 24 horas 84, 74, 92, 96 e 99% dessas fêmeas

encontravam-se no controle (Figura 3). Nos testes com o extrato hexânico nas

concentrações de 1,9, 3,7, 7,6, 15 e 30 mg/mL, foi observado que,

respectivamente, 82, 90, 95, 98 e 98% das femeas tiveram preferência pelo

controle (Figura 4). Dessa forma, foi possível afirmar que a medida que se

aumenta a concentração do extrato a uma maior preferência da fêmea pelo

controle, sugerindo que nesses extratos orgânicos podem conter propriedades

repelentes.

32

Figura 3. Frequência média (%) de fêmeas de Tetranychus urticae na

escolha pelo hospedeiro tratado e não tratado com extrato metanólico de

Annona vepretorum em diferentes concentrações. Avaliação após 24 horas da

liberação das fêmeas. Diferenças significativas analisadas pelo teste qui-

quadrado ao nível de 5% de probabilidade.

2D G raph 1

Escolha do hospedeiro (% , n=15)

-100 -90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0

C ontro le

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Extrato

30 m g/m L

15 m g/m L

7,5 m g/m L

3,7 m g/m L

1,9 m g/m L

P<0,0001

P<0,0001

P<0,0001

P<0,0001

P<0,0001

0

FONTE: FERNANDES, M.H.A.

Figura 4. Frequência média (%) de fêmeas de Tetranychus urticae na escolha

pelo hospedeiro tratado e não tratado com extrato hexânico de Annona vepretorum em

diferentes concentrações. Avaliação após 24 horas da liberação das fêmeas.

Diferenças significativas analisadas pelo teste qui-quadrado ao nível de 5% de

probabilidade.

Escolha de hospedeiro

-100 -90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0

C ontro le

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Extrato

0

P<0,0001

P<0,0001

P<0,0001

P<0,0001

P<0,0001

30 m g/m L

15 m g/m L

7,5 m g/m L

3,7 m g/m L

1,9 m g/m L

FONTE: FERNANDES, M.H.A.

Os resultados mostraram que a escolha das fêmeas para oviposição foi

um reflexo da escolha para alimentação, pois os percentuais observados foram

muito semelhantes para ambas as escolhas nos tratamentos. Sendo que, o

menor percentual de oviposição no controle foi de 83%, alcançando até 100%.

33

Dessa forma, fica evidente que a quantidade de ovos na área controle e área

tratada está relacionada à preferência alimentar do ácaro no decorrer do tempo

de exposição ao extrato (SABELIS, 1985).

Esses resultados mostram que o extrato de A. vepretorum além de

possuir poder acaricida, também exibe atividades que afetam aspectos

biológicos e comportamentais de T. urticae. Mesmo que não sejam

necessariamente letais para os ácaros, alguns compostos químicos desse

extrato podem contribuir indiretamente para o controle dessa praga, pois são

capazes de interferir no ciclo biológico e, consequentemente, reduzir a

densidade populacional.

A identificação de espécies vegetais com potencial acaricida tem sido

cada vez mais necessária para contribuir no desenvolvimento de produtos

botânicos e introdução destes no mercado como uma alternativa aos produtos

químicos convencionais. Pois, a maioria dos biopesticidas é caracterizada por

baixa toxicidade em mamíferos, efeitos reduzidos sobre organismos benéficos

e mínima persistência no ambiente. Além disso, por constituírem-se por

misturas complexas o desenvolvimento da resistência pode ocorrer muito

lentamente.

Após esse estudo, o extrato de A. vepretorum surge como uma

alternativa possível no controle de T. urticae. Porém, muitos outros trabalhos

devem ser realizados, uma vez que, este é o primeiro estudo que avalia a

atividade pesticida dessa espécie vegetal. Sendo essencial a realização de

outras avaliações em condições de campo ou semi-campo, para verificar a

estabilidade e eficácia desses metabólicos que apresentaram bioatividade em

laboratório.

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38

5. COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ACARICIDA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE Annona vepretorum (ANNONACEAE) SOBRE Tetranychus

urticae (ACARI: TETRANYCHIDAE)2

RESUMO – Novas estratégias no controle de Tetranychus urticae Koch tem

sido investigada nos últimos anos como alternativa aos acaricidas sintéticos

convencionais. Este trabalho teve como objetivo determinar os constituintes

químicos de óleos essenciais de folhas de Annona vepretorum Mart, coletadas

em duas épocas distintas, e avaliar a toxicidade sobre T. urticae. A análise

realizada por CG/EM revelou como constituinte majoritário o espatulenol

(29,84%) na época 1 (junho/2015) e biciclogermacreno (28,81%) na época 2

(fevereiro/2016). Recipientes de vidro (1,4 L) foram utilizados como câmaras de

fumigação. Para cada combinação de dose (2,5, 5, 10, 20 e 40 μL/L de ar) e

tempo de exposição (24, 48 e 72 h) foram realizadas três repetições, com 30

fêmeas cada. Para avaliar a toxicidade por contato do óleo da época 2, as

concentrações utilizadas foram 0, 200, 400, 600 e 800 µL/mL e realizadas 10

repetições/tratamento, totalizando 100 ácaros. A avaliação ocorreu após 24, 48

e 72 h após a liberação do ácaro. Constatou-se efeito significativo na interação

entre as épocas de coleta e as diferentes concentrações do óleo. A ação

fumigante dos óleos foi maior após 72 h, na concentração de 40 μL/L,

alcançando em média 98,9 e 97,2% de mortalidade nas épocas 1 e 2,

respectivamente. No teste de contato, análise de regressão só foi significativa

para as concentrações de 200, 600 e 800 µL/mL. A toxicidade por contato foi

maior nas primeiras 24 horas, onde a maior mortalidade (96,4%) foi obtida com

800 µL/mL. O óleo essencial de A. vepretorum tem ação contra T. urticae,

porém, outros estudos devem ser realizados com essa espécie vegetal.

