UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO

CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

KAMILLA FÉRES BOROTO

PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgG

GERADOS EM CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A

PROTEÍNA RECOMBINANTE LigA(625-1224aa) DE Leptospira

interrogans

NITERÓI

2015

KAMILLA FÉRES BOROTO

PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgG

GERADOS EM CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A

PROTEÍNA RECOMBINANTE LigA(625-1224aa) DE Leptospira

interrogans

Monografia apresentada ao Curso de

Graduação em Biomedicina da

Universidade Federal Fluminense, como

requisito parcial para obtenção do grau de

Bacharel, habilitação em Análises Clínicas.

Orientadora:

Msc. Gabriela dos Santos Esteves

Mestre em Biologia; Chefe do Laboratório

de Tecnologia Recombinante (LATER);

Bio-Manguinhos; Fundação Oswaldo Cruz

Co-orientador:

Prof. Dr. Marco Alberto Medeiros

3

À minha família que sempre

esteve ao meu lado, apoiando e

dando força para seguir em

frente com as minhas escolhas.

iii

Agradecimentos

À Deus por me ajudar e me guiar durante todos os momentos da minha

vida, me mostrando sempre o caminho a seguir.

Aos meu pais, Olindo e Igleice, por me apoiarem sempre, e por me

ensinarem a valorizar todas as minhas conquistas, mesmo que por menores

que estas pudessem ser.

À minha irmã, Marianna, que sempre esteve ao meu lado nas minhas

escolhas e por ser minha melhor amiga.

Às minhas amigas Sarah, Luciana, Patrícia e Gabriella, pela paciência e

pelo apoio durante todos esses anos de amizade.

À minha turma, 2011.2, que me acolheu quando cheguei de

transferência, e por tudo que passamos juntos nesses quatro anos de

faculdade.

À minhas amigas, Raphaela, Caroline e Thaís, pelas conversas,

brincadeiras e horas estudando. Vou leva-las para sempre na minha vida.

Mesmo morando longe, vocês fazem parte de uma fase muito bonita da minha

vida.

Ao Anderson e a Jéssica, pelas palhaçadas, piadas, risos, conselhos, e

pela amizade que construímos. Vocês já fazem parte da minha vida.

Ao projeto de extensão conhecido como “Boa Noite, Bom Dia” (BNBD),

por todas as nossas visitas que nunca foram iguais. Que o projeto continue

sendo leve e muito bonito, fazendo sempre o bem a todos os pacientes do

Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) e a todos os participantes dele.

iv

À minha primeira orientadora, Priscilla Oliveira, por me aceitar como

aluna desde o meu segundo período de faculdade e, por ter tido a paciência

para me ensinar tudo o que estivesse ao alcance dela.

Aos colegas do laboratório de neurobiologia, pela ajuda, paciência,

conversas, e brincadeiras durante os dois anos trabalhando no laboratório.

Ao Dr. Marco Alberto Medeiros, que aceitou me orientar durante o meu

trabalho de conclusão de curso, junto a Mestre Gabriela dos Santos Esteves.

Também pela oportunidade de ter proporcionado um aprendizado em outra

área do conhecimento.

Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER) pelo

apoio, conversas, conselhos, piadas e momentos de confraternização.

À coordenação, corpo docente e funcionários do curso de biomedicina

por nos ajudarem de todas as maneiras possíveis, facilitarem a nossa vida

acadêmica e nos inspirarem com seus exemplos de dedicação ao trabalho.

v

"O sucesso normalmente vem para quem está ocupado demais para

procurar por ele"

Henry David Thoreau.

vi

RESUMO

A leptospirose é uma enfermidade cosmopolita grave que acomete diferentes

espécies de animais domésticos, silvestres e o homem. As vacinas

convencionais baseadas na célula inteira inativada contra leptospirose, tanto

para uso humano quanto veterinário, possuem sucesso limitado, pois induzem

imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Para vacinas

constituídas por peptídeos e peptídeos recombinantes necessitam que sejam

utilizados adjuvantes em suas vacinas por possuir baixa imunogenicidade. Os

adjuvantes podem promover resposta celular ou humoral, e, no caso desse

trabalho onde foram avaliadas formulações contendo Hidróxido de Alumínio, a

principal resposta imunológica gerada é a humoral. Os anticorpos gerados a

partir desta resposta necessitam que sua qualidade seja avaliada. Para tal, o

teste de avidez, baseado no ensaio imunoenzimático, foi padronizado utilizando

o agente caotrópico, Tiocianato de Amônio. Testamos a interferência desse

agente quanto a ligação do antígeno em placa de 96 poços, e foi observado

que concentrações menores que 1M não interferiam nesta ligação. Diante

disso, para determinação do índice de avidez, foi estabelecida uma

concentração onde o agente caotrópico diminuísse em 50% a ligação entre o

anticorpo presente no soro padrão e o antígeno fixado na placa. A

concentração estabelecida foi a de 0,4M e a partir dela houve a determinação

da faixa do índice de avidez (41,39 a 53,72%) dos anticorpos produzidos com a

formulação contendo LigA(625-1224aa) e Hidróxido de Alumínio. Em nosso

estudo essa avaliação é uma ferramenta de extrema importância que serve

como parâmetro para determinação do potencial dessa formulação em ensaios

de desafio com Leptospiras vivas, que serão realizados futuramente.

vii

Abstract

Leptospirosis is a serious cosmopolitan disease affecting different species of

domestic animals, wildlife and humans. The conventional vaccines based on

inactivated whole cell against leptospirosis, both for veterinary and human use,

have limited success, because they induce short and serovar-specific protective

immunity. Vaccines consisting of recombinant peptides and peptides are

required to use adjuvants in their formulations because of their low

immunogenicity. Adjuvants can promote cellular or humoral response and in

this work were evaluated formulations containing Aluminum hydroxide, generate

and the primary immune response generated is humoral. The quality of

response generated from the antibodies need to be evaluated. To this end, the

avidity test based on enzyme-linked immunosorbent assay was standardized

using the chaotrope agent Ammonium thiocyanate. We tested the agent

interference such as antigen binding in a 96 well plate, and we observed that

the concentrations below 1M do not interfere in the linkage. Thus, to determine

the avidity index, it was necessary to stabilish the chaotropic agent

concentration to decrease 50% on binding between the antibody present in

standard serum and the antigen fixed on the plate. The determined

concentration of Amonium tiocyanate was 0.4M and consequently the

determination of the avidity index range of 41.39 to 53.72% of the antibodies

produced with the formulation containing LigA(625-1224aa) and Aluminum

hydroxide. In our study, this evaluation is an extremely important tool that

serves as a parameter to determine the potential of this formulation challenge

tests with live Leptospira, which will be held in the future.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Análise da interferência do Tiocianato de Amônio, em diferentes

concentrações, na sensibilização da placa. ..................................................... 18

Figura 2 - Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz

em 50% a ligação antígeno-anticorpo. .............................................................19

Figura 3 - Confirmação da concentração 0,4M de Tiocianato de Amônio.

.......................................................................................................................... 20

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Média da densidade óptica obtida na leitura das diferentes

concentrações do antígeno utilizando a diluição seriada do soro padrão. ...... 16

Tabela 2: Valores de Índices de Avidez das repetições da concentração de

0,4M do Tiocianato de Amônio..........................................................................19

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

APC: Célula Apresentadora de Antígeno

BSA: Albumina Bovina

DO: Densidade óptica

ELISA: do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EU: Unidade de Elisa

FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz

LPS: Lipopolissacarídeo

MHC: Complexo Maior de Histocompatibilidade

PBS: Tampão Fosfato

PBS-T: Tampão Fosfato 1X contendo Tween 20

TMB: Tetrametilbenzidina

x

SUMÁRIO

1. Introdução ............................................................................................................... 1

1.1.Vacina ........................................................................................................................... 3

1.2.Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) ......................................................................... 5

1.3. Adjuvantes ................................................................................................................... 6

1.3. ELISA ........................................................................................................................... 7

1.4. Teste de avidez ........................................................................................................... 8

2. Justificativa e relevância ...................................................................................... 10

3. Objetivos ............................................................................................................... 12

4. Métodos ................................................................................................................. 13

4.1. Produção de soro hiperimune .................................................................................. 13

4.2. Padronização ELISA................................................................................................. 13

4.2.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio ............................ 13

4.2.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com

TMB ............................................................................................................................... 14

4.3. Padronização do teste de Avidez ...................................................................... 14

4.3.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas ........... 14

4.3.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz

de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de

avidez (IA) ..................................................................................................................... 15

4.3.3. Análise dos dados.............................................................................................. 16

5. Resultados ............................................................................................................ 17

5.1. Padronização do ELISA ........................................................................................... 17

5.1.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio ........................... 17

5.1.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de revelação com

TMB ............................................................................................................................... 18

5.2. Padronização do Teste de Avidez ..................................................................... 18

5.2.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas ........... 18

5.2.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio capaz

de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a determinação do índice de

avidez (IA) ..................................................................................................................... 19

6. Discussão e conclusão ........................................................................................ 22

7. Referências bibliográficas.................................................................................... 25

8. Anexo ..................................................................................................................... 32

1

1. Introdução

A leptospirose é uma doença bacteriana, infecciosa sistêmica, aguda,

febril, causada pela bactéria do gênero Leptospira, do qual se conhecem

atualmente 14 espécies patogênicas, sendo a mais importante a L. interrogans.

