UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO...

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

MÉRCIA LETICE LOZER DE AMORIM

ESTUDO FITOQUÍMICO E ENSAIOS BIOLÓGICOS DE Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob

(ASTERACEAE)

DIAMANTINA 2012

MÉRCIA LETICE LOZER DE AMORIM

ESTUDO FITOQUÍMICO E ENSAIOS BIOLÓGICOS DE Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob

(ASTERACEAE)

Dissertação apresentada à Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, área de concentração em Química Orgânica, para obtenção do título de Mestre.

Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Fernanda Fuzer Grael

Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Costa Archanjo

DIAMANTINA 2012

Ficha Catalográfica - Serviço de Bibliotecas/UFVJM Bibliotecário Rodrigo Martins Cruz

CRB6-2886 A524e

Amorim, Mércia Letice Lozer de. Estudo fitoquímico e ensaios biológicos de Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M.King & H.Rob (Asteraceae) / Mércia Letice Lozer de Amorim. – Diamantina: UFVJM, 2012. 86 p. Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Fernanda Fuzer Grael. Coorientador: Prof. Dr. Fernando Costa Archanjo. Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-Graduação em Química) – Faculdade de Ciências Exatas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2012. 1. Pseudobrickellia brasiliensis. 2. Fitoquímica. 3. Atividade antiinflamatória. 4. Atividade antioxidante. I. Cristiane Fernanda Fuzer Grael. II. Fernando Costa Archanjo. III. Título. CDD 572.2

Elaborada com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).

Aos meus queridos pais e irmãos,

que são minha essência, base,

estrutura e porto seguro.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Flávio e Elizete, e aos meus irmãos, Amanda e Flávio, pelo

incentivo, apoio, confiança e amor incondicionais.

Ao meu namorado, Leonardo, pelo carinho, força e paciência.

À Profa. Dra. Cristiane Fernanda Fuzer Grael, pela orientação, dedicação,

paciência, ensinamentos, idealização deste trabalho, e por ter sido fator essencial para a

minha formação científica e realização profissional.

Ao Prof. Dr. Fernando Costa Archanjo, pela co-orientação, disponibilidade e

preocupação ao longo de tantos anos.

Ao Prof. Dr. Luiz Elídio Gregório, o Mazza, pela coluna de Sephadex, e pelas

dicas e conselhos, imprescindíveis para o meu trabalho.

À Profa. Dra. Roqueline Rodrigues Silva de Miranda – Departamento de

Química/UFMG pelas análises em RMN e IV.

Ao Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes e à Izabel Cristina Casanova Turatti –

Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintéticos da FCFRP/USP pelas análises em

CG-EM.

Ao Wilson Muanis Godinho pela colaboração na coleta da planta e extração do

óleo essencial.

Ao Prof. Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Mello e à Valéria Almeida

Gomes do Laboratório de Imunologia/UFVJM pela colaboração no ensaio

antiinflamatório.

À Juliana Martins Ribeiro pelo interesse e ajuda em meu trabalho.

Aos técnicos do laboratório, Ana Carolina Ferreira Maia e Fernando Roberto

Figueiredo Leite, pela ajuda diária.

Aos professores e colegas da Pós-graduação em Química por dividirem seus

conhecimentos e experiências, em especial às professoras Cristiane, Roqueline e

Patrícia, e aos amigos Wilson, Vinícius e Abraão.

À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri por minha

formação profissional.

Ao Departamento de Farmácia pelos laboratórios.

À CAPES pela bolsa de estudos.

À FAPEMIG pelo apoio financeiro.

“O correr da vida embrulha tudo. A vida é assim: esquenta e esfria,

aperta e daí afrouxa, sossega e depois desinquieta.

O que ela quer da gente é coragem.”

João Guimarães Rosa

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... i

LISTA DE TABELAS.............................................................................................. iv

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS...................................... v

RESUMO................................................................................................................... vii

ABSTRACT............................................................................................................... vii

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS.......................................................................................................... 5

2.1. Objetivos gerais............................................................................................. 6

2.2. Objetivos específicos..................................................................................... 6

3. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 7

3.1. Pseudobrickellia brasiliensis.......................................................................... 8

3.2. Metabolismo vegetal...................................................................................... 9

3.3. Óleo essencial................................................................................................. 10

3.4. Atividade antiinflamatória........................................................................... 13

3.5. Atividade antioxidante.................................................................................. 15

4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 19

4.1. Materiais, equipamentos e técnicas utilizadas............................................ 20

4.2. Coleta e identificação do material vegetal.................................................. 22

4.3. Estudo Fitoquímico....................................................................................... 22

4.4. Ensaios Biológicos......................................................................................... 30

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 34

5.1. Estudo Fitoquímico....................................................................................... 35

5.2. Ensaios Biológicos......................................................................................... 65

6. CONCLUSÃO....................................................................................................... 73

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 75

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Terpenos identificados por Bohlmann et al. (1984) em extrato apolar

de partes aéreas de P. brasiliensis..........................................................

10

Figura 2. Estruturas gerais dos principais metabólitos secundários...................... 12

Figura 3. Reação do ácido gálico com molibdênio, componente do reagente

Folin-Ciocalteau......................................................................................

16

Figura 4. Reação de redução do DPPH.................................................................. 17

Figura 5. Reação de formação do Azul da Prússia através de compostos

redutores..................................................................................................

18

Figura 6. Pseudobrickellia brasiliensis (A- Planta inteira; B- Folhas).................. 23

Figura 7. Cidade de Diamantina no estado de Minas Gerais................................. 23

Figura 8. Preparação de extratos brutos................................................................. 25

Figura 9. Triagem fitoquímica do EHE................................................................. 26

Figura 10. Triagem fitoquímica do EAE................................................................. 26

Figura 11. Triagem fitoquímica do EET.................................................................. 27

Figura 12. Triagem fitoquímica do EAQ................................................................. 28

Figura 13. Partição de EAE e EET.......................................................................... 29

Figura 14. Cromatograma do óleo essencial obtido por CG em coluna DB5-MS.. 35

Figura 15. Espectro de massas do α-tujeno............................................................. 36

Figura 16. Espectro de massas do α-pineno............................................................. 36

Figura 17. Espectro de massas do sabineno............................................................. 37

Figura 18. Espectro de massas do β-pineno............................................................. 37

Figura 19. Espectro de massas do β-mirceno.......................................................... 37

Figura 20. Espectro de massas do α-felandreno...................................................... 37

Figura 21. Espectro de massas do α-terpineno........................................................ 38

Figura 22. Espectro de massas do p-cimeno............................................................ 38

Figura 23. Espectro de massas do limoneno............................................................ 38

Figura 24. Espectro de massas do Z-β-ocimeno...................................................... 38

Figura 25. Espectro de massas do E-β-ocimeno...................................................... 39

Figura 26. Espectro de massas do γ-terpineno......................................................... 39

Figura 27. Espectro de massas do α-terpinoleno..................................................... 39

Figura 28. Espectro de massas do α-terpineol......................................................... 39

ii

Figura 29. Espectro de massas do δ-elemeno.......................................................... 40

Figura 30. Espectro de massas do α-copaeno.......................................................... 40

Figura 31. Espectro de massas do E-cariofileno...................................................... 40

Figura 32. Espectro de massas do α-humuleno....................................................... 40

Figura 33. Espectro de massas do germacreno D.................................................... 41

Figura 34. Espectro de massas do biciclogermacreno............................................. 41

Figura 35. Espectro de massas do α-muuroleno...................................................... 41

Figura 36. Espectro de massas do δ-cadineno......................................................... 41

Figura 37. Espectro de massas do germacreno B.................................................... 42

Figura 38. Espectro de massas do espatulenol......................................................... 42

Figura 39. Espectro de massas do óxido de cariofileno........................................... 42

Figura 40. Obtenção, partição e fracionamento de extratos brutos de P.

brasiliensis..............................................................................................

45

Figura 41. Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EHE........ 45

Figura 42. Cromatograma de EHE1 obtido por CG em coluna DB17-MS............. 46

Figura 43. Espectro de massas do ácido caurenóico................................................ 47

Figura 44. Espectro de massas do acetato de β-amirina.......................................... 48

Figura 45. Espectro de massas de acetato de α-amirina.......................................... 48

Figura 46. Espectro de massas de acetato de lupeol................................................ 48

Figura 47. Espectro de RMN de 1H da fração EHE1 (CDCl3; 200 MHz)............... 49

Figura 48. Espectro de RMN de 13C da fração EHE1 (CDCl3; 50 MHz)................ 50

Figura 49. Subespectro DEPT-135 de EHE1 (CDCl3; 50 MHz)............................. 52

Figura 50. Cromatograma de EHE4 obtido por CG em coluna DB17-MS............. 52

Figura 51. Espectro de massas de β-amirina........................................................... 53

Figura 52. Espectro de massas de α-amirina........................................................... 54

Figura 53. Espectro de massas de lupeol................................................................. 54

Figura 54. Cromatograma da fração EHE5 obtido por CG em coluna DB5-MS.... 55

Figura 55. Espectro de massas de pseudotaraxasterol............................................. 56

Figura 56. Espectro de massas de taraxasterol........................................................ 56

Figura 57. Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EAE........ 57

Figura 58. Cromatograma da fração EAE1 obtido por CG em coluna DB5-MS.... 58

Figura 59. Espectro de massas da crisanina............................................................. 59

Figura 60. Espectro de RMN de 1H da fração EAE1 (CDCl3; 200 MHz)............... 60

iii

Figura 61. Espectro de RMN de 13C da fração EAE1 (CDCl3; 50 MHz)................ 61

Figura 62. Espectro de IV da fração EAE2............................................................. 61

Figura 63. Fracionamento e identificação dos constituintes químicos do EET....... 63

Figura 64. Fracionamento do EAQ.......................................................................... 64

Figura 65. População de linfócitos estimulados a expressarem a citocina IFN-γ.... 66

Figura 66. Potencial imunomodulador para as citocinas IFN-γ , TNF-α e IL-10.... 67

Figura 67. Curva de regressão linear do padrão AT nas concentrações 100, 200,

300, 400 e 500 ppm................................................................................

68

Figura 68. Porcentagem de ARR dos extratos de P. brasiliensis e do padrão

ácido gálico.............................................................................................

70

Figura 69. Poder redutor dos extratos de P. brasiliensis......................................... 71

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Taxonomia de P. brasiliensis................................................................ 9

Tabela 2. Preparo das culturas para ensaio antiinflamatório................................. 31

Tabela 3. Terpenóides do óleo essencial de folhas frescas de P. brasiliensis....... 43

Tabela 4. Classes de metabólitos secundários detectadas nos extratos brutos de

folhas de P. brasiliensis.........................................................................

44

Tabela 5. Terpenos identificados em EHE1 por CG............................................. 46

Tabela 6. Atribuição dos sinais de hidrogênios de EHE1 (200 MHz, CDCl3)...... 49

Tabela 7. Atribuição dos sinais de carbono de EHE1 (50 MHz, CDCl3).............. 51



Tabela 10. Terpenos identificados em EAE1 por CG............................................. 58

Tabela 11. Quantidade de fenólicos totais nos extratos de P. brasiliensis.............. 69

Tabela 12. Atividade de retirada de radical de extratos de P. brasiliensis e do

antioxidante ácido gálico.......................................................................

70

Tabela 13. Poder redutor dos extratos de P. brasiliensis sobre o íon metálico

Fe3+.........................................................................................................

71

v

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

Abs Absorbância

ARR Atividade de Retirada de Radical

AG Ácido gálico

AT Ácido tânico

BFA Brefeldina A

BSA Albumina de soro bovino

CCC Cromatografia em Coluna Clássica

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CG Cromatografia Gasosa

CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

DMSO Dimetilsulfóxido

DP Desvio Padrão

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

IFN-γ Interferon gama

IL-10 Interleucina 10

IRR Índice de Retenção Relativo

IS Índice de Similaridade

IV Infravermelho

µL Microlitro

mM Milimolar

N.I. Não Identificado

nm Nanômetro

PBS Phosphate Buffered Saline

PBS-P Phosphate Buffered Saline Peptone

PBS-W Phosphate Buffered Saline Wash

PMA Acetato Miristato de Forbol

ppm Partes por milhão

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

rpm Rotações por minuto

vi

RPMI Meio de cultura desenvolvido pelo Roswell Park Memorial Institute

TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa

UV Ultravioleta

UV-VIS Ultravioleta-Visível

TR Tempo de Retenção

vii

RESUMO

Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob (Asteraceae) é uma

espécie de Asteraceae conhecida popularmente como arnica-do-mato, arnica-do-campo

ou simplesmente arnica. E utilizada na medicina popular contra machucados e dores no

corpo, porem a literatura carece de informações científicas, encontrando-se apenas um

artigo sobre estudo fitoquímico. Com o objetivo de contribuir para o estudo de P.

brasiliensis, esse trabalho relata o estudo fitoquímico e ensaios biológicos que

investigaram a atividade antiinflamatória e antioxidante de extratos das folhas da planta.

As folhas foram coletadas na cidade de Diamantina, no Campus JK da UFVJM. Uma

parte das folhas ainda frescas foi utilizada para extração de óleo essencial, e outra parte

do material vegetal foi seco e submetido à extração com solventes de diferentes

polaridades – hexano, acetato de etila, etanol e água – obtendo-se quatro extratos. Os

constituintes do óleo essencial foram identificados por CG-EM, encontrando-se 25

terpenos, sendo os majoritários os monoterpenos α-tujeno (17,21%) e α-pineno

(32,61%). Os extratos foram submetidos a técnicas cromatográficas clássicas e suas

frações foram analisadas por CG-EM, IV, RMN de 1H e 13C, identificando-se o

diterpeno acido caurenóico; os triterpenos β-amirina, acetato de β-amirina, α-amirina,

acetato de α-amirina, lupeol, acetato de lupeol, pseudotaraxasterol, taraxasterol; e

possivelmente uma lactona sesquiterpênica. Em ensaios de triagem fitoquímica

realizados com os extratos, foram detectadas as classes de metabólitos secundários:

cumarinas, flavonóides, taninos condensáveis, antocianinas, antraquinonas, saponinas,

compostos redutores e triterpenos/esteróides. A espécie apresentou um potencial

antiinflamatório, uma vez que os extratos aquoso e etanólico modularam a produção da

citocina IFN-γ, envolvida diretamente na inicialização e amplificação da resposta

inflamatória. Os extratos apresentaram baixo potencial antioxidante, nas concentrações

avaliadas e nos ensaios de atividade de retirada de radical, e de poder de redução do íon

metálico Fe3+, apesar dos extratos aquoso e etanólico possuírem compostos fenólicos.

Sendo assim, o presente trabalho foi uma contribuição para o estudo fitoquímico e de

atividades biológicas desta planta.

