Universidade Nova de Lisboa

Instituto de Higiene e Medicina Tropical

Estudo da Influência da Flora Intestinal do

Mosquito Anopheles sp. no Estabelecimento da

Infecção por Plasmodium berghei

Joana da Graça Matias Gomes

DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM

SAÚDE TROPICAL

OUTUBRO, 2012

Universidade Nova de Lisboa

Instituto de Higiene e Medicina Tropical

Estudo da Influência da Flora Intestinal do

Mosquito Anopheles sp. no Estabelecimento da

Infecção por Plasmodium berghei

Joana da Graça Matias Gomes Licenciada em Biologia, ramo Biotecnologia pela Universidade do Açores

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários obtenção do grau

de Mestre em Saúde Tropical

Orientador: Professor Doutor Henrique Silveira

Unidade de Parasitologia Médica

Instituto de Higiene e Medicina Tropical

OUTUBRO, 2012

Agradecimentos

Gostaria de agradecer às pessoas que tornaram possível a realização deste

trabalho.

Em primeiro lugar gostaria de agradecer ao Professor Doutor Henrique Silveira

pela orientação desta tese e por todo apoio e motivação dados durante a sua realização.

Ao Professor Doutor Jorge Atouguia, Professor Doutor Jorge Seixas e

Professora Doutora Sónia Lima pela oportunidade de realizar este mestrado.

À Professora Doutora Isabel Sá-Correia e Doutora Carla Coutinho, do Instituto

Superior Técnico, pelas bactérias e apoio na manipulação das mesmas.

À Professora Doutora Isabel Couto e Sofia Costa pelo apoio demonstrado e

acompanhamento inicial na parte das culturas.

À Catarina Alves pela ajuda com os mosquitos e motivação.

À Luísa Simões pela ajuda com o tratamento estatístico dos resultados.

Às minhas colegas Isa Pires, Ana Custódio e Marta Machado pela amizade e

motivação ao longo deste mestrado.

A Filipa Ferreira a amizade e apoio demonstrados.

I

Resumo 

Estudo da Influência da Flora Intestinal do Mosquito Anopheles sp. no Estabelecimento da Infecção por Plasmodium berghei

Joana da Graça Matias Gomes

PALAVRAS-CHAVE: Plasmodium berghei, Microbiota, Pseudomonas aeruginosa, coinfecção, oocistos, biofilme

A malária é uma doença infecciosa com um efeito devastador nas áreas afectadas. É provocada pelo protozoário Plasmodium e transmitida pelo insecto vector do género Anopheles. As fêmeas hematófagas ao alimentar-se de um hospedeiro infectado vão dar continuidade ao ciclo de vida do parasita e transmiti-lo a um novo hospedeiro na próxima refeição sanguínea. O intestino médio dos mosquitos é um órgão imunocompetente, onde a presença de microrganismos vai activar o sistema imunitário, determinando a sua capacidade vectorial.

Novas abordagens de controlo biológico de doenças transmitidas por vectores parecem ganhar terreno. P. aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, potencialmente patogénica, em especial as estirpes produtoras de muco, sendo um microrganismo modelo em estudos de biofilmes. Estes são caracterizados por conferir tolerância a antibióticos e resistência ao sistema imune do hospedeiro. Com este trabalho pretendeu-se analisar o efeito da influência da flora bacteriana, nomeadamente isolados de Pseudomonas aeruginosa produtores de muco e não produtores, presentes no tracto digestivo de Anopheles sp. e a sua relação com a infecção por P. berghei.

Com este estudo é possível afirmar a existência de uma proporcionalidade directa entre a taxa de infecção por P. berghei e a ausência da Microbiota. A presença de Pseudomonas produtoras de muco no intestino médio dos mosquitos demonstrou conferir algum grau de protecção no estabelecimento da infecção, bem como na intensidade da mesma. Contudo, mais estudos necessitam ser realizados e com um maior número de mosquitos, de forma a ultrapassar as limitações impostas pelo tratamento antibacteriano. Possivelmente, a sobreposição de respostas imunes anti-bacterianas e anti-Plasmodium, vão provocar um incremento no sistema imune e limitação das infecções por Plasmodium. Biofilmes bacterianos têm demonstrado a capacidade de aderir e inibir o crescimento de protozoários

Uma melhor compreensão do papel da flora microbiana face ao sistema de defesa do hospedeiro poderá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo da transmissão da malária.

II

Abstract

Study of the Influence of Anopheles Midgut Microbiota in the Plasmodium berghei Infection Establishment

Joana da Graça Matias Gomes

KEYWORDS: Plasmodium berghei, Microbiota, Pseudomonas aeruginosa, coinfection, oocysts, biofilm

Malaria is an infectious disease with a devastating impact on the affected areas. It is caused by the protozoan Plasmodium and transmitted by the insect vector of the genus Anopheles. Hematofagous females, feeding on an infected host, will continue the life cycle of the parasite and pass it to a new host in the next blood meal. Insect midgut is an immunocompetent organ, where the presence of microorganisms will activate the immune system, thus, determining vector ability.

New approaches to biological control of vector-borne diseases appear to be gaining ground. Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative bacteria, potentially pathogenic, especially mucoid strains, being a model microorganism in biofilm studies. Pseudomonas are characterized by confer resistance to antibiotics and resistance to the host immune system. With this study we intended to analyze the effect of Microbiota, specially mucoid and non-mucoid P. aeruginosa strains, in the gut of Anopheles mosquitoes and is relation with infection by P. berghei.

With this study we can observe a direct proportionality between P. berghei infection rate and the absence of midgut microorganisms. The presence of mucus-producing Pseudomonas in the mosquito gut demonstrated the ability to confer some protection degree against P. berghei infection establishment as well as in infection intensity. However, further studies should be performed in order to overcome the limitations imposed by antibacterial treatment. Possibly the overlapping between anti-bacterial immune responses and anti-Plasmodium, will cause an increase in the immune system and the limitation of Plasmodium infection. Bacterial biofilms have demonstrated the ability to adhere and inhibit protozoans growth.

A better understanding of microbial role against host defense system may contribute to the development of new control strategies for malaria transmission.

III

Índice

Resumo ............................................................................................................................ II 

Abstract .......................................................................................................................... III 

Lista de Abreviaturas ..................................................................................................... 1 

Introdução ....................................................................................................................... 2 

Malária .......................................................................................................................... 3 

Vector Anopheles / Parasita Plasmodium ..................................................................... 4 

Ciclo de Vida ................................................................................................................ 5 

O Intestino Médio de Anopheles sp. ............................................................................. 7 

Novas Perspectivas no Controlo do Vector ................................................................ 11 

Pseudomonas aeruginosa e a Produção de Biofilme .................................................. 12 

Objectivo e Desenho Experimental ............................................................................. 16 

Objectivo ......................

Desenho Experimental .............................................................................................. 17 

.............................................................................................. 17 

M 18 etodologia ...................................................................................................................

Análise metagenómica de Anopheles gambiae infectados e não infectados com 

.......................................... ...... 19 Plasmodium falciparum .................................... .........

Determinação das curvas de crescimento de Pseudomonas aeruginosa dos 

................................................. 20 isolados mucoso e não mucoso ...............................

fecção de mosquitos Anopheles stephensi ................ 21 Esterilização bacteriana e in

ei ................................................ 24 Infecção dos mosquitos com Plasmodium  bergh

as do intestino médio de Anopheles stephensi ................... 25 Isolamento de bactéri

Contagem de oocistos ............................................................................................... 26 

Re 27 sultados ......................................................................................................................

Análise metagenómica de Anopheles gambiae infectados e não infectados com 

8 Plasmodium falciparum ............................................................................................. 2

Curvas de crescimento de Pseudomonas aeruginosa dos isolados mucoso e não 

................................................................................... 29 mucoso ....................................

ei ................................................. 30 Infecção dos mosquitos com Plasmodium bergh

Isolamento de bactérias do intestino médio de Anopheles stephensi ................... 31 

IV

V

Contagem de oocistos ............................................................................................... 33 

Discussão dos Resultados / Conclusões ....................................................................... 36 

Referências Bibliográficas ............................................................................................ 45 

Lista de Ilustrações ....................................................................................................... 52 

Lista de Tabelas ............................................................................................................ 55 

Anexos ............................................................................................................................ 56 

Lista de Abreviaturas

Antib – Antibióticos

CO2 – Dióxido de carbono

Cont – Controlo

DNA – Deoxyribonucleic acid

EPS – Extracellular polymeric substance

GFP – Green Fluorescent Protein

LB – Luria-Bertania Broth

OTU – Unidades taxonómicas operacionais

PaM – Pseudomonas aeruginosa isolado mucoso

PAMPs – Pathogen-associated molecular patterns

PaNM – Pseudomonas aeruginosa isolado não mucoso

PBS – Phosphate Buffered Saline

PCR – Polymerase chain reaction

PGN – Peptidoglicano

PGRPs – Peptidoglycan Recognition Proteins

PMN’s – Células polimorfonucleares

PRR – Pattern recognition receptor

ROS – Reactive Oxygen Species

TSA – Trypticase Soy Agar

1

Introdução

2

Malária

A malária é uma doença infecciosa causada pelo parasita Plasmodium sp. e

transmitida pelo insecto vector, Anopheles sp. nas regiões endémicas, a malária

apresenta-se como um grave problema de saúde pública e com um impacte devastador

sobre a população nos países em vias de desenvolvimento, especialmente nas regiões

tropicais e subtropicais de África subsariana (Figura 1). Aqui, estima-se que anualmente

cerca de 1 milhão de mortes são resultado só da infecção por Plasmodium falciparum

(Aly et al., 2010).

Figura 1. Distribuição mundial da malária, com referência às zonas em fase de eliminação da transmissão e zonas de controlo da infecção. Adapado de: http://www.talkafrique.com/issues/eradicating-malaria-not-anytime-soon.

Uma variedade de factores podem explicar efeito devastador da malária nas

regiões endémicas, nomeadamente a combinação de uma elevada taxa de transmissão

por um vector bastante eficiente; uma espécie predominante e mais agressiva do

parasita (P.falciparum) associada a uma maior taxa de casos de malária grave e as

condições ambientais locais propícias à transmissão da infecção. Além das

características ambientais e vectorais mencionadas, a sua conjugação com os baixos

recursos da população e instabilidade sócio-económica, prejudiciais a eficientes

3

programas de controlo, vão acentuar ainda mais o efeito negativo e consequências da

malária sobre a população (CDC, 2012).

Nas regiões com mais altos níveis de transmissão, entre os grupos mais

vulneráveis à doença, destacam-se aqueles cuja imunidade se encontra comprometida.

Entre os grupos de risco, salientam-se as crianças, as mulheres grávidas e os viajantes

ou migrantes (CDC, 2012).

