USO DE VETORES ADENOVIRAIS NO DIAGNÓSTICO DE … · pigmentação da pele e os vários graus de...
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1 RICARDO ALEXANDRE LEITE USO DE VETORES ADENOVIRAIS NO DIAGNÓSTICO DE PORTADORES DE XERODERMA PIGMENTOSUM E EM ESTUDOS DE REPARO DE DNA Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Microbiologia. Orientador: Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck São Paulo 2008
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RICARDO ALEXANDRE LEITE
USO DE VETORES ADENOVIRAIS NO DIAGNÓSTICO DE
PORTADORES DE XERODERMA PIGMENTOSUM E EM ESTUDOS
DE REPARO DE DNA
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Microbiologia. Orientador: Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck
São Paulo 2008
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RESUMO
LEITE, R A. Uso de vetores adenovirais no diagnóstico de xeroderma pigmentosum e em estudos de reparo de DNA. 99 f. Tese - Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Um dos mais versáteis mecanismos de reparo de DNA é o reparo por excisão de
nucleotídeos (“nucleotide excision repair”- NER). Defeitos genéticos associados a esta via
podem gerar diferentes síndromes com deficiência de reparo. Dentre essas, xeroderma
pigmentosum (XP) é a que apresenta maior sensibilidade à luz solar, resultando em um grande
aumento na incidência de tumores em regiões expostas da pele e, em alguns casos,
degeneração neurológica progressiva e envelhecimento prematuro. Na primeira parte deste
projeto é apresentado o uso de adenovírus recombinantes portando genes da via de NER para
identificar a deficiência gênica de três pacientes portadores de XP. Na segunda parte do
trabalho os estudos de reparo de DNA são estendidos a modelos animais, com deficiências
nos mesmos genes carregados pelos vetores adenovirais. A expressão gênica do vetor foi
avaliada pela detecção de proteína e por visualização da fluorescência de EGFP na pele dos
animais infectados. Em resumo, este trabalho apresenta o uso eficiente de vetores adenovirais
portando genes de reparo em ensaios in vitro e in vivo, e descreve duas mutações deletérias no
gene XPC de pacientes XP brasileiros, incluindo uma mutação nova.
Palavras-chaves: Reparo de DNA. Xeroderma Pigmentosum. Vetores adenovirais. Reparo por excisão de nucleotídeos. Radiação ultravioleta. XPC.
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ABSTRACT LEITE, R A. Use of adenoviral vectors at diagnosis of xeroderma pigmentosum patients and DNA repair studies. 99 f. Thesis - Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
One of the most versatile mechanisms of DNA repair is the nucleotide excision repair
(NER). Genetic defects in NER can generate different syndromes. Among these, xeroderma
pigmentosum (XP) presents the highest sensitivity to sunlight, resulting in a large increase in
the incidence of skin cancer, especially in areas exposed to the sunlight, and in some cases,
progressive neurological degeneration and premature aging. In the first part of this project,
adenoviral vectors carrying NER genes were used to identify genetic deficiency of three XP
patients. The second part of work was extended to animal models, deficient for the same XP
genes carried by adenoviral vectors. The genetic expression of vector was evaluated by
detection of protein and EGFP fluorescence visualization in the skin of animals transduced. In
summary, this work presents the use of adenovirus, carrying DNA repair genes for in vitro
and in vivo studies and reports two deleterious mutations in Brazilian XP patients, including a
new mutation.
Key words: DNA repair. Xeroderma Pigmentosum. Adenoviral vectors. Nucleotide excision repair. UV radiation. XPC.
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1 INTRODUÇÃO
A molécula de DNA (Ácido desoxirribonucléico) foi inicialmente isolada por
Friedrich Miescher (DAHM, 2005), em 1869, a partir de células presentes no pus.
Inicialmente batizado como nucleína, posteriormente foi renomeado como ácido nucléico em
1889 por Richard Altmann. Somente no século XX foram realizados trabalhos que agregavam
ao DNA o papel central no armazenamento e perpetuação das informações genéticas dos seres
vivos (LORENZ e WACKERNAGEL, 1994), (HERSHEY e CHASE, 1952), (AVERY et al.,
1979). Em complementação a estes trabalhos foi feita a descrição da estrutura do DNA, que
rendeu o prêmio Nobel a James Watson e Francis Crick (WATSON e CRICK, 1953),
juntamente com Maurice Wilkins (WILKINS et al., 1953).
A integridade da molécula de DNA e consequentemente das informações contidas
nela são fundamentais para o funcionamento e perpetuação de todos os seres vivos. Apesar da
estabilidade intrínseca da molécula de DNA e dos meios físicos de proteção ao DNA, como a
pigmentação da pele e os vários graus de empacotamento da cromatina, a molécula de DNA é
constantemente afetada pela ação de agentes lesivos de origem endógena ou ambiental. Estas
lesões podem ser causadas por fatores físicos (radiações com luz ultravioleta-UV e ionizantes)
ou químicos (exemplos; agentes alquilantes, radicais livres de oxigênio). Como resultado,
ocorre grande quantidade de lesões que podem acarretar em morte celular, degeneração dos
tecidos, envelhecimento e câncer (TUTEJA e TUTEJA, 2001).
Mesmo na resolução da estrutura da dupla-hélice do DNA, em 1953 por Watson e
Crick, apesar da citação aos possíveis tautomerismos de bases, os mecanismos de reparo de
DNA não foram citados. O primeiro relato de que o material genético pudesse ser reparado
após introdução de lesões aconteceu em 1948, com a descoberta da fotorreativação, ou
reversão direta da lesão, concomitantemente e independentemente por Albert Kelner
(KELNER, 1949) e Renato Dulbecco (DULBECCO, 1949). Em continuidade a esta
descoberta, a biologia molecular permitiu a caracterização de diversos sistemas de reparo e
deixou claro que o material genético é extremamente valioso e que possui uma intrincada rede
para sua manutenção estrutural. Dada a importância e o grau de conservação de alguns
mecanismos de reparo, provavelmente alguns deles já eram existentes desde o início da vida
na Terra (DE LAAT et al., 1999).
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1.1 Luz ultravioleta e suas conseqüências no DNA
Dentre os fatores de origem ambiental a radiação UV tem grande destaque. Ela
interage com a molécula de DNA e provoca a formação de lesões específicas que
comprometem processos fundamentais, como transcrição e replicação, resultando na parada
da progressão do ciclo celular, indução de apoptose e instabilidade genômica. Em organismos
multicelulares, a persistência dessas lesões no DNA pode originar mutações e culminar em
processos como envelhecimento e tumorigênese.
A radiação UV está contida na faixa de luz com comprimento de onda abaixo do
espectro visível, entre 100 e 400 nm e é classificada como UV-A (315-400 nm), UV-B (280-
315 nm) e UV-C (100-280 nm) (GALLAGHER e LEE, 2006). A principal fonte de radiação
UV é a luz solar, e apenas os comprimentos de onda mais longos, UV-A e parte de UV-B,
conseguem passar pela camada de ozônio e atingir a superfície terrestre.
A radiação UV com comprimentos de onda mais curtos é mais lesiva ao DNA.
Embora absorvida pela camada de ozônio da atmosfera terrestre e, portanto, com pouca
contribuição ambiental efetiva em relação aos outros espectros de UV, a UV-C constitui uma
das principais ferramentas utilizadas nos laboratórios em estudos visando investigação dos
efeitos de danos no DNA. Outro exemplo é o uso de lâmpadas germicidas com emissão de
UV-C para esterilização de ambientes e equipamentos. Dentre a faixa de luz UV que incide
sobre a superfície terrestre, a luz UV-B é a mais agressiva a saúde humana podendo, em
excesso, causar eritema, câncer de pele e imunossupressão. A radiação UV-A, por sua vez,
pode causar envelhecimento da pele e tem sido apontada como importante, juntamente com a
radiação UV-B, para o desenvolvimento de câncer de pele em animais e imunossupressão em
humanos (GALLAGHER e LEE, 2006).
Em resposta e como defesa ao excesso da radiação solar, a pele aumenta a produção
de melanina e o espessamento da epiderme (hiperplasia), o que minimiza a penetração da UV
na camada basal de células tronco epidérmicas, onde geralmente, tem início o processo
cancerígeno (GLOSTER e BRODLAND, 1996).
As lesões causadas pela luz UV no DNA são denominadas fotoprodutos. Os
principais fotoprodutos gerados pela luz UV (principalmente UV-C E UV-B) são dímeros
resultantes da excitação e conseqüente formação de ligações covalentes entre duas pirimidinas
adjacentes presentes em uma mesma fita de DNA. Os fotoprodutos mais comuns induzidos
pela luz UV são os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD) e os fotoprodutos (6-4), 6-4 PPs
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(FRIEDBERG et al., 2005). Nos CPDs as pirimidinas tornam-se covalentemente ligadas pela
formação de um anel ciclobutano entre os átomos de carbono C5 e C6 de ambas as bases
nitrogenadas (Figura 1A). No caso dos 6-4PPs, os carbonos covalentemente ligados são o C6
e o C4 das pirimidinas 5’ e 3’, respectivamente (Figura 1B). Ambos fotoprodutos promovem
distorções na molécula de DNA, sendo mais acentuadas as distorções causadas pelos 6-4 PPs.
Figura 1 – Principais lesões causadas no DNA pela luz UV. A - Dímero de pirimidina ciclobutano (CPD). B - Fotoproduto (6-4)-pirimidina-pirimidona (6-4PP).
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Além das diferenças estruturais, outras particularidades são inerentes aos tipos de
fotoprodutos. A proporção na formação de fotoprodutos é de 3 a 5 CPDs para cada 6-4PPs
(VAN HOFFEN et al., 1995; LO et al., 2005) sendo que os CPDs são removidos mais
lentamente do genoma (RIOU et al., 1999; HANAWALT, 2001), possivelmente em
decorrência do menor grau de distorção da dupla fita (MAILLARD et al., 2007). Essa maior
permanência das lesões CPDs no genoma pode explicar porque os CPDs são os maiores
responsáveis pelas mutações causadas por luz UV em roedores (YOU et al., 2001). Além
disso, o grau de empacotamento e condensação da cromatina também interfere na formação
das lesões, sendo que os 6-4PPs, diferente dos CPDs, são formados preferencialmente em
regiões de DNA internucleossômico (NIGGLI e CERUTTI, 1982; GALE e SMERDON,
1990; MITCHELL et al., 1990).
1.2 Reparo de lesões induzidas por UV
1.2.1 Fotorreativação
A fotorreativação foi o primeiro