PALAVRAS-CHAVE: Ácaro rajado. Pesticida botânico. Óleos essenciais.

2FERNANDES, M.H.A.; MENEZES, K.O.; OLIVEIRA, A.P.; ALMEIDA, J.R.G.; OLIVEIRA, J.E.M.; GONÇALVES-GERVÁSIO, R.C.R. Composição química e atividade acaricida do óleo essencial de Annona vepretorum (Annonaceae) sobre Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae). A ser submetido.

39

CHEMICAL COMPOSITION AND ACARICIDES ACTIVITY OF THE

ESSENTIAL OIL OF Annona vepretorum (ANNONACEAE) ON Tetranychus

urticae (ACARI: TETRANYCHIDAE)

ABSTRACT – New strategies in control of Tetranychus urticae Koch has been

investigated in recent years as an alternative to conventional synthetic

acaricides. This study aimed to determine the chemical constituents of essential

oils of Annona vepretorum Mart leaves, collected in two different periods, and to

evaluate the toxicity of T. urticae. The analysis made by GC/MS has revealed

the spathulenol as major constituent (29.84%) at the time 1 (June/2015) and

bicyclogermacrene (28.81%) at the time 2 (February/2016). Glass containers

(1.4 L) were used as fumigation chambers. For each combination dose (2.5, 5,

10, 20 e 40 µL/L of air) and exposure time (24, 48 and 72 h) were made three

replicates with 30 females each. To evaluate the toxicity of the oil by contact at

time 2, the concentrations used were 0, 200, 400, 600 and 800 µL/mL and

performed 10 repetitions/treatment, totaling 100 mites. The evaluation were

performed on 24, 48 and 72 h after release of the mite. It was found a

significant effect in interaction between the time of collection and the different oil

concentrations. The fumigant action of the oils was greater after 72h in

concentration of 40 µL/L, reaching the average 98.9 and 97.2% of mortality at

the times 1 and 2, respectively. In the contact test, regression analysis was only

significant at the concentrations of 200, 600, and 800 µL/mL. The toxicity by

contact was greater in the first 24 hours, where the highest mortality rate

(96.4%) was obtained with 800 µL/mL. The essential oil of A. vepretorum has

action against T. urticae, however, further studies must be performed with this

plant species.

KEY WORDS: Spotted spider mite. Botanical pesticide. Essential oils.

40

INTRODUÇÃO

Os óleos essenciais são um grupo de metabolitos secundários, com

misturas complexas de terpenóides, que possuem potentes propriedades

bioativas (LABORDA et al., 2013). Esses óleos, na natureza, desempenham

um papel importante na proteção das plantas como agentes antibacterianos,

antivirais, antifúngicos e inseticidas (BAKKALI et al., 2008). Nas plantas, eles

mostram bioatividades ampla e modificada em artrópodes, que variam de

toxicidade (ISMAN, 2004; JIANG; AKHTAR; BRADBURY, 2009; AKHTAR et al.,

2010) para efeitos subletais, incluindo deterrência de oviposição e alimentação

(AKHTAR et al., 2010) ações repelente e atraente (ISMAN, 2006).

Diversos óleos essenciais de plantas mostraram atividade acaricida

contra diferentes espécies de ácaros, incluindo o ácaro-rajado Tetranychus

urticae Koch (Acari: Tetranychidae) (ROH; LEE; PARK, 2013). Esta espécie de

ácaro tem ampla distribuição mundial e é uma das principais pragas que ocorre

em ambientes abertos e fechados, (GERSON; WEINTRAUB, 2012). Ataca

muitas plantas de importância econômica, tais como frutíferas, hortaliças e

ornamentais (VAN LEEUWEN et al., 2007; MORAES; FLECHTMANN, 2008).

O controle de T. urticae, normalmente, é realizado através de acaricidas

sintéticos, porém, a utilização contínua e excessiva desses produtos possibilita

a ocorrência de efeitos adversos, como intoxicação, contaminação ambiental e

eliminação de inimigos naturais (MOTAZEDIAN; RAVAN; BANDANI, 2012),

além do desenvolvimento de populações resistentes aos acaricidas

(NICASTRO; SATO; SILVA, 2010). Assim, visando à redução desses efeitos

negativos, métodos alternativos para o controle de T. urticae vêm sendo

testados, dentre os quais destacam-se o uso de óleos essenciais extraídos de

plantas (MOTAZEDIAN; RAVAN; BANDANI, 2012).

Em contraste aos acaricidas sintéticos, geralmente constituídos por um

único ingrediente ativo, óleos essenciais apresentam uma mistura complexa de

constituintes (20-60 componentes), bastante diferentes em concentrações, o

que os tornam mais adequados para evitar a resistência, uma vez que seus

componentes podem interagir sinergicamente (BAKKALI et al., 2008; ISMAN;

MIRESMAILLI; MACHIAL, 2011).

Os óleos essenciais podem ser sintetizados por todos os órgãos da

planta, ou seja, brotos, flores, folhas, caules, galhos, sementes, frutas, raízes,

41

madeira ou casca, e são armazenadas em células secretoras, cavidades,

canais, células epidérmicas ou tricomas glandulares (BAKKALI et al., 2008). A

composição química desses óleos é determinada por fatores genéticos, porém,

outros fatores podem acarretar alterações significativas na produção dos

metabólitos secundários (MORAIS, 2009).