Palavras-chave: Pseudobrickellia brasiliensis, fitoquímica, atividade antiinflamatória,

atividade antioxidante.

viii

ABSTRACT

Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob (Asteraceae) is a

species of Asteraceae popularly known as arnica-do-mato, arnica-do-campo or arnica

simply. It is used in folk medicine against wounds and body aches, but there lack of

scientific literature and found only one article on phytochemical study. Aiming to

contribute to the study of P. brasiliensis, this work reports the phytochemical and

biological tests that investigated the anti-inflammatory and antioxidant activity of

extracts of the leaves. The leaves were collected in the city of Diamantina, in the

Campus JK of UFVJM. Part of the leaves still fresh, were used for extraction of

essential oil, and another part of the plant material was dried and subjected to extraction

with solvents of different polarities - hexane, ethyl acetate, ethanol and water - resulting

in four extracts. The constituents of the essential oil were identified by GC-MS and was

found 25 terpenes, of which the major was the monoterpenes α-thujene (17.21%) and α-

pinene (32.61%). The extracts were subjected to classical chromatographic techniques

and their fractions were analyzed by GC-MS, IR, 1H and 13C NMR, identifying the

diterpene kaurenoic acid, triterpenes β-amyrin acetate, β-amyrin, α-amyrin, α-amyrin

acetate, lupeol acetate, lupeol, pseudotaraxasterol, taraxasterol, and possibly a

sesquiterpene lactone. In tests conducted with phytochemical extracts were detected

classes of secondary metabolites, coumarins, flavonoids, condensed tannins,

anthocyanins, anthraquinones, saponins, reducing compounds and triterpenes/steroids.

The species had an anti-inflammatory potential, because the aqueous and ethanol

extracts modulate the production of the cytokine IFN-γ, directly involved in the startup

and amplification of the inflammatory response. The extracts showed lower antioxidant

potential, and concentrations evaluated in the trials of withdrawal of radical activity, and

power reduction of Fe3+ metal ion, despite the aqueous and ethanol extracts possess

phenolic compounds. Thus, the present work was a contribution to the study

phytochemical and biological activities of this plant.

Keywords: Pseudobrickellia brasiliensis, phytochemistry, anti-inflammatory activity,

antioxidant activity.

1

11111111........ IIIIIIIInnnnnnnnttttttttrrrrrrrroooooooodddddddduuuuuuuuççççççççããããããããoooooooo

2

1. INTRODUÇÃO

O Brasil possui uma das maiores biodiversidades do mundo, estimada em cerca

de 20% do número total de espécies do planeta (CALIXTO, 2003). Com a grandeza de

seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida

e de outros biomas únicos no planeta, não pode abdicar de sua vocação para o estudo de

produtos naturais (PINTO et al., 2002).

Esse imenso patrimônio genético tem valor econômico-estratégico inestimável

no campo do desenvolvimento de novos medicamentos. Estima-se que 25% dos

medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram desenvolvidos a partir de plantas

(CALIXTO, 2003). Além disso, muitas plantas são utilizadas por diversas populações

com fins terapêuticos.

Segundo a RDC nº 10 de 9 de março de 2010 (BRASIL, 2010) plantas

medicinais são espécies vegetais, cultivadas ou não, utilizadas com propósitos

terapêuticos. Podem ser usadas como chás, extratos brutos ou suas frações padronizadas

em preparações farmacêuticas, como tinturas, extratos fluidos, em pó, comprimidos e

cápsulas; seus compostos isolados podem ser usados diretamente na composição de

medicamentos ou como precursores em processos de síntese ou semi-síntese de

fármacos (RATES, 2001).

A utilização de plantas com fins medicinais, para tratamento, cura e prevenção

de doenças, é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade

(VEIGA Jr. et al.,2005). As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas

medicinais contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas

dos vegetais, tornando válidas informações que foram sendo acumuladas durante

séculos (MACIEL et al., 2002).

Está comprovado hoje, que grande parte da população mundial, principalmente

aquelas de países em desenvolvimento usa como remédios as preparações oriundas de

plantas (MONTANARI & BOLZANI, 2001). Isso ocorre porque o conhecimento sobre

essas plantas representa muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas

comunidades e grupos étnicos (MACIEL et al., 2002).

As pesquisas com plantas medicinais envolvem várias etapas de investigação: 1-

a medicina tradicional; 2- isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos;

3- investigação farmacológica e toxicológica de extratos e dos constituintes químicos

isolados; 4- transformações químicas de princípios ativos; 5- estudo da relação

3

estrutura/atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (MACIEL et al.,

2002).

Essas pesquisas têm diversos objetivos, sendo os mais comuns, aqueles voltados

para o descobrimento de estruturas químicas com as quais se possam desenvolver novos

produtos terapêuticos. No entanto, segundo Kong et al. (2011), na atualidade a

descoberta de moléculas novas e interessantes do ponto de vista estrutural e de atividade

biológica está se tornando difícil mesmo com grandes avanços nas técnicas de

purificação e análise estrutural. Assim, atualmente, o foco de uma parte das pesquisas

na área de produtos naturais é o estudo das plantas medicinais (seus princípios ativos,

marcadores químicos, a comprovação de sua atividade farmacológica, a verificação de

sua toxicidade, e a realização de ensaios biológicos diversos) para fornecer subsídios

para o desenvolvimento de fitoterápicos ou para validação de seu uso popular ou ainda

conhecer potenciais atividades biológicas de seus extratos.

Dentre os biomas brasileiros, o Cerrado se destaca como um dos mais ricos e

ameaçados ecossistemas mundiais, sendo considerado um dos ‘hotspots’ para a

conservação da biodiversidade, devido à 54,9% de sua área ter sido devastada até o ano

de 2002 (MYERS et al., 2000; MACHADO et al., 2004; KLINK & MACHADO,

2005). Possuindo uma flora estimada em aproximadamente 7 mil espécies, é o segundo

bioma brasileiro de maior diversidade vegetal (MENDONÇA et al., 1998). Ocupava

originalmente uma área de aproximadamente 1,8 milhão de km², cerca de 21% do

território nacional, cortando diagonalmente o país no sentido nordeste-sudoeste

(AGUIAR & CAMARGO, 2004).

No bioma ocorrem diferentes formações vegetais, florestais, savânicas, lenhosas

e campestres, com várias fitofisionomias denominadas de cerrado, cerradão, mata de

galeria, campo, vereda, entre outros (AGUIAR & CAMARGO, 2004).

O uso de plantas do Cerrado na medicina popular brasileira é muito difundido,

sendo utilizadas aproximadamente 270 espécies com diversos fins terapêuticos

(VIEIRA & MARTINS, 2000). Muitas plantas medicinais e alimentícias são usadas e

comercializadas, gerando alimentos alternativos e renda adicional para as comunidades.

Arnica, casca-de-barbatimão, velame, frutos de sucupira, mangaba, pequi, sempre-

vivas, folhas e palmitos de palmeiras estão entre as principais coletadas (AGUIAR &

CAMARGO, 2004).

Umas das famílias com maior relevância no cerrado é a Asteraceae. A família é

uma das mais importantes como fonte de espécies vegetais de valor medicinal dentro da

4

ordem Asterales. Inclui espécies arbustivas, arbóreas, trepadeiras e ervas, sendo que a

maioria são espécies de pequeno porte (DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002).

Asteraceae é a família que contém o maior número de espécies de plantas do

planeta, 24.000-30.000, distribuídas em 1.600-1.700 gêneros que ocorrem em todos os

continentes exceto na Antártida, o que equivale a 10% do total de plantas existentes no

mundo (FUNK et al., 2005).

Dentre as espécies da família Asteraceae que são endêmicas do cerrado,

podemos destacar a Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob. Essa

planta medicinal não apresenta nenhum estudo de suas atividades biológicas, havendo

somente um estudo da composição química de seu extrato apolar realizado em 1984 por

Bohlmann e colaboradores.

Apesar do aumento de estudos na área de produtos naturais nas últimas décadas,

apenas um pequeno percentual de plantas conhecidas foram estudadas quanto ao seu

potencial medicinal e/ou sua composição química. Assim, as plantas endêmicas ainda

são pouco conhecidas e se constituem num fascinante assunto de pesquisa acadêmica e

de desenvolvimento de novos fármacos ou fitoterápicos (SOEJARTO, 1996; PINTO et

al., 2002).

5

22222222........ OOOOOOOObbbbbbbbjjjjjjjjeeeeeeeettttttttiiiiiiiivvvvvvvvoooooooossssssss

6

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVOS GERAIS

O presente trabalho objetivou o estudo fitoquímico e a realização de ensaios

biológicos de extratos de folhas de Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King &

H. Rob. (Asteraceae).

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Coleta de folhas de P. brasiliensis e preparo de extratos brutos de diferentes

polaridades;

� Extração, identificação e quantificação dos componentes químicos do óleo

essencial das folhas de P. brasiliensis por CG-EM;

� Determinação qualitativa dos principais grupos de metabólitos secundários nos

extratos da planta, através de ensaios cromogênicos, de precipitação e CCD;

� Fracionamento e isolamento de metabólitos secundários de extratos de P.

brasiliensis;

� Identificação dos compostos químicos isolados através de técnicas

espectrométricas e hifenadas (CG-EM, IV, RMN 1H e RMN 13C);

� Avaliação do potencial antiinflamatório de extratos de P. brasiliensis;

� Avaliação do potencial antioxidante de extratos de P. brasiliensis.

7

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lllllllliiiiiiiitttttttteeeeeeeerrrrrrrraaaaaaaattttttttuuuuuuuurrrrrrrraaaaaaaa

8

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1. Pseudobrickellia brasiliensis

O gênero Pseudobrickellia é composto por três espécies endêmicas, de

ocorrência apenas no Brasil: P. angustissima (Spreng. ex Baker) R.M. King & H. Rob.,

P. brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob., e P. irwinii R.M. King & H. Rob.

(FORZZA et al., 2010).

A espécie Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H. Rob. é uma

planta pertencente à tribo Eupatorieae, derivada da família Asteraceae, que é encontrada

nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Goiás, Mato Grosso, Bahia e Pernambuco, em

regiões de cerrado, campo rupestre, e campo sujo (RIBEIRO et al., 2001; ALMEIDA et

al., 2004; BRASIL, 2004; MUNHOZ, 2007; VIANA, 2007; HATTORI &

NAKAJIMA, 2008; KAMINO et al., 2008; REIS, 2008).

Conhecida popularmente como arnica-do-mato, arnica-do-campo, ou

simplesmente arnica, suas folhas, o caule, ou a planta inteira macerada ou curtida no

álcool são utilizadas na medicina popular para o tratamento de machucados e dores no

corpo (RIBEIRO et al., 2001; REIS, 2008; CARNEIRO, 2009).

Sua descrição botânica segundo Hattori & Nakajima (2008) consiste em:

Subarbusto de 1,3 m de altura; ramos cilíndricos, costados, glabros. Folhas simples, alternas, densamente espiraladas, sésseis, limbo 9–21 x 0,5 mm, linear; ápice agudo, margens ciliadas, base obtusa; ambas as faces glabras. Capítulos discóides, pedunculados, em corimbos; invólucro campanulado, 4–6 mm de comprimento, 1,5–3 mm diâmetro; brácteas involucrais 13, 4-seriadas, 2–6 x 1–1,5 mm, lanceoladas, ápice agudo, margens inteiras, glabras; receptáculo plano, epaleáceo, glabro. Flores 5, creme, monóclinas, corola tubulosa, tubo 4–4,5 mm de comprimento, 1,2 mm diâmetro, internamente glabro, fauce infundibuliforme, lobos 1 x 0,4 mm, glabros; anteras com apêndice apical obtuso, base obtusa; ramos do estilete clavelados, curto-papilosos, ápice arredondado, sem pilosidade abaixo do ponto de bifurcação. Cipsela cilíndrica, 2,5–3 mm de comprimento, 0,9 mm de diâmetro, setosa, 10-costada, costas ciliadas; papilho cerdoso, 2-seriado, série interna 5 mm, série externa 1,2 mm.

A Tabela 1 (pág. 9) indica a taxonomia da espécie.

A espécie em questão possui somente um estudo de Bohlmann e colaboradores

(1984), em que os pesquisadores fizeram extração das partes aéreas de P. brasiliensis

com éter etílico e éter de petróleo 1:2. Após fracionamento e isolamento

cromatográfico, os autores puderam verificar a presença dos sesquiterpenos 4β-

hidroxigermacra-1(10),5-dieno, espatulenol, γ-cadineno, α-cadinol, oplopanona, e dos

triterpenos, lupeol, isômero de lupeol, acetato de β-amirina, 11α-hidroxi-α-amirina e

provavelmente 11α-hidroxi-β-amirina (Fig. 1, pág. 10).

9

Tabela 1. Taxonomia de P. brasiliensis.

Táxons

Classe Equisetopsida

Subclasse Magnoliidae

Superordem Asteranae

Ordem Asterales

Família Asteraceae

Tribo Eupatorieae

Subtribo Alomiinae

Gênero Pseudobrickellia

Espécie P. brasiliensis

Fontes: KING & ROBINSON, 1972; BOHLMANN et al., 1984;

www.tropicos.org/Name/2716144

3.2. METABOLISMO VEGETAL E PESQUISA FITOQUÍMICA

O conjunto de reações químicas que ocorrem em um organismo é chamado de

metabolismo. Além do metabolismo primário, responsável pela produção de celulose,

lignina, proteínas, lipídios, açúcares e outras substâncias que realizam suas principais

funções vitais, as plantas também apresentam o chamado metabolismo secundário, do

qual resultam substâncias de baixo peso molecular, às vezes produzidas em pequenas

quantidades (ALVES, 2001).

Os metabólitos secundários é que são, em sua maioria, responsáveis pelos efeitos

medicinais, ou tóxicos das plantas, além de apresentarem grande importância ecológica,

pois atraem potenciais agentes polinizadores ou dispersores de sementes, e estão

relacionados com a defesa química do vegetal contra estresse ambiental, atuando em sua

sobrevivência e preservação (BALADRIN et al., 1985; DI STASI, 1996; SIMÕES et

al., 2007).

Eles tem uma distribuição restrita no reino vegetal, ou seja, nem todos os

metabólitos secundários são encontrados em todos os grupos de plantas. São

sintetizados de forma não generalizada, tendo muitas vezes a sua produção restrita a

uma determinada família, um gênero ou mesmo uma espécie (GARCÍA & CARRIL,

2009).

O acúmulo e a composição dos metabólitos secundários em plantas podem ser

influenciados por diversos fatores, os principais são: sazonalidade, ritmo circadiano,

10

Δ12

∆12

Sesquiterpenos:

OH

4ß-hidroxigermacra-1(10),5-dieno

H

HO

Espatulenol

gama-cadinenoH

H

alfa-cadinol

H

HOH

OplopanonaH

HOH

O

Triterpenos:

HO

H

H

H

H

Lupeol

HO

H

H

H

Isômero de Lupeol

HO

H

H

11-alfa-hidroxi-beta-amirina

H

HO

H

HO

H

H

11-alfa-hidroxi-alfa-amirina

H

H

HO

O

H

H

O

Acetato de beta-amirina

H

Figura 1. Terpenos identificados por Bohlmann et al. (1984) em extrato apolar de

partes aéreas de P. brasiliensis

11

altitude, temperatura, índice pluviométrico, radiação UV, composição atmosférica,

água, nutrientes, herbivoria e ataque de patógenos (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

Além disso, a genética e o desenvolvimento individual também influenciam no

metabolismo secundário (BÜTER, 1998; SUDATTI, 2004).

O uso das plantas para fins medicinais tem despertado um grande interesse pelo

conhecimento da composição química dos vegetais. Para o estudo da composição

química de um determinado vegetal, são coletados órgãos (folhas, flores, frutos, caule

e/ou raízes), dos quais são obtidas drogas derivadas, tais como, extratos, tinturas, óleo

essencial, mucilagem (CSEKE et al., 2006; SIMÕES et al., 2007).

A pesquisa fitoquímica tem por objetivos conhecer os constituintes químicos das

espécies vegetais ou avaliar sua presença nos mesmos. Quando não se dispõe de estudos

químicos sobre a espécie de interesse, a triagem fitoquímica pode identificar a presença

de grupos de metabólitos secundários relevantes (SIMÕES et al., 2007).

A triagem fitoquímica normalmente é realizada através de ensaios qualitativos

(reações cromogênicas e de precipitação, e análise por CCD) que indicam a possível

presença ou ausência de grupos de metabólitos secundários (COSTA, 2002; SIMÕES et

al., 2007). Os principais metabólitos secundários de plantas pesquisadas nos ensaios de

triagem são cumarinas, flavonóides, taninos, antocianinas, derivados de

antracenosídeos, alcalóides, saponinas, triterpenos e esteróides (Fig. 2, pág. 12).

A identificação estrutural dessas substâncias em um extrato de planta é feita,

geralmente, a partir de procedimentos exaustivos de isolamento, purificação e análises

através de métodos cromatográficos e espectrométricos (PATITUCCI et al., 1995).

3.3. ÓLEO ESSENCIAL

Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, e

geralmente odoríferas e líquidas. Geralmente possuem um sabor acre e picante;

normalmente são incolores ou levemente amarelados; apresentam densidade geralmente

menor do que a água; são pouco estáveis, principalmente na presença de ar, luz, calor,

umidade e metais; a maioria possui índice de refração e são opticamente ativos

(SIMÕES et al., 2007).

Quimicamente, a maioria dos óleos voláteis é constituída de derivados

fenilpropanóides ou de terpenóides, sendo que esses últimos preponderam (SANGWAN

et al., 2001; SIMÕES et al., 2007). O perfil terpênico apresenta normalmente

substâncias constituídas de moléculas de dez e de quinze carbonos (monoterpenos e

12

O O

Cumarina

O

O

Flavonóide

COOH

OH

HO OH

Ácido gálico (e derivados) presentes em tanino hidrolisável

O

OH

HO

Monômero de tanino condensado

O

OH

+

Antocianina

OH O OH

Derivado de antracenosídeo

O

HO

H

R

Esteróide

RO

Saponina

R= açúcar

HO

H

H

Triterpeno

NH

N

N

N

NN

O

Esqueletos básicos de alguns Alcalóides

Figura 2. Estruturas gerais dos principais metabólitos secundários

13

sesquiterpenos), mas, dependendo do método de extração e da composição da planta,

terpenos menos voláteis podem aparecer na composição do óleo essencial (assim como

podem se perder os elementos mais leves) (SIANI et al., 2000).

Geralmente são encontrados em folhas e flores, mas também podem estar em

outros órgãos vegetais. São utilizados em indústrias farmacêuticas, de cosméticos,

perfumaria, de domissaneantes e alimentícias (SANGWAN et al., 2001).

Um método muito comum de análise da composição química do óleo essencial é

a Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM). Em geral, para

a identificação dos componentes químicos, analisa-se o espectro de massas e o Índice de

Retenção Relativo (IRR) de cada componente da amostra (ADAMS, 1995;

BABUSHOK & ZENKEVICH, 2009).

O IRR pode ser determinado através de CG, co-injetando a amostra do óleo

essencial com uma série homóloga de hidrocarbonetos lineares e alifáticos. Após a

obtenção do cromatograma com os tempos de retenção dos componentes do óleo e dos

hidrocarbonetos, são aplicados cálculos para obtenção de IRR de cada componente do

óleo (VAN DEN DOLL & KRATZ, 1963). Cada IRR calculado é comparado com o

IRR na literatura para um determinado componente do óleo essencial (ADAMS, 1995;

BABUSHOK & ZENKEVICH, 2009).

3.4. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA

As respostas imunes são estimuladas quando o organismo está ameaçado. A

ativação do sistema imune frente à colonização por agentes infecciosos propaga o

distúrbio na balança fisiológica do hospedeiro o qual dispõe de mecanismos reguladores

para o retorno à homeostase, no entanto, em algumas situações esse poderá estar

prejudicado (HOLLAND & VIZI, 2002).

Os imunomoduladores são agentes capazes de modificar a resposta imune,

podendo o efeito ser estimulatório ou inibitório (DUTTA, 2002). Os imunoestimulantes

estimulam os mecanismos que envolvem tanto a imunidade inata quanto a imunidade

adquirida, através da ativação de células e mediadores, enquanto os imunossupressores

agem seletivamente sobre os mecanismos envolvidos na imunidade adquirida

deprimindo-os (STITES & TERR, 1995).

Com a descoberta dos imunomoduladores tornou-se possível a manipulação do

sistema imune na tentativa de reduzir os efeitos associados à quimioterapia, à rejeição

de enxertos, à doenças alérgicas, e à doenças cancerígenas (DUTTA, 2002) .

14

Dentre os imunomoduladores, destacam-se os produtos de origem vegetal e

microbiana, as drogas sintéticas, além das proteínas derivadas da ativação do próprio

sistema imune (MASIHI, 2000).

Dentre os mediadores endógenos, liberados, primeiramente, pelas células

residentes e, posteriormente, pelas células recrutadas para o foco infeccioso, as citocinas

desempenham um papel primordial na resposta do hospedeiro (BENJAMIM, 2001).

Citocinas são proteínas de baixo peso molecular produzidas por diferentes tipos

celulares do sistema imune. A produção de citocinas é desencadeada quando as células

são ativadas por diferentes estímulos, como agentes infecciosos, tumores ou estresse. As

citocinas atuam na comunicação entre as células, promovendo a indução ou regulação

da resposta imune (BILATE, 2007).

As citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IFN-γ são respectivamente importantes

na resposta inflamatória aguda a bactérias gram-negativas e outros microorganismos

infecciosos e responsável por muitas complicações sistêmicas de infecções graves; e na

ativação de macrófagos e exercício de funções críticas na imunidade natural e na

imunidade adquirida mediada por células contra microorganismos intracelulares

(ABBAS et. al., 2008).

A citocina antiinflamatória IL-10 é um inibidor de macrófagos e células

dendríticas ativados e está, portanto, envolvida no controle das reações da imunidade

natural e da imunidade mediada por células (ABBAS et. al., 2008).

Inflamação é um mecanismo de defesa do organismo caracterizado por uma

série de alterações bioquímicas, fisiológicas e imunológicas para responder a estímulos

agressivos. A reação inflamatória produz calor, rubor, tumor, dor e perda de função do

tecido lesionado. Apesar de ser um mecanismo de defesa, o complexo de eventos e os

mediadores envolvidos no processo inflamatório, podem manter ou agravar muitas

doenças. Por isso, em alguns casos, há a necessidade de utilização de antiinflamatórios

(FALCÃO et al., 2005).

A citometria de fluxo vem sendo uma ferramenta importante no estudo dos

eventos celulares envolvidos na resposta imunológica e inclui métodos para a avaliação

de efeitos sobre a população analisada, como, por exemplo, ativação e proliferação

celulares, para a identificação de eventuais modificações que ocorrem dentro e fora das

células e na análise das substâncias produzidas e secretadas pelas células em estudo

(SHAPIRO, 1985).

15

3.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do nosso metabolismo e,

assim, os radicais são produzidos naturalmente. No organismo, encontram-se

envolvidos na produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular,

sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes (BARREIROS et

al., 2006).

No entanto, em excesso, os radicais e outros oxidantes, tais como espécies

reativas de oxigênio, espécies reativas de nitrogênio, radicais derivados de tióis,

espécies reativas de cloro, espécies reativas de carbono e complexos de metais de

transição, principalmente Fe, Cu, Mn e Cr, causam danos ao DNA ou podem oxidar

lipídios e proteínas. Estão envolvidos no processo de envelhecimento e nas doenças

degenerativas associadas ao envelhecimento, como câncer, doenças cardiovasculares,

catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais (SOUSA et al., 2007;

OLIVEIRA et al., 2009).

O excesso de radicais no organismo é combatido por antioxidantes endógenos,

destacando-se as superóxido dismutases, consideradas como a linha de frente de defesa

antioxidante, a catalase e as glutationas peroxidases; ou absorvidos da dieta, como as

vitaminas C, E e A, carotenóides, flavonóides, outros polifenóis, furanóides e tióis e

produtos sintéticos (ex.: N-acetilcisteína) (BARREIROS et al., 2006; OLIVEIRA et al.,

2009).

Antioxidantes são as substâncias que presentes em concentrações baixas,

comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou inibem a oxidação do

substrato. Os radicais formados a partir de antioxidantes não são reativos, sendo

neutralizados por reação com outro radical, formando produtos estáveis ou podem ser

reciclados por outro antioxidante (SOUSA et al., 2007).

Os compostos fenólicos de origem vegetal são considerados agentes

antioxidantes e se enquadram em diversos grupos de metabólitos secundários, como

fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ácidos benzóico e cinâmico), cumarinas,

flavonóides, estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas

(SOUSA et al., 2007).

A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas

propriedades redutoras e estrutura química. Estas características desempenham um

papel importante na neutralização ou seqüestro de espécies radicalares e quelação de

metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo

16

oxidativo. Os intermediários formados pela ação de antioxidantes fenólicos são

relativamente estáveis, o elétron desemparelhado entra em ressonância com a nuvem

eletrônica do anel aromático (SOUSA et al., 2007).

A quantificação de compostos fenólicos em extratos vegetais é realizada por

meio de uma variedade de métodos; todavia, o que utiliza o reagente de Folin-

Ciocalteau é o mais extensivamente empregado (ABDILLE et al., 2005).

O reagente de Folin-Ciocalteau consiste de uma mistura dos ácidos

fosfomolibídico e fosfotunguístico, na qual o molibdênio e o tungstênio se encontram

no estado de oxidação 6 (cor amarela no complexo Na2MoO4.2H2O); porém, em

presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os

chamados complexos molibdênio-tungstênio azuis [(PMoW11O4)4-], nos quais a média

do estado de oxidação dos metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a

determinação da concentração das substâncias redutoras (SINGLETON et al., 1999;

HUANG et al., 2005).

A Figura 3 mostra a desprotonação do ácido gálico (composto fenólico de

origem vegetal) em meio básico, gerando os ânions fenolatos. A partir daí, ocorre uma

reação de oxirredução entre o ânion fenolato e o reagente de Folin-Ciocalteau, na qual,

segundo Singleton e colaboradores (1999) o molibdênio, componente do reagente, sofre

redução e o meio reacional muda de coloração amarela para azul (absorção no

comprimento de onde de 765 nm).

Figura 3. Reação do ácido gálico com molibdênio, componente do reagente Folin-

Ciocalteu

17

Diversas técnicas têm sido utilizadas para determinar a atividade antioxidante in

vitro, de forma a permitir uma rápida seleção de substâncias e/ou misturas

potencialmente interessantes. Dentre estes métodos destaca-se o método de seqüestro de

espécies radicalares (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).

O radical DPPH é um cromóforo muito estável, com um pico de absorção no

comprimento de onda de 517 nm, em meio alcoólico, apresentando solução de

coloração violeta intensa (BLOIS; 1958; ARNAO et al., 2000).

O método consiste em avaliar a atividade seqüestradora do radical 2,2-difenil-1-

picril-hidrazila (DPPH•), de coloração violeta. Por ação de um antioxidante ou uma

espécie radicalar (R•), o DPPH• é reduzido formando 2,2-difenilpicril-hidrazina (DPPH-

H), de coloração amarela (Figura 4), com conseqüente decréscimo da absorbância em

517 nm (OLIVEIRA et al., 2009).

Figura 4. Reação de redução do DPPH

Os métodos baseados na redução do Fe+3, que determinam o poder redutor são

também utilizados para avaliação do potencial antioxidante. Tais métodos avaliam a

capacidade de compostos fenólicos reduzirem o Fe+3, com conseqüente formação de um

complexo colorido com Fe+2 (ROGINSKY & LISSI, 2005).

Substâncias fenólicas reagem com o íon ferricianeto [Fe(CN)6]3- e são oxidadas,

enquanto [Fe(CN)6]3- é reduzido ao íon ferrocianeto [Fe(CN)6]

4-. O íon [Fe(CN)6]4-

então reage com o íon férrico (Fe3+) para formar ferrocianeto férrico ou hexacianeto de

ferro III (Fe4[Fe(CN)6]3), conhecido como Azul da Prússia (Fig. 5, pág. 18). Deste

modo, a formação da coloração azul medida a 700 nm pode ser usada para monitorar a

concentração de Fe2+ (GRAHAM, 1992).

18

[Fe(CN)6]3- + Compostos Redutores � [Fe(CN)6]

4-

Ferricianeto Ferrocianeto

3 [Fe(CN)6]4- + 4 Fe3+ � Fe4[Fe(CN)6]3

Ferrocianeto Ferrocianeto férrico Azul da Prússia

Figura 5. Reação de formação do Azul da Prússia através de compostos redutores

19

44444444........ MMMMMMMMaaaaaaaatttttttteeeeeeeerrrrrrrriiiiiiiiaaaaaaaaiiiiiiiissssssss eeeeeeee

MMMMMMMMééééééééttttttttooooooooddddddddoooooooossssssss

20

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAIS, EQUIPAMENTOS E TÉCNICAS UTILIZADAS

4.1.1. Solventes

Foram utilizados solventes orgânicos de grau comercial para o preparo dos

extratos, partição, fracionamento por CCC, análise por CCD, limpeza e união das

frações. Os solventes PA eram das marcas Dinâmica®, Impex®, Isofar®, Proquimios®

e Vetec®. A água foi destilada em Destilador Quimis®.

4.1.2. Concentração de solventes

Os solventes contidos nos extratos, fases e frações foram concentrados em

evaporador rotativo Fisatom® 802 a 40-50ºC sob pressão reduzida, e/ou secagem por

exposição à temperatura ambiente.

4.1.3. Balança

Para pesagem de todos os reagentes, materiais, frascos e extratos deste trabalho,

utilizou-se balança analítica Shimadzu® AY220.

4.1.4. Liofilizador

O extrato aquoso e as fases hidroalcoólicas foram liofilizados em liofilizador

Liotop® L101.

4.1.5. Cromatografia em coluna clássica (CCC)

As fases estacionárias usadas nas CCC foram Sílica Gel 60 0,060 – 0,200 mm

(Acrós-Organics®), e Sephadex® LH-20 (GE Healthcare®). Nas colunas de sílica gel, a

fase móvel foi por gradiente crescente de polaridade com os solventes hexano, acetato

de etila e etanol, e misturas dos mesmos. Já nas colunas de Sephadex®, a fase móvel foi

isocrática usando metanol.