A unidade taxonômica básica é o sorovar. Mais de 200 sorovares já foram

identificados, e cada um tem o seu hospedeiro preferencial, ainda que uma

espécie animal possa albergar um ou mais sorovares. No Brasil, os sorovares

Icterohaemorrhagiae e Copenhageni estão frequentemente relacionados aos

casos mais graves da doença (LEVETT, 2001).

As estimativas indicam que mais de 500.000 casos de leptospirose

ocorram no mundo todos os anos, sendo que mais de 10% dos casos são

fatais (Ministério da Saúde, 2014). Este número subestima o impacto global por

que a notificação se baseia nos casos de doença severa e o diagnóstico da

leptospirose se confunde com o de outras causas de febre aguda, como a

dengue (MCBRIDE et al., 2005).

A doença vem sendo reconhecida como um importante problema de

saúde pública no mundo inteiro, e considerada a zoonose geograficamente

mais difundida no mundo (ADLER, 2010). No Brasil a doença é de distribuição

endêmica com ocorrência durante todos os meses do ano e com coeficiente

médio de incidência anual de 1,9/100.000 habitantes. Além disso, epidemias

urbanas anuais, principalmente em comunidades carentes, pós-enchentes e

alagamentos, e surtos relacionados em áreas rurais, principalmente em locais

de cultura de subsistência, também são considerados padrões epidemiológicos

da doença (Ministério da Saúde, 2014). Os principais reservatórios de

leptospiras são os roedores, os quais são portadores assintomáticos da

doença. Em áreas metropolitanas, o rato de esgoto (Rattus norvegicus), é

considerado o mais importante transmissor para o homem. A bactéria se

localiza e se multiplica nos túbulos renais dos animais infectados, os quais não

apresentam sintomas, e são liberadas na urina durante semanas ou meses

após a fase aguda contaminando água, solo e alimentos (McBRIDE et al.,

2005). Infecções de animais ou seres humanos ocorrem a partir de contato

2

direto com a urina ou indiretamente através da água contaminada. Os veículos

podem ser animais selvagens ou domésticos, especialmente roedores e

marsupiais pequenos, gado, porcos e cães (ADLER, 2010).

A patogenia da leptospirose inclui a penetração ativa dos micro-

organismos através de mucosas (ocular, respiratória e gênito-urinária), da pele

escarificada e até mesmo da pele íntegra, em condições especiais que

favoreçam a dilatação dos poros, como ocorre quando há permanência por

tempo prolongado em coleções de água contaminada (EVANGELISTA, 2010).

Vencidas as barreiras da porta de entrada, normalmente a doença segue duas

fases. As leptospiras se multiplicam ativamente no interstício e nos humores

orgânicos (sangue, linfa e líquor), caracterizando a leptospiremia. Uma vez a

infecção instalada, na próxima fase, pode haver a evolução da doença em

hospedeiros sensíveis com o desenvolvimento de imunidade protetora e

eliminação do micro-organismo, ou desenvolvimento do estado de portador

crônico (ATHANAZIO et al., 2008; FRAGA et al., 2011).

A maioria das complicações de leptospirose está associada com a

localização da bactéria no interior dos tecidos durante a fase imune e, assim,

ocorrer durante a segunda semana da doença (LEVETT, 2001).

A grande maioria das infecções causadas por leptospiras são ou

subclínica ou de gravidade muito leve, e os pacientes provavelmente não

procuram ajuda médica. É de menor proporção infecciosa, se apresentando

como uma doença febril de início súbito. Outros sintomas incluem calafrios,

cefaleia, mialgia, dor abdominal, derrame conjuntival e, menos frequentemente

uma erupção cutânea. Estes sintomas caracterizam a Síndrome Anictérica da

leptospirose, e, geralmente, com duração de cerca de uma semana, com a

resolução coincidindo com o aparecimento de anticorpos. A dor de cabeça é

frequentemente grave, semelhante a que ocorre na dengue, com dor retro-

orbital e fotofobia. Mialgia afetando a parte inferior das costas, coxas e

panturrilhas são muitas vezes intensas. Em aproximadamente 25% dos casos

pode apresentar meningite asséptica. Para diagnosticar devem ser feitos testes

contra infecções virais comuns, como gripe e dengue (LEVETT, 2001).

A Síndrome da Leptospirose Ictérica é muito mais grave em que o curso

clínico é frequentemente muito rapidamente progressivo. Os casos mais graves

possuem uma elevada taxa de mortalidade, que varia entre 5 e 15%. A icterícia

3

que ocorre na leptospirose não está associada com a necrose hepatocelular,

mas sim pelo nível de bilirrubina no soro estar elevada. Sendo assim, várias

semanas podem ser necessárias para normalização. As complicações da

forma grave da leptospirose pode enfatizar a natureza multissistêmica da

doença. Ela é uma causa comum de insuficiência renal aguda, que ocorre entre

16 e 40% dos casos. A trompocitopenia ocorre em aproximadamente 50% dos

casos, podendo ser um marcador para o desenvolvimento da insuficiência renal

aguda. No entanto, trombocitopenia na leptospirose é transitória e não resulta

de coagulação intravascular disseminada (LEVETT, 2001). A Síndrome

Hemorrágica grave é reconhecida como uma importante manifestação da

doença. Essa síndrome é considerada como um fator prognóstico relevante, já

que está associada com os casos fatais de leptospirose, sendo essa a principal

causa de morte por leptospirose no Brasil (FRAGA et al., 2011).

A manutenção da bactéria nas regiões urbanas e rurais do Brasil é

favorecida pelo clima tropical úmido e uma vasta população de roedores. O

crescimento urbano desordenado e a grande quantidade de lixo espalhado

sobre as vias e terrenos baldios propiciam também um ambiente ideal para a

proliferação da população murina (Ministério da Saúde, 2001).

O controle químico para roedores tem sido utilizado (Centro de Controle

de Zoonoses-SP, 2003), mas representa alto custo e não pode ser mantido

como intervenção de longo prazo. Entretanto, as intervenções que promovem a

utilização de indumentária de proteção, assim como profilaxia com doxiciclina

(DE SAINTE MARIE, 2015) são difíceis de implementar em grandes

populações de risco. Estratégias de estratificação de risco não foram

desenvolvidas para orientar medidas de saneamento e de controle de roedores

em populações onde medidas de prevenção não podem ser facilmente

implementadas. Em virtude desses motivos, se fazem necessárias estratégias

de intervenção mais eficazes, tais como as vacinas.

1.1. Vacina

Vacinas são substâncias, como proteínas, toxinas, bactérias ou vírus

atenuados ou mortos, que ao serem introduzidas no organismo de um animal,

4

levam a uma reação do sistema imunológico semelhante a que ocorreria no

caso de uma infecção por um determinado agente patogênico, desencadeando

a produção de anticorpos que acabam por tornar o organismo imune, ou ao

menos mais resistente, a esse agente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).