Vector Anopheles / Parasita Plasmodium

Os mosquitos são insectos transmissores de uma vasta multiplicidade de doenças

virais e parasitárias, sendo que a malária permanece a mais devastadora (Mendes et al.,

2011). É transmitida ao ser humano através de fêmeas do género Anopheles, que apesar

de apresentar uma distribuição mundial, os mosquitos vectores de Plasmodium sp.

encontram-se principalmente associados a condições ideais de temperatura e humidade,

características das regiões tropicais e subtropicais (CDC, 2012). O vector Anopheles

gambiae, amplamente distribuído nas regiões endémicas de África subsariana, é o mais

importante vector associado à transmissão de P. falciparum (Mitri et al., 2009). A.

sthephensi, também importante vector na transmissão da malária, tem a sua distribuição

localizada no Continente asiático (Damiani et al., 2009).

Ao longo do desenvolvimento, como qualquer outro mosquito, Anopheles sp.

compreende 4 fases de desenvolvimento, nomeadamente: ovo, larva (L1, L2, L3 e L4),

pupa e adulto (macho e fêmea). A postura dos ovos é efectuada pelas fêmeas, após a

ingestão de sangue, directamente na água. Após a eclosão dos ovos, larvas aquáticas

vão-se desenvolver ao longo de 4 instars, onde por metamorfose as larvas L4 vão dar

origem às pupas. A partir das pupas vão emergir os mosquitos adultos. Enquanto que os

machos se alimentam apenas de néctar ou outras fontes de açúcar, para realizar a

postura as fêmeas necessitam ainda de uma refeição sanguínea, para o desenvolvimento

dos ovos (CDC, 2012).

4

Ciclo de Vida

O primeiro contacto entre mosquito vector e parasita tem lugar na membrana

epitelial do tracto digestivo do insecto e ocorre após a ingestão de eritrócitos infectados

durante a refeição sanguínea, a partir de um hospedeiro infectado (Azambuja et al.,

2005). Desta forma, a transmissão de Plasmodium pelo mosquito Anopheles, é

possibilitado pelo fenómeno da hematofagia, cuja ingestão de sangue pelas fêmeas do

insecto hematófago é fundamental para a ovogénese (Mitri & Vernick, 2012).

Durante a refeição sanguínea, as fêmeas vão ingerir os gametócitos presentes no

sangue periférico do hospedeiro. No lúmen do intestino médio, vai ocorrer a

gametogénese e após a fertilização dos gametócitos vão se formar os zigotos. As

alterações de habitat do parasita estão sempre associadas a grandes flutuações na

densidade populacional (Aly et al., 2012) e nesta fase do ciclo de vida a população

parasitária vai sofrer uma significativa redução (efeito de Bottleneck) (figura 2). Apesar

da elevada importância desta etapa no ciclo parasitário, os mecanismos responsáveis por

esta redução drástica no número de parasitas não se encontram esclarecidos (Azambuja

et al., 2005), além da pressão imposta pelo sistema de defesa, outros mecanismos poder-

se-ão encontrar associados a esta redução, tais como a produção de enzimas digestivas,

a presença de uma flora intestinal Microbiota do mosquito (Dong et al., 2009), lectinas,

Figura 2. Efeito de Bottleneck, onde se observa uma redução significativa do número de oocistos no intestino médio de Anopheles. Adaptado de: http://kafatos.openwetware.org/Research.html.

5

péptidos antimicrobianos e óxido nítrico (Azambuja et al., 2005).

Apesar desta redução drástica da população parasitária, os oocistos

remanescentes vão ser suficientes para o ciclo de vida do parasita seguir o seu curso e a

transmissão persistir (Cirimotich et al., 2011b).

Após a diferenciação dos oocinetos

móveis, estes vão atravessar a matriz

peritrófica e vão-se alojar na lâmina basal,

onde vão-se desenvolver em oocistos imóveis

(Aly et al., 2010) (Figura 3).

A partir dos oocistos vão-se formar os

esporozoítos, que vão ser libertados na

cavidade corporal dos mosquitos, onde

posteriormente alcançarão e invadirão as

glândulas salivares (Aly et al., 2010).

Quando os esporozoítos alcançam as

glândulas salivares, os mosquitos tornam-se

infectantes e poderão ser transmitidos ao

hospedeiro na refeição sanguínea

subsequente.

Figura 3. Desenvolvimento de Plasmodium no intestino médio do mosquito vector. 1- Gametogénese, fertilização e transformação do zigoto; 2- Invasão da matriz peritrófica; 3- Redução do nº de oocinetos invasores no espaço ectopritrófico; 4- Invasão do epitélio intestinal 5- Adesão dos oocinetos e desenvolvimento dos oocistos. Adaptado de: http://www.scie/pii/S0169475898013489.

encedirect.com/science/articl

esquizonte serão libertados na corrente

O início do novo ciclo parasitário, no

hospedeiro mamífero, vai ter origem na

invasão do fígado pelos esporozoítos

inoculados, aquando da ingestão de sangue

por uma fêmea infectada (Aly et al., 2010).

Após a invasão dos hepatócitos, vai ocorrer a

diferenciação em esquizontes que contêm

milhares de merozoítos, que após a ruptura do

sanguínea, onde irão iniciar a fase eritrocitária do seu ciclo de vida (Lau et al., 2000)

(Figura 4).

6

Figura 4. Ciclo de vida de Plasmodium. Desenvolvimento no mosquito vector e infecção no hospedeiro mamífero. Adaptado de: http://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS147330990970177X/images?imageId=gr1&sectionType=green&hasDownloadImagesLink=true.

O Intestino Médio de Anopheles sp.O Intestino Médio de Anopheles sp.

Todos os organismos complexos são colonizados por uma vasta multiplicidade

de microrganismos, exemplo disso são os microrganismos constituintes da flora

microbiana nativa que coloniza o tracto digestivo, local onde se observa a maior

quantidade e diversidade de bactérias. Esta colonização bacteriana, de um modo geral,

confere benefícios ao hospedeiro revelando-se uma verdadeira relação mutualista

(Rakoff-Nahoum et al., 2004).

O sucesso dos insectos nos diferentes ecossistemas permitiu criar assim, um

conjunto de oportunidades ambientais para a sua colonização pelas bactérias, tornando-

se mesmo vantajoso para o hospedeiro, como por exemplo, ao nível da obtenção e

utilização de produtos resultantes do metabolismo bacteriano (Dillon & Dillon, 2004).

7

Tornou-se ainda universalmente aceite, que os microrganismos endossinbiontes têm

uma influência profunda na persistência e competência do vector no seu habitat natural

(Rani et al., 2009).

Dillon & Dillon, 2004 define uma relação simbiótica de um microrganismo no

tubo digestivo de um insecto hospedeiro como a aquisição e manutenção desse

microrganismo, que resulta na aquisição de novas estruturas ou metabolismos. Assim, a

diversidade Microbiota relaciona uma variedade de estruturas especializadas presentes

no tubo digestivo (ex. sistema imune), com o efeito do pH, condições redox, enzimas

digestivas e tipo de alimentação (ex. hematofagia).

O tracto digestivo do mosquito é o habitat de diversas comunidades microbianas

que constituem a flora Microbiota, cuja grande maioria destas populações são bactérias

Gram-negativas e pertencem ao grupo das Proteobacterias e Enterobacterias (Meister et

al., 2009).

A membrana epitelial do intestino médio do mosquito representa o primeiro

ponto de contacto entre parasita e insecto vector e consiste na primeira oportunidade do

parasita aderir e invadir os tecidos subjacentes, e consequentemente estabelecer

infecção (Azambuja et al., 2005). O intestino médio é um órgão imunocompetente e a

presença de microrganismos vai induzir uma resposta imunitária (Rani et al., 2009). Da

interacção entre bactérias simbióticas, parasitas invasores e sistema imune, resulta a

activação da principal barreira de defesa do hospedeiro, o sistema imunitário do

mosquito, onde vão ter origem uma série de processos e factores imunes que vão

culminar numa redução da população parasitária (Dong et al., 2006b), além de

desempenhar um papel preponderante na susceptibilidade/resistência do mosquito à

infecção por plasmódio (Meister et al., 2009).

Durante a infecção do hospedeiro invertebrado, o plasmódio depara-se com

diversos obstáculos ao longo dos diversos estágios de desenvolvimento e transições

espaciais. A principal barreira a ultrapassar, como referido, é o epitélio do intestino

médio, onde o oocineto ao atravessar vai sofrer a pressão do sistema imunitário do

hospedeiro (Dong et al., 2006a)

A imunidade inata dos mosquitos desempenha um papel muito importante na

interacção entre vector e parasita, ou agente patogénico, o que vai determinar a

8

capacidade vectorial do mosquito. Enquanto que a exposição dos mosquitos a

determinados microrganismos pode ser bastante extensa, os mecanismos moleculares

responsáveis pelo reconhecimento desta vasta diversidade ainda não são completamente

compreendidos (Dong & Dimopoulos, 2009).

O sistema de defesa dos mosquitos é composto por mecanismos celulares e

humorais que são activados após o reconhecimento de agentes patogénicos invasores

por receptores moleculares específicos (PRR). O reconhecimento destes padrões

moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) vai activar indirectamente uma

série de mecanismos de defesa que controla a transcrição de genes efectores, ou vai

actuar directamente através de mecanismos de encapsulação e fagocitose (Dong &

Dimopoulos, 2009).

No entanto, estes sistemas de vigilância imunitária carecem de reconhecimento

mediado por anticorpos e por isso, assentam num conjunto relativamente limitado de

receptores que reconhecem padrões de moléculas invariantes e evolutivamente

conservadas na superfície dos agentes patogénicos (Dong & Dimopoulos, 2009).

A sinalização imunológica é desencadeada após reconhecimento de estruturas

conservadas microbianas específicas, comuns às bactérias mas ausentes no hospedeiro,

cujo reconhecimento é essencial para a activação da imunidade inata do insecto. Um

destes exemplos é o peptidoglicano (PGN), constituinte da parede celular de bactérias

Gram-negativas e Gram-positivas e que pode estar na origem do reconhecimento

específico por proteínas como as PGRPs (Meister et al., 2009).

Estudos sobre a flora microbiana do tracto digestivo de insectos assentam,

sobretudo, na contribuição dos micorganismos endosimbiontes para a homeostase

nutricional do hospedeiro. Recentemente tem sido demonstrado que a presença de uma

flora bacteriana natural, no intestino médio de Anopheles sp., quer em insectos de

laboratório quer na Natureza, desempenha um papel preponderante na prevenção do

desenvolvimento parasitário de Plasmodium sp. Dong et al. 2009, afirma que a presença

de bactérias é responsável pela activação de respostas imunitárias antimicrobianas no

intestino médio dos mosquitos, onde péptidos sintetizados e outros factores imunes vão

actuar contra a infecção com P. berghei.

9

Actualmente vários métodos são aplicados na identificação de bactérias, em

mosquitos do género Anopheles, capturados em campo, recorrendo a técnicas de cultura

de bactérias. Apesar da flora bacteriana variar em função da distribuição geográfica e

nichos ecológicos ocupados pelos mosquitos, têm sido abundantemente detectadas as

bactérias Pseudomonas cepacia, Enterobacter agglomerans e Flavobacterium spp.,

associadas à flora bacteriana de A. stephensi e A. gambiae criados em laboratório (Rani

et al., 2009).