A extração dos óleos essenciais é, geralmente, realizada por vapor ou

hidro-destilação e pode variar em qualidade, quantidade e composição de

acordo com o clima, composição do solo, órgão da planta, época de coleta,

idade e fase vegetativa (MASOTTI et al., 2003; ANGIONI et at., 2006, MORAIS,

2009). Esses óleos são extraídos a partir de várias plantas aromáticas

geralmente encontradas em países quentes e de clima temperado, a exemplo

de países mediterrânicos e tropicais (BAKKALI et al., 2008).

Dentre as famílias de plantas encontradas nas regiões tropicais ou

subtropicais do mundo, destaca-se a família Annonacae com cerca de 108

gêneros e, aproximadamente, 2.400 espécies (CHATROU et al., 2012). Muitas

das espécies dessa família, principalmente as do gênero Annona, já foram

investigadas para fins de controle de pragas (KRINSKI; MASSAROLI;

MACHADO, 2014). No entanto, o potencial da grande maioria das anonáceas

ainda não foi estudado, como é o caso da espécie Annona vepretorum Mart.

Na literatura, encontram-se poucos trabalhos realizados com A.

vepretorum. Os estudos realizados, com óleo essencial desta espécie,

descrevem a composição química e atividade antioxidante, antinociceptivo,

anti-inflamatório, antimaláricas e tripanocida (COSTA et al., 2012; SILVA, 2013;

ARAÚJO et al., 2015; MEIRA, et al., 2015), porém, não há relatos do uso dessa

espécie investigando seu potencial no controle de insetos e ácaros.

Na busca por alternativas aos acaricidas convencionais, óleos

essenciais pertencentes a várias espécies de plantas têm sido amplamente

investigados e vários desses óleos e seus constituintes já apresentaram

eficácia contra os ácaros fitófagos (ISMAN, 2000; MIRESMAILLI; BRADBURY;

ISMAN, 2006). Assim, este trabalho teve como objetivo identificar a

composição química de óleos essenciais de folhas de A. vepretorum, coletadas

em duas épocas distintas, e avaliar a toxicidade desses óleos sobre o ácaro T.

urticae.

42

MATERIAL E MÉTODOS

Os óleos essenciais foram obtidos no Laboratório de Bioquímica da

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) e as análises

químicas foram realizadas na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP

em Ribeirão Preto. Os bioensaios foram conduzidos no Laboratório de

Entomologia da Embrapa Semiárido.

Material vegetal. Folhas de A. vepretorum foram coletadas em área de

caatinga no campus de Ciências Agrarias da Universidade Federal do Vale do

São Francisco (latitude 09º19’37,50’’’ longitude 040º33’01,40’’ e altitude 385 m)

em duas épocas distintas, junho de 2015 (época 1) e fevereiro de 2016 (época

2). A exsicata da espécie está depositada no Herbário Vale do São Francisco

(HVASF) na Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o

número #18350.

Extração do óleo essencial. As folhas frescas foram trituradas com

água destilada em um liquidificador industrial e submetidas à hidrodestilação

durante 2 horas num aparelho tipo Clevenger. Ao final do processo, obteve-se

1,35 g do óleo essencial das folhas coletadas (1,672 kg) da época 1 e 1,85 g

do óleo das folhas coletadas (1,730 kg) na época 2. O óleo essencial foi

separado da água por diferença de densidade e armazenado em fraco de vidro

âmbar em freezer, a temperatura inferior a 4 °C.

Análise química do óleo essencial. As substâncias presentes no óleo

essencial de A. vepretorum foram investigadas em um cromatógrafo a gás

Shimadzu QP-2010 em interface com um espectrómetro de massa (CG/EM).

Foram utilizadas as seguintes condições: coluna DB-5MS Agilent Technologies

(30 m × 0,25 mm × 0,25 μm); hélio (99,999%) como gás transportador com um

fluxo constante de 1,1 ml/min; volume de injeção1,0 μl; a taxa de partição do

volume injetado foi de 1:10; temperatura do injetor de 250 °C; detector de

captura iônica operando com ionização por impacto de elétrons a 70 eV; fontes

de íons a temperatura de 280 °C e linha de transferência de temperatura a 260

°C. A programação de temperatura do forno do CG foi de 60 °C, com um

aumento de 3 °C/min até 240 °C.

Uma mistura de hidrocarbonetos lineares (C9H20-C21H40) foi injetado

sob as mesmas condições experimentais que as amostras, e a identificação

dos componentes foi efetuada por comparação dos espectros obtidos com os

43

da base de dados dos equipamentos (Wiley 7 lib e NIST 08 lib) e através da

utilização do Índice de Kovats, cada componente foi calculado como

previamente descrito (ADAMS, 1997; VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963). Os

dados foram obtidos e processados com um PC com o software Shimadzu

GC/MS Solution.

Criação de T. urticae. Os ácaros utilizados nos ensaios foram

provenientes de uma criação mantida no Laboratório de Entomologia da

Embarapa Semiárido. Os ácaros foram criados em plantas de feijão-de-porco,

Canavalia ensiformes L. (Leguminosae), sob temperatura de 25 ± 1oC,

umidade relativa de 70 ± 10% e fotofase de 12 horas. Essas mesmas

condições foram adotadas na condução de todos os experimentos.