As vacinas convencionais contra leptospirose, tanto para uso humano

quanto veterinário, possuem sucesso limitado, pois falham ao induzir proteção

contra a infecção. Ido e colaboradores demonstraram em 1916 que a

imunização com leptospiras mortas confere proteção contra infecção em

condições experimentais. No entanto, a viabilidade do desenvolvimento de

vacinas humanas, especialmente para populações carentes em áreas

endêmicas, ainda continua sendo um desafio. Barreiras ao desenvolvimento da

vacina incluem a falta de conhecimento dos sorovares localmente circulantes,

avaliação da segurança e eficácia da vacina, e custo (GUERRA, 2013). Sendo

assim, vacinas seguras e efetivas para leptospirose ainda não estão

disponíveis para uso humano.

Embora países como China e Cuba produzam vacinas baseadas em

bacterina para utilização em humanos (Yan, 2003; Martinez, 2004), estas

vacinas não têm sido licenciadas fora destes países devido a preocupações

relacionadas à eficácia em longo prazo, capacidade de proteção cruzada

contra a ampla variedade de sorovares e reações adversas (McBRIDE, 2005;

KOIZUMI, 2005).

Existe um grande número de sorovares patogênicos, o que impõe uma

maior limitação para a produção de uma vacina com componentes multi-

sorovar (GAMBERINI et al., 2005). Nas imunizações a resposta gerada é

predominantemente humoral e sorovar específica (EVANGELISTA, 2010).

Assim, protegem somente contra infecções causadas por sorovares homólogos

ou antigenicamente relacionadas.

Estratégias para o desenvolvimento de vacinas de subunidade oferecem

uma série de vantagens, tais (i) ausência de reações adversas associadas ao

LPS, (ii) possibilidade de indução de resposta de longa duração e (iii) a

utilização de proteínas conservadas entre diversos sorovares patogênicos

(HAAKE & MATSUNAGA, 2002). Os candidatos vacinais mais promissores são

aqueles baseados em subunidades da proteína Lig, as quais induzem níveis de

proteção que se aproximam de 100% (YAN et al., 2009; KOIZUMI, 2004). As

5

Ligs são proteínas de membrana externa presentes em todos os sorovares de

leptospiras patogênicas e a expressão destas proteínas ocorre somente

durante a infecção (MATSUNAGA et al., 2003; KOIZUMI, 2004).

1.2. Leptospiral immunoglobulin-like (Lig)

Fatores de virulência expressos durante a infecção do hospedeiro são

esperados para ativar respostas de anticorpos específicos e, portanto, podem

servir como marcadores candidatos para um teste de diagnóstico sorológico à

base de proteína recombinante. A nova família de proteínas associadas à

superfície, imunoglobulina Leptospira (Ig) proteínas (Liga, LigB, e LigC) foram

identificados (PALANIAPPAN et al, 2002; CRODA et al, 2007).

Essas proteínas são expressos durante a infecção do hospedeiro e

parecem induzir fortes respostas de anticorpos em pacientes e animais

infectados (CRODA et al, 2007).

Três proteínas Lig foram descritas, designadas LigA, LigB, e LigC que

estão envolvidos na adesão de leptospira a proteínas de matriz extracelular e

proteínas do plasma, incluindo colagénios I e IV, laminina, fibronectina e

fibrinogénio são induzidas a osmolaridade fisiológica. As proteínas Ligs têm

domínios repetidos in tandem do tipo BIg (bacterial immunoglobulin-like) de 90

aminoácidos, os quais são encontrados em fatores de virulência como intimina

e invasina. O número de domínios BIg varia de 12 a 13 em função da proteína

Lig. LigB e LigC tem uma região carboxi-terminal, a qual não está presente em

LigA. Os genes lig estão presentes em todas as espécies patogênicas e não

estão presentes em leptospiras saprófitas. A expressão de lig está ligada à

virulência das cepas de Leptospira e as proteínas são super-expressas durante

a infecção (Lehmann et al, 2014). Assim, as proteínas Lig parecem estar

intimamente associadas à infecção do hospedeiro mamífero, sugerindo que

eles podem ser imunógenos protetores (CHOY, 2007).

Alguns dados preliminares indicam seu potencial no desenvolvimento de

vacinas recombinantes contra leptospirose, pois são proteínas de membrana

externa presentes em todos os sorovares de leptospiras patogênicas e a

expressão destas proteínas ocorre somente durante a infecção (MATSUNAGA

et al., 2003; KOIZUMI; WATANABE, 2004). O nosso grupo inicialmente

6

demonstrou que um único fragmento, LigA(625-1224aa), o qual corresponde

aos seis domínios carboxi-terminais da molécula LigA, conferiram

imunoproteção contra mortalidade (67-100%, P <0.05) em hamsters que

receberam dose letal da cepa Fiocruz L1-130. Dados recentes do nosso grupo

demonstraram que a imunização com fragmentos de LigA(625-1224aa)

conferiram proteção 90-100% contra desafio letal por via intramuscular e

subcutânea com 20ug de proteína formulada com adjuvante Hidróxido de

Alumínio, contudo falhou em conferir imunidade estéril (MEDEIROS et al.,

2006).

1.3. Adjuvantes

Adjuvantes (do latim adjuvare, que significa "para ajudar ou auxílio"),

foram descritas pela primeira vez por Ramon como "substâncias utilizadas em

combinação com um antígeno específico que produziu uma resposta

imunológica mais robusta do que o antígeno sozinho" (RAMON, 1924 – citado

em AWATE S. et al, 2013). Adjuvantes imunológicos são substâncias capazes

de aumentar a resposta imunológica específica e auxiliar o antígeno a

desencadear uma resposta precoce, elevada e duradoura (MOTA, 2006;

RESENDE, 2004).

Como os antígenos constituídos por proteínas recombinantes

apresentam estrutura e conformação menos complexas do que os agentes

patogênicos inativados, a utilização de adjuvantes é necessária para aumentar

a imunogenicidade dessas proteínas. (AUDIBERT, 2003; RESENDE, 2004).

Os adjuvantes apresentam diversos mecanismos de ação e devem ser

selecionados baseados na rota de administração e na imunidade requerida

pelo tipo de vacina. De acordo com alguns estudos, vem sendo descrito que os

melhores componentes para serem utilizados como adjuvantes incluem

extratos de parede bacteriana, óleos de parafinas, sais de metais, endotoxinas,

e recentemente, lipossomos, Interferon, entre outros (RESENDE, 2004; RUSH,

2000).

Os adjuvantes têm sido tradicionalmente usados para aumentar a

magnitude de uma resposta imune adaptativa a uma vacina, com base no título

de anticorpo ou na capacidade de prevenir a infecção. Além disso, um segundo

7

papel tornou-se cada vez mais importante: os adjuvantes podem ser utilizados

para direcionar a resposta adaptativa, de modo a produzir formas mais eficazes

de imunidade para cada patógeno específico. Os adjuvantes são atualmente

utilizados para: (I) aumentar a resposta a uma vacina na população em geral;

(II) aumentar as taxas de soroconversão em populações com reduzida

capacidade de resposta devido à idade, doença, ou por medidas terapêuticas;

(III) facilitar o uso de doses menores de antígeno; e (IV) permitir imunização

com menos doses de vacina. Para vacinas atualmente em desenvolvimento, os

adjuvantes são cada vez mais utilizados para promover tipos de imunidade que

não podem ser geradas somente pelo antígeno. (COFFMAN et al., 2010).

Evidências sugerem que os adjuvantes possuem um ou mais dos

seguintes mecanismos para induzir respostas imunitárias: (I) liberação

prolongada de antígeno no local da injeção; (II) up-regulation de citocinas e

quimiocinas; (III) recrutamento celular no local da injeção; (IV) aumento da

absorção de antígenos e apresentação do antígeno pelas células

apresentadoras de antígeno (APC); (V) de ativação e maturação de APC,

aumento da expressão de moléculas do complexo principal de

histocompatibilidade (MHC) classe II e de moléculas co-estimulatórias (AWATE

et al., 2013).

Com a utilização de adjuvantes, a resposta imunológica pode ser

modulada seletivamente entre o Complexo Principal de Histocompatibilidade

(MHC) Classe I ou Classe II, e resposta tipo T helper1 (Th1), que é muito

importante para formação de resposta protetora contra patógenos

intracelulares, ou resposta tipo T helper2 (Th2), que se direciona para

antígenos e micro-organismos extracelulares (RESENDE, 2004).

O Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3) continua sendo o adjuvante mais

utilizado nas vacinas para humanos, contribuindo na indução de uma boa

resposta do tipo Th2. Entretanto, ele possui uma capacidade limitada na

estimulação da resposta imunológica celular Th1, importante para a proteção

contra diversos patógenos (HOGENESCH, 2002; RESENDE, 2004).

1.3. ELISA

8

O Ensaio Imunoenzimático (do inglês: Enzyme Linked Immuno Sorbent

Assay, ELISA) foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio

para a detecção de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a

imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro

reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade

enzimática como da imunológica do anticorpo.

O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou

anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do

ensaio forem bem padronizados. Especial atenção deve ser dada ao material

utilizado na produção da placa, cujas propriedades podem variar de acordo

com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo que será

disposto também é muito importante, pois qualquer material heterólogo

competirá pelo espaço na placa. O objetivo do ensaio é a quantificação ou

verificação da presença de um antígeno ou anticorpo (FERREIRA et al., 1996).

Devido à técnica do ELISA ter um alto nível de sensibilidade e

reprodutibilidade e permitir automação, tornou-se um método de eleição para

avaliação de um grande número de amostras. Existem vários tipos de ELISA

sendo eles do tipo direto, indireto, duplo sanduíche. (VAZ et al., 2007).

Alguns problemas podem dificultar a padronização do ELISA, tais como:

(I) alto background, (II) leituras superestimadas por ligações inespecíficas, (III)

lavagens inadequadas, (IV) conjugado com baixa afinidade, entre outros (REIS,

2000). Por outro lado, trata-se de um teste rápido e de baixo custo, altamente

sensível, que possui segurança por não utilizar o patógeno vivo. Ademais, sua

análise é de fácil execução, possui objetividade da interpretação dos resultados

(TOMICH, 2009) além da estabilidade e necessita de um pequeno volume de

reagentes, podendo ser utilizado para estudos epidemiológicos (TIZARD,1998).

1.4. Teste de avidez

A afinidade do anticorpo por um antígeno pode ser definida como a força

da ligação de um único tipo de anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal, a

um único alvo antigênico. (MURPHY et al., 2010)

9

A avidez é uma medida da estabilidade global do complexo entre

anticorpo e antígeno. A força total de uma interação antígeno-anticorpos é

governada por três elementos principais: a afinidade intrínseca do anticorpo

com o epítopo, a valência do anticorpo e antígeno, e o arranjo geométrico dos

componentes que interagem. Em soro humano, a população de anticorpos é

policlonal (heterogênea), e a determinação da afinidade dos anticorpos não é

possível. No entanto, adaptações no conceito de afinidade foram feitas, e a

determinação da estabilidade na interação antígeno-anticorpo em uma

população mista de anticorpos foi denominada determinação da avidez do

anticorpo. Quanto mais heterogênea é a população de anticorpos, mais difícil é

estabelecer uma verdadeira medida da avidez. A população de anticorpos ideal

para determinação seria uma população homogênea. Nesta situação, uma

estimativa exata da constante de afinidade é determinada. (HARLOW, 1998).

Foram descritas diferentes metodologias utilizadas para a determinação

da avidez de um anticorpo e avanços recentes na medição da avidez do

anticorpo possibilitam a aplicação de tais medições para um grande número de

soros, tais como os obtidos durante um teste de vacina (GOLDBLATT, 1997;

ROMERO-STEINER et al., 2005). Assim, agentes caotrópicos, tais como Uréia,

Tiocianato ou Dietilamina (DEA), estão sendo preferidos para a determinação

da estimativa média da avidez do anticorpo por serem considerados métodos

mais simples. O uso dos agentes caotrópicos é baseado na dissociação do

complexo antígeno-anticorpo de baixa avidez enquanto os de alta avidez

continuam associados (ROMERO-STEINER et al., 2005). Admite-se que o

Tiocianato age sobre as ligações hidrofóbicas, e que a Uréia age nas ligações

de hidrogênio (ANTTILA et al., 1998). A Dietilamina (DEA) tem ação associada

ao pH da solução (GOLDBLATT, 1997).

A ressonância plasmônica de superfície (do inglês: surface plasmon

ressonance) é uma metodologia utilizada para detectar adsorção molecular, e

em ensaios imunológicos utiliza antígenos ligados a uma placa de metal e os

anticorpos mono ou policlonais reativos para esse antígeno. Através das

constantes de dissociação e cinética obtidas, também podem mensurar a

avidez de um determinado anticorpo. Esse teste deve ser utilizado em conjunto

com o ensaio de ELISA e/ou outras técnicas associadas (LYNCH, 2014).

10

2. Justificativa e relevância

A leptospirose é uma doença de notificação compulsória no Brasil. É

uma zoonose de elevada incidência no país, com uma média de 13.000 casos

notificados por ano, sendo mais de 4.000 casos confirmados entre os anos de

2000 e 2013 em todo o país, possuindo letalidade média de 10,8% (SINAN,

2014). A necessidade crítica de novas estratégias de intervenção é uma

prioridade em saúde pública a fim de prevenir desfechos graves da doença. A

mortalidade da leptospirose é alta mesmo sob tratamento de suporte intensivo

(LEVETT, 2001; BHARTI et al., 2003; MCBRIDE et al., 2005).

O uso de vacinas é uma estratégia com custo-benefício potencialmente

positivo para a prevenção da leptospirose. A Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

identificou uma nova família de fatores putativos de virulência: as proteínas

Ligs. Resultados do grupo demonstraram evidências de que as proteínas Ligs

conferem proteção contra desafio letal em modelo experimental para

leptospirose e, assim são candidatos potenciais para uma vacina de

subunidade. Porém, para as vacinas com proteínas recombinantes é

necessária a utilização de adjuvantes para potencializar a resposta imunológica

e assim, serão testados diferentes adjuvantes, incluindo o Hidróxido de

Alumínio.

Como é sabido, a resposta imunológica mediada por este adjuvante é

principalmente a resposta humoral (SCHIRMBECK et al., 1994), e assim, se faz

necessário a avaliação quantitativa e qualitativa dos anticorpos produzidos a

partir de uma formulação contendo este adjuvante (RESENDE, 2004). Não

existem medidas efetivas de controle que possam ser oportunamente

implementadas em comunidades carentes. Logo, a produção de uma vacina

eficaz para tal doença, seria a melhor opção para prevenção da mesma.

Para isso, diversos testes são necessários para que uma vacina

eficiente possa ser liberada para uso em seres humanos, e para tal é

importante avaliar o tipo de resposta associada (celular ou humoral). Neste

trabalho, utilizaremos o teste de ELISA com o qual poderemos determinar os

tipos e a qualidade dos anticorpos produzidos pelos animais imunizados a

partir de uma formulação vacinal, já que o Hidróxido de Alumínio estimula a

resposta humoral.

11

Os testes baseados na técnica de ELISA precisam ser padronizados

antes de serem avaliadas as respostas nos camundongos, a fim de controlar as

variações que possam ocorrer durante o teste.

Os padrões de referência para considerar que um teste baseado em

ELISA seja realmente confiável devem permitir determinar a atividade do

anticorpo a um nível específico de sensibilidade do teste. Para estabelece-los

para qualquer ELISA, deve-se considerar a seleção de padrões que

representam, em média, o que se espera de uma resposta imunológica do

organismo em questão. Devem-se considerar também, os isotipos de

anticorpos, concentração e avidez, bem como a especificidade antigênica

(WRIGHT et al, 1993).

A avidez de um anticorpo vem sendo demonstrada como uma

característica importante da resposta imune de proteção (BORROW, 2001;

BORROW 2003; SOUTHERN, 2004; HARRIS, 2007). Imunologicamente, a

seleção constante de clones de células B é responsável pelo aumento

progressivo de anticorpos de alta avidez. As células produtoras de anticorpos

de baixa afinidade vão sendo selecionadas negativamente por apoptose no

folículo e, as que produzem anticorpos de alta afinidade vão se acumulando no

centro germinativo, onde serão selecionadas para se tornarem células de

memória (TARLINTON & SMITH, 2000).

