UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE · formulações que amenizassem os problemas relacionados com a...

3

UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Marisol Souza Almeida de Oliveira

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO Cymbopogon citratus (DC)

Stapf., Piper aduncum (L) E Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass. SOBRE BACTÉRIAS

PERIODONTOPATOGÊNICAS

Governador Valadares

2010

Marisol Souza Almeida de Oliveira

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO Cymbopogon citratus (DC)

Stapf., Piper aduncum L E Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass. SOBRE BACTÉRIAS

PERIODONTOPATOGÊNICAS

Governador Valadares

2010

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências

Biológicas da Universidade Vale do Rio

Doce como pré-requisito para a obtenção

do grau de mestre.

Orientador: Anderson Assunção Andrade

Co-orientadora: Kênia Valéria dos Santos

4

À minha família, sem vocês eu não chegaria até aqui.

Ao meu esposo Farias, pelo amor e companherismo.

Aos meus queridos filhos, Lorenna, Sarah e João Paulo

pela paciência e compreensão as minha ausências.

Aos meus pais e aos meus irmãos, que sempre me apoiaram

e souberam me compreender.

5

AGRADECIMENTOS

A Deus que é luz e sabedoria no meu caminho, sempre me guardando e me dando força e

persistência para alcançar meu objetivo.

Agradeço a todas as pessoas que direta e indiretamente colaboraram para a realização deste

trabalho e de modo especial:

Ao meu orientador Prof. Dr. Anderson Assunção pela paciência, apoio, incentivo e

conhecimentos os quais foram muito importantes para a realização desse trabalho. Muito

obrigado por seu esforço, dedicação e principalmente por acreditar que eu seria capaz.

A Profª Drª Kênia Valéria dos Santos, minha Co-orientadora, pelo seu apoio, paciência e por

sua importante participação na finalização de trabalho.

À Profª Drª Alda Maria Soares Oliveira pela sua amizade, confiança e incentivo.

Ao Profº. Dr. Ezequias Pessoa de Siqueira Filho (Centro de Pesquisas René Rachou), ao

Profº. Dr. Rodrigo Loreto Peres (UNIVALE) e ao Profº. Dr. Luiz de Macedo Farias (UFMG)

pela colaboração na construção deste trabalho.

A Profª Ms. Carmen Helena Barbosa do Vale pelas importantes sugestões e ajuda na

realização da parte experimental do trabalho e em especial pela gentileza da acolhida em

Governador Valadares.

Aos funcionários do laboratório de Microbiologia da UNIVALE, em especial as biólogas

Elaine e a Adiléia que sempre estiveram prontas a me ajudar, a amizade de vocês fez toda a

diferença.

Aos alunos do curso de mestrado pela amizade durante o período de aulas do curso, em

especial à Tatiane e Vanessa, pelo apoio e a companhia. A caminhada ao lado dos amigos é

sempre mais alegre e mais suave.

MUITO OBRIGADA!

6

RESUMO

O uso de plantas medicinais como recurso terapêutico para o tratamento e cura de doenças é

tão antigo quanto a espécie humana. Para muitos pesquisadores, uma estratégia promissora e

menos dispendiosa para a obtenção de novos compostos antimicrobianos é buscar tais

compostos a partir de produtos de origem vegetal, por meio da etnofarmacologia. Desse

modo, o objetivo deste trabalho foi obter tais compostos a partir de extratos de espécies

vegetais com atividade antimicrobiana já demonstrada, contra espécies de bactérias

anaeróbias associadas às doenças periodontais. Inicialmente, foi avaliada a atividade

antimicrobiana dos extratos brutos de Cymbopogon citratus, Piper aduncun e Porophyllum

ruderale sobre linhagens ATCC de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium

nucleatum e Peptostreptococcus anaerobius. A atividade antimicrobiana dos extratos foi

determinada pelos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Bactericida Mínima (CBM), obtidos através das técnicas de macro e microdiluição. Para o C.

citratus foi avaliada também a atividade do extrato oleoso frente às linhagens das bactérias.

Todas as plantas utilizadas neste estudo demonstraram atividade antibacteriana contra

bactérias periodontopatogênicas. Entre as bactérias testadas, a P. anaerobius apresentou a

maior sensibilidade aos extratos das plantas. Observou-se que a sensibilidade do A.

actinomycetemcomitans e do F. nucleatum ao extrato oleoso de C.citratus foi maior quando

comparada ao extrato bruto da mesma planta. Estes resultados indicam que os extratos de C.

citratus, P. aduncun e P. ruderale, podem ser úteis no tratamento das doenças periodontais.

Palavras-chave: Doença periodontal, Plantas medicinais, Atividade antimicrobiana.

7

ABSTRACT

The use of medicinal plants as a therapeutic for the treatment and cure of disease is as old as

mankind. For many researchers, a promising and less costly to obtain new antimicrobial

compounds is to seek such compounds from vegetable products, through ethnopharmacology.

Thus, the objective was to obtain such compounds from extracts of plant species that have

demonstrated antimicrobial activity against species of anaerobic bacteria associated with

periodontal diseases. Initially, we evaluated the antimicrobial activity of crude extracts of

Cymbopogon citratus, Piper aduncun and Porophyllum ruderale on ATCC strains of

Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum and Peptostreptococcus

anaerobius. The antimicrobial activity of extracts was determined by the values of minimum

inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC), obtained

through the techniques of macro and microdilution. For C. citratus has also evaluated the

activity of the extract oily face the strains of bacteria. All plants used in this study showed

antibacterial activity against periodontopathic bacteria. Among the bacteria tested, P.

anaerobius showed increased sensitivity to plant extracts. It was observed that the sensitivity

of A. actinomycetemcomitans and F. nucleatum the oily extract of C. citratus was higher

when compared to crude extract of the same plant. These results indicate that extracts of C.

citratus, P. aduncun and P. ruderale may be useful in the treatment of periodontal diseases.

Key words: Periodontal disease, Medicinal plants, Antimicrobial activity.

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 – Fotografia da planta da espécie Cymbopogon citratus .......................................... 17

Figura 02 - Fotografia da planta da espécie Piper aduncum ..................................................... 18

Figura 03 - Fotografia da planta da espécie Porophyllum ruderale .......................................... 19

Figura 04 – Fotografia da Gengivite (a) e da Periodontite (b) .................................................. 21

9

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Métodos de obtenção dos diversos extratos utilizados no trabalho, para

cada espécie de planta e respectivos solventes............................................................. 37

Tabela 02 - Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida

mínima (CBM) dos extratos brutos de Porophyllum ruderale contra o crescimento

de P.anaerobius (Pa), F. nucleatum (Fn) e A. actinomycetemcomitans (Aa)

determinadas pela técnica de microdiluição em caldo ............................................... 38


mínima (CBM) de extratos brutos de Porophyllum ruderale contra A.

actinomycetemcomitans (Aa), F. nucleatum (Fn) e P. anaerobius (Pa) determinadas

pela técnica de macrodiluição em caldo ...................................................................... 39


mínima (CBM) dos extratos brutos de Cymbopogon citratus contra o crescimento

de P.anaerobius (Pa), F. nucleatum (Fn) e A. actinomycetemcomitans (Aa)

determinadas pela técnica de microdiluição em caldo ................................................. 40


mínima (CBM) de óleo essencial de Cymbopogon citratus contra

A.actinomycetemcomitans (Aa), F.nucleatum (Fn) e P.anaerobius (Pa) determinada

pela técnica de macrodiluição em caldo...................................................................... 40


mínima (CBM) dos extratos brutos de Piper aduncum contra o crescimento de P.

anaerobius (Pa), F. nucleatum (Fn) e A. actinomycetemcomitans (Aa), determinadas

pela técnica de microdiluição em caldo ................................................................... 41

Tabela 07 - Compostos voláteis majoritários identificados em extratos etanólicos e

hexânicos de folhas de Piper aduncum obtidos por diferentes métodos de extração... 42

10

LISTA DE ABREVIATURAS

ATCC American Type Culture Collection

BHI Caldo brain heart infusion

CBM Concentração bactericida mínima

CIM Concentração inibitória mínima

D.A.V Destilação por arraste a vapor

DMSO Dimetilsulfóxido

SPME Microextração em fase sólida

UFC Unidades formadoras de colônias

ml Mililitro

µl Microlitro

pH Potencial Hidrogeniônico;

11

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ................................................................................ 13

2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................... 15

2.1 Plantas Medicinais ............................................................................................................ 15

2.2 Doença Periodontal .......................................................................................................... 20

2.3 Periodontopatógenos ........................................................................................................ 22

2.4 Opções Terapêuticas ........................................................................................................ 24

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 28

3.1 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 28

4 METODOLOGIA ................................................................................................................ 29

4.1 Obtenção das Espécies Vegetais a Serem Estudadas .................................................... 29

4.2 Métodos de Extração – Preparo dos extratos de plantas .............................................. 29

4.2.1 Sonicação (Ultrassom) ................................................................................................... 29

4.2.2 Decocção (Refluxo) ........................................................................................................ 30

4.2.3 Maceração ...................................................................................................................... 30

4.2.4 Soxhlet ............................................................................................................................ 31

4.2.5 Turbólise ......................................................................................................................... 31

4.2.6 Destilação por arraste a vapor ( D.A.V.) ..................................................................... 32

4.3 Detecção dos Constituintes por Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria

de Massas ................................................................................................................................. 32

4.4 Testes Microbiológicos ..................................................................................................... 33

4.4.1 Amostras Bacterianas ................................................................................................... 33

4.4.2 Preparação das Suspensões Bacterianas ..................................................................... 33

4.4.3 Preparação dos Extratos ............................................................................................... 34

4.4.4 Determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) ................................. 34

4.4.4.1 Macrodiluição ............................................................................................................. 34

12

4.4.4.2 Microdiluição .............................................................................................................. 35

4.4.5 Concentração Bactericida Mínima (CBM) ................................................................. 36

5 RESULTADOS .................................................................................................................... 37

5.1 Porophyllum ruderale ........................................................................................................ 37

5.2 Cymbopogon citratus ......................................................................................................... 39

5.3 Piper aduncum ................................................................................................................... 41

6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 43

7 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 48

8 PERSPECTIVAS PARA CONTINUIDADE DO TRABALHO ..................................... 49

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 50

13

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

As plantas medicinais têm sido utilizadas durante séculos para tratar infecções e outras

doenças em seres humanos, mas os estudos clínicos controlados são escassos. Em alguns

casos, a medicina popular serve como base para o desenvolvimento de pesquisas sobre a

utilização das plantas, bem como sua segurança, toxicidade e eficácia terapêutica (COWAN,

1999).

A utilização das plantas medicinais também é bastante vantajosa quando se considera

a questão social, pois o acesso aos medicamentos industrializados é mais caro, estando assim

diretamente relacionado ao poder aquisitivo do indivíduo. Por outro lado, as plantas

medicinais são de fácil acesso, de baixo custo e aceitáveis do ponto de vista cultural, pois já

são cultivadas e utilizadas há muito tempo. Outro ponto marcante é o fato de muitas pessoas

terem as plantas como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde (MATU & VAN

STADEN, 2003).

A pesquisa de novos produtos a partir de fontes vegetais tem se mostrado promissora

para obtenção de novos princípios bioativos. A busca por novos compostos com efeito

antimicrobiano tem sido objeto de grande número de trabalhos, pois é crescente o

aparecimento de formas bacterianas resistentes aos compostos já existentes, decorrente,

sobretudo, do uso indiscriminado dos quimioterápicos antimicrobianos (SILVEIRA et. al.,

2007).

Na odontologia, como em outras áreas da saúde, o uso de antimicrobianos é muitas

vezes feito de forma empírica, favorecendo a prescrição indiscriminada destes compostos. Na

terapia das doenças periodontais, por exemplo, o controle do biofilme microbiano, através do

tratamento mecânico local, poderia, em muitos casos, resolver a infecção sem a necessidade

do uso de antimicrobianos (LOTUFO & PANNUTI, 2004; HEITZ-MAYFIELD et al., 2004).

Entretanto, para o tratamento destas infecções, por vezes são empregados medicamentos

bactericidas e de amplo espectro de ação como os nitroimidazóis, macrolídeos, lincosaminas,

tetraciclinas e penicilinas. Em conseqüência disso, vem crescendo significativamente o

número de relatos na literatura de bactérias anaeróbias obrigatórias resistentes a tais

compostos (GAETTI-JARDIM et al., 2007). Neste contexto, torna-se de grande relevância a

14

avaliação de extratos e substâncias bioativas, com aplicação direcionada para as infecções de

caráter anaeróbico com perspectivas para novas abordagens terapêuticas das periodontites.