Teste de fumigação. Recipientes de vidro com capacidade de 1,4 L

foram usados como câmaras de fumigação. Em placas de Petri (9 cm),

contendo uma esponja de polietileno umedecida com água e um disco de papel

filtro, foram colocados três discos de folha de feijão-de-porco (2,5 cm). Em

cada disco de folha foram colocadas 10 fêmeas adultas de T. urticae. Cada

placa de Petri, contendo 30 ácaros, foi colocada no interior do recipiente de

vidro. O óleo essencial foi aplicado, com auxílio de uma pipeta automática, em

tiras de papéis de filtro (5 x 2 cm) presas à superfície inferior da tampa dos

recipientes. Após a aplicação, os recipientes foram fechados e abertos

somente no momento da avaliação. As doses aplicadas foram de 3,5, 7, 14, 28

e 56 μL do óleo essencial, o que corresponde a uma concentração de 2,5, 5,

10, 20 e 40 μL/L de ar, respectivamente. Nada foi aplicado na testemunha. O

período de exposição ao óleo foi de 24, 48 e 72 horas. Para cada dose e tempo

de exposição, 3 repetições foram realizadas, sendo cada repetição um

recipiente de vidro contendo uma placa de Petri com 30 ácaros. As câmaras de

fumigação foram mantidas em câmara climatizada (B.O.D.). Para ambos os

óleos essenciais (época 1 e época 2) os testes foram conduzidos em

delineamento inteiramente casualizado (DIC) considerando esquema fatorial

6x2 (6 concentrações de óleo e 2 épocas de coleta).

As avaliações foram realizadas ao final do período de cada tempo de

exposição, considerando mortos os ácaros incapazes de caminhar uma

distância superior ao comprimento de seu corpo após um leve toque com pincel

de cerdas finas.

44

Os dados obtidos foram submetidos aos testes de normalidade dos

resíduos de Shapiro-Wilk e de homocedasticidade de Bartlett a 5% de

significância. Em seguida, foram realizadas análises de variância e de

regressão (p≤0,05). Estas análises foram realizadas com auxílio do software R

versão 3.2.5 (R CORE TEAM, 2016).

Toxicidade por contato. Os testes para avaliar o efeito por contato

residual foram realizados através do método de “pincelagem” em disco de folha

descrita por Miresmailli; Bradbury; Isman, (2006). Devido ao baixo rendimento

obtido para o óleo essencial da época 1, só foi possível a realização desse

bioensaio com o óleo da época 2. As concentrações utilizadas foram 200, 400,

600 e 800 µL/mL. As soluções foram preparadas pela diluição do óleo

essencial em água destilada e Tween 20 (0,1%) utilizado como dispersante. No

tratamento controle foi utilizada apenas água destilada contendo o dispersante

a 0,1%. Discos de folha de feijão-de-porco (3,0 cm) foram acondicionados em

placas de Petri (9 cm) contendo uma esponja de polietileno umedecida com

água e um disco de papel de filtro. A face inferior desses discos foi tratada com

o óleo essencial através da aplicação, com uma pipeta automática, de uma

alíquota de 20 μL por disco da solução de cada tratamento. A solução aplicada

em cada disco de folha foi espalhada com o auxílio de um bastão de vidro.

Após secar em temperatura ambiente por aproximadamente duas horas, as

bordas dos discos foram cobertas com pedaços de papel toalha para evitar a

fuga dos ácaros. Em seguida, 10 fêmeas adultas de T. urticae foram

transferidas para cada disco de folha e as placas de Petri acondicionadas em

câmara climatizada (B.O.D.). Foram realizadas 10 repetições por concentração,

totalizando 100 ácaros por tratamento. Os ensaios foram conduzidos em

delineamento inteiramento casualizado (DIC) considerando o arranjo em

parcela subdividida 5x3 (5 concentrações e 3 tempos).

As avaliações foram realizadas após 24, 48 e 72 horas da liberação dos

ácaros, registrando-se o número de ácaros mortos. A mortalidade foi

considerada quando, após um leve toque com a extremidade de um pincel de

cerdas finas (n°000), os ácaros foram incapazes de se deslocar por uma

distância superior ao comprimento do seu corpo.

Os dados obtidos foram submetidos aos testes de normalidade dos

resíduos de Shapiro-Wilk e de homocedasticidade de Bartlett a 5% de

significância. Em seguida, os dados foram transformação para log(x+1) e

45

prosseguiu-se com as análises de variância e regressão (p≤0,05). As análises

foram realizadas com auxílio do software R versão 3.2.5 (R CORE TEAM,

2016).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A caracterização química dos óleos essenciais de folhas de A.

vepretorum, através da análise por CG-EM, permitiu detectar 81,45% dos

constituintes da amostra de óleo da coleta de junho/2015 (época 1) e 91,14%

dos constituintes da coleta de fevereiro/2016 (época 2).

A análise da composição do óleo essencial de A. vepretorum da época

1, revelou 34 picos, dos quais foi possível identificar 19 destes. Os

componentes majoritários encontrados foram: espatulenol (29,84%),

biciclogermacreno (10,82%), (E)-β-ocimeno (7,84%), germacreno D (6,99%), p-

cimeno (3,89%), cadin-4-en-10-ol (3,19%) (Tabela 1).

Para o óleo essencial de A. vepretorum coletado na época 2, foram

observados 42 picos, dos quais 23 foram identificados. Os componentes

reconhecidos como majoritários foram: biciclogermacreno (28,81%), (E)-β-

ocimeno (15,19%), germacreno D (13,41%), α-phellandreno (11,41%),

espatulenol (7,05%), p-cimeno (3,12%), α-pineno (2,45%), (E)-cariofileno

(1,53%) (Tabela 2).

Outros constituintes foram identificados, mas em menor concentração,

nos óleos avaliados. Na maioria das vezes os componentes principais que

estão em maior quantidade nos óleos essenciais são testados comprovando

que o efeito causado pelo óleo é devido a este composto majoritário, porém em

alguns óleos essenciais alguns componentes agem sinergicamente (LEYVA et

al., 2009).

46

Tabela 1. Composição química do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum coletas em junho de 2015 (época 1).

Pico TR (min)1 IR exp.