Com esse estudo pretende-se avaliar a força de interação entre o

anticorpo produzido e o antígeno recombinante, a fim de determinar a avidez

deste anticorpo. Com anticorpos eficientes, espera-se ter uma resposta

imunológica também eficaz. Sabendo disso, iremos utilizar uma formulação

vacinal para imunizar os camundongos a fim de obtermos o soro padrão, e a

partir dele padronizaremos a técnica. Estes resultados contribuirão, no futuro,

para a escolha de formulações vacinais mais eficazes.

12

3. Objetivos

a) Objetivo geral: Padronizar um ensaio imunoenzimático para

determinar o índice de avidez de anticorpos murinos direcionados

contra o fragmento recombinante da proteína LigA(625-1224aa) de

Leptospira sp.

b) Objetivos específicos:

Determinar a concentração de antígeno pra sensibilização da

placa;

Determinar o tempo de bloqueio da placa;

Determinar diluição do soro padrão e do conjugado;

Determinar o tempo de revelação da reação;

Avaliar a interferência do Tiocianato de Amônio na

sensibilização da placa;

Avaliar a interferência do Tiocianato de Amônio na ligação

antígeno-anticorpo (avaliação da avidez);

Determinar a faixa de aceitação do soro padrão.

13

4. Métodos

4.1. Produção de soro hiperimune

Este projeto cumpre todos os requisitos da Comissão de Ética em

Experimentação Animal - PROTOCOLO - CEUA LW-18/13. Sendo assim, trinta

camundongos da linhagem BALB/c, fêmeas, com idade entre 4 e 6 semanas,

foram imunizados com 10 μg de LigA(625-1224aa) adsorvida em 0,1 mg de

Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3; Alhydrogel®, Brenntag).

Os animais receberam três doses da formulação vacinal, pela via

intramuscular, com intervalo de sete dias entre cada inoculação. Sete dias após

a terceira dose, os animais receberam uma dose de reforço, pela via

intraperitoneal, com 10 μg de LigA(625-1224aa) sem adjuvante. Três dias após

o reforço, os camundongos foram submetidos à punção cardíaca e eutanásia.

Os tubos contendo o sangue dos camundongos foram centrifugados por 10

minutos a 1000 x g. Após a centrifugação, o soro foi aliquotado e armazenado

a -20ºC. Ressalta-se que os procedimentos experimentais foram avaliados e

aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da

FIOCRUZ/RJ, protocolado com a numeração P-63/12-2 (Anexo 1).

4.2. Padronização ELISA

4.2.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio

Foram utilizados 100ng da proteína recombinante LigA 625-1224aa para

a sensibilização das placas de 96 poços (NuncMaxiSorp®). Essas placas foram

incubadas overnight de 2º-8ºC. No dia seguinte, foram lavadas quatro vezes

utilizando tampão de lavagem; Tampão fosfato (PBS)/Tween 20 0,05% pH 7,2

(PBS-T).

O tempo de bloqueio foi testado, incubando as placas com tampão de

bloqueio (PBS-T, BSA 3%, soro bovino e leite) por uma hora e outra placa por

14

duas horas. As placas foram então bloqueadas e lavadas com tampão de

lavagem.

4.2.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de

revelação com TMB

Uma diluição seriada do soro padrão, na faixa de 1:100 a 1:104.857.600

foi realizada, seguindo o protocolo do ELISA, para determinar a diluição

correspondente a uma DO de aproximadamente 1,0 a um comprimento de

onda de 450nm.

As placas em seguida foram lavadas com tampão de lavagem; Tampão

fosfato (PBS)/Tween 20 0,05% pH 7,2 (PBS-T); e incubadas com conjugado

anti-IgG de camundongo produzido em coelho associado à peroxidase - Sigma,

e utilizada a diluição de 1:30000 (de acordo com o fabricante) por uma hora a

37ºC.

A reação foi revelada utilizando TMB (Life Technologies) e, em um

primeiro teste a placa foi revelada após 5 minutos. Esse tempo de revelação

posteriormente foi testado e assim, foram utilizados os tempos de revelação da

placa, com leitura após 10, 15 e 20 minutos de incubação.

Após esses tempos, a reação foi parada com a adição de Ácido Sulfúrico

2N e a leitura foi feita no comprimento de onda 450nm, na leitora de placas

TECAN. Com os parâmetros analisados e padronizados, seguimos para a

próxima fase.

4.3. Padronização do teste de Avidez

4.3.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas

As placas de ELISA (NuncMaxiSorp®) foram sensibilizadas com a

concentração de antígeno definida no item 4.2.1, diluídos em tampão de

sensibilização. As placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC, e no dia

seguinte, lavadas utilizando PBS-T. Em seguida, foi adicionado o tampão de

bloqueio e a placa foi incubada à 37ºC, de acordo com o tempo definido no

item 4.2.1. As placas foram lavadas novamente com tampão de lavagem, e

15

então foi adicionada a etapa com a agente caotrópico, Tiocianato de Amônio, a

fim de testar a interferência deste na sensibilização da placa. Foram utilizadas

diferentes molaridades do Tiocianato de Amônio, sendo elas: 2M, 1,5M, 1M,

0,5M, 0,25M, 0,12M, 0,06M; que foram diluídas em Tampão Fosfato com soro

bovino a 0,3% (PBS-BSA 0,3%) e avaliadas em quadruplicata. A placa foi

incubada por 15 minutos a temperatura ambiente.

Em seguida, as placas foram lavadas quatro vezes com tampão de

lavagem e seguimos o protocolo do ELISA normalmente. As placas foram

incubadas com o soro padrão, na diluição inicial definida no item 4.2.1, e foi

feita diluição seriada. As placas foram incubadas por 1 hora a 37º C, lavadas

com tampão de lavagem e incubadas com anticorpo secundário (anti-IgG de

camundongo produzido em coelho associado a peroxidase - Sigma) na

concentração definida no item 4.2.3, por 1 hora a 37ºC. Após lavagem da

placa, o substrato TMB foi adicionado. As placas foram incubadas no tempo

definido pelo item 4.2.3 à temperatura ambiente na ausência de luz, e a reação

foi paralisada com Ácido Sulfúrico 2M e a absorbância foi determinada a

450nm. Esse teste foi feito para verificar a concentração de Tiocianato de

Amônio capaz de desfazer a ligação antígeno-anticorpo sem afetar a

sensibilização da placa.

4.3.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio

capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a

determinação do índice de avidez (IA)

As placas de ELISA (NuncMaxiSorp®) foram sensibilizadas com a

concentração de antígeno definida no item 4.2.1, diluídos em tampão de

sensibilização. As placas foram incubadas overnight de 2º-8ºC, e no dia

seguinte, foram lavadas utilizando tampão de lavagem. Em seguida, foi

adicionado o tampão de bloqueio e procedeu-se a incubação à 37ºC de acordo

com o tempo definido no item 4.2.1.

As placas foram lavadas com tampão de lavagem, e incubadas por 1h a

37°C com soro padrão e novamente lavadas com tampão de lavagem. Em

seguida, foram incubadas com Tiocianato de Amônio, em diferentes

16

concentrações, por 15 minutos à temperatura ambiente. As placas foram

lavadas com tampão de lavagem e incubadas com anticorpo secundário em

concentração definida no item 4.2.3, durante 1 hora a 37ºC. Após lavagem, o

substrato TMB foi adicionado, e as placas incubadas pelo tempo definido no

item 4.2.3, à temperatura ambiente e na ausência de luz. A reação foi

paralisada com Ácido Sulfúrico 2M e a leitura da DO a 450nm.

Esse teste foi feito para determinar qual a diluição do soro onde se

observa uma redução de 50% na ligação antígeno-anticorpo, que foi

visualizada a partir da diferença de densidade óptica (DO).

4.3.3. Análise dos dados

Os dados do ELISA foram obtidos através do programa SoftMaxPro –

Molecular Devices, o qual determina os títulos de IgG total em EU/mL

baseados na diluição da amostra e na DO obtida.

O índice de avidez (IA) foi obtido pela razão da concentração de IgG

total da amostra incubada com Tiocianato de Amônio pela amostra sem o

agente caotrópico multiplicado por 100, como mostra a fórmula abaixo, cujo

resultado é dado em porcentagem.

