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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA João Edson Ourique Balbé TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO CURITIBA 2010
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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
João Edson Ourique Balbé
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
CURITIBA
2010
EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS E PRODUÇÃO IN VITRO DE
EMBRIÕES BOVINOS
CURITIBA
2010
João Edson Ourique Balbé
EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS E PRODUÇÃO IN VITRO DE
EMBRIÕES BOVINOS
Relatório de Estágio Curricular Obrigatório apresentado ao curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná, na área de reprodução de grandes animais sob orientação do professor Msc. Marcelo Arne Feckinghaus e como orientador profissional a professora Dra. Mara Iolanda Batistella Rubin.
CURITIBA
2010
Reitor Prof. Luis Guilherme Rangel Santos Pró- Reitor Sr. Carlos Eduardo Rangel Santos Pró-Reitora Profª Carmen Luiza da Silva Pró-Reitor de Planejamento e Avaliação Sr. Afonso Celso Rangel dos Santos Pró-Reitoria de Pós Graduação, Pesquisa e Extensão Prof. Roberval Eloy Pereira Secretário Geral Sr. Bruno Carneiro da Cunha Diniz Diretor da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde Prof. João Henrique Faryniuk Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária Profª Ana Laura Angelli Metodologia Científica Prof. Jair Mendes Marques Coordenação de Estágio Obrigatório do Curso de Medicina Veterinária Profª Ana Laura Angeli
CAMPUS PROF. SIDNEY LIMA SANTOS (BARIGÜI) Rua Sidney A Rangel dos Santos 238 Bairro: Santo Inácio CEP 82.010-330 Curitiba – Paraná Telefone: (41) 3331-7700
TERMO DE APROVAÇÃO
João Edson Ourique Balbé
EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS E PRODUÇÃO IN VITRO DE
EMBRIÕES BOVINOS
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado e aprovado para obtenção do título de Médico Veterinário por
uma banca examinadora do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.
Curitiba, 03 de dezembro de 2010.
Orientador:
_____________________________________________
Professor Msc Marcelo Arne Feckinghaus
Universidade Tuiuti do Paraná
______________________________________________
Professora Msc. Beatriz Calderi Vianna
Universidade Tuiuti do Paraná
_______________________________________________
Professora Msc. Elza Maria Galvão Ciffoni
Universidade Tuiuti do Paraná
Agradecimentos
Aos meus pais Cesar R. J. Balbé e Inaiara O. Balbé por sempre me mostrarem o caminho
certo a seguir, nunca me deixando desistir e sempre incentivando a estudar.
Aos meus tios Getulio Jacques Ourique Neto e família por me apoiarem, pelo incentivo e
pelos conselhos durante esta etapa.
À professora Dra Mara Rubin e a toda equipe do laboratório Embryolab com quem tive o
prazer de trabalhar durante o período de estágio.
À minha vó Eima da Cruz Ourique pelo carinho depositado, pelos conselhos e pela dedicação.
À professora Elza Maria G. Ciffoni pelas orientações e monitoria durante a faculdade cursada
e pelo companheirismo.
Ao professor Marcelo Feckinghaus por orientação durante o estágio curricular.
A lição número um,
Eu aprendi com meus pais:
Quem não sabe pra onde vai,
Não vai a lugar nenhum. (Jayme
Caetano Braun)
É um grande erro teorizar antes de ter os
dados, as pessoas destorcem os fatos para que se moldem às suas teorias, ao invés
das teorias se moldarem aos fatos! Sherlock Holmes – o filme.
SUMÁRIO
LISTA DE QUADROS.........................................................................................6
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................7
RESUMO...............................................................................................................8
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................9
2. DESCRIÇÃO DO LOCAL .........................................................................11
3. ATIVIDADES REALIZADAS...................................................................15
4. EXAME ANDROLÓGICO EM TOUROS – REVISÃO DE LITERATURA 17
4.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR ..............17
4.2 AVALIAÇÃO DO TOURO...........................................................................20
4.2.1 Morfologia testicular ............................................................................21
4.3 COLETA SÊMEN EM BOVINOS................................................................21
4.4 EXAME DO SÊMEN.....................................................................................22
4.4.1 Avaliação da Motilidade e Vigor..........................................................22
4.4.2 Morfologia espermática ........................................................................24
4.4.3 Integridade de membrana plasmática ...................................................25
4.4.4 Concentração espermática ....................................................................25
5. EXAME ANDROLOGICO EM BOVINOS – RELATÓRIO.................28
6. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS – REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................................35
6.1 ASPIRAÇÃO DOS FOLÍCULOS .................................................................38
6.2 SELEÇÃO DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS .............................40
6.3 MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS .................................45
6.3.1 Meios de cultivo e suplementos para maturação in vitro de embriões de bovinos...........................................................................................................51
6.4 FECUNDAÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS.............................54
6.4.1 Capacitação espermática.......................................................................54
6.4.2 Fusão dos Gametas ...............................................................................59
6.4.3 Meio de Fecundação in vitro de embriões bovinos ..............................60
6.5 CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS......................................62
7. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS – RELATÓRIO 65
7.1 ASPIRAÇÃO FOLICULAR ..........................................................................66
7.2 SELEÇÃO DOS OÓCITOS BOVINOS........................................................67
7.3 LAVAGEM DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS ...........................69
7.4 MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS .................................70
7.5 FECUNDAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS................................73
7.5.1 Capacitação espermática.......................................................................73
7.6 CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS.......................................77
7.7 AVALIAÇÃO DA TAXA DE ECLOSÃO E DOS EMBRIÕES..................79
8 CONCLUSÃO...............................................................................................81
9 REFERÊNCIAS ...........................................................................................83
6
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1: PARÂMETROS MÍNIMOS E MÁXIMOS DA AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA ..................................................................................................24
QUADRO 2: ROTEIRO DO EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS ........26
QUADRO 3: EFEITOS POSITIVOS DAS CÉLULAS DO CUMULUS SOBRE A FECUNDAÇÃO...................................................................................................41
QUADRO 4: CRITÉRIOS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE OÓCITOS BOVINOS ..........................................................................................42
QUADRO 5: CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DE COCs E OÓCITOS...................43
QUADRO 6: ETAPAS QUE CARACTERIZAM A CAPACIDADE DO OÓCITO..............................................................................................................................50
QUADRO 7: FATORES QUE AFETAM A MATURAÇÃO IN VITRO DOS OÓCITOS E DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES .....................................50
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Frente do laboratório EMBRYOLAB UFSM 2010 .........................11
FIGURA 2: Ilustração da planta baixa do laboratório embryolab da UFSM; 201013
FIGURA 3: Ilustração do sistema reprodutor masculino bovino.........................17
FIGURA 4: Inter-relações no controle da função reprodutiva masculina ...........19
FIGURA 5: Touro submetido ao exame andrológico ..........................................28
FIGURA 6: Coleta sêmen com auxilio do eletro-ejaculador introduzido no reto do animal ...................................................................................................................30
FIGURA 7: Eletro-ejaculador utilizado para coleta do sêmen bovino ................30
FIGURA 8: Sêmen bovino avaliado sob microscópio - avaliação da motilidade e vigor...............................................................................................................................32
FIGURA 9: Microscópico e câmara de Neubauer para determinação da concentração espermática. ..........................................................................................................34
FIGURA 10: Esquema de produção in vitro de embriões bovinos......................38
FIGURA 11 : A.) COCs selecionados para maturação in vitro. B.) COCs após o período de maturação com as células do cumulus expandidas.............................48
FIGURA 12: Rompimento da vesícula germinativa ............................................49
FIGURA 13: Preparação do sêmen com gradiente de Percoll .............................57
FIGURA 14: Método do Swin-up para obtenção de espermatozóides para FIV.58
FIGURA 15: Fases da Fertilização.......................................................................60
FIGURA 16: Fases do desenvolvimento embrionário bovino. ............................63
FIGURA 17: Banho dos ovários em álcool e solução fisiológica........................66
FIGURA 18: Aspiração folicular – aspiração dos folículos de tamanho entre 2-8 mm..............................................................................................................................67
FIGURA 19: Seleção, lavagem e procura dos oócitos sob lupa ..........................68
FIGURA 20: Complexos cumulus-oócitos ..........................................................68
FIGURA 21: Banho dos COCs em liquido folicular sob lupa .............................69
FIGURA 22: Oócitos selecionados no meio TCM-Hepes ...................................70
FIGURA 23: Estufa de pressão, temperatura e umidade controlada ..................71
FIGURA 24: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas ..........71
FIGURA 25: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas ..........72
FIGURA 26: Placa Nunc com meio de maturação ..............................................72
FIGURA 27: Meio Talp-Sperm em banho-maria. ...............................................75
FIGURA 28: Avaliação da motilidade e vigor das palhetas de sêmen descongeladas..............................................................................................................................75
FIGURA 29: Retirada do sobrenadante do Swin-up............................................76
FIGURA 30: Centrifuga – centrifugação da fração do sobrenadante do Swin-up76
FIGURA 31: Possíveis zigotos submetidos ao vortex. ........................................78
FIGURA 32: Busca dos possíveis zigotos e banho em gotas no meio TCM-HEPES...............................................................................................................................78
FIGURA 33: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D2 .........................80
FIGURA 34: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D2 .........................80
xi
RESUMO
O presente trabalho de conclusão de curso aborda os assuntos de: exame andrológico
em bovinos e produção in vitro de embriões bovinos, ambos os temas realizados
durante o estágio curricular realizado no laboratório de embriologia EMBRYOLAB da
Universidade Federal de Santa Maria. O estágio foi orientado academicamente pelo
professor Msc. Marcelo Arne Feckinghaus e profissionalmente pela professora Dra.
Mara Iolanda Batistella Rubin, iniciando no dia 18 de julho de 2010 e tendo fim no dia
29 de outubro de 2010 totalizando 472 horas. Durante o período de estágio foram
desenvolvidas várias atividades relacionadas à reprodução de grandes animais entre
elas destacam-se a produção in vitro de embriões bovinos (PIV), congelamento de
sêmen bovino, analise de sêmen bovino e eqüino, exames andrológicos em touros,
entre outras atividades.
Palavras-chave: Andrológico, produção in vitro, embrião, PIV.