2 IR lit.

3 Composto % CG-EM

4

1 5,52 930 939 α-Pineno 2,24 2 6,71 974 979 β-Pineno 0,22 3 6,99 985 990 Mirceno 0,65 4 7,53 1004 1002 α-Phellandreno 1,96 5 8,11 1020 1024 p-Cimeno 3,89 6 8,32 1026 1029 Limoneno 2,89 7 8,50 1031 1037 (Z)-β-Ocimeno 0,60 8 8,89 1042 1050 (E)-β-Ocimeno 7,84 9 10,83 1096 1096 Linalool 0,36 10 15,26 1204 --- 2,6-Dimetil-3,5,7-octatrieno-2-ol 0,71 11 16,77 1239 --- Limoneno dioxide 2,02 12 17,86 1264 --- NI 0,61 13 19,06 1293 --- NI 0,45 14 19,95 1314 --- NI 1,60 15 20,22 1320 --- NI 1,31 16 23,03 1386 --- NI 0,25 17 23,11 1388 --- NI 1,65 18 24,30 1417 1419 (E)-Cariofileno 1,16 19 25,97 1458 --- NI 0,56 20 26,79 1479 1481 Germacreno D 6,99 21 27,41 1494 1500 Biciclogermacreno 10,82 22 30,57 1575 1578 Espatulenol 29,84 23 30,79 1580 --- NI 0,73 24 30,89 1583 1590 Globulol 2,27 25 31,19 1591 1592 Viridiflorol 2,56 26 31,59 1601 --- NI 1,19 27 32,48 1625 --- NI 0,60 28 32,73 1632 --- NI 3,39 29 33,04 1640 --- NI 2,19 30 33,15 1643 --- NI 0,84 31 33,48 1652 --- Cadin-4-en-10-ol 3,19 32 34,18 1671 --- NI 1,54 33 35,76 1714 --- NI 1,64 34 44,16 1962 --- Ácido hexadecanoico 1,24

Total 81,45 FONTE: FERNANDES, M.H.A. 1TR: tempo de retenção,

2IR exp.: índice de retenção encontrado na amostra;

3IR lit.: índice de

retenção encontrado na literatura, 4GC-MS: cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massas. NI= não identificado.

47

Tabela 2. Composição química do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum coletas em fevereiro de 2016 (época 2).

Pico TR (min)1 IR exp.

2 IR lit.

3 Composto % CG-EM

4

1 5,29 921 930 α-Tujeno 0,08 2 5,50 929 939 α-Pineno 2,45 3 6,69 973 979 β-Pineno 0,14 4 6,97 984 990 Mirceno 0,74 5 7,52 1003 1002 α-Phellandreno 11,41 6 8,09 1019 1024 p-Cimeno 3,12 7 8,31 1025 1029 Limoneno 0,49 8 8,48 1030 1037 (Z)-β-Ocimeno 1,05 9 8,88 1041 1050 (E)-β-Ocimeno 15,19 10 10,26 1080 --- NI 0,08 11 10,38 1083 --- δ-2-Careno 0,06 12 10,81 1095 1096 Linalool 0,23 13 15,23 1203 --- NI 0,31 14 16,74 1238 --- NI 0,57 15 19,90 1312 --- NI 0,34 16 20,19 1319 --- NI 0,41 17 20,72 1332 --- NI 0,27 18 20,81 1334 --- δ-Elemeno 0,22 19 22,51 1374 1376 α-Copaeno 0,36 20 23,08 1388 1390 β-Elemeno 1,27 21 24,28 1417 1419 (E)-Cariofileno 1,53 22 24,90 1432 --- NI 0,27 23 25,71 1452 --- NI 0,45 24 25,95 1458 1460 allo-Aromadendreno 0,65 25 26,78 1478 1481 Germacreno D 13,41 26 27,41 1494 1500 Biciclogermacreno 28,81 27 27,79 1503 --- NI 0,44 28 28,34 1517 1523 δ-Cadineno 0,53 29 30,50 1573 1578 Espatulenol 7,05 30 30,85 1582 1590 Globulol 0,68 31 31,16 1590 1592 Viridiflorol 0,58 32 31,53 1599 --- NI 0,81 33 32,44 1624 --- NI 0,26 34 32,70 1631 --- NI 1,19 35 32,97 1638 --- NI 1,51 36 33,47 1652 --- Cadin-4-en-10-ol 1,09 37 34,16 1670 --- NI 1,05 38 34,84 1689 --- NI 0,12 39 35,33 1702 --- NI 0,28 40 35,72 1713 --- NI 0,25 41 35,85 1717 --- NI 0,09 42 37,28 1757 --- NI 0,15

Total 91,14 FONTE: FERNANDES, M.H.A. 1TR: tempo de retenção,

2IR exp.: índice de retenção encontrado na amostra;

3IR lit.: índice de

retenção encontrado na literatura, 4GC-MS: cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massas. NI= não identificado.

Ao comparar os constituintes químicos presentes nas duas amostras de

óleo essencial de A. vepretorum, é possível afirmar que há diferenças em sua

composição. As análises evidenciaram o espatulenol (29,84%) e o

biciclogermacreno (10,82%) como os principais componentes do óleo referente

48

à coleta da época 1, já para a época 2 os majoritários foram biciclogermacreno

(28,81%) e (E)-β-ocimeno (15,19%). Isto indica que a mesma espécie vegetal

pode apresentar diferenças em sua composição química dependendo da época

de coleta, sendo, portanto, o efeito sazonal um fator a ser considerado.

Outros fatores podem exercer influência direta nos metabólitos

secundários produzidos pelas plantas, tais como a temperatura, umidade

relativa, luminosidade, nutrição, estágio de desenvolvimento e estresse hídrico

(MORAIS, 2009). Essas características podem justificar as diferenças dos

compostos químicos de A. vepretorum encontrados no presente trabalho com

aqueles encontrados por Araújo et al., (2015), na mesma região, que observou

como componentes principais o espatulenol (43,7%) e limoneno (20,5%). Os

compostos E-ocimeno (25,56%) e biciclogermacreno (15,63%) também já

foram citados como majoritários do óleo essencial de folhas de A. vepretorum

coletadas em Petrolina (SILVA et al., 2013).