A diversidade bacteriana nas espécies de Anopheles é assumida como sendo

particularmente baixa no estádio de adulto, devido à renovação do tracto digestivo

durante a metamorfose de pupa para adulto (Boissière et al., 2012). A microflora nos

mosquitos adultos apresenta ainda uma composição diferente, devido às transições

metamórficas a eliminação da microflora dos estádios larvares está associada à

aquisição de um novo set de microrganismos (Rani et al., 2009). Estas bactérias terão

sido adquiridas, naturalmente, do ambiente aquático durante o desenvolvimento dos

estágios imaturos, no entanto transmissão vertical também se encontra documentada

(Boissière et al., 2012).

Apesar de permanecerem desconhecidos os mecanismos responsáveis pela

colonização do trato digestivo dos mosquitos vectores adultos, por bactérias da

microflora intestinal no seu habitat natural, sabe-se que a aquisição de uma flora

intestinal bacteriana, em meio laboratorial, pode ocorrer verticalmente ou por via

alimentar, através de soluções de açúcar ou durante refeições sanguíneas contaminadas

(Rani et al., 2009).

A correcta identificação das bactérias Gram-negativas, frequentemente

encontradas no tubo digestivo dos mosquitos e constituintes da flora Microbiota, assim

como os mecanismos fisiológicos associados, podem contribuir para uma melhor

compreensão da dinâmica da co-infecção com Plasmodium e definição de novas

estratégias de controlo (Azambuja et al., 2005).

10

Novas Perspectivas no Controlo do Vector

Actualmente, e ao longo das últimas décadas, as estratégias de controlo da

malária, têm consistido primariamente no uso de insecticidas para reduzir as populações

de vectores e a utilização de fármacos para eliminar o parasita (Riehle et al., 2005).

Mais ainda, os procedimentos utilizados para medir as taxas de transmissão não se

encontram padronizados, nem consideram as diferenças ecológicas, demográficas e

sócio-económicas da população (Kelly-Hope & Mckenzie, 2009).

A compreensão de como as interacções Anopheles-Plasmodium contribuem para

a competência vectorial do mosquito, tem sido recentemente alvo de elevada atenção,

abrindo caminho para a aquisição de novas estratégias no controlo da malária (Boissière

et al., 2012).

Actualmente, o principal objectivo de um programa de controlo da malária, não

deve consistir apenas na eliminação do parasita, mas na interferência na sua transmissão

pelos mosquitos vectores (Riehle & Jacobs-Lorena, 2005). Técnicas de modificação

genética têm sido desenvolvidas para A. gambiae e A. stephensi (Boissière et al., 2012).

A ideia de substituir as populações de vectores naturais por outras alteradas

geneticamente, capazes de actuar directamente sobre infecções por Plasmodium, recebe

actualmente particular atenção. Existem modelos para alterar geneticamente os

mosquitos, estão identificadas moléculas efectoras capazes de actuar sobre os parasitas

e estão identificados promotores específicos para expressar as moléculas efectoras no

tempo e local apropriado (Riehle & Jacobs-Lorena, 2005). No entanto, a utilização de

mosquitos transgénicos está associada a uma diminuição da sua fitness (Boissière et al.,

2012), além que seria ainda necessário ultrapassar as limitações associadas ao método

para substituir as populações de mosquitos naturais, pelas refractárias à infecção por

Plasmodium (Riehle & Jacobs-Lorena, 2005).

Recentemente têm sido exploradas outras hipóteses associadas à utilização de

microrganismos como agentes de controlo biológico de doenças transmitidas por

vectores. A susceptibilidade de Anopheles à infecção por Plasmodium está sobre

controlo genético, no entanto a elevada variabilidade no número de oocistos em

espécies de mosquitos relativamente próximas indica que os factores ambientais

11

também podem influenciar. Várias evidências sugerem que a flora bacteriana do

mosquito tem influência na sua competência vectorial (Boissière et al., 2012).

As bactérias presentes no lúmen do intestino médio dos mosquitos interagem

directamente e adversamente, contra os diferentes estádios de desenvolvimento de

Plasmodium presentes na refeição sanguínea através da produção de enzimas, toxinas e

barreira física que inibem a interacção entre os oocinetos e o epitélio do intestino médio.

Alternativamente, o efeito bacteriano no desenvolvimento do parasita pode ocorrer

através de alterações na fisiologia do próprio mosquito hospedeiro. Aqui, a indução do

sistema imune vai actuar de forma cruzada sobre bactérias e Plasmodium (Dong et al.,

2009b).

Pseudomonas aeruginosa e a Produção de Biofilme

P. aeruginosa é um microrganismo ubíquo que ocupa um elevado leque de

nichos ecológicos (Drenkard, 2003). Enquanto algumas espécies residem no seu habitat

natural, outras têm propensão para causar doença (Mann & Wozniak, 2012). É uma

bactéria Gram-negativa potencialmente patogénica para o ser humano cuja importância

médica reside na sua natureza oportunista, quando associada a um sistema imunitário

imunocomprometido. Uma das suas características mais importantes é a capacidade de

produzir biofilme (Ma et al., 2012). Infecções persistentes causadas por bactérias

produtoras de biofilme estão associadas a um elevado número de condições médicas,

com especial referência à fibrose quística. Como consequência, este tipo de infecções

geralmente são crónicas e difíceis de tratar (Drenkard, 2003).

Nos biofilmes produzidos por P. aeruginosa, células bacterianas individuais

iniciam a aderência a um substrato, seguindo-se uma propagação clonal, construção da

matriz e maturação do biofilme (Mann & Wozniak, 2012). Em termos espaciais, o ciclo

de formação destas matrizes traduz-se em 5 fases, que têm início com a adesão de

células livres a uma superfície, seguindo-se a formação de microcolónias e por fim a

dispersão, onde se libertam células das microcolónias para ocupar novas superfícies

(Ma et al., 2009) (Figura 5).

12

Figura 5. Fases da formação do biofilme por P. aeruginosa. 1- Adesão inicial; 2- Adesão irreversível; 3- Maturação I; 4- Maturação II e 5- Dispersão. Adaptado de http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_aeruginosa.

P. aeruginosa é um microrganismo modelo na investigação de biofilmes. Estes

têm sido tema de intenso estudo na última década por dois motivos principais. Primeiro

no sentido de estudar as bactérias, procurando perceber a natureza das comunidades

multicelulares, e por fim, a formação de biofilmes provoca sérios problemas médicos e

industriais, uma vez que as bactérias presentes nestas matrizes podem resistir não só ao

tratamento antibiótico mas também às respostas imunitárias do hospedeiro (Harmsen et

al., 2010).

Os biofilmes ou comunidades de bactérias estruturadas associadas a superfícies

são mantidos por uma substância extracelular polimérica extracelular (EPS),

responsável por manter a arquitectura e funções como matriz, sustendo as células do

biofilme. A matriz ou EPS de P. aeruginosa consiste numa mistura pouco definida de

polissacarídeos, ácidos nucleicos e proteínas, onde um dos principais constituintes que

contribui para a formação do biofilme é o alginato (Ma et al., 2009). Este

polissacarídeo, de elevado peso molecular, é fundamental para a estabilidade estrutural

do biofilme, onde eventos genéticos específicos podem dar origem a uma

sobreprodução nos fenótipos mucoides (Mann & Wozniak, 2012) (Figura 6).

13

Figura 6. Estrutura química possível do alginato produzido por P. aeruginosa, resíduos de ácido D-manurónico intercalados com resíduos de ácido L-gulurónico (Franklin et al., 2011.)

A EPS alberga as células bacterianas do biofilme, consequentemente

desemp

al, os biofilmes são considerados como uma

comun

Pseudomonas, além da EPS,

destaca

, uma das mais importantes características dos

biofilm

enha um papel preponderante em diversos processos associados à adesão

bacteriana, interconexão celular, interacções entre subpopulações, tolerância e trocas de

material genético (Harmsen et al., 2010). Devido a estes factos, de um modo geral,

pode-se afirmar que a matriz exopolissacrídea providencia uma barreira efectiva que

restringe a entrada de biocidas quimicamente reactivos, antibióticos catiónicos e

péptidos antibióticos (Drenkkard, 2003).

Além da sua capacidade estrutur

idade funcional de células bacterianas, alcançando como comunidade o que

espécies isoladas não conseguem. Ou seja, nesta associação sinérgica as propriedades da

comunidade no interior da matriz são superiores ao somatório das propriedades

individuais de cada subpopulação (Sutherland, 2001).

Dos principais compostos sintetizados pelas

m-se os biossurfactantes e os sideroforos. O biossurfactante ramnolipídeo

desempenha múltiplas funções na formação do biofilme, sendo necessário para a

manutenção dos canais, bem como para a migração das células móveis. Recentemente,

foi ainda demonstrado que a produção de ramnolipídeo por P. aeruginosa, desempenha

um papel na tolerância do biofilme às células do sistema imune. Mais ainda, é sugerido

que as células bacterianas no biofilme respondem à presença de PMN’s (células

polimorfonucleares) pela síntese de ramnolipídeo, que vai aderir às bactérias do

biofilme e actuar como escudo e eliminar as células imunitárias após contacto. O

sideróforo de ferro, a pioverdina, é necessário para a estruturação da matriz (Harmsen et

al., 2010). De acordo com Azambuja et al., 2005, hipoteticamente, a pioverdina e

piocianina actuam como potenciais citocinas contra parasitas do tracto digestivo. Uma

das grandes vantagens para a população bacteriana é que a produção de compostos pelas

bactérias vai-se acumular na matriz extracelular e ficar disponível para toda a

comunidade (Harmsen et al., 2010).

Como referido anteriormente

es consiste na aquisição de tolerância, por parte da população bacteriana, a

agentes antimicrobianos, antibióticos e componentes do sistema imunitário. Apesar dos

agentes antimicrobianos diminuírem o número de bactérias presentes nos biofilmes, não

14

as elimina completamente o que pode ter como consequências recidivas de infecções

bacterianas. As evidências disponíveis indicam que a matriz do biofilme, em geral, não

inibe a difusão dos antibióticos, mas antes a penetração de alguns compostos parece ser

retardada (Harmsen et al., 2010). Enquanto que a maioria dos antibióticos é capaz de se

difundir rapidamente pela matriz do biofilme de estirpes de P. aeruginosa wild-type,

parece que o alginato produzido pelas estirpes mucoides pode retardar a difusão de

alguns antimicrobianos (ex. piperacilina, amicacina e gentamicina). Outros

antimicrobianos difudem-se rapidamente (ex. ciprofloxacina, levofloxacina,

esparfloxacina e ofloxacina) (Harmsen et al., 2010). Recentes evidências demonstraram

que a actividade antibiótica sobre o biofilme de P. aeruginosa mucoide pode ser

significativamente aumentada pela adição de liases de alginato. Estes dados sugerem

que o alginato pode actuar como barreira aos antibióticos (Harmsen et al., 2010).

Estudos efectuados com P. aeruginosa, indicam que a tolerância do biofilme é

multifa

bactérias Gram-negativas frequentemente encontradas no intestino

édio

ctorial e apenas uma combinação de diferentes mecanismos pode contribuir para

os níveis de resistência observada pelas comunidades albergadas pelo biofilme

(Drenkkard, 2003). Entre os mecanismos que contribuem para a tolerância encontram-

se uma difusão antimicrobiana restrita, actividade fisiológica diferencial, indução de

mecanismos de tolerância específicos e formação celular contínua (Harmsen et al.,

2010).

As diversas

m dos mosquitos, possivelmente influenciam especificamente o crescimento e

desenvolvimento diferencial de Plasmodium ingerido com a refeição sanguínea. Esta

contribuição para a modulação da competência vectorial ganha actualmente terreno no

estabelecimento de novas estratégias de controlo do vector (Azambuja et al., 2005).

15

Objectivo e Desenho Experimental

16

Objectivo 

Este trabalho teve como objectivo geral o estudo da influência da flora

bacteriana, nomeadamente as bactérias do género Pseudomonas, presentes no trato

digestivo do mosquito Anopheles sp. e a sua relação com a infecção por Plasmodium

berghei.

Desenho Experimental  

Para se averiguar se a presença destas bactérias no intestino médio do mosquito

confere algum grau de proteção à infecção, foi delineada a seguinte metodologia:

• A obtenção de mosquitos estéreis através de tratamento com antibióticos de

largo espectro.

• A colonização do tubo digestivo dos mosquitos estéreis com dois isolados de P.

aeruginosa, não mucosa e mucosa.

• O efeito da Microbiota na evolução da infecção por P. berghei em mosquitos,

determinado através da prevalência e intensidade de infecção nas seguintes

condições:

o Flora bacteriana natural intacta

o Condição de esterilidade

o Presença de P. aeruginosa mucosa

o Presença de P. aeruginosa não mucosa

17

Metodologia

 

 

 

18

Análise  metagenómica  de  Anopheles  gambiae  infectados  e  não 

infectados com Plasmodium falciparum 

No ano de 2005, foi realizado um estudo de metagenómica da Microbiota de

mosquitos A. gambiae infectados e não infectados com P. falciparum. Este estudo foi

realizado na empresa biotecnológica Biocant (Cantanhede, Portugal), utilizando

amostras colectadas na Guiné Equatorial pela Dra. Cristina Mendes no âmbito de um

projeto liderado pela Doutora Ana Paula Arez, e é referenciada a metodologia aplicada e

resultados obtidos para comparação dos mesmos.

No estudo referido, fêmeas de mosquitos A. gambiae alimentadas, provenientes

de duas regiões da Guiné Equatorial foram recolhidas de manhã no interior de

habitações. Os mosquitos que se alimentaram durante a noite na habitação foram

mantidos durante 8 dias para que se pudesse dar o desenvolvimento do parasita.

Mosquitos com oocistos foram considerados susceptíveis e mosquito sem oocistos

foram considerados resistentes. Mosquitos com parasitas nas glândulas salivares não

foram considerados por representarem infecções adquiridas noutro local. O DNA destes

mosquitos foi extraído e a presença de espécies de Plasmodium foi determinada por

PCR (Mendes et al., 2012). O DNA dos mosquitos com presença de oocistos foi

agrupado em 3 pools infectados (susceptiveis à infecção) e 3 pools não-infectados

(resistentes à infecção). Os pools de DNA foram processados por PCR. O DNA

ribossomal 16S da comunidade bacteriana do intestino médio dos mosquitos foi

amplificado para a região hipervariável V6 com primers de fusão contendo os códigos

de barras, os adaptadores A e B Roche-454 Titanium e as sequencias específicas para a

região ribossomal. Os amplicões foram quantificados por fluorimetria com kit

quantificação PicoGreen (Invitrogen) e agrupados em concentrações equimolares e

sequenciados na direção A utilizando a plataforma GS 454 FLX Titanium, de acordo

com as instruções do fabricante (Roche, 454 Life Ciências, Brandford, CT, EUA) no

Biocant (Cantanhede, Portugal).

Os resultados da pirosequenciação foram processados usando um “pipline”

automático implementado no Biocant. Num primeiro passo, as leituras da sequenciação

foram classificadas de acordo com o código de barras correspondente. De modo a

19

minimizar os erros aleatórios de sequenciação foram eliminadas as sequências com

menos do que 120 pb e que continham mais do que dois nucleótidos indeterminados. As

sequências com mais de 50% das regiões de baixa complexidade, determinada por

DustMasker (Sogin et al., 2006) e as sequências quiméricas, identificados por UChime

(Edgar, 2011), foram descartados. As sequências foram agrupadas com USearch (Edgar,

2010) com uma distância filogenética de 3%, para criar as unidades taxonómicas

operacionais (OTU). A taxonomia de cada OTU foi identificada através de uma

pesquisa BLAST contra o Ribosomal Database project II (RDP) de banco de dados

(Cole et al., 2008). Todas as sequências com um alinhamento menor do que 40%, bem

como aqueles com um valor de e maior do que 1e-50 foram rejeitados. Além disso, um

teste de bootstrap foi aplicado aos OTUs para identificar o nível taxonómico. Apenas as

sequências com um bootstrap superior a 70%, depois de 100 repetições, obtidas a partir

de SeqBoot pelo pacote Phylip (Felsenstein, 1989), foram mantidas. A atribuição

taxonómica das OTUs foi concluída com a atribuição do número de identificação

taxonómica NCBI, o que permitiu a identificação de todos os organismos. Por fim, para

cada um taxon identificado na amostra, o número total de sequências foi determinado,

fornecendo a abundância de todos os organismos identificados, para análise estatística

a população. d

 

Determinação das  curvas de  crescimento de Pseudomonas aeruginosa 

dos isolados mucoso e não mucoso 

As bactérias utilizadas neste estudo foram isoladas a partir de um doente com

fibrose cística e foram cedidas pela Professora Isabel Sá-Correia do Centro de

Engenharia Biológica e Química do Instituto Superior Técnico.

Os isolados de P. aeruginosa foram recebidos em placas de cultura, cultivados

em meio específico para Pseudomonas (agar de citrimida). As colónias de bactérias

isoladas foram retiradas com uma ansa e inoculadas em 2 ml de meio de cultura LB e

incubadas durante a noite com agitação à temperatura ambiente (≈ 30 °C). Após 24

20

horas, e observando-se um claro crescimento bacteriano, a cada 500 μl desta suspensão

adicionou-se 500 μl de glicerol e conservou-se a -80 °C até posterior utilização.

Para determinar a fase de crescimento exponencial, garantindo assim uma

melhor taxa de divisão celular bacteriana, foram determinadas as curvas de crescimento

dos isolados, mucoso e não mucoso, de P. aeruginosa. Para tal, adicionou-se 1 ml do

extracto bacteriano, conservado em glicerol a -80 °C, a 7 ml de meio de cultura LB e

determinou-se a absorvância num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 600

nm. Após a primeira leitura, deixou-se incubar a 30 °C com agitação e, a todas as horas

procedeu-se à leitura dos valores de absorvância para cada intervalo de tempo.

Esterilização bacteriana e infecção de mosquitos Anopheles stephensi 

Foi recolhido um total de 800 pupas de A. stephensi, que foram posteriormente

distribuídas por 4 grupos com cerca 200 de pupas cada. As pupas correspondentes aos

grupos 1, 2 e 3, foram colocadas a emergir em água autoclavada com uma mistura de 4

antibióticos: Ampicilina, Sulfato de Neomicina e Metronidazole numa concentração de

1g/L e Hidrocloreto de Vancomicina a 0,5 g/L (Figura 7). As pupas correspondentes ao

grupo 4 foram deixadas a emergir, noutra gaiola, em apenas água autoclavada.

Segundo Ivanov et al., 2008 a Vancomicina ou Ampicilina inibem

predominantemente bactérias Gram-positivas, o Metronidazole atua sobre as bactérias

anaeróbicas e o Sulfato de Neomicina tem como alvo predominante as bactérias Gram-

negativas.

Durante 3 dias, após a separação das pupas para as gaiolas de emergência, foi

disponibilizada solução de sacarose estéril, numa concentração de 10 % e com a mistura

dos 4 antibióticos, para os grupos 1, 2 e 3. Para o grupo 4 foi disponibilizada apenas

solução de sacarose a 10 %. Procedeu-se ainda à mudança diária destas soluções.

21

A B

Figura 7. Pupas de A. stephensi colocadas a emergir na presença de antibióticos (A) e em água estéril (B).

De forma a garantir o máximo de esterilidade da fonte de açúcar e visto a

impossibilidade de sujeitar esta molécula a elevadas temperaturas de forma a não perder

priedades, a solução de sacarose, com e sem os antibióticos, foi preparada

uma câmara de fluxo laminar com água Milli-Q esterilizada e passada por um filtro de

,2 µm, para seringas.

o 4º dia, procedeu-se à distribuição/transferência dos mosquitos para 4 copos

de papel descartável (Figura 8). Neste ensaio não foram utilizadas as gaiolas de rede

convencionais para manter os mosquitos, devido ao tratamento dos mesmos com

seudomonas, optando-se por utilizar material descartável e de fácil descontaminação.

cta).

as suas pro

n

0

A

P

Foi atribuída aos grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente, as designações de PaNM

(tratamento antibiótico e reconstituição da Microbiota com P. aeruginosa não mucoso),

PaM (tratamento antibiótico e reconstituição da Microbiota com P. aeruginosa

mucoso), Antib (tratamento antibiótico sem reconstituição da Microbiota) e Cont (flora

microbiana natural inta

22

23

Figu 8. Copos descartáveis de papel, onde foram colocados os mosquitos, A. stephensi, correspondentes a cada grupo de cada experiência. A – Vista lateral e B – Vista superior.

ra

A B

squitos e procedeu-se à

ucoso e mucoso de

r durante a noite os isolados de

horas. Este intervalo de tempo,

ento.

nto bacteriano, o algodão

as

dentes ao

grupo Cont (sem tratamento antibiótico nem Pseudomonas) e grupo Antib (com

tratame

Ainda no 4ª dia, foi retirada a fonte de açúcar aos mo

reconstituição da Microbiota dos grupos 1 e 2 com os isolados não m

P. aeruginosa. No dia anterior, deixou-se a incuba

Pseudomonas em meio LB por aproximadamente 12

fundamental para a taxa de crescimento bacteriano alcançar a fase exponencial, foi

determinado por espectofotometria aquando da construção das curvas de crescim

Após a incubação e na fase exponencial do crescime

est

ond

éril foi embebido na suspensão bacteriana e colocado sobre as redes das estrutur

e os mosquitos se encontravam contidos. Para os mosquitos correspon

nto antibiótico mas sem as bactérias), colocou-se apenas algodão embebido em

meio de cultura LB estéril (Figura 9).

Os algodões com meio de cultura, com e sem bactérias, foram disponibilizados

aos mosquitos durante cerca de 24 horas e decorrido este intervalo de tempo foram

retirados.

A

24

Figura 9. Copos de papel descartáveis com os grupos de mosquitos em estudo durante o tratamento com os isolados de P. aeruginosa em meio de cultura LB e em meio LB estéril. A – Vista lateral e B – Vista superior.

B

Infecção dos mosquitos com Plasmodium  berghei 

Ao quinto dia, após a emergência dos mosquitos adultos e após tratamento

anti à

infe . berghei GFP. Para isto, 7 dias antes da refeição

os (Mus musculos) CD1 com uma ampola de sangue

itémias e procedeu-se

. Efectuou-se uma punção

-se novos

4 murganhos com 150 µl de

a m

bacteriano e reconstituição da flora bacteriana dos grupos respectivos, procedeu-se

cção dos mosquitos com P

sanguínea infectaram-se 2 murganh

infectado com P. berghei. Após 4 dias determinaram-se as p

novamente a uma passagem para 6 1

ardíaca no murganho com a para

aras

murganhos da estirpe CD

sitémia entre 15 % a 20 % e infectaram

murgan

c

hos por via intraperitoneal com o sangue infectado.

Três dias após a infecção dos 6 murganhos, coincidente com o 5ª dia dos

mosquitos, determinaram-se as parasitémias e observou-se a exflagelação, ou seja, a

libertação dos gâmetas masculinos. Para a observação deste fenómeno, bafejou-se sobre

uma gota de sangue fresco obtida da cauda do murganho. O aumento da taxa de CO2 e

consequente diminuição do pH é responsável por desencadear o processo de

exflagelação dos microgametócitos. Seguidamente procedeu-se à refeição sanguínea dos

mosquitos e infecção destes com P. berghei. Anestesiou-se

um istura de 10 % Rompun (Bayer), 20 % Imalgene (Merial) em PBS por via

intraperitoneal e aguardou-se alguns minutos até os murganhos perderem o reflexo de

retirada da pata. Após este tempo, os murganhos foram colocados sobres as redes dos

copos de papel descartáveis e as fêmeas de A. stephensi puderam alimentar-se durante

30-45 min.

Durante a alimentação das fêmeas, os copos foram cobertos com um pano escuro

de forma a diminuir não só a intensidade luminosa, mas também a evitar a perda de

calor por parte dos murganhos por acção do ar condicionado e baixas temperatura da

sala, tornando os murganhos menos atractivos aos mosquitos. Temperaturas da ordem

dos 21 °C estão associadas a uma melhor taxa de infecção por P. berghei no trato

digestivo do mosquito.

Terminada a refeição sanguínea e retirando-se as fêmeas não alimentadas (não

engorgitadas) restituiu-se a glucose, disponibilizando-a num algodão embebido sobre as

redes e trocando-o diariamente. Os mosquitos foram mantidos durante 8 dias a 21 °C.

Isolamento de bactérias do intestino médio de Anopheles stephensi 

A presença de Pseudomonas no intestino médio dos mosquitos foi avaliada após

o tratamento com os antibióticos e reconstituição da Microbiota. Ao 5º dia, cerca de 24

horas após a reconstituição com Pseudomonas e antes da refeição sanguínea, 5

tib e Cont foram extraídos e

oram

A partir destas diluições, 100

os meios gerais LA e TSA e

com o

dos dois isolados.

intestinos médios de fêmeas dos grupos PaNM, PaM, An

homogeneizados em PBS, em condições de esterilidade. Dos estratos obtidos, f

realizadas diluições sequenciais de 1/10, 1/100 e 1/1000.

l de cada, foram inoculadas em placas de cultura com µ

meio específico, agar de citrimida, para Pseudomonas. As placas foram deixadas

a crescer numa estufa a 37 °C e foram observadas 24, 48 e 72 horas após a inoculação.

Sabendo-se da existência de um incremento bacteriano cerca de 24 horas após a

refeição sanguínea, o mesmo procedimento foi aplicado decorrido esse intervalo de

tempo, após a refeição sanguínea.

Foi ainda inoculado em agar de citrimida, 100 µl de diluições de 1/100 e 1/1000,

dos isolados mucoso e não mucoso a crescer em meio LB, aquando da sua utilização

para infectar os mosquitos. Pretendeu-se de forma a confirmar o crescimento bacteriano

25

Contagem de oocistos 

Oito dias após a refeição sanguínea dos mosquitos, procedeu-se à contagem dos

oocistos a partir dos intestinos m

-se à dissecção dos tubos digestivos. Após a obtenção dos

m alinhados entre lâmina e lamela em PBS e observados ao

a. O número de oocistos foi determinado para cada intestino

médio de cada fêmea, para cada grupo.

rentes grupos.

édios das fêmeas de A. stephensi. Para cada grupo em

estudo, foram retiradas as fêmeas através de um aspirador entomológico e foram

ndos no congelador. Após os mosquitos se encontrarem colocadas cerca de 30 segu

inactivos pelo frio, procedeu

intestinos médios, estes fora

icroscópio de fluorescêncim

Os resultados relativos às taxas de infecção e contagem de oocistos, foram

analisados estatisticamente de forma a compararem-se os diferentes grupos de

tratamento em relação ao grupo controlo. Para tal, comparam-se as taxas de infecção

dos mosquitos através de um teste de Fisher, bem como a intensidade de infecção, ou

número de oocitos por estômago nas fêmeas infectadas, através de um teste de Mann-

Whitney. A aplicação destes testes estatísticos permitiu determinar a existência ou não

de diferenças significativas entre os dife

26

Resultados

27

Figura 10. Alterações da Microbiota do intestino médio de mosquitos infectados por P. falciparum. As barras representam a relação entre a quantidade OTUs (Unidades taxonómicas operacionais) e do número de sequências por OTU observadas nos mosquitos infectados em relação aos mosquitos não infectados.

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

racio infectad

o nã

o

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

infectad

o

OTU

SEQ

Total Total Gram pos Total Gram neg Pseudomonas Gammaproteobacteria

nálise  metagenómica  de  Anopheles  gambiae  infectados  e  não A

infectados com Plasmodium falciparum 

í os mosquitos infectados ( f

e D A

édio dos mosquitos. As sequências

a tificar alt ações na di r

na em mosquitos susceptíveis à infecção por P. falciparum, quando

compa

A partir do DNA extra do d susceptíveis à in ecção) e

não infectados (resistentes à infecção), foi amplificado e s quenciado o N da

população microbiana presente no intestino m

obtidas foram analisadas par iden er versidade e estrutu a da

comunidade bacteria

rados com mosquitos resistentes à infecção. Foram obtidas um total de 60 037

sequências nas três réplicas de mosquitos analisados (28 005 infectados, 32 032 não

infectados) e o número de sequências por amostra variou de 3 328 a 13 186.

Apenas foram considerados os grupos que estavam representados em todas as 3

réplicas. O género Pseudomonas (Tax ID:286) estava sub-representado nos mosquitos

infectados, enquanto que a Classe Gammaproteobacteria (Tax ID:1236) estava sobre-

representada (Figura 10).

28

Curvas  de  crescimento  de  Pseudomonas  aeruginosa  dos  isolados 

mucoso e não mucoso

Figura 11. Valores de absorvância para o isolado mucoso e não mucoso de P. aeruginosa, para cada intervalo de tempo. Cada intervalo de tempo corresponde a 1 hora e os valores de absorvância foram medidos a um comprimento de onda de 600 nm.

Isolado não mucoso Isolado mucoso

 

ase de maior actividade celular

coso e não mucoso, apresentaram um crescimento idêntico,

A partir dos isolados utilizados para o crescimento bacteriano e determinação

das curvas de crescimento, procedeu-se à sua inoculação em agar de citrimida com o

ultura LB, incubando-se posteriormente a 37 °C. Foram efectuadas observações

decorridas 24, 48 e 72 horas.

De forma a determinar-se a f das Pseudomonas,

ou seja, o período correspondente à maior taxa de divisão bacteriana, a fase de

crescimento exponencial ou fase L o dos valores de

absorvância a 600 nm, para cada inte dos (Anexo 1).

Os dois isolados, mu

og, procedeu-se à determinaçã

rvalo de tempo, para os dois isola

ou seja, revelaram valores de absorvância muito semelhantes. Em ambos, a fase

exponencial teve início 6 horas após a inoculação do isolado em meio de cultura LB

(Figura 11).

objectivo de se confirmar o crescimento bacteriano de ambos. Efectuaram-se diluições

de 1/100 e 1/1000, a partir das quais foram inoculados 100 µl de cada em meio de

c

29

A partir da observação do crescimento bacteriano, foram verificadas diferenças

morfológicas nos diferentes isolados (figura 12). O crescimento bacteriano

correspondente ao isolado não mucoso, demonstrou uma tendência de crescimento das

colónias mais homogénea (placas da esquerda). Por sua vez, o isolado mucoso

evidenciou a produção de alginato, típico destas colónias, mais acentuado com o

decorrer do tempo e com a tendência para se acumular e escorrer (placas da direita).

Infecção dos mosquitos com Plasmodium berghei

A B A B

 

 

Tabela I. Parasitémias dos murganapós a infecção por ampola e 3 dias após passa

hos 4 dias a

la Passagem19 212 20

3 ‐ 18

Parasitémia 

gem.

Murganho Ampo

2 21

4 ‐ 215 ‐ <16 ‐ 17

(%)

 

 

Par

xperiment

cessário

os CD ,

sitémias

m

Figura 12. Crescimento bacteriano em meio de cultura de citrimida do isolado não mucoso (à esquerda) e mucoso (à direita) de P. aeruginosa. A - Após 24 horas de cultivo e B - Após 48 horas de cultivo.

a se proceder à infecção

al dos mosquitos de A. e

sthephensi com P. berghei, foi ne

proceder-se à infecção dos murganh 1

fonte do parasita aquando da refeição

sanguínea dos mosquitos. As para

fora determinadas por esfregaço

sanguíneo, quatro dias após a infecção

intraperitoneal com sangue infectado

30

criopreservado, de dois murganhos (Nº 1 e 2) e três dias após passagem para quatro

novos murganhos (Nº 3, 4, 5, e 6) (tabela I).

Todos os murganhos infectados, à excepção do Nº 5 posteriormente à passagem,

apresentaram valores de parasitémia dentro do intervalo utilizado para a infecção dos

mosquitos (≈ 15-20 %). Desta forma, para se efetuar a passagem a partir dos dois

primeir

ente da presença de bactérias. No grupo controlo a mortalidade foi

bastant

actérias do intestino médio de Anopheles stephensi

os murganhos infectados, optou-se pelo Nº 2. Para a alimentação das fêmeas dos

quatro grupos excluíram-se os murganhos 3 e 5, pois o primeiro pareceu apresentar uma

menor taxa de exflagelação e o segundo apresentou uma parasitémia praticamente

indetectável.

No dia da refeição sanguínea, foi observada uma mortalidade bastante elevada

nos mosquitos correspondentes aos grupos sujeitos ao tratamento antibiótico,

independentem

e reduzida.

Isolamento de b  

uitos

ento bacteriano através do

u-se também a detecção de P.

obtidos, 100 µl das diluições 1/10, 1/100 e 1/1000 foram cultivados

nos me

intestinos médios dos mosquitos, cuja flora Microbiota foi restituída com as

Para se confirmar a condição de esterilidade do tracto digestivo dos mosq

após o tratamento antibiótico, procedeu-se ao isolam

rescimento no meio de cultura geral LA e TSA. Pretendec

aeruginosa, após re-infecção dos mosquitos previamente esterilizados, através do

crescimento bacteriano em meio de cultura à base de citrimida, específico para este

grupo de bactérias.

Para cada grupo experimental, foram seleccionados aleatoriamente cinco

mosquitos aos quais foram extraídos os intestinos médios e homogeneizados em PBS. A

partir dos extractos

ios de cultura seleccionados. Este procedimento foi aplicado 24 horas antes e

após a refeição sanguínea. O crescimento bacteriano foi seguido 24, 48 e 72 horas após

a inoculação e incubação a 37 °C (Anexo 2 e 3).

Previamente à refeição sanguínea, a partir da inoculação dos extractos dos

31

Pseudomonas, foi observado crescimento bacteriano nos mosquitos do grupo PaNM

para os diferentes meios de cultura. Contudo, na inoculação em agar de citrimida, foi

e colónias no meio de cultura LA e na

diluiçã

s com aparência não mucosa na inoculação do grupo PaNM. Já no grupo

ormação de colónias não mucosas e uma

apenas verificado crescimento bacteriano na diluição de 1/10. Morfologicamente, as

colónias de Pseudomonas observadas apresentaram uma aparência de crescimento não

mucoso, ou seja, não foi observada a produção de alginato. Este composto apresenta um

aspecto de uma substância translúcida e viscosa em torno da colónia, que com o

decorrer do tempo tem tendência para escorrer e acumular-se na fase oposta da placa de

Petri. Para o grupo PaM, apenas foi verificado crescimento bacteriano quando semeado

no meio de cultura LA e na diluição de 1/100.

Não foi observada qualquer colónia a partir da inoculação dos mosquitos

tratados com os antibióticos, independentemente de meio de cultura e diluição

efectuada. Por sua vez, para o grupo controlo, tecnicamente com a flora microbiana

intacta, apenas foi observado o crescimento d

o de 1/100.

Decorridas 24 após a refeição sanguínea, período correspondente a um aumento

significativo quer na composição da flora microbiana intestinal dos mosquitos quer na

quantidade, foi observado um acentuado crescimento bacteriano, em comparação com a

fase anterior.

Para os mosquitos correspondentes aos grupos PaNM e PaM, foi observada uma

elevada taxa de crescimento bacteriano nos meios de cultura LA e TSA,

independentemente da diluição. Em relação ao meio de citrimida, foram observadas

apenas colónia

PaM, foram verificadas diferenças morfológicas correspondentes ao crescimento dos

dois tipos de isolado, mucoso e não mucoso.

Como esperado, não foi registado nenhuma evidência de crescimento bacteriano

no grupo Antib. Contrariamente, no grupo Cont houve um crescimento bacteriano

bastante acentuado para os meios de cultura LB e TSA. Em relação ao meio de

citrimida, foi observado para este grupo a f

colónia mucosa, nas diluições 1/10 e 1/100. A partir destas placas de cultura, foram

seleccionadas seis colónias não mucosas e uma colónia mucosa, todas bem

diferenciadas e distintas, e foram retiradas com uma ansa e colocadas a crescer em meio

32

LB durante a noite. Foram realizadas alíquotas destas suspensões bacterianas e

conservadas com glicerol a -80 °C para posterior análise molecular.

A tabela II sumariza o crescimento bacteriano de cada grupo, para cada meio de

cultura e diluição.

conservadas com glicerol a -80 °C para posterior análise molecular.

A tabela II sumariza o crescimento bacteriano de cada grupo, para cada meio de

cultura e diluição.

Tabela II. Presença/ausência de crescimento bacteriano dos extractos intestinais dos mosquitos, 24 horas antes e após a refeição sanguínea, decorridas 24 e 48 horas após incubação a 37 ºC, em relação a cada

Meio de CulturaLA CitrimidaTSA

grupo de estudo e diluição.

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

 

C

 

ontagem de oocistos ontagem de oocistos C  

Para a determinação da taxa e intensidade de infecção dos mosquitos, foi

dissecado o intestino médio que se observou ao microscópio de fluorescência. O

+ + + - -1/1000 + + + + - -

1/10 + + + + + +1/100 + + + + + +

1/1000 + + + + + +1/10 - - - - - -

1/100 + + - - - -1/1000 - - - - - -

1/10 + + + + + +1/100 + + + + + +

1/1000 + + + + + +1/10 - - - - - -

1/100 - - - - - -1/1000 - - - - - -

1/10 - - - - - -1/100 - - - - - -

1/1000 - - - - - -1/10 - - - - - -

1/100 + + - - - -1/1000 - - - - - -

1/10 + + + + + +1/100 + + + + + +

1/1000 + + + + - -

Con

t

24h antes RF

24h após RF

PaN

24h após RF

PaM

24h antes RF

24h após RF

Ant

ib

24h antes RF

24h após RF

Diluição 24 H 48 H 24 H 48 H 24 H 48 H1/10 + + + + + +

1/100 +

M

24h antes RF

33

Pa NM PaM Antib ContInfectados 8 (20 %)  10 (47,6 %) 10 (58,8 %) 25 (62,5 %) 53Não Infectados 2 (80 %) 11 (52,4 %) 7 (41,2 %) 15 (37,5 %) 35Total 10 2

Gru

1 17 40 88

pos mosquitos (%)Total

Tabela III. Nº de mosquitos infectados com P. berghei e não infectados para cada grupo de estudo e respectivas percentagens.

Figura 13. Taxa de infecção para cada grupo de mosquitos

do e registado para cada mosquito em cada grupo (anexo 4,

à elevada mortalidade nos mosquitos sujeitos ao tratamento

entes grupos apresentaram uma grande variação no número

os tratados com os antibióticos e re-colonizados com os

isolado

da

flora Microbiota com P. aeruginosa

mucosa) apresentou a menor taxa de

infecção. O grupo PaNM (restituição da

flora Microbiota com P. aeruginosa não

ucosa) apresentou a maior taxa de

infecçã

número de oocistos foi conta

5, 6 e 7), no entanto, devido

antibiótico, ao 8º dia os difer

e indivíduos. Para os grupd

s não mucoso e mucoso de P. aeruginosa e para o grupo sem re-colonização, foi

apenas possível dissecar um total de 10, 21 e 17 mosquitos, respectivamente. Para o

grupo controlo, foi possível dissecar um total de 40 mosquitos.

Em relação ao número de oocistos no intestino médio de cada mosquito para

cada grupo, foram determinados os valores médios da taxa de infecção (tabela III e

figura 13).

O grupo PaM (restituição

m

o e o grupo Antib apresentou

uma taxa de infecção semelhante ao

grupo Cont. Contudo, estes resultados

não apresentaram diferenças

significativas p=0,1991, p=0,2567 e

p=0,5108, respectivamente quando

comparadas com o teste exato de Fisher.

34

Para o estudo da intensidade da infecção, foi possível verificar que o grupo

Antib (p=0,1751), apresentou uma intensidade de infecção mais elevada, ou seja,

apresentou um maior número de oocistos, por intestino médio

(p=0,2

infectado. O grupo PaM

101), que além de apresentar a menor taxa de infecção, apresentou ainda a menor

intensidade de infecção. Por fim, o grupo PaNM (p=0,5444) apresentou uma

intensidade de infecção intermédia, em relação aos grupos anteriores, mas superior ao

grupo Cont (figura 14). Estes resultados não apresentaram diferenças significativas

quando comparadas com o teste de Mann-Whitney.

Figura 14. Intensidade de infeção para cada grupo de estudo. Control, sem tratamento com antibiótico; PaNM, tratamento com antibiótico e recolonização do intestino médio com P. aeruginosa nao-mucosa; PaM; tratamento com antibiótico e recolonização do intestino médio com P. aeruginosa mucosa; tratamento com antibiótico sem recolonização do intestino médio.

35

Discussão dos Resultados / Conclusões

36

Ao longo da evolução da Classe Insecta, as bactérias foram e continuam a ser

ma força constante e dominante no meio ambiente. O sucesso dos insectos criou uma

diversidade de oportunidades para os microrganismos ocuparem uma variedade de

ichos ecológicos criados pelos insectos. O intestino médio dos representantes desta

classe

t. Contudo, com a nova geração de métodos de sequenciação de

acteriana nas condições descritas anteriormente. O crescimento dos dois

alginato, onde foi possível observar a

rmaç

u

n

é um exemplo clássico de nichos onde os hospedeiros obtêm vantagens (Dillon &

Dillon, 2004).

De um modo geral, o conhecimento das comunidades residentes no tracto

digestivo dos insectos continua por explorar, principalmente devido às limitações das

técnicas de isolamento baseadas em culturas e devido à baixa resolução de técnicas de

análise como fingerprin

DNA está-se a providenciar novas oportunidades para explorar a diversidade bacteriana

nos ambientes complexos, assim como aprofundar conhecimento sobre a

susceptibilidade à doença e interacções hospedeiro/agente patogénico (Boissière et al.,

2012).

Na primeira fase deste trabalho, procedeu-se ao crescimento bacteriano dos dois

isolados de P. aeruginosa, produtor de biofilme e não produtor. Deste procedimento, foi

possível determinar que a fase Log teve início, aproximadamente, 6 horas após a

incubação b

isolados apresentou valores de absorvância bastante semelhantes para cada intervalo de

tempo, incluindo o início da fase exponencial após o mesmo espaço de tempo. Este

ensaio terminou ao fim de 10 horas, não tendo sido possível alcançar a fase estacionária,

por isso, optou-se por assumir 12 horas como tempo ideal para o qual as bactérias

encontrar-se-iam metabolicamente mais activas.

A partir da inoculação destes isolados, após 12 horas de incubação, observou-se

em agar de citrimida o crescimento bacteriano ao fim de 24 e 48 horas. Aqui, foi

possível observar claras diferenças morfológicas entre os isolados mucoso e não

mucoso, nomeadamente no isolado produtor de

fo ão do biofilme. Com o decorrer do tempo, as colónias foram-se alastrando e a

formação do biofilme demonstrou uma tendência para cobrir toda a superfície da placa,

chegando a escorrer e acumular-se na extremidade oposta da placa.

37

Durante o processo de expansão do biofilme, células microbianas de P.

aeruginosa vão-se libertar das microcolónias e alcançar novas áreas da superfície ou

então b

ão bacteriana nos grupos PaNM,

PaM e

cteriana intestinal dos insectos tem as suas contrapartidas, além

5 mg/ml e Estreptomicina/Penicilina 10 mg/ml. Nestes

estudos verificou-se uma elevada mortalidade, até 7 dias após a infecção com P.

actérias isoladas vão-se deslocar através de flagelos. Quando a fonte de carbono

utilizada para o crescimento bacteriano é a glucose, as bactérias aderentes a uma

superfície vão-se diferenciar inicialmente em subpopulações não móveis e móveis. As

primeiras vão formar uma espécie de “talos” de uma estrutura multicelular semelhante a

“cogumelos”, onde as subpopulações móveis vão colonizar os “talos” e

subsequentemente vão formar a parte superior da estrutura. Quando o citrato é utilizado

como fonte de carbono, a totalidade da população bacteriana é móvel na fase inicial de

formação do biofilme e não se formam estruturas semelhantes a “cogumelos”, mas antes

um biofilme plano e contínuo (Harmsen et al., 2010).

Previamente à colonização do tubo digestivo dos mosquitos com Pseudomonas,

mucoide e não mucoide, procedeu-se à sua esterilizaç

Antib. No fim deste procedimento, foram cedidas as bactérias em meio de

cultura LB aos dois primeiros grupos e apenas meio LB estéril ao grupo Antib. Foi

verificada uma mortalidade bastante significativa nos mosquitos tratados com os

antibióticos seleccionados. Devido a esta redução bastante acentuada dos grupos

sujeitos ao tratamento antibiótico, em relação ao grupo controlo, não foi possível retirar

conclusões concretas.

De acordo com Dillon & Dillon, 2004, a utilização de agentes antimicrobianos

para suprimir a flora ba

do efeito tóxico sobre o hospedeiro, microrganismos resistentes podem superar o efeito

antibacteriano. Em estudos com determinadas espécies de gafanhotos, esta desvantagem

foi ultrapassada simplesmente pela esterilização da superfície dos ovos e mantendo a

descendência em condições de esterilidade e isolamento. Também Lyke et al., 2010 no

seu trabalho com um isolado de P. falciparum resistente à cloroquina obteve mosquitos

A. stephensi assépticos através de desinfecção dos ovos e controlo do desenvolvimento

em condições de esterilidade.

Em trabalhos realizados com A. gambiae, Dong et al., 2009 esterilizou

mosquitos com Gentamicina 1

38

berghei

volvimento de oocistos. O

mesmo

seleccionados, antes e

após a

, aproximadamente 60 % em mosquitos sépticos e 40 % em assépticos. Contudo,

estes resultados sugerem que a longevidade de Anopheles, após a infecção por

Plasmodium, é influenciada pela presença da Microbiota, uma vez não há diferenças

significativas na mortalidade dos mosquitos após uma refeição sanguínea não infectada,

o aumento da mortalidade resulta assim, da ocorrência simultânea de bactérias e

Plasmodium. Também Noden et al., 2011 utilizou diferentes concentrações de

gentamicina para analizar o seu efeito antibiótico sobre isolados bacterianos

provenientes do intestino médio de mosquitos A. gambiae. Este autor obteve ainda

mosquitos estéreis através de um tratamento de três dias com uma solução de 10 % de

sacarose com uma concentração de 50 µg/ml do antibiótico.

Mosquitos adultos criados em laboratório, alimentados com bactérias Gram-

negativas juntamente com gametócitos de P. falciparum, demostraram que todas as

bactérias deste grupo inibiram total ou parcialmente o desen

resultado não foi demonstrado com bactérias Gram-positivas. Da mesma forma,

alimentando os mosquitos com gentamicina aumentou significativamente o número de

mosquito infectados com Plasmodium (Azambuja et al., 2005).

Seguindo a selecção de antibióticos proposta por Ivanov et al., 2008, para a

eliminação da flora microbiana, foi possível obter mosquitos estéreis, ou pelo menos

sem microrganismos capazes de crescer nos meios de cultura

refeição sanguínea. Para os mosquitos tratados com os antibióticos, mas re-

infectados com as Pseudomonas, foi observado crescimento bacteriano, de um modo

geral, nos meios de cultura LA e TSA. No meio de citrimida, específico para este grupo

de bactérias, foi observado apenas crescimento para o isolado não mucoso. Após a

refeição sanguínea, o crescimento bacteriano foi bastante acentuado para os meios de

cultura LA e TSA, para o meio de citrimida verificou-se crescimento para o isolado

mucoso, onde foi possível observar-se o desenvolvimento de colónias produtoras de

muco e não mucosas, com a respectiva pigmentação característica associada a este meio

de cultura. Posteriormente à ingestão de sangue por fêmeas hematófagas, assiste-se a

uma expansão bacteriana massiva no intestino médio dos mosquitos, provavelmente

devido à acumulação de nutrientes resultantes da digestão do sangue (Pumpuni et al.,

1996).

39

Com este trabalho, devido à exacerbada mortalidade dos mosquitos tratados com

os antibióticos, não foi possível obter diferenças significativas relativas à taxa de

. O grupo sujeito ao tratamento

antibió

icial da infecção e a

presenç

ma e numa primeira análise, conferir algum grau de

proteçã

infecção entre os diferentes grupos em relação ao grupo controlo. O entanto, a maior

taxa de infecção foi verificada no grupo cuja flora Microbiota foi restabelecida com P.

aeruginosa do isolado não mucoso, já a menor taxa de infecção foi apresentada pelo

grupo de mosquitos tratados com o isolado mucoso.

Após o estabelecimento da infecção, foi analisada a intensidade da mesma, ou

seja, o número de oocistos por intestino médio

tico, mas sem restituição de flora Microbiota, exibiu a maior proporção de

oocistos por fêmea infectada. Além de apresentar a menor taxa de infecção, o grupo

PaM apresentou a menor intensidade de infecção. Em relação ao grupo Cont e Antib,

apesar de não apresentarem taxas de infecção muito diferentes, superior no primeiro, a

intensidade de infecção foi bastante superior no grupo esterilizado.

Podemos afirmar com estes resultados, que após o estabelecimento da infecção

no hospedeiro vector, existe uma relação entre o desenvolvimento in

a de flora bacteriana do tracto digestivo. Determinadas espécies bacterianas

poderão modificar o ambiente do intestino médio dos mosquitos e torná-lo menos

propício ou favorável ao desenvolvimento parasitário. Também, elevadas concentrações

bacterianas, nomeadamente a expansão bacteriana após a refeição sanguínea, podem

evocar uma resposta imunitária que posteriormente bloqueia o desenvolvimento do

parasita (Pumpuni et al., 1996).

Também, relativamente ao grupo das Pseudomonas, o isolado produtor de

alginato demonstrou de alguma for

o não só relativamente ao estabelecimento da infecção por P. berghei, mas

também no número de oocistos observáveis no intestino médio após a infecção,

actuando, possivelmente, na capacidade dos oocinetos atravessarem a parede do

intestino. Noden et al., 2011 afirma que biofilmes bacterianos têm demonstrado a

capacidade de aderir e inibir crescimento de outros protozoários in vitro, no caso

particular de Plasmodium, possivelmente encontrar-se-á associado à diminuição da

mobilidade dos oocinetos.

40

No estudo metagenómico efectuado, as sequências da região hipervariável V6 do

16S rRNA bacteriano foram analisadas para identificar alterações na diversidade e

estrutu

de significância, possivelmente associada às

diferen

odução de

oocisto

ento

de Pla

ra da comunidade bacteriana em mosquitos susceptíveis à infecção por P.

falciparum, quando comparados com mosquitos resistentes à infecção. A presença de

uma maior quantidade relativa de bactérias do género Pseudomonas parece estar

associada aos mosquitos não infectados, sugerindo que poderá conferir alguma proteção

ao mosquito A. gambiae contra a infecção por P. falciparum. No entanto, com o

trabalho actual, a quebra no número de mosquitos tratados com antibióticos impediu a

formulação de conclusões concretas.

Contudo, estes resultados preliminares não permitem tirar conclusões concretas,

nomeadamente devido à ausência

ças no número de mosquitos de cada grupo, especialmente considerando o baixo

número de mosquitos nos grupos tratados. Também, a elevada mortalidade nos grupos

sujeitos à esterilização bacteriana, de alguma forma poderá ter seleccionado os

mosquitos mais resistentes por grupo tratado, e estes não serem representativos da

população em geral. Desta forma, torna-se fundamental a repetição deste ensaio de

forma a não só confirmar os resultados como aumentar a robustez estatística.

Recentes investigações com mosquitos sugerem a existência de uma ligação

entre a redução da taxa de bactérias no tracto digestivo e um aumento da pr

s de Plasmodium. De acordo com Dillon & Dillon, 2004, a prevalência de

determinados tipos de bactérias no intestino médio dos mosquitos, pode influenciar o

desenvolvimento de Plasmodium face a variações no seu habitat.

As bactérias no lúmen do intestino médio dos mosquitos podem interagir

directamente e produzir um efeito adverso nos diferentes estágios de desenvolvim

smodium após a refeição sanguínea. Este efeito pode ser resultado de diversos

factores, tais como a produção de várias enzimas ou toxinas e a presença de barreiras

físicas que impedem o contacto entre os oocinetos de Plasmodium e o epitélio do tracto

digestivo. Alternativamente, o efeito bacteriano no desenvolvimento do parasita, pode

ocorrer indirectamente através de alterações na fisiologia do próprio hospedeiro.

Possivelmente, este efeito resulta da indução de respostas imunitárias cruzadas entre as

bactérias e os parasitas de malária (Dong et al., 2009). Mais ainda, após uma refeição

41

sanguínea, as populações bacterianas no intestino médio dos mosquitos sofrem uma

expansão massiva, o que poderá também resultar numa sobreactivação do sistema

imunitário do hospedeiro (Azambuja et al., 2005).

Alterações no metabolismo do hospedeiro poderão também afectar a composição

de moléculas derivadas do mosquito, essenciais para o desenvolvimento de

Plasmo

s imunes anti-bacterianas e anti-Plasmodium, sugerindo que os mosquitos

responsáveis pela

coinfecção com parasitas de malária, pode ser

dium. Alguns estudos sugerem, que factores imunes do mosquito induzidos pela

presença das bactérias, estão associados na eliminação de parasitas na fase do

desenvolvimento de pré-oocisto (Dong et al., 2009). Existem evidências consideráveis

que o intestino médio dos insectos vectores é um órgão imunoreactivo, capaz de

responder à presença de bactérias e parasitas ingeridos com a refeição sanguínea, pela

regulação de genes específicos e síntese de péptidos antimicrobianos (Azambuja et al.,

2005).

De facto, em termos funcionais, tem sido observada uma sobreposição de

resposta

carecem de mecanismos de defesa específicos contra parasitas de malária, mas recorrem

aos mecanismos anti-bacterianos para limitar as infecções por Plasmodium. Assim,

surge como hipótese que a presença das bactérias é responsável pela activação de

respostas imunitárias antimicrobianas e consequentemente, a síntese de péptidos

antimicrobianos e outros factores imunes que irão actuar contra coinfecção com

Plasmodium (Dong et al., 2009). Ou seja, tem sido demonstrado que a flora microbiana

do tubo digestivo do mosquito é capaz de estimular a actividade imune basal, que por

sua vez actua contra o parasita da malária (Cirimotich et al., 2011a).

A massiva quantidade de bactérias presentes no intestino médio após uma

refeição sanguínea pode também resultar na produção de factores

inibição da adesão ou desenvolvimento dos parasitas. Tais factores podem incluir

pigmentos como a prodigiosina, produzida pelas bactérias Gram-negativas Serratia

marcescens, S. plymuthica, P. aeruginosa, Klebsiella sp e Enterobacter, ou moléculas

tóxicas com potencial actividade antiparasitária, como os sideróforos pioverdina e

piocianina (Azambuja et al., 2005).

Boissière et al., 2012 afirma que o papel protector da flora microbiana do tracto

digestivo de Anopheles contra a

42

demon

s de ingestão de sangue. A digestão da hemoglobina, a

princip

s

por P.

stivo destes insectos.

Este e

strado através de tratamento antibiótico para suprimir as bactérias, que resulta

num aumento das infecções por Plasmodium. Desta forma, coinfecções de bactéria e

Plasmodium reduzem o número de oocistos em desenvolvimento no intestino médio do

mosquito, quer em condições laboratoriais quer em condições de campo. Numerosos

estudos demonstram que as bactérias da flora microbiana actuam sobre a capacidade de

Plasmodium se diferenciar em oocisto no intestino médio de Anopheles. Mosquitos que

foram tratados com antibióticos para remover as bactérias do tubo digestivo, são mais

susceptíveis a infecções por Plasmodium e a reconstituição da flora microbiana destes

mesmos mosquitos, resulta em infecções do mesmo nível de mosquitos não tratados

(Cirimotich et al., 2011a).

A capacidade vectorial das espécies de insectos hematófagas está directamente

associada aos seus hábito

al proteína do sangue, no tubo digestivo destes insectos resulta na libertação de

grandes quantidades do grupo prostético heme, com um potencial pro-oxidante e efeito

citotóxico quando não ligado a proteínas. Diversos mecanismos de protecção contra o

stress oxidativo provocado pelo grupo heme e as espécies reactivas do oxigénio (ROS),

evoluiram com as diferentes espécies de insectos hematófagos (Oliveira et al., 2011).

Estudos realizados com Enterobacter bacterium isolada em mosquitos selvagens

capturados na Zâmbia, demonstraram que esta bactéria confere resistência a infecçõe

falciparum. Em vez de induzir respostas imunes que levam a uma diminuição da

carga parasitária, estas experiências revelaram que a inibição no desenvolvimento de

Plasmodium na presença da flora Microbiota comensal, resulta da produção de ROS por

bactérias do grupo Enterobacter. Este stress oxidativo vai actuar directamente sobre os

parasitas do intestino médio do mosquito (Boissière et al., 2012).

Em estudos com Aedes aegypti, foi também demonstrado que imediatamente

após a ingestão de sangue diminui a taxa de ROS no tracto dige

vento, que ocorre em paralelo com a expansão da flora microbiana, permite

concluir que as ROS estão relacionadas com o controlo bacteriano no tracto digestivo

destes insectos. É ainda demonstrado que a ausência de ROS diminui a resistência dos

mosquitos à infecção e aumenta a sua mortalidade. Um outro exemplo, refere-se a uma

estirpe de A. gambiae, refratária à infecção por Plasmodium, vive num estádio crónico

43

de stress oxidativo, esta situação permite o crescimento bacteriano que antagoniza a

infecção pelo parasita (Oliveira et al., 2011). Segundo Cirimotich et al., 2011b, foi

recentemente identificada uma estirpe de Enterobacter a partir de mosquitos selvagens,

que produz espécies reactivas de oxigénio que elimina os parasitas em desenvolvimento

no tubo digestivo inibindo a infecção por Plasmodium antes da formação do oocisto.

A constituição simples, quando comparada com os mamíferos, da flora

microbiana dos mosquitos torna-os um bom modelo tentar compreender a dinâmica

entre o

sistema imune do hospedeiro, a flora Microbiota e a invasão por agentes

patogénicos. Uma melhor compreensão do papel da flora microbiana face ao sistema de

defesa do hospedeiro irá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de

controlo da transmissão da malária (Dong et al., 2009). Formulações bacterianas são

actualmente utilizadas como biocontrolo de larvas de mosquito, no entanto devido à

natureza das interacções mosquito-bactéria ainda não totalmente esclarecidas, a

elaboração de procedimentos susceptíveis de aplicar à população adulta continua por

resolver (Cirimotich et al., 2011a).

44

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51

Lista de Ilustrações

Figura 1. Distribuição mundial da malária, com referência às zonas em fase de

eliminação da transmissão e zonas de controlo da infecção. Adaptado de:

http://www.talkafrique.com/issues/eradicating-malaria-not-anytime-soon.

Figura 2. Efeito de Bottleneck, onde se observa uma redução significativa do número

de oocistos no intestino médio de Anopheles. Adaptado de:

http://kafatos.openwetware.org/Research.html.

Figura 3. Desenvolvimento de Plasmodium no intestino médio do mosquito vector. 1

Gametogénese, fertilização e transformação do zigoto; 2- Invasão da matriz peritrófica;

3- Redução do nº de oocinetos invasores no espaço ectoperitrófico; 4- Invasão do

epitélio intestinal 5- Adesão dos oocinetos e desenvolvimento dos oocistos. Adaptado

de: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169475898013489.

Figura 4. Ciclo de vida de Plasmodium. Desenvolvimento no mosquito vector e

infecção no hospedeiro mamífero. Adaptado de:

http://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS147330990970177X/images?imag

eId=gr1&sectionType=green&hasDownloadImagesLink=true.

Figura 5. Fases da formação do biofilme por P. aeruginosa. 1- Adesão inicial; 2-

Adesão irreversível; 3- Maturação I; 4- Maturação II e 5- Dispersão. Adaptado de

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_aeruginosa.

Figura 6. Estrutura química possível do alginato produzido por P. aeruginosa, resíduos

de ácido D-manurónico intercalados com resíduos de ácido L-gulurónico (Franklin et

al., 2011.).

52

Figura 7. Pupas de A. stephensi colocadas a emergir na presença de antibióticos (A) e

em água estéril (B).

Figura 8. Copos descartáveis de papel, onde foram colocados os mosquitos, A.

stephensi, correspondentes a cada grupo de cada experiência. A – Vista lateral e B –

Vista superior.

Figura 9. Copos de papel descartáveis com os grupos de mosquitos em estudo durante o

tratamento com os isolados de P. aeruginosa em meio de cultura LB e em meio LB

estéril. A – Vista lateral e B – Vista superior.

Figura 10. Alterações da Microbiota do intestino médio de mosquitos infectados por P.

falciparum. As barras representam a relação entre a quantidade OTUs e do número de

sequências por OTU observadas nos mosquitos infectados em relação aos mosquitos

não infectados.

Figura 11. Valores de absorvância para o isolado mucoso e não mucoso de P.

aeruginosa, para cada intervalo de tempo. Cada intervalo de tempo corresponde a 1

hora e os valores de absorvância foram medidos a um comprimento de onda de 600 nm.

Figura 12. Crescimento bacteriano em meio de cultura de citrimida do isolado não

mucoso (à esquerda) e mucoso (à direita) de P. aeruginosa. A - Após 24 horas de

cultivo e B - Após 48 horas de cultivo.

Figura 13. Taxa de infecção para cada grupo de mosquitos.

53

Figura 14. Intensidade de infecção para cada grupo de estudo. Control, sem tratamento

com antibiótico; PaNM, tratamento com antibiótico e recolonização do intestino médio

com P. aeruginosa nao-mucosa; PaM; tratamento com antibiótico e recolonização do

intestino médio com P. aeruginosa mucosa; tratamento com antibiótico sem

recolonização do intestino médio.

54

Lista de Tabelas

Tabela I. Parasitémias dos murganhos 4 dias após a infecção por ampola e 3 dias após a

passagem.

Tabela II. Presença/ausência de crescimento bacteriano dos extractos intestinais dos

mosquitos, 24 horas antes e após a refeição sanguínea, decorridas 24 e 48 horas após

incubação a 37 ºC, em relação a cada grupo de estudo e diluição.

Tabela III. Nº de mosquitos infectados com P. berghei e não infectados para cada

grupo de estudo e respectivas percentagens.

55

Anexos

56

Anexo 1

Valores de absorvância o isolado mucoso e não mucoso de P. aeruginosa, para cada intervalo de tempo. Cada intervalo de tempo corresponde a 1 hora e λ = 600 nm.

57

Anexo 2

Inoculação dos extractos dos estômagos para os três meios utilizados, à esquerda PaNM e à direita PaM, 24 H antes da refeição sanguínea e após re-infecção com Pseudomonas. Observação 48 H após incubação a 37 °C. A – Meio de cultura LA, B – Meio de cultura TSA e C – Agar de citrimida.

A B C

Inoculação dos extractos dos estômagos para os 3 meios utilizados, à esquerda Antib e à direita Cont, 24 H antes da refeição sanguínea. Observação 48 H após incubação a 37 °C. A – Meio de cultura LA, B – Meio de cultura TSA e C – Agar de citrimida.

A B C

58

Anexo 3

Ir

M

noculação dos extractos dos estômagos para os 3 meios, à esquerda PaNM e à direita PaM, 24 H após efeição sanguínea e após re-infecção com Pseudomonas. Observação 48 H após incubação a 37 °C. A –

eio de cultura LA, B – Meio de cultura TSA e C – Agar de citrimida.

A B CA B C

Inoculação dos extractos dos estômagos para os 3 meios, à esquerda Antib e à direita Cont, 24 H após refeição sanguínea. Observação 48 H após incubação a 37 °C. A – Meio de cultura LA, B – Meio de cultura TSA e C – Agar de citrimida.

B C A

59

Anexo 4

Nº de oocistos de P. berghei, por estômago para cada mosquito de cada grupo de estudo.

60

Anexo 5

Fotografias de fluorescência de oocistos de P. berghei marcados com GFP, de cada estômago infectado de fêmeas de A. sethephensi tratados com antibióticos e re-infectados com um isolado não mucoso de P. aeruginosa (grupo PaNM).

61

Anexo 6

Fotografias de fluorescência de oocistos de P. berghei marcados com GFP, de cada estômago infectado de fêmeas de A. sethephensi tratados com antibióticos e re-infectados com um isolado mucoso de P. aeruginosa (grupo PaM).

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62

Anexo 7

Fotografias de fluorescência de oocistos de P. berghei marcados com GFP, de cada estômago infectado de fêmeas de A. sethephensi tratados com antibióticos sem re-infecção por P. aeruginosa (grupo Antib).

. . .

. . .

. . .

.

63

Anexo 8

Fotografias de fluorescência de oocistos de P. berghei marcados com GFP, de cada estômago infectado de fêmeas de A. sethephensi sem tratamento antibiótico nem re-infecção com P. aeruginosa (grupo Cont).

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64

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65