A pesquisa de extratos de plantas medicinais de uso na região do Vale do Rio Doce e

Mucuri foi realizada durante anos por pesquisadores que constituíam o grupo de pesquisa

Bioplanta da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE). Dentre os vários trabalhos

desenvolvidos pelo grupo pode-se destacar a avaliação, por bioensaios in vitro, da atividade

antimicrobiana de plantas medicinais utilizadas na região de Governador Valadares, dentre as

quais estão o Cymbopogon citratus (“capim limão”), Piper aduncun (“falso jaborandi”) e

Porophyllum ruderale (“couve cravinha”) já com demonstrada atividade antibacteriana contra

Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

Pelo exposto, pretendeu-se com este estudo ampliar a avaliação da atividade

antibacteriana de extratos derivados das plantas C. citratus, P. aduncun e P. ruderale, por

meio do estudo de seus efeitos sobre as espécies anaeróbias peridontopatogênicas A.

actinomycetemcomitans, F. nucleatum e P. anaerobius, com perspectivas de novas opções

terapêuticas para o controle das infecções periodontais.

15

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 PLANTAS MEDICINAIS

Desde o início dos tempos, o homem utilizou vários recursos da natureza, preparando

formulações que amenizassem os problemas relacionados com a saúde, numa busca

incansável da cura de enfermidades. Por meio de tentativas, com erros e acertos, o homem

primitivo foi descobrindo a ação biológica das plantas e determinando assim quais seriam

alimentos, venenos e remédios (SILVA, 2002; FIGUEIREDO, 2005).

Na Idade Antiga o homem já reconhecia a ação de algumas plantas medicinais e,

principalmente, a relação dose-efeito. Este fato pode ser confirmado através de relatos

históricos da utilização da Atropa belladona (beladona) e do Hyoscyamus niger (meimendro).

Ambas eram fontes de hiosciamina (atropina) e escopolamina, usadas no suicídio de

Cleópatra e suas escravas (SILVA, 2002).

No Brasil, a utilização das plantas como medicamento se inicia antes mesmo do

descobrimento, visto que os índios já utilizavam a flora brasileira como uma espécie de

farmácia natural. Após a colonização e a chegada dos portugueses, esta prática de utilização

de recursos da natureza para resolverem os problemas de saúde, curar ferimentos e as picadas

dos insetos foi sendo disseminada a todos. Os portugueses foram aprendendo com os índios

como preparar os remédios através dos produtos naturais e também como utilizá-los

(VOTTA, 1999).

O termo planta medicinal é utilizado para designar aquela que, administrada ao

homem ou animal por qualquer via ou sob qualquer forma, exerce algum tipo de efeito

farmacológico. Essas espécies vegetais empregadas na terapia de doenças são popularmente

conhecidas como fitoterápicos, que podem ser definidos como medicamentos preparados

exclusivamente à base de plantas medicinais e seus derivados, não podendo ter em sua

composição a presença de substância ativa isolada. Já os fitofármacos são medicamentos que

contém um princípio ativo previamente isolado a partir de extratos obtidos de plantas

(BRASIL, 2004(a)).

16

A utilização de plantas medicinais com finalidade profilática, curativa, paliativa ou

para fins de diagnóstico, foi reconhecida oficialmente pela Organização Mundial da Saúde

(OMS) em 1978, que passou a recomendar a difusão dos conhecimentos necessários para o

seu uso a nível mundial. De acordo com dados da OMS, 80% da população dos países em

desenvolvimento utilizam as plantas medicinais como principal opção terapêutica. Ainda

segundo a OMS, tem se verificado uma crescente utilização das plantas medicinais nas

práticas da medicina tradicional na última década, sendo incentivada a utilização até mesmo

nos países desenvolvidos, onde a medicina convencional é predominante no sistema de saúde

(OMS, 2000; BRASIL, 2001).

Com o crescimento da utilização das plantas medicinais, acaba ocorrendo também o

uso indevido das plantas, pois muitas pessoas desconhecem a posologia adequada, indicação

terapêutica e ainda a possível existência de substâncias tóxicas, visto que acreditam estar

utilizando um produto natural. Atualmente o Ministério da Saúde tem dado uma maior

atenção ao uso das plantas no tratamento de doenças, pois através da Resolução RE nº 89, de

16 de março de 2004 (RE nº89/2004) autorizou a comercialização de 34 plantas,

reconhecendo assim seu potencial medicinal e sua utilização como recurso terapêutico. Sendo

assim, torna-se um desafio desenvolver trabalhos que possam elucidar a ação farmacológica

das plantas medicinais e ainda fazer com que estas informações cheguem a quem mais utiliza

estes produtos, ou seja, a população (BRASIL, 2004(b); PEREIRA et al., 2004).

O conhecimento popular sobre a utilização das plantas medicinais é de extrema

importância para o desenvolvimento de estudos no intuito de avaliar o real valor medicinal de

tais plantas, bem como seus componentes ativos e sua toxicidade (NOSTRO et al, 2000). O

estudo de plantas medicinais requer também o entendimento de diversos fatores ambientais

que podem interferir na concentração dos compostos fitoquímicos, bem como na sua ação

terapêutica (MATU & VAN STADEN, 2003; ADEKUNLE & IKUMAPAYI, 2006). Outro

fato a ser considerado é o de que mesmo uma planta possuindo diversos metabólitos

secundários, apenas os que estão em maior concentração são geralmente isolados e estudados,

embora, os compostos minoritários estejam, frequentemente, entre os que apresentam

melhores efeitos biológicos. Por isso, analisar compostos ativos de plantas acaba sendo uma

tarefa complexa e longa, que deve ser iniciada com a análise de extratos brutos, seguido de

extratos semi-puros, frações e finalmente, os compostos puros. Posteriormente, deve ser

realizada a análise da potência das frações e das substâncias puras em relação à sua

17

concentração, visto que somente após esta avaliação podemos concluir se o principal

componente químico responsável pela atividade biológica foi realmente determinado. Sendo

assim, toda substância presente na planta pode ser um princípio ativo, independente se sua

proporção é conhecida ou não (CECHINEL FILHO E YUNES, 1998; MATU & VAN

STADEN, 2003; ALVIANO et al.,2008; VICTÓRIO et al., 2009).

O Cymbopogon citratus é uma espécie da família Poaceae, originária da Índia e

muito conhecida no Brasil e em cada região recebe uma denominação popular, como capim-

limão, capim-santo, erva-cidreira, capim-de-cheiro, entre outros. É uma erva do tipo perene,

aromática e de fácil cultivo, por isto se encontra bem difundida no país e pode ser encontrada

facilmente. Apresenta-se na forma de touceiras compactas e robustas com altura de até 1,2

metro (Figura 01), apresenta ainda rizoma semi-subterrâneo (COSTA et al., 2005).

As folhas do C. citratus são muito usadas no preparo de chás, e na medicina popular é

empregado como calmante, analgésico, antitussígeno, diurético e no tratamento de distúrbios

digestivos. Na agricultura, o C. citratus é aproveitado na contenção de encostas para evitar a

erosão e na composição de cercas vivas (SCHUCK et al., 2001; COSTA et al., 2005).

Figura 01 - Planta da espécie Cymbopogon citratus.

Fonte: http://www.google.com.br

18

O extrato oleoso ou óleo essencial de C. citratus possui odor de limão e é conhecido

mundialmente como óleo de lemon grass. É utilizado pela indústria farmacêutica para síntese

de ianonas e vitamina A e também como aromatizante em indústrias de cosméticos e de

alimentos. O seu principal constituinte é o citral, responsável pela ação antimicrobiana desta

planta. Os óleos essenciais são formados por elementos voláteis presentes em vários órgãos

das plantas e recebem esta denominação devido à sua composição lipofílica que é

quimicamente diferente da composição glicerídica dos verdadeiros óleos e gorduras

(ONAWUNMI et al., 1984; SIANI et al., 2000; CARVALHO et al., 2005; COSTA et al.,

2005).

O P. aduncum é uma espécie exótica, pertencente à família Piperaceae e originária da

Nova Guiné. É uma planta perene, que se apresenta sob forma de arbusto, pode crescer até

uma altura de cerca de 6 m e possui folhas de até 20 cm de comprimento (Figura 02). Todas

as partes da planta possuem um odor picante característico. Seu tronco é utilizado para cercas

e construções provisórias, apesar de apodrecer facilmente quando submetidos constantemente

à umidade (RALI et al., 2007).

Figura 02 - Planta da espécie Piper aduncum.


19

Estudos demonstram que o P. aduncum possui uma ação inibitória contra patógenos

como a Candida albicans, Cryptococcus neoformans e o Mycobacterium intracellularae. Na

análise do seu óleo essencial, um total de 46 componentes foram identificados, dentre eles o

safrol, utilizado na produção de cosméticos e inseticidas e o 2',6'-Diidroxi-4'-Metoxichalcona,

que se mostrou eficaz contra Leishmania amazonensis (OKUNADE et. al., 1997;TORRES-

SANTOS et al., 1999; MARTINEZ et al., 2003; RALI et al., 2007).

O P. aduncum possui comprovada ação sobre fitopatógenos de culturas tradicionais

como fungos, bactérias, moluscos. Indicada também para cistite, diarréia, ferida crônica,

hemorragias, mal estomacal, mau hálito, úlcera externa, inflamação, hemorróidas. Esta

espécie é conhecida popularmente como pimenta de macaco, falso jaborandi entre outras

denominações (MORADIM et al., 2009).

O Porophyllum ruderale é uma espécie do tipo invasora, pertencente à família

Asteraceae. É nativa da América do Sul e amplamente distribuída em todas as regiões do

Brasil, onde é conhecida como couve-cravinho, erva-fresca, erva-de-veado, arnica-brasileira,

arnica-do-campo, arruda-de-galinha, cravo-de-urubu e picão-branco. Apresenta porte

herbáceo, caule ereto e ramificado na porção superior (Figura 03). Floresce nos meses de

maio a setembro (FONSECA, 2001).

Figura 03 - Planta da espécie Porophyllum ruderale.


20

Na medicina popular o P. ruderale é utilizada na forma de tinturas ou macerados das

folhas. Possui ação cicatrizante, antiinflamatória, antifúngica, antibacteriana, calmante, sendo

utilizada também para tratamento da hipertensão arterial, picada de cobra, leishmaniose,

doenças reumáticas, edemas, traumatismos e dores em geral. A atividade cicatrizante tem sido

relacionada aos compostos fenólicos do tipo taninos, presente nas folhas (FONSECA, 2006).

Estudos científicos demonstraram que o extrato hidroalcóolico de P. ruderale possui

eficácia antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. Na análise

do extrato oleoso foi encontrada uma mistura complexa de terpenos. As propriedades

antimicóticas atribuídas à couve-cravinho também foram comprovadas, visto que o extrato

das folhas de P.ruderale reduziu o crescimento das colônias de Trichophyton mentagrophytes

e de T. rubrum (NETO, 1991; FONSECA, 2006).

2.2 DOENÇA PERIODONTAL

A microbiota normal ou indígena desempenha um papel muito importante tanto na

saúde quanto nas doenças dos seres humanos e dos animais. A microbiota indígena previne

contra a colonização de espécies exógenas patogênicas. Por outro lado, também constitui um

reservatório de microrganismos com grande potencial patogênico que podem infectar os

tecidos do hospedeiro a qualquer momento, dependendo do seu estado imunológico. Neste

contexto, a microbiota bucal está diretamente relacionada com o aparecimento de muitas

doenças infecciosas, tais como cáries e doenças periodontais, estas últimas caracterizadas pela

predominância de bactérias anaeróbias obrigatórias (MARCOTTE & LAVOIE, 1998).

A doença periodontal é resultante de um processo interativo entre o biofilme e os

tecidos periodontais por meio de respostas celulares e vasculares. Tanto o início da

periodontite quanto a progressão envolvem a participação de um conjunto de eventos

imunopatológicos e inflamatórios, com a participação de fatores modificadores locais,

sistêmicos, ambientais e genéticos (LOTUFO & PANNUTI, 2004).

O início da doença periodontal envolve a destruição dos tecidos de suporte do dente

pela ação direta de bactérias e de seus produtos, ou por ação indireta, onde as reações de

destruição tecidual são mediadas pelo hospedeiro. Esta destruição do tecido gengival pode

21

progredir em direção ao tecido ósseo, caso não tratada, levando a perda definitiva do dente

(GOMES-FILHO et.al., 2006).

As doenças periodontais podem ser agrupadas em duas categorias, gengivite e

periodontite. A gengivite, forma mais branda da doença, é definida como uma inflamação dos

tecidos gengivais que não afeta as estruturas de suporte subjacentes dos dentes e é reversível

(Figura 04a). A periodontite, por sua vez, é caracterizada por perda do suporte dos dentes

afetados, especialmente do osso alveolar e fibras do ligamento periodontal e é a principal

causa de perda dos dentes em adultos (Figura 04b) (MARCOTTE & LAVOIE, 1998;

PIHLSTROM et al., 2005).

