Universidade São Judas Tadeu · Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São...
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Universidade São Judas Tadeu Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Educação Física EFEITOS MORFOQUANTITATIVOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA AORTA ASCENDENTE EM CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DOS HORMÔNIOS OVARIANOS Claudia Marchon São Paulo 2010
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Universidade São Judas Tadeu
Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Educação Física
EFEITOS MORFOQUANTITATIVOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA
AORTA ASCENDENTE EM CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT
SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DOS HORMÔNIOS OVARIANOS
Claudia Marchon
São Paulo
2010
Universidade São Judas Tadeu
Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Educação Física
EFEITOS MORFOQUANTITATIVOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA
AORTA ASCENDENTE EM CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT
SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DOS HORMÔNIOS OVARIANOS
Claudia Marchon
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Educação Física da Universidade São Judas Tadeu como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Educação Física. Linha de Pesquisa: Bases Biodinâmicas da Atividade Física.
Orientadora: Profa. Dra. Laura Beatriz Mesiano Maifrino. Co-orientadora: Profa. Dra. Kátia De Angelis.
São Paulo
2010
Marchon, Claudia Maria
Efeitos morfoquantitativos do treinamento físico aeróbico na aorta ascendente em
camundongos fêmeas LDL KOCKOUT submetidas à privação dos hormônios ovarianos
/ Claudia Maria Marchon. - São Paulo, 2010.
87 f. : il., gráf.; tab. ; 30 cm.
Orientadora: Laura Beatriz Mesiano Maifrino
Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, 2010.
1. Morfologia (animal) - 2. Treinamentos físicos 3. Imunohistoquímica I. Maifrino,
Laura Beatriz Mesiano II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação
Stricto Sensu em Educação Física. III. Título
CDD – 571.96 Ficha catalográfica: Elizangela L. de Almeida Ribeiro - CRB 8/6878
Dedico esta dissertação aos meus pais, que sempre estimularam meus estudos, a
minha filha Catarina e ao meu marido Élson, que compreenderam minhas
constantes ausências e a importância do mestrado em minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos vocês familiares e amigos, colegas, professores e funcionários
da USJT, que sempre me apoiaram, nos bons e maus momentos, para a
concretização deste trabalho.
Tenho muita humildade em reconhecer que esta dissertação é fruto de um
trabalho em equipe, no qual sem a colaboração de todos, este trabalho não teria
sido concluído.
A minha orientadora Professora Dra. Laura Maifrino pela paciência e
disponibilidade em orientar-me.
A minha co-orientadora Professora Dra. Kátia De Angelis por me proporcionar os
ensinamentos iniciais e pela confiança.
Aos amigos de experimento: Michele, Janaína, Marcelo, Jaqueline, Daniele,
Sebastião, Ledimar, e especialmente, a Elizabeth e a Nathália Bernardes,
agradeço pelo apoio, ensinamentos, e principalmente, pela amizade.
À chefe do Biotério, Leide, que sempre esteve presente nos experimentos e no
cuidado com os animais.
Ao André e sua equipe, pelo apoio sempre imediato.
Ás minhas amigas pessoais, Ariane, Gabriela, Luciana, Marlene, e principalmente
Cibele, pela grande paciência que tiveram em me escutar o tempo todo falando
sobre o meu trabalho.
Às eternas crianças da minha vida, Rafaela, Bia, Hugo, meu príncipe encantado,
Fábio, sempre com carinho e atenção.
Às minhas tias e tios, primos e primas, padrinho e madrinhas, principalmente a
segunda mãe da minha filha, Márcia, pelo apoio e palavras de generosidade.
Às minhas irmãs, que são grande exemplo de perseverança e inteligência, Carla e
Cássia.
À minha falecida amiga Silvia, que sentirei muita falta, e família, e todos os meus
amigos de Vinhedo, pelo carinho e apoio.
Meus sinceros agradecimentos à UNIFESP, através do técnico Toninho e da
Professora Doutora Silvia Ihara, pelo aprendizado da técnica de
imunohistoquímica, e à USP, através da Professora Silvia Lacchini e pela
doutoranda Kátia, por tornar a imunohistoquímica uma realidade deste trabalho.
RESUMO
A menopausa e a dislipidemia são fatores causadores de lesões endoteliais e
teciduais, que levam ao aumento do risco de desenvolver doenças
coronarianas. Por outro lado, o treinamento físico é considerado como um
importante tratamento não farmacológico em várias disfunções
cardiovasculares. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do
treinamento físico na aorta ascendente de camundongos fêmeas LDL knockout
submetidas à privação dos hormônios ovarianos sob parâmetros
histomorfométrico, estereológico e imunohistoquímico. Foram utilizados 30
camundongos fêmeas divididos em 6 grupos (n=5): controle não-
ovariectomizado sedentário (CS); controle ovariectomizado sedentário (COS);
controle ovariectomizado treinado (COT); LDL knockout não ovariectomizado
sedentário (LDL-S) e LDL-Knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS) e
LDL-Knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). Foram analisados a
capacidade física dos animais, a densidade de volume de núcleo dos miócitos
(Vv[n]), densidade numérica de núcleo dos miócitos (Nn[n]), volume
nuclear médio dos miócitos (V), espessura das túnicas média e íntima (µm),
área da luz arterial (µm), razão espessura/luz (µm), densidade de volume de
fibras colágenas (Vv[fc]), densidade numérica de lamelas (Nn[lam]), densidade
de volume de lamelas (Vv[lam]) e análise da A II e ECA I em técnica de
imunohistoquímica.
Nossos resultados demonstraram que o treinamento físico foi eficaz em
melhorar a capacidade física e diminuir a produção da angiotensina II nos
grupos treinados, além de diminuir a densidade de volume das fibras colágenas
e elásticas no grupo COT. Em contra-partida, verificamos que houve diminuição
exacerbada da densidade de volume de fibras colágenas no grupo LDL-OT e
um aumento da ECA I. Nesse sentido, poderíamos supor que quando
associamos a diminuição do hormônio estrogênio e a dislipidemia, o
treinamento físico poderia ser prejudicial para a artéria aorta.
Palavras-chave: aorta, treinamento físico aeróbio, análises morfoquantitativa e
imunohistoquímica, dislipidemia, estrogênio.
ABSTRACT
Menopause and dyslipidemia are major factors for endothelial damage and tissue,
leading to increased risk of developing coronary heart disease. Moreover, physical
training is regarded as an important non-pharmacological treatment in various
cardiovascular disorders. Hence, the objective was to determine the effect of
physical training in the ascending aorta of LDL knockout female mice subjected to
deprivation of ovarian hormones on histomorphometric parameters, stereological
and immunohistochemical study. A total of 30 female mice divided into six groups
(n = 5): control non-ovariectomized sedentary (CS); control ovariectomized
sedentary (COS), control ovariectomized trained (COT), not LDL knockout
ovariectomized sedentary (LDL-S) and LDL- Knockout ovariectomized sedentary
(LDL-OS) and LDL-trained ovariectomized Knockout (LDL-OT). We analyzed the
physical capacity of the animals, the volume density of nuclei of myocytes (Vv[n]),
numerical density of myocyte nuclei (Nn[n]), mean nuclear volume of myocytes (V),
thickness of the tunica media and intima (mm), lumen area (mm), ratio thickness /
lumen (mm), volume density of collagen fibers (Vv[cf]), numerical density of
lamellae (Nn[lam]), volume density of lamellae (Vv [lam]) and A II and ACE I
through the method of immunohistochemistry.
Our results showed that exercise training was effective in improving physical
function and production of A II was decreased in the trained groups, beside that,
decrease the volume density of collagen and elastic fibers in the COT group. In
return, we found that there was a decrease exacerbated the volume density of
collagen fibers in group LDL-OT and an increase in the ACE I. In this sense, one
would assume that when we associate the decrease of the hormone estrogen and
dyslipidemia, physical training could be detrimental to the aorta.
Keywords: aorta, aerobic exercise, analysis morphoquantitative and
immunohistochemistry, dyslipidemia, estrogen.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Fotomicrografia da aorta de camundongos mostrando presença da placa de ateroma. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aum.10x.
09
Figura 02 Papel das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) na aterogênese.
18
Figura 03 Sequência experimental. 28 Figura 04 Treinamento de camundongos em esteira ergométrica 30 Figura 05 Fotomicrografia de corte transversal da aorta mostrando
técnica para medida dos volumes nucleares. Coloração Hematoxilina-eosina. Aumento: 40X.
37
Figura 06 Fotomicrografia da aorta de camundongo para visualização do lúmen e da túnica vascular. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aumento: 5X.
39
Figura 07 Gráfico da diferença entre o Peso corporal inicial e final em gramas dos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
43
Figura 08 Gráfico do Teste de esforço máximo (km/h) inicial e final, nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
45
Figura 09 Gráfico da Densidade numérica de núcleo dos miócitos (Nv[n]) por área, nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
46
Figura 10 Gráfico da Densidade de volume de núcleo dos miócitos (Vv[n]) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado LDL-OT).
47
Figura 11 Gráfico do Volume nuclear médio dos miócitos (V) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado
48
(LDL-OT). Figura 12 Gráfico da Espessura das túnicas média e íntima (µm) nos
grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
50
Figura 13 Gráfico da Área da luz arterial (µm) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
51
Figura 14 Gráfico da Razão espessura/luz (µm) da aorta nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
52
Figura 15 Gráfico da Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc])(%) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
54
Figura 16 Gráfico da Densidade numérica de lamelas (Nv[lam]) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
55
Figura 17 Gráfico da Densidade de volume de lamelas (Vv[lam])(%) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
56
Figura 18 Gráfico da expressão da AII e ECA I, em técnica de imunohistoquímica, nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
58
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Pressão arterial diastólica (PAD), sistólica (PAS) e média (PAM) e frequência cardíaca nos grupos controle ovariectomizado sedentário (COS) e treinado (COT), LDL Knockout ovariectomizado sedentário (LOS) e treinado (LOT).
32
Tabela 02 Peso inicial (PI), Peso final (PF) e a diferença entre o Peso corporal inicial e final (PF-PI) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
42
Tabela 03 Resultado do Teste de esforço inicial (TI), Teste de esforço (TF) e a diferença entre o teste de esforço máximo inicial e final (TF-TI) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
44
Tabela 04 Densidade numérica, de volume de núcleo e volume nuclear médio (V), nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
49
Tabela 05 Espessura das túnicas média e íntima (µm), Área da luz arterial (µm), e razão espessura/luz (µm), nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
52
Tabela 06 Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc])(%), e densidade numérica (Nv[lam]) e de volume de lamelas (Vv[lam])(%), nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
57
Tabela 07 Score da expressão de Angiotensina II e ECA I nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL OT.
58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AII angiotensina II
BSA albumina de soro bovino
CS grupo controle sedentário
COS grupo controle ovariectomizado sedentário
COT grupo controle ovariectomizado treinado
DAB diaminobenzidina
DCV doença cardiovascular
ECA I enzima conversora de angiontensina I
EROs espécies reativas de oxigênio
ERNs espécies reativas de nitrogênio
HAS hipertensão arterial sistêmica
HDL lipoproteína de alta densidade
H2O2 peróxido de hidrogênio
ICAM 1 molécula de adesão intercelular 1
IHQ imunohistoquímica
IL-6 interleucina 6
IFN β interferon β
IFN λ interferon λ
LDL lipoproteína de baixa densidade
LDL-S grupo LDL-knockout sedentário
LDL-OS grupo LDL-knokout ovariectomizado sedentário
LDL-OT grupo LDL knockout ovariectomizado treinado
M molar
NO óxido nítrico
Nn[n] densidade numérica de núcleo
Nv[lam] densidade numérica de lamelas
PA pressão arterial
PAD pressão arterial diastólica
PAS pressão arterial sistólica
TNF α fator de necrose tumoral α
TNF β fator de necrose tumoral β
VCAM 1 molécula de adesão vascular 1
VLDL lipoproteína de muito baixa densidade
V volume nuclear médio
Vv[n] densidade de volume de núcleo
V[A]) volume da aorta
V[luz] volume da Luz
Vv[fc] densidade de volume de fibras colágenas
Vv[lam] densidade de volume de lamelas
LISTA DE SÍMBOLOS
µm micrômetro
∑ somatória
% percentagem
ºC graus celsius
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 01
1.1. Menopausa e doenças cardiovasculares 01
1.2. Dislipidemia 02
1.3. Artéria aorta ascendente 04
1.4. Sistema Renina Angiotensina 09
1.5. Fatores envolvidos no processo inflamatório 12
1.6. Treinamento físico e o processo inflamatório 18
2. RELEVÂNCIA DO TRABALHO 23
3. OBJETIVOS 24
3.1. Objetivos gerais 24
3.2. Objetivos específicos 24
4. MATERIAIS E MÉTODOS 27
4.1. Animais e grupos 27
4.2. Sequência experimental 28
4.3. Ovariectomia 28
4.4. Teste de Esforço Máximo 29
4.5. Treinamento Físico 30
4.6. Registro da pressão arterial 31
4.7.Preparação dos Tecidos da parede da aorta 32
4.8. Análise em Imunohistoquímica 33
4.9. Análise Morfométrica 35
4.10. Análise estereológica 36
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 40
6. RESULTADOS 42
6.1. Peso corporal 42
6.2. Capacidade Física 43
6.3. Análises Estereológica, Morfoquantitativa
e dos componentes do SRA (A II e ECA I)
45
6.3.1. Análise do núcleo dos miócitos 45
6.3.1.1. Densidade Numérica de núcleo (Nn[n]) por área 46
6.3.1.2. Densidade de Volume de núcleo (Vv[n])(%) 47
6.3.1.3. Volume nuclear médio (V) 48
6.3.2. Análise das túnicas média intima arterial 49
6.3.2.1. Espessura da Parede das Túnicas Média e Íntima (µm) 49
6.3.2.2. Área da luz arterial (µm) 49
6.3.2.3. Razão espessura/luz da aorta 51
6.3.3. Análise dos componentes da Matriz extracelular 53
6.3.3.1. Densidade de Volume de Fibras Colágenas (Vv[fc])(%) 53
6.3.3.2. Densidade Numérica de Lamelas (Nn[lam]) 54
6.3.3.3. Densidade de Volume de Lamelas (Vv[lam])(%) 55
6.3.4. Análise dos componentes do SRA (A II e ECA I ) 57
7. DISCUSSÃO 60
7.1. Peso Corporal 61
7.2. Capacidade Física 62
7.3. Análise do núcleo dos miócitos (Densidade de volume de núcleo
(Vv[n]), Densidade numérica de núcleo (Nn[n]) e Volume nuclear (V))
62
7.4. Análise das Túnicas média e íntima arterial (Espessura das
túnicas média e íntima (µm), área da luz arterial (µm) e razão
espessura/luz)
64
7.5. Análise dos componentes da Matriz extracelular (Densidade de
volume de fibras colágenas (Vv[fc])(%), densidade numérica de
lamelas (Nn[lam]) e Densidade de Volume de Lamelas ( Vv[lam])(%)
66
7.6. Análise dos componentes do SRA (A II e ECA I ) 69
8. CONCLUSÃO 72
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Menopausa e doenças cardiovasculares
Com a diminuição da produção do hormônio estrogênio e o término da
menstruação, temos a menopausa, que tem como característica, a atrofia dos ovários,
das tubas uterina, útero, vagina e mamas. Esta diminuição hormonal está diretamente
envolvida no desenvolvimento de doenças cardiovasculares através de diversos
mecanismos. Após a menopausa, as doenças cardiovasculares (DCV´s) são as
principais causas de morbi-mortalidade. Nos Estados Unidos, as DCV´s afetam mais de
70 milhões de americanos (ALLEN et al.,2006). No Brasil, as doenças circulatórias
representam a principal causa de morte entre homens e mulheres (LIMA et al.,2007).
Estudos epidemiológicos vêm indicando que mulheres pós-menopausadas tem
maior risco de desenvolver doenças cardíacas (PERELLA et al.,2003; SOWERS, 1998;
IRIGOYEN et al.,2005) quando comparadas com homens da mesma idade e com
outros fatores de risco (STAMPFER et al.,1991). Isso ocorre, pois nesta fase, as
mulheres perdem a proteção cardiovascular, pela diminuição da produção do hormônio
estrogênio, que confere propriedades antioxidantes (DEBING et al.,2007), e como
consequência, ocorre o que denominamos estresse oxidativo.
2
1.2. Dislipidemia
A dislipidemia, caracterizada por alterações metabólicas lipídicas decorrente de
fatores genéticos ou ambientais, incluindo a dieta inadequada e a inatividade física,
vem sendo apontada como um importante fator de risco no surgimento das doenças
coronarianas.
Este distúrbio no metabolismo lipídico leva a alterações nos níveis plasmáticos
de lipoproteínas e de seus componentes na circulação sanguínea (GIANNINI,1998).
Desta forma, os lipídios (triglicerídios, fosfolipídios, colesterol entre outros) são
transportados no plasma sanguíneo na forma de lipoproteínas, que são proteínas
específicas chamadas apoproteínas com diferentes combinações de lipídios, formando
partículas com densidades distintas. Estas apoproteínas tem função sinalizadora e de
dirigir as lipoproteínas para os tecidos específicos que tenham receptores de superfície
que as reconheçam. Os quilomícrons (QL) são lipoproteínas constituídas por altas
proporções de triglicerídios portanto pouco densas. Já as lipoproteínas de muito baixa
densidade (VLDL) são formadas por triglicerídios oriundos do fígado resultado dos
ácidos graxos e carboidratos da dieta.
Os LDLs, que são as lipoproteínas de baixa densidade, são formadas
principalmente por colesterol, enquanto as lipoproteínas de alta densidade, comumente
chamadas de HDL, são sintetizadas no fígado e no intestino delgado e sua constituição
3
tem pouco colesterol e muitas proteínas. Vale ressaltar que o LDL tem receptores
específicos para o reconhecimento da Apo B e o HDL tem receptores para a ApoE.
A concentração plasmática elevada da lipoproteína de baixa densidade (LDL)
bem como de triglicerídeos, e a baixa concentração plasmática da lipoproteína de alta
densidade (HDL), considerado um protetor contra coronariopatias (GIANNINI, 1998;
PENALVA, 2008), são importantes preditores no desenvolvimento de doença arterial
coronariana, contribuindo com a formação de lesões em forma de placas, podendo
causar obstrução no fluxo sanguíneo (PENALVA, 2008). O HDL é considerado um
protetor contra coronariopatias, devido à sua capacidade em remover partículas de LDL
da corrente sanguínea e transportá-lo para o hepatócito, prevenindo uma possível
oxidação e posterior agregação do LDL na parede dos vasos sanguíneos (GIULLUM,
2000).
Vale ressaltar que os níveis de lipídeos séricos podem ser influenciados por
fatores dietéticos, sendo as gorduras saturadas ou de origem animal, as responsáveis
pelo aumento do colesterol na corrente sanguínea. Porém, alterações do colesterol
sérico também são influenciados por fatores genéticos, através da síntese endógena de
colesterol, produzidas principalmente pelo fígado. É importante ressaltar que após a
menopausa, existe maior incidência de níveis elevados de lipídeos devido à perda dos
hormônios sexuais femininos.
4
1.3. Artéria aorta ascendente
A atividade bombeadora do coração juntamente com os vasos sanguíneos e o
sistema linfático são responsáveis pela circulação do sangue e a distribuição de
líquidos pelo organismo. A regulação do fluxo sanguíneo responde a regulação
metabólica tecidual local; além da influência hormonal, através de agentes
vasoconstritores (norepinefrina, angiotensina e vasopressina) e os agentes
vasodilatadores (bradicinina e histamina); de íons e fatores químicos (cálcio, potássio,
íon hidrogênio); e por último, responde ao controle neural composto pelo sistema
nervoso simpático e parassimpático.
Uma característica importante das artérias coronarianas é a grande quantidade
de oxigênio que o miocárdio necessita, mesmo quando o indivíduo se encontra em
repouso (MARON, 1997).
Os vasos sanguíneos de maior calibre, como a aorta, são compostos por três
camadas ou túnicas, sendo a túnica íntima caracterizada por uma camada de células
endoteliais e uma camada de tecido conjuntivo frouxo; já a túnica média é constituída
principalmente por células musculares lisas e matriz extracelular composta por fibras
elásticas, fibras reticulares, proteoglicanos e glicoproteínas; e por último, a túnica
adventícia se caracteriza pela presença de colágeno do tipo I e fibras elásticas
(JUNQUEIRA et al.,2005).
5
A camada média é a responsável pela síntese do material extracelular composto
por colágeno, elastina e proteoglicanos, e também é nesta camada que acontece a
regulação do fluxo sanguíneo, no qual durante a sístole, devido a contração cardíaca, o
tecido do vaso se distende, e na diástole o tecido volta ao diâmetro normal. Estes vasos
apresentam o que denominamos de vasa vasorum, ou seja, vasos dos vasos, onde se
ramificam arteríolas, capilares e vênulas com a função de nutrir as túnicas adventícia e
média, que se encontram mais distantes da luz do vaso, portanto apresentam maior
dificuldade na chegada destes nutrientes e do oxigênio. Sabendo que estes vasos
recebem informações do sistema nervoso simpático que modula a contração e o
diâmetro dos mesmos (WILLIAMS et al., 1995; HALL, 1996).
As fibras elásticas consistem em uma glicoproteína chamada elastina e fibrilina,
que é uma microfibrila que confere elasticidade ao material, formando uma "malha" no
interior do tecido.
Os fibroblastos, responsáveis pela síntese de colágeno, elastina, proteoglicanas
e glicoproteínas da matriz extracelular são ativados somente quando solicitados, como
por exemplo, no caso de lesões teciduais, no qual se inicia o processo inflamatório, com
elevação do fluxo sanguíneo e aumento dos capilares, com conseqüente saída de
moléculas, entrada de células do sistema imune para o conjuntivo. Neste caso, o tecido
conjuntivo participa do processo de reparação tecidual, através da regeneração das
artérias teciduais destruídas.
6
A artéria aorta é considerada um vaso de grande calibre, que se divide em artéria
aorta ascendente, arco aórtico e artéria aorta descendente (TORTORA GRABOWSKI,
2002). As camadas da aorta não são completamente diferenciadas até cerca de vinte e
cinco anos de idade, sendo difícil separar alguns estágios finais de diferenciação
(BAILEY,1973). Essas artérias sofrem alterações com o envelhecimento e com a
inatividade física (HOFFMAN, 1961), tornando a túnica íntima mais espessa. As
camadas elásticas da média também sofrem alterações químicas e se tornam menos
elásticas, além do acúmulo de gordura entre as fibras elásticas e colágenas (BAILEY,
1973). Porém, estas alterações variam em tipo e grau em diferentes vasos do mesmo
indivíduo. As artérias elásticas, especialmente a aorta, mostram maiores alterações do
que as artérias das extremidades, tais como a femoral ou braquial (HOFFMAN, 1961).
Os vasos sanguíneos apresentam uma camada de epitélio pavimentoso em sua
superfície interna denominada endotélio, sendo considerado um dos principais
componentes da parede vascular indispensável na manutenção da fluidez normal do
sangue. O endotélio além de ter um papel importante na troca de moléculas e células
entre o sangue e os tecidos, também tem a função de produzir fatores vasoativos, como
as endotelinas, que são substâncias vasoconstritoras, e o óxido nítrico, que é um
importante vasodilatador da musculatura vascular (JUNQUEIRA et al.,2005).
Existem diversos fatores causadores de lesões endoteliais e teciduais, como o
envelhecimento, que estão associados com a maior rigidez dos vasos sanguíneos
7
(O’ROURKE et al.,1999 MOREAU et al.,2006), e com a maior suscetibilidade dos vasos
ao desenvolvimento de placas de ateroma, devido ao acúmulo de células endoteliais e
de depósito de substâncias na matriz na região íntima dos vasos, juntamente com
fragmentos da membrana elástica interna e o incremento do conteúdo de colágeno na
camada média das artérias (ROBERT,1999). A ativação de células endoteliais e a
redução da função dilatadora em grandes artérias contribuem para o processo
aterogênico (ALEXANDER et al.,2000).
A aterosclerose é uma doença que acontece nas artérias, no qual se evidencia
alta concentração de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) plasmático, com baixa
concentração de lipoproteínas de alta densidade (HDL), com posterior desenvolvimento
de lesão gordurosa na camada íntima das artérias e no músculo liso. Com isto, os
fibroblastos são ativados e liberam grande quantidade de tecido conjuntivo, que culmina
com o espessamento das paredes arteriais, perda da elasticidade, diminuição da
distensibilidade e rigidez do vaso (TORTORA GRABOWSKI, 2002).
Uma importante função do endotélio é produção de agentes vasoativos, como o
óxido nítrico, que influenciam no tônus vascular. Por outro lado, agressões vasculares
provocadas pela presença de fatores de risco cardiovasculares, podem levar a redução
da biodisponibilidade de óxido nítrico endotelial, ocasionando uma diminuição da
resposta vasodilatadora dependente, causando remodelação e formação da lesão
aterosclerótica (CELERMAJER et al., 1994), que se caracteriza pelo espessamento da
8
camada íntima através da proliferação de células musculares lisas e extracelulares do
tecido conjuntivo, podendo evoluir para a camada média, e de acordo com a sua
evolução, causar obstrução da luz do vaso.
O estágio inicial da aterosclerose se caracteriza pela disfunção endotelial
(ANDERSON,1999), no qual o endotélio apresenta moléculas de adesão na superfície
que atraem monócitos iniciando um processo inflamatório (ROSS, 1999). Este processo
desencadeia a formação de marcadores inflamatórios e apoptóticos (STEIN et al.,
2004).
Figura 1: Fotomicrografia da aorta de camundongo mostrando presença da placa de ateroma. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aumento: 10X.
Placa de ateroma
9
1.4. Sistema Renina Angiotensina
A disfunção endotelial está caracterizada pela diminuição do NO, que é um
potente vasodilatador produzido pelo endotélio, e está relacionado com a regulação do
tônus vascular, inibição plaquetária, e a diminuição da proliferação de células
musculares (REES et al., 1989). A diminuição do NO, juntamente com os diversos
fatores de risco coronariano, estão relacionados com a elevação dos níveis de pressão
arterial (GARDINER et al., 1990) e a aterosclerose (REES et al., 1989). O endotélio,
além de ser responsável pela produção do NO, também é responsável pela liberação
de substâncias vasoconstritoras, sendo a principal denominada endotelina. Com a
diminuição do NO, se evidencia o aumento da ação da endotelina, levando ao aumento
da ação do sistema nervoso simpático e ativação do sistema renina-angiotensina
(GIMBRONE Jr., 1995; PECHANOVA et al., 2004).
O sistema nervoso simpático está relacionado com o estado hiperdinâmico da
hipertensão e ao aumento da parede vascular levando à alterações estruturais do vaso
(IRIGOYEN et al., 2003) , enquanto o sistema renina-angiotensina (SRA) está
relacionado com a ativação de diversas substâncias vaso-ativas, inclusive da
angiotensina II, que é um potente vasoconstritor (REUDELHUBER, 1995), o qual
estimula o crescimento celular e o aumento da produção de colágeno (WEBER, 1997).
10
O SRA é formado por tres importantes componentes, que são a renina, o
angiotensinogênio, e a enzima conversora da angiotensina I (ECA I). O
angiotensinogênio é o principal substrato da renina e precursor da angiotensina II (AII).
Este peptídeo (AII), age nos receptores AT1 e AT2, sendo este primeiro, o responsável
pelas principais ações fisiopatológicas da AII, estando relacionado com a disfunção
endotelial oriunda do aumento da produção de EROs, vasoconstrição, ativação
plaquetária, espessamento da túnica íntima, entre outros (DIETZ et al., 1998).
Lembrando que a AII é produzida à partir da angiotensina I, através da ação da enzima
conversora da angiotensina I (ECA I) (WEBER, 1997).
O SRA além da produção de renina pelos rins e do angiotensinogênio pelo
fígado, mais recentemente, vem sendo verificado atuação local nos tecidos, tais como
cerebral, adrenal, miocárdio e nos vasos sanguíneos (LINDPAINTNER & GANTEN,
1991), sendo produzida pelas células endoteliais, macrófago, miofibroblastos e células
epiteliais (SUN & WEBER, 1996), fazendo com que a angiotensina II e a ECA exerçam
efeitos parácrino nesses órgãos (LINDPAINTNER & GANTEN, 1991). A ECA sofre
influência da produção do RNA mensageiro da enzima, que consequentemente
influencia na produção local de AII (DZAU, 1988).
Juntamente com a proliferação vascular, o aumento de macrófago, durante a
reabsorção de tecido necrosado (SUN & WEBER, 1996), e o aumento de
11
miofibroblastos (MILL et al., 1996), aumentam a expressão da ECA (SUN & WEBER,
1996; MILL et al., 1996), que está envolvida na cicatrização tecidual.
Fatores mecânicos e bioquímicos estão envolvidos no processo de remodelação
celular, dentre eles a AII, estimulando o crescimento celular e o acúmulo de colágeno
(WEBER, 1997), oriunda da produção local ou sistêmica.
Assim, a hipertrofia do miocárdio é um componente importante na remodelação
cardíaca em resposta à sobrecarga hemodinâmica crônica, que se caracteriza por
alterações morfofuncionais deste orgão. De início, este mecanismo tem sua importância
na manutenção da função cardíaca em resposta ao aumento de carga, e a longo prazo,
aumenta o risco de morbi-mortalidade ( PFEFFER, 1990; ZORNOFF et al., 2002).
Estudo de Staessen e colaboradores (1998), acrescenta que a diminuição dos
hormônios ovarianos, poderiam ser responsáveis pelo aumento da pressão arterial (PA)
em mulheres pós-menopausadas. De forma semelhante, Gallagher e colaboradores
(1999) demonstraram que o estrógeno diminui a produção da ECA I em diversos
tecidos, inclusive na aorta de ratas.
Nesse sentido, pesquisa de Gonçalves e colaboradores (2005), indicam que
bloqueadores dos receptores AT1 da angiotensina II e inibidores da ECA I podem
atenuar o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca em ratos. Brum e colaboradores
(2004) verificaram que o treinamento físico promove diversos ajustes fisiológicos,
inclusive resposta vasodilatadora, e o aumento da biodisponibilidade de NO.
12
1.5. Fatores envolvidos no processo inflamatório
As espécies reativas de oxigênio (EROs) também podem ser produzidas em
situações que necessitam de ativação do sistema imunológico (SCHNEIDER &
OLIVEIRA,2004), e a utilização de marcadores de estresse oxidativo estabelece uma
relação entre o dano oxidativo, as macromoléculas e as diversas doenças. A produção
excessiva de ERO’s além de poder causar danos às organelas celulares, também pode
ser considerado como um importante sinalizador intracelular que amplifica respostas
inflamatórias (FILIPPIN et al., 2008). O estresse oxidativo é capaz de induzir esta
resposta principalmente através da oxidação do colesterol LDL (KUNSCH et al.,1999).
A presença de fatores de risco como a menopausa, a dislipidemia, o
sedentarismo, entre outros, ocorre aumento de espécies oxidantes no organismo, que
culmina no estresse oxidativo, e o sistema de defesa antioxidante representado pelas
enzimas superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase (SIES,1996;
SCHNEIDER & OLIVEIRA,2004; AGARWAL et al.,2005) e os antioxidantes não-
enzimáticos provenientes da dieta ou através da suplementação alimentar
(SCHNEIDER & OLIVEIRA,2004), dentre eles a vitamina C (ácido ascórbico), vitamina
E (alfa-tocoferol), β-caroteno (SCHNEIDER & OLIVEIRA,2004; AGARWAL et al.,2005)
13
e flavonóides, tem como objetivo minimizar ou impedir os efeitos deletérios dos radicais
livres (BOGLIOLO et al.,2004).
Existem dois principais tipos de oxidantes, as EROs, e as espécies reativas de
nitrogênio (ERNs). Os principais tipos de EROs são o ânion superóxido, o peróxido de
hidrogênio e o radical hidroxila (AGARWAL et al.,2005). E as ERNs tem como principal
componente o óxido nítrico (NO), sintetizado a partir da L-arginina (AGARWAL et
al.,2005; ZAGO et al.,2006) na presença da enzima óxido nítrico sintase (AGARWAL et
al.,2005), sendo considerado o mais importante vasodilatador, que desencadeia
processos de relaxamento dos vasos sanguíneos, essenciais na manutenção do tônus
vascular (BOGLIOLO et al.,2004; BOLAD et al.,2005).
O processo inflamatório se inicia com a primeira linha de defesa denominada
inata, que é caracterizada pelo reconhecimento do patógeno ou qualquer material
estranho. Já a segunda linha de defesa, chamada resposta adaptativa (GOLDBERG et
al.2004), é representada pela migração de leucócitos para o local lesado, e
posteriormente, a liberação de citocinas, mediadores inflamatórios, enzimas
proteolíticas , migração de células musculares lisas e formação de tecido fibrótico
(GOLDBERG et al.2004).
Os leucócitos compreendem os monócitos, macrófagos e neutrófilos, além dos
linfócitos T ou células T e os linfócitos B ou células B (ROITT, 1998). As células B, por
sua vez, liberam anticorpos (também chamados de imunoglobulinas) que reconhecem e
14
se ligam ao antígeno, enquanto as células T (ROIIT, 1998) e os macrófagos (VAZ et al.,
2007) são responsáveis pela liberação das diversas citocinas (ROIIT, 1998), com
funções biológicas distintas (VAZ et al., 1998). Além dos anticorpos e das citocinas, as
proteínas do complemento também fazem parte da resposta imunológica (ROIIT, 1998).
As citocinas, moléculas de proteínas ou peptídeos, participam da sinalização
entre as células durante o processo das respostas imunes, e compreendem a família
das interleucinas, interferon (β e λ), fatores estimuladores de colônia, fatores de
necrose tumoral (α e β), fatores de crescimento e quimiocinas (ROIIT, 1998).
As citocinas da família das interleucinas, que podem ser IL1 até IL22, estão
envolvidas, entre outras funções, na indução da divisão e diferenciação celular. Já o
fator de necrose tumoral α (TNFα), fator de necrose tumoral β (TNF β) e o fator β de
transformação de crescimento (TGF β) são particularmente importantes nas reações
inflamatórias e citotóxicas (ROIIT,1998).
Vale ressaltar que na inflamação, as células e todo produto derivado desta
resposta, se concentram no local da inflamação e de acordo com a fase do processo,
ocorre produção e liberação de moléculas específicas (ROIIT, 1998), até que no
processo final, culmina na invasão da fibrose para a luz do vaso sanguíneo através da
ruptura da estrutura do endotélio, causando alteração no fluxo sanguíneo (GOLDBERG
et al., 2004).
15
Marcadores inflamatórios e a disfunção endotelial são fatores que evidenciam a
inflamação (GREWAL et al., 2003) e a hiperlipidemia, colaborando com o
desenvolvimento da disfunção endotelial. Quando o endotélio se encontra saudável, a
permeabilidade da membrana não permite a entrada do LDL, nem a proliferação de
células musculares lisas (VAN DEN BERG, 1995). Entretanto, nas células do endotélio
lesado, o óxido nítrico pode formar peroxinitrito, que é um prooxidante (ALEXANDER &
DZAU, 2000), fazendo com que as células musculares lisas e as plaquetas liberem
citocinas (FUSTER, 2005), aumentando assim a presença de LDL oxidado (WEBER et
al., 1999). Estas citocinas tem a função de promover e regular a adesão intercelular
junto a matriz extracelular (ROIIT, 1998).
As moléculas de adesão são importantes marcadores inflamatórios, que podem
ser divididas, de acordo com sua estrutura e função, em integrinas, selectinas e a
superfamília das imunoglobulinas. Estas moléculas são ativadas a partir do
reconhecimento do antígeno pelos linfócitos T, onde macrófagos e citocinas estimulam
as selectinas que proporcionam a adesão dos leucócitos no endotélio lesado. A
agregação das plaquetas é o segundo passo e acontece pela expressão da P-selectina,
que também está diretamente ligada à formação de células espumosas através do LDL
oxidado (SERRANO et al., 2004).
O acúmulo de lipídio na forma oxidada na intima da artéria, é reconhecido como
um patógeno pelos macrófagos, que migram para o tecido conjuntivo na forma de
16
monócitos e adquirem a forma ativa, fagocitando então a molécula de lipídeo como
forma de defesa. Esta molécula de LDL-ox englobada pelo macrófago passa a ser
denominada célula espumosa.
Particularmente o TNFα e o IFNλ, estão envolvidos na expressão das moléculas
de adesão endotelial incercelular 1 (ICAM1) e vascular 1 (VCAM1), que estão sendo
apontadas como importantes preditores de doenças cardiovasculares (HWANG et al,
1997) por estarem envolvidas no processo de sinalização e aderência de plaquetas,
monócitos e células musculares lisas na parede dos vasos , além de sua participação
no processo trombótico (SERRANO et al., 2004).
Nesse sentido, o sistema renina angiotensina tem mostrado participação direta
na disfunção endotelial (BATLOUNI, 1994), através da estimulação do crescimento de
células musculares lisas e de componentes da matriz na parede dos vasos (CHAGAS,
2004), sugerindo envolvimento deste sistema com a resposta inflamatória.
Como os marcadores inflamatórios estão sendo considerados preditores
importantes de doenças cardiovasculares, estudiosos vem pesquisando alternativas no
intuito de diminuir esta resposta. Assim, Koga e colaboradores (2004), propõem a
suplementação de vitamina E em coelhos submetidos a dieta hiperlipidêmica,
resultando em uma supressão na expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e
VCAM-1, enquanto Colacurci e colaboradores (2005), demonstraram que a
administração de isoflavona em mulheres pós-menopausadas, parece ter um papel
17
relevante na redução dos níveis plasmáticos das moléculas de adesão ICAM-1, VCAM-
1 e E-selectina, atuando na diminuição da resposta inflamatória. Smith e colaboradores
(1999),demonstraram que o exercício físico seria capaz de reduzir citocinas
inflamatórias e níveis de PCR.
Estudos estão sendo efetuados com relação aos bloqueadores de angiotensina II
e ECA I, no sentido de promover diminuição da resposta à injúria endotelial (TADDEI, et
al, 1997,2002). Desta forma, se mostra igualmente importante, estudos demonstrando a
expressão da AII e ECA I para maior compreensão destes dados.
Figura 2. Papel das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) na aterogênese. (Collins et al. 1995)
18
1.6. Treinamento físico e o processo inflamatório
O treinamento físico vem sendo considerado como uma conduta não-
farmacológica importante no tratamento de diferentes patologias, devido aos seus
benefícios cardiovasculares e metabólicos (NEGRÃO et al.,1998). Além disso, o
treinamento físico contribui na melhora da vasodilatação endotélio-dependente em
aorta de ratos hipertensos, através do aumento da biodisponibilidade de óxido nítrico
(RUSH et al., 2004), e é capaz de diminuir a deposição de colágeno e elastina na
parede arterial em idosos (OCAMPO et al., 2005), sugerindo ser um protetor contra a
disfunção vascular e aterogênese.
Existem evidências demonstrando que exercícios aeróbicos, praticados de
maneira regular, são capazes de melhorar alguns dos fatores de risco associados a
doenças cardiovasculares, como os níveis plasmáticos de lipídeos (SEGAL et al.,1991),
o índice de gordura visceral (MOURIER et.al.,1997), o aumento da sensibilidade à
insulina (RUDERMAN et al.,1979), o aumento da sensibilidade barorreflexa (SOUZA et
al.,2007), e na melhora da função endotelial, através do aumento do fluxo sanguíneo
que leva ao aumento da pressão de cisalhamento ou shear stress estimulando a
liberação de óxido nítrico (BOGLIOLO et al.,2004).
Estudos demonstram que o treinamento físico, agudo ou crônico, é capaz de
reduzir a pressão arterial em pacientes hipertensos (SUZUKI & OHTA, 2008), enquanto
19
Asikainen e colaboradores (2004), demonstram a relação entre a melhora da pressão
arterial e do controle metabólico em mulheres pós-menopausadas. Já, dados da Tese
de Cardinot (2008), observa o efeito hipotensivo do treinamento físico em estudo com
camundongos LDL knockout normotensos submetidos a treinamento físico com
intensidade moderada.
O treinamento físico está associado ao aumento do metabolismo, sugerindo
aumento do estresse oxidativo, porém Napoli e colaboradores (2004, 2006)
demonstraram que o estresse oxidativo induzido pelo treinamento físico aeróbico com
intensidade moderada, em camundongos LDL knockout, aumenta a biodisponibilidade
de NO, além de melhorar a atividade das defesas antioxidantes. No mesmo sentido,
Irigoyen et al. (2005), sugerem que o treinamento físico estaria associado com a
diminuição do estresse oxidativo.
Pedersen et al. (2006), mostraram que o treinamento físico é capaz de induzir
ações antiinflamatórias. Já, Tsukui et al. (2000), demonstram a importância do exercício
físico aeróbio com intensidade entre 40-50% do VO² máximo, na diminuição da
expressão do fator de necrose tumoral (TNFα) em mulheres japonesas com idade entre
41 a 69 anos. Enquanto Cardinot (2008), observou que o treinamento físico não foi
capaz de alterar as concentrações plasmáticas das citocinas TNFα e IL-6.
Mariotti (2009), utilizando ratas idosas, ovariectomizadas e submetidas ao
treinamento físico aeróbio, demonstrou redução na densidade de volume do colágeno
20
da túnica média na aorta destes animais. Enquanto, Heeren (2008), com o mesmo
protocolo, demonstrou que o treinamento físico aeróbio diminuiu o colesterol sérico,
melhorou o controle autonômico e hemodinâmico cardiovascular, além de aumentar a
concentração de nitrito, sugerindo melhora na biodisponibilidade de óxido nítrico.
21
RELEVÂNCIA DO TRABALHO
22
2. RELEVÂNCIA DO TRABALHO
Sabendo-se que a dislipidemia e a perda do estrogênio, são fatores de risco
importantes para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e que o treinamento
físico vem sendo considerado uma importante intervenção não farmacológica na
diminuição dos riscos das DCV’s, a importância deste trabalho está em caracterizar as
alterações histomorfológicas e imunohistoquímicas que ocorrem na aorta ascendente,
sob estes importantes fatores de risco, no intuito de ajudar na melhora da qualidade de
vida da mulher.
23
OBJETIVOS
24
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVOS GERAIS
Investigar os efeitos do treinamento físico na artéria aorta ascendente de
camundongos fêmeas ovariectomizadas selvagens e LDL knockout submetidas à
privação dos hormônios ovarianos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar os efeitos do treinamento físico na aorta ascendente em camundongos
fêmeas ovariectomizadas selvagens e LDL knockout nos seguintes parâmetros:
− Peso corporal;
− Capacidade física e registro da pressão arterial;
− Densidade numérica (Nv[n] ) e do volume dos núcleos ( Vv[n]) nas túnicas média
e íntima;
− Espessura da parede das túnicas média e íntima (µm);
− Área da luz arterial (µm) e Razão espessura/ luz;
− Volume nuclear médio (V);
− Densidade de volume das fibras colágenas (Vv[fc]);
25
− Número (Nv[lam]) e densidade de volume de lamelas (Vv[lam]);
− Produção da Angiotensina II (AII) e da Enzima conversora de angiotensina
(ECA), através da técnica de imunohistoquímica.
26
MATERIAIS E MÉTODOS
27
4. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade São Judas Tadeu (COEP-USJT) de acordo com o seguinte protocolo:
058/2007.
4.1. Animais e Grupos
Foram utilizados camundongos fêmeas geneticamente modificados, knockout do
receptor de lipoproteína de baixa densidade e para o grupo controle, foram utilizados
camundongos fêmeas selvagens (C57BL/6J).
Ambos os grupos com 9 meses de idade e peso inicial variando entre 20 e 30
gramas, provenientes do Biotério da Universidade São Judas Tadeu. Os camundongos
foram mantidos em gaiolas, em local com temperatura ambiente controlada entre 22 –
24ºC e com ciclo claro/escuro de 12/12 horas no Biotério da USJT. Todos os
camundongos foram alimentados com água e ração padrão “ad libitum”. Os animais
foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n=5 em cada grupo):
G1- Controle não-ovariectomizado sedentário (CS);
G2- Controle ovariectomizado sedentário (COS);
G3- Controle ovariectomizado treinado (COT);
28
G4- LDL knockout não ovariectomizado sedentário (LDL-S);
G5- LDL Knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS);
G6- LDL-Knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
4.2. Sequência Experimental:
Os grupos experimentais seguiram a sequência experimental ilustrada abaixo:
Figura 3. Seqüência experimental.
4.3. Ovariectomia
A ovariectomia foi realizada quando os animais completaram 9 meses de idade.
Os animais foram anestesiados com solução de ketamina e xylazina (120:20 mg/Kg im)
e foram colocados em decúbito dorsal para que se realizasse uma pequena incisão em
paralelo com a linha do corpo na pele e na musculatura no terço inferior na região
abdominal. Os ovários foram localizados e foi realizada a ligadura das tubas ou cornos
uterinos, incluindo os vasos sanguíneos. As tubas uterinas foram seccionadas e os
EUTANÁSIA
4 semanas
NASCIMENTO
OOFORECTOMIA
9 meses
1 semana
TESTE DE ESFORÇO INICIAL
TREINAMENTO FÍSICO
48h
ANÁLISE MORFOMÉTRICA E ESTEREOLÓGICA
29
ovários removidos. A musculatura e a pele foram suturadas (MARSH et al., 1999;
IRIGOYEN et al., 2005).
A confirmação da eficácia da ovariectomia foi determinada através da
observação da secreção vaginal realizada durante quatro dias consecutivos, sendo o
último dia de análise, a realização da eutanásia destes animais.
4.4. Teste de Esforço Máximo
O teste de esforço máximo foi realizado em todos os grupos no início e no final
do programa de treinamento físico. Este teste serve de base para prescrição do
treinamento físico para os grupos treinados bem como para evidenciar melhora na
capacidade aeróbia após o período de treinamento físico. O teste consiste em colocar o
animal correndo na esteira ergométrica a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo esta carga
incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até que o animal atingisse a exaustão. O
tempo de teste e a velocidade da última carga foram anotados e serviram para fazer a
média de capacidade aeróbia de cada grupo (DE ANGELIS et al., 2004).
30
Figura 4: treinamento de camundongos em esteira.
4.5. Treinamento Físico
O treinamento físico teve início após sete dias da cirurgia de ovariectomia, os
grupos treinados foram submetidos a um protocolo de treinamento físico em esteira
ergométrica com velocidade e carga progressiva (1 hora por dia / 5 dias por semana a
50 a 60% da velocidade máxima de esforço) durante 4 semanas conforme previamente
descrito (DE ANGELIS et al., 2004). Os animais foram adaptados na esteira por 10
minutos durante tres dias que antecederam o início do treinamento.
31
4.6. Registro da pressão arterial
Para que não houvesse interferência na avaliação dos resultados referentes aos
dados morfométricos e imuno-histoquimico, optamos por utilizar os dados referentes ao
registro de pressão arterial (PA), obtidas em trabalho com protocolo semelhante
(HEEREN, 2008), no qual avaliou aspectos hemodinâmicos e do estresse oxidativo do
treinamento físico aeróbio.
Conforme Heeren (2008), a aferição da pressão arterial foi feita através de
cânulas implantadas na altura da região cervical da veia jugular e artéria carótida. Este
procedimento foi realizado após o período de treinamento ou de acompanhamento, 48
horas antes da aferição da PA.
A cânula arterial foi conectada a um tubo de polietileno (PE-100) e este foi
conectado a um transdutor eletromagnético (Kent Instruments, USA) que, por sua vez,
foi conectado a um amplificador (General Purpose Amplifier, Stemtech, Inc., USA). A PA
em repouso foi registrada com animal acordado e com livre movimentação por 30
minutos, e o sinal analógico do pulso de pressão arterial foi convertido para digital
através de uma placa de conversão analógico digital de 10 bits (CODAS, Dataq
Instrumentes, USA) (De ANGELIS et al., 2004).
Com relação aos resultados da PA direta, foram demonstrado valores reduzidos
de pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial
32
média (PAM) nos grupos treinados (COT e LOT) quando comparado aos grupos
sedentários (COS e LOS). Vale ressaltar que no trabalho citado, o autor não trabalhou
com os grupos Controle Sedentário (CS) e LDL- Sedentário (LDL-S).
Para melhor visualização dos dados da pressão arterial, foi anexada tabela a seguir:
Tabela 1. Pressão arterial diastólica (PAD), sistólica (PAS) e média (PAM) e freqüência cardíaca nos grupos controle ovariectomizado sedentário (COS) e treinado (COT), LDL Knockout ovariectomizado sedentário (LOS) e treinado (LOT).
COS COT LOS LOT
PAD (mmHg) 114 ± 2,8 89 ± 3,4*† 106 ± 2,7 88 ± 2,5*†
PAS (mmHg) 140 ± 6 115 ± 2,1*† 143 ± 3 113 ± 3,3*†
PAM (mmHg) 127 ± 4 106 ± 2,5*† 125 ± 2,8 101 ± 2,7*†
Valores representam média ± EPM ao final do protocolo. *p< 0,05 vs. grupo LOS, † p< 0,05 vs. grupo COS; ¥ p< 0,05 vs. COT.
4.7. Preparação dos Tecidos da parede da aorta
Após aproximadamente 5 semanas do inicio do protocolo, os animais foram
sacrificados através da decapitação. Os corações foram evidenciados por meio de uma
33
toracotomia. A artéria aorta ascendente foi seccionada em sua raiz, situada na região
adjacente a base do coração. Em seguida as amostras foram lavadas em solução
salina fosfatada (PBS) a 0,1M e pH 7,4 e fixadas em solução de formol tamponado a
10% por 72 horas, desidratadas em séries crescentes de álcoois, diafanizadas em xilol,
incluídas em parafina, seccionadas em cortes transversais de 5 micrômetros de
espessura e coletados em lâminas de vidro para análise em microscopia de luz. As
secções foram coradas por:
-Hematoxilina-Eosina para análise da espessura da parede das túnicas média e
íntima, diâmetro da luz e a relação espessura/luz, densidade numérica e de volume de
núcleos e o volume nuclear médio;
-Verhoff-Van Gieson para verificar a densidade de volume e numérica das
lamelas;
- Picro-Sirius para verificação da densidade de volume de fibras colágenas.
4.8. Análise em Imunohistoquímica (IHQ)
A análise imunohistoquímica (IHQ) foi realizada nas seguintes etapas:
A. Preparação dos cortes, no qual os blocos com as aortas foram cortados com
espessura de 4 µm em micrótomo e aderidos em lâminas silanizadas,
permanecendo em estufa a 60ºC por 24 horas.
34
B. Desparafinização, que consiste na etapa anterior às reações de
imunohistoquímica, propriamente ditas, no qual as lâminas foram imersas em xilol
durante 10 minutos, por 3 vezes. A seguir, as lâminas foram mergulhadas em álcool
absoluto por 5 minutos (2 vezes) e, em seguida, em álcool 95% por 3 minutos (2
vezes). Posteriormente, as lâminas foram lavadas com água destilada por 2 vezes.
C. Nesta etapa foi utilizado o sistema A-B-C (Estreptoavidina – Biotina –
Peroxidase) para amplificação da reação. Como durante o processo de
parafinização pode ocorrer o “mascaramento” de antígenos no tecido dificultando
assim sua detecção, para aumentar a exposição antigênica (recuperação
antigênica), as lâminas foram imersas em tampão citrato, pH=6,0, a 90ºC em banho-
maria por 40 minutos, seguindo o resfriamento por 20 minutos. A seguir, foi feito o
bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 a 3% por 15 minutos. Os tecidos foram
incubados em câmara úmida, overnight, a 4ºC com anticorpos primários (Ac 1º),
diluídos em Albumina de Soro Bovino (BSA) a 2%.
Para a identificação da producão de Angiotensina II (Ang II) foi utilizado anticorpo
primário diluído em BSA (Bovine Sorum Albumin, Sigma®) do tipo policlonal de
coelho (Bachem®) com diluição 1:400 e para Enzima Conversora de Angiotensina I
(ACE goat polyclonal C-20; Santa Cruz Biotechnology, Inc.®) na diluição de 1:250. O
controle negativo foi realizado omitindo-se o anticorpo primário e colocando-se
35
somente o substrato (BSA, Bovine Sorum Albumin, Sigma®) no primeiro corte de
cada lâmina histológica.
A seguir, foram incubados com imunoglobulina biotinilada de cabra anticoelho
para A II e anticabra (Vector®, Burlingame, EUA) na diluição de 1:1000, ambos
durante 60 minutos. Em seguida, foi acrescentada a Estreptoavidina usando-se o kit
ABC Vecstain Elite (Vector®, Burlingame, EUA) durante 30 minutos.
A revelação da reação IHQ foi feita usando-se diaminobenzidina (DAB) como
cromógeno (Kit DAB Vector®). A contra-coloração foi feita com hematoxilina, seguida
pela montagem das lâminas com ClearmountTM (Zymed® Laboratories).
Os dados foram apresentados em escore de 0 a 4 para a marcação do tecido,
analisado em 8 pontos distintos da artéria.
4.9. Análise Morfométrica
A morfometria foi realizada utilizando um sistema digital de processamento de
imagens em computador do Laboratório de Análise Morfoquantitativa e
Imunohistoquímica da Universidade São Judas Tadeu. O sistema transmite as imagens
de um arquivo para o computador equipado com processador Pentium V e placa
digitalizadora. A análise foi realizada em imagens digitalizadas com o programa Axio
Vision, Zeiss, onde foram consideradas as chamadas “linhas proibidas”, ou seja,
36
estruturas que tocavam as linhas superior e lateral esquerda, não eram consideradas, e
as que tocavam nas linhas inferior e lateral direita eram contadas.
4.10. Análise Estereológica
A estereologia tem por objetivo a observação quantitativa de estruturas
tridimensionais. (GUNDERSEN, 1987), ou também podemos dizer que determina a
ocupação relativa das estruturas na área teste. Com esta análise, podemos quantificar
as principais modificações adaptativas normais e patológicas (PEREIRA et al., 1998)
das estruturas celulares.
As fotomicrografias dos cortes transversais da artéria aorta foram utilizadas para
determinação da fração ocupada pelos núcleos dos miócitos, pelas fibras colágenas e
as lamelas. Para as análises estereológica e morfométrica, foram capturadas imagens e
estas transferidas para o programa de análise de imagens.
Para as análises morfoquantitativas, foram utilizadas, em média 8 cortes por
animal.
- Densidade numérica (Nv[n] ) e de volume de núcleo ( Vv[n]) dos miócitos:
As imagens foram capturadas com objetiva de 40x com 10 campos fotografados por
animal. Para obtenção da densidade numérica foi feita a contagem do número de
núcleos, utilizando o sistema teste composto por linhas e pontos (MANDARIM-DE-
37
LACERDA, 2003). A densidade de volume tem por objetivo expressar a fração de
volume total de pontos de cada componente proposto. O número total de pontos
utilizados no sistema teste foi de 200 pontos (100%), sendo contados os pontos que
caíam sobre as fibras do corte. Os valores foram expressos em percentual, sendo
considerado 100% o número total de pontos, que neste caso foi 200, e o cálculo da
percentagem das fibras presentes foi feito a partir do número de pontos sobre os
mesmos.
- Volume nuclear médio (V):
O volume nuclear médio foi analisado com objetiva de 40x. Foi realizado o cálculo do
volume nuclear médio segundo a fórmula de Salvatore e Schreider, 1947, que foi
devidamente aplicada para posterior análise estatística. Segue a fórmula:
V= a² x b/1,91 onde V= volume nuclear, a = diâmetro menor do núcleo, b = diâmetro
maior do núcleo e 1,91 é uma constante utilizada.
38
Figura 5: Fotomicrografia de corte transversal da aorta mostrando técnica para medida dos volumes nucleares. Coloração Hematoxilina-eosina. Aumento: 40X.
- Espessura da parede das túnicas média e íntima (µm):
As imagens foram capturadas com aumento de 50x. A espessura das túnicas média e
íntima foi mensurada em quatro pontos ortogonais, a 0º, 90º, 180º e 270º (AGUILA,
2003), com tres medidas em cada ponto ortogonal, totalizando 12 medidas por corte.
- Área da luz arterial (µm):
As imagens foram capturadas com objetiva de 5x. A área da luz arterial foi mensurada à
partir do traçado da circunferência do lúmen arterial. A medida foi mensurada em
micrômetro.
- Razão espessura / luz (µm):
As imagens foram capturadas com objetiva de 5x. Para obtermos a razão espessura
/luz da aorta foi necessário acharmos o valor do diâmetro e a largura total da aorta.
Assim, para calcularmos o diâmetro da aorta, utilizamos a fórmula: diâmetro da aorta =
área da luz / π, sendo o π =3,1415. Para a largura total, como já havíamos calculado o
diâmetro da luz, utilizamos a fórmula: largura total da aorta = diâmetro da luz + 2 x
espessura da aorta. Assim chegamos a razão espessura/luz através da fórmula:
Razão espessura/luz = espessura / largura total/2.
39
Figura 6: Fotomicrografia da aorta de camundongo para visualização do lúmen e da túnica vascular. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aumento: 5X.
- Densidade de volume das fibras colágenas (Vv[fc]):
As imagens foram capturadas com objetiva de 40x. Para obtenção da densidade de
volume de fibras colágenas foi utilizado o sistema teste com 200 pontos, com valores
expressos em percentual.
- Número (Nv[lam]) e densidade de volume de lamelas (Vv[lam]):
O número de lamelas, que são os componentes elásticos das fibras elásticas, foi
mensurada em quatro pontos ortogonais, a 0º, 90º, 180º e 270º (AGUILA,2003),
contando o número de lamelas. Para obter a densidade de volume de lamelas, foram
Lúmen
Túnica vascular
40
capturadas imagens com objetiva de 40x e aplicado o sistema teste com 200 pontos,
com valores expressos em percentual.
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram apresentados como média e erro padrão da média. O teste
de análise de variância (ANOVA) one way, e post-hoc de Tukey foram devidamente
aplicados para análise dos dados. O nível de significância adotado em todos os testes
foi de p< 0,05.
41
RESULTADOS
42
6. RESULTADOS
6.1. Peso Corporal (g)
A seguir na Tabela 2 podemos observar a diferença entre o peso corporal inicial
e final, avaliados 1 semana após a ovariectomia e ao término do protocolo de
treinamento físico respectivamente. Todos os grupos apresentaram peso corporal
semelhantes. Para uma melhor visualização, a Figura 7 apresenta os resultados do
peso corporal nos 6 grupos.
Tabela 2: Peso inicial (PI), Peso Final (PF) e Diferença entre o peso corporal inicial e final (PF-PI) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
Grupos
Variável CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT
Peso Corporal Inicial
(PI) (g)
22,66
22,69 22,42 22,89 22,44 23,9
Peso Corporal Final
(PF)(g)
24,05
23,47 23,3 23,16 24,28 25,05
Diferença entre o PF e
PI (g)
1,4 ± 0,2
0,8 ± 0,7 0,9 ± 0,5 0,3 ± 0,1 1,8 ± 0,3 1,1 ± 0,2
_________________________________________________________________________________ Valores representam média ± EPM
43
Figura 7: Diferença entre o peso corporal inicial e final em gramas dos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
6.2. Teste de Esforço Máximo (km/h)
Na Tabela 3 e Figura 8 podemos observar a diferença entre o teste de esforço
máximo inicial, realizado uma semana após a ovariectomia, e o teste de esforço
máximo final, realizado ao término do protocolo de treinamento físico, e na mesma data
com os grupos não treinados. O grupo controle ovariectomizado sedentário (COS)
apresentou menor diferença entre os testes de esforço máximo quando comparado aos
gra
mas
0
0,5
1
1,5
2
2,5
C S C O S C O T L D L - S L D L - O S L D L - O T
gra
mas
0
0,5
1
1,5
2
2,5
C S C O S C O T L D L - S L D L - O S L D L - O T
44
grupos controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL
knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). Somado a isso, o grupo controle
sedenário (CS) também apresentou menor diferença entre os testes de esforço máximo
quando comparado ao grupo LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
Sumarizando, o grupo controle ovariectomizado sedentário (COS) obteve o pior
resultado com relação a capacidade física no teste de esforço final, enquanto somente
os grupos controle ovariectomizado treinado (COT) e LDL knockout ovariectomizado
treinado (LDL-OT), que realizaram o protocolo de treinamento físico, melhoram sua
capacidade física, como seria esperado.
Tabela 3: Resultado do Teste de Esforço inicial (TI), Teste de Esforço final (TF), e a diferença entre o teste de esforço máximo inicial e final (TF-TI) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
Grupos
Variável CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT
TI (km/h)
12,84
17,13 17,23 15,18
16,64 18,57
TF (km/h)
11,11
12,82 18,6 15,71
16,14 21,56
TF - TI (km/h)
-1,7 ± 0,5
-4,3 ± 0,6
1,4 ± 1
†
0,5 ± 1,5
†
-0,5 ± 1,1 2,9 ± 0,3
* †
__________________________________________________________________________
Valores representam média ± EPM. * p< 0,05 vs. CS; † p< 0,05 vs. COS.
45
Figura 8: Diferença entre o teste de esforço máximo inicial e final (km/h) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). * p< 0,05 vs. CS; † p< 0,05 vs. COS.
6.3. Análises Estereológica, Morfoquantitativa e Imunohistoquímicas
6.3.1. Avaliação de Núcleo dos miócitos
km/h
*† †
†
CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
km/h
*† †
†
CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
46
6.3.1.1. Densidade Numérica de Núcleo dos miócitos (Nn[n]) por área
Os grupos Controle (CS, COS, COT) e LDL (LDL-S. LDL-OS, LDL-OT) não
apresentaram diferença significante entre os animais do próprio grupo. Observamos
aumento significante de 29% na densidade numérica de núcleo no grupo LDL-S quando
comparado com o grupo COS. Já os grupos LDL-S, LDL-OS e LDL-OT também
apresentaram aumento significante na densidade numérica de núcleo de 60%, 56% e
52% respectivamente, quando comparados com o grupo COT. (Tabela 4 e Figura 9).
Figura 9: Densidade numérica de núcleo (Nv[n]) de miócitos por área, nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). † p< 0,05 vs. LDL-S *p< 0,05 vs LDL-S, LDL-OS e LDL-OT
47
6.3.1.2. Densidade de Volume de Núcleo de miócitos (Vv[n]) (%)
Os animais dos grupos COT e LDL-OT apresentaram uma perda significante de
29% e 23%, respectivamente, na densidade de volume de núcleo quando comparado
ao grupo CS. O grupo LDL-S obtive um aumento significante na densidade de volume
de núcleo quando comparado com os grupos COS (23%) e COT (26%). Quando
comparado o grupo LDL-S com os demais grupos LDL (LDL-OS e LDL-OT) estes
apresentaram uma diminuição de 19% e 30%, respectivamente. Não foi observada
diferença significante entre os grupos controle CS e COS e entre os grupos COS e
COT. Entre os grupos LDL não foi encontrada diferença significante entre os grupos
LDL-OS e LDL-OT (Tabela 4; Figura 10).
Figura 10: Densidade de volume de núcleo (Vv[n]) de miócitos nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado LDL-OT). *p< 0,05 vs. COT e LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-S; ¥ p< 0,05 vs. LDL-S; τ p< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT.
48
6.3.1.3. Volume Nuclear Médio (V)
Na Tabela 4 e Figura 11, podemos observar que o grupo LDL ovariectomizado
treinado (LDL-OT) apresentou diminuição significante de 70% no volume nuclear médio
quando comparado ao grupo COT. Os outros grupos não apresentaram diferença
significante.
Figura 11: Volume nuclear médio (V) dos miócitos, nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). *p< 0,05 vs. LDL-OT
Para melhor visualização dos dados, agrupamos os dados da densidade
numérica de núcleo (Nv[n]), densidade de volume de núcleo (Vv[n]), e o volume
nuclear médio (V) na tabela abaixo:
49
Tabela 4: Densidade numérica (Nv[n]), de volume (Vv[n]) e volume nuclear médio (V) da aorta nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado. Grupos CS COS COT LDL-S LDL-OS
LDL-OT
Nv[n]/área 33 ± 1,1 31 ± 1† 25 ± 1* 40 ± 1,1 39 ± 1,2 38 ±
1
Vv[n] (%) 4,8 ± 1,3* 4,3 ± 1,2# 3,9 ± 1,2¥ 5,3 ± 1,5# 4,3 ± 1,5
3,7±1,2 V 26 ± 4,1 29 ± 3 40 ± 4,6* 22 ± 4 26 ± 7
12 ± 2
Valores representam a média ± EPM. Nv[n] † p< 0,05 vs. LDL-S *p< 0,05 vs LDL-S, LDL-OS e LDL-OT Vv[n] *p< 0,05 vs. COT e LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-S; ¥ p< 0,05 vs. LDL-S; # p< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT 6.3.2. Avaliação das Túnicas Média e Íntima (µm)
6.3.2.1. Espessura da Parede das Túnicas Média e Íntima (µm)
Os grupos Controle (CS, COS e COT) não apresentaram diferença significante entre si.
Já o grupo LDL-OT apresentou aumento significante quando comparado aos grupos CS
(37%), COT (29%) e LDL-S (29%). Não foi encontrada diferença significante entre os
grupos LDL-S e LSL-OS (tabela 5 e figura 12). Os dados podem ser observados
através da Tabela 5 e Figura 13.
50
Figura 12: Espessura das túnicas média e íntima (µm) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). *p< 0,05 vs. LDL-OT; † p< 0,05 vs. LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-OT; 6.3.2.2. Área da Luz arterial (µm)
Dados da área de luz da aorta foram semelhantes aos encontrados na medida
da espessura da aorta. O grupo LDL-OT apresentou aumento significante entre os
grupos CS (25%), COT (27%), LDL-S (30%) e LDL-OS (28%). Não foi encontrado
diferença significante entre os grupos Controle (CS, COS e COT), e entre os grupos
LDL-S e LDL-OS.
51
Figura 13: Área da luz arterial (µm) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). * p< 0,05 vs. LDL-OT; ¥ p< 0,05 vs. LDL-OT; ‡ p< 0,05 vs. LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-OT. 6.3.2.3. Razão espessura / luz da aorta (µm)
Não foram observadas diferenças significantes na razão espessura / luz da aorta
entre os grupos estudados (Tabela 5 e figura 14).
52
Figura 14: Razão espessura/luz da aorta (µm) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).Os valores não apresentaram diferença significante entre os grupos.
No intuito de facilitar a compreensão dos dados, agrupamos em uma mesma
tabela a espessura das túnicas média e íntima, área da luz arterial e a razão
espessura/luz.
Tabela 5: Espessura das túnicas média e íntima (µm), área da luz (µm) e razão espessura/luz (µm) da aorta nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT)
Grupos CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT Espessura 138 ± 6,5* 162 ± 6,2 147 ± 3,1† 146 ± 8,5 # 161 ± 8,2 189 ± 8,6
Área da luz 6951 ± 321* 7490 ± 385 6865 ± 165† 6696 ± 484¥ 6814 ± 270# 8692 ± 319 Espessura/Luz 0,11±0,02 0,12±0,01 0,12±0,0 0,12±0,02 0,13 ± 0,02 0,12 ± 0,01 Valores representam média ± EPM. Espessura. * p< 0,05 vs CLDL-OT; † p< 0,05 vs LDL-OT; # p< 0,05 vs LDL-OT. Área da Luz. * p< 0,05 vs LDL-OT; ‡ p< 0,05 vs LDL-OT.; ¥ p< 0,05 vs LDL-OT; #p< 0,05 vs LDL-OT. Razão espessura/luz. Os valores não apresentaram diferença significante entre os grupos.
53
6.3.3. Análise dos componentes da Matriz extracelular
6.3.3.1. Densidade de Volume de Fibras Colágenas (%) (Vv[fc])
Os animais dos grupos COS (25%) e LDL-S (32%) apresentaram aumento
significante de 25% e 32%, respectivamente, com relacao ao grupo CS, na densidade
de volume de fibras colágenas e o grupo LDL-OT mostrou uma diminuição 71%,
quando comparados com CS. Os grupos COT e LDL-OT mostraram uma diminuição
significante de 20% e 77%, respectivamente, quando comparados com o grupo COS. O
grupo LDL-S demonstrou aumento significante de 32% na densidade de volume de
fibras colágenas, enquanto o grupo LDL-OT apresentou diminuição significante de 71%
quando ambos foram comparados com o grupo COT. Os animais do grupo LDL-OS
mostrou menor densidade de volume de fibras colágenas (13%) quando comparado
com o grupo LDL-S, considerado significante. O grupo LDL-OT apresentou diminuição
significante quando comparado com os grupos LDL-S (36%) e LDL-OS (75%). (Tabela
6 e Figura 15).
54
Figura 15: Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc])(%) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). * p< 0,05 vs. COS;LDL-S e LDL-OT; † p< 0,05 vs. COT e LDL-OT; ‡ p< 0,05 vs. LDL-S e LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT; ¥ p< 0,05 vs. LDL-OT.
6.3.3.2. Densidade Numérica de Lamelas (Nn[lam])
Não houve diferença significante na densidade numérica de lamelas entre os
grupos CS e COS quando comparados com o grupo COT. O grupo COS apresentou
aumento significativo de 4% quando comparado com o grupo CS e o grupo LDL-OT
diminuiu significantemente (4%) quando comparado com o grupo COS. Não houve
diferença significante entre o grupo COT e os grupos LDL (LDL-S, LDL-OS E LDL-OT) e
estes entre si.( Tabela 6 e Figura 16)
55
Figura 16: Densidade numérica de lamelas (Nv[lam]) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). * p< 0,05 vs. COS; † p< 0,05 vs. LDL-OT. 6.3.3.3. Densidade de Volume de Lamelas (Vv[lam]) (%)
Os grupos COS e COT não apresentaram diferença quando comparado com o
grupo CS. Os grupos LDL-OS e LDL-OT apresentaram diminuição significativa de 16%
na densidade de volume de lamelas quando comparado com o grupo CS. O grupo COT
apresentou aumento significante de 18% quando comparado com o grupo COS. Os
animais dos grupos LDL-OS e LDL-OT mostraram uma diminuição de 20% quando
56
comparados com o grupo COT. Os animais do grupo LDL (LDL-S, LDL-OS e LDL-OT)
não apresentaram diferença significante entre si (Tabela 6 e Figura17).
Figura 17: Densidade de volume de lamelas (Vv[lam])(%) nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). ‡p< 0,05 vs.LDL-OS e LDL-OT; # p< 0,05 vs. COT; τp< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT.
Os resultados da densidade de fibras colágenas, densidade numérica de lamelas
e densidade de volume de lamelas, foram agrupados na tabela 6, para melhor
visualização.
57
Tabela 6: Densidade de volume de fibras colágenas Vv[fc], Densidade numérica (Nv[lam]) e de volume (Vv[lam]) de lamelas da aorta nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado. Grupos CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT Vv[fc] % 2,8 ± 0,1* 3,5 ± 01† 2,8 ± 0,1‡ 3,7 ± 0,1# 3,2 ± 0,1 # 0,8 ± 0,1
Nv[lam]/área 6,9 ± 0,1* 7,2 ± 0,1 † 7 ± 0,1 7,1 ± 0,2 7,1 ± 0,1 6,9 ± 0,1
Vv[lam] 19 ± 0,5* 17 ± 0,3† 20 ± 0,3‡ 18 ± 0,6‡ 16 ± 0,4 ‡ 16 ± 0,6 ___________________________________________________________________________________________
Valores representam média ± EPM. Vv[fc] * p< 0,05 vs. COS, LDL-S E LDL-OT; † p< 0,05 vs. COT e LDL-OT; ‡ p< 0,05 vs.LDL-S e LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT; # p< 0,05 vs. LDL-OT. Nv[lam] * p< 0,05 vs. COS; † p< 0,05 vs. LDL-0T. Vv[lam] * p< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT; † p< 0,05 vs. COT; ‡ p< 0,05 vs. LDL-OS e LDL-OT.
6.3.4. Análise Imunohistoquímica dos componentes do SRA (AII e ECA I) em IHQ
A expressão da A II e da ECA I estão apresentados na tabela7, Figura 18.
Os resultados obtidos com relação a AII, mostram que todos os grupos apresentam
aumento da AII com relação ao CS. os grupos COT e LDL-OS apresentaram aumento
significante (130% e 94% respectivamente) na produção de AII, quando comparado ao
grupo CS.
Também observamos uma diminuição desta variável no grupo LDL-OT, não
atingindo portanto, os valores do grupo CS.
Com relação aos resultados da ECA I, verificamos um aumento na produção de
68% no grupo COS, e de 56% no grupo COT, quando comparamos com o grupo CS. Já
no grupo COT, verificamos um aumento de 56% em comparação ao grupo CS, e uma
58
diminuição de 8% na produção da ECA I na comparação entre os grupos COS e COT.
Além disso, obtivemos a maior expressão da ECA I no grupo LDL-OT.
Tabela 7: Score da expressão de Angiotensina II e ECA nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). O grupo COS no marcador Angiotensina II está zerado devido à perda do material na realização da técnica. Grupos CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT
Angiotensina II 1,25 ± 0,37 ---- 2,88 ± 0 2,43 ± 0,17 3,13 ± 0,21 1,74 ± 0,26
ECA 1,44 ± 0,19 2,42 ± 0,15 2,25 ± 0 1,74 ± 0,27 2,82 ± 0,36 3,13 ± 0,2
Valores representam média ± EPM
Figura 18: Expressão de AII e ECA I, em técnica de imunohistoquímica, nos grupos controle sedentário (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT), LDL knockout sedentário (LDL-S), LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDL-OS), LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
C S C O S C O T L D L - S L D L - O S L D L - O T
Angiotensina II
ECA
59
DISCUSSÃO
60
7. DISCUSSÃO
A dislipidemia tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento da
placa aterosclerótica (GIANNINI, 1998), com consequente aumento do risco de doenças
cardiovasculares. Neste sentido, a utilização de animais knockout do receptor de LDL
em pesquisas, tem sido de grande importância para o melhor entendimento do
metabolismo dos lipídeos, no intuito de ajudar a minimizar os efeitos desta disfunção
metabólica.
Com o evento da menopausa, ocorre o aumento da prevalência de lipoproteínas
de baixa densidade sanguíneo, com posterior diminuição da lipoproteína de alta
densidade, com consequente dano na função endotelial nos vasos sanguíneos.
Estudos realizados por Szilvassy et al., 2001, em coelhos hipercolesterolêmicos,
demonstraram diminuição do óxido nítrico no endotélio vascular, induzindo um quadro
de hipertensão.
Com relação ao treinamento físico, este vem sendo apontado como uma
importante ferramenta não-farmacológica na diminuição dos riscos de doenças
cardiovasculares, promovendo importantes respostas metabólicas e hemodinâmicas
(ALMEIDA & ARAÚJO, 2003; MONTEIRO & SOBRAL, 2004), capazes de reverter
prejuízos ocasionados por diversos fatores de risco, inclusive a menopausa, idade e
dislipidemias.
61
Nesse sentido, nossos resultados demonstraram que o treinamento físico foi
eficaz em melhorar a capacidade física nos grupos treinados, sugere que o treinamento
físico promoveu uma leve diminuição da espessura das túnicas média e íntima arterial,
porém significativa, além da diminuição da densidade de fibras colágenas e o aumento
da densidade de volume de fibras elásticas no grupo que apresentava a privação do
estrogênio com níveis normais de colesterol, podendo sugerir uma possível diminuição
da rigidez da parede arterial.
Quando analisamos o grupo que apresentava a privação do hormônio estrogênio
e a dislipidemia, verificamos que o treinamento físico, poderia estar sendo prejudicial
devido a diminuição excessiva da densidade de volume de fibras colágenas, aumento
da área da luz arterial e maior produção da ECA I, provavelmente, por afetar a
propriedade de extensibilidade da artéria aorta.
7.1. Peso corporal
Após as 5 semanas de experimento não foi observado diferença significativa do
peso corporal nos grupos estudados. Este dado corrobora com trabalho ainda não
publicado de Heeren (2008), com o mesmo protocolo desta dissertação. Em contra-
partida, Mariotti (2009), com ratos wistar por 12 semanas de treinamento aeróbio em
esteira, demonstrou aumento do peso corporal nos grupos ovariectomizados treinados
e sedentários.
62
7.2. Capacidade física
Conforme esperado, após 5 semanas de treinamento físico em esteira, os grupos
treinados obtiveram melhora em sua capacidade física, confirmada por uma maior
velocidade máxima atingida no teste de esforço máximo.
Paralelo a isto, o grupo controle ovariectomizado sedentário (COS), obteve o pior
desempenho no teste de esforço final, confirmando a hipótese de Mercuro e
colaboradores (2006) que sugerem uma correlação direta entre a diminuição do
hormônio estrogênio e a capacidade aeróbia em mulheres pós-menopausadas.
Estes resultados sugerem que o nosso protocolo de treinamento físico foi eficaz
em melhorar a capacidade física em camundongos fêmeas com privação de hormônio
estrogênio e dislipidemia.
7.3. Análise do núcleo dos miócitos (densidade numérica de núcleo (Vn[n]) e
densidade de volume de núcleo (Vv[n])(%) e volume nuclear médio (V))
Observamos que a densidade numérica de núcleo nos animais controle (CS,
COS e COT) foi significantemente menor quando comparada aos animais LDL-
knockout (LDL-S, LDL-OS e LDL-OT), sugerindo que a ovariectomia não foi fator
preponderante em relação a esta variável. Marques e colaboradores (2006), com ratos
63
SHR idosos com duração de 13 semanas de ovariectomia, demonstrou que este
parâmetro sofreu alteração, diferentemente dos dados encontrados em nosso estudo,
provavelmente pelo tempo que nossos animais passaram com a privação dos
hormônios ovarianos (5 semanas).
Já nos animais do grupo COT, não verificamos alterações na densidade
numérica de núcleo por área e no volume nuclear, porém, encontramos uma diminuição
da densidade de volume dos núcleos neste grupo. Estes dados poderiam estar
associados ao processo de degeneração celular e rearranjo dos componentes
celulares.
Em contra-partida, quando adicionamos a dislipidemia, como fator de risco, os
animais do grupo LDL- knockout (LDL-S) apresentaram valores de densidade numérica
de núcleo maiores quando comparados ao grupo (COS), sugerindo possível
proliferação de células musculares lisas. Neste sentido, Celermajer e colaboradores
(1994), acrescentam que fatores de risco cardiovasculares provocam redução de NO,
com consequente remodelação do vaso. Robert (1999) cita maior suscetibilidade dos
vasos ao desenvolvimento de placas de ateroma, devido ao acúmulo de células
endoteliais e depósito de substâncias na matriz na região íntima dos vasos.
O resultado encontrado na densidade de volume de núcleo no grupo LDL-OT,
que apresentou diminuição significante, adicionado a diminuição acentuada do volume
nuclear médio, sem alteração do volume numérico de núcleo entre os grupos LDL-
64
knockout, sugerem uma possível adaptação na forma da célula muscular lisa,
provavelmente ocasionada pela dilatação do vaso, e uma possível perda da
extensibilidade vascular como consêquencia do treinamento físico, neste grupo que
apresenta a dislipidemia e a privação do hormônio estrogênio como fatores de risco
coronariano.
7.4. Análise das túnicas média e íntima arterial (espessura das túnicas média e
íntima (µm), área da luz (µm) e razão espessura/luz)
Quando analisamos os resultados referentes a espessura das túnicas média e
íntima, observamos aumento significativo no grupo LDL knockout ovariectomizado
treinado (LDL-OT) com relação ao grupo CS. Neste parâmetro, observamos que o
treinamento físico não modificou a espessura do vaso no grupo COT, enquanto
obtivemos um aumento na espessura das túnicas no grupo LDL-OT.
Esta alteração da espessura da parede arterial, segundo Lakata (2003), sugere
proliferação de células musculares lisas, aumento da matriz intercelular, aumento do
tecido colágeno e fragmentação das fibras elásticas. Safar & Frohlich (1995), associam
o aumento da espessura da parede arterial com alterações funcionais e morfológicas
com aumento de células musculares e da matriz extracelular em hipertensos. Pereira e
colaboradores (1998), também observaram em hipertensos, aumento da espessura da
65
túnica média dos vasos intramiocárdicos, devido a infiltrado inflamatório e fibrose
cicatricial, por consequência da necrose de miócitos nestas áreas associado às lesões
isquêmicas.
Já com relação a razão espessura/luz, não observamos diferença significativa
entre os grupos. Estes dados corroboram com Matsuda e colaboradores (1989), que
também não observou diferença com relação a este parâmetro em aorta de ratos
treinados e sedentários, além de Marques et al. (2006) em estudo com ratas
hipertensas ovariectomizadas e treinadas.
Com relação a área da luz arterial, observamos que o grupo LDL knockout
ovariectomizado treinado (LDL-OT) apresentou a maior área da luz com relação a todos
os outros grupos, que segundo Hayashi e colaboradores (2005) este aumento da área
arterial poderia estar relacionado com a redução do enrijecimento da parede arterial. Já
Huonker e colaboradores (2003) dizem que este aumento do diâmetro do vaso está
relacionado com as alterações metabólicas induzidas pelo treinamento físico aeróbio,
especificamente, o aumento da demanda para a musculatura esquelética. Porém,
quando analisamos este dado com a densidade de volume de fibras colágenas,
verificamos que a possível explicação para o aumento da área da luz no grupo LDL-OT,
poderia estar relacionado com a perda excessiva da densidade de volume de fibras
colágenas, a qual confere limite à extensibilidade dos grandes vasos (CATTELL et al.,
1996), prejudicando as propriedades mecânicas deste vaso, tornando-os incapazes de
66
promoverem a extensibilidade do vaso. Mais uma vez, evidencia-se que, quando
unimos a diminuição do hormônio estrogênio com a dislipidemia, o treinamento físico foi
prejudicial para a artéria aorta.
7.5. Análise dos componentes da matriz extracelular (Densidade de volume de
fibras colágenas (Vv[fc]), Densidade numérica (Nn[lam], e de Volume de lamelas
(Vv[lam]))
As fibras colágenas e as lamelas são os principais constituintes da matriz
extracelular dos vasos sanguíneos, onde as fibras elásticas conferem elasticidade, e
consequentemente, a complacência, e o colágeno está relacionado com a rigidez da
parede arterial (MATSUDA et al., 1993; JACOB, 2003), e conferindo limite à
extensibilidade dos grandes vasos (CATTELL et al., 1996).
A relação entre estas fibras estabelece um equilíbrio nas propriedades
mecânicas dos vasos, e alterações nestes constituintes, podem ocasionar doenças em
todo sistema vascular, inclusive na artéria aorta (MATSUDA et al., 1993; SILVER et al.,
2001).
Aguila e colaboradores (2003) acrescentam que qualquer alteração na
quantidade ou qualidade nos componentes da matriz extracelular, podem afetar
diretamente a artéria aorta. As células musculares lisas, endoteliais, fibroblastos e o
67
colágeno, têm função de resistir às alterações decorrentes de patologias ou lesões
celulares. Porém, dependendo do estímulo, as fibras colágenas são importantes
moduladores, podendo se acumular nos tecidos (WEBER, 1997; LORELL &
CARABELLO, 2000).
Mereau et al. (2006), demonstraram que o exercício físico melhora a
complacência das grandes artérias em mulheres pós-menopausadas, além de melhorar
a composição corporal com a diminuição do tecido adiposo, reduzir o LDL colesterol e
aumentar o HDL colesterol. Corroborando com Mereau et al. (2006), Lima (2005),
acrescenta que o treinamento físico, é capaz de aumentar a biodisponibilidade de NO,
preservando a função endotelial.
Com relação às fibras colágenas, nosso trabalho mostrou que tanto a redução
dos níveis de estrogênio quanto a dislipidemia, favorecem o aumento das fibras
colágenas, e que o exercício físico foi capaz de reduzir a densidade de volume de fibras
colágenas a níveis encontrados no grupo Controle (CS). Neste contexto, nossos
achados corroboram com Jonason, et al. (1998) e Kallikazaros et al. (2002), no qual
estes autores relacionam a diminuição do hormônio estrogênio com o enrijecimento
arterial. Desta forma, podemos sugerir que o treinamento físico colaborou para a
redução do enrijecimento do vaso no grupo que apresentava privação do estrogênio
com níveis de colesterol normal.
Porém, quando observamos o grupo LDL knockout treinado (LDL-OT)
68
verificamos uma redução significativa na densidade de volume das fibras colágenas,
podendo sugerir que ao associarmos a diminuição do estrogênio e a dislipidemia, o
treinamento físico poderia ser prejudicial para a propriedade de extensibilidade da
artéria aorta. Neste sentido, seriam necessários mais estudos quanto às propriedades
mecânico-funcionais, para melhor compreensão deste resultado. Porém, poderíamos
sugerir que a pressão de cisalhamento estimulada pelo exercício, seria prejudicial,
quando temos uma estrutura arterial fragilizada pela diminuição do hormônio estrogênio
e a dislipidemia, ou seja, com as propriedades mecânicas deste vaso já danificadas, o
treinamento físico, exercendo pressão sobre a parede deste vaso, causaria mais danos
ao mesmo.
Quanto a densidade numérica de lamelas, o grupo controle ovariectomizado
sedentário (COS) apresentou aumento pequeno, porém significante, em relação ao
grupo controle sedentário (CS) e diminuição, também pequena porém significante, no
grupo LDL knockout ovariectomizado treinado (LDL-OT). Resultado diferente foi
encontrado por Park e colaboradores (2008) estudando ratas ovariectomizadas com
dieta acrescida de vitamina D3, no qual não observaram alterações da elastina na
parede arterial.
Com relação a densidade de volume das lamelas, encontramos que o grupo
controle ovariectomizado treinado (COT) apresentou maior densidade de volume de
lamelas com relação ao grupo COS, sugerindo que o treinamento físico poderia ser
69
eficaz em melhorar fatores relacionados a complacência da aorta, com possível
redução da rigidez arterial, mesmo com privação do hormônio ovariano. Porém no
grupo LDL-OT, o treinamento físico não foi capaz de reverter o percentual de volume de
lamelas ocasionados pela diminuição do estrogênio e a dislipidemia.
7.6. Análise dos componentes do SRA (AII e ECA I)
Quando analisamos os valores de angiotensina II (AII) sobre o processo
inflamatório, verificamos que todos os grupos apresentaram valores superiores ao
grupo controle (CS). Isto nos leva a sugerir que a ovariectomia e a dislipidemia
influenciaram neste resultado. No mesmo sentido, ambos os grupos exercitados
diminuíram a produção da AII. Vale ressaltar que o grupo com ambos os fatores de
risco (LDL-OT) foi o que apresentou a diminuição mais acentuada da produção desta
variável. Juntamente, com isto, verificamos que os valores de PA também
apresentaram redução, tanto na sistólica quanto na diastólica nos grupos treinados.
Enquanto, pesquisa de Staessen e colaboradores (1998), demonstraram que a
diminuição dos hormônios ovarianos, poderiam ser responsáveis pelo aumento da
pressão arterial (PA) em mulheres pós-menopausadas.
Nesse sentido, Brum e colaboradores (2004) verificaram que o treinamento físico
promove o aumento da biodisponibilidade de NO. Já Smith e colaboradores (1999),
70
demonstraram que o treinamento físico seria capaz de reduzir citocinas inflamatórias e
níveis de PCR. Pedersen e colaboradores (2006), concluíram que o treinamento físico é
capaz de induzir ações antiinflamatórias.
Desta forma, podemos sugerir que houve uma diminuição da ativação do
sistema renina angiotensina nos grupos treinados. Já, com relação a enzima
conversora de angiontensina I (ECA I), também apresentou níveis elevados em todos
os grupos com relação ao grupo controle, porém com relação a esta variável, os
resultados sugerem maior influência da ovariectomia do que da dislipidemia.
Corrroborando com este dado, estudo de Gallagher e colaboradores (1999),
demonstraram que a presença do hormônio estrogênio diminuiu a expressão da ECA
em diversos tecidos, inclusive na aorta de ratas.
No entanto, quando treinamos os animais, o grupo que apresentava somente a
ovariectomia, apresentou diminuição da produção da ECA I, enquanto o grupo que
apresentava a dislipidemia agregada a ovariectomia, apresentou aumento do mesmo.
Desta forma, podemos sugerir que o aumento da produção da ECA I, juntamente com a
perda excessiva de colágeno, além da área da luz aumentada no grupo com privação
do hormônio ovariano e a dislipidemia, reforça a hipótese que o treinamento físico
poderia estar sendo prejudicial para a estrutura vascular.
71
CONCLUSÃO
72
8. CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos no presente estudo sob os efeitos do
treinamento físico na aorta ascendente em camundongos fêmeas ovariectomizadas
selvagens e LDL knockout podemos concluir que nosso protocolo de treinamento fisico
não influenciou no peso corporal dos animais, porém foi eficaz em melhorar a
capacidade física nos grupos que foram submetidos ao protocolo de exercício.
Quando analisamos a densidade numérica de núcleo dos miócitos, verificamos
que os animais tanto dos grupos controle como dos grupos LDL não apresentaram
diferença entre si. Observamos aumento de 55% na densidade numérica de núcleo nos
grupos LDL quando comparados ao grupo Controle, sugerindo uma possível
proliferação de células musculares lisas e adaptação na forma da célula muscular lisa,
provavelmente ocasionada pela dilatação do vaso.
Na avaliação das túnicas média e íntima, observamos que o treinamento físico
não modificou a espessura do vaso no grupo COT, enquanto obtivemos um aumento na
espessura das túnicas no grupo LDL-OT, sugerindo alteração funcional e morfológica
com aumento de células musculares e da matriz extracelular. A razão espessura/luz da
aorta, não apresentou diferença significativa entre os grupos. E por fim, a área da luz
arterial aumentou no grupo LDL-OT com relação a todos os outros grupos sugerindo
perda na propriedade de extensibilidade.
73
Podemos sugerir que o treinamento físico colaborou para a redução do
enrijecimento do vaso no grupo que apresentava privação do estrogênio com níveis de
colesterol normal, porém, quando observamos o grupo LDL knockout treinado (LDL-OT)
verificamos uma redução significativa na densidade de volume das fibras colágenas,
além de uma pequena diminuição na densidade numérica de lamelas, sem portanto
alterar a densidade de volume de fibras elásticas, podendo sugerir que ao associarmos
a diminuição do estrogênio e a dislipidemia, o treinamento físico poderia ser prejudicial
para a propriedade de extensibilidade da artéria aorta.
Com relação à densidade de volume das lamelas no grupo COT, encontramos
maior densidade de volume de lamelas com relação ao grupo COS, sugerindo que o
treinamento físico poderia ser eficaz em melhorar fatores relacionados a complacência
da aorta, com possível redução da rigidez arterial.
Quando analisamos os componentes do sistema renina angiotensina,
concluímos que os grupos exercitados diminuíram a produção da AII, juntamente com
os e os valores de PA, sugerindo aumento da biodisponibilidade de NO e possível
redução de citocinas inflamatórias. Já, com relação a ECA I, obtivemos níveis elevados
em todos os grupos com relação ao grupo controle, porém, no grupo treinado
ovarectomizado e dislipidemico, foi encontrado o nível mais elevado da ECA I.
Com isto, podemos sugerir que o aumento da produção da ECA I, com a perda
excessiva de colágeno, pequena diminuição na densidade numérica de lamelas,
74
aumento na espessura das túnicas e da luz arterial e valores superiores da densidade
numérica de núcleo, no grupo com privação do hormônio ovariano e a dislipidemia,
reforça a hipótese que o treinamento físico poderia estar sendo prejudicial para a
estrutura vascular no grupo com privação do hormônio ovariano e a dislipidemia.
Neste sentido, seriam necessários mais estudos quanto às propriedades
mecânico-funcionais, para melhor compreensão destes resultados, porém poderíamos
sugerir que a pressão de cisalhamento estimulada pelo exercício, seria prejudicial,
quando temos uma estrutura arterial fragilizada pela diminuição do hormônio estrogênio
e a dislipidemia, ou seja, com as propriedades mecânicas deste vaso já danificadas, o
treinamento físico, exercendo pressão sobre a parede deste vaso, causaria mais danos
ao mesmo.
75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
76
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGARWAL, A.; GUPTA, S.; SHARMA, R.K.. Role of oxidative stress in female
reproduction. Reproductive Biology and Endocrinology: 28, 2005.
AGUILA,M.B.; MANDARIM-DE-LACERDA, C.A.; APFEL, M.I.R.. Estereologia do
Miocardio de Ratos Jovens e Idosos. Arq. Bras. Cardiol., volume 60 (n.2) 105-109,
1998.
AGUILA, M.B.; MANDARIM-DE-LACERDA, C.A.. Aorta wall quantitative alterations due
to different long-term high-fat diet in rats. Food and chemical Toxicol. V.41, p.1391-
97, 2003.
ALEXANDER, R.W.; DZAU V.J. Vascular Biology: the past 50 years. Circulation.
102:112-116, 2000.
ALLEN, J.D.;COBB, F.R.; KRAUS, W.E.; GOW, A.J.. Total nitrogen oxide following
exercise testing reflects endethelial function and discriminates health status. Free
Radical Biology & Medicine.41, 740- 747, 2006.
ALMEIDA, P.J.; CABRAL, A.M.; VASQUEZ, E.C. O endotélio como modulador de
respostas vasomotoras. Arq. Bras.Cardiol. n.60:347-56, 1993.
ALMEIDA, M.B.; ARAÚJO, C.G.S. Efeitos do treinamento aeróbico sobre a frequência
cardíaca. Rev.Bras. Med. Esporte. Vol.9, p.104-12, 2003
ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S. Morte cellular por apoptose: uma visão bioquímica e
molecular. Metrocamp pesquisa. Vol.1, n.1, p.37-58, jan./jun.,2007.
ANDERSON, T.J. Assessment and treatment of endothelial dysfunction in humans. J.
Am. Coll. Cardiol. 34:631-638, 1999.
ASIKAINEN, T.M.; KUKKONEN, H.; MIILUNPALO, S. Exercise for health for early
postmenopausal women: a systematic review of randomised controlled trials.
Sports Med. 34:753-778, 2004.
BAILEY, F. R. Histologia. São Paulo: Edgard, 1973.
77
BATLOUNI, M.; RAMIRES, J. A. F. Importância do endotélio na doença arterial
coronária e na aterogênese. Arq. Bras. Cardiol. v.62, n.4, p.255-270, 1994.
BOGLIOLO, L.; BRASILEIRO FILHO, G. Bogliolo: Patologia Geral. 3.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara, 2004.
BOLAD, I.; DELAFONTAINE, P. Endothelial dysfunction: its role in hypertensive
coronary disease. Curr.Op.in Cardiol., 20:270-274, 2005.
BRUM, P.C.; FORJAZ, C.L.M.; TINUCCI, T.; NEGRÃO, C.E. Adaptações agudas e
crônicas do exercício físico no sistema cardiovascular. Rev.Paul.Educ.Física, SP,
vol.18, p.21-31, 2004.
CARDINOT, Themis Moura. Efeito do treinamento físico aeróbico na prevenção e
terapêutica da doenças aterosclerótica em modelo experimental de aterosclerose.
SP, 2008. Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
CATTEL, M.A.; ANDERSON, J.C.; HASLETON, P.S. Aged-related changes in amounts
and concentrations of collagen and elastin in normotensive human aorta. Clinica
Chimica Acta. Vol.245, n.1, p.73-84, 1996.
CELERMAJER, DS; SORENSON, KE.; BULL, C.; ROBINSON, J.. Endothelium-
dependent dilation in the systemic arteries of asymptomatic subjects relates to
coronary risk factors and their interaction. J.Am.Coll.Cardiol., 86:207-10, 1994.
CHAGAS, .C.P.; JARDIM, C.A.P. Tratamento da disfunção endotelial na insuficiência
cardíaca. Revista SOCESP, v.14, n.1, p.127-133, 2004.
COLACURCI, N.; CHIANTERA, A.; FORNARO, F.; DE NOVELLIS, V.; MANZELLA, D.;
ARCIELLO, A.; CHIANTERA, V.; IMPROTA,L.; PAOLISSO, G.. Effects of soy
isoflavones on endothelial function in healthy postmenopausal women.
Menopause. 12(3):299-307, 2005.
COLLINS, T; READ, M.A.; NEISH, A.S.; WHITLEY, M.Z.; THANOS, D.; MANIATIS, T.
Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-Kappa β and
cytokine-inducible enhancers. FASEB J, 899-909, 1995.
78
DE ANGELIS, K; SANTOS, M.S.B.; IRIGOYEN, M.C.. Sistema nervoso autônomo e
doença cardiovascular. Revista da Sociedade de Cardiologia do Rio Grande do
Sul, v.3, 2004.
DEBING, E.; PEETERS, E.; DUQUET, W.; POPPE, K.; VELKENIERS, B.; VAN DEN
BRANDE, P. Endogenous sex hormone levels in postmenopausal woman
undergoing carotid artery endarterectomy.European Journal of Endocrinology, 156
687-693, 2007.
DIETZ, R.; VON HARSDORF, R.; GROSS, M.; et al.. Angiotensin II and coronary artery
disease, congestive heart failure, and sudden cardiac death. Basic Res. Cardiol.
93(Suppl.2):101-8, 1998.
DZAU, V.J. Circulating versus local renin-angiotensin system in cardiovascular
homeostasis. Circulation. Vol.77(suppl I): 1-4-1-13; 1988.
FILIPPIN, L.I.; VERCELINO, R.; MARRONI, N.P.; XAVIER, R.M. Influência de
processos redox na resposta inflamatória da artrite reumática. Rev. Bras. de
Reumatol. v.48 n.1 São Paulo, 2008. Bases fisiológicas do exercício e do esporte.
6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
FUSTER, V.; MORENO, P.; FAYAD, Z., CORTI, R., BADIMON, J. Atherosthrombosis
and high-risk plaque. Part I: Evoluing concepts. J.Am.Coll.Cardiol. Vol.46, issue 6,
p.937-54, 2005.
GALLAGHER, P.E.; LI, P.; LENHART, J.R.; CHAPPELL, M.C.; BROSNIHAN, K.B..
Estrogen regulation of angiotensin converting enzyme mRNA. Hypertension. 33
(part.II):323-8, 1999.
GARDINER, S.M.; CONPTON, A.M., BENNETT, T.; PALMER, R.M.; MONCADA, S.
Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension.
Vol.15, 486-492, 1990.
GONÇALVES, G.; ZORNOFF, L.; RIBEIRO, H.; OKOSHI, M.; CORDARO, F.; OKASHI,
K.; PADOVANI, C.; ARAGON, F.; CICOGNA,A.. O bloqueio do sistema renina-
79
angiotensina atenua a remodelação cardíaca de ratos submetidos a estenose
aórtica. Arq. Bras. Cardiol. São Paulo, vol. 8, n.4, 2005.
GOLDBERG, A.C.; GLOTZ, D.; KALIL,J. Endotélio e Sistema Imune. Cap.6. In:
Endotélio e doenças Cardiovasculares. LUZ, P.L.; LAURINDO, F.; CHAGAS,
A.C.P. Ed. Atheneu, 2004.
GIANNINI, S.D. Aterosclerose/dislipidemias, clínica e terapêutica: fundamentos práticos.
B.G.Cultural. São Paulo, 1998.
GIMBRONE JR.; M. Vascular endothelium an integrator of pathophisiologic stimuli in
atherosclerosis. The American Journal of Cardiology. Vol.75, n.6, p.67B-70B.
GIULLUM, R.F..Index of tissue distribuition, apolipoproteins B and A1, lipoprotein, and
triglycerides concentration in children age 4-11 years: The Third National Health
and Nutrition Examination Survey. J.Clin.Epidemiology, 2000; I4:367-75.
GREWAL, J.; CHAN, S.; FROHLICH, J.; MANCINI, G.B.J.. Assessment of novel risk
factors in patients at low risk for cardiovascular events based on Framingham risk
stratification. Clin.Invest Med, 26(4):158-65, 2003.
GUNDERSEN, H.J.G.; JENSEN, E. B.. The efficiency of systematic sampling in
stereology an its prediction. Journal of Microscopy. Vol.147, p.229-63, parte 3,
1987.
HALL, D.B.; HOLMLIN, R.E.; BARTON, J.K. Oxidative DNA damage throught long-
range electron transfer. Nature.382-731-735, 1996.
HAYASHI, K.; SUGAWARA, J.; KMINE, H.; MAEDA, S.; YOKOI, T.. Effects of aerobic
exercise training on the stiffness of central and peripheral arteries in middle-aged
sedentary men. Japanese Journal of Physiology. Vol.55, n.4 p.235-39, 2005.
HEEREN, M.V. Efeitos do treinamento físico em parâmetros hemodinâmicos e no
estresse oxidativo em camundongos fêmeas LDL knockout submetidas à privação
dos hormônios ovarianos. DISSERTAÇÃO. Programa de pós graduação stricto
sensu em Educação Física, USJT, SP. 2008.
80
HUONKER, M.; SCHIMID, A.; SCHMEDT, A.; SCHMIDT-TRUCKSAB, GRATHWOHL,
D.; KEUL,J. Size and bloodflow of central and peripheral arteries in highly trained
able-bodied and desabled athletes. J.Appl.Physiol. Vol.95:685-691, 2003.
HWANG, S.J.; BALLANTYNE, C.M.; SHARRETT, A.R.. Circulating adhesion molecules
VCAM-1 ICAM-1, and E-selectin in carotid atherosclerosis and incident coronary
heart disease cases: the Atherosclerosis Risk in Communities study. Circulation
96:4219-25, 1997.
IRIGOYEN, M.C.; LACCHINI, S.; DE ANGELIS, K.; MICHELINI, L. Fisiopatologia da
hipertensão: o que avaçamos?. Rev.Soc. Cardiol.E.S.P. Vol.13, n.1, 2003.
IRIGOYEN, M.C.; DE ANGELIS, K.; FIORINO, P.; KRIEGER, E.M.. Sistema nervoso
simpático e hipertensão arterial: reflexos circulatórios. Revista Bras.Hipert,
vol.12,n.4,229-234, 2005.
IRIGOYEN, M.C.; PAULINI, J.; FLORES, L.J.F.; FLUES, K.; BERTAGNOLLI, M.;
MOREIRA, E.D.; CONSOLIM-COLOMBO, F.; BELLÓ-KLEIN, A.; DE ANGELIS, K.
Exercise Training Improves Baroreflex Sensitivity Associated With Oxidative Stress
Reduction in Ovariectomized Rats. J.Hypertension. 46:998-1003, 2005.
JACOB, M.H.V.M.. Estresse Oxidativo e Hipertrofia Cardíaca.2005 Disponível em
http://www.Guaiba.ulbra.tche.br/pesquisas/2005/artigos/biologia/10.pdf (acessado
em 10, junho, 2008).
JONASON, T.; HENRIKSEN, E.; KANGRO,T.; VESSBY,B.; RINGQVIST,I. Menopause
is associated with the stiffness of the common carotid artery in 0 year old women.
Clinical Physiology. Vol.18, n.2, p.149-55, 1998.
JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8.ed.Rio de Janeiro:
Guanabara, 2005.
KALLIKAZAROS, I.; TSIOUFIS, C.; ZAMBARAS, P.; STEFANADIS,C.; TOUTOUZAS,P.
Conjugated estrogen administration improves common carotid artery elastic
81
proporties in normotensive postmenopausal women. Clinical Cardiology.
Vol.25,n.4,p.167-72, 2002.
KOGA, T.; KWAN, P.; ZUBIK, L.; AMEHO, C.; SMITH, D.; MEYDANI, M..Vitamin E
supplementation macrophage accumulation and endothelial cell expression of
adhesion molecules in the aorta of hypercholesterolemic rabbits. Atherosclerosis,
265-272, 2004.
KUNSCH, C.; MEDFORD, M.R..Oxidative Stress as a regulator of gene expression in
the vasculature. Circ.Res., 85: 753-6, 1999.
LAKATA, E.G.; LEVY D. Arterial and cardiac aging. Major shareholders in
cardiovascular disease enterprises. Circulation. 2003.
LIMA, S.M.; ALDRIGUI J.M.; CONSOLIM-COLOMBO, F.M.; MANSUR P.; RUBIRA
M.C.; KRIEGER E.M.; RAMIRES, J.A. Administration of 17 beta-estradiol improves
endothelium-dependent vasodilation in postmenopausa. Maturitas. 50(4), p.266-
74, 2005.
LIMA, S.M.R.R.; BELLÓ-KLEIN, A.; FLUES, K.; PAULINI, J.; MONTE, O.; IRIGOYEN,
M.C.; DE ANGELIS, K. Efeitos da suplementação do 17B-estradiol no dano
oxidativo cardíaco de ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos.
Revista Bras.de Ginecologia e Obstetrícia. Vol.29 no 1; 2007.
LINDPAINTNER, K.; GANTEN, D. The cardiac renin-angiotensin system. An appraisal
of present experimental and clinical evidence. Circ.Res. Vol. 68: 905-21; 1991.
LORELL, B.H & CARABELLO, B.A. Left ventricular hypertrophy: pathogenesis,
detection and prognosis. Circulation. 102:480-9, 2000.
MANDARIM-DE-LACERDA, C.A. Stereological tools biomedical research. Ann. Braz.
Acad. Sci. Vol.75, p.469-486, 2003.
MARIOTTI, V.B. Análise morfoquantitativa da matriz extra-celular da túnica média da
aorta de ratas ovariectomizadas submetidas a exercício físico aeróbio. Dissertação
82
do programa de pós-graduação em anatomia dos animais domésticos e silvestres
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, SP, 2009.
MARON, B. J. Clínicas Cardiológicas – O coração de atleta e a doença cardiovascular.
Rio de Janeiro,v3: Interlivros, 1997.
MARQUES, C.M.; NASCIMENTO, F.A.; MANDARIM-DE-LACERDA,C.A.; AGUILA,M.B.
Exercise training attenuates cardiovascular adverse remodeling in adult
ovariectomized spontaneously hypertensive rats. Menopause. Vol.13, n.1, p.87-95,
2006.
MARSH, M.M.; WALKER, V.R.; CURTISS, L.K.; BANKA, C.L.. Prottection against
atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL
receptor-deficient mice. J.Lipid Res., 40(5):893-900, 1999.
MATSUDA, M.; NOSAKA, T,; SATO,M.; IIJIMA,J.; OHSHIMA,N.; FUKUSHIMA, H.
Effects of exercise training on biochemical and biomechanical proporties of rat
aorta. Angiology. Vol.40, n1, p.51-58, 1989.
MERCURO, G.; SAIU, F.; DEIDDA, M.; MERCURO, S.; VITALE, C.; ROSANO, G.M.
Impairment of physical exercise capacity in healthy postmenopausal women.
American Heart Journal. Vol.151, n.4, p.923-27, 2006.
MILL, J.G.; BUSATTO, V.C.W.; CICILINI, M.A. Time-dependent activation of the
ngiotensin converting enzyme in the heart after myocardial infarction. J. Heart Failure.
Vol. 3 : 55; 1996.
MONTEIRO, M.F.; SOBRAL FILHO, D.C. Exercicio físico e o controle da pressão
arterial. Rev.Bras. Med. Esporte, 10-32, 2004.
MOREAU, K.L.; DONATO, A.J.; SEALS,D.R.; DE SOUZA, C.A.; TANAKA, H. Regular
exercise, hormone replacement therapy and the age-related decline in carotic
arterial complience in healthy women. Cardiovascular Research. Vol.57, p.861-68,
2003.
83
MOREAU, K.L.; GAVIN, K.M.; PLUM, A.E.; SEALS, D.R. Oxidative stress explains
differences in large elastic artery compliance between sedentary and habitually
exercising postmenopausal women. The North Am.Menopause Soc., vol.13, no6,
pp.951-958, 2006.
MOURIER, A; GAUTIER, J.F.; DE KERVILER, E.; BIGARD, A.X.; VILLETTE, J.M.;
GARNIER, J.P.; DUVALLET, A.; GUEZENNEC C.Y.; CATHELINEAU, G.
Mobilization of visceral adipose tissue related to the improvement in insulin
sensitivity in response to physical training in NIDDM: effects of branched-chain
amino acid supplements. Diabetes Care. 20:385-391, 1997.
NAPOLI, C.; et al..Physical training and metabolic supplementation reduce spontaneous
atherosclerotic plaque rupture and prolong survival in hypercholesterolemic mice.
Proc. Natl. Acad. S. USA, 2006. 103(27):p.10479-84.
NAPOLI,C. Long-term combined beneficial effects of physical hypercholesterolemic
mice. Proc. Natl. Acd. Sc., USA, 2004-101(23):p.8797-802.
NEGRÃO, C.E.; BARRETO, A.C.P.. Efeito do treinamento físico na insuficiência
cardíaca: implicações autonômicas, hemodinâmicas e metabólicas. Revista
Soc.Cariol.de S.P., v.08, n.2, 1998.
OCAMPO, J.M.; GUTIERREZ, J.. Envejecimento del Sistema Cardiovascular. Revista
Colombiana de Cardiologia., vol.12 n.2, 2005.
O’ROURKE, M.F.; MANCIA, G. Arterial Stiffness. J. Hypertension., 17:1-4, 1999.
O´ROURKE, M.F,; HASHIMOTO, J. Mechanical factors in arterial aging. A clinical
perspective. JACC. 50, p.1-13, 2007.
PARK, J.H.; OMI, N.; NOSAKA,T.; KITAJIMA,A.; EZAWA, I. Estrogen deficiency and
low-calcium diet increase bone loss and urinary calcium excretion but did not alter
arterial stiffness in young female rats. Journal of Bone and Mineral Metabolism.
Vol.26, n.3, p.218-25, 2008.
84
PEDERSEN, B.K.. The anti-inflmmatory effect of exercise: role in diabetes and
cardiovascular disease control. Essays Biochem. 42:p.105-17, 2006.
PENALVA, R.A.. Perfil lipídico e intensidade de doença aterosclerótica na síndrome
coronariana aguda. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v.90 n.1 São Paulo jan.
2008.
PEREIRA, L.; VIANNA, G.; MANDARIM-DE-LACERDA, C.A. Morfologia e estereologia
do miocárdio em ratos hipertensos. Correlação com o tempo de inibição da síntese
do óxido nítrico. Arq.Bras.Cardiol. Vol.70, n.6, p.397-402, 1998.
PECHANOVA, O.; DOBESOVA, Z.; CEJKA, J.; KUNES, J.; ZICHA, J.. Vasoactive
systems in L-NAME hypertension: the role of inducible nitric oxide synthase. J.
Hypertension, 22:167-73, 2004.
PERELLA, J.; BERCO, M.; CECUTTI, A.; GERULATH, A.; BRAVNANI, B.R.. Potential
role of the interaction between equine estrogens, low-density lipoprotein (LDL) and
high-density lipoprotein (HDL) in the prevention of coronary heart and
neurodegenerative diseases in postmenopausal women. Lipids in Health and
Disease, 2:4, 2003.
PFEFFER, M.A. & BRAUNWALD, E.. Ventricular remodeling after myocardial infarction:
experimental observations and clinical implications. Circulation. 81:1161-72, 1990.
REES, D. D.; PALMER, R. M.; MONCADA,S.. Role of endothelium-derived nitric oxide
in the regulation of blood pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3375-8, 1989.
REUDELHUBER, T.L. Molecular biology of renin. In: Schondorff, D. & Bonventre J.V
(Editors). Molecular Nephrology. Marcel Dekker Inc., New York, USA.
ROBERT, L. Aging of the vascular – wall and arteriosclerosis. Exp.Gerontol., 34:491-
501, 1999.
ROIIT, IM.. Imunologia. Ed. Atheneu. São Paulo. 5 edição, 1998.
ROSS, R. Atherosclerosis: an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340(2):115-26,
1999.
85
RUDERMAN N.B.; GANDA, O.P.; JOHANSEN, K. The effect of physical training on
glucose tolerance and plasma lipids in maturity-onset diabetes. 28:S89-S92, 1979.
RUSH, J.W.E.; GRAHAN, D.A.. Exercise training aortic endothelium-dependent
vasorelaxation and determinants of nitric oxide bioavailability in spontaneously
hypertensive rats. J.Appl.Physiol., 96:2088-2096, 2004.
SAFAR, M.; FROHLICH,E. The arterial system in hypertension: a prospective view.
Hypertension. Vol.26:10-14, 1995.
SCHNEIDER, D.C.; OLIVEIRA, A.R.. Radicais livres de oxigênio e exercicio:
mecanismos de formação e adaptação ao treinamento fisico. Revista Brasileira de
Medicina Esportiva. vol.10, n.4, 2004.
SEGAL, K.R.; EDANO, A.; ABALOS A.; ALBU J.; BLANDO L.; TOMAS, M.B.; PI-
SUNYER, F.X. Effect of exercise training on insulin sensibility and glucose
metabolism in lean, obese, and diabetic men. J.Appl.Physiol. 71:2402-2411, 1991.
SERRANO, C.V.; FERNANDES, J.L; LUZ, P.L.. Moléculas de Adesão, Inflamação e
Endotélio. Cap.8. In: Endotélio e doenças Cardiovasculares. LUZ, P.L.;
LAURINDO, F.; CHAGAS, A.C.P. Ed. Atheneu,2004.
SIES, H. Oxidative Stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology. 82: 291-
295, 1997.
SILVER, F.H.; HORVATH, I.; FORAN, D.J. Viscoelasticity of the vessel wall: the role of
collagen and elastic fibers. Critical reviews in biomedical engineering. Vol. 29,n.3,
p.279-301, 2001.
SMITH, J.K.; DYKES, R.; KRISHNASWAMY, G.; BERK, S.. Long-term exercise and
atherogenic activity of blood mononuclear cells in persons at risk of developing
ischemic heart disease. JAMA, 281:1722-7, 1999.
SOUZA, S.B.C.; FLUES, K.; PAULINI, J.; MOSTARDA, C.; RODRIGUES, B.; SOUZA,
L.E.; IRIGOYEN, M.; DE ANGELIS, K.. Role of Exercice Training in Cardiovascular
86
Autonomic Dysfunction and Mortality in Diabetic Ovariectomized Rats.
Hypertension, 50;786-791, 2007.
SOWERS, J. R. Diabetes mellitus and cardiovascular disease in women.
Arch.Intern.Med. 158:617 – 621; 1998.
STAESSEN, J.A.; CELIS, H.; FAGARD, R. The epidemiology of the association between
hypertension and menopause. Journal of Human Hypertension. Vol.12, n.9, p.587-
92, 1998.
STAMPFER, M.J.; COLDITZ. G.A.; WILLETT, W.C.; MANSON J.E.; ROSNER, B.;
SPEIZER, F.E.; HENNEKENS C.H. Postmenopausal estrogen therapy and
cardiovascular disease. Ten-year follow-up from Nurses Healthy Study. N.England
J.Med. 325:756-762, 1991.
STEIN, R.; GUTHS, H.; RAMOS, S.S.. Exercicio, Inflamação e Disfunção Endotelial na
Doença Cardiovascular. Revista de Cardiologia do Rio Grande do Sul, 2004.
SUZUKI, S. & OHTA, T. Exercise therapy for patients with mild hypertension]. Nippon
Rinsho, 2008. 66(8):p.1553-9.
SUN, Y; WEBER, K.T. Angiotensin converting enzyme and myofibroblasts during tissue
repair in the rat heart. J. Mol. Cell. Cardiol.Vol. 28: 851-8;1996.
SZILVASSY, C.T.; PALI, T.; DROYR LE FAIX, M.T.; FERDINANDY, P. Nitric Oxide,
Peroxynitrite and cGMP in Aterosclerosis – induced hypertension in rabbits:
beneficial effects of cicletanine. J.Vasc. Res., 38, p.39-46, 2001.
TORTORA GRABOWSKI. Princípios de Anatomia e fisiologia. RJ: Guanabara Koogan.
9 ed.
TSUKUI, S.; KANDA, T.; NARA, M.; NISHINO, M.; KONDO, T.; KOBAYASHI, I..
Moderate-intensity regular exercise decreases serum tumor necrosis factor-alpha
and HbA1c levels in healthy women. International Journal of Obesity, 24:1207-
1211, 2000.
87
VAN DEN BERG, M.; BOERS, GH.; FRANKEN, DG.; BLOM, HJ.; VAN KAMP, GJ.;
JACOBS, C.. Hyperhomocysteinemia and endothelial dysfunction in yong patients
with peripherial arterial cclusive desease. Eur.J.Clin. Invest, 24:176-81, 1995.
VAZ, A. J.; TAKEI, K. ; BUENO, E. C. . Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações. 1.
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. v. 1.
ZAGO, A.S.; ZANESCO, A. Óxido Nítrico, Doenças Cardiovasculares e Exercício Físico.
Arq.Bras.Cardiol. 87(6): 264-270, 2006.
ZORNOFF, L.; CICOGNA, A.C.; PAIVA, SPADARO, J.. Remodelamento e seu impacto
na progressão da disfunção ventricular. Rev.Soc.Cardiol.E.S.P. 12:371-, 2002.
WILLIAMS, P.L.; WARWICK,R.; DYSON,M.; BANNISTER,L.H. Gray Anatomia. Vol.1,
ed.37. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan,1995.
WEBER, K.T. Extracelular matrix remodeling in heart failure: a role for de novo
angiotensin II generation. Vol.96, p.4065-82, 1997.
WEINSTOCK, J.V.; BOROS,D.L., GEE, J.B. Enhanced granuloma angiotensin I
converting enzyme activity associated with modulation in murine schistosomiasis.
Gastr. Vol. 81: 48-53; 1981.