4.1.6. Cromatografia em camada delgada (CCD)

Para a CCD foram empregadas placas de Sílica Gel 60 Whatman® 20 x 20 cm,

espessura 250 µm. A fase móvel foi preparada com os solventes hexano, acetato de etila

e etanol, e misturas dos mesmos de acordo com as características de polaridade de cada

amostra analisada. Como agentes reveladores foram usadas luz UV (λ = 254 e 366 nm)

21

(lâmpadas Sankyo Denk®), vanilina sulfúrica seguida de aquecimento da placa a 100-

110ºC e vapor de iodo.

4.1.7. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)

O óleo essencial e frações pouco polares dos extratos foram analisados por

Cromatógrafo Gasoso acoplado a Espectômetro de Massas (CG-EM) Shimadzu® CG-

EM-QP2010 do Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintéticos da FCFRP/USP.

4.1.7.1. Coluna e condições de análise do óleo essencial

Espectômetro equipado com coluna capilar DB-5-MS Agilent (30 m X 0,25 mm,

0,25 µm de espessura). Empregou-se o hélio como gás de arraste a uma pressão de

81,90 kPa, e fluxo de 1,33 mL/min. A temperatura no injetor foi de 250°C, a

temperatura do forno aumentou de 60 até 240°C a 3°C/min. O modo de ionização

utilizado foi ionização por elétrons a 70 eV.

4.1.7.2. Coluna e condições de análise dos demais terpenos

As amostras contendo terpenos foram analisadas em coluna DB-5-MS Agilent®

(30 m X 0,25 mm, 0,25 µm de espessura) ou DB-17-MS Agilent® (30 m X 0,25 mm,

0,25 µm de espessura), sob as seguintes condições:

� DB-5-MS: utilizou-se o hélio como gás de arraste a uma pressão de 182,20 kPa,

e fluxo de 1,50 mL/min; a temperatura no injetor foi de 260°C; a temperatura inicial da

coluna era 250°C (permanecendo por 12 min), aumentando para 280°C a 6°C/min

(sendo conservado por 20 min). O modo de ionização utilizado foi ionização por

elétrons a 70 eV.

� DB-17-MS: empregou-se o hélio como gás de arraste a uma pressão de 114,10

kPa, e fluxo de 1,40 mL/min; a temperatura no injetor foi de 260°C; a temperatura

inicial da coluna era 120°C, aumentando para 260°C a 20°C/min (permanecendo por 5

min), aumentando para 280°C a 2°C/min (sendo conservado por 9 min), aumentando

para 290°C a 2°C/min (permanecendo por 20 min). O modo de ionização utilizado foi

ionização por elétrons a 70 eV.

O 5-α-colestano (SIGMA®) foi usado como padrão interno. Os constituintes das

amostras foram identificados através de análise dos espectros de massas e comparação

de seus IRR calculados com o IRR de padrões de terpenos (isolados de extratos de

diversas plantas e identificados por RMN1H e RMN13C. A quantificação de cada

22

constituinte da mistura foi realizada através da área relativa dos picos dos

cromatogramas.

4.1.8. Ressonância magnética nuclear (RMN)

Foi utilizado espectrômetro Bruker® Avance DPX-200 para análise de algumas

amostras em solventes deuterados, com TMS como referência interna. Foram

registrados espectros de RMN1H (200 MHz), RMN13C (50 MHz) e DEPT-135 do

Departamento de Química da UFMG.

4.1.9. Infravermelho (IV)

Para análise de uma fração, foi utilizado o Espectrômetro Shimadzu® IR-408 do

Departamento de Química da UFMG. Para sólidos, os espectros são obtidos utilizando

pastilhas de KBr [1% (m/m)].

4.1.10. Ultravioleta-Visível (UV-VIS)

Nos ensaios de atividade antioxidante dos extratos, foi utilizado

espectrofotômetro UV-VIS Quimis® modelo Q798U2VS.

4.1.11. Citometria de fluxo

No teste de potencial antiinflamatório dos extratos, foi utilizado citômetro de

fluxo FACScan® (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

4.2. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL

No dia 21 de abril de 2010, às 7 horas e 45 minutos, foram coletadas folhas de P.

brasiliensis (Fig. 6, pág. 23), na cidade de Diamantina (Fig. 7, pág. 23), estado de Minas

Gerais, em área situada no Campus JK da Universidade Federal dos Vales do

Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM). A espécie está localizada em área de campo rupestre,

na altitude de 1.384 m, nas coordenadas Sul 18°12,164’ e Oeste 43°34,398’. Uma

exsicata foi depositada no Herbário DIAM/UFVJM sob o número 1296.

23

Figura 6. Pseudobrickellia brasiliensis (A- Planta inteira; B- Folhas)

Fotos: Wilson Muanis Godinho – com permissão

Figura 7. Cidade de Diamantina no estado de Minas Gerais

Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Diamantina

4.3. ESTUDO FITOQUÍMICO

4.3.1. Óleo essencial

4.3.1.1. Extração do óleo essencial

Os componentes voláteis foram extraídos mediante hidrodestilação por 2 horas e

20 minutos de 84,4912g de folhas frescas de P. brasiliensis, utilizando aparato de

Clevenger. O óleo foi coletado e armazenado em freezer até a análise. O rendimento

médio do óleo essencial foi obtido através da relação do volume de óleo obtido e a

massa de material vegetal fresco utilizada.

A B

24

4.3.1.2. Caracterização do óleo essencial

O óleo essencial foi analisado em Cromatógrafo a Gás acoplado a Espectômetro

de Massas (CG-EM). Posteriormente, sob as mesmas condições experimentais, a

amostra foi injetada novamente com uma série homóloga de n-alcanos (C9 – C24)-

Alltech® para obtenção de Índice de Retenção Relativa (IRR) de cada componente do

óleo.

Para a realização dos cálculos do IRR utilizou-se a equação abaixo de Van Den

Dool & Kratz (1963).

IRR = 100.n + 100. (tx – tn)/(tn+1 – tn)

Onde:

� n = número de átomos de carbono do hidrocarboneto eluído imediatamente

antes do composto “x” de interesse;

� tn = tempo de retenção do hidrocarboneto eluído imediatamente antes do

composto “x” de interesse;

� tn+1 = tempo de retenção do hidrocarboneto eluído imediatamente após o

composto “x” de interesse;

� tx = tempo de retenção do composto “x”.

A identificação dos compostos foi realizada por análise e comparação dos

espectros de massa com os do banco de dados da espectroteca Wiley 7 e por

comparação do IRR calculado de cada substância com o IRR da literatura (ADAMS,

1995; BABUSHOK & ZENKEVICH, 2009).

4.3.2. Preparação de extratos brutos

Foram dessecadas 184g de folhas de P. brasiliensis à temperatura ambiente,

protegidas da luz solar direta, por duas semanas, até peso constante. As folhas foram

rasuradas e armazenadas em recipientes de vidro âmbar. O método utilizado para a

preparação dos extratos foi a maceração, sendo os solventes usados sucessivamente para

a extração, o hexano, o acetato de etila, o etanol e a água, respectivamente (Fig. 8, pág.

25). Cada extração foi realizada em duplicata, e cada processo de maceração foi feito

por três dias. Ao término da maceração, os extratos hexânico, em acetato de etila e

etanólico foram filtrados e concentrados em evaporador rotativo (40-42oC, sob pressão

reduzida). Já o extrato aquoso foi filtrado, congelado e liofilizado. Ao final foram

obtidos quatro extratos de diferentes polaridades.

Figura 8. Preparação de extratos brutos

4.3.3. Triagem Fitoquímica

Foram pesquisados

secundários nos extratos da planta

cromogênicas, de precipitação e análise por CCD

Costa (2002) e Matos (1997) conforme a polaridade de cada extrato.

As figuras 9 à 12 (pág. 26 à 28) indicam os testes realizados na triagem

fitoquímica de alíquotas dos extratos e o resultado esperado no caso de reação positiva

para cada uma determinada classe de metabólito s

Folhas de P. brasiliensis

Maceração com hexano

Extrato hexânico (EHE)

Extrato em acetato de etila

(EAE)

Preparação de extratos brutos

. Triagem Fitoquímica

pesquisados qualitativamente os principais grupos de metabólitos

extratos da planta, por análise fitoquímica, que compreende reações

cromogênicas, de precipitação e análise por CCD. Os testes foram realizados

(1997) conforme a polaridade de cada extrato.


dos extratos e o resultado esperado no caso de reação positiva

para cada uma determinada classe de metabólito secundário.

Torta 1

Maceração com acetato de etila


(EAE)Torta 2

Maceração com etanol

Extrato etanólico (EET)

Torta 3

Maceração com água

Extrato aquoso (EAQ)

25

qualitativamente os principais grupos de metabólitos

, que compreende reações

Os testes foram realizados segundo


dos extratos e o resultado esperado no caso de reação positiva

Torta 3

Maceração com água

Torta 4

Figura 9. Triagem fitoquímica do EHE

Figura 10. Triagem fitoquímica do EAE

Extrato hexânico

Alcalóides: 3 mL de HCl 3% + Reativo de Mayer = Formação de precipitado (+)

Cumarinas: 1 mL de água fervendo. CCD móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Observação a 254 nm =

Manchas esverdeadas ou azul fluorescente (+)

Derivados antracênicos:

Flavonóides: 2 mL de metanol + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado. Aguardar 10

Triterpenos/esteróides:


Alcalóides: 3 mL de HCl 3% + Reativo de Mayer = Formação de precipitado (+)

Cumarinas: 1 mL de água fervendo. CCD móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Observação a 254 nm =



Flavonóides: 2 mL de metanol + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado. Aguardar 10

Triterpenos/esteróides:

Triagem fitoquímica do EHE

Triagem fitoquímica do EAE

3 mL de HCl 3% + Reativo de Mayer = Formação de precipitado (+)

1 mL de água fervendo. CCD - Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Observação a 254 nm =


Derivados antracênicos: 1 mL de NH4OH 25% = Coloração vermelha (+)

2 mL de metanol + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado. Aguardar 10-20 min = Cor avermelhada (+)

Triterpenos/esteróides: 1 mL de CHCl3 + Reativo de Liebermann Burchard = Anel verde com interface marrom (+)


1 mL de água fervendo. CCD - Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Observação a 254 nm =



2 mL de metanol + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado. Aguardar 10-20 min = Cor avermelhada (+)

Triterpenos/esteróides: 1 mL de CHCl3 + Reativo de Liebermann Burchard = Anel verde com interface marrom (+)

26


Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Observação a 254 nm =

OH 25% = Coloração vermelha (+)

2 mL de metanol + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado.

+ Reativo de Liebermann Burchard =


Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Observação a 254 nm =

OH 25% = Coloração vermelha (+)

2 mL de metanol + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado.

+ Reativo de Liebermann Burchard =

Figura 11. Triagem fitoquímica do EET

Extrato etanólico

Alcalóides: 10 mL de HCl 10% + Alcalinização até pH 9 + Extração com éter dietílico + Evaporação da fração etérea +

de Mayer = Formação de precipitado (+)

Taninos: 2 mL de água destilada + 3 gotas de FeCltaninos condensados; = Cor azul (+) para taninos hidrolisáveis

25 mL de etanol + 20 mL de HCl 20% + Refluxo por 30 min + 10 mL de água + Evaporação + Extração com 10 mL de éter dietílico por 3 vezes + Separação das

Fase aquosa

Fase etéreaFase etérea


Fase aquosa

Triagem fitoquímica do EET

mL de HCl 10% + Alcalinização até pH 9 + Extração com éter dietílico + Evaporação da fração etérea + 10 mL de HCl 10% + Reativo

de Mayer = Formação de precipitado (+)

2 mL de água destilada + 3 gotas de FeCl3 1% = Cor verde (+) para taninos condensados; = Cor azul (+) para taninos hidrolisáveis


fases aquosa e etérea

Fase aquosa

Fase etéreaFase etérea

Cumarinas: CCD - Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M.

Observação a 254 nm = Manchas esverdeadas ou azul fluorescente (+)


Flavonóides: 2 mL de metanol 50% + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado. Aguardar 10-20 min = Cor avermelhada

(+)

Triterpenos/esteróides: Reativo de Liebermann Burchard = Anel verde com interface marrom (+)

Fase aquosaAntocianinas: pH 9-10 = coloração verde

acastanhado a azul (+)

27

mL de HCl 10% + Alcalinização até pH 9 + Extração com mL de HCl 10% + Reativo

1% = Cor verde (+) para taninos condensados; = Cor azul (+) para taninos hidrolisáveis


Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M.

Observação a 254 nm = Manchas esverdeadas ou azul

OH 25% = Coloração

2 mL de metanol 50% + Mg metálico + 1 mL 20 min = Cor avermelhada

Reativo de Liebermann Burchard = Anel verde com interface marrom (+)

10 = coloração verde acastanhado a azul (+)

Figura 12. Triagem fitoquímica do EAQ

4.3.4. Fracionamento dos

4.3.4.1. Partição dos extratos em acetato de etila e etanólico

Extrato aquoso

Alcalóides: Alcalinização até pH 9 + Extração com 30 mL de éter dietílico 3 vezes + Evaporação da fração etérea +

Taninos: 1 mL de água destilada + 3 gotas de FeCltaninos condensados; Cor azul (+) para taninos hidrolisáveis

Saponinas: 10 mL de água + Agitação por 10 min = Espuma persistente por

100 mL de água + 20 mL de HCl concentrado + Refluxo por 30 min + Extração com 30 mL de éter dietílico por 3 vezes + Separação das fases aquosa e etérea

Fase aquosa

Fase etérea

Fase aquosa

Fase etérea

hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Obseração


de HCl concentrado. Aguardar 10

Triagem fitoquímica do EAQ

extratos brutos

Partição dos extratos em acetato de etila e etanólico

Alcalinização até pH 9 + Extração com 30 mL de éter dietílico 3 vezes + Evaporação da fração etérea + 1,5 mL de HCl 10% + Reativo de Mayer

= Formação de precipitado (+)

1 mL de água destilada + 3 gotas de FeCl3 1% = Cor verde (+) para taninos condensados; Cor azul (+) para taninos hidrolisáveis

10 mL de água + Agitação por 10 min = Espuma persistente por

20 min (+)


Fase aquosa

Fase etérea

Fase aquosaAntocianinas: pH 9-10 = coloração verde

acastanhado a azul (+)

Fase etérea

Cumarinas: CCD - Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Obseração a 254 nm = Manchas esverdeadas ou azul fluorescente (+)


Flavonóides: 2 mL de metanol 50% + Mg metálico + 1 mL de HCl concentrado. Aguardar 10-20 min = Cor avermelhada

(+)

Triterpenos/esteróides: Reativo de Liebermann Burchard = Anel verde com interface marrom (+)

28

Alcalinização até pH 9 + Extração com 30 mL de éter dietílico 3 mL de HCl 10% + Reativo de Mayer

1% = Cor verde (+) para taninos condensados; Cor azul (+) para taninos hidrolisáveis

10 mL de água + Agitação por 10 min = Espuma persistente por


10 = coloração verde acastanhado a azul (+)

Fase estacionária sílica gel, fase móvel hexano:acetato de etila 1:1, revelador KOH 0,5M. Obseração a 254 nm = Manchas esverdeadas ou azul fluorescente (+)

OH 25% = Coloração

2 mL de metanol 50% + Mg metálico + 1 mL 20 min = Cor avermelhada

Reativo de Liebermann Burchard = Anel verde com interface marrom (+)

Os extratos em acetato de etila e etanólico

400 mL de água:etanol 1:3, filtrados e particionados com hexano e clorofórmio.

Obtendo-se assim as fases hexânica, clorofórm

processo realizado.

Figura 13. Partição de EAE e EET

4.3.4.2. Cromatografia em Coluna Clássica

O extrato hexânico, a porção clorofórmica do extrato em acetato de etila e a

porção clorofórmica do extrato etanólico foram fracionados através de CCC, utilizando

Fase hexânica

s extratos em acetato de etila e etanólico foram suspensos separadamente em


se assim as fases hexânica, clorofórmica e hidroalcoólica. A figura 13 ilustra o

Partição de EAE e EET

Cromatografia em Coluna Clássica



Extrato

Suspensão em 400 mL de

água:etanol 1:3

Adição de 300 mL de n-

hexano (3 x de 100 mL)

Fase hexânica Fase hidroalcoólica

Adição de 300 mL de

Clorofórmio (3 x de 100 mL)

Fase clorofórmica

Fase hidroalcoólica

Rotaevaporação e liofilização

29

foram suspensos separadamente em


ica e hidroalcoólica. A figura 13 ilustra o



30

como fase estacionária a sílica gel 60 (35-70 mesh) e fase móvel n-hexano, acetato de

etila, etanol e misturas desses solventes em gradiente crescente de polaridade.

A fase hidroalcoólica do EET e o EAQ liofilizado foram fracionados através da

CCC, usando como fase estacionária o Sephadex LH 20 GE, e metanol como fase

móvel. Essas amostras foram preparadas pesando-se aproximadamente 1,5 g, que foram

diluídas em 20 mL de metanol, filtradas e centrifugadas. Os constituintes não solúveis

no solvente foram descartados, de modo que somente os solúveis foram colocados na

coluna.

4.3.4.3. Cromatografia em Camada Delgada

O monitoramento das frações obtidas na CCC foi através de CCD tendo como

objetivos a observação do grau de pureza das frações e a detecção de frações com perfis

cromatográficos semelhantes para sua posterior reunião.

4.3.4.4. Identificação de substâncias isoladas

Os constituintes dos extratos foram identificados através de espectros obtidos a

partir de análises por CG-EM, IV, RMN 1H e RMN 13C.

4.4. ENSAIOS BIOLÓGICOS

4.4.1. Atividade antiinflamatória

Os testes foram realizados pelo Laboratório de Imunologia do Programa

Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da UFVJM, sendo aprovado

pelo CEP/UFVJM sob registro nº 002/09.

Neste estudo, foram utilizados três extratos de P. brasiliensis: em acetato de etila

e etanólico dissolvidos em DMSO 1 mg/mL, e aquoso, solubilizado em PBS 1 mg/mL.

4.4.1.1. Preparo das culturas

Foram colocados RPMI e 12,5 µL de BFA em todos os tubos de cultura. Em

seguida adicionou-se 25 µL de PMA (1:1000) e 1µL de Ionomicina aos tubos das

culturas estimuladas (E) para a produção de citocinas, e 26 µL de RPMI nas culturas

não estimuladas. Foram acrescentados 50 µL de cada extrato em seus respectivos tubos

identificados (AE+E, ET+E e AQ+E) e 50 µL de RPMI nas culturas controle (C) e na

cultura estimulada (E). Depositou-se em todos os tubos 500 µL de sangue devidamente

31

homogeneizado de 3 voluntários aptos a doação de sangue, conforme Tabela 2. As

culturas foram incubadas por 4 horas em estufa de CO2 a 37,0 °C.

Tabela 2. Preparo das culturas para ensaio antiinflamatório

C: Cultura controle não estimulada; EXT: Cultura experimental não estimulada; E: Cultura estimulada; EXT+E: Cultura experimental estimulada; EXT: AE (em acetato de etila), ET (etanólico) ou AQ (aquoso)

4.4.1.2. Marcação intracitoplasmática de citocinas em linfócitos humanos

Após 4 h de incubação, as culturas foram tratadas com 138 µL de EDTA a 20

mM e incubados por 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas com 6

mL de PBS-W (PBS 0,015 M, pH 7,4, contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica) e

centrifugadas a 1800 rpm por 7 min. Os sobrenadantes foram desprezados, e os

precipitados celulares foram submetidos a lise eritrocitária através da adição da solução

de 5 mL de Billig [citrato de sódio.2H2O, formaldeído 2%, dietilenoglicol 3%, heparina

comercial (5.000 UI/mL) e água bidestilada] e mantidos em incubação por 10 min à

temperatura ambiente.

Após esse tempo, os tubos foram centrifugados a 1800 rpm por 7 min a 18ºC, e

os sobrenadantes desprezados. As células foram ressuspensas em 500 µL de PBS-W e 3

mL de PBS-P (PBS 0,015 M, pH 7,4, contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica, e

0,5% de saponina), incubadas novamente por 10 min à temperatura ambiente, e

centrifugadas sob as mesmas condições anteriores. Na seqüência as células foram

lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS-W.

Após a homogeneização, a suspensão celular foi incubada com anticorpos

monoclonais anticitocinas conjugados a ficoeritrina, específicos para as citocinas IFN-γ,

IL-10 e TNF-α, seguido de incubação por 30 min à temperatura ambiente e ao abrigo da

luz.

Em seguida, as células foram ressuspensas em PBS-P e centrifugadas a 1500

rpm por 7 min a 18ºC. Após desprezar o sobrenadante, as células foram lavadas duas

vezes com PBS-W, seguido de centrifugação e descarte do sobrenadante (1500 rpm por

Cultura celular

RPMI (µµµµL)

Sangue (µµµµl)

BFA (µg/mL)

PMA (µL)

Ionomicina (µg/mL)

Extrato (µL)

C 488 500 12,5 - - -

EXT 438 500 12,5 - - 50

E 462 500 12,5 25 1, 0 -

EXT+E 412 500 12,5 25 1, 0 50

32

7 min a 18ºC). As suspensões celulares foram avaliadas quanto à produção de citocinas

utilizando-se citômetro de fluxo, procedendo-se a aquisição de pelo menos 30.000

eventos dentro da região correspondente aos linfócitos.

4.4.1.3. Análise estatística

Os resultados dos ensaios da atividade antiinflamatória foram expressos como

médias de três repetições (n=3) ± desvio padrão. Os dados foram submetidos à análise

de variância (ANOVA) e, em seguida foi aplicado o teste de Tukey (p<0,05). O

programa estatístico utilizado para esses testes foi o GraphPad Prism (versão 5, 2007).

4.4.2. Atividade Antioxidante

4.4.2.1. Fenólicos totais

O conteúdo de compostos fenólicos nos extratos de P. brasiliensis foi obtido

baseado no método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, e foi analisado de acordo com

metodologia descrita por Singh e colaboradores (2002).

Todos os extratos foram dissolvidos em metanol, e alíquotas de 0,6 mL a 300

ppm (3 mg de extrato solubilizados em 10 mL de solvente) foram misturadas a 0,3 mL

de reagente de Folin-Ciocalteu (Dinâmica®) diluído em metanol (1:9) e 2,4 mL de

solução de carbonato de sódio 7,5%. Após 30 min em repouso à temperatura ambiente,

as absorbâncias foram medidas a 765 nm em espectrofotômetro UV-VIS. O ácido tânico

(AT) (Isofar®) foi utilizado como padrão para construção da curva analítica, sendo

determinada uma curva de regressão linear a partir das concentrações 100, 200, 300,

400 e 500 ppm. O ensaio foi realizado em triplicata, e a quantidade em miligramas de

fenólicos totais foi expressa em equivalentes de AT por grama de extrato.

4.4.2.2. Atividade de retirada de radical usando o método DPPH

A atividade antioxidante foi determinada através da capacidade das

substâncias presentes nas amostras em seqüestrar o radical estável DPPH, de acordo

com a metodologia descrita por Blois (1958) e Singh e colaboradores (2002).

Alíquotas de 100 µL dos extratos dissolvidos em metanol, a 200 e 300 ppm,

foram colocadas em tubos de ensaio separadamente. Foram adicionados aos tubos 5,0

mL de solução metanólica de DPPH (Aldrich®) 0,1 mM, que em seguida foram

agitados vigorosamente. Os tubos foram deixados em repouso a 27 ºC por 20 min. Dois

tubos controles contendo metanol e DPPH, sem os extratos, foram usados como

33

brancos. As absorbâncias foram medidas a 517 nm em espectrofotômetro UV-VIS.

Como padrão utilizou-se 100 µL de solução metanólica de ácido gálico (Impex®) a 200

e 300 ppm. Todos os testes foram realizados em triplicata e a atividade de retirada de

radical (ARR) foi expressa como a porcentagem de inibição e calculada usando a

fórmula:

% ARR = (Abs. branco – Abs. amostra) x 100

Abs. branco

4.4.2.3. Poder redutor

A avaliação do poder redutor dos extratos de P. brasiliensis foi realizada de

acordo com a metodologia descrita por YILDIRIM e colaboradores (2001).

Foram utilizadas alíquotas de 1 mL dos extratos a 50, 100, 200 e 300 ppm em

etanol, separadamente. Foi usado como padrão 1 mL de solução de ácido gálico

(Impex®) nas mesmas concentrações dos extratos. Acrescentaram-se às alíquotas, 1,0

mL de tampão fosfato 0,2 mol/L (pH 6,6) e 1,5 mL de ferricianeto de potássio 1%. Em

seguida, as amostras foram incubadas a 50 °C por 30 min. Após este período adicionou-

se 1,5 mL de ácido tricloroacético 10% e as misturas foram centrifugadas

separadamente a 2500 rpm por 8 min. Retirou-se 2,0 mL da camada superior, que foram

acrescidos de 2,0 mL de água destilada e 0,5 mL de cloreto férrico 0,1 %. A absorbância

foi medida a 700 nm em espectrofotômetro UV-VIS. Os testes foram realizados em

triplicata, e o poder redutor foi considerado maior ou menor dependendo da maior ou

menor absorbância observada, respectivamente.

4.4.2.4. Análise estatística dos ensaios antioxidantes

Os resultados apresentados neste estudo correspondem à média de três

repetições (n=3) ± desvio padrão da média. Para detectar as diferenças entre as médias e

avaliar estas diferenças foi utilizada análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey

com 95% de nível de confiança para os testes de atividade de retirada de radical usando

o método DPPH e poder redutor. O programa estatístico utilizado para esses testes foi o

GraphPad Prism (versão 5, 2007).

34

55555555........ RRRRRRRReeeeeeeessssssssuuuuuuuullllllllttttttttaaaaaaaaddddddddoooooooossssssss eeeeeeee DDDDDDDDiiiiiiiissssssssccccccccuuuuuuuussssssssssssssssããããããããoooooooo

35

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. ESTUDO FITOQUÍMICO

5.1.1. Óleo essencial

A hidrodestilação das folhas frescas de P. brasiliensis apresentou um rendimento

de 0,002% de óleo essencial.

O óleo essencial foi analisado através de CG em coluna DB5-MS acoplado ao

EM. Na Figura 14 está representado o cromatograma obtido por CG.

Figura 14. Cromatograma do óleo essencial obtido por CG em coluna DB-5-MS

Os espectros de massas e as estruturas dos componentes identificados no óleo

essencial de folhas frescas de P. brasiliensis estão nas Figuras 15 à 39 (pág. 36 à 42).

A comparação dos espectros de massas dos componentes da amostra com os do

banco de dados Wiley 7 library e a comparação de seus IRR com os IRR já descritos na

literatura (Adams, 1995) permitiram identificar e quantificar 25 dos 30 componentes do

óleo essencial, apresentados na Tabela 3 (pág. 43).

As duas substâncias majoritárias observadas foram os monoterpenos α-tujeno

(17,21%) e α-pineno (32,61%), ambos com fórmula molecular C10H16. Nos espectros de

massas desses monoterpenos pode-se observar os sinais em 136 m/z relativo ao íon

molecular, e em 93 m/z relativo ao pico base, indicando a provável formação de C7H9+,

provavelmente o íon toluenium (MORMANN et al., 2006).

Diferentes monoterpenos apresentam padrões de fragmentação semelhantes, o

que dificulta sua identificação apenas por análise de espectros de massas. Sendo viável,

portanto obter IRR para auxiliar na i

Outros monoterpenos que apresentaram quantidade relativa acima de 3% foram

o α-felandreno (8,86%), o β

(4,15%), o limoneno (3,41%) e o β

abundantes na amostra analisada que apresentar

foram o E-cariofileno (6,87%) e o germacreno D (3,40%).

Dos terpenóides identificados no óleo essencial, o cadineno e o espatulenol já

foram isolados de extratos de partes aéreas da

colaboradores (1984).

Figura 15. Espectro de massas do α




portanto obter IRR para auxiliar na identificação.


felandreno (8,86%), o β-pineno (7,55%), o sabineno (4,44%), o

(4,15%), o limoneno (3,41%) e o β-mirceno (3,22%). Os sesquiterpenos mais

mostra analisada que apresentaram quantidade relativa acima de 3%

cariofileno (6,87%) e o germacreno D (3,40%).


foram isolados de extratos de partes aéreas da P. brasiliensis por Bohlmann

Espectro de massas do α-tujeno

Espectro de massas do α-pineno

36




pineno (7,55%), o sabineno (4,44%), o E-β-ocimeno

mirceno (3,22%). Os sesquiterpenos mais

m quantidade relativa acima de 3%


por Bohlmann e

Figura 17. Espectro de massas do sabineno

Figura 18. Espectro de massas do β

Figura 19. Espectro de massas do β


Espectro de massas do sabineno

Espectro de massas do β-pineno

Espectro de massas do β-mirceno

Espectro de massas do α-felandreno

37

38

Figura 21. Espectro de massas do α-terpineno

Figura 22. Espectro de massas do p-cimeno

Figura 23. Espectro de massas do limoneno

Figura 24. Espectro de massas do Z-β-ocimeno

Figura 25. Espectro de massas do




Espectro de massas do E-β-ocimeno

Espectro de massas do γ-terpineno

Espectro de massas do α-terpinoleno

Espectro de massas do α-terpineol

39

40

Figura 29. Espectro de massas do δ-elemeno

Figura 30. Espectro de massas do α-copaeno

Figura 31. Espectro de massas do E-cariofileno

Figura 32. Espectro de massas do α-humuleno

41

Figura 33. Espectro de massas do germacreno D

Figura 34. Espectro de massas do biciclogermacreno

Figura 35. Espectro de massas do α-muuroleno

Figura 36. Espectro de massas do δ-cadineno

42

Figura 37. Espectro de massas do germacreno B

Figura 38. Espectro de massas do espatulenol

Figura 39. Espectro de massas do óxido de cariofileno

5.1.2. Triagem fitoquímica

Nos ensaios de triagem fitoquímica, foram empregados testes usuais para a

detecção de 9 classes de metabólitos secundários nos 4 extratos de P. brasiliensis. Os

resultados são mostrados na Tabela 4 (pág. 44).

De acordo com os resultados das reações desenvolvidas nos testes se pode

sugerir a presença de cumarinas, flavonóides e triterpenos/esteróides no EHE. No EAE

pode-se observar a provável presença de triterpenos/esteróides. No EET foram

detectados antocianinas, cumarinas, taninos condensados e triterpenos/esteróides. No

43

Tabela 3. Terpenóides do óleo essencial de folhas frescas de P. brasiliensis.

Componente IS TR (min)

IRR calculado

IRR teórico

Quantidade relativa (%)

1. α-tujeno 97 5,181 924 931 17,21 2. α-pineno 99 5,396 932 939 32,61 3. N.I. - 5,573 939 - 0,18 4. N.I. - 5,822 948 - 0,22 5. sabineno 97 6,423 971 976 4,44 6. β-pineno 96 6,590 977 980 7,55 7. β-mirceno 99 6,867 987 991 3,22 8. α-felandreno 98 7,449 1007 1005 8,86 9. α-terpineno 89 7,779 1016 1018 0,08 10. p-cimeno 95 8,044 1023 1026 0,52 11. limoneno 96 8,198 1028 1031 3,41 12. N.I. - 8,265 1030 - 0,05 13. Z-β-ocimeno 91 8,391 1033 1040 0,10 14. E-β-ocimeno 96 8,772 1044 1050 4,15 15. γ-terpineno 95 9,212 1056 1062 0,33 16. α-terpinoleno 91 10,224 1084 1088 0,16 17. N.I. - 11,310 1112 - 0,17 18. α-terpineol 94 14,111 1179 1189 0,31 19. δ-elemeno 91 20,663 1332 1339 0,13 20. α-copaeno 96 22,361 1372 1376 1,28 21. E-cariofileno 96 24,189 1415 1418 6,87 22. N.I. - 24,623 1426 - 0,23 23. α-humuleno 90 25,647 1450 1454 0,15 24. germacreno D 95 26,715 1476 1480 3,40 25. biciclogermacreno 95 27,295 1490 1494 1,54 26. α-muuroleno 90 27,458 1494 1499 0,19 27. δ-cadineno 94 28,246 1514 1524 0,85 28. germacreno B 93 29,779 1552 1556 1,12 29. espatulenol 91 30,520 1571 1576 0,46 30. óxido de cariofileno 89 30,690 1576 1581 0,21 Total 100,00 Compostos identificados 99,15 Monoterpenos 82,95 Sesquiterpenos 16,20

IS: Índice de Similaridade do espectro de massas obtido experimentalmente com o espectro da espectroteca Wiley 7; TR: Tempo de Retenção; IRR: Índice de Retenção Relativo; N.I.: Não Identificado.

EAQ pode-se sugerir a presença de antocianinas, cumarinas, antracenosídeos,

flavonóides, saponinas e taninos condensados.

Não se observou a presença de alcalóides e taninos hidrolisáveis em nenhum

extrato.

44

Tabela 4. Classes de metabólitos secundários detectadas nos extratos brutos de folhas

de P. brasiliensis.

Classe EHE EAE EET EAQ

Alcalóides Negativo Negativo Negativo Negativo

Antocianinas * * Positivo Positivo

Cumarinas Positivo Negativo Positivo Positivo

Antracenosídeos Negativo Negativo Negativo Positivo

Flavonóides Positivo Negativo Negativo Positivo

Saponinas * * * Positivo

Taninos condensados * * Positivo Positivo

Taninos hidrolisáveis * * Negativo Negativo

Triterpenos/esteróides Positivo Positivo Positivo Negativo

* Teste não realizado devido as características dos metabólitos secundários serem incompatíveis com as polaridades dos extratos.

Segundo Alvarenga et al. (2001), os alcalóides não são encontrados comumente

na família Asteraceae. Por outro lado, flavonóides, cumarinas e terpenóides são

observados na família, sendo que muitos são marcadores químicos (BOHLMANN &

JAKUPOVIC, 1990; ZDERO & BOHLMANN, 1990; ALVARENGA et al., 2001).

5.1.3. Fracionamento de extratos brutos e identificação de compostos

A Figura 40 (pág. 45) mostra um resumo da preparação, partição e

fracionamento dos extratos brutos de P. brasiliensis.

5.1.3.1. Extrato hexânico

O fracionamento de 5,0323 g do extrato hexânico em coluna de sílica gel 60

rendeu 107 frações de 25 mL cada. Estas frações foram submetidas a CCD e foram

reunidas em 53 frações conforme a semelhança do perfil cromatográfico. A seguir, 19

frações foram lavadas com hexano, e o material insolúvel das frações EHE1, EHE4 e

EHE5 foi analisado por CG-EM, RMN 1H e RMN 13C.

A Figura 41 (pág. 45) resume a obtenção e análise de frações obtidas a partir do

EHE de folhas de P. brasiliensis.

Figura 40. Obtenção, partição e fracionamento

Figura 41. Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EHE

6,1425 g Extrato Hexânico

5,0323 g CCC Sílica gel 60

5,9045 g Extrato em Ac. de etila

4,9888 g Partição

1,8307 g Fase hexânica

0,9220 g Fase

clorofórmica

CCC Sílica gel 60

6,1425 g Extrato hexânico

5,0323 g CCC Sílica

gel 60 (eluída com hexano,

acetato de etila e etanol)

, partição e fracionamento de extratos brutos de P. brasiliensis

Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EHE

184 g Folhas de

P. brasiliensis

5,9045 g Extrato em Ac. de etila

4,9888 g Partição

0,9220 g

clorofórmica

CCC Sílica gel 60

1,4098 g Fase

hidroalcoólica

3,1887 g Extrato

Etanólico

2,1808 g Partição


0,4623 g Fase

clorofórmica

CCC Sílica gel 60

CCC Sílica

(eluída com 107 Frações (25 mL cada)

CCD -Reunião de frações

semelhantesem 53 frações

HE1, HE4 e HE5 -

CG-EM, RMN 1H e RMN 13C

45

P. brasiliensis

Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EHE

CCC Sílica

1,6248 g Fase

hidroalcoólica

1,5064 g CCC Sephadex LH 20

13,6782 g Extrato Aquoso

1,5583 g CCC Sephadex LH 20

HE1, HE4 e

EM, H e C

Ácido caurenóico

α-amirina

Acetato de α-amirina

β-amirina

Acetato de β-amirina

Lupeol

Acetato de lupeol

Pseudo taraxasterol

Taraxasterol

46

5.1.3.1.1. Análise da fração EHE1

A Figura 42 representa o cromatograma obtido por CG da fração EHE1 do

extrato hexânico. A tabela 5 apresenta a identificação dos terpenos através de seus TRR

quando comparados aos TRR de seus respectivos padrões.

Tabela 5. Terpenos identificados em EHE1 por CG

Área (%) TR (min) TRR cal TRR ref

ácido caurenóico 77,09 10,986 0,7891 -

acetato de β-amirina 3,34 31,991 2,2977 2,305 acetato de α-amirina

2,19 34,440 2,4736 2,471 acetato de lupeol 4,86 34,838 2,5022 2,505 TR padrão interno = 13,923 min; Área: área relativa do pico no cromatograma; TR: Tempo de Retenção; TRR: Tempo de Retenção Relativo.

Figura 42. Cromatograma de EHE1 obtido por CG em coluna DB17-MS. (AC = Ácido

caurenóico, PI = Padrão interno: α-Colestano, ABA = Acetato de β-amirina, AAA =

Acetato de α-amirina, AL = Acetato de lupeol)

Na fração EHE1 podemos observar a ocorrência do ácido caurenóico como

componente majoritário, e dos triterpenos acetato de β-amirina, acetato de α-amirina e

47

acetato de lupeol, presentes em menores concentrações de acordo com a área relativa

dos picos do cromatograma.

Os espectros de massas dos terpenos de EHE1 são apresentados nas Figuras 43 a

46 (pág. 47 e 48).

O diterpeno ácido caurenóico, com fórmula molecular C20H30O2, e íon molecular

de 302 m/z, possui pico base 91 m/z, indicando a provável formação do íon tropílio.

Outros picos característicos de espectro de massas obtido por impacto eletrônico são

287 m/z, 259 m/z, 243 m/z, 148 m/z, 121 m/z, 109 m/z, 105 m/z (KALINOVSKII et al.,

1971; VILEGAS et al., 1997; GREGÓRIO, 2008).

Por se tratarem de isômeros de posição, com fórmula molecular C32H52O2, e pelo

molecular de 468, o acetato de β-amirina e o acetato de α-amirina possuem espectros de

massas muito semelhantes. O que basicamente difere os espectros das duas moléculas

são as intensidades de certos picos. O pico base do acetato de β-amirina e do acetato de

α-amirina é 218 m/z, representando íon característico de triterpenos das séries oleaneno

e urseno, com insaturação no C-12. O íon representado pelo pico base é proveniente de

um rearranjo do tipo retro-Diels-Alder. Esse tipo de rearranjo pode levar a formação de

fragmentos contendo anéis A-B e parte do C e anéis E-D e parte do anel C

(OGUNKOYA, 1981; BURNOUF-RADOSEVICH et al., 1985; SILVA et al., 1998).

O acetato de lupeol, com fórmula molecular C32H52O2, e íon molecular de 468

m/z, possui pico base 189 m/z, característico de triterpenos da série lupano. O íon

molecular 468 m/z difere o acetato de lupeol do lupeol, que apresenta íon molecular 426

m/z (BUDZIKIEWICZ et al., 1963; SILVA et al., 1998).

Figura 43. Espectro de massas do ácido caurenóico

H

O OH

H

48

Figura 44. Espectro de massas do acetato de β-amirina

Figura 45. Espectro de massas de acetato de α-amirina

Figura 46. Espectro de massas de acetato de lupeol

Através dos dados de TRR dos componentes da mistura de EHE1, bem como

pela análise de seus respectivos espectros de massas, podemos sugerir a presença dos

triterpenos acetato de β-amirina, acetato de α-amirina e acetato de lupeol nas folhas de

P. brasiliensis.

O

H

H

H

H

O

O

H

H

H

O

A

O

H

H

H

O

B

C D

E

49

O diterpeno ácido caurenóico foi identificado na mistura através de seu espectro

de massas e por meio das análises de espectros de RMN da fração EHE1 (Fig. 47 a 49,

pág. 49 a 51).

O espectro de RMN 1H de EHE1 (Fig. 47) apresentou um singleto largo

em δH 2,64 (1H) indicativo de hidrogênio alílico, ligado ao carbono C-13, característico

de diterpenos de esqueleto do tipo caureno. Este tipo estrutural foi confirmado por

sinais característicos de hidrogênios, como indicado na Tabela 6: H-18 (δH 1,24; s; 3H),

H-20 (δH 0,95; s; 3H), H-17 (δH 4,80; s; 1H) e H-17 (δH 4,74; s; 1H) (BATISTA et al.,

2005; NETO et al., 2008).

Tabela 6. Atribuição dos sinais de hidrogênios de EHE1 (200 MHz, CDCl3)

Hidrogênio Presente trabalho Batista et al., 2005

13 2,64 (1H, s) 2.64 (1H, m)

17a 4,74 (1H, s) 4.73 (1H, s)

17b 4,80 (1H, s) 4.79 (1H, s)

18 1,24 (3H, s) 1.24 (3H, s)

20 0,95 (3H, s) 0.95 (3H, s)

s: singleto; m: multipleto

Figura 47. Espectro de RMN de 1H da fração EHE1 (CDCl3; 200 MHz)

H

O OH

H

1

2

3 45

6

7

10

11

1213

15

18

19

20

814

17

169

H17b H17a H13

H18

H20

50

No espectro de RMN 13C de EHE1 (Fig. 48) o sinal em δC 183,6 foi relacionado

ao grupo carboxila (C-19) e os sinais em δC 155,3 e 102,4 foram atribuídos aos C-16 e

C-17, respectivamente, o que permitiu confirmar a presença da ligação dupla exocíclica

do esqueleto caureno. O sinal em δC 56,4 (C-5) pode indicar uma localização trans-axial

entre o grupo carboxila e o H-5 (VELANDIA et al., 1998; BATISTA et al., 2005;

NETO et al., 2008).

Figura 48. Espectro de RMN de 13C da fração EHE1 (CDCl3; 50 MHz)

O padrão de hidrogenação dos carbonos determinados pelo subespectro DEPT-

135 (Fig. 49), indica que em EHE1 há um composto que apresenta 2 carbonos metílicos

(C-18 e C-20), 10 carbonos metilênicos, 3 metínicos (C-5, C-9, C-13), e 5 carbonos

não-hidrogenados, totalizando 20 carbonos. A Tabela 7 (pág. 51) apresenta a atribuição

dos sinais do espectro de RMN 13C (BATISTA et al., 2005).

Os dados obtidos por RMN mostraram-se de acordo com os dados registrados na

literatura para o ácido caurenóico. Como o ácido caurenóico é o componente majoritário

na fração EHE1, os sinais dos triterpenos não são evidenciados nos espectros de RMN.

H

O OH

H

1

2

3 45

6

7

10

11

1213

15

18

19

20

814

17

169

C19 C16 C17 C5

51

Tabela 7. Atribuição dos sinais de carbono de EHE1 (50 MHz, CDCl3)

Carbono Presente trabalho Batista et al., 2005

1 40,79 40,7

2 19,18 19,1

3 37,89 37,7

4 43,23 43,2

5 57,14 57,1

6 21,92 21,8

7 41,37 41,3

8 43,61 44,2

9 55,19 55,1

10 40,08 39,7

11 18,52 18,4

12 33,20 33,1

13 43,94 43,8

14 39,79 39,7

15 49,05 48,9

16 155,3 155,9

17 103,08 103,0

18 29,06 29,0

19 183,6 184,8

20 15,69 15,6


A Figura 50 (pág. 52) representa o cromatograma obtido por CG da fração

EHE4 do extrato hexânico. A Tabela 8 (pág. 53) apresenta a identificação dos terpenos

através de seus TRR quando comparados aos TRR de seus respectivos padrões.

52

Figura 49. Subespectro DEPT-135 de EHE1 (CDCl3; 50 MHz)

Figura 50. Cromatograma de EHE4 obtido por CG em coluna DB17-MS. (PI = Padrão

interno: α-Colestano, BA = β-amirina, AA = α-amirina, L = Lupeol)

H

O OH

H

1

2

3 45

6

7

10

11

1213

15

18

19

20

814

17

169

C17

C5 C9

C15

C13

C18 C20

C7 C12 C6

C1 C14 C3

C2 C11

53



β-amirina 8,20 30,370 2,1818 2,184

α-amirina 8,03 32,999 2,3706 2,370 lupeol

29,73 33,253 2,3889 2,390 TR padrão interno = 13,920 min; Área: área relativa do pico no cromatograma; TR: Tempo de Retenção; TRR: Tempo de Retenção Relativo.

Na fração EHE4 podemos observar a ocorrência de triterpenos, sendo o

majoritário, o lupeol. A β-amirina e a α-amirina estão presentes em menores

concentrações de acordo com a área relativa dos picos do cromatograma.

Os espectros de massas dos componentes de EH4 são apresentados nas figuras

51 a 53 (pág. 53 e 54).

Por se tratarem de isômeros de posição, com fórmula molecular C30H50O, e íon

molecular de 426 m/z, β-amirina e α-amirina possuem espectros de massas muito

semelhantes. O que difere os espectros das duas moléculas são as intensidades de alguns

picos. O pico base de β-amirina e de α-amirina é 218 m/z, característico de triterpenos

das séries oleaneno e urseno, respectivamente. O íon representado pelo pico base é

proveniente de um rearranjo retro-Diels-Alder. Esse tipo de rearranjo pode levar a

formação de fragmentos contendo anéis A-B e parte do C e anéis E-D e parte do anel C

(OGUNKOYA, 1981; BURNOUF-RADOSEVICH et al., 1985; SILVA et al., 1998).

O lupeol, com fórmula molecular C30H50O, e íon molecular de 426 m/z, possui

pico base de 95 m/z. na fragmentação do lupeol ocorreu a formação do íon representado

pelo pico 189 m/z, característico de triterpeno com esqueleto lupano (OGUNKOYA,

1981).

Figura 51. Espectro de massas de β-amirina

HO

H

H

H

54

Figura 52. Espectro de massas de α-amirina

Figura 53. Espectro de massas de lupeol


A Figura 54 (pág. 55) representa o cromatograma obtido por CG da fração

EHE5 do extrato hexânico. A tabela 9 (pág. 55) apresenta a identificação dos terpenos

através de seus TRR quando comparados aos TRR de seus respectivos padrões.

Na fração EHE5 podemos observar a ocorrência do ácido caurenóico e de

triterpenos, sendo os majoritários o lupeol e a β-amirina. O pseudotaraxasterol e o

taraxasterol estão presentes em baixas concentrações de acordo com a área relativa dos

picos do cromatograma.

Os espectros de massas do pseudotaraxasterol e do taraxasterol, presentes na

mistura EHE5, são apresentados nas Figuras 55 e 56 (pág. 56). Os espectros de massas

do ácido caurenóico, β-amirina e lupeol foram obtidos e apresentaram padrão de

fragmentação característico, como já discutido anteriormente; por isso não são

reapresentados.

HO

H

H

H

H

HO

H

H

H

55

Figura 54. Cromatograma da fração EHE5 obtido por CG em coluna DB5-MS. (AC =

Ácido caurenóico, PI = Padrão interno: α-Colestano, BA = β-amirina, L = Lupeol, PT =

Pseudotaraxasterol, T = Taraxasterol)



ácido caurenóico 3,18 17,425 0,7914 - β-amirina

16,31 29,434 1,3368 1,334 lupeol 47,48 30,504 1,3854 1,383 pseudotaraxasterol

0,50 32,664 1,4835 1,480 taraxasterol 0,83 32,977 1,4977 1,494 TR padrão interno = 22,018 min; Área: área relativa do pico no cromatograma; TR: Tempo de Retenção; TRR: Tempo de Retenção Relativo.

Confrontando os dados dos espectros com os dados de TRR, sugerimos que na

mistura analisada ocorre a presença do pseudotaraxasterol (urs-20-eno) e do taraxasterol

(urs-20(30)-eno), que são isômeros de posição, com fórmula molecular C30H48O, peso

molecular de 424, e pico base de 189 m/z. São triterpenos pentacíclicos que

apresentaram padrão de fragmentação semelhante a outros terpenos de esqueleto urseno,

derivados de taraxasterol (JEONG & LACHANCE, 2001).

56

Figura 55. Espectro de massas de pseudotaraxasterol

Figura 56. Espectro de massas de taraxasterol

5.1.3.2. Extrato em acetato de etila

A partição de 4,9888 g do extrato em acetato de etila resultou em 3 fases de

polaridades diferentes: hexânica, clorofórmica e hidroalcoólica.

As fases hexânica e clorofórmica foram concentradas em evaporador rotativo,

rendendo respectivamente 1,8307 g e 0,9220 g.

O fracionamento de 0,9220 g da fase clorofórmica em coluna de sílica gel 60


reunidas em 80 frações conforme a semelhança do perfil químico. Em seguida, a fração

EAE1 foi limpa com hexano e analisada por CG-EM, RMN1H e RMN13C.

A fase hidroalcoólica foi concentrada em evaporador rotatório, congelada e

liofilizada obtendo-se 2,5398 g. Esta foi submetida a CCD e posteriormente a análise

por IV, RMN1H e RMN13C.

A Figura 57 (pág. 57) consta a obtenção, fracionamento e análise do extrato em

acetato de etila de folhas de P. brasiliensis.

HO

H

H

H

H

HO

H

H

H

H

Figura 57. Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EAE

5.1.3.2.1. Análise da fração EAE1

A Figura 58 representa o cromatograma

extrato em acetato de etila.

Fase hexânica

EAE1 CG-EM

Ácido caurenóico β-amirina

Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EAE


representa o cromatograma obtido por CG da fração EAE1 do

5,9045 g Extrato em acetato de

etila

4,9888 g Partição


0,9220 g Fase

clorofórmica

CCC Sílica gel 60 (Eluída com hexano, acetato de

etila e etanol)

234 Frações (20 mL)


semelhantes em 80 frações

EAE1 EM

amirina Lupeol

EAE1 RMN

Ácido caurenóico


Liofilização 2,5398 g

CCD

RMN e IV

Resultado Inconclusivo

57

Fracionamento e identificação de constituintes químicos do EAE

obtido por CG da fração EAE1 do

EAE1 RMN

Provavelmente a lactona

sesquiterpênica Crisanina

hidroalcoólica

Liofilização

RMN e IV

Resultado Inconclusivo

58

Figura 58. Cromatograma da fração EAE1 obtido por CG em coluna DB5-MS. (AC =

Ácido caurenóico, PI = Padrão interno: α-Colestano, CR = Crisanina, BA = β-amirina,

L = Lupeol)

A Tabela 10 apresenta a identificação dos terpenos através de seus TRR quando

comparados aos TRR de seus respectivos padrões.

Tabela 10. Terpenos identificados em AE1 por CG


ácido caurenóico 25,01 17,524 0,7970 -

β-amirina 0,25 29,295 1,3324 1,334 lupeol 0,96 30,344 1,3801 1,383 TR padrão interno = 21,987 min; Área: área relativa do pico no cromatograma; TR: Tempo de Retenção; TRR: Tempo de Retenção Relativo.

Na fração AE1 podemos observar a ocorrência do diterpeno ácido caurenóico

como componente majoritário, e dos triterpenos β-amirina e lupeol, presentes em

menores concentrações de acordo com a área relativa dos picos do cromatograma.

Foram obtidos os espectros de massas desses terpenos, que são compatíveis com os

espectros de massas do ácido caurenóico, da β-amirina, e do lupeol presentes em outras

amostras de P. brasiliensis e analisadas por CG-EM.

A Figura 59 apresenta o espectro de massas de um quarto componente presente

na mistura EAE1 que foi eluída no TR 24,687 min. A comparação desse espectro com

CR

59

os espectros da espectroteca indicou um IS de 71, tratando-se possivelmente da lactona

sesquiterpênica crisanina, cuja fórmula molecular é C20H26O5, e o peso molecular é 346.

No espectro de massas pode-se observar o pico base 83 m/z que pode corresponder ao

íon angelato ([C4H7CO]+). Outro pico intenso em 55 m/z, pode ser do fragmento [83 –

CO]+. O angelato está presente na molécula de lactonas sesquiterpênicas, como o

eudesmanolídeo crisanina (BOHLMANN et al., 1983).

Figura 59. Espectro de massas da crisanina

O espectro de RMN 1H de EAE1 (Fig. 60, pág. 60) apresentou sinais em δH 6,09,

1,89, e 1,77 correspondentes respectivamente aos H-3’ vinílicos, e aos H das posições

C-5’ e C-4” (metilas vinílicas) do grupo angeloil (GRAEL, 2003; HAJDÚ et al., 2010).

Esse espectro também apresentou um singleto largo em δH 2,79 (1H) indicativo

de hidrogênio alílico, ligado ao carbono C-13, característico de diterpenos de esqueleto

do tipo caureno. Este tipo estrutural foi confirmado pelos sinais característicos dos

hidrogênios: H-18 (δH 1,21; s; 3H), H-20 (δH 0,95; s; 3H), H-17 (δH 4,79; s; 1H) e H-17

(δH 4,73; s; 1H) sugerindo a presença do ácido caurenóico na mistura (NETO et al.,

2008).

No espectro de RMN 13C de EAE1 (Fig. 61, pág. 61) podemos observar nesse

espectro, a presença dos sinais em δC 168,07, 137,10 e 128,95. Sendo que o primeiro foi

relacionado a carboxila do grupo angeloil; o segundo ao carbono quaternário 11 da

ligação dupla exocíclica; e o terceiro ao carbono quaternário do grupo angeloil. Os

sinais em δC 15,78 e 20,30 são relativos aos carbonos de metilas vinílicas do grupo

angeloil. Esses dados sugerem a presença de lactona sesquiterpênica com grupo angeloil

(GRAEL, 2003; HAJDÚ et al., 2010).

O sinal em δC 183,95 foi relacionado ao grupo carboxila e os sinais

em δC 155,51 e 109,97 permitiram confirmar a presença da ligação dupla exocíclica do

O

OH

O

O

CO

C

H3C

C

CH3

H

60

Figura 60. Espectro de RMN de 1H da fração EAE1 (CDCl3; 200 MHz)

esqueleto caureno. Os dados obtidos por RMN mostraram-se de acordo com os dados

registrados na literatura para o ácido caurenóico (NETO et al., 2008).

Tentativas de purificação e outras análises merecem ser realizadas para

confirmar a presença ou não de lactona sesquiterpênica, bem como identificar a

estrutura.


O espectro de IV da fração EAE2 (Fig. 62, pág. 61) apresenta uma banda larga

em 3118 cm-1 característica de νO-H, absorção em 3024 cm-1 referente a ν=C-H de

aromáticos, absorção em 2804 cm-1 característico de νC-H, absorção 1746 cm-1

referente a νC=O, uma banda intensa em 1402 cm-1 referente a νC=C, e absorção em

666 cm-1 característico de γC-H de aromáticos (BARBOSA, 2007).

Experimentos de RMN 1H e RMN 13C foram realizados, no entanto os espectros

não apresentaram sinais. Novas análises poderão ser feitas para se obter alguma

conclusão sobre a composição da amostra.

O

OH

O

O

OC

C

H3C

C

CH3

H

12

34

56

7

89

10

11

12

13

14

15 1'2' 3'

4'

5'

CrisaninaH

O OH

H

1

2

3 45

6

7

10

11

1213

15

18

19

20

814

17

169

Ácido caurenóico

61

Figura 61. Espectro de RMN de 13C da fração EAE1 (CHCl3; 50 MHz)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

%T

ran

sm

itta

nce

31

18

30

24

28

04

23

70

23

44

20

00

17

46

14

02

66

6

Figura 62. Espectro de IV da fração EAE2

O

OH

O

O

OC

C

H3C

C

CH3

H

12

34

56

7

89

10

11

12

13

14

15 1'2' 3'

4'

5'

CrisaninaH

O OH

H

1

2

3 45

6

7

10

11

1213

15

18

19

20

814

17

169

Ácido caurenóico

62

5.1.3.3. Extrato etanólico

A partição de 2,1808 g do extrato etanólico resultou em 3 fases de polaridades

diferentes: hexânica, clorofórmica e hidroalcoólica.

As fases hexânica e clorofórmica foram concentradas em evaporador rotatório,

rendendo respectivamente 0,3559 g e 0,4623 g.

O fracionamento de 0,4623 g da fase clorofórmica em coluna de sílica gel 60


reunidas em 43 frações conforme a semelhança do perfil químico. Porém, por se

tratarem de misturas e apresentarem massas insuficientes para posteriores

fracionamentos, essas frações não foram pesquisadas quanto a natureza de seus

constituintes.

A fase hidroalcoólica foi concentrada em evaporador rotatório, congelada e

liofilizada. O fracionamento de 1,5064 g da fase hidroalcoólica liofilizada em coluna de

Sephadex LH 20 rendeu 42 frações de 25 mL cada. Estas frações foram submetidas a

CCD e foram reunidas em 10 frações conforme a semelhança do perfil químico. Duas

frações foram submetidas posteriormente a análise por RMN 1H e RMN 13C, porém os

resultados foram inconclusivos porque os espectros não apresentaram sinais. Novas

análises poderão ser feitas a fim de se obter alguma conclusão sobre a composição da

amostra.

A Figura 63 (pág. 63) apresenta a obtenção e análise do EET de folhas de P.

brasiliensis.

5.1.3.4. Extrato aquoso

O fracionamento de 1,5583 g do extrato aquoso liofilizado em coluna de

Sephadex LH 20 rendeu 33 frações metanólicas de 25 mL cada. Estas frações foram

submetidas a CCD e foram reunidas em 12 frações com metanol conforme a

semelhança do perfil químico. Porém houve crescimento de fungos, e as amostras não

foram analisadas.

A Figura 64 (pág. 64) consta a obtenção e análise do EAQ de folhas de P.

brasiliensis.

Figura 63. Fracionamento e identificação dos constituintes químicos do EET


Fracionamento e identificação dos constituintes químicos do EET

3,1887 g Extrato etanólico

2,1808 g Partição


0,4623 g Fase clorofórmica

CCC Sílica gel 60 (Eluída com hexano, acetato de

etila e etanol)




Amostras não analisadas


Liofilização

1,6248 g

1,5064 g Sephadex LH 20 (Isocrática:

metanol)




RMN 1H e RMN 13C

Resultado inconclusivo

63

Fracionamento e identificação dos constituintes químicos do EET

hidroalcoólica

Sephadex LH 20 (Isocrática:

42 Frações (25

Reunião de


inconclusivo

Figura 64. Fracionamento do EAQ

5.1.4. Terpenóides identificados na espécie

No estudo realizado

essencial das folhas de P. brasiliensis

qualitativamente e quantitativamente em número superior aos sesquiterpenos.

A partir de extratos orgânicos, foram identificados um di

tipo olean-12-eno, urs-12-eno, urs

acetilados de alguns deles. Além disso, detectou

sesquiterpênica, porém outros estudos devem ser conduzidos

estrutura química.

A presença de lupeol, acetato de

na espécie por Bohlmann e colaboradores

Esta é a primeira vez que se relata a presença de diterpeno na espécie.

Diterpenos são encontrados em espécies da tribo Eupatorieae, sendo destacados aqueles

com esqueleto caurano (ALVARENGA

atividade antiinflamatória, o que pode justificar o uso popular da planta

(CAVALCANTI et al., 2006).

Lactonas sesquiterpênicas são características de Asteraceae e são encontradas

também em espécies da tribo Eupatorieae (BOHLMANN & JAKUPOVIC, 1990;

ZDERO & BOHLMANN, 1990; ALVARENGA

sesquiterpênicas do tipo helenalina s

de Arnica montana L., espécie nativa da Europa

tratamento de contusões, inflamações, dores

1979; LYSS et al., 1997; BLUMENTHAL, 1998)

brasiliensis, poderia justificar também o

Triterpenos com esqueletos oleano, ur

família Asteraceae, e estão presentes em praticamente todas as tribos (HEGNAUER,

1977; ZDERO & BOHLMANN, 1990).

13,6782 g Extrato Aquoso

Fracionamento do EAQ

5.1.4. Terpenóides identificados na espécie P. brasiliensis

realizado foram identificados monoterpenos e sesquiterpenos no óleo

P. brasiliensis, sendo que os monoterpenos se apresentaram


A partir de extratos orgânicos, foram identificados um diterpeno, triterpenos do

eno, urs-20-eno, urs-20(30)-eno e lup-20(29)-

acetilados de alguns deles. Além disso, detectou-se a possível presença de uma lactona

sesquiterpênica, porém outros estudos devem ser conduzidos para identificar sua

A presença de lupeol, acetato de β-amirina, espatulenol e cadineno já foi descrita

e colaboradores (1984).


são encontrados em espécies da tribo Eupatorieae, sendo destacados aqueles

com esqueleto caurano (ALVARENGA et al., 2005). O ácido caurenóico apresenta


, 2006).

ctonas sesquiterpênicas são características de Asteraceae e são encontradas


ZDERO & BOHLMANN, 1990; ALVARENGA et al., 2001).

sesquiterpênicas do tipo helenalina são as responsáveis pela atividade antiinflamatóri

L., espécie nativa da Europa utilizada na medicina tradicional para o

tratamento de contusões, inflamações, dores musculares e reumáticas

, 1997; BLUMENTHAL, 1998). A presença dessas substâncias em

poderia justificar também o seu uso popular.

Triterpenos com esqueletos oleano, ursano e lupeano são característicos da


1977; ZDERO & BOHLMANN, 1990). É sabido que os dois primeir

1,5583 g CCC Sephadex LH

20


CCD Reunião de frações


64

monoterpenos e sesquiterpenos no óleo

, sendo que os monoterpenos se apresentaram


terpeno, triterpenos do

-eno e derivados

se a possível presença de uma lactona

para identificar sua

amirina, espatulenol e cadineno já foi descrita


são encontrados em espécies da tribo Eupatorieae, sendo destacados aqueles

O ácido caurenóico apresenta


ctonas sesquiterpênicas são características de Asteraceae e são encontradas


, 2001). Lactonas

is pela atividade antiinflamatória

utilizada na medicina tradicional para o

musculares e reumáticas (HALL et al.,

A presença dessas substâncias em P.

sano e lupeano são característicos da


primeiros tipos de



Amostras deterioradas

65

esqueletos possuem atividade antiinflamatória, o que também pode justificar o uso

popular da planta (LIU, 1995).

5.2. ENSAIOS BIOLÓGICOS

5.2.1. Atividade antiinflamatória

Na Figura 65 (pág. 66) estão representados os gráficos utilizados para a análise

do percentual de linfócitos positivos para as citocinas por citometria de fluxo. O gráfico

de distribuição pontual FSC (Tamanho das células) x SSC (Complexidade das células) é

utilizado para a seleção da população de linfócito. Em seguida são utilizados gráficos de

distribuição pontual FL1 x FL2 para avaliar a expressão de citocinas em linfócitos.

Sendo que E é a cultura estimulada, AE+E a cultura estimulada e acrescida de EAE,

ET+E a cultura estimulada e acrescida de EET e AQ+E a cultura estimulada e acrescida

de EAQ. Os dados aqui apresentados se referem a população de linfócitos estimulados a

expressarem a citocina é o IFN-γ.

As culturas AE, ET e AQ não mostraram diferença significativa (p>0,05) na

porcentagem de células positivas para as citocinas quando comparadas com a cultura C.

Verificou-se uma redução (p<0,05) na porcentagem de linfócitos positivos para a

citocina IFN-γ nas culturas ET+E, e AQ+E quando comparados com a cultura E,

indicando uma inibição da produção da citocina pelos extratos.

Não foi observada diferença (p>0,05) na porcentagem de células positivas para

TNF-α e IL-10 quando os leucócitos foram tratados com os diferentes extratos de P.

brasiliensis.

Os flavonóides presentes no EAQ e as cumarinas presentes no EET e no EAQ

possuem efeito antiinflamatório, e podem ser os responsáveis por essa atividade em P.

brasiliensis, justificando assim o seu uso popular (ROBBERS et al., 1997).

Mais estudos merecem ser realizados a fim de se comprovar o efeito

antiinflamatório da espécie para validar o seu uso popular.

66

Figura 65. População de linfócitos estimulados a expressarem a citocina IFN-γ

E

AE+E ET+E

AQ+E

67

A Figura 66 mostra os resultados do ensaio para cada citocina separadamente.

CAE E

TAQ E

AE+

E

ET+

E

AQ+E

0

10

20

30

40

50

Cultura

% d

e lin

fócitos IN

F- γγ γγ

+

CAE E

TAQ E

AE+

E

ET+

E

AQ+E

0

20

40

60

80

Cultura

% d

e lin

fócitos T

NF- αα αα

+

CAE E

TAQ E

AE+

E

ET+

E

AQ+E

0.0

0.5

1.0

1.5

Cultura

% d

e lin

fócitos IL-1

0+

Figura 66. Potencial imunomodulador para as citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-10 (*

Diferença estatística significativa em relação as outras amostras analisadas – p<0,05)

* *

68

5.2.2. Atividade antioxidante

5.2.2.1. Fenólicos totais

No método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, a curva analítica foi obtida

utilizando ácido tânico (AT) como padrão (Fig. 67). Considerando A = absorbância; C =

concentração de compostos fenólicos totais em equivalentes de AT em mg, a equação

da reta encontrada foi:

A = 1,89 x 10-4 C + 0,2719 R= 0,9915

100 200 300 400 5000.28

0.30

0.32

0.34

0.36

0.38

Concentração de ácido tânico (ppm)

Absorb

ância

(765 n

m)

Figura 67. Curva de regressão linear do padrão AT nas concentrações 100, 200, 300,

400 e 500 ppm.

Substituindo a absorbância (A) de cada solução dos extratos na equação da reta,

obteve-se C, e em seguida, calculou-se a quantidade de fenóis totais em equivalentes de

AT na solução dos extratos, utilizando a equação:

mg AT (10 mL) = 10 x C / 1000

Por fim, para encontrar a quantidade em mg de fenóis totais em equivalentes de

AT por g de extrato, utilizou-se a equação seguinte:

mg AT / g extrato = 1000 x mg AT (10 mL) / 3

As quantidades em mg de fenólicos totais em equivalentes de AT por g dos

extratos de P. brasiliensis são apresentadas na Tabela 11 (pág. 69).

69

Tabela 11. Quantidade de fenólicos totais nos extratos de P. brasiliensis

Extrato Absorbância média

(nm)

Fenólicos totais

(mg AT/g extrato ± DP)

EHE 0,011 -

EAE 0,125 -

EET 0,281 160,49 ± 26,94

EAQ 0,317 795,41 ± 17,63

n = 3

Analisando os extratos de diferentes polaridades, não foram detectadas

concentrações significativas de compostos fenólicos no EH e no EAE. Já no EE e no

EA, foi observada a ocorrência de 160,49 ± 26,94 mg e 795,41 ± 17,63 mg de

compostos fenólicos por grama do extrato. O extrato mais polar foi o que apresentou

maior quantidade de fenóis totais.

Comparando-se os resultados com a triagem fitoquímica, verifica-se que foram

detectados compostos fenólicos em EET e EAQ, no entanto, os mesmos não foram

isolados e identificados a partir de seus fracionamentos. Para EAE os resultados

sugerem ausência desses compostos, ou os mesmos não estavam em concentrações

detectáveis para os testes aplicados. Apesar da triagem fitoquímica sugerir a presença de

cumarinas e flavonóides no EHE, não se detectou quantidades significativas de fenóis

totais através do método de Folin-Ciocalteu.

5.2.2.2. Atividade de retirada de radical usando o método DPPH

A Tabela 12 e Figura 68 (pág. 70) apresentam os resultados de ARR de extratos

de P. brasiliensis.

Analisando os resultados de concentração de extratos de P. brasiliensis a 200 e

300 ppm e comparando-os com o antioxidante utilizado com padrão, ácido gálico, a 200

e 300 ppm, verifica-se que os extratos tem uma pequena ARR.

Excetuando-se o EAQ na maior concentração, os extratos não possuem diferença

estatística (p>0,05) entre si na ARR. Há diferença estatística (p<0,05) entre os extratos

de P. brasiliensis nas concentrações avaliadas e as soluções de ácido gálico a 200 e 300

ppm.

70

Tabela 12. Atividade de retirada de radical de extratos de P. brasiliensis e do

antioxidante ácido gálico

Amostra Média Abs ± DP % ARR

EHE 200 1,028 ± 0,014 17,69

EHE 300 1,012 ± 0,008 18,98

EAE 200 1,002 ± 0,004 19,78

EAE 300 1,000 ± 0,010 19,96

EET 200 0,975 ± 0,019 21,94

EET 300 0,961 ± 0,004 23,06

EAQ 200 0,950 ± 0,010 23,96

EAQ 300 0,677 ± 0,006 45,80

AG 200 0,204 ± 0,004 83,67

AG 300 0,109 ± 0,003 91,27

n = 3

EHE 200

EHE 300

EAE 200

EAE 300

EET 20

0

EET 30

0

EAQ 200

EAQ 300

AG 200

AG 300

0

20

40

60

80

100

% A

RR

Figura 68. Porcentagem de ARR dos extratos de P. brasiliensis e do padrão ácido

gálico (* Diferença estatística significativa em relação as outras amostras analisadas –

p<0,05)

Conforme os resultados, o EAQ na concentração de 300 ppm foi o extrato que

apresentou o melhor resultado de atividade antioxidante por captura de radical, porém

esse resultado não é significativo quando comparado com o padrão ácido gálico.

* *

71

5.2.2.3. Poder redutor

A Tabela 13 e Figura 69 mostram os resultados de poder redutor de extratos de

P. brasiliensis sobre o íon metálico Fe3+.

Tabela 13. Poder redutor dos extratos de P. brasiliensis sobre o íon metálico Fe3+

Amostra Média Abs ±

DP (50 ppm)

Média Abs ±

DP (100 ppm)

Média Abs ±

DP (200 ppm)

Média Abs ±

DP (300 ppm)

EHE 0,202 ± 0,001 0,222 ± 0,003 0,283 ± 0,006 0,308 ± 0,010

EAE 0,224 ± 0,001 0,239 ± 0,001 0,259 ± 0,005 0,301 ± 0,001

EET 0,209 ± 0,002 0,241 ± 0,010 0,251 ± 0,024 0,263 ± 0,008

EAQ 0,201 ± 0,001 0,226 ± 0,014 0,254 ± 0,005 0,370 ± 0,026

AG 0,821 ± 0,007 0,865 ± 0,029 0,882 ± 0,0011 0,919 ± 0,004

n = 3

A partir dos resultados de poder de redução dos extratos de P. brasiliensis sobre

o íon metálico Fe3+, observa-se uma pequena atividade dos extratos, quando

comparados com o poder de redução do padrão ácido gálico.

Observou-se um maior poder de redução no EAQ na concentração de 300 ppm,

no entanto, baixo quando comparado ao padrão.

Verifica-se que o poder de redução é dependente da concentração, isto é, quanto

mais concentrado está o extrato, maior o seu poder redutor.

50 100

200

300

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0EHE

EAE

EET

EAQ

AG

Concentração (ppm)

Absorb

ância

(700 n

m)

Figura 69. Poder redutor dos extratos de P. brasiliensis (* Diferença estatística

significativa em relação as outras amostras analisadas – p<0,05)

* * * *

72

O potencial antioxidante por redução de íon metálico dos EAQ e EET, mesmo

sendo baixo, pode ser associado com a presença de compostos fenólicos. O EAQ de P.

brasiliensis contém a concentração mais elevada de compostos fenólicos, e tem o maior

potencial antioxidante, apesar de não ser comparável à atividade antioxidante de

composto fenólico ácido gálico.

73

66666666........ CCCCCCCCoooooooonnnnnnnncccccccclllllllluuuuuuuussssssssããããããããoooooooo

74

6. CONCLUSÃO

O óleo essencial de folhas frescas de P. brasiliensis obtido por hidrodestilação

com aparato de Clevenger, permitiu um rendimento de 0,002%. Através das técnicas de

cromatografia gasosa, espectrometria de massas e índice de retenção relativo foram

identificados e quantificados 25 terpenos, dentre eles, 82,95% de monoterpenos e

16,20% de sesquiterpenos, totalizando 99,15% de óleo identificado.

Pela triagem fitoquímica nos extratos da espécie, destaca-se a presença de

cumarinas, flavonóides, taninos condensáveis, antocianinas, antraquinonas, saponinas,

compostos redutores e triterpenos/esteróides. Apesar desse resultado, os processos de

fracionamento dos extratos levaram a identificação apenas da presença de terpenóides

nas folhas de P. brasiliensis: o diterpeno ácido caurenóico; os triterpenos β-amirina,

acetato de β-amirina, α-amirina, acetato de α-amirina, lupeol, acetato de lupeol,

pseudotaraxasterol, taraxasterol; e possivelmente a lactona sesquiterpênica crisanina. As

cumarinas, flavonóides, o diterpeno ácido caurenóico, os triterpenos de esqueleto oleano

e ursano, e as lactonas sesquiterpênicas possuem atividade antiinflamatória

comprovada, o que pode justificar o uso popular da planta.

Os extratos etanólico e aquoso de P. brasiliensis têm potencial antiinflamatório,

uma vez que modularam a produção da citocina tipo 1, IFN-γ, envolvida diretamente na

inicialização e amplificação da resposta inflamatória, explicando assim o seu uso

popular.

Os extratos etanólico e aquoso são os únicos a possuírem concentração

significativa de compostos fenólicos quando comparados aos outros extratos menos

polares. Sendo o extrato aquoso, o que apresenta maior quantidade de compostos

fenólicos, maior atividade de retirada de radical, e maior poder de redução do íon

metálico Fe3+, sendo assim, apresentou maior potencial antioxidante, apesar de não ser

tão significativo quando comparado com o padrão ácido gálico.

Sendo a espécie P. brasiliensis utilizada na medicina popular e, havendo poucos

estudos fitoquímicos e nenhum biológico sobre a mesma, os dados obtidos nesse

trabalho são uma contribuição ao conhecimento da composição química da planta, bem

como algumas atividades biológicas. Mais estudos deverão ser conduzidos a fim de

validar a utilização medicinal desta espécie e determinar o(s) marcador(es) químico(s).

75

77777777........ RRRRRRRReeeeeeeeffffffffeeeeeeeerrrrrrrrêêêêêêêênnnnnnnncccccccciiiiiiiiaaaaaaaassssssss BBBBBBBBiiiiiiiibbbbbbbblllllllliiiiiiiiooooooooggggggggrrrrrrrrááááááááffffffffiiiiiiiiccccccccaaaaaaaassssssss

76

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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