Em estudos realizados para avaliar a composição química de folhas de

A. vepretorum no Estado de Sergipe, Costa et al., (2012) e Meira et al., (2015)

identificaram o biciclogermacreno (43,7%) e espatulenol (11,4%); e

biciclogermacreno (39,0%) e espatulenol (14,0%), respectivamente, como os

principais compostos do óleo dessa espécie. Esses resultados corroboram com

os resultados encontrados no presente trabalho.

O composto biciclogermacreno é um dos mais abundantes em óleos

essenciais de Annonaceae, com destaque para o gênero Annona. O

biciclogermacreno constitui 18,2% do óleo essencial de Annona cherimola

(RIOS et al., 2003), 35,12% de Annona foetida (COSTA et al., 2009), 39,8% de

Annona coriácea (SIQUEIRA et al., 2011), 20,3% de Annona salzmannii e

45,4% de Annona pickelii (COSTA et al., 2011).

A detecção da concentração proeminente de biciclogermacreno em

muitas espécies de Annona sugere que estas plantas são uma fonte natural

deste composto. Outro destaque é o espatulenol, que tem sido relatado como

um composto presente com teores elevados no óleo essencial de várias

espécies da família Annonaceae (TRIGO et al., 2007; PEREZ-HERNANDEZ et

al., 2008). A presença de biciclogermacreno e espatulenol como componentes

principais em óleos essenciais de muitas espécies de anonáceas, sugere que

estes compostos podem ser considerados marcadores quimiotaxonómicos do

gênero Annona (DUTRA et al., 2012; COSTA et al., 2012).

49

Apesar de alguns compostos químicos serem bastante frequentes em

óleos de anonáceas, em geral há uma grande variação dos constituintes,

quanto ao tipo e a concentração. Na literatura, é comum perceber essa

variação em estudos com espécies do gênero Annona, visto que, o composto

majoritário de A. squamosa é o (E)-cariofileno (27,4%) (MEIRA et al., 2015), de

A. senegalensis o citronelal (30,0%) (AMEEN et al., 2011) de A. muricata o

(E)- cariofileno (38,9%) (OWOLABI et al., 2013) de A. reticulata o copaeno

(35,4%) (CHAVAN; WAKTE; SHINDE, 2012) de A. glabra o β-cariofileno

(21,5%), de A. squamosa o β-cariofileno (24,5%) e de A. muricata o β- pineno

(20,6%) (THANG et al., 2013). Isso porque a composição desses óleos pode

variar com o clima, área geográfica, estações, condições do solo, período de

colheita e técnica de isolamento (CARVALHO-FILHO et al., 2006).

Após a identificação dos compostos dos óleos essências de A.

vepretorum, avaliou-se a toxicidade destes óleos sobre o ácaro T. urticae. A

figura 1 demonstra, por diferentes equações de regressão, os resultados da

atividade fumigante do óleo essencial de folhas de A. vepretorum, coletadas

em duas épocas distintas do ano, sobre a mortalidade de T. urticae. Constatou-

se efeito significativo na interação entre as épocas de coleta e as diferentes

concentrações do óleo.

Observou-se, em todos os tempos de exposição (24, 48 e 72h) do ácaro

aos óleos, que a mortalidade de T. urticae foi semelhante nas duas épocas de

coleta na maior concentração testada (40 μL/L de ar). Porém, é perceptível que

o óleo da época 1, nas menores concentrações, provoca um maior percentual

de mortalidade, inferindo que os compostos presentes nesse óleo podem agir

sinergicamente e com maior rapidez sobre o ácaro.

De acordo com a análise das curvas de regressão, o aumento

significativo da mortalidade foi constatado com o aumento das concentrações

dos óleos essenciais (época 1 e 2) em todos os tempos de exposição (24, 48 e

72h), obedecendo uma equação quadrática com valores ascendentes. Nas 24h

de exposição ao óleo, a mortalidade diferiu significativamente entre as épocas

nas concentrações de 2,5, 10 e 40 μL/L de ar (Figura 1A). As maiores

diferenças de mortalidade entre os óleos das duas épocas ocorreram após 48h

de exposição, onde a mortalidade atingiu 68,8 e 11,9% na época 1 e 2,

respectivamente, com a concentração de 10 μL/L de ar. Esse efeito foi ainda

maior na concentração de 20 μL/L, onde a época 1 mostrou uma mortalidade

50

bem superior, em média 70% a mais, em comparação com a época 2 (Figura

1B). Em geral, a toxicidade do óleo foi maior após 72h na concentração de 40

μL/L, alcançando em média 98,9 e 97,2% de mortalidade nas épocas 1 e 2,

respectivamente (Figura 1C).

Trabalhos que avaliaram também o efeito fumigante de óleos essenciais

contra T. urticae, mostraram que a CL50 para a espécie Protium bahianum

(Burseraceae) foi de 3,5 µL/L de ar (PONTES et al., 2010), Citrus aurantium

(Rutaceae) de 1,63 µL/L (CHOI et al., 2004) e Lippia sidoides (Verbenaceae)

de 0,01 µL/L de ar (CAVALCANTI et al., 2010). Analisando esses números, é

possível julgar que óleo de A. vepretorum possui toxicidade moderada, uma

vez que, para alcançar altos níveis de mortalidade do ácaro foi necessário

utilizar concentrações elevadas do óleo.

