UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas

Uso da extrao acelerada por solvente (ASE) para determinao

cromatogrfica de analitos de cocana e tetraidrocanabinol em amostras de

mecnio

Cnthia de Carvalho Mantovani

Dissertao para obteno do grau de

MESTRE

Orientador:

Prof. Dr. Mauricio Yonamine

So Paulo

2014

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas

Uso da extrao acelerada por solvente (ASE) para determinao

cromatogrfica de analitos de cocana e tetraidrocanabinol em amostras de

mecnio

Verso corrigida

Cnthia de Carvalho Mantovani

Dissertao para obteno do grau de

MESTRE

Orientador:

Prof. Dr. Mauricio Yonamine

So Paulo

2014

Cnthia de Carvalho Mantovani

Uso da extrao acelerada por solvente (ASE) para determinao cromatogrfica de analitos

de cocana e tetraidrocanabinol em amostras de mecnio

Comisso Julgadora

da

Dissertao para obteno de grau de Mestre

__________________________

Prof. Dr. Mauricio Yonamine

orientador/presidente

__________________________

Prof. Dra. Edna Maria de Albuquerque Diniz

1o. examinador

__________________________

Karina Helena Morais Cardozo

2o. examinador

So Paulo, 15 de maio de 2014.

Aos meus pais, Cida e Fausto, pelo amor e

apoio incondicionais. Minha eterna gratido por

serem os maiores e melhores exemplos de

minha vida.

AGRADECIMENTOS

Ao professor e orientador Mauricio Yonamine pelas oportunidades e

acolhimento desde minha graduao. Com muita pacincia sempre se

mostrou pronto a ensinar, sendo um grande exemplo de seriedade e

comprometimento.

Aos amigos Rafael e Carolina, pelo convvio que tornou esta jornada mais

leve em inmeros momentos. Sou muito grata por tudo que me

ensinaram e por todo o apoio e ajuda em diversos aspectos de meu

trabalho. Muitas de minhas conquistas tiveram essencial contribuio de

vocs.

Ao Andr Grilo, por tornar o laboratrio divertido e pelas reflexes e

discusses filosficas do dia a dia.

Camila, grande amiga que com carinho e prontido me auxiliou em

momentos difceis.

Aos alunos de iniciao cientfica, Marcela e Guilherme, que me

acompanharam e fizeram parte de diferentes etapas deste trabalho.

s professoras Elizabeth Nascimento e Tania Marcourakis pelos conselhos e

conversas.

Aos colegas ps-graduandos Marcelo, Ariana, Sarah, Tiago, Cando, Eric,

Wesley, Carine, Isabel, Jos e Raphael Caio pelo convvio e troca de

informaes.

Leila Bonadio, pela reviso das referncias.

Aos funcionrios Luzia, ngelo e Samantha por sempre estarem dispostos

e prontos a ajudar.

s enfermeiras da maternidade e UTI neonatal do Hospital Universitrio

pelo auxlio com a coleta das amostras, e s voluntrias que participaram

deste estudo.

s funcionrias do Laboratrio de Anlises Toxicolgicas Beatriz, Tatiana,

Flvia e Gabriela pelo convvio e ajuda no laboratrio.

minha famlia, especialmente minha irm Danielle, parte essencial de

minha vida, sem a qual no seria quem sou.

Aos meus amigos Doug, Aninha, Dri, Patche, Dudu, Panda, Laura,

Luciana, Luiza, Mari e Alex pelo companheirismo, pelas conversas,

diverses e apoio que so to importantes em minha vida.

Ao meu companheiro Vitor, por estar ao meu lado nessa jornada, por me

apoiar e ajudar a crescer. Voc ocupa um lugar especial em meu corao.

Resumo

MANTOVANI, C.C. Uso da extrao acelerada por solvente (ASE) para determinao

cromatogrfica de analitos de cocana e tetraidrocanabinol em amostras de mecnio.

2014. 97 f. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de

So Paulo, So Paulo, 2014.