Índice de Avidez (IA) = [(soro com NH4SCN-)/(soro sem NH4SCN-)]*100

17

5. Resultados

5.1. Padronização do ELISA

5.1.1. Concentração de antígeno na placa / Tempo de bloqueio

Para determinação da concentração da proteína LigA(625-1224aa)

utilizada na sensibilização das placas durante o teste com as três

concentrações do antígeno foram realizadas uma diluição seriada do soro do

camundongo.

As concentrações do antígeno testadas não se mostraram muito

diferentes, e por esta razão, foi escolhido utilizar a concentração de 100ng uma

vez que a utilização de uma baixa concentração de antígeno pode acarretar na

perda da sensibilidade do teste, e também evitar reações inespecíficas devido

a uma maior concentração do mesmo (Tabela 1).

Tabela 1: Média da densidade óptica obtida na leitura das diferentes

concentrações do antígeno utilizando a diluição seriada do soro padrão.

Ao serem testados dois tempos diferentes para o bloqueio da placa, foi

observado que o tempo de bloqueio de duas horas leva a uma diminuição do

background da reação.

Diluição seriada

50ng (Média da DO)

100ng (Média da DO)

200ng (Média da DO)

1 / 100 1,96 2,15 2,28

1 / 200 1,41 1,60 1,90

1 / 400 0,98 1,11 1,26

1 / 800 1,00 1,00 0,97

1 / 16000 0,56 0,69 0,56

1 / 32000 0,26 0,36 0,40

1 / 64000 0,39 0,39 0,28

18

5.1.2. Diluição do soro padrão e determinação do tempo ideal de

revelação com TMB

A partir dos resultados obtidos no item 5.1.1, foi necessário avaliar a

melhor diluição do soro que alcance a DO entre 0,8 e 1,0 à 450nm. Essa DO é

desejada, pois acima é formado um platô que não pode ser utilizado para o

cálculo, que analisa a faixa linear da curva. Após a incubação com o conjugado

a reação do TMB foi interrompida após 5 minutos. Com esse experimento foi

observado que a melhor diluição inicial foi estabelecida entre 1:800 e 1:1600,

mas o tempo para revelação não se mostrou satisfatório pois a faixa de DO não

foi obtida de acordo com o previsto.

Então, o ELISA foi feito repetido, e seguindo o protocolo, foi feita diluição

seriada do soro a partir de 1:1000, mas ao adicionar o TMB, foram feitas

leituras com intervalos de 5 minutos, sem utilizar o Ácido sulfúrico para parar a

reação, até completar 20 minutos. Ao interromper a reação foi visto que na

diluição de 1:2000 do soro padrão o tempo necessário para que a reação

alcançasse a DO 1,0 foi de 20 minutos. Desta forma o teste de ELISA foi

padronizado utilizando-se a diluição de 1:2000 do soro padrão com tempo de

revelação de 20 minutos.

5.2. Padronização do Teste de Avidez

5.2.1. Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização das placas

Após padronizar o teste de ELISA indireto, iniciaram-se os testes para

padronização do teste de avidez utilizando o soro padrão. O Tiocianato de

Amônio além de dissociar as ligações antígeno-anticorpo pode interferir na

ligação do antígeno com a placa de poliestireno. Assim, era necessário definir a

concentração a partir da qual o agente caotrópico não interfere na ligação da

proteína recombinante com a placa.

Ao comparar a DO obtida a partir da reação sem o Tiocianato de Amônio

com a DO da reação que utilizou o agente caotrópico não foi observada uma

diferença significativa entre as concentrações abaixo de 1M de Tiocianato

19

(Figura 1). Todas as concentrações superiores comprometeram a

sensibilização das placas acarretando na dissociação do antígeno.

Figura 1: Análise da interferência do Tiocianato de Amônio, em diferentes

concentrações, na sensibilização da placa.

5.2.2. Teste para definição da concentração ideal de Tiocianato de Amônio

capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo para a

determinação do índice de avidez (IA)

Com os parâmetros do ELISA determinados, seguimos para a

identificação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em 50% a

ligação antígeno-anticorpo. Após vários testes, optou-se por utilizar as

concentrações de 0,47M, 0,45M, 0,43M e 0,4M. O experimento demonstrou

que a concentração capaz de reduzir em 50% a ligação antígeno-anticorpo e

ao mesmo tempo não interferir na sensibilização das placas foi de 0,4M (Figura

2).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

5M 4M 3M 2M 1,5M 1M 0,8M 0,75M 0,7M 0,5M 0,35M

Mé

dia

da

DO

Concentração do Tiocianato

Interferência do Tiocianato de Amônio na sensibilização

com tiocianato sem tiocianato

20

Figura 2: Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio que reduz em

50% a ligação antígeno-anticorpo.

A partir deste dado, foi feito outro teste utilizando apenas a concentração

de 0,4M para determinar uma faixa de aceitação do soro padrão (Figura 3 e

Tabela 2), levando em consideração o desvio padrão. Esse dado será utilizado

posteriormente.

Ao fazer as análises através do programa SoftMax Pro, foi obtida uma

faixa de aceitação do soro padrão entre 41,39% e 53,72% (desvio padrão:

6,16).

Tabela 2: Valores de Índices de Avidez das repetições com Tiocianato de

Amônio (0,4M)

Teste 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

I.A (%) 47,56 55,64 51,84 58,19 45,68 40,62 45,66 45,38 46,61 38,36

0,47M 0,45M 0,43M 0,4M

I.A (%) 39,38676374 44,60227485 44,19696587 49,66478991

0

10

20

30

40

50

60 ín

dic

e d

e av

idez

(%)

Confirmação da concentração de Tiocianato de Amônio ideal

21

Figura 3: Repetição do teste de avidez utilizando a concentração de 0,4M de

Tiocianato de Amônio para obtenção da faixa de aceitação do soro padrão.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

índ

ice

de

avid

ez (%

)

repetições do teste

Teste da concentração

22

6. Discussão e conclusão

A necessidade de mostrar a qualidade dos métodos de análises

laboratoriais está sendo cada vez mais exigida na avaliação da resposta

imunológica. Para garantir que essa avaliação gere informações viáveis sobre

a amostra ela deve passar por uma etapa de padronização.

O teste de ELISA é considerado um teste altamente sensível (menor

risco de falso-negativo) e específico (menor risco de falso-positivo) além de ser

um teste barato e tem a possibilidade de testar várias amostras ao mesmo

tempo, porém, alguns reagentes são suscetíveis a degradação com facilidade.

Por ser uma técnica sensível e específica, ela está sujeita a erros de

pipetagem, variações no tempo de incubação e lavagem, e alterações nos

reagentes (DULL, 1976). Para a padronização do teste de ELISA foram

utilizadas as concentrações e diluições determinadas na literatura como ponto

inicial da pesquisa.

Os ensaios de avidez dos anticorpos fornecem uma ferramenta de

laboratório baseado em ELISA para a avaliação da atividade funcional do

anticorpo. É sabido que quanto mais heterogênea é a população de anticorpos,

mais difícil é de estabelecer uma medida confiável da afinidade dos mesmos,

sendo o ideal uma população homogênea para tal (ROMERO-STEINER et al.,

2001).

Goldblatt (1997) mostrou que a utilização de diferentes agentes para

verificar a avidez de um anticorpo frente ao seu antígeno não mostraria

diferença quanto ao resultado do índice de avidez. Logo, a escolha do

Tiocianato de Amônio foi feita visto que outros estudos experimentais que são

realizados em Bio-manguinhos o utilizam.

Agentes caotrópicos, tais como Tiocianato de Sódio ou de Amônio, têm

sido amplamente utilizados para a dissociação ou interferência de ligação da

reação antígeno-anticorpo, permitindo que apenas os anticorpos com avidez

mais elevada permaneçam ligados ao antígeno alvo. A base desta interação é

dependente da concentração do composto do agente caotrópico de interferir

com as interações eletrostáticas que mantêm o complexo antígeno-anticorpo.

Quanto maior for a avidez dos anticorpos na amostra de soro, mais forte é a

ligação antígeno-anticorpo formada, e, por conseguinte, uma concentração

23

maior de Tiocianato de Amônio é necessária para quebrar ou evitar a formação

de tais complexos antígeno-anticorpo. Existem três formas de se obter a avidez

de um anticorpo, tais como, utilização crescente do agente caotrópico e

diluição fixa do soro, utilização de uma única concentração do agente e

variação da diluição do soro, e competição entre o anticorpo presente no soro e

o agente caotrópico que são adicionados concomitantemente em contato com

o antígeno (ROMERO-STEINER et al., 2005).