(a) (b)

Figura 04 – Gengivite (a), Periodontite(b). Fonte: http://www.clinicadentaria.pt

As doenças periodontais tais como gengivite e periodontites são infecções bacterianas

bastante comuns em seres humanos e são resultado do acúmulo de comunidades bacterianas

na superfície dos dentes, levando à formação da placa dental ou biofilme. O biofilme dental é

uma película incolor composta por grande variedade de espécies bacterianas, proteínas

salivares, polissacarídeos, células descamadas, leucócitos e restos alimentares que se alojam

na superfície dental alterando o equilíbrio local. Estas infecções periodontais muitas vezes

não são tratadas, pois tem sua importância minimizada, em relação à saúde do ser humano

(LOESCHE, 1986; ALVIANO et al.,2008).

As doenças periodontais são altamente prevalentes, podendo alcançar até 90% da

população mundial (PIHLSTROM et al., 2005). Apresentam graus variados de gravidade e

acometem todas as classes sociais, sendo consideradas importante problema de saúde pública,

interferindo na atividade produtiva dos indivíduos (SOCRANSKY, 1970; LÖE et al., 1986).

http://www.clinicadentaria.pt/

22

2.3 PERIODONTOPATÓGENOS

Considerando as doenças periodontais, as bactérias desempenham um papel primário

na iniciação desta patologia, no entanto, uma variedade de fatores relacionados ao hospedeiro,

incluindo fatores genéticos e ambientais, especialmente o uso de tabaco, influenciam o

estabelecimento, a apresentação clínica e a velocidade de progressão da doença (HEITZ-

MAYFIELD, 2005; PIHLSTROM et al., 2005). Além disso, existem fortes evidências de que

a periodontite aumenta o risco para várias doenças sistêmicas, incluindo arteriosclerose,

doenças coronárias e baixo peso de recém nascidos (PAGE & KORNMAN, 1997).

Os microrganismos anaeróbios são reconhecidos como os principais patógenos

associados com a maioria das doenças infecciosas periodontais. Esta condição é determinada

em função de inúmeros fatores, especialmente, os fatores de virulência de espécies

bacterianas tais como: Porphyromonas gingivalis, Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella

intermedia, Prevotella nigrescens, Treponema denticola, Tannerella forsythus (antigo

Bacteroides forsythus), Fusobacterium nucleatum, Campylobacter (Wollinella) recta,

Capnocytophaga ochacea, Eikenella corrodens e Aggregatibacter actinomycetemcomitans

(antigo Actinobacillus actinomycetemcomitans) (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 1991;

GRENIER & MAYRAND, 2000).

O A. actinomycetemcomitans se apresenta como bastonetes ou filamentos curtos

Gram-negativos, podendo ocorrer isoladamente, em pares ou em pequenos grupos. São

anaeróbios facultativos, mas se desenvolvem melhor em anaerobiose com presença de gás

carbônico. Formam pequenas colônias, com um diâmetro que varia de 0,5 mm após 24

horas e superior a 1-2 mm após 48 horas. São colonizadores primários do biofilme dental

supragengival, mas devido ao seu potencial patogênico estão predominantemente associados a

casos de doença na cavidade bucal e língua. Também estão envolvidos em outras patologias,

tais como, doença pulmonar, endocardite, abscessos cerebrais e infecções do trato urinário

(HOLT et al., 1994; NORSKOV-LAURITSEN & KILIAN, 2006).

Na microbiota normal o A. actinomycetemcomitans é encontrado na cavidade bucal,

principalmente das dobras gengivais e supragengivais e está especificamente associado a uma

entidade clínica bem definida, denominada periodontite agressiva. Essa doença afeta crianças

e adultos e é caracterizada por degeneração e destruição do osso alveolar que sustenta os

23

primeiros molares e incisivos permanentes. Durante o desenvolvimento dessa enfermidade

observa-se acúmulo de placa em um grau mínimo e inflamação gengival escassa ou nula

(KONEMAN et al., 2001). A prevalência e gravidade das doenças periodontais em pessoas

jovens são significativas, e o A. actinomycetemcomitans, caracteristicamente, é o principal

patógeno envolvido (DOUGHERTY & SLOTS, 1993).

O F. nucleatum pertencente à família Bacteroidaceae, é um microorganismo Gram-

negativo, anaeróbio obrigatório, mas que sobrevive na presença de até 6% de oxigênio. É

quase sempre fusiforme, com extremidades pontiagudas, possui tamanho que varia de 5 a 10

mm de comprimento (HOLT et al., 1994; BOLSTAD et al., 1996 ).

O F. nucleatum é uma das principais espécies microbianas isoladas da microbiota

indígena de seres humanos. São frequentemente relacionados ao aparecimento de doenças

periodontais, além de constantemente serem encontrados em infecções clínicas humanas, tais

como sinusite, infecções pélvicas, osteomielite, pericardite, endocardite, abscessos cerebrais e

pulmonares (BOLSTAD et al., 1996; AVILA-CAMPOS et al., 2006).

O aumento significativo do número de F. nucleatum na placa gengival corresponde

também a um aumento na probabilidade de ocorrência de gengivite e de doenças periodontais

destrutivas (SOCRANSKY, 1977). A espécie F. nucleatum parece desempenhar importante

papel no desenvolvimento de doenças periodontais, pois foi definitivamente associada ao

mecanismo de espessamento da placa supragengival e, conseqüentemente, ao

desenvolvimento de placa subgengival. Essa espécie atua como uma ponte permitindo a

coagregação de outras bactérias, especialmente outros bacilos Gram-negativos, os quais são

os microrganismos predominantes quando a placa subgengival está completamente

colonizada (KOLENBRANDER, 2000).

O Peptostreptococcus anaerobius pertence à família Peptostreptococcaceae que é

composta por bactérias que estão distribuídas na microbiota humana e animal. Este grupo é

constituído de cocos Gram-positivos anaeróbios, apresentando-se dispostos em cadeias longas

ou curtas, cachos irregulares, tétrades e dois a dois (HOLT et al., 1994). São anaeróbios

obrigatórios, mas algumas linhagens são aerotolerantes, porém este aspecto de sua biologia

tem sido muito pouco estudado. Eles não formam esporos e na maioria das espécies, os

produtos da digestão de proteínas parecem ser a principal fonte de energia (MURDOCH,

1998).

24

O P. anaerobius é uma bactéria integrante da flora gastrointestinal normal, ocorrendo

também na flora bucal e vaginal. São encontrados em infecções polimicrobianas e inclusive,

tem sido isolada em muitas delas, tais como abscessos do cérebro, ouvidos, maxilar, cavidade

pleural, regiões pélvica, urogenital e abdominal, abscessos nasais e hemorróidas infectadas.

Além disto, o P. anaerobius está envolvido em infecções dos tecidos moles, incluindo os da

perna e genitália externa, sendo encontrado também em cultura de casos de endocardite

(MURDOCH, 1998; RIGGIO & LENNON, 2002;). O P. anaerobius tem sido associado com

gengivite e periodontite, embora seja uma espécie encontrada com mais freqüência nos canais

radiculares de dentes com lesões periapicais e em cultura de abscesso de amígdalas. A

identificação de P. anaerobius em amostras clínicas tem sido tradicionalmente realizada por

uma combinação de cultura microbiológica e testes bioquímicos (RIGGIO & LENNON,

2002).

2.4 OPÇÕES TERAPÊUTICAS

A periodontite começa com a lesão inflamatória da gengiva que, se não tratada, com o

tempo pode progredir e eventualmente envolver e comprometer inteiramente o aparato de

ligação periodontal do dente afetado. Esse fato sugere que a prevenção da doença periodontal

deve ser baseada em medidas que visam o controle da placa supragengival. A eficácia das

medidas mecânicas de higiene bucal para essa finalidade tem sido documentada de forma

convincente (AXEISSON & LINDHE, 1974; PAQUETTE et al., 2008). Idealmente, o

controle do biofilme supragengival deve prevenir a inflamação do tecido periodontal.

Contudo, visto que a remoção completa do biofilme é impraticável, a prevenção pode ser

conseguida por meio da redução da quantidade da placa abaixo do limiar do indivíduo para a

doença ou da mudança da qualidade do biofilme para uma composição não hostil ao

hospedeiro (KORNMAN, 1986). Para obter níveis suficientemente baixos do biofilme para

suportar a saúde do periodonto, vários métodos mecânicos de auxílio à higiene bucal, além da

escova dental, são necessários. Em particular, as regiões interproximais são difíceis de limpar

com a escova dental. Nesses sítios, o fio dental desempenha um papel muito importante para

reduzir a quantidade do biofilme. O problema, contudo, parece ser que somente poucas

pessoas têm entusiasmo e a habilidade requerida para alcançar um nível ótimo de limpeza

25

dental. Muitas revisões têm suportado a praticidade de abordagens químicas no controle da

formação do biofilme, auxiliando o indivíduo a conseguir uma condição gengival aceitável, a

despeito de uma dedicação abaixo da ideal e pequeno envolvimento para alcançar esse

objetivo (VAN DER WEIJDEN et al., 1998).

Por outro lado, a utilização de compostos químicos para o controle do biofilme é um

tema controverso, pois o uso indiscriminado desses agentes (antisépticos e antibióticos)

acarreta a seleção de organismos resistentes (SIBANDA & OKOH, 2007). Em relação a isso,

uma atenção crescente tem sido dada para o uso de compostos antimicrobianos de origem

natural. O aumento da demanda para novos antimicrobianos tem impulsionado pesquisas para

investigar o efeito antimicrobiano de extratos de uma grande quantidade de espécies

botânicas, muitas das quais usadas há séculos na medicina tradicional (FILOCHE et al.,

2005).

Especificamente em relação ao controle do crescimento das bactérias da cavidade

bucal, muitos produtos de planta têm sido incorporados com sucesso em dentifrícios e

enxaguantes bucais para essa finalidade. Por exemplo, o dentifrício Parodontax ® contém

uma mistura de extratos vegetais de mirra, echinacea, camomila e ratânia. Experimentos em

laboratório demonstraram que esse dentifrício inibiu o crescimento de S. mutans e A. viscosus

(YANKELL et al., 1988). Sanguinarine, um alcalóide extraído do rizoma da sanguinária do

Canadá, inibiu, in vitro, o crescimento de 98% de microrganismos isolados da cavidade bucal

em concentração relativamente baixa (DZINK & SOCRANSKY, 1985). Em um estudo in

vivo, indivíduos que usaram o produto na forma de dentifrício e enxaguante bucal, mostraram

redução significante no índice de placa e gengivite, sugerindo que essa combinação pode ter

valor terapêutico (KOPCZYK, et al., 1991). O extrato do chá verde, o qual é habitualmente

bebido após cada refeição no Japão, é conhecido por conter vários polifenóis que inibem o

crescimento de S. mutans, principal espécie envolvida no processo da cárie dental

(SAKANAKA et al., 1989 apud RUKAYADI & HWANG, 2006).

Considerando que a periodontite é uma doença de caráter infeccioso e que certos

pacientes não respondem à terapia mecânica de higiene, agentes antimicrobianos são

incorporados ao tratamento com a finalidade de diminuir a adesão bacteriana, inibir o

crescimento e proliferação dos microrganismos na superfície do dente e modificar a atividade

bioquímica e a ecologia do biofilme dentário. Contudo, o aparecimento de bactérias

resistentes aos antibióticos constitui um grave problema de ordem clínica, pois os antibióticos

26

devem ser usados somente quando existir uma indicação específica, de modo que os

benefícios esperados aos pacientes sejam maiores que os riscos a que os mesmos estariam

submetidos, pelo uso pouco criterioso destes compostos (GILLETTE, 1996, COS et al.,

2006).

Tendo em vista o aumento da resistência bacteriana aos antimicrobianos

convencionais, surge a necessidade de se buscar alternativas para o controle de

microrganismos resistentes às drogas disponíveis no mercado (LEGGIADRO, 1995;

SIBANDA & OKOH, 2007). A pesquisa de novas substâncias antimicrobianas isoladas a

partir de extratos vegetais tem sido uma tendência mundial e, neste sentido, a contribuição da

fitoquímica é fundamental, pois a grande diversidade estrutural que essa área da ciência

proporciona, permite o encontro de moléculas que podem servir como protótipos para novas

substâncias antimicrobianas. Este tipo de procedimento, baseado na utilização de dados

etnofarmacológicos, conduz a um melhor direcionamento na seleção de princípios ativos com

futura aplicação terapêutica (ELISABTSKY & DE SOUZA, 2003; GIBBONS, 2004).

Na odontologia, estudos recentes têm demonstrado a ação antimicrobiana de algumas

plantas medicinais sobre bactérias da cavidade bucal. Por exemplo, Ceanothus americanus

apresentou efeito bactericida sobre S. mutans, A. viscosus e P. gingivales (LI et al., 1997).

Além disso, o bacuquiol, um composto isolado da semente e folhas de Psoralea corylifolia,

uma planta nativa da China, apresentou atividade antimicrobiana contra S. aureus.

Posteriormente, Katsura e colaboradores (2001), demonstraram o efeito bactericida do

bacuquiol sobre vários microrganismos bucais, incluindo S. mutans, S. sanguis, S. salivarius,

S. sobrinus, E. faecalis, E. faecium, L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, A. viscosus, e P.

gingivalis. Além desses, vários outros produtos de origem vegetal têm sido avaliados quanto à

sua atividade sobre bactéria cariogênicas e periodontopatogênicas (SOTE & WILSON, 1995;

TAKARADA et al., 2004).

Iauk e colaboradores (2003), avaliaram a atividade antimicrobiana de extratos de

plantas medicinais, sobre um número significativo de bactérias periodontopatogênicas, e

mostraram resultados bastante significativos sobre algumas espécies e, portanto, com

potencial para serem utilizados como medicação tópica em profilaxia periodontal. Em

conjunto, esses estudos demonstram que extratos ou compostos isolados de plantas medicinais

possuem propriedades de inibir a formação do biofilme dental, sugerindo sua utilização na

27

odontologia preventiva, sobretudo em países em desenvolvimento, onde grande parte da

população não dispõe de recursos financeiros para tratamentos odontológicos. Entretanto, a

biodisponibilidade dos princípios ativos dessas plantas bem como os efeitos produzidos após

um longo período de uso in vivo precisam ser mais bem estudados (SOTE & WILSON, 1995;

DE SOUZA et al., 2004).

28

3 OBJETIVOS

Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos de Cymbopogon citratus, Piper

aduncun e Porophyllum ruderale contra os peridontopatógenos A. actinomycetemcomitans, F.

nucleatum e P. anaerobius.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter extratos brutos, utilizando diferentes solventes e métodos de extração,

das folhas de Cymbopogon citratus (“capim limão”), Piper aduncun (“falso jaborandi”) e

Porophyllum ruderale (“couve cravinha”).

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Bactericida Mínima (CBM) dos extratos brutos obtidos sobre linhagens de referência de A.

actinomycetemcomitans, F. nucleatum e P. anaerobius.

Avaliar o efeito dos diferentes métodos de extração sobre a atividade

antibacteriana dos extratos sobre A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum e P. anaerobius.

Verificar a concordância entre as CIMs e CBMs obtidas pelas técnicas de

macro e microdiluição em caldo.

Detectar os principais constituintes voláteis do extrato de P. aduncum por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.

29

4 METODOLOGIA

4.1 OBTENÇÃO DAS ESPÉCIES VEGETAIS A SEREM ESTUDADAS

O material vegetal (C. citratus – folhas, P. aduncum - folhas e P.ruderale – parte

aérea) foi coletado no horto de plantas medicinais e em áreas próximas ao Campus II da

UNIVALE. As amostras foram secas sobre telas em ambiente com desumidificador. Após a

secagem completa, o material foi triturado com auxilio de um moinho de facas (Marconi -

modelo 340) e o pulverizado foi submetido à extração. Foram utilizados como solventes o

etanol 99% e o hexano 95%. Para a obtenção dos extratos foram empregados pelo menos um

dos seguintes métodos: sonicação, decocção, soxhlet, turbólise, maceração e destilação por

arraste a vapor. Exemplares das espécies utilizadas foram herborizados e as exsicatas

depositadas no Herbário do Laboratório de Botânica da Faculdade de Ciências Agrárias da

Univale.

A escolha das espécies vegetais foi baseada em informações etnobotânicas e em dados

preliminares de atividade antimicrobiana das mesmas contra outros grupos microbianos

(BRASILEIRO et al., 2003; LORENZI & MATOS, 2002).

4.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO – PREPARO DOS EXTRATOS DE PLANTAS

Para a obtenção dos extratos vegetais contou-se com a colaboração do Prof. Dr.

Rodrigo Loreto Peres do Laboratório de Química da Univale.

4.2.1 Sonicação (ultrassom)

Inicialmente, foram obtidos através deste método de extração os extratos brutos de P.

aduncum (etanólico), P. ruderale (etanólico e hexânico) e C. citratus (hexânico).

30

O material vegetal foi submetido à secagem, moagem e adicionados ao solvente. Em

seguida, os tecidos vegetais foram extraídos sob um banho de ultrassom. Para tanto, foram

adicionados cerca de 15 g do material vegetal triturado em um béquer (600 ml) onde se verteu

150 ml do solvente extrator (etanol/hexano). Tampou-se o béquer e este permaneceu em um

banho de ultrassom (Qimis) durante 4 horas.

A solução obtida foi então filtrada em algodão, e novamente vertida em outro balão de

fundo redondo, para então ser levada ao rotaevaporador (Fisatom) com pressão reduzida, à

temperatura de 40 ºC e 80 rpm, onde foi lavado com o próprio solvente. Em seguida, essa

solução foi depositada em um novo béquer (250 ml), o qual foi selado com um filme de PVC

perfurado, e conduzido a uma estufa de fluxo de ar (Nova Ética) a 40 °C, onde permaneceu

até a completa secagem do extrato. Por fim, o béquer (250 ml) contendo o extrato foi selado,

identificado e armazenado em freezer (Brastemp) até ser requisitado nos bioensaios de

suscetibilidade, quando este foi pesado e solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO).

4.2.2 Decocção (refluxo)

Foram obtidos através deste método de extração os extratos brutos de P. aduncum

(etanólico e hexânico) e C. citratus (etanólico e hexânico). Depois de separadas, as folhas

foram secas, moídas e, posteriormente, submetidas à decocção para obtenção de um extrato

aquoso semelhante ao chá utilizado na medicina popular.

O material vegetal triturado (15 g) foi acondicionado em um balão de fundo redondo

(500 ml) onde também se adicionou 150 ml do respectivo solvente. O balão foi colocado em

uma manta de aquecimento (Nalgon) à temperatura de 100 °C, onde permaneceu por 4 horas.

A solução foi filtrada e processada de modo idêntico ao descrito para a técnica de sonicação.

4.2.3 Maceração

Através deste método de extração foram obtidos os extratos brutos de P. aduncum

(etanólico e hexânico) e C. citratus (etanólico e hexânico).

31

Foram adicionados cerca de 15 g do material vegetal triturado(almofariz e pistilo) em

um béquer (600 ml) onde se verteu 150 ml do solvente extrator. Tampou-se o béquer e este

foi mantido em um agitador magnético (Novatec) durante 4 horas. Após isso a solução foi

armazenada durante 7 dias em condições ambientais. Após esse período, a solução foi filtrada

processada de modo idêntico ao descrito para a técnica de sonicação.

4.2.4 Soxhlet

Através deste método de extração foram obtidos os extratos brutos de P. aduncum

(etanólico e hexânico) e C. citratus (etanólico e hexânico).

Os extratos foram preparados em extrator tipo Soxhlet com os solventes etanol e

hexano. Foram adicionados 15 g do material vegetal triturado envolvido em papel filtro

(Whatman), e então acondicionado no interior da parte extratora do aparelho de Soxhlet, que

foi acoplado a um balão de fundo redondo (500 ml) contendo 150 ml do respectivo solvente.

O sistema foi deixado em uma manta de aquecimento (Nalgon) a 100 ºC, por 4 horas. Após

este período a solução foi processada de modo idêntico ao descrito para a técnica de

sonicação.

4.2.5 Turbólise

Com este método de extração foram obtidos os extratos brutos de P. aduncum

(etanólico) e C. citratus (etanólico).

Adicionaram-se exatamente cerca de 15 g do material vegetal triturado em um copo de

liquidificador (1000 ml) juntamente com 150 ml de solvente extrator. O aparelho de

liquidificador (Arno) realizou 1000 rpm durante 5 minutos, e isso foi repetido durante 6

vezes. Após esse período, a solução foi filtrada e processada de modo idêntico ao descrito

para a técnica de sonicação.

32

4.2.6 Destilação por arraste a vapor ( D.A.V.)

Com este método de extração foi obtido o extrato oleoso de Cymbopogon citratus. O

material vegetal (15 g) já triturado foi acondicionado em um balão de três pontas (250 ml).

Uma das pontas deste balão estava conectada a um outro balão de fundo redondo (500 ml),

que continha 400 ml de água, e estava envolvido por uma manta de aquecimento (Nalgon) a

100 ºC. Após a água entrar em ebulição, o vapor gerado pela vaporização da água na caldeira

arrastou a essência através de um condutor, que passou por uma serpentina de resfriamento,

condensando uma mistura de óleo-água, que foi progressivamente depositada em um

erlenmeyer (250 ml).

O erlenmeyer (250 ml) com a emulsão (óleo-água) produzida foi armazenado durante

24 hs em ambiente fechado a 5 ºC. Em seguida, foram adicionados 15 ml de diclorometano

(99,5%) a esta solução, que foi então levada ao funil de separação. Com a ativação da válvula,

o óleo da emulsão foi depositado em outro erlenmeyer (250 ml), agora contendo cerca de 20 g

de sulfato de sódio anidro. Após esse período, a solução foi filtrada e processada de modo

idêntico a técnica de sonicação. Em seguida, essa solução foi identificado e armazenado em

freezer (Brastemp) até sua utilização nos bioensaios.

4.3 DETECÇÃO DOS CONSTITUINTES POR CROMATOGRAFIA GASOSA

ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS

As análises por cromatografia gasosa e espectrometria de massas dos extratos de P.

aduncum foram realizadas no Centro de Pesquisas René Rachou (CPqRR) em colaboração

com o Dr. Ezequias Pessoa de Siqueira Filho. Foi utilizada a técnica de preparo de amostras

denominada microextração em fase sólida- SPME. Para isso, um miligrama do extrato foi

transferido para um frasco de vidro de 2 ml. O frasco foi fechado com uma tampa selada com

septo revestido de teflon (Supelco, EUA.) e colocado em um bloco de aquecimento ajustado a

90 °C. A fibra de SPME (polidimetilsiloxano/divinilbenzeno - PDMS/DVB 65 µm, Supelco,

EUA) foi inserida através do septo, e deixada no headspace durante 5 minutos. Antes da

33

utilização, a fibra foi pré-condicionada a 230°C durante 30 minutos na porta do injetor do

cromatógrafo. As análises por cromatografia gasosa e espectrometria de massas foram

realizadas em um equipamento Shimadzu QP-5050A (Shimadzu, Japão), equipado com uma

coluna PTE™-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Supelco, EUA), usando hélio como gás de arraste.

As seguintes condições foram utilizadas para todas as análises: hélio na vazão de 22,3

ml/min; temperatura do injetor mantida a 230 °C.; forno a 80 °C durante 3 minutos seguida de

aquecimento até 300 °C na velocidade de 7 °C/min, mantendo a 300 °C por 5 minutos. A

injeção foi feita no modo split, com um razão de 1:10. O detector de massas foi programado

para fazer a varredura na faixa de m/z de 50 a 500, a uma taxa de 2 varreduras por segundo. A

aquisição e manipulação dos dados foram feitas por meio do software CLASS 5000

Shimadzu. Os arquivos dos dados obtidos na análise por cromatografia gasosa e

espectrometria de massas foram analisados pelo software Automated Mass Deconvolution

and Identification System (AMDIS) versão 2.1, fornecida pelo Instituto Nacional de Padrões e

Tecnologia (NIST, EUA). A elucidação estrutural dos compostos foi feita por meio do

programa NIST MS Search 2.0 (NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library, versão 2002).

4.4 TESTES MICROBIOLÓGICOS

4.4.1 Amostras bacterianas

Neste estudo foram utilizadas as linhagens de referência A. actinomycetemcomitans

ATCC (American Type Culture Collection) 25923, P. anaerobius ATCC 27337 e F.

nucleatum ATCC 10953 que foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Microbiologia

Oral e Anaeróbios do ICB/UFMG. As amostras se encontravam congeladas (nitrogênio

líquido, a -196 ºC) em caldo infuso de cérebro-coração suplementado com hemina,

menadiona e extrato de levedura (BHI-S), contendo 10% de glicerina.

4.4.2 Preparação das suspensões bacterianas

As amostras bacterianas foram descongeladas e alíquotas de 100 µl foram inoculadas

34

em tubos de ensaio contendo caldo BHI-S. Os tubos foram incubados a 37ºC, por

aproximadamente 24 horas em anaerobiose (câmara de anaerobiose, Forma Scientific

Anaerobic System, Inc Model 1025, contendo uma atmosfera de N2 85%, H2 10% e CO2 5%).

Após o período de incubação a pureza das culturas foi avaliada por meio da coloração de

Gram. As culturas puras eram novamente repicadas e incubadas nas mesmas condições antes

da realização de cada teste. Os testes de atividade antimicrobiana foram realizados com

suspensões bacterianas contendo aproximadamente 1,5 x 105

unidades formadoras de colônias

(UFC), como recomendado pelo Clinical and Laboratory Standard Intistute (CLSI) (NCCLS,

2004). As culturas de bactérias foram inicialmente ajustadas para a concentração de 1,5 x 108

UFC/ml (padrão 0,5 da Escala de McFarland) e em seguida novamente diluídas (7,5 vezes)

obtendo-se uma suspensão bacteriana com concentração de 2,0 x 107

UFC/ml. A concentração

bacteriana final foi atingida com uma última diluição diretamente nos tubos testes.

4.4.3 Preparação dos extratos

Soluções estoque foram preparadas solubilizando-se 100 mg do extrato em 250 µl de

dimetilsulfóxido (DMSO), atingindo uma concentração final de 400 mg/ml. A partir desta

solução foram realizadas diluições até alcançar a concentração de trabalho (20 mg/ml).

4.4.4 Determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM)

A atividade antibacteriana dos extratos hexânicos e etanólicos de C. citratus,

P.aduncum e P. ruderale foi avaliada por meio da determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM), que é definida como a menor diluição do extrato ou composto capaz de inibir

crescimento visível de um microorganismo (NCCLS, 2004; LORIAN, 2005)

4.4.4.1 macrodiluição

As CIMs dos extratos de plantas foram determinadas pelo método de diluição em

caldo aprovado pelo CLSI, protocolo M11-A6 (NCCLS, 2004). As soluções de trabalho (20

mg/ml) foram submetidas a diluições seriadas (1:2) em tubos de ensaio contendo 2 ml de

35

BHI-S, obtendo no final as concentrações de 10; 5; 2,5; 1,25; 0,62; 0,31; 0,16 e 0,08 mg/ml.

As culturas bacterianas, previamente ajustadas (2,0 x 107

UFC/ml), foram inoculadas (200 µl)

em cada tubo teste alcançando a concentração final de 1,5x105 UFC por tubo. Após incubação

em anaerobiose, a 37 ºC, por 48 h foi realizada a leitura do experimento. A CIM foi definida

como a menor diluição do extrato capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano

visível. Como controle da esterilidade do meio de cultura foi incluído no teste um tubo

contendo apenas o caldo BHI-S (controle negativo) (LORIAN, 2005). Como controle da

viabilidade bacteriana foi incluído um tubo contendo o caldo BHI-S mais o microrganismo

(controle positivo). Finalmente, como controle do DMSO, foi incluído um tubo com caldo

BHI-S, mais o microrganismo, mais o DMSO. Todos os testes, incluindo os controles, foram

realizados em triplicata.

Considerando o consumo relativamente grande de extrato para a realização da

macrodiluição, este ensaio foi realizado apenas com os extratos de P. ruderale. Para maior

aproveitamento dos compostos, as CIMs passaram a ser determinadas por meio da técnica de

microdiluição, como descrito a seguir. Além disso, a técnica de microdiluição é uma

adaptação da macrodiluição, pois a única diferença é o uso de pequenos volumes de caldo

colocados em placas com poços de fundo redondo. Quaisquer influências nos valores de CIM,

tais como sensibilidade do organismo, o diluente utilizado, o estágio e a taxa de crescimento

bacteriano, são os mesmos tanto para a técnica de macrodiluição quanto para a de

microdiluição (NCCLS, 2004; LORIAN, 2005).

4.4.4.2 microdiluição

As soluções de trabalho (20 mg/ml) foram submetidas a diluições seriadas (1:2) em

microplacas de poliestireno de 96 poços, obtendo no final as concentrações de 10; 5; 2,5;

1,25; 0,62; 0,31; 0,16 e 0,08 mg/ml, no volume final de 100 µl. Na sequência, 100 µl das

culturas bacterianas, previamente ajustadas (2,0 x 106

UFC/ml), foram inoculadas em cada

poço alcançando a concentração final de 1 x 105 UFC por poço. Após incubação em

anaerobiose, a 37 ºC, por 48 h foi realizada a leitura do experimento. A CIM foi definida

como a menor diluição do extrato capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano

visível. Como controle da esterilidade do meio de cultura foram incluídos no teste poços

36

contendo apenas o caldo BHI-S (controle negativo). Como controle da viabilidade bacteriana

foram incluídos poços contendo o caldo BHI-S mais o microrganismo (controle positivo).

Finalmente, como controle do DMSO foram incluídos poços com caldo BHI-S, mais o

microrganismo, mais o DMSO). Todos os testes, incluindo os controles foram realizados em

triplicata (NCCLS, 2004).

4.4.5 Concentração bactericida mínima (CBM)

Para determinar a atividade bactericida dos extratos foi estimada a CBM como

resultado do ensaio de CIM. Após a leitura da CIM, alíquotas (100 µl da macrodiluição e 25

µl da microdiluição) das diluições iguais e/ou superiores a CIM foram semeadas nas placas de

Petri (52 x 12 mm) contendo 5 ml de ágar BHI-S (Sangue), com o auxílio da alça de

Drigalski. As placas foram então incubadas a 37 ºC por um período de 48 h em ambiente

anaeróbio. O controle positivo do crescimento bacteriano consistiu de ágar BHI-S inoculado

com microorganismo. Este procedimento também foi realizado nos tubos nos quais a CIM

não pode ser definida devido à turvação do próprio extrato. A CBM de cada composto, para

cada linhagem bacteriana, foi definida como a menor concentração capaz de eliminar o

microorganismo (NCCLS, 2004; LORIAN, 2005).

37

Espécie de Planta

Métodologia de

Extração

Sonicação Extrato etanólico Extrato etanólico

Extrato hexânico

Extrato hexânico

Decocção Extrato etanólico

Extrato hexânico

Extrato etanólico

Extrato hexânico

Soxhlet Extrato etanólico

Extrato hexânico

Extrato etanólico

Extrato hexânico

Turbólise Extrato etanólico Extrato etanólico

Extrato hexânico

Maceração Extrato etanólico

Extrato hexânico

Extrato etanólico

Extrato hexânico

Extrato etanólico

Extrato hexânico

D.A.V* Óleo essencial

Piper aduncum Porophyllum

ruderale

Cymbopogon

cytratus

5 RESULTADOS

Os extratos obtidos pelas diferentes técnicas de extração e utilizados nos ensaios

microbiológicos estão listados na tabela 01.

Tabela 01 - Métodos de obtenção dos diversos extratos utilizados no trabalho, para cada espécie de planta e

respectivos solventes.

5.1 POROPHYLLUM RUDERALE

Os valores de CIM e CBM, obtidos pela técnica de microdiluição em caldo, para a

espécie P. ruderale são mostrados na Tabela 02. As CIMs e as CBMs dos extratos etanólicos

de P. ruderale para A. actinomycetemcomitans, apresentaram valores maiores que 10 mg/ml,

ou seja, esta concentração não foi suficiente para inibir o crescimento bacteriano. O extrato

hexânico, preparado por ultrassom, mostrou-se mais ativo em relação ao correspondente

extrato etanólico.

* Destilação por arraste a vapor.

38

Extrato

hexânico

Maceração Ultrasom Ultrasom

Pa 0,04 (0,08) 0,08 (0,31) 0,02 (0,04)

Fn 0,31 (0,62) 0,31 (0,62) 0,04 (0,08)

Aa >10(>10) >10(>10) 2,5 (10)

Espécie

CIM (CBM) mg/ml

Extrato etanólico

Ambos os extratos etanólico e hexânico, preparados por ultrassom, apresentaram

atividade contra F. nucleatum. Entretanto, o extrato hexânico foi mais ativo contra este

microrganismo, visto que os valores de CIM e CBM foram oito vezes menores (Tabela 02).

Da mesma forma que A. actinomycetemcomitans e F. nucleatum, o P. anaerobius

também demonstrou maior sensibilidade ao extrato hexânico de P. ruderale em relação aos

extratos etanólicos. O valor de CIM do extrato hexânico variou duas diluições em relação ao

seu correspondente extrato etanólico, já a variação do valor de CBM chegou a três diluições.

Em relação aos extratos etanólicos, os melhores resultados foram obtidos com o processo de

maceração, o qual apresentou menores valores de CIM e CBM em relação ao extrato obtido

por ultrassom, sendo que a diferença no valor de CBM foi de duas diluições (0,08 e 0,31

mg/ml, respectivamente).

Tabela 02 - Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) dos extratos

brutos de P.ruderale contra o crescimento de P.anaerobius (Pa), F. nucleatum (Fn) e A. actinomycetemcomitans

(Aa) determinadas pela técnica de microdiluição em caldo.

= As concentrações dos extratos variaram de 0,005 a 10 mg/ml. Os valores obtidos são representativos de pelo

menos dois ensaios independentes, cada um realizado em triplicata.

A atividade antibacteriana dos extratos etanólico e hexânico (ultrassom) de P. ruderale

também foi avaliada pela técnica de macrodiluição em caldo (Tabela 03). Os valores de CIM

para o P. anaerobius e o F. nucleatum não puderam ser precisamente definidos, pois as

bactérias foram inibidas pela menor concentração testada (0,08 mg/ml). Ao contrário, o A.

actinomycetemcomitans se manteve viável até a maior concentração testada (10 mg/ml) do

extrato etanólico, mas foi sensível a 5 mg/ml do extrato hexânico. O valor de CBM foi

precisamente definido apenas para o extrato etanólico frente ao F. nucleatum (0,16 mg/ml).

Nas demais situações a CBM não foi definida, pois F. nucleatum e P. anaerobius não

39

cresceram na presença da menor concentração testada dos extratos (0,08 mg/ml), e o A.

actinomycetemcomitans cresceu até a maior concentração testada (10 mg/ml).

Tabela 03 - Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de extratos brutos

de P.ruderale contra A. actinomycetemcomitans (Aa), F. nucleatum (Fn) e P. anaerobius (Pa) determinadas pela

técnica de macrodiluição em caldo.

Espécie Etanol (ultrasom) Hexano (Ultrasom)

Pa ≤0,08(≤0,08) ≤0,08(≤0,08)

Fn ≤0,08(0,16) ≤0,08(≤0,08)

Aa >10(>10) 5 (>10)

CIM (CBM) mg/ml



5.2 CYMBOPOGON CITRATUS

Para o C. citratus foi avaliada a atividade do extrato bruto e do extrato oleoso contra

as linhagens de P. anaerobius, F. nucleatum e A. actinomycetemcomitans (Tabela 04). O

extrato etanólico, obtido por decocção, foi o que apresentou maior atividade contra A.

actinomycetemcomitans. As CIMs dos extratos hexânicos obtidos pelos diferentes métodos de

extração foram iguais contra A. actinomycetemcomitans (2,5 mg/ml). A mesma CBM também

foi detectada nos diferentes métodos de extração testados (10 mg/ml), exceto para o extrato

obtido por maceração, o qual demonstrou variação de uma diluição (5 mg/ml).

Os extratos de C. citratus obtidos por diferentes métodos de extração com o solvente

hexano forneceram valores de CIM e CBM iguais contra P. anaerobius (0,08 mg/ml). Em

relação ao F. nucleatum, os valores de CIM coincidiram com os de CBM para os extratos

etanólicos e hexânicos, exceto o extrato preparado por turbólise, cuja CIM foi 2,5 mg/ml e

CBM foi 5,0 mg/ml.

40

Decocção Soxhlet Turbólize Maceração Ultrasom Decocção Soxhlet Turbólize Maceração

Pa 0,31 (0,62) 0,08 (0,31) 0,16 (0,31) 0,16 (0,31) ND (ND) 0,08 (0,08) 0,08 (0,08) 0,08 (0,08) 0,08 (0,08)

Fn 0,62 (0,62) 0,62 (0,62) 2,5 (5,0) 2,5 (2,5) 2,5 (2,5) 1,25 (1,25) 1,25 (1,25) 2,5 (2,5) 2,5 (2,5)

Aa 1,25 (5,0) 2,5 (5,0) 2,5 (10) 2,5 (2,5) >10(>10) 2,5 (10) 2,5 (10) 2,5 (10) 2,5 (5,0)

Extrato hexânicoExtrato etanólico

Espécie

CIM (CBM) mg/ml


brutos de C. citratus contra o crescimento de P.anaerobius (Pa), F. nucleatum (Fn) e A. actinomycetemcomitans

(Aa) determinadas pela técnica de microdiluição em caldo.


menos dois ensaios independentes, cada um realizado em triplicata. ND = Não determinado

O óleo essencial de C. citratus apresentou uma atividade antimicrobiana superior

àquela observada para seus extratos. Para o A. actinomycetemcomitans, o óleo essencial

apresentou valores de CIM e CBM de 0,16 mg/ml, ou seja, até quatro diluições menores que

aquelas dos extratos brutos. Para o F. nucleatum a diferença de atividade entre os extratos e o

óleo essencial também foi considerável, pois os menores valores de CIM e CBM para os

extratos foram de 0,62 mg/ml, contra 0,08 mg/ml do óleo essencial, uma diferença de pelo

menos três diluições. Em relação ao P. anaerobius não foi possível determinar se houve

diferença entre a atividade dos extratos hexânicos e do óleo essencial do C. citratus, pois o

óleo essencial não foi testado em concentrações inferiores a 0,08 mg/ml. Assim, de acordo

com os dados a atividade do óleo essencial do C. citratus contra o P. anaerobius é pelo menos

equivalente àquela verificada para os extratos hexânicos, os quais foram mais potentes que os

etanólicos (TABELAS 04 e 05).

Tabela 05- Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de óleo essencial

de C. citratus contra A.actinomycetemcomitans (Aa), F.nucleatum (Fn) e P.anaerobius (Pa) determinada pela

técnica de macrodiluição em caldo.

Espécie Óleo essencial

Aa 0,16 (016)

Fn ≤ 0,08 (≤0,08)

Pa ≤0,08 (≤0,08)

CIM (CBM) mg/ml



41

5.3 PIPER ADUNCUM

A tabela 06 apresenta os dados da atividade antibacteriana de extratos etanólicos e

hexânicos de P. aduncum, preparados por diferentes métodos de extração, contra linhagens de

bactérias periodontopatogênicas. De forma geral observou-se que, dentre as bactérias

avaliadas, o P. anaerobius foi a mais sensível aos extratos etanólicos e hexânicos de P.

aduncum. Os extratos hexânicos de P. aduncum apresentaram menores valores de CIM e/ou

CBM do que seus correspondentes extratos etanólicos para todas as espécies bacterianas

testadas. Na maioria dos casos, o método de extração não interferiu na atividade dos extratos

preparados com o mesmo solvente, pois os valores de CIM e CBM foram idênticos ou com

diferença em apenas uma diluição. Houve diferença em duas diluições apenas para os valores

de CBM do A. actinomycetemcomitans para o extrato etanólico soxhlet (0,62 mg/ml) em

relação ao maceração (2,5 mg/ml), e o hexânico soxhlet (0,62 mg/ml) em relação ao decocção

(2,5 mg/ml) (Tabela 06).


brutos de P. aduncum contra o crescimento de P. anaerobius (Pa), F. nucleatum (Fn) e A.

actinomycetemcomitans (Aa), determinadas pela técnica de microdiluição em caldo.

Decocção Soxhlet Turbólize Maceração Ultrasom Soxhlet Maceração Decocção

Pa 0,08 (0,16) 0,08 (0,16) 0,08 (0,16) 0,08 (0,16) 0,16 (0,16) 0,08 (0,08) 0,08 (0,08) 0,08 (0,08)

Fn 1,25 (2,5) 1,25 (2,5) 1,25 (2,5) 1,25 (2,5) 1,25 (1,25) 0,31 (0,31) 0,31 (0,31) 0,31 (0,31)

Aa 1,25 (1,25) 0,62 (0,62) 1,25 (1,25) 1,25 (2,5) 0,62 (1,25) 0,62 (0,62) 0,62 (1,25) 0,62 (2,5)

Espécie

CIM (CBM) mg/ml

Extrato etanólico Extrato hexânico



Os principais constituintes voláteis dos extratos etanólicos (maceração, ultrassom,

decocção) e hexânicos (maceração, decocção) de P. aduncum foram identificados por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. A Tabela 07 apresenta a relação

dos doze compostos majoritários identificados, ou seja, compostos que demonstraram

porcentagem superior a 4% em pelo menos um dos extratos. A maioria desses compostos é

classificada como sesquiterpenos (Cariofileno, -Calacoreno, -Elemeno, Cis- - cadineno,

42

Germacreno D, Óxido de Linalol, Nerolidol, β-Elemeno, δ-Cadineno, α-Cariofileno), mas

também foram identificados monoterpeno (Linalol) e álcool graxo (Falcarinol). Os extratos

obtidos por maceração e decocção e preparados com o mesmo solvente apresentaram perfil

fitoquímico muito semelhante, qualitativa e quantitativamente. A única diferença qualitativa

observada foi o oxido de linalol para o extrato etanólico, o qual foi detectado na extração por

maceração (em pequena porcentagem – 0,55%), mas não na decocção. Diferenças qualitativas

e quantitativas foram mais evidentes quando diferentes solventes foram utilizados: o

composto Cis- -cadineno foi detectado apenas nos extratos etanólicos; o linalol foi pelo

menos três vezes mais abundante nos extratos etanólicos maceração e decocção em relação

aos correspondentes hexânicos e o δ-Cadineno foi cerca de 1,7 vezes mais abundante no

extrato etanólico maceração do que no hexânico maceração. Contudo, as maiores diferenças

foram observadas para o extrato preparado por ultrassom: os compostos -Calacoreno e

Falcarinol foram detectados exclusivamente no extrato obtido por essa técnica, por outro lado,

-Elemeno, Germacreno D, β-Elemeno e δ-Cadineno só não foram encontrados nesse extrato.

Tabela 07 - Compostos voláteis majoritários identificados em extratos etanólicos e hexânicos de folhas de P.

aduncum obtidos por diferentes métodos de extração.

Maceração Ultrasom Decocção Maceração Decocção

Cariofileno 6,78 7,56 5,63 6,06 5,51

α-Calacoreno - 5,41 - - -

-Elemeno 14,48 - 13,49 13,27 14,78

Cis -cadineno 17,16 - 15,39 - -

Falcarinol - 6,06 - - -

Germacreno D 17,16 - 15,39 17,84 18,93

Linalol 2,44 8 1,89 0,74 0,56

Óxido de Linalol 0,55 4,34 - - -

Nerolidol 13,41 18,45 15,24 15,26 15,78

β-Elemeno 3,12 - 2,68 3,57 3,83

δ-Cadineno 6,01 - 5,73 3,51 4,51

α-Cariofileno 7,49 8,25 6,06 6,65 6,26

Compostos

% dos compostos nos extratos

Etanólico Hexânico

43

6 DISCUSSÃO

Com esse trabalho pretendeu-se encontrar novas espécies vegetais com propriedades

antimicrobianas contra bactérias anaeróbias periodontopatogênicas. Foi demonstrado que

extratos de P. aduncum, P. ruderale e Cymbopogon citratus, além do óleo essencial dessa

última, possuem atividade, em grau diferente, contra três espécies envolvidas em doenças

periodontais: A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum e P. anaeobius. Observou-se que o P.

anaerobius foi a espécie mais sensível aos extratos testados. Este fato é consistente com os

resultados de estudos anteriores (OKUNADE et al., 1997; NOSTRO et al., 2000; ALVIANO

et al., 2008), os quais demonstraram uma maior sensibilidade de bactérias Gram-positivas a

extratos de diferentes plantas em relação às Gram-negativas. Segundo Nostro e colaboradores

(2000), a razão para a diferença de sensibilidade entre os tipos de bactérias pode ser atribuída

às constituições da parede celular destes microorganismos. Bactérias Gram-negativas têm a

parede celular composta de peptideoglicano e apresenta ainda uma membrana externa

composta por fosfolipídios, lipoproteína e lipopolissacarídeo que servem como uma barreira

seletiva para entrada e saída substâncias. As bactérias Gram-positivas são mais suscetíveis,

pois apresentam na sua camada externa apenas peptideoglicanos que não são muito eficazes

como barreira de permeabilidade.

Apesar de não haver entendimento sobre o nível de inibição antimicrobiana aceitável

para considerar um material vegetal promissor, o critério proposto por Aligiannis e

colaboradores (2001) para classificar potência de produtos vegetais, baseado em valores de

CIM tem sido adotado por outros pesquisadores (DUARTE et al., 2005) e consiste nos

seguintes parâmetros: inibidor forte - CIM até 0,5 mg/ml; inibidor moderado - CIM entre 0,6

e 1,5 mg/ml; inibidor fraco - CIM acima de 1,6 mg/ml. De acordo com esse critério, o óleo

essencial de C. citratus apresentou forte atividade contra as três espécies bacterianas testadas.

Esses dados estão em acordo com trabalhos anteriores que demonstram que o óleo essencial

de plantas é uma importante fonte de compostos com atividade antimicrobiana (DUARTE et

al., 2005; HERNANDEZ et al.,2007). Segundo Cowan (1999), o óleo essencial é o

responsável pelo odor característico, ou seja, a essência das plantas. Estes óleos são

compostos por metabólitos secundários altamente enriquecidos por compostos denominados

terpenos, e que ocorrem como diterpenos, triterpenos e tetraterpenes. Assim o óleo essencial

de C. citratus é uma mistura de citral e terpenos, utilizado na medicina popular como

antimicrobiano, antiinflamatório e sedativo (NEGRELLE & GOMES, 2007). Além disto, os

44

resultados de Duarte (2005) demonstraram que os óleos essenciais apresentaram ação sobre

um maior número de microrganismos quando comparado aos extratos.

Todos os extratos apresentaram forte atividade contra o P. anaerobius. Em relação ao

F. nucleatum, a forte atividade foi observada para os extratos hexânicos e etanólicos de P.

ruderale, para os extratos hexânicos de P. aduncum e para os extratos etanólicos de C.

citratus. A espécie A. actinomycetemcomitans foi a menos sensível aos extratos, sendo que

nenhum deles demonstrou forte atividade sobre essa bactéria. Os extratos de P. ruderale e de

C. citratus apresentaram fraca atividade, exceto o C. citratus decocção, o qual apresentou

atividade moderada. O melhor resultado foi obtido com extratos hexânicos de P. aduncum

que, juntamente com seus extratos etanólicos, demonstraram atividade moderada sobre o A.

actinomycetemcomitans. A atividade biológica de espécies do gênero Piper é muito

diversificada, o que justifica sua ampla utilização na medicina popular para o tratamento de

inúmeras doenças. A atividade antibacteriana do P. aduncum já foi relatada por vários

autores, entre eles OKUNADE et al., 1997, FIGUEIRA et al., 2003, MARTINEZ et al., 2003,

DUARTE et al., 2005, NAVICKIENE et al., 2006, RALI et al., 2007. Em um estudo que

avaliou a atividade antimicrobiana de 92 plantas medicinais hondurenhas, o extrato de P.

aduncum demonstrou atividade contra bactérias orais, incluindo as espécies

periodontopatogênicas F. nucleatum, P. intermedia e A. actinomycetemcomitans (LENTZ et

al., 1998). Nesse trabalho a bioatividade dos extratos foi avaliada pela técnica de difusão em

ágar, por meio da medida dos halos de inibição. Desse modo, não foram determinados os

valores de CIM ou CBM, pois a técnica é apenas qualitativa.

Em relação ao uso de diferentes métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de

produtos vegetais, Cos e colaboradores (2006) argumentam que uma vez que esses métodos

não são igualmente sensíveis ou baseados no mesmo princípio, os resultados serão

profundamente influenciados pelo método escolhido. Sobre o método de disco-difusão, esses

autores acrescentam que o método não é apropriado para testar amostras não-polares ou

amostras que não se difundem facilmente no ágar. Nessas situações os métodos de diluição

em caldo são vantajosos, pois permitem ainda determinar se o composto ou extrato tem ação

microbiostática ou microbicida em uma determinada concentração.

Um dos objetivos deste estudo foi comparar os resultados de CIM dos extratos

utilizando os métodos de micro e macrodiluição em caldo. No entanto, em função do pouco

45

rendimento da maioria dos extratos, não foi possível testar a atividade dos mesmos pela

técnica de macrodiluição, a qual requer uma grande quantidade de material. Essa análise foi

realizada apenas para extratos etanólicos e hexânicos de P. ruderale. Pela técnica de

macrodiluição, não foi possível definir o valor de CIM para P. anaerobius e F. nucleatum,

visto que esses microrganismos foram sensíveis à menor concentração testada dos extratos

(0,08 mg/ml). No entanto, é possível verificar que em relação ao extrato etanólico ultrassom,

o valor de CIM na macrodiluição para o F. nucleatum foi pelo menos quatro vezes menor

(duas diluições) em relação à microdiluição. Já para o A. actinomycetemcomitans a diferença

no valor de CIM do extrato hexânico foi de duas vezes (uma diluição) entre a macro e

microdiluição, sendo o menor valor verificado na microdiluição. Esse dado está em acordo

com trabalhos anteriores que avaliaram a sensibilidade bacteriana a agentes antimicrobianos e

encontraram que, para bacilos gram-negativos, os valores de CIM da microdiluição são

geralmente uma diluição 2 vezes mais baixos do que os valores de CIM dos testes de

macrodiluição. Em relação aos cocos gram-positivos, as duas técnicas dão resultados

essencialmente equivalentes (BARRY et al., 1978). A técnica de microdiluição mostrou-se

inadequada para avaliar a atividade do óleo essencial visto que houve inibição do crescimento

bacteriano até nos poços correspondentes ao controle positivo, ou seja, onde o óleo não foi

adicionado. Esse efeito ocorreu possivelmente pela ação de compostos antibacterianos

voláteis muito ativos, o que corrobora o forte efeito antibacteriano desse óleo essencial

observado nos ensaios de macrodiluição.

Na maioria dos casos a técnica de extração empregada na obtenção dos extratos teve

pouco efeito sobre a atividade dos mesmos. De fato, as análises de CG-MS mostraram que o

perfil fitoquímico dos extratos foi muito semelhante, onde os principais constituintes foram

mantidos, independentemente do método de extração utilizado. Por outro lado, a diversidade

de compostos identificados nos extratos hexânicos foi maior que nos correspondentes extratos

etanólicos, o que pode explicar a maior atividade antibacteriana dos primeiros. Segundo

Adekunle & Ikumapayi (2006) processos de extração podem influenciar na concentração dos

compostos fitoquímicos presentes nos extratos e provocar diferenças nas taxas de inibição dos

mesmos.

A técnica de extração empregada teve pouco efeito na atividade dos extratos

preparados com o mesmo solvente, pois, na maioria dos casos, os valores de CIM e CBM

foram idênticos, ou com diferença em apenas uma diluição. O fator que exerceu mais

46

influência na determinação da atividade do extrato foi o tipo de solvente utilizado. Para o P.

aduncum e P. ruderale, os extratos hexânicos claramente foram mais ativos que seus

correspondentes etanólicos. Essa diferença de atividade do extrato hexânico também foi

observada por Hernandez e colaboradores (2007), que ao estudar a Cordia curassavica

(Boraginaceae), encontrou uma atividade antibacteriana maior do extrato hexânico contra o

Vibrio choleraes (CIM= 125 mg/ml), em relação aos seus correspondentes metanol (CIM=

2000 mg/ml) e clorofórmio (CIM=1500 mg/ml). Segundo Victório e colaboradores (2009)

parâmetros como tempo, solvente, temperatura e técnica de extração influenciam a extração

de metabólitos secundários. Outro estudo demonstrou que diferentes técnicas de extração

podem interferir quantitativamente e qualitativamente na composição do extrato (PAIVA et

al., 2004). Além disto, a eficácia terapêutica dos compostos ativos das plantas pode ser

afetada pela localização geográfica, época de colheita e condições de armazenamento entre

outros fatores. Esses fatores poderiam, em determinados casos, serem responsáveis pelas

observações contrastantes na ação farmacológica da planta (MATU & VAN STADEN, 2003).

As análises de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas para os

extratos de P. aduncum confirmaram os efeitos dos solventes e técnicas de extração sobre a

composição dos extratos, pois ao utilizar vários métodos de extração pode-se identificar um

maior número de compostos. A coincidência nos valores de CIM entre as extrações por

decocção e maceração preparadas com o mesmo solvente pode ser correlacionada com a

semelhança do perfil fitoquímicos desses extratos.

Os principais constituintes voláteis que identificamos nos extratos de P. aduncum

foram sesquiterpenos (Cariofileno, -Calacoreno, -Elemeno, Cis- - cadineno, Germacreno

D, Óxido de Linalol, Nerolidol, β-Elemeno, δ-Cadineno, α-Cariofileno), monoterpeno

(Linalol) e álcool graxo (Falcarinol). Isso está de acordo com trabalhos anteriores que

demonstraram que os componentes voláteis das partes aéreas de espécies de Piperaceae são

misturas variáveis, com predomínio de sesquiterpenos e monoterpenos, embora diterpenos e

fenilpropanóides também sejam encontrados (OKUNADE et al., 1997, NOSTRO et al., 2000,

MARTINEZ et al.,2003, NAVICKIENE et al., 2006).

Os sesquiterpenos são substâncias que apresentam esqueletos carbônicos com ampla

atividade antibacteriana, anti-fúngica e inibidores enzimáticos (ABRAHAM, 2001). O

composto cariofileno e seu isômero α–cariofileno classificados como sesquiterpenos,

47

apresentaram atividade antiinflamatória e antitumoral (VALLILO, 2006, RUDIGER et al.,

2007). Estudos também evidenciaram a presença destes metabólitos em outras plantas, tais

como, Ageratum conyzoides L (CASTRO et al., 2004), Leonurus sibiricus L (ALMEIDA et

al., 2005), Pothomorphe umbellata (MESQUITA et al., 2005).

O -Elemeno, Cis- -cadineno, Germacreno D e Nerolidol foram os compostos

identificados em maior quantidade nos extratos de P. aduncum. Um estudo realizado em

Papua Nova Guiné com extrato de folhas de P. aducum identificou os mesmos compostos

encontrados neste estudo, com exceção dos metabólitos -Calacoreno, Cis- -cadineno,

Óxido de Linalol, Linalol e Falcarinol (RALI et al., 2007). Sendo assim, é importante

ressaltar que a composição do extrato pode ser influenciada por vários fatores, tais como:

solvente, temperatura, métodos de extração, condições climáticas e geográficas (MATU &

VAN STADEN, 2003, PAIVA et al., 2004, ADEKUNLE & IKUMAPAYI , 2006,

VICTÓRIO et al.,2009).

O estudo revelou que extratos de P. ruderale, P. aduncum e C.citratus, além do óleo

essencial de C. citratus apresentaram forte atividade antibacteriana contra importantes

espécies de bactérias anaeróbias periodontopatogências, sugerindo que eles podem ser úteis

para o desenvolvimento de novos compostos direcionados para a prevenção e/ou tratamento

de doenças periodontais causadas por esses microrganismos.

48

7 CONCLUSÕES

Os extratos de Porophyllum ruderale, Piper aduncum e Cymbopogon citratus

apresentaram forte atividade antibacteriana contra P. anaerobius;

O óleo essencial de C. citratus apresentou forte atividade antibacteriana contra A.

actinomycetemcomitans, F. nucleatum e P. anaerobius;

Os extratos de Porophyllum ruderale e de Piper aduncum apresentaram forte

atividade antibacteriana contra P. anaerobius;

Os extratos de P. aduncum e de C. citratus apresentaram atividade moderada contra

A. actinomycetemcomitans;

Os extratos obtidos pelos diferentes métodos de extração com solvente hexânico

foram mais ativos do que aqueles obtidos com etanol;

Os principais constituintes voláteis identificados nos extratos de P. aduncum foram

sesquiterpenos;

49

8 PERSPECTIVAS PARA CONTINUIDADE DO TRABALHO

Analisar, separar e determinar a CIM e CBM dos constituintes presentes nos extratos

de P. ruderale, P. aduncum e C. citratus;

Determinar as curvas de morte de A. Actinomycetemcomitans, F. nucleatum e P.

anaerobius na presença de diferentes concentrações dos extratos de P. ruderale, P.

aduncum e C. citratus, para se definir o mecanismo de ação (bactericida ou

bacteriostático).

Realizar testes para avaliar a atividade antiinflamatória, antitumoral e leishmanicida

dos extratos;

Realizar análise de toxicidade celular dos extratos.

50

REFERÊNCIAS

ABRAHAM, W.R. Bioactive sesquiterpenes produced by fungi: are they useful for humans as

well? Current Medicinal Chemistry, v.8, p.583-606, 2001.

ADEKUNLE, A.M.; IKUMAPAYI. Antifungal Property and Phytochemical Screening of the

Crude Extracts of Funtumia Elastica and Mallotus Oppositifolius. West Indian Medical

Journal. 55 (4), 1, 2006.

ALIGIANNIS, N. et al. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of two

Origanum species. Journal Agriculture Food Chemincal. 40: 4168-4170, 2001.

ALMEIDA, L.F.R., DELACHIAVE, M.E.A., MARQUES, M.O.M. Composição do óleo

essencial de rubim (Leonurus sibiricus L. – Lamiaceae). Revista Brasileira de Plantas

Medicinais, Botucatu, v.8, n.1, p.35-38, 2005.

ALVIANO, W.S. et al. In vitro antioxidant potential of medicinal plant extracts and their

activities against oral bacteria based on Brazilian folk medicine. Archives of oral biology.

53, 545 – 552, 2008.

AVILA-CAMPOS, M.J.; RIVERA, J.N.; NAKANO, V. Genetic diversity of oral

Fusobacterium nucleatum isolated from patients with different clinical conditions. Revista do

Instituto de Medicina tropical de São Paulo.São Paulo 48(2), 59-63, 2006.

AXEISSON, P; LINDHE, J. The effect of a preventive programme on dental plaque,

gingivitis and caries in schoolchildren. Results after one and two years. Journal of Clinical

Periodontology .1,126-138, 1974.

BARRY, A.L; JONES, R.N.; GAVAN, T.L.; Evaluation of the Micro-Media System for

quantitative antimicrobial drug susceptibility testing. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy. 13, 61-69, 1978.

BOLSTAD, A.I.; JENSEN, H.B.; BAKKEN, V. Taxonomy, biology, and periodontal aspects

of Fusobacterium nucleatum. Clinical Microbiology Reviews. V. 9, p.55-71, 1996.

51

BRASILEIRO, B.G. A utilização de plantas medicinais pela população atendida no programa

Saúde da Família –PSF- Governador Valadares-MG. In Anais:V Congresso Internacional

de Plantas Medicinais .Chile, Outubro, 2003.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Proposta de Política

Nacional de Plantas Medicinais e Medicamentos Fitoterápicos. Brasília, 2001. Disponível

em:< http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd03_18.pdf>. Acesso em: 13 mai. 2010.

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC

nº48 de 16 de março de 2004. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos.

Brasília, 18 março de 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/

registro/ legis. htm>. Acesso em: 13 mai. 2010. (a)

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução – RE nº

89, de 16 de março de 2004. Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos. Brasília, 2004.

Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/registro/legis.htm>>. Acesso em:

13 mai. 2010. (b)

CARVALHO, C.M. et al. Rendimento da produção de óleo essencial de capim-santo

submetido a diferentes tipos de adubação. Revista de Biologia e Ciências da Terra. V. 5, n.

2, 2005.

CASTRO, H.G. et al. Teor e composição do óleo essencial de cinco acessos de mentrasto.

Quimica Nova, Vol. 27, No. 1, 55-57, 2004.

CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R.A. Estratégias para a obtenção de compostos

farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação

estrutural para otimização da atividade. Química Nova. V.21, nº1, 1998. Disponível em:

<http:www. scielo.br/pdf/qn/v21n1/3475.pdf. > Acesso em: 8 ago. 2010.

COS, P. et al. Anti-infective potential of natural products: how to develop a stronger in vitro

'proof-of-concept'. Journal of Ethnopharmacology. 106(3), 290-302, 2006.

COSTA, L.C.B. et al. Secagem e fragmentação da matéria seca no rendimento e composição

do óleo essencial de capim-limão. Horticultura Brasileira. Brasília, v.23, n.4, p.956-959,

out/dez , 2005.

COWAN, Marjorie M. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology

Reviews. V. 12, n. 4, p. 564–582, oct. 1999.

http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/

52

DE SOUZA, G.C. et al. Ethnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the south

of Brazil. Journal of Ethnopharmacology, 90 (1), 135-143, 2004.

DOUGHERTY, M.A.; SLOTS, J. Periodontal diseases in young individuals. Journal of the

California Dental Association. 21(1), 55-69, 1993.

DUARTE, M.C. et al. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. Journal of

Ethnopharmacology. 97, 305–311, 2005.

DZINK, J. L; SOCRANSKY, S. S. Comparative in vitro activity of sanguinarine against oral

microbial isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 11, 663-665, 1985.

ELISABTSKY, E.; DE SOUZA, G.C. Etnopharmacologia como ferramenta na busca de

substâncias bioativas In: Farmacognosia da planta ao Medicamento, Organizado por

Cláudia Maria Oliveira Simões. 5a Edição, Editoras Universitária UFSC & UFRGS,

Florianópolis, 2003.

FIGUEIRA, G.M. et al. Atividade antimicrobiana do extrato e do óleo essencial de Piper spp

cultivadas na coleção de germoplamas do CPQBA-Unicamp, Horticultura Brasileira. 21(2):

403, 2003.

FIGUEIREDO, Betânia Gonçalves (org). Farmácia: ofício & história. Belo Horizonte:

Conselho regional de Farmácia do Estado de Minas Gerais, 2005. p.149 -160.

FILOCHE, S. K.; SOMA, K.; SOSSONS, C. H. Antimicrobial effects of essential oils in

combination with chlorhexidine digluconate. Oral Microbiology Immunology. 20, 221–225,

2005.

FONSECA, Maira Christina Marques. Crescimento, composição do óleo essencial, teores

de óleo e tanino em Porophyllum ruderale (Jacq.) Cassini. 2001. 68 f. Dissertação

(Mestrado em Fitotecnia) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2001.

FONSECA, M.C.M., MEIRA, R.M.S.A. e CASALI, V.W.D. Anatomia dos órgãos

vegetativos e histolocalização de compostos fenólicos e lipídicos em Porophyllum ruderale

(ASTERACEAE). Planta Daninha. v. 24, n. 4, p. 707-713, 2006.

53

GAETTI-JARDIM JR.E. et al. Susceptibilidade de bactérias anaeróbias isoladas de infecções

periimplantares e periodontais ao metronidazol, lincosaminas, macrolídeos e tetraciclina.

Revista Odonto Ciência. Fac. Odonto/PUCRS, v. 22, n. 56, abr./jun. 2007.

GIBBONS, S. Anti-staphylococcal plant natural products, Natural Product Reports. 21(2)

263-277, 2004.

GILLETTE, W. Antibiotics and periodontal disease. Journal of Periodontology. 67(7),726,

1996.

GOMES-FILHO I.S. et al. A influência da doença periodontal sobre o tecido pulpar –

avaliações clínica e radiográfica. Revista Sitientibus. n.34, p.101-114, jan./jun. 2006.

GRENIER, D., MAYRAND, D. Periodontitis as an ecological imbalance. In: KURAMITSU,

H. K.; ELLEN, R. P. Oral bacterial ecology: the molecular basis. Norfolk: Horizon

Scientific Press, 2000.314p. cap. 6, p. 275-310.

HEITZ-MAYFIELD, L.J. Disease progression: identification of high-risk groups and

individuals for periodontitis. Journal Clinical Periodontology. 32 (Suppl 6),196-209, 2005.

HEITZ-MAYFIELD, L.J.A.; LANG, N.P. Antimicrobial treatment of peri-implant diseases.

The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 19(suppl.),128-39, 2004.

HERNANDEZ, T. et al. Antimicrobial activity of the essential oil and extracts of Cordia

curassavica (Boraginaceae). Journal of Ethnopharmacology. 111, 137–141, 2007.

HOLT, J.G., KRIEG, N.R., SNEATH, P.H.A. Bergey's manual of determinative

bacteriology. 9.ed. Baltimore : Williams & Wilkins, 1994.

IAUK, L. et al. Antibacterial activity of medicinal plant extracts against periodontopathic

bacteria. Phytother Res. 17(6),599-604, 2003.

KATSURA, H. et al. In vitro antimicrobial activities of bakuchiol against oral

microorganisms. Antimicrobial Agents Chemother. 45(11),3009-13, 2001.

KOLENBRANDER, P.E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic

systems. Annual Review of Microbiology.54,413-37, 2000.

54

KONEMAN, E.W. et al. Diagnóstico microbiológico. Texto e Atlas colorido. 5ª edição. Rio

de Janeiro: Editora Medsi,2001.P.406-412.

KOPCZYK, R. et al. A. Clinical and microbiological effects of a sanguinaria containing

mouthrinse and dentifrice with and without fluoride during six months of use. Journal of

Periodontology, 62, 617-622, 1991.

KORNMAN, K. S. The role of supra-gingival plaque in the prevention and treatment of

periodontal diseases, a review of current concepts. Journal of Periodontal Research. V.16,

5-22, 1986.

LEGGIADRO, R.J. Emerging drug-resistant bacteria: the wake-up call hás come. Southern

Medical Journal. 88, 884-885, 1995.

LENTZ, D.L. et al. Antimicrobial properties of Honduran medicinal plants. Journal of

Ethnopharmacology. 63, 253–263, 1998.

LI, X.C.; CAI, L.; WU, C.D. Antimicrobial compounds from Ceanothus americanus against

oral pathogens. Phytochemistry. 46(1),97-102, 1997.

LÖE, H. et al. Natural history of periodontal disease in man. Rapid moderate and no loss of

attachmant in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal Clin Periodontol.

Copenhagen, v.13, p. 431-440.1986.

LOESCHE, W.J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiology

Reviews. 50, 353–380, 1986.

LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exoticas. São

Paulo: Instituto Plantarum, 2002. 544 p.

LORIAN, V. Antibiotics in Laboratory Medicine. 5ªedição. USA: Williams & Wilkins.

2005. P.127-133.

LOTUFO, R.F.M.; PANNUTI, C.M. Efeitos Diretos dos PatógenosBucais nas Condições

Sistêmicas, em: Brunetti MC. Periodontia Médica. São Paulo, 42-57, 2004.

55

MARCOTTE, H., LAVOIE, C.M. Oral microbial ecology and the role of salivary

immunoglobulin A. Microbiology and Molecular Biology Reviews. v. 62. p. 71-109, 1998.

MARTINEZ, J. et al. Extraction of Volatile Oil from Piper aduncum L. Leaves With

Supercritical Carbon Dioxide . In: 6TH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON

SUPERCRITICAL FLUIDS - 6th ISSF, 2003, Versailles. Proceedings of the 6th

International Symposium on Supercritical Fluids. 2003. v. 1. p. 65-70.

MATU, E.N.; VAN STADEN, J. Antibacterial and anti-inflammatory activities of some

plants used for medicinal purposes in Kenya. Journal of Ethnopharmacology. 87(1), pp.

35-41, 2003.

MESQUITA, J.M.O. et al. Estudo comparativo dos óleos voláteis de algumas espécies de

Piperaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia 15(1): 6-12, Jan./Mar. 2005.

MORANDIM.A.A. et al. Intraspecific variability of dihydrochalcone, chromenes and benzoic

acid derivatives in leaves of Piper aduncum L. (Piperaceae). African Journal of

Biotechnology.V. 8 (10), p. 2157–2162, 2009.

MURDOCH, D.A. Gram-Positive Anaerobic Cocci. Clinical Microbiology Reviews. V. 11,

n. 1, p. 81–120, 1998.

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS)

Methods for Antimicrobial susceptibility testing for anaerobic bacteria; Approved standard,

6th Edition, NCCLS document M11-A6. National Committee for Clinical Laboratory

Standards. Wayne, Pa, USA, 2004.

NAVICKIENE,H.M.D. et al. Composition and antifungal activity of essential oils from Piper

aduncum, Piper arboreum and Piper tuberculatum. Química Nova. Vol. 29, No. 3, 467-470,

2006.

NEGRELLE, R.R.B; GOMES, E.C. Cymbopogon citratus (DC.) Stapf : chemical

composition and biological activities. Rev. Bras. Pl. Med, v.9, n.1, p.80-92, 2007.

NETO, Domingos A. L. Efeitos cicatrizantes e antimicrobianos das plantas medicinais

especies Porophyllum ruderale (Arnica), Arctium lappa minor (Bardana) e Plantago

major (Tanchagem ou Cinco Nervos). 1991.123 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de

Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, Piracicaba, 1991.

56

NORSKOV-LAURITSEN, N.; KILIAN, M. Reclassification of Actinobacillus

actinomycetemcomitans, Haemophilusaphrophilus, Haemophilus paraphrophilus and

Haemophilus segnis as Aggregatibacter actinomycetemcomitans gen. nov., comb. nov.,

Aggregatibacter aphrophilus comb. nov. and Aggregatibacter segnis comb. nov., and

emended description of Aggregatibacter aphrophilus to include V factor-dependent and V

factorindependent isolates. International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology 56, 2135–2146, 2006.

NOSTRO, A. et al. Extraction methods and bioautography for evaluation of medicinal plant

antimicrobial activity.Letters in Applied Microbiology 30, 379-84, 2000.

OKUNADE, A.L. et al. Antimicrobial Properties Of The constituents of Piper aduncum.

Phytother. Res. 11,142–144, 1997.

OMS Organización Mundial de La Salud. Situación regulamentaria de los medicamentos:

uma resena mundial. Traducción del inglés: Organización Panamericana de la Salud.

Washington: OPAS, 2000. 62p.

ONAWUNMI, G.O.; YISAK, W.A.; OGUNLANA, E.O. Antibacterial constituents in the

essential oil of Cymbopogon citratus (DC) STAPF. Journal Ethnopharmacology. 12(3),

279-286, 1984.

PAGE, R.C.; KORNMAN, K.S. The pathogenesis of human periodontitis: an introduction.

Periodontal. 2000, 14, 09-11, 1997.

PAIVA, S.R. et al. Plumbagin quantification in roots of Plumbago scandens L. obtained by

different extraction techniques. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 76 (3), 499-504,

2004.

PAQUETTE, P.W.; RYAN, M.E.; WILDER, R.S. Locally Delivered Antimicrobials:Clinical

Evidence and Relevance. Journal Dental Hyg. 82 Suppl 3:10-5. Oct 1, 2008.

PEREIRA, R.S. et al. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de

infecção urinária. Revista de Saúde Pública. V.38, n.2, p. 326-328, 2004.

PIHLSTROM, B.L.; MICHALOWICZ, B.S.; JOHNSON, N.W. Periodontal diseases. The

Lancet. 366 (9499), 1809-1820, 2005.

57

RALI, T. et al. Volatile chemical constituents of Piper aduncum L and Piper gibbilimbum C.

DC (Piperaceae) from Papua New Guinea. Molecules. 12, 389-394, 2007.

RIGGIO, M.P.; LENNON A. Development of a PCR assay specific for Peptostreptococcus

anaerobius . Journal of Medical Microbiology.V. 51, 1097–1101, 2002.

RUDIGER, A.L.; SIANI, A.C.; VEIGA,V.F. The Chemistry and pharmacology of the South

America genus Protium Burm. f. (Burseraceae). Pharmacognosy Reviews. Vol 1, Issue 1,

Jan- May, 2007.

RUKAYADI, Y.; HWANG, J.K. In vitro activity of xanthorrhizol against Streptococcus

mutans biofilms Letters in Applied. Microbiology. 42, 400–404, 2006.

SCHUCK, V.J.A. et al. Avaliação da atividade antimicrobiana de Cymbopogon citratus.

Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. V. 37, n. 1, jan./abr., 2001.

SIANI, A.C. et al. Óleos essenciais - Potencial anti-inflamatório. Revista Biotecnologia

Ciência & Desenvolvimento. ano 3, n.16, 38-43, 2000.

SIBANDA, T.; OKOH, A. I. The challenges of overcoming antibiotic resistance:Plant

extracts as potential sources of antimicrobial and resistance modifying agents. African

Journal of Biotechnology. 6 (25), pp. 2886-2896, 28 December, 2007.

SILVA, P. Farmacologia. 6ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002. p.1373

SILVEIRA, L.M.S. et al. Atividade antibacteriana de extrato de gervão frente cepas de

Staphylococcus aureus oxacilina-sensíveis e oxacilina-resistentes isoladas de amostras

biológicas. Revista Brasileira de Análise Clínica. v. 39(4), p.299-301, 2007.

SOCRANSKY, S.S. Relationship os bacteria to the etiology of periodontal disease. Journal

Dental Research. 49, 203-22, 1970.

SOCRANSKY, S.S. Microbiology of periodontal disease present status and future

considerations. Journal Periodontal. 48, p.497-504, 1977.

58

SOCRANSKY, S.S.; HAFFAJEE, A.D. Microbiol mechanisms in the pathogenesis of

destructive periodontal diseases: a critical assessment. Journal Periodontal Research. 26,

195-212, 1991.

SOTE, E.O., WILSON, M. In-vitro antibacterial effects of extracts of Nigerian tooth-cleaning

sticks on periodontopathic bacteria. African Dental Journal. 9:15-9, 1995.

TAKARADA, K. et al. Comparison of the antibacterial efficacies of essential oils against oral

pathogens. Oral Microbiology and Immunology. 19(1),61-4, 2004.

TORRES-SANTOS, E. C. et al. Selective effect of 2',6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone

isolated from Piper aduncum on Leishmania amazonensis.” Antimicrobial Agents and

Chemotherapy. 43(5) p.1234-1241, 1999.

VALLILO, M.L., BUSTILLIOS, O. V, AGUIAR, O.T. Indentificação de terpenos no óleo

essencialdos frutos de Campomanesia adamantium (Cambessédes) O. Berg. – Myrtaceae.

Revista Instituto Florestal. v.18 ,n único, p 15-22 dez., 2006.

VAN DER WEIJDEN, G. A. et al. The effect of herbal extracts in an experimental

mouthrinse on established plaque and gingivitis. Journal of Clinical Periodontology 25,

399–403, 1998.

VICTÓRIO, C.P.; LAGE, C.L.; KUSTER, R.M. Flavonoid extraction from Alpinia zerumbet

(Pers.) Burtt et Smith leaves using different techniques and solvents. Eclética Química,

34(1): 19-24, 2009.

VOTTA, Raul. Breve História da Farmácia no Brasil. 2 ª edição. Brasília: Conselho

Federal de Farmácia,1999.p.48.

YANKELL, S. L.; DOLAN, M. M.; EMLING, R. C. Laboratory evaluations of a herbal

sodium bicarbonate dentifrice. Journal of Clinical Dentistry 1 (suppl A), 6-8,1988.

UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE · formulações que amenizassem os problemas relacionados com a...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE · formulações que amenizassem os problemas relacionados com a...