O consumo de drogas de abuso grave problema de sade pblica em todo o mundo. No

Brasil observa-se aumento no nmero de usurias em idade frtil, levando a crescente

preocupao com relao exposio fetal. Efeitos deletrios como diminuio do peso e

crescimento fetal, parto prematuro, dficits neurolgicos e comportamentais esto associados

ao uso de cocana e cannabis durante a gestao. Portanto, importante obter informaes

acerca do consumo de drogas durante a gravidez, permitindo intervenes mdicas e

psicolgicas adequadas. Os relatos fornecidos pelas gestantes so relevantes, porm muitas

vezes resultam em dados subestimados devido omisso de informaes por medo de aes

punitivas. Desta forma, a confirmao por meio de anlises toxicolgicas em amostras

biolgicas se faz necessria. O mecnio, primeiras fezes do recm-nascido, tem sido proposto

como matriz adequada para avaliao da exposio fetal, pois apresenta coleta no invasiva,

fcil obteno e fornece informaes de longo prazo (2 e 3 trimestre de gestao).

Entretanto, uma matriz complexa, exigindo diversas etapas de purificao para posterior

anlise. No presente trabalho, mtodos analticos foram desenvolvidos visando deteco dos

biomarcadores da exposio fetal cocana e ao tetraidrocanabinol em amostras de mecnio

por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (GC-MS). Para ambos os

mtodos, a extrao acelerada por solvente (ASE) foi utilizada para o isolamento dos analitos

de interesse de amostras de mecnio, j que esta apresenta vantagens frente s tcnicas

convencionais, devido sua maior eficincia e menor manipulao da amostra. Associada

ASE, a extrao em fase slida (SPE) foi empregada para purificao e concentrao dos

analitos de interesse. Na etapa de desenvolvimento, inicialmente foram estabelecidos os

procedimentos de derivatizao e as condies cromatogrficas a serem empregadas nas

anlises. Posteriormente, realizou-se a otimizao dos procedimentos empregados na ASE,

atravs de anlise de superfcie de resposta. Os mtodos foram validados de acordo com o

preconizado por referncias internacionais, estabelecendo-se os limites de deteco e

quantificao, recuperao, linearidade, preciso intra e interensaio e exatido. O mtodo para

deteco dos biomarcadores da cocana foi aplicado em 342 amostras de mecnio,

provenientes do Hospital Universitrio da Universidade de So Paulo (HU-USP). Destas, 19

(5,6%) apresentaram resultado positivo para um ou mais biomarcadores da exposio fetal

cocana. Alm disto, foi observada reduo estatisticamente significante do peso ao

nascimento, comprimento e permetro ceflico entre os recm-nascidos expostos cocana

durante a gestao. O mtodo para a deteco da exposio fetal ao tetraidrocanabinol foi

aplicado em 6 amostras positivas, obtidas do HU-USP, mostrando a aplicabilidade da tcnica

desenvolvida.

Palavras-chave: Extrao acelerada por solvente, exposio fetal, cocana,

tetraidrocanabinol, mecnio, cromatografia gasosa, espectrometria de massas.

Abstract

MANTOVANI, C.C. Accelerated solvent extraction (ASE) for chromatographic analysis

of cocaine and tetrahydrocannabinol analytes in meconium samples. 2014. 97 f.

Dissertao (Mestrado) Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo,

So Paulo, 2014.

The use of illicit drugs is a relevant public health problem in the world. In Brazil, the number

of women users in fertile age is increasing, which leads to a growing concern regarding fetal

drug exposure. Adverse outcomes such as low birth weight, intra-uterine growth restriction,

preterm birth, neurobehavioral and developmental deficits are associated with cocaine and

cannabis use during pregnancy. Consequently, it would be important to obtain data related to

drug misuse during gestation with the aim to plan medical and psychological interventions.

Self-report drug use by pregnant women is often inaccurate due to feelings of guilt or fear of

punitive actions. Therefore, confirmation by toxicological analysis in biological matrices must

be accomplished. Meconium, the first stool of the newborn, has been proposed as a proper

matrix to evaluate fetal exposure because it is collected by an easy and non-invasive way and

enables the achievement of long-term information regarding fetal exposure. However,

meconium is a complex matrix, which requires extensive sample cleaning previously to the

analytes identification. In the present research, analytical methods were developed aiming the

determination of cocaine and tetrahydrocannabinol biomarkers in meconium samples through

gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Accelerated solvent extraction (ASE) was

used for analytes isolation due to its advantages over conventional techniques, such as greater

extraction efficiency and minor sample handling. In order to achieve proper analytes

selectivity and detectability, solid phase extraction (SPE) was employed for post-extraction

clean-up. Initially, the derivatization procedure and chromatographic parameters were

established for the development of the methods. Afterwards, ASE procedure was optimized

through response surface methodology. The analytical methods were validated in accordance

to international references. Limits of detection and quantification, recovery, linearity,

precision and accuracy were obtained. The developed method for cocaine was applied i