Não há registro na literatura sobre o potencial de óleos essenciais de

espécies de Annona sobre T. urticae. Além disso, poucos trabalhos existem

com espécies de anonáceas. Choi et al., (2004) avaliaram a atividade

fumigante e Roh et al., (2011) a atividade de contato do óleo essencial de

Cananga adorata (Annonaceae) contra T. urticae e observaram que não houve

toxicidade. Entretanto, existem muitos estudos que relatam a ação de óleos

essenciais de outras espécies vegetais sobre essa mesma praga.

Dentre as famílias de plantas mais estudadas, quanto a toxicidade de

óleos essenciais contra T. urticae, destacam-se as famílias Lamiaceae,

Myrtaceae, Rutaceae e Solanaceae. Muitas espécies dessas famílias

estudadas são consideradas desde muito tóxica a não tóxica. A alta toxicidade

por teste de fumigação contra T. urticae foi observada nas espécies vegetais

Eugenia caryophyllata (Myrtaceae), Eucalyptus citriodora (Myrtaceae),

Eucalyptus globulus (Myrtaceae), Pimenta racemosa (Myrtaceae), Citrus

bergamia (Rutaceae), Salvia officinalis (Lamiaceae), Mentha piperita

(Lamiaceae), Mentha spicata (Lamiaceae), Mentha pulegium (Lamiaceae),

Lavandula officinalis (Lamiaceae), Pelargonium graveolens (Geraniaceae)

(CHOI et al. (2004), Nepeta racimosa (Lamiaceae), Origanum vulgare

(Lamiaceae), Melissa officinalis (Lamiaceae) (ÇALMAŞUR; ASLAN; ŞAHIN,

2006), Allium sativum (Alliaceae) (HINCAPIÉ LI; LÓPEZ; TORRES, 2008),

Lippia sidoides (Verbenaceae) (CAVALCANTI et al., 2010) e Protium bahianum

(Burseraceae) (PONTES et al., 2010).

51

Figura 1. Efeito de concentrações do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum e duas épocas de coleta do material vegetal sobre a mortalidade de

Tetranychus urticae, após 24h (A), 48h (B) e 72h (C) de exposição. Médias

seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5%. ****:

modelo de regressão significativo (p≤0,0001).

FONTE: FERNANDES, M.H.A.

A

B

C

52

Um trabalho realizado por Choi et al., (2004) mostra que assim como

existem muitas espécies altamente tóxicas para T. urticae, em experimentos de

fumigação, outras apresentam baixa ou nenhuma toxicidade, como é o caso

das espécies Rosmarinus officinalis (Lamiaceae), Aniba rosaeodora

(Lauraceae), Melaleuca alternifolia (Myrtaceae), Myristica fragrans

(Myristicaceae), Citrus reticulate (Rutaceae), Santalum album (Santalaceae),

Zingiber officinale (Zingiberaceae).

É importante ressaltar que nos óleos essenciais, os níveis dos

compostos que possuem ação acaricida podem variar em função da espécie

vegetal, das condições de cultivo e da forma de extração desses compostos, o

que afeta diretamente na atividade dos óleos essenciais. Por essa razão,

tornam-se necessárias pesquisas criteriosas quanto à composição química das

sustâncias oriundas das plantas e os seus efeitos toxicológicos aos

organismos.

Além da ação por fumigação, neste trabalho também foi avaliada a

toxicidade por contato do óleo essencial de A. vepretorum. De acordo com a

análise de variância, houve interação entre as concentrações do óleo e os

tempos de avaliação (Figura 2). Foi possível observar que a análise de

regressão só foi significativa para as concentrações de 200, 600 e 800 µL/mL e

não foram significativas para as concentrações de 0 (controle) e 400 µL/mL. A

análise de regressão mostrou curvas quadráticas com valores descendentes,

pois quanto maior a concentração do óleo, maior a mortalidade dos ácaros.

Os resultados mostraram que na primeira avaliação, com 24 horas,

houve o maior índice de mortalidade nas concentrações que foram

significativas para a análise de regressão, cuja a mortalidade maior (96,4%) foi

obtida com 800 µL/mL. Já para as concentrações de 600 e 200 µL/mL a

mortalidade foi de 37,2 e 16,6%, respectivamente. Nas avaliações posteriores,

com 48 e 72 horas, a mortalidade registrada foi menor. Isso infere que o

aparecimento de sinais tóxicos é rápido, apesar dos mecanismos de ação

tóxica dos óleos essenciais ainda não serem bem esclarecidos (KNAAK;

FIUZA, 2010).

53

Figura 2. Efeito de concentrações do óleo essencial de folhas de Annona

vepretorum e três tempos (horas) de avaliação sobre a mortalidade de

Tetranychus urticae. NS: modelo de regressão não significativo, **: modelo de

regressão significativo (p≤0,01). ****: modelo de regressão significativo

(p≤0,0001).

FONTE: FERNANDES, M.H.A.

Embora tenha sido possível alcançar um percentual alto na mortalidade

de T. urticae com o teste de contato, é importante observar que para isto foi

necessário utilizar uma concentração muito alta do óleo essencial, o que pode

caracterizá-lo como pouco tóxico para essa espécie de ácaro. No entanto, isso

pode ter ocorrido devido as condições do experimento, o qual foi conduzindo

com placas de Petri abertas, fazendo com que possivelmente houvesse perdas

significativas dos compostos mais voláteis dos óleos através da evaporação.

Araújo et al., (2012), avaliando por diferentes métodos a toxicidade do

óleo de Piper aduncum (Piperaceae) e seus constituintes contra T. urticae,

concluíram que a mortalidade obtida nos testes de contato com placas abertas

foi significativamente menor do que aquela obtida para os experimentos com

placas fechadas. Isso indica que o tipo de bioensaio e o método de aplicação

do óleo podem influenciar diretamente na susceptibilidade dos ácaros.

Não há relatos na literatura da toxicidade de A. vepretorum sobre insetos

e ácaros. No entanto, vários pesquisadores trabalhando com óleos essenciais

no controle de T. urticae apresentaram diversos resultados quanto a eficiência

destes. Algumas espécies vegetais consideradas muito toxicas em

experimentos de contato para T. urticae foram Citrus sinensi (Rutaceae) (CHOI

54

et al., 2004), Capparis aegyptia (Capparaceae) (HUSSEIN et al., 2006),

Rosmarinus officinalis (Lamiaceae) (MIRESMAILLI; ISMAN, 2006),

Lycopersicon hirsutum (Solanaceae) (ANTONIOUS; SNYDER, 2006), Mentha

spicata (Lamiaceae) (OMAR; EL SAYED; ROMEH, 2009), Datura stramonium

(Solanaceae) (KUMRAL; COBANOGLU; YALCIN, 2009), Artemisia judaica

(Lamiaceae) (EL-SHARABASY, 2010), Chrysanthemum coronarium

(Asteraceae), Hertia cheirifolia (Asteraceae) e Mentha pulegium (Lamiaceae)

(ATTIA et al., 2012).

Os resultados obtidos no presente trabalho, para ambos os métodos de

avaliação (fumigação e contato), mostram que a toxicidade do óleo de A.

vepretorum pode variar de acordo com o seu modo de ação, podendo ser mais

tóxico por fumigação, do que por contato ou ingestão. Essas diferenças

metodológicas relacionadas à forma de aplicação do óleo podem justificar, em

parte, a diferença observada na maior suscetibilidade dos ácaros nos testes de

fumigação em comparação aos testes de contato.

Uma vez verificado o efeito inseticida/acaricida, os óleos essenciais,

principalmente, pela volatilidade, podem ser usados para o controle de pragas

em ambientes fechados, como também na preparação de formulações para o

emprego em ambientes abertos (ASLAN et al., 2004; ÇALMAŞUR; ASLAN;

ŞAHIN, 2006).

Apesar de décadas de pesquisa em todo o mundo e um grande número

de espécies vegetais mostrarem toxicidade sobre artrópodes pragas, poucos

produtos naturais de plantas têm sido comercializados com sucesso como

pesticidas botânicos (ISMAN; MIRESMAILLI, 2011). Dentre as barreiras

existentes estão: a disponibilidade de material vegetal numa base sustentável,

padronização com base na quantificação de ingredientes ativos e aprovação

governamental, normalmente exigindo várias avaliações toxicológicas (ISMAN;

MACHIAL, 2006).

Pesticidas derivados de óleos essenciais de plantas têm vários

benefícios importantes que os tornam compatíveis com manejo integrado de

pragas. Dessa forma, espera-se que sejam desenvolvidas formulações

capazes de manter os ingredientes ativos para que esses pesticidas alcancem

uma maior aplicação comercial no controle de praga.

55

Este trabalho é o primeiro relato da avaliação do óleo essencial de A.

vepretorum no controle pragas e, portanto, contribui para melhorar o

conhecimento sobre esta espécie ainda pouco estudada.

A busca constante de novos métodos de controle, que sejam capazes

de diminuir os efeitos indesejáveis dos produtos químicos e possam ser

utilizados de forma integrada com outros métodos, faz com que o uso do óleo

essencial de A. vepretorum seja apontado como uma alternativa futura aos

acaricidas sintéticos para utilização no manejo integrado de T. urticae. Porém,

muitos outros trabalhos precisam ser realizados para analisar a viabilidade do

uso desse óleo e verificar a eficiência em ambientes abertos, bem como a sua

ação como repelente ou atraente.

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61

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Annona vepretorum é uma espécie pouco estudada e não há relatos do

seu uso no controle de pragas. Esse estudo apresentou, pela primeira vez, a

avaliação da toxicidade de extratos orgânicos e óleo essencial dessa espécie

contra artrópodes.

Os resultados obtidos mostram que extratos e óleos de A. vepretorum são

tóxicos para Tetranychus urticae. O extrato metanólico destaca-se como mais

tóxico, quando comparado com o extrato hexânico. Além de causarem a

morte, os extratos orgânicos também têm efeito sobre parâmetros reprodutivos

e são altamente repelentes.

Os constituintes majoritários dos óleos essenciais de folhas de A.

vepretorum são o espatulenol (coleta de junho/2015) e o biciclogermacreno

(coleta de fevereiro/2016). Os óleos coletados nas diferentes épocas mostram

resultados semelhantes quanto a ação fumigante, porém, em menores

concentrações, o óleo referente à época 1, apresenta maior eficiência. É

possível concluir que T. urticae é muito mais suscetível ao óleo essencial

através de testes por fumigação em relação ao efeito de contato.

Em resumo, A. vepretorum mostrou-se uma espécie interessante do

ponto de vista biológico, exibindo perfis de atividade acaricida. Essas

atividades provavelmente estão relacionadas aos constituintes químicos

presentes nessa espécie vegetal. Dessa forma, destacamos o ineditismo desse

estudo quanto à investigação do potencial acaricida dessa espécie, além da

contribuição para o conhecimento quimiotaxonômico do gênero Annona e da

família Annonaceae.

Os produtos naturais abordados neste trabalho são possíveis alternativas

aos agrotóxicos convencionais e podem fazer parte de uma nova geração de

compostos biologicamente ativos com potencial de uso no manejo integrado de

T. urticae. No entanto, outros estudos precisam ser realizados a fim de avaliar

a suscetibilidade do ácaro a extratos e óleos essenciais de A. vepretrorum sob

condições de campo e semi-campo. Além disso, é importante avaliar os efeitos

toxicológicos desses extratos e óleos provenientes de outras estruturas da

planta.