INTRODUÇÃO
Com o objetivo de aumentar a eficiência da produção em sistemas de criação
de bovinos, várias técnicas reprodutivas foram desenvolvidas ao longo dos últimos
anos, entre elas destacam-se a inseminação artificial, sincronização de cio,
transferência de embriões e produção in vitro de embriões. Tais técnicas possibilitaram
um aumento e rapidez no melhoramento genético de rebanhos.
A produção in vitro de embriões bovinos em programas comerciais é utilizada
para melhorar geneticamente o rebanho em curto espaço de tempo e se constitui como
fonte alternativa para programas de transferências de embriões. Essa biotecnologia
tem-se desenvolvido amplamente nas ultimas décadas, porém sua eficiência é
relativamente baixa, tendo necessidade de pesquisas na área para seu aperfeiçoamento.
Em um sistema de criação de bovinos a reprodução do rebanho é um ponto
crucial para obtenção de lucros para o criador. E neste segmento, a avaliação da
fertilidade do macho. O exame andrológico torna-se um requisito necessário em
centrais de colheita e processamento de sêmen bovino e em propriedades que utilizam
o macho a monta natural. A avaliação baseia-se em dizer se o reprodutor esta apto,
questionável ou inapto para a reprodução com base na avaliação do touro e em exames
seminais.
O presente trabalho de conclusão de curso, com estágio curricular sendo
realizado no laboratório EMBRYOLAB, aborda os temas de exames andrológicos em
touros e produção in vitro de embriões bovinos.
2. DESCRIÇÃO DO LOCAL
O estágio obrigatório em medicina veterinária foi realizado no período de 19
de julho a 29 de outubro de 2010, completando 472 horas, este sendo realizado no
Embryolab – Laboratório de Embriologia Animal (ver figura 1) fazendo parte do
departamento de clinica de grandes animais do centro de ciências rurais da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM).
FIGURA 1: Frente do laboratório EMBRYOLAB UFSM 2010
A UFSM localizada na cidade de Santa Maria está na região centro-oeste do
estado do Rio Grande do Sul a 329 km de Porto Alegre, possui um clima mesotérmico
e úmido.
O laboratório é coordenado pelos Médicos Veterinários Drs. Carlos Antonio
Mondino Silva e Mara Iolanda Batistella Rubin. O estágio curricular foi orientado pela
professora Dra Mara Iolanda Batistella Rubin CRMV-RS: 2294
O Embryolab possui o complexo de sala de laboratório que é composto por
quatro salas, sendo estas: a sala de produção in vitro de embriões (PIV), a sala de
pesagem e preparação dos meios, a sala de aspiração e armazenamento de materiais e a
sala de limpeza e esterilização do material, o laboratório é composto ainda por: sala
individual de professores – sala da professora titular (Dra. Mara Rubin), sala de
estudos e reuniões, sala de limpeza de material de campo e pela sala de
armazenamento de material de campo e outros matérias (Ver figura 2).
No laboratório propriamente dito, a sala principal é onde ocorrem os
procedimentos, tais como: a aspiração folicular dos ovários, o congelamento e análise
de sêmen, a análise de material coletado a campo, é também nessa sala ficam
armazenados os botijões de nitrogênio e alguns materiais utilizados dentro do
laboratório.
Na sala de pesagem é efetuado o preparo de soluções e meios de cultivo para a
PIV, no congelamento de embriões, no congelamento de sêmen, corantes para lâminas,
entre outras soluções.
Na sala da PIV ocorre: a busca e seleção dos complexos cumulus-oócitos,
seleção e avaliação dos embriões, e onde fica a estufa de cultivo de embriões, enfim, é
a sala de manipulação dos oócitos e dos embriões.
FIGURA 2: Ilustração da planta baixa do laboratório embryolab da UFSM; 2010
Na sala de limpeza como o próprio nome já diz, é onde se efetua a limpeza e
esterilização do material do laboratório. Nela também se efetuam os processos de
destilação e deionização da água bem como a purificação da água, tornando-a ultra-
pura. Nesta sala encontram-se as estufas e autoclaves.
O laboratório ainda conta com uma mangueira de contenção de bovinos,
composta por 18 bretes, e neste espaço realizam-se as aulas práticas ministradas,
cursos e manejo dos animais.
No Embryolab desenvolvem-se pesquisas e atividades na área de reprodução
de grandes animais, principalmente trabalhando nas espécies bovinas e equinas, além
de desenvolver cursos na área.
As atividades desenvolvidas no laboratório vão desde a produção in vitro de
embriões bovinos e eqüinos, transferência de embriões, exames ginecológicos, seleção
de doadoras e receptoras bovinas, coleta, análise e congelamento de sêmen bovino e
eqüino.
O laboratório ainda desenvolve o Equidil, um diluente para sêmen equino, e o
TSZ - teste de sulfato de zinco, que analisa a imunidade passiva transferida ao potro.
Ambos os testes são desenvolvidos comercialmente.
3. ATIVIDADES REALIZADAS
No estágio curricular obrigatório efetuado no Embryolab, sob orientação da
Professora Dra. Mara Iolanda Batistella Rubin, foram realizadas atividades referentes à
área de reprodução de grandes animais, principalmente bovinos.
As atividades foram:
• Preparo dos meios utilizados na produção in vitro de embriões bovinos;
• Produção in vitro de embriões bovinos;
• Exame andrológico em bovinos;
• Coleta e análise de sêmen bovino;
• Congelamento de sêmen bovino;
• Coleta e análise de sêmen eqüino;
• Exames ginecológicos em vacas:
o Exames de palpação retal em vacas;
o Exames de vaginoscopia em vacas;
o Exames de ultra-sonografia em vacas.
• Protocolos de Inseminação Artificial em tempo fixo em vacas de corte;
• Visita e assistência técnica em propriedades leiteiras;
• Lavagem Uterina em bovinos;
• Avaliação de lâminas de biopsia uterina de éguas e vacas;
• Acompanhamento das aulas teóricas e práticas de Ginecologia
Veterinária;
• Acompanhamento de vulvoplastia equina;
O presente trabalho de conclusão de curso aborda os temas de exame
andrológico em bovinos e produção in vitro de embriões bovinos.
4. EXAME ANDROLÓGICO EM TOUROS – REVISÃO DE
LITERATURA
4.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR
Os principais órgãos do sistema reprodutor masculino em bovinos são os
testículos, epidídimos, ductos deferentes, glândulas vesiculares, próstata, glândulas
bulbouretrais e pênis, ver figura 3 (NOAKES, 1991).
FIGURA 3: Ilustração do sistema reprodutor masculino bovino
FONTE: Noakes (1991).
Segundo Ball & Peters (2004), as duas funções dos testículos são: a secreção
de testosterona e outros hormônios esteróides e a produção de espermatozóides, sendo
que essas funções são controladas principalmente por hormônios da glândula pituitária
anterior.
As glândulas acessórias: a próstata, as glândulas vesiculares e as glândulas
bulbouretrais emitem secreções para dentro da uretra; essas secreções misturam-se no
momento da ejaculação com os espermatozóides e com as secreções ampolares dos
dutos deferentes (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
O pênis, órgão copulador, é formado pelos corpos cavernosos pares, uretra
com seu corpo cavernoso ímpar, pela ponta do pênis e pelas raízes da verga, sendo no
bovino fibroelástico (REICHENBACH et al., 2008). Nos ruminantes, a verga
apresenta duas flexões, em S, chamadas de S peniano ou flexura sigmóide (MIES
FILHO, 1977).
O escroto, os músculos cremasteres, o sistema vascular das artérias e veias
testiculares tem como função a proteção e a regulação da temperatura dos testículos
(MARQUES FILHO, 2006)
A formação dos espermatozóides é um processo conhecido como
espermatogênese e ocorre de maneira contínua, no testículo, durante a vida sexual dos
animais. A espermatogênese tem duração de 61 dias e depende de fatores ambientais
(luminosidade, temperatura e estresse), nutricionais e genéticos (MARQUES FILHO,
2006). Os gonócitos (primeiras células germinativas a habitarem os túbulos
seminíferos) multiplicam-se diferenciando-se em espermatogônias. Estas se dividem e
na última geração, formam as espermatogônias B que sofrendo meiose, formam os
espermatócitos primários e as espermátides arredondadas que se diferenciam em
espermatozóides (AGUIAR et al., 2006).
A espermatogênese depende do suporte funcional das células de Sertoli, dos
níveis adequados de esteróides, gonadotrofinas e de fatores de crescimento (AGUIAR
et al., 2006).
Na figura abaixo que representa a função reprodutiva no macho mostra que o
hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) estimula a liberação do FSH e do LH. O
FSH age nos túbulos seminíferos dos testículos – nas células de Sertoli – estimulando
a espermatogênese. As células de Sertoli produzem a inibina, que tem o efeito de
feedback negativo na secreção de FSH. Já o LH estimula a liberação de testosterona
pelas células de Leydig (PTASZYNSKA & MOLINA, 2007).
FIGURA 4: Inter-relações no controle da função reprodutiva masculina
FONTE: Ptaszynska & Molina (2007)
4.2 AVALIAÇÃO DO TOURO
Umas das principais características consideradas na avaliação é a fertilidade
do touro, tanto em sistemas de produção de carne quanto de leite. No exame
andrológico completo detecta-se alterações no sistema reprodutivo, lesões nos órgãos,
distúrbios na libido e na habilidade da cópula, tornando o touro infértil (BARBOSA et
al., 2005).
Sendo imprescindível para avaliação do potencial reprodutivo, o exame
andrológico de touros jovens e adultos, utilizados em monta natural ou como doadores
de sêmen para comercialização, fundamenta-se na avaliação da saúde geral, saúde do
sistema reprodutor e conclusão do aproveitamento do touro na reprodução
(REICHENBACH et al., 2008).
No exame andrológico deve-se incluir o exame físico geral, onde se observa as
condições que possam interferir com a habilidade de monta tais como defeitos de
aprumos, condição corporal, incidência de doenças, problemas respiratórios e de
dentição; o exame do trato reprodutivo, onde devem ser constatadas anormalidades dos
órgãos genitais internos e externos (VALLE et al., 1998).
O comportamento do touro em serviço e a avaliação da libido efetuada no
exame andrológico devem ser observados em ambiente natural, com pelo menos duas
vacas no estro, o padrão de acasalamento, libido bem como a inspeção do pênis ereto
(NOAKES, 1991).
4.2.1 Morfologia testicular
A morfologia testicular tem sido adotada como critério na avaliação da
capacidade reprodutiva dos touros sendo que touros saudáveis, com perímetro escrotal
grande geralmente apresentam maior fertilidade (REICHENBACH et al., 2008).
A circunferência escrotal (CE) permite estimar o potencial reprodutivo do
touro por estar associada ao desenvolvimento do testículo, a produção diária de
espermatozóide e a idade à puberdade (NEVES, 2007).
A avaliação da consistência, forma, simetria, mobilidade dentro do escroto,
posição, temperatura, sensibilidade e tamanho também devem ser realizados
rotineiramente nos exames andrológicos (BARBOSA et al., 2005).
A CE geralmente obtida ao desmame do touro, ao ano – 365 dias de idade – e
sobreano – 450 a 550 dias de idade – é uma medida biométrica de fácil obtenção que
apresenta a herdabilidade de média a alta, a media da CE varia conforme o padrão
racial dos touros (NEVES, 2007).
4.3 COLETA SÊMEN EM BOVINOS
Vários métodos existem e podem ser usados para a coleta de sêmen dos
bovinos. O mais utilizado é o emprego da vagina artificial que se baseia na utilização
de um instrumento prático que tende a imitar o aparato genital feminino e que permite
uma rápida coleta do ejaculado e este livre de contaminantes (RODRÍGUES et al.,
2003). Aplicam-se ainda os métodos de estímulo por eletroejaculação e pela massagem
por via retal das glândulas vesiculares e das ampolas dos condutos deferentes para a
coleta do ejaculado nos bovinos (REICHENBACH et al., 2008).
Sendo geralmente utilizado em centrais de coleta e processamento de sêmen o
método de induzir o touro a ejacular em vagina artificial a qual é constituída para
simular a sensação da vagina de uma vaca. A quantidade e qualidade do sêmen obtido
varia conforme a “provação” (tempo sem cobertura) do touro antes da coleta (BALL &
PETERS, 2004).
O eletro-ejaculador faz a indução da ejaculação por meio de estímulos
elétricos ao nível da quarta vértebra lombar, o aparelho consiste por um gerador
elétrico, de intensidade entre 0 e 1.000mA, acoplado a dois pólos terminais, disposto
em fitas longitudinais ou anéis sobre um eletrodo bipolar (REICHENBACH et al.,
2008).
Reichenbach et al. (2008), indicam como método alternativo a massagem das
glândulas vesiculares e ampolas dos ductos deferentes por palpação retal sendo que o
método geralmente é empregado a campo com reprodutores não condicionados a
vagina artificial e na indisponibilidade de um eletroejaculador.
4.4 EXAME DO SÊMEN
Em centrais de colheita e processamento de sêmen bovino os métodos mais
utilizados consistem basicamente na análise subjetiva da motilidade, concentração,
morfologia e integridade de membranas plasmáticas e acrossomal (MAZIERO et al.,
2009).
4.4.1 Avaliação da Motilidade e Vigor
A avaliação da motilidade espermática corresponde à proporção do número
total de espermatozóides móveis em uma amostra de sêmen, sendo que a primeira
avaliação deve ser feita imediatamente após a obtenção do ejaculado
(REICHENBACH et al., 2008). De forma subjetiva e sob microscopia óptica
convencional, a motilidade é estimada pela avaliação visual das células espermáticas e
associada à ausência de movimento com quadros de infertilidade (MAZIERO et al.,
2009).
Sendo uma técnica subjetiva, a avaliação da motilidade e vigor ao microscópio
depende da capacitação do avaliador, sendo que a baixa repetibilidade dos resultados
entre diferentes avaliadores leva a interpretações equivocadas.
Para se realizar a avaliação da motilidade é utilizado geralmente um
microscópio com contraste de fase, platina aquecida a 37ºC e a amostra é examinada
em 200x de aumento, entre lâmina e lamínula. Conforme o quadro abaixo citado por
Severo (2009) que mostra os parâmetros da avaliação espermática tem se uma base
dos valores mínimos e máximos (SEVERO, 2009).
QUADRO 1: PARÂMETROS MÍNIMOS E MÁXIMOS DA AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA
1 Motilidade espermática progressiva – mínimo (%) 30
2 Vigor de motilidade – mínimo (1-5) 3
3 Espermatozóides com motilidade progressiva – mínimo (x106/dose) 10
4 Motilidade após teste de termo-resistência – mínimo (%) 15
5 Defeitos Maiores totais – máximo 20
6 Defeitos totais – maiores e menores – Maximo (%) 30
4.4.2 Morfologia espermática
O estudo anatômico da célula espermática, a morfologia espermática
(SEVERO, 2009), permite a eliminação de touros com baixo potencial de fertilidade,
evitando a entrada desses animais nos programas de reprodução, pois os defeitos
específicos na morfologia estrutural das células espermáticas correlacionam-se com a
sub e infertilidade masculina (MAZIERO et al., 2009)
Classificados conforme a estrutura espermática envolvida (acrossomo, cabeça,
peça intermediária e cauda), os defeitos são interpretados em defeitos maiores –
associados com subfertilidade ou esterilidade – e os defeitos menores – não estando
estes relacionados a processos patológicos dos testículos (REICHENBACH et al.,
2008).
4.4.3 Integridade de membrana plasmática
A integridade da membrana plasmática está relacionada aos processos de
fertilização, tais como a capacitação espermática, ligação à zona pelúcida, reação
acrossomal e fusão dos gametas (MAZIERO et al., 2009).
Para avaliação da integridade da membrana plasmática, vários testes são
disponibilizados tais como: colorações supra-vitais incluindo Tripan-Blue-Giensa e
Eosina-Nigrosina; testes hiposmóticos; sondas fluorescentes (MAZIERO et al., 2009).
4.4.4 Concentração espermática
Sendo considerada como a quantidade de espermatozóides presentes em um
dado volume do ejaculado, varia muito conforme o método de colheita de sêmen. Pode
variar também conforme a freqüência da colheita, raça, época do ano e estado
nutricional, sendo normalmente nos bovinos a concentração variando entre 0,2 a 2,2
milhões/mm3. A concentração é determinada diluindo-se o sêmen em formol salino
tamponado ou citrato de sódio formalizado, e em seguida introduz-se na câmara de
Neubauer para se efetuar a contagem dos espermatozóides (REICHENBACH et al.,
2008).
Reichenbach et al. (2008) cita os passos do roteiro a ser seguido no exame
andrológico conforme o quadro 2 abaixo.
QUADRO 2: ROTEIRO DO EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS
Etapas Objetivos gerais e procedimentos
1 Identificação • Obtenção de informações referentes à propriedade e ao
reprodutor
2 Exame clínico e
anamnese
Exame clínico geral
Exame clínico especial
Exame clínico do
aparelho genital
masculino
• Avaliação do rebanho: estado sanitário, manejo, nutrição,
desempenho reprodutivo e índices de fertilidade obtidos;
• Avaliação da história pregressa do reprodutor com enfoque
à fertilidade.
• Análise do desenvolvimento corporal, do temperamento,
do estado nutricional e das características sexuais secundárias.
• Exame dos sistemas circulatório, respiratório, disgestório,
musculoesquelético.
• Inspeção e palpação dos órgãos genitais externos: escroto,
testículos, epidídimos, cordões espermáticos, linfonodos
testiculares, prepúcio, pênis, palpação retal e ultra-sonografia dos
órgãos genitais internos
3 Exame do
comportamento e da
capacidade reprodutiva
• Avaliação da capacidade coeundi (exame funcional):
análise da libido, da capacidade de monta e de ereção
• Avaliação da capacidade generandi (espermograma)
• Exame macroscópico: características físicas e químicas do
sêmen;
• Exame microscópico: análise do tipo e da freqüência de
alterações morfológicas do espermatozóide;
• Exame microbiológico do sêmen.
4 Registro e avaliação • Elaboração do Certificado de Exame Andrológico
5. EXAME ANDROLOGICO EM BOVINOS – RELATÓRIO
Ao longo do estagio curricular foram desenvolvidos exames andrológicos em
bovinos, para fins de seleção de touros e avaliação de sêmen para utilização na
produção in vitro e para congelamento, e analise de palhetas de sêmen congelado
vindo de centrais para laudo técnico.
O exame andrológico se inicia com a anamnese ou história clinica do animal e
posterior identificação do touro, da propriedade que se encontra e do proprietário
seguindo então a avaliação externa do animal, sua integridade física, sua idade, sua
aptidão (para produção de leite ou para produção de carne), sua conformação e seu
desenvolvimento corporal (ver figura 5).
FIGURA 5: Touro submetido ao exame andrológico
Com o animal preso em um brete de contenção procedia-se o exame clinico
geral, através da inspeção rápida dos sistemas, principalmente digestivo, locomotor,
respiratório e circulatório.
O exame do sistema genital, principalmente do escroto, testículos, epidídimos,
prepúcio e pênis é feito através da inspeção e palpação, verificando a presença ou
ausência do órgão, dimensão, consistência, simetria e mobilidade dos órgãos,
avaliando-se a sua compatibilidade com o desenvolvimento corporal e idade, e
verificação da existência de lesões ou outros tipos de anomalias.
O escroto é avaliado com o animal em estação e por palpação, verificando-se
mobilidade, sensibilidade, temperatura e presença de lesões. O testículo ainda é
avaliado em sua forma, simetria, consistência, posição e mobilidade. O prepúcio
também é um órgão examinado e considera-se a situação da pele e tecido subcutâneo,
volume, temperatura e existência de lesões. O pênis avaliado, retraído e exposto (após
excitação sexual), em seu tamanho, mobilidade e presença de anomalias.
No exame andrológico também era avaliado a índole e comportamento sexual
do touro. Utilizando-se vacas em cio, é verificada a manifestação dos sinais de
interesse e excitação do touro.
A coleta do sêmen para avaliação, feita principalmente através do uso de
vagina artificial e vaca em cio como manequim para monta, porém, quando não se
conseguia efetuar a coleta por este método, utilizava-se o eletro-ejaculador (ver figura
6 e 7).
FIGURA 6: Coleta sêmen com auxilio do eletro-ejaculador introduzido no reto do animal
FIGURA 7: Eletro-ejaculador utilizado para coleta do sêmen bovino
No uso da vagina artificial, prende-se a vaca em cio, para servir de manequim
na monta do touro, e apresenta-se o touro. Quando este monta na vaca, desvia-se o
pênis para a vagina artificial e procede-se a coleta do ejaculado.
Com auxilio do eletro-ejaculador o touro é preso no brete e introduz-se o
eletrodo bipolar no reto do animal; coleta-se o sêmen em um copo coletor (ver figura 6
e 7). O eletro-ejaculador utilizado era automático, passando as correntes elétricas em
modo automático ou manual, dependendo do operador. No modo automático, o eletro-
ejaculador passa as correntes automaticamente e estimula à ejaculação, no modo
manual, o operador aplica correntes elétricas rápidas de aproximadamente 200 mA por
2 a 3 segundos, aumentando a intensidade e o tempo de intervalo progressivamente.
Logo após a coleta o sêmen era submetido à avaliação sendo que no exame
imediato avaliava-se o volume, aspecto e cor do sêmen. Sob microscópio era avaliado
a motilidade, o vigor e o movimento de massa dos espermatozóides sendo avaliado de
forma subjetiva. A motilidade é expressa em porcentagem (%) – de 0 a 100% - e o
vigor é expresso de zero a cinco, de acordo com a velocidade do movimento
progressivo (Ver figura 8).
FIGURA 8: Sêmen bovino avaliado sob microscópio - avaliação da motilidade e vigor.
O sêmen diluído em formol salino e sob câmara de Neubauer sendo
determinada à concentração espermática (ver figura 9). Para a determinação da
concentração, utiliza-se a fórmula recomendada pelo manual de exames andrológicos
do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal:
A = Número de espermatozóides contados;
B = Fator de diluição (Ex. 1:200 = 200; 1:100 = 100);
N = Número de quadrados grandes contados, superfície contada;
1/10 = altura da câmara.
Logo em seguida confeccionava-se um esfregaço em lâmina para coloração e
avaliação morfológica dos espermatozóides.
Na avaliação morfológica são verificados os espermatozóides e classificados
os seus defeitos conforme a estrutura afetada (acrossomo, cabeça, peça intermediaria e
cauda). O esfregaço em lâmina é corado seguindo o método de eosina-nigrosina e
analisado sob imersão em aumento de 1.000 a 2.000x em microscopia de campo claro.
No laboratório são contadas aproximadamente 200 células por lâmina preparada e feita
à porcentagem dos defeitos encontrados.
Ainda é realizada a avaliação de partida de sêmen congelado, este vindo de
central de inseminação, para elaboração de laudo técnico veterinário, este sêmen era
submetido à avaliação, pós descongelamento, de motilidade, vigor e movimento em
massa, a concentração era determinada e o prosseguia-se também o exame
morfológico sobre lamina corada, na mesma maneira como citado anteriormente. O
sêmen era submetido a teste de termo-resistência lento e teste de termo-resistência
estressado. O teste de termo-resistência consistia em deixar a amostra por cinco horas
em banho-maria a 38ºC e avaliar o vigor e a motilidade (ver figura 9). O teste de
termo-resistência estressado consiste em deixar a amostra em banho-maria a 38ºC por
cinco horas e depois transferir para geladeira a 5ºC e avaliar no outro dia, após 24
horas.
FIGURA 9: Microscópico e câmara de Neubauer para determinação da concentração espermática.
6. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS – REVISÃO
DE LITERATURA
Sendo uma ferramenta de significativa importância na exploração zootécnica
na pecuária brasileira, a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos vem sendo
utilizada para acelerar a produção de animais geneticamente superiores, constituindo
uma fonte alternativa de embriões em programas de transferência de embriões (TE)
(ALVES et al., 2001).
Empregada primeiramente como instrumento de pesquisa fundamental, para
estudar fenômenos fisiológicos relacionados aos gametas masculinos e femininos, o
que permitiu uma melhor elucidação dos fenômenos de crescimento, maturação e
fecundação de oócitos, da capacitação espermática, bem como do desenvolvimento
embrionário precoce e de seus mecanismos de regulação (GONÇALVES et al, 2008).
A PIV vem sendo utilizada em programas comerciais e apresenta resultados
razoáveis, tendo grande variação em relação à taxa de clivagem e produção de mórulas
e blastocistos (COELHO et al., 2000). A técnica de produção in vitro além de baixa
eficiência, apresenta embriões de qualidade inferior quando comparados aos embriões
produzidos in vivo (GONÇALVES et al., 2008).
A taxa de blastocistos, prenhez e criopreservação obtidas a partir de oócitos
maturados e fecundados in vitro são inferiores às obtidas em produção in vivo,
provavelmente pela incompleta maturação citoplasmática do oócito, que reflete na
capacidade de desenvolvimento embrionário subseqüente (GONÇALVES et al.,
2008).
Palma (2008) afirma que a PIV apresenta vantagens sobre a inseminação
artificial (IA) e a superovulação, do ponto do vista que na PIV, esta não depende de
limites fisiológicos para responder a tratamentos como ocorre na superovulação, isto é,
a PIV é uma técnica que permite produzir embriões cujas doadoras não respondem a
tratamentos superovulatórios.
As limitações desta biotecnologia estão relacionadas com as inter-relações
potenciais do embrião com ambiente e meio durante o cultivo, sendo relacionado à
composição do meio e o suplemento protéico (PALMA, 2008). Os diferentes
protocolos utilizados tornam a técnica muito variável, tanto na pesquisa como em
programas comerciais. Ocorre também a variação individual dos animais, condições de
manejo nos quais estes estão submetidos e ao sistema de cultivo utilizado para a
produção dos embriões como citado anteriormente (SILVA, 2006).
Para o aumento da eficiência da técnica de produção in vitro, Gonçalves et al.
(2008) sugerem o aperfeiçoamento e a simplificação das condições de cultivo durante
as varias etapas do processo, principalmente no que se refere à maturação
citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro.
Oócitos bovinos podem ser obtidos in vitro por meio de punção folicular ou de
dissecação folicular de ovários provenientes de abatedouro ou in vivo por meio de
laparotomia ou de laparoscopia via flanco e ainda por laparoscopia ou por ultra-
sonografia via vaginal (GONÇALVES et al., 2008). Com a incorporação da punção
folicular em fêmeas vivas (ovum pick-up, OPU) tornou a ser uma vantagem na PIV e
estabeleceu um ponto de partida exitoso nos programas de produção de embriões
(PALMA, 2008).
As etapas que compreendem a produção in vitro de embriões bovinos são a
maturação dos oócitos, a capacitação dos espermatozóides, a fecundação dos oócitos e
o cultivo dos zigotos até o estádio de mórula ou blastocisto. Sendo de execução
razoavelmente fácil, vários fatores podem interferir no processo e afetar os índices de
sucesso da PIV (BERNARDI, 2005).
Depois de recuperados os oócitos, três passos biológicos que ocorrem in vivo
são realizados em laboratório para a produção de embriões: maturação in vitro (MIV)
dos oócitos, fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) (BUENO &
BELTRAN, 2008). Esses três principais eventos compreendem uma série de processos
fisiológicos, muitos dos quais são desconhecidos, sendo que cada um pode ser o êxito
ou o fracasso do processo seguinte (MUCCI et. al, 2006).
O cultivo in vitro de embriões bovinos termina com a transferência para as
receptoras, com os embriões nos estágio de mórulas ou blastocisto ou a
criopreservação da estrutura (VARAGO et al., 2008).
Embora a PIV tenha se desenvolvido ao longo das últimas décadas, sua
eficiência é relativamente baixa, apenas 30-40% dos oócitos bovinos maturados,
fecundados e cultivados conseguem se desenvolver até o estádio de blastocisto e
dentre estes, somente 30% chegam a termo após a transferência para receptoras
(GOTTARDI & MINGOTI, 2009).
Palma (2008) esquematiza a produção in vitro de embriões bovinos conforme
a ilustração abaixo.
FIGURA 10: Esquema de produção in vitro de embriões bovinos
FONTE: Palma (2008)
6.1 ASPIRAÇÃO DOS FOLÍCULOS
In vivo a principal técnica de aspiração folicular é pelo método transvaginal
guiado por ultra-sonografia (OPU), técnica esta que permitiu a disseminação das
biotecnologias e maior rapidez nos programas de melhoramento genético de rebanho
bovinos (PONTES, 2009). A possibilidade de produzir descendentes geneticamente
superiores em curto espaço de tempo e a precisão na seleção evidenciam a eficácia do
uso da OPU e da PIV. Essas biotecnologias progrediram deste o melhoramento
genético do rebanho em curto prazo, bem como para o tratamento de infertilidade de
doadoras impossibilitadas de produzir embrião (WAGTENDONK-DE LEEUW,
2006).
In vitro, a forma mais utilizada e relativamente simples, é a aspiração de
folículos de ovários provenientes de abatedouros com emprego de sistema dotado de
bomba a vácuo, ou diretamente com seringas (PALMA, 2008). Em ovários
provenientes de abatedouros Gonçalves et al. (2008) sugerem o uso de solução salina a
0,9% de NaCl, ou solução salina fosfatada tamponada (PBS) aquecida a 35ºC para o
transporte.
Palma (2008) propõe que os COCs aspirados com o liquido folicular devem
ser coletados em tubos estéreis de 10 ml e postos para decantar por aproximadamente
10 minutos, com exceção de aspiração feita com auxílio de seringas. A pressão
utilizada no sistema de aspiração com bomba a vácuo pode variar conforme o tamanho
das mangueiras utilizadas, mas que geralmente ficam em torno de 90 a 150 mm Hg ou
20 – 40 ml por minuto. Sendo que com a seringa a punção deve ser de 5 a 10 ml.
Gordon (2003) relata da vantagem da aspiração folicular em quesito de
velocidade de operação, o que se torna importante em unidades ou laboratórios de
produção comercial de embriões, porém é importante levar em consideração a
qualidade, há pouco mérito na velocidade das operações quando resulta em COCs de
qualidade baixa.
Na produção in vitro de embriões bovinos, os oócitos aspirados do interior dos
folículos são de diâmetro de 2 a 8 mm, fase em que estão antes da divergência
folicular (GONÇALVES et al. 2008). O oócito no interior do folículo se encontra em
repouso na prófase da primeira divisão meiótica, ou seja, em vesícula germinal
(RAUBER et al.2003). Esses oócitos segundo Antoniolli (2005) mantém-se
estagnados dentro do folículo devido a fatores inibitórios do mesmo ainda
desconhecidos. Depois que são removidos do interior do folículo, estes oócitos
meioticamente competentes reiniciam espontaneamente o processo de meiose, sendo
que uma parte desse não adquire a plena competência citoplasmática (BARRETTO,
2007).
Os oócitos menores de 2 mm não são competentes para reiniciar a meiose e os
maiores de 8 mm geralmente se encontram em processo de atresia ou maturação. Em
ambos os casos a viabilidade é comprometida (GONÇALVES et al. 2008). Os oócitos
puncionados de folículos menores que 1 mm de diâmetro podem reiniciar a meiose
quando cultivados in vitro, porém somente oócitos obtidos de folículos maiores que
2mm são capazes de atingir o estádio de metáfase II (BARRETTO, 2007).
Sirard et al. (2006) afirma que a capacidade de sustentar a primeira semana de
desenvolvimento embrionário é claramente influenciado pelo status folicular a partir
do qual o oócito é obtido.
6.2 SELEÇÃO DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS
Os complexos cumulus-oócitos (COCs) aspirados para a produção in vitro
variam em sua aparência (aspecto do citoplasma e das células do cumulus) e em sua
morfologia (PALMA, 2008). Os oócitos aspirados na PIV são obtidos de folículos de
diferentes etapas do desenvolvimento e em fases distintas do ciclo estral, portanto,
expostos a diferentes concentrações de estradiol, progesterona, LH e FSH, fatores estes
que podem vim a afetar a competência oocitária para o desenvolvimento embrionário
in vitro (CASTILHOS et al., 2007).
Os COCs classificados de grau I ou II, de boa qualidade, são aqueles que estão
rodeados por células do cumulus compacta de cor uniformemente marrom escuro. Essa
células são importantes uma vez que regulam a maturação citoplasmática do oócito nas
ultimas etapas do desenvolvimento in vitro. Outro fator de significativa importância é
que estas células do cumulus melhoram a fecundação na maioria das espécies
mamíferas, com exceção da espécie humana (PALMA, 2008).
Para a seleção dos COCs são avaliados os parâmetros morfológicos, tais
como: a morfologia do ooplasma e do cumulus, o tamanho do folículo e ovócito, e o
grau de atresia folicular. Os COCs com massa de cumulus compacta, com numerosas
camadas de células e com um ovócito de ooplasma homogêneo apresentam maior
capacidade de desenvolvimento (CALADO et. al. 2005).
QUADRO 3: EFEITOS POSITIVOS DAS CÉLULAS DO CUMULUS
SOBRE A FECUNDAÇÃO
• Aumenta o número de espermatozóides fecundantes ao redor do ovócito, através de
atividade quimiotática;
• Estabelece um microambiente que facilita a capacitação espermática e penetração,
através da secreção de fatores e modelação da tensão de oxigênio e pH;
• Protege o oócito mudanças desfavoráveis, como o endurecimento prematuro da zona
pelúcida que produzira uma menor penetração espermática;
FONTE: Palma (2008)
Na prática Palma (2008) recomenda a seleção de COCs que possuem um
cumulus denso, com 3 a 6 camadas de células que cobrem toda a superfície do oócito e
que o citoplasma seja de cor marrom ou cinza escuro e uniforme.
QUADRO 4: CRITÉRIOS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE OÓCITOS BOVINOS
Categoria COC
1 Cumulus compacto com várias camadas de células; ooplasma homogêneo; COC
transparente em sua totalidade.
2 Cumulus compacto com várias camadas de células; ooplasma homogêneo, mas
com aparência mais escura na periferia do oócito; COC transparente ou
ligeiramente mais escuro.
3 Cumulus compacto com poucas camadas; ooplasma irregular e escuro; COC mais
escuro que 1 e 2.
4 Cumulus expandido; células do cumulus espalhadas e escuras; ooplasma irregular
e escuro; COC irregular e escuro.
FONTE: Gordon (2003)
QUADRO 5: CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DE COCs E OÓCITOS
De Loos y col. (1989 y 1991) – Cumulus e oócito
Classificação Critérios
1
2
3
4
Cumulus com camadas múltiplas;
Cumulus Compacto;
COC de cor clara e transparente;
Citoplasma Homogêneo;
Cumulus com 1 ou mais pontos escuros e menos transparente;
Citoplasma com granulação mais grossa e mais escura na periferia que em 1;
Cumulus menos compacto, mas escuro que 1 e 2;
Com Manchas escuras;
Cumulus expandido;
Según Hawk y Wall (1994) – Cumulus y ovócito
Bom
Regular
Ruim
Cumulus com múltiplas camadas, compacto e translúcido
Citoplasma com granulação fina, densa e uniforme.
Cumulus ligeiramente expandido, com menor número de camadas que podem cobrir
a zona pelúcida, granulosa e granulações ligeiramente mais grossas;
Cumulus parcialmente expandido e disperso;
Rede de união nas células do cumulus;
Ovócitos pequenos ou grandes, ovócitos desnudos;
Cumulus escuro (marrom escuro);
Citoplasma de cor muito claro ou escuro;
Citoplasma regular com áreas claras ou escuras.
FONTE: Palma (2008)
Gonçalves et al (2008) apresentam a classificação com escala de 1 a 4,
considerando as características do cumulus (cobertura do oócito) e do citoplasma do
oócito (ooplasma).
• Qualidade 1 – cumulus compacto presente, com mais de três camadas de
células. Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o
interior da zona pelúcida e de coloração marrom.
• Qualidade 2 – cumulus compacto parcialmente presente em volta do
oócito ou rodeando-o por completo, com menos de 3 camadas
celulares. Ooplasma com granulações distribuídas de modo
heterogêneo, podendo estar mais concentradas no centro e mais claras
na periferia, ou condensadas em um só local aparentando uma mancha
escura. O ooplasma preenche o espaço do interior da zona pelúcida.
• Qualidade 3 – Cumulus presente, mas expandido. Ooplasma contraído,
degenerado, vacuolado, ou fragmentado, com espaço entre a membrana
celular e a zona pelúcida, preenchendo irregularmente o espaço
perivitelino.
• Qualidade 4 – oócito desnudo sem células do cumulus.
O diâmetro dos ovócitos esta relacionado a sua capacidade para retornar a
meiose. Os oócitos menores que 110 µm ainda que ativos, possuem um valor reduzido
na capacidade de retornar a meiose. Os oócitos de pequeno tamanho e com zona
pelúcida de pouca espessura tendem a uma maturação meiótica anormal, tendo
problemas na maturação, fertilização e clivagem. (GORDON, 2003).
6.3 MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
No folículo pré-ovulatório de uma vaca cíclica, o oócito in vivo inicia a
maturação com a presença da onda do hormônio luteinizante (LH), para atingir o
estagio desde prófase I a metáfase II em aproximadamente 20-24h (Palma, 2008). Os
oócitos meioticamente competentes mantidos em estádio de vesícula germinativa (VG)
no ambiente folicular é mantido ate que ocorra o pico de LH o qual estimula a
maturação oócitaria (BARRETTO, 2007).
In vitro o início da meiose ocorre espontaneamente no momento em que o
oócito é separado do folículo não ovulatório (2-8 mm) e alcança a metáfase II em 18-
24 horas de cultivo (PALMA, 2008). Varago et. al. (2008) afirmam que o fator que
inibe a maturação oócitaria esta presente no folículo, pois este desaparece com a
remoção do oócito do ambiente folicular e inicia seu desenvolvimento.
Palma (2008) divide a maturação dos oócitos em 3 níveis:
• Maturação meiótica.
• Maturação citoplasmática.
• Maturação molecular.
A maturação envolve transformações nucleares, citoplasmáticas e
moleculares, todas ligadas a uma série de mudanças estruturais e bioquímicas isto faz
com que o gameta feminino se torne apto a ser fecundado e a completar seu
desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2008). A maturação engloba os
eventos que permitem o oócito expressar seu máximo potencial de desenvolvimento
após a fecundação (BARRETTO, 2007).
As alterações oocitárias de maturação são nucleares e citoplasmáticas, entre as
nucleares incluem-se: quebra da vesícula germinativa (GVBD), desaparecimento do
nucléolo, condensação da cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e
formação do segundo fuso meiótico. As alterações citoplasmáticas são: redistribuição
das organelas intracelulares (mitocôndrias migram para posição perinuclear e grânulos
corticais depositam-se abaixo da membrana vitelina) e maturação dos mecanismos de
liberação de cálcio (Ca²+) (BARRETTO, 2007).
Na retomada da meiose, o oócito avança para metáfase, anáfase I (AI) e
telófase I (TI), momento que ocorre a extrusão do primeiro corpúsculo polar. Então o
desenvolvimento cessa em metáfase II (MII), a conclusão da meiose ocorre então com
a penetração do espermatozóide, ou seja, com a fecundação ocorre a ativação oócitaria
que é acompanhada pela extrusão do segundo corpúsculo polar para o espaço
perivitelinico (VARAGO et. al, 2008).
Para a conclusão da primeira divisão meiótica in vitro de oócitos bovinos o
tempo varia de 18-24 horas, sendo o primeiro evento, o rompimento da vesícula
germinativa, ocorre entre 7 e 12 horas após o inicio do cultivo, enquanto a metáfase I
(MI) ocorre entre 12 e 15 horas. A anáfase I e a telófase I ocorrem entre 15 e 18 horas
e a metáfase II (MII) a partir de 18 horas, sendo que mais de 95% dos oócitos
apresentam bloqueio em MII entre 22 a 24 horas de cultivo (BERTAGNOLLI et al.
2004).
Avaliando ao microscópio, o primeiro sinal da retomada da meiose é a
dissolução da membrana nuclear, extrusão do primeiro corpúsculo polar e a formação
do segundo fuso meiótico posteriormente de ocorrer o amadurecimento do oócito e
expansão das células do cumulus (GORDON, 2003). A expansão das células do
cumulus na superfície do oócito indica e coincide com a retomada da meiose
(BARRETTO, 2007).
As células ao redor do oócito, chamadas de células da granulosa, que formam
o complexo cumulus-oócito (GONÇALVES et al., 2008), são importantes para
assegurar ao oócito sua completa maturação, sob as condições de cultivo em
laboratório, sendo avaliadas as características morfológicas para o processo seguinte
(GORDON, 2003).
Durante a maturação as células do cumulus desenvolvem importantes funções
no crescimento, divisão meiótica e na maturação citoplasmática do oócito. Essas
células do cumulus exceto as do mural tornam-se suspensas em uma matriz de muco
durante a maturação, permanecendo separadas em conseqüência do acumulo desse
muco o qual é rico em acido hialurônico, esse acido sintetizado pelas células do
próprio cumulus induzem sua expansão ou mucificação durante a maturação
(GONÇALVES et al, 2008).
FIGURA 11 : A.) COCs selecionados para maturação in vitro. B.) COCs após o período de maturação com as células do cumulus expandidas
FONTE: Gordon (2003)
A primeira modificação do núcleo visível ao microscópio é a condensação da
cromatina e a dissolução da membrana nuclear, processo conhecido como ruptura da
vesícula germinativa. A ultima manifestação da maturação nuclear coincide com o
final da meiose e presença de 2 corpúsculos polares (PALMA, 2008).
FIGURA 12: Rompimento da vesícula germinativa
FONTE: Gordon (2003)
QUADRO 6: ETAPAS QUE CARACTERIZAM A CAPACIDADE DO OÓCITO
• Alcançar a meiose;
• Dividir-se depois da fecundação;
• Desenvolvimento a blastocisto;
• Induzir a prenhes;
• Desenvolvimento fetal até nascimento.
FONTE: Palma (2008).
QUADRO 7: FATORES QUE AFETAM A MATURAÇÃO IN VITRO
DOS OÓCITOS E DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES
• Origem dos oócitos se estes provem de folículos grandes ou pequenos, estado
cíclico da fêmea, estado nutricional, etc.
• Saúde e integridade do folículo: atresia, dominância, estado sexual e
nutricional;
• Comunicação entre o oócito e as células do cumulus;
• Estimulação do folicular;
• Condições de cultivo in vitro.
FONTE: Palma (2008).
Depois de maturados, os oócitos permanecem em metáfase II até a fecundação
ou a ativação partenogenética, provavelmente por ação de fatores citostáticos (CSF)
(BETAGNOLLI et al. 2004). Após a conclusão da maturação nuclear e citoplasmática
o oócito esta competente para ser fecundado e para o desenvolvimento embrionário.
Uma inadequada maturação, tanto nuclear como citoplasmática, inviabiliza a
fecundação e aumenta a ocorrência de polispermia, de partenogênese e de bloqueio de
desenvolvimento embrionário (VARAGO et. al, 2008).
6.3.1 Meios de cultivo e suplementos para maturação in vitro de embriões de
bovinos
A habilidade do oócito para se tornar um embrião e eventualmente um
bezerro, é adquirida durante sua diferenciação progressiva na foliculogênese, processo
que culmina em um estado de competência de desenvolvimento, conhecido também
por capacitação do oócito (GORDON, 2003).
O meio de cultivo tradicional e mais utilizado na maturação dos oócitos
bovino é o Tissue Culture Medium 199 (TCM-199), composto por sais Earle’s com
HEPES e bicarbonato, como estabilizadores de pH, suplementado com piruvato,
lactato, vitaminas, aminoácidos, purinas, proteínas (albumina bovina ou soro de vaca
em estro) (PALMA, 2008). Com o uso do soro como componente e este por conter
varias substancias ativas (hormônios, aminoácidos, proteínas, fatores de crescimento,
etc.), torna-se difícil saber a medida da resposta do oócito frente à presença ou
ausência de substâncias não identificadas em tais suplementos (GORDON, 2003).
A desvantagem do uso de soro de vaca no estro (SVE) vem do fato da
indefinição de seus componentes, pois, além de conter estrógenos, o soro pode conter
outras substâncias estimuladoras e/ou inibidoras da maturação oócitaria, além disso, o
uso do SVE impossibilita o conhecimento exato da concentração hormonal utilizada e
os resultados podem ser influenciados pela partida do soro (COELHO et al., 2002).
O TCM é usado por muitos dos principais laboratórios como meio de
maturação in vitro para oócitos bovinos, sendo modificado de acordo com cada um,
geralmente adicionado de piruvato, lactato, aminoácidos, bicarbonato de sódio,
vitaminas entre outras substancias. A suplementação com o hormônio folículo
estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH) são essenciais, enquanto a
suplementação de estrógenos nos meios MIV é opcional e varia conforme o
laboratório (VARAGO et.al, 2008). Os hormônios LH e FSH promovem uma melhor
expansão nas células do cumulus oophorus, sendo que o FSH estimula a produção de
substâncias sinalizadoras pelas células somáticas, que induzem a retomada da meiose
e, portanto, facilitam a fertilização (GOTTARDI & MINGOTI, 2009).
As fontes protéicas de origem animal mais utilizadas nos meios de maturação
são o soro fetal bovino (SFB) e a albumina sérica bovino (BSA), porem, esses
suplementos possuem componentes como fatores de crescimento, aminoácidos e
proteínas, as quais variam significativamente (VARAGO et al, 2008). O Soro, um
componente de origem biológica, utilizado em inúmeros protocolos da PIV, fornece
nutrientes e fatores ainda pouco conhecidos, e há sempre o risco da introdução de
agentes patogênicos nas etapas do processo que o utilizam (MOZZAQUATRO, 2004).
Pontes (2009) vincula o SFB a alterações no metabolismo embrionário, como
o rompimento da estrutura mitocondrial, desenvolvimento de grandes vesículas de
lipídios, alterações da estrutura embrionária, modificações na expressão gênica e
formação prematura de blastocele.
Apesar do avanço tecnológico nos métodos de coleta e principalmente
processamento do soro, não se tem a completa eliminação de contaminantes exógenos,
e certas viroses podem permanecer, sendo que a inativação pelo calor ou radiação
gama não são inteiramente eficazes na eliminação da contaminação vírica (FIGUEIRÓ
et al., 2004). O uso de soro de égua em estro, utilização de soro heterólogo, na PIV de
embriões bovinos é citado como uma alternativa para evitar a transmissão de doenças
espécie-específica (FIGUEIRÓ et al., 2000).
Nos meios de cultura varias proteínas são adicionadas e desempenham papel
importante, tais como: redução da embriotoxicidade do suplemento ou de produtos do
metabolismo embrionário, fonte básica de necessidades nutritivas do embrião, fonte de
fator de crescimento, promoção do desenvolvimento direta ou indiretamente do
embrião através da proliferação das células do cumulus (ECKERT & NIEMANN,
1995).
Coelho et al. (2002) afirmam que a adição de estradiol no meio de maturação
melhora tanto a maturação nuclear como promove a síntese do fator de crescimento do
pronúcleo masculino em oócitos imaturos submetidos à maturação e fecundação.
Muitos estudos vêm sendo desenvolvido ao longo dos anos na busca de um
protocolo definido para identificação da composição exata dos meios com objetivo de
evitar variabilidade nos resultados. Porém, tais protocolos não viabilizam a obtenção
de taxas embrionárias superiores aos protocolos que utilizam fontes de proteínas
animais (MOZZAQUATRO, 2004).
6.4 FECUNDAÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Palma (2008) descreve a fecundação in vitro (FIV) como sendo o
procedimento do qual os oócitos maduros são cultivados junto com os
espermatozóides e fecundados.
Sendo um processo complexo, resultando na união do espermatozóide e do
oócito, sinaliza o início da transição de oócito para embrião é também um processo no
qual o óvulo é ativado e pode ser considerado um evento obrigatório para o início do
desenvolvimento após a fecundação (GORDON, 2003).
Para o sucesso da FIV esta requer a preparação adequada de ambos os
gametas, assim como meios de cultivo e condições favoráveis para que ocorra a
fertilização (GORDON, 2003).
6.4.1 Capacitação espermática
A capacidade fecundante dos touros pode ser definida como o sucesso do
espermatozóide em fecundar o oócito, resultando na formação do zigoto, seguindo um
desenvolvimento embrionário e fetal até o nascimento (WATANABE & OLIVEIRA
FILHO, 2000).
Os espermatozóides de mamíferos após serem ejaculados não possuem
habilidade para fecundação, mesmo estando móveis e com morfologia aparente
normal. A capacidade de adquirir a competência para fecundar é denominada
capacitação espermática. In vivo, a capacidade fecundante é completada quando o
espermatozóide atinge o trato genital da fêmea (BALL & PETERS, 2004). Sendo uma
célula altamente especializada, o espermatozóide precisa se tornar capaz para fertilizar
o oócito, para isso precisa sofrer uma serie de alterações bioquímicas atingindo um
estado denominado capacitação (PONTES, 2009).
Ball & Peters (2004), dizem que a capacitação espermática envolve mudanças
e alterações enzimáticas e estruturais, principalmente na parte anterior do acrossoma e
da membrana da cabeça do espermatozóide, tais alterações são:
1. Aumento na permeabilidade do cálcio;
2. Alterações da estrutura da membrana;
3. Ativação da enzima adenil-ciclase;
4. Conversão de proteínas.
Na FIV, os espermatozóides precisam estar capacitados, isto requer uma
seleção e recuperação de espermatozóides móveis, com formas normais, livres de
contaminantes do plasma seminal (COELHO et al, 2000). Para a fecundação in vitro
de oócitos bovinos, grande parte dos laboratórios utilizam sêmen congelado, porém
após o descongelamento é necessário selecionar os espermatozóides vivos e aptos a
fecundar (VARAGO et.al, 2008). Camargo et al. (2002) afirmam que há grande
variabilidade entre touros durante a fecundação in vitro.
Coelho et al. (2000) indicam vários métodos utilizados para a separação e
eliminação do plasma seminal e diluente da fração móvel do sêmen diluído e
descongelado, tais como: swin-up, separação por gradiente descontinuo de BSA,
filtração em coluna de sefadex/filtro de troca iônica, separação por gradiente
descontínuo de Percoll e lavagem mediante centrifugação.
Os dois métodos mais comumente utilizados para preparação de
espermatozóides para a FIV, em bovinos, são o gradiente de Percoll e o Swim-up
(migração ascendente) (RHEINGANTZ et al., 2002).
Gordon (2004) refere-se que umas das etapas da FIV é a seleção de
espermatozóides, uma prática comum nos laboratório é selecionar o esperma
descongelado com base no método de separação de Percoll. O método de separação de
Percoll refere-se a uma suspensão coloidal de partículas de sílicas revestidas com
polivinil pirrolidona (PVP).
Gordon (2003) atribui duas vantagens ao metodo de separação de Percoll, são
elas: os espermatozóides móveis foram efetivamente isolados e foram rapidamente
removidos do plasma seminal, células somaticas, células mortas e espermatozóides
morfologicamente anormais.
A separação por Percoll consiste na deposição dos espermatozóides em duas
ou mais camadas de soluções de Percoll em diferentes concentrações, sendo submetido
a centrifugação, a qual permite o fracionamento de subpopulações de espermatozóides
separando-os do diluidor e de outras celulas (RHEINGANTZ et al. 2002).
Em seu trabalho, Coelho et al. (2000) descrevem a técnica utilizada separação
de Percoll usando soluções de gradiente a 55% e a 90% de Percoll a 100%. No fundo
de um tubo cônico contendo previamente a solução de Percoll a 55%, adicionou-se a
solução de Percoll a 90% e, sobre as duas soluções, a amostra de sêmen depositada
delicadamente. O conjunto foi centrifugado a 200G durante 25 minutos, efetuaram-se
duas lavagens com meio TALP-SPERM sem cálcio nem glicose, suplementado com
cafeína e adicionado de sulfato de gentamicina para retirada do Percoll, o sedimento
foi ressuspenso em meio TALP-SPERM contendo heparina e posteriormente
incubado.
FIGURA 13: Preparação do sêmen com gradiente de Percoll
Fonte: Gonçalves et al., 2008
O método do Swim-up é baseado na tendência que os espermatozóides mais
móveis apresentam, de migrarem para cima após incubação em um meio apropriado,
geralmente o Tyrode com albumina, lactato e piruvato (TALP). Após o período de
incubação, os espermatozóides capacitados são retirados da fração superior do meio e
durante a migração ascendente desses espermatozóides. Ocorre também a remoção dos
fatores de decapacitação, diluentes e crioprotetores (RHEINGANTZ et al., 2002).
O meio TALP modificado é uma preparação contendo Tyrode, bicarbonato e
albumina bovina, ainda pode possuir lactato de sódio, fontes de energia, piruvato de
sódio (GORDON, 2003).
FIGURA 14: Método do Swin-up para obtenção de espermatozóides para FIV
FONTE: Gordon, 2003
A metodologia de separação por gradiente de Percoll resulta em recuperação
de espermatozóides móveis seis vezes maior que o do Swim-up, porém os
espermatozóides submetidos ao Swim-up penetram um maior número de oócitos,
aumentando as taxas de fecundação e clivagem, quando a mesma concentração de
espermatozóides é utilizada (PARRISH et al., 1995).
A concentração espermática e o tempo de incubação de oócitos são fatores de
elevada importância no sistema de fecundação in vitro. A concentração espermática
afeta a taxa de fecundação e clivagem em bovinos, tanto o excesso de espermatozóides
durante a fecundação como aumento do tempo de incubação entre os gametas podem
provocar aumento da incidência de polispermia (CAMARGO et al., 2002). Em geral a
concentração usada para a FIV é de 2 x 106 espermatozóides por ml, calculado de
acordo com a motilidade e concentração da fração viva de espermatozóides obtida
(BUENO & BELTRAN, 2008).
6.4.2 Fusão dos Gametas
In vivo a fecundação - união entre espermatozóide e oócito – ocorre na ampola
e essa fecundação requer 3 eventos críticos, sendo eles: 1) migração espermática entre
as células do cumulus oophorus; 2) união espermática e migração através da zona
pelúcida e 3) fusão das membranas plasmáticas do espermatozóide e do oócito
(HAFEZ & HAFEZ, 2004).
Quando o espermatozóide atravessa a zona pelúcida e se une as
microvilosidades da membrana plasmática do oócito, fase esta que se denomina fusão
dos gametas, a parte posterior da cabeça espermática se incorpora ao oócito por meio
de fusão das membranas, enquanto a parte anterior esta envolvido pela membrana do
oócito como se fosse uma fagocitose (PALMA, 2008).
A fecundação é completada (ver figura 15) com a fusão dos prónucleos
haplóides masculino e feminino, processo conhecido como singamia (BALL &
PETERS, 2004).
FIGURA 15: Fases da Fertilização.
Fonte: Hafez & Hafez (2004).
6.4.3 Meio de Fecundação in vitro de embriões bovinos
O meio de cultivo tem um importante papel na fecundação de embriões
bovinos in vitro (BHUIYAN et al., 2007). Este meio de cultivo deve permitir o
metabolismo do oócito e das células do cumulus e manter a função espermática
eficiente (GONÇALVES et al., 2008).
Muitos fatores no meio de cultivo contribuem para a interação bem sucedida
do oócito e espermatozóide para a fertilização in vitro. O meio TALP modificado sob
óleo mineral é amplamente utilizado como meio de fertilização por diversos
laboratórios (GORDON, 2003).
A adição de penicilamina, hipotaurina e epinefrina ao meio de fertilização
(TALP-FERT) é para aumentar a porcentagem de capacitação do acrossoma do
espermatozóide. Sabe-se que a hipotaurina combinada com adrenalina ou epinefrina,
aumenta a motilidade e a taxa de penetração do espermatozóide no oócito, outro fator
é que a hipotaurina mais adrenalina são capazes de limitar a formação de superóxido
que pode inibir a peroxidação lipídica na célula espermática (GORDON, 2003).
In vivo a fecundação ocorre no istmo e há presença de fluidos orgânicos, os
quais são viscosos e compostos por glicoproteinas que contribuem para subida do
espermatozóide e sua fusão com o oócito. In vitro, a viscosidade do meio é diferente
das secreções tubáricas. Na verdade o SFB e a BSA são componentes comum dos
meios de fecundação, fornecendo fonte de proteínas e aumentando a viscosidade, mas
não atinge os níveis presumíveis do liquido tubárico, onde medições precisas ainda
não estão disponíveis (COY et al., 2009).
6.5 CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
O oócito aspirado do folículo é competente segundo Sirard et al. (2006),
quando:
1. Possui habilidade para retomar a meiose;
2. Possui capacidade de clivar após a fecundação;
3. Possui capacidade de desenvolver até o estádio de blastocisto;
4. Possui capacidade de induzir uma gravidez e levá-la a termo;
5. Possui capacidade de desenvolver geneticamente a expressão de boa
saúde.
Após a fertilização, o óvulo começa a mitose, processo conhecido como
clivagem. Essa divisão continua até um grupo de células sólido ser formado, conhecida
por mórula, por volta de 5 – 6 dias. Do sexto dia após fertilização a mórula começa a
formar o blastocisto este constituído por uma única camada de células esféricas – o
trofoblasto (BALL & PETERS, 2004).
O cultivo in vitro corresponde ao período de desenvolvimento do oócito
fertilizado até o estádio de blastocisto, durante tal período ocorre ativação do genoma
embrionário, processo de divisão celular, compactação dos blastômeros no estádio de
mórula e inicio da diferenciação embrionária com a formação da blastocele (BUENO
& BELTRAN, 2008).
A primeira semana de desenvolvimento embrionário representa um momento
perigoso, neste intervalo ocorre o implante na parede uterina e estabelecimento da
prenhes. Este intervalo é conhecido como fase de pré-implantação ou desenvolvimento
de pré-fixação, este período culmina com a formação do blastocisto (WATSON &
BARCROFT, 2001).
FIGURA 16: Fases do desenvolvimento embrionário bovino.
FONTE: Gordon (2003).
O período de pré-implantação se caracteriza por clivagens sucessivas do
zigoto e estádio embrionários iniciais, ativação da transcrição embrionária e eventos
morfogenéticos de compactação e cavitação, que culminam com a formação do
blastocisto (LIMA & SOUZA, 2009).
Lima & Souza (2009) afirmam que o zigoto, estádio embrionário inicial,
difere do blastocisto, estádio embrionário final, em termos de morfologia e
características fisiológicas e bioquímicas. As principais alterações morfológicas que
ocorrem no embrião inicialmente são:
• A compactação dos blastômeros (mórula compacta);
• O desenvolvimento da blastocele (blastocisto inicial).
A compactação dos blastômeros se caracteriza por um aumento do contato
celular entre blastômeros, o qual permanece até o total desaparecimento dos limites
celulares individuais por meio de junções de adesão. O estádio de blastocisto é
caracterizado pela diferenciação de células do trofectoderma, que se localizam mais
externamente e circundam a blastocele, e pela formação da massa celular interna
(WATSON & BARCROFT, 2001).
7. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS –
RELATÓRIO
A produção in vitro de embriões bovinos (PIV) desenvolvida no laboratório
EMBRYOLAB, ao longo do estágio curricular para fins de pesquisas e estudos, se
inicia com a coleta dos ovários no frigorífico Silva, localizado na Rodovia Br 392, 100
km 8, Urlandia, na cidade de Santa Maria a aproximadamente 20 km do laboratório.
Os ovários provenientes do frigorífico são transportados em uma garrafa
térmica com solução fisiológia de NaCl (Cloreto de Sódio) a 9% acrescida de
penicilina G-potássica e a uma temperatura de aproximadamente 35º-37ºC. Desde o
horário da coleta a chegada ao laboratório, o tempo varia em torno de 1 a 2 horas.
Ao chegar no laboratório, os ovários são submetidos a uma lavagem com
álcool 70% e posterior enxágüe em solução fisiológica, ambos aquecidos previamente
a uma temperatura de aproximadamente 35 ºC (ver figura 17). Logo após esse
processo, os ovários são colocados no banho-maria em solução fisiológica a
aproximadamente 35º-37ºC, e então é realizada a punção folicular.
FIGURA 17: Banho dos ovários em álcool e solução fisiológica
7.1 ASPIRAÇÃO FOLICULAR
A aspiração dos folículos é realizada com auxílio de uma bomba a vácuo
conectadas a mangueira e tubo coletor, sendo a punção realizada com agulha tamanho
25mm x 8mm (21G). A pressão utilizada na bomba a vácuo é em torno de 20 ml por
minuto (ver figura 18).
Os folículos puncionados no laboratório são do tamanho de 2 – 8mm de
diâmetro, sendo os mais aspirados e recomendados os de 2 – 6 mm.
Após a punção dos complexos cumulus-oócitos (COCs) e liquido folicular em
tubos estéreis, estes são postos a sedimentar por 10 minutos a uma temperatura de
37ºC.
FIGURA 18: Aspiração folicular – aspiração dos folículos de tamanho entre 2-8 mm
7.2 SELEÇÃO DOS OÓCITOS BOVINOS
Após a sedimentação das estruturas celulares nos tubos é realizada a procura e
seleção dos oócitos sob lupa estereomicroscópica. Com auxilio de pipeta de Pasteur, o
sedimentado dos tubos é posto em placas de Petri e então feita a seleção.
Os oócitos selecionados segundo a avaliação de De Loos (1989 citado por
PALMA, 2008) são os de grau I e II e raramente os de grau III.
A avaliação dos complexos cumulus-oócitos é subjetiva, selecionando os
COCs de melhor aparência, aqueles que possuam de 3-5 camadas de células do
cumulus, estas sendo compactas e sem vacúolos. Os oócitos devem ter o ooplasma
homogêneo e sem manchas enegrecidas (ver figura 20).
FIGURA 19: Seleção, lavagem e procura dos oócitos sob lupa
FIGURA 20: Complexos cumulus-oócitos
7.3 LAVAGEM DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS
O restante do líquido folicular é centrifugado para ser usado na lavagem dos
COCs. As estruturas são lavadas em placas de Petri pequenas (ver figura 19 e 21) ou
em gotas, quando o banho for em gotas utiliza-se de 4 a 6 gotas.
Posteriormente as estruturas são submetidas e lavadas com HEPES, para
retirar o liquido folicular, este sendo lavado em mais gotas, dependendo do operador,
sendo usados geralmente 5 a 8 gotas de HEPES por grupo de COCs.
FIGURA 21: Banho dos COCs em liquido folicular sob lupa
FIGURA 22: Oócitos selecionados no meio TCM-Hepes
7.4 MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
Após serem lavados em meio TCM-Hepes os COCs são transferidos para o
meio de maturação – TCM-199 – postos em placas Nunc de 4 poços (ver figura 26) e
então conduzidos a estufa de pressão, temperatura e umidade controlada (39°C, com
5% de CO2 em ar com umidade saturada,) por 20-24 horas aproximadamente (ver
figura 23).
Para a maturação foi utilizado de 20 – 25 COCs por poço da placa Nunc em
meio TCM-199 adicionado de piruvato de sódio, rFSH, LH e soro fetal bovino.
FIGURA 23: Estufa de pressão, temperatura e umidade controlada
FIGURA 24: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas
FIGURA 25: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas
FIGURA 26: Placa Nunc com meio de maturação
7.5 FECUNDAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
Concluída a maturação dos oócitos (ver figura 24 e 25), estes são avaliados
para constatar a maturação e não degeneração e/ou morte celular ou contaminação do
meio e então são transferidos para Placas Nunc com solução de TALP-FERT,
acrescido de Bovine Serum Albumin (BSA – albumina de soro bovino), de piruvato de
sódio, penicillaminea, hypotaurine, epinefrine (PHE) e de heparina. O meio é pré-
estabilizado na estufa de cultivo de uma a duas horas antes.
Para a fecundação in vitro (FIV) é utilizado sêmen de bovino congelado, em
palhetas de 0,25ml, este sendo descongelado por 30 segundos em banho-maria a 38ºC.
Após a adição do sêmen nos poços com os oócitos, estes vão para a estufa de
cultivo e permanecem em torno de 18 – 22 horas.
7.5.1 Capacitação espermática
A capacitação espermática no laboratório é feita pelo método de Swim-up. O
método desenvolvido consiste em depositar 1 mL de meio TALP-FERT em um tubo
cônico, fazendo vários tubos, aproximadamente 5 por palheta, deixar estabilizar em
banho-maria a 38ºC por 1 hora, deposita-se o sêmen no tubo com TALP-FERT
estabilizado (ver figura 27). O sêmen proveniente de palhetas congeladas é
descongelado a 38ºC por 30 segundos, avaliado a motilidade e vigor e então submetido
ao método (ver figura 28).
Após depositar o sêmen no meio aguardar 1 hora para que ocorra a migração
ascendente. Ao final do processo retira-se o sobrenadante de cada tubo tendo o
cuidado de não mexer o tubo e misturar o sobrenadante com o precipitado e não
aspirar a camada inferior (ver figura 29).
O sobrenadante dos tubos são postos para centrifugar por 10 minutos a 1200
rpm (ver figura 30), é retirado o pellet que se forma após a centrifugação,
homogeneizado e determinada a concentração espermática.
Para determinar a concentração espermática utiliza-se 5µL o qual é diluído em
95 µL de água tendo uma diluição de 1:20 e efetuada a contagem na câmara de
Neubauer.
A câmara de Neubauer é montada, adiciona-se o sêmen diluído nos dois lados
da câmara, e aguarda-se cinco minutos com a câmara em repouso na horizontal, para
que as células fiquem depositadas no fundo da mesma. Sob microscópio de campo
claro e objetivas de 10x e 40x, realiza-se a contagem de cinco quadrados grandes de
cada lado da câmara e divide-se por 2.
Para o calculo da FIV divide-se 400 µL (volume/poço) pelo numero de
espermatozóides contados nos dois lados da câmara. A dose inseminante utilizada nas
rotinas é de 1 a 2 x 106 de espermatozóides por mL.
FIGURA 27: Meio Talp-Sperm em banho-maria.
FIGURA 28: Avaliação da motilidade e vigor das palhetas de sêmen descongeladas
FIGURA 29: Retirada do sobrenadante do Swin-up
FIGURA 30: Centrifuga – centrifugação da fração do sobrenadante do Swin-up
7.6 CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Após a incubação dos oócitos/espermatozóides os possíveis zigotos são
desnudados, isto é, retirada as células do cumulus. Para isso é utilizado o método de
VORTEX que consiste em depositar meio TCM-HEPES em tubos cônicos e transferir
os possíveis zigotos para o mesmo, e então submetidos a agitação mecânica por 1,5
minutos com 20% de intensidade (ver figura 31).
O conteúdo do tubo é vertido em placa de Petri estéril, o tubo é lavado duas
vezes com meio TCM-HEPES depositando o conteúdo na mesma placa e então é
realizada a busca dos prováveis zigotos, estes são postos em uma gota do meio TCM-
HEPES e espera-se cinco minutos para que ocorra a sedimentação das células da
granulosa. Após estas etapas os zigotos são submetidos a banhos de TCM-Hepes,
então são transferidos para placas Nunc com meio SOFaa (Sintetic Oviduct Fluid), este
já estabilizado na estufa (ver figura 32).
Para o cultivo de possíveis zigotos, após a fecundação e o desnudamento, é
utilizado o meio SOFaa, este geralmente feito um dia antes - quando se prepara o meio
de fertilização - adicionado de Soro fetal bovino (SFB), aminoácidos essenciais e
aminoácidos não essenciais, sendo distribuído em aproximadamente 20 zigotos por
poço da placa Nunc, sob óleo mineral e levado a estufa de cultivo celular.
FIGURA 31: Possíveis zigotos submetidos ao vortex.
FIGURA 32: Busca dos possíveis zigotos e banho em gotas no meio TCM-HEPES.
7.7 AVALIAÇÃO DA TAXA DE ECLOSÃO E DOS EMBRIÕES
As avaliações ocorrem no dia 2 após a fertilização (D2) no dia 7 (D7) e no dia
9 (D9), considerando o dia da fertilização como dia zero (D0)
• Em D2 avalia-se a taxa de clivagem dos embriões.
• Em D7 avalia-se Blastocistos inicias (Bi), Blastocistos expandidos (Bx),
Blastocistos em eclosão (Bh) e Blastocistos eclodidos (Be).
• Em D9 avalia-se Bx, Bh e Be.
A avaliação leva em consideração o grau de desenvolvimento embrionário e
variações no desenvolvimento e aspecto morfológico das estruturas.
Avaliando-se o aspecto morfológico os principais parâmetros de qualidade,
sendo classificados de 1 a 5 – sendo 1 excelente e 5 degenerado - são:
• Formato;
• Simetria;
• Coloração;
• Extrusão celular;
• Integridade da zona pelúcida.
FIGURA 33: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D2
FIGURA 34: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D2
CONCLUSÃO
O período de estágio curricular obrigatório realizado no laboratório
EMBRYOLAB-UFSM, na área de reprodução de grandes animais, teve como objetivo
a aquisição de experiência nas atividades relacionadas à reprodução animal e aquisição
de conhecimentos das biotecnologias utilizadas academicamente e comercialmente.
O presente trabalho teve como enfoque a produção in vitro de embriões
bovinos e o exame andrológico em bovinos, ambos os temas de elevada importância
na formação de médicos veterinário que exercem a profissão na área de reprodução
animal.
A produção in vitro de embriões bovinos é utilizada em fins de pesquisas e na
reprodução de rebanhos elites por possuir um custo elevado. A busca constante de
aperfeiçoamento da técnica e por protocolos padronizáveis, tornam a técnica em
constantes pesquisas para melhoramento e usos na área comercial aumentando seu
índice de eficiência.
A eficiência reprodutiva de um rebanho é um fator determinante no
melhoramento genético e na sobrevivência econômica do pecuarista, por isso o exame
andrológico é de vital importância na carreira profissional uma vez que na reprodução
do rebanho um ponto chave é a avaliação do macho e de suas características passadas
para a prole. O médico veterinário deve dizer se o reprodutor está apto ou não para a
reprodução e avaliar as características do reprodutor.
A vivência profissional no estágio proporcionou um amplo crescimento do
conhecimento técnico-científico que permitiu com que o conteúdo visto em aula
pudesse ser posto em prática, e a aquisição de experiência profissional torna o estágio
curricular um quesito necessário na formação acadêmica de médicos veterinários.
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