Para avaliar a concentração do agente caotrópico capaz de reduzir em

50% a ligação antígeno-anticorpo utilizamos o teste que fixa a diluição do soro,

capaz de permitir um intervalo de DO entre 0,8 e 1,0, e uma diluição seriada do

agente caotrópico. Tal metodologia será utilizada para análise de amostras

posteriores, pois é capaz de detectar mais eficientemente as amostras com

baixa e alta avidez (ROMERO-STEINER et al., 2005).

Gray and Saw (1993) relataram a presença de artefatos durante a

dissociação usando concentrações mais baixas do Tiocianato de Amônio em

um método para o polissacarideo pneumococal. Sendo assim, Romero-Steiner

et al (2005) observaram que a utilização de uma única concentração de agente

caotrópico elimina estes potenciais vieses no cálculo do índice de avidez. Foi

escolhida a utilização do modelo que fixa a diluição do Tiocianato de Amônio e

varia a diluição do soro, pois altas concentrações de anticorpo podem levar a

uma alta avidez e com isso necessitam de uma concentração maior do

Tiocianato de Amônio, entretanto esta alta concentração do agente pode

acarretar na dissociação do antígeno sensibilizado na placa.

Métodos tradicionais de ELISA podem não detectar interações de baixa

afinidade com taxas de dissociação rápida e esses dados podem ser menos

confiáveis. Nestes ensaios tradicionais, um índice de avidez relativo é

calculado após a dissociação de anticorpos de baixa avidez. Uma advertência

notável associada com os ensaios que utilizam agentes de dissociação é que

os anticorpos que se ligam a epítopos conformacionais podem ser mais

facilmente dissociados do seu complexo ligado devido a alterações na

conformação de epítopo. Essas alterações podem não refletir corretamente a

força de ligação inerente (LYNCH, 2014). De acordo com nossos resultados,

onde tivemos uma faixa de aceitação de 41,39% a 53,72%, se configurando um

bom resultado. Entretanto, devido a todas as possíveis limitações técnicas já

24

citadas, outras técnicas deveriam ser associadas, como Surface Plasmon

Resonance (SPR), que permitiria embasar melhor os resultados obtidos se

avaliado em conjunto com o ELISA. Além disso, de acordo com estudo de

Kasturi et. al (2011), para análise da quantidade e qualidade dos anticorpos

produzidos na avaliação do desenvolvimento de vacinas associadas à

adjuvantes, outras técnicas associadas ao estudo também devem ser

avaliadas. No nosso caso, a avaliação de citocinas e interleucinas seria este

componente adicional do estudo.

Existe a necessidade da avaliação da qualidade de anticorpos

produzidos frente a diferentes formulações vacinais para a proteína

recombinante LigA(625-1224aa). Este projeto está inserido dentro de um

projeto maior, onde serão testadas diferentes formulações vacinais, utilizando

esta proteína recombinante combinada com diferentes adjuvantes, e para este

fim, a padronização do ensaio imunoenzimático para determinação do índice

de avidez destes anticorpos foi necessária, pois será utilizada como base para

a avaliação da qualidade dos anticorpos gerados a partir dessas diversas

formulações vacinais.

25

7. Referências bibliográficas

ADLER, B; DE LA PEÑA-MOCTEZUMA, A. Leptospira and leptospirosis.

Veterinary Microbiology v.140, p.287-296, 2010.

ATHANAZIO, D.A; SILVA, E.F; SANTO, C.S; ROCHA, G.M; VANNIER-

SANTOS, M.A; MCBRIDE, A.J; KO, A.I; REIS, M.G. Rattus norvegicus as a

model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.

Acta Tropica, v.105, n.2, p.176-180, 2008.

AUDIBERT, F. Adjuvants for vaccines, a quest. International

Immunopharmacology, v. 3, p. 1187- 1193, 2003

AWATE S, BABIUK L A., MUTWIRI G; Mechanisms of action of adjuvants.

Front Immunol. 2013 May 16;4:114. doi: 10.3389/fimmu.2013.00114.

eCollection 2013.

BHARTI, A.R; NALLY, J.E; RICALDI, J.N. Leptospirosis: a zoonotic disease of

global importance. Lancet Infectious Diseases, v.3, p.757-771, 2003.

BORROW R, ANDREWS N, GOLDBLATT D, MILLER E; Serological basis for

use of meningococcal serogroup C conjugate vaccines in the United Kingdom:

reevaluation of correlates of protection. Infect Immun. 2001 Mar; 69(3):1568-73.

BORROW, R., D. GOLDBLATT, A. FINN, J. SOUTHERN, L. ASHTON, N.

ANDREWS, G. LAL, C. RILEY, R. RAHIM, K. CARTWRIGHT, G. ALLAN, AND

E. MILLER. Immunogenicity of, and immunologic memory to, a reduced primary

schedule of meningococcal C-tetanus toxoid conjugate vaccine in infants in the

United Kingdom, 2003, Infect. Immun. 71:5549–5555.

Centro de Controle de Zoonoses (CCZ-SP), São Paulo, Secretaria Municipal de

Saúde, Coordenação de Vigilância em Saúde, Gerencia de Vigilância

ambiental, Controle da Fauna Sinantropica e outras atividades 1998/2002.

Boletim Informativo do CCZ-SP; 2003

26

COFFMAN, RL; SHER, A; SEDER, RA; Vaccine Adjuvants: Putting Innate

Immunity to Work; Immunity. 2010 October 29; 33(4): 492–503.

CHOY HA, KELLEY MM, CHEN TL, MØLLER AK, MATSUNAGA J, HAAKE

DA; Physiological osmotic induction of Leptospira interrogans adhesion: LigA

and LigB bind extracellular matrix proteins and fibrinogen.; Infect Immun. 2007

May;75(5):2441-50. Epub 2007 Feb 12.

CRODA J, RAMOS JG, MATSUNAGA J, QUEIROZ A, HOMMA A, RILEY LW,

HAAKE DA, REIS MG, KO AI.; Leptospira immunoglobulin-like proteins as a

serodiagnostic marker for acute leptospirosis.; J Clin Microbiol. 2007

May;45(5):1528-34. Epub 2007 Mar 14.

DE SAINTE MARIE B, DELORD M, DUBOURG G, GAUTRET P, PAROLA P,

BROUQUI P, LAGIER JC.; Leptospirosis presenting as honeymoon fever.; Int J

Infect Dis. 2015 May;34:102-4. doi: 10.1016/j.ijid.2015.03.018. Epub 2015 Mar

30.

DULL, Enzime-linked immunosorbent assay (ELISA), Wold Health Organ,

vol.54, 1976

EVANGELISTA K V, COBURN J, Leptospira as an emerging pathogen: a

review of its biology, pathogenesis and host immune responses, Future

Microbiol. 2010 September; 5(9): 1413–1425. doi:10.2217/fmb.10.102.

FERREIRA, A. WATTER; ÁVILA, SANDRA L.M. Diagnóstico

Laboratorial .1996, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ.

FRAGA, T. R.; BARBOSA, A. S.; ISAAC, L.; Leptospirosis: Aspects of Innate

Immunity, Immunopathogenesis and Immune Evasion From the Complement

System. Scandinavian Journal of Immunology 73, 408–419; 2011

27

GOLDBLATT D. Simple solid phase assays of avidity. In: Turner MW, John- 17.

Booy R, Heath PT, Slack MPE, Begg N, Moxon ER. Vaccine failures after stone

AP, eds. Immunochemistry 2: a practical approach. Oxford: IRL primary

immunisation with Haemophilus influenzae type-b conjugate Press at Oxford

University Press, 1997:31–51.

GRAY, B. M.; SHAW D. R., Artifacts with the thiocyanate elution method for

estimating relative antibody avidity. J. Immunol. Methods, 1993, 157: 269–271.

GUERRA MA, Leptospirosis: Public health perspectives, Biologicals 41

295e297, 2013

HAAKE, D. A; CHAMPION, C. I; MARTINICH, C; SHANG, E. S; BLANCO, D. R;

MILLER, J. N; LOVETT, M. A. Molecular cloning and sequence analysis of the

gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of

pathogenic Leptospira spp. Journal Bacteriology v.175, p.4225-4234, 1993.

HAAKE, D.A; MATSUNAGA, J. Characterization of the leptospiral outer

membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.

Infection and Immunity, v.70, n.9, p.4936-45, 2002.

HARRIS SL, TSAO H, ASHTON L, GOLDBLATT D, FERNSTEN P.; Avidity of

the immunoglobulin G response to a Neisseria meningitidis group C

polysaccharide conjugate vaccine as measured by inhibition and chaotropic

enzyme-linked immunosorbent assays.; Clin Vaccine Immunol. 2007

Apr;14(4):397-403. Epub 2007 Feb 7.

HARLOW, E., AND D. LANE., Using antibodies: a laboratory manual, 1st ed.,

1998, p. 23–37. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

HOGENESCH, H; Mechanisms of stimulation of the immune response by

aluminum adjuvants; Vaccine 20, 2002; S34–S39

28

IDO Y, HOKI R, ITO H AND WANI H. The prophylaxis of Weil's disease

(Spirochaetosis Icterohaemorrhagica). J. Exp. Med. 1916; 24:471-483

KASTURI SP, SKOUNTZOU I, ALBRECHT RA, KOUTSONANOS D, HUA T,

NAKAYA HI, RAVINDRAN R, STEWART S, ALAM M, KWISSA M, VILLINGER

F, MURTHY N, STEEL J, JACOB J, HOGAN RJ, GARCÍA-SASTRE A,

COMPANS R, PULENDRAN B., Programming the magnitude and persistence

of antibody responses with innate immunity., Nature. 2011 Feb

24;470(7335):543-7. doi: 10.1038/nature09737.

KOIZUMI N, WATANABE H., Leptospirosis vaccines: past, present, and future.

J Postgrad Med 2005; 51:210-4

KOIZUMI, N; WATANABE, H. Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit

protective immunity. Vaccine v.22, p.1545-1552, 2004.

LEHMANN JS, MATTHIAS MA, VINETZ JM, FOUTS DE; Leptospiral

pathogenomics.; Pathogens. 2014 Apr 10;3(2):280-308. doi: 10.3390/

pathogens3020280.

LEVETT PN. Leptospirosis. Clin Microbiol Rev 2001; 14:296-326

LYNCH HE, STEWART SM, KEPLER TB, SEMPOWSKI GD1, ALAM SM,

Surface plasmon resonance measurements of plasma antibody avidity during pr

imary and secondary responses to anthrax protective antigen., J. Immunol

Methods. 2014 Feb;404:1-12. doi: 10.1016/j.jim.2013.11.026.

MARTINEZ R, PEREZ A, QUINONES MDEL C, ET AL. Efficacy and safety of a

vaccine against human leptospirosis in Cuba. Rev Panam Salud Publica 2004;

15:249-55

MATSUNAGA, J; BAROCCHI, M. A; CRODA, J; YOUNG, T. A; SANCHEZ, Y;

SIQUEIRA, I; BOLIN, C. A; REIS, M. G; RILEY, L. W; HAAKE, D. A; ALBERT,

K. I. Pathogenic Leptospira species express surface-exposed proteins

29

belonging to the bacterial immunoglobulin superfamily. Molecular Microbiology,

v.49, p.929-945, 2003.

McBRIDE AJ, ATHANAZIO DA, REIS MG AND KO AI., Leptospirosis. Curr

Opin Infect Dis 2005; 18:376-86

McBRIDE AJ, CERQUEIRA GM, SUCHARD MA, et al. Genetic diversity of the

Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp. Infect

Genet Evol 2009;9:196-205

McBRIDE, A. J; ATHANAZIO, D. A; REIS, M. G; KO, AI. Leptospirosis. Current

Opinion Infecttious Disease. v.18, p.376-386, 2005.

McDONOUGH, P. L; MOHAMMED, H. O. Cloning and molecular

characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans.

Infection and Immunity v.70, p.5924-5930, 2002.

MEDEIROS, A. M. et al. LigA and LigA Proteins (Leptospiral Ig-Like (Lig)

domains) for Vaccination and Diagnosis, 2006 - Publication number:

WO2007070996.

MINISTÉRIO DA SAÚDE, Fundação Nacional de Saúde, Manual de Normas de

Vacinação, 3º edição, 2001

MINISTÉRIO DA SAÚDE, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de

Vigilância das Doenças Transmissíveis; Leptospirose: diagnóstico e manejo

clínico; Brasília – DF, 2014

MINISTÉRIO DA SAÚDE, Sistema de Informação de Agravos de Notificação

(SINAN), 2014

MOTA, E.F.; LIMA, M.G.S.; MELO, D.F. Adjuvantes imunológicos: Avanços e

Perspectivas. Ciência Animal, 16(2): 79-88, 2006

30

MURPHY, K.; TRAVERS, P.; WALPORT M.; Imunobiologia de Janeway,

página 741, 7ª edição, Porto Alegre, Artmed, 2010

PALANIAPPAN, R. U; CHANG, Y. F; JUSUF, S. S; ARTIUSHIN, S; TIMONEY,

J. F; MCDONOUGH, S. P; BARR, S. C; DIVERS, T. J; SIMPSON, K. W;

MCDONOUGH, P. L; MOHAMMED, H. O.; Cloning and molecular

characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans.;

Infection and Immunity v.70, p.5924-5930, 2002.

REIS M.M, Testes Imunológico – Manual Ilust Profis Sal, 2000, 1ª edição,

editora SENAC, São Paulo.

RESENDE F.C.B.; PASSOLD J.; FERREIRA S.A.I.C; ZANETTI C.R.; LIMA HC;

Vaccine adjuvants: possibilities for use in humans or animals Rev. bras. alerg.

imunopatol. Vol. 27, Nº 3, 2004

ROMERO-STEINER S, HOLDER PF, GOMEZ DE LEON P, SPEAR W,

HENNESSY TW, CARLONE GM., Avidity determinations for Haemophilus

influenzae Type b anti-polyribosylribitol phosphate antibodies., Clin Diagn Lab

Immunol. 2005 Sep; 12(9):1029-35.

ROMERO-STEINER, S., J. FERNANDEZ, C. BILTOFT, M. E. WOHL, J. FERIS,

S. BALTER, O. S. LEVINE, AND G. M. CARLONE. 2001. Functional antibody

activity elicited by fractional doses of Haemophilus influenzae type b conjugate

vaccine (polyribosylribitol phosphate-tetanus conjugate). Clin. Diagn. Lab.

Immunol. 8:1115–1119.

RUSH BR, FLAMINIO MJ. Immunomodulation in horses. Vet Clin North Am

Equine Pract. 2000;16:183-97.

SCHIRMBECK R, MELBER K, KUHROBER A, JANOWICZ ZA, REIMANN J.

Immunization with soluble hepatitis B virus surface protein elicits murine H-2

class I-restricted CD8+ cytotoxic T lymphocyte responses in vivo. J Immunol.

1994;152:1110-9.

31

SOUTHERN, J., S. DEANE, L. ASHTON, R. BORROW, D. GOLDBLATT, N.

ANDREWS, P. BALMER, R. MORRIS, J. S. KROLL, AND E. MILLER. Effects

of prior polysaccharide vaccination on magnitude, duration, and quality of

immune responses to and safety profile of a meningococcal serogroup C

tetanus toxoid conjugate vaccination in adults. 2004. Clin. Diagn. Lab. Immunol.

11:1100–1104.

TARLINTON DM, SMITH KG.; Dissecting affinity maturation: a model explaining

selection of antibody-forming cells and memory B cells in the germinal centre.

Immunol Today. 2000 Sep;21(9):436-41.

VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e

aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007, 1ª edição

YAN W, FAISAL SM, MCDONOUGH SP, et al. Immunogenicity and protective

efficacy of recombinant Leptospira immunoglobulin-like protein B (rLigB) in a

hamster challenge model. Microbes Infect 2009; 11:230-7

WRIGHT P.F., E. NILSSON, E.M.A. VAN ROOIJ, M. LELENTA; M.H. JEGGO

Standardisation and validation of enzymelinked immunosorbent assay

techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis Rev. sci.

tech. Off. int. Epiz., 1993,12 (2), 435-450

32

8. Anexo

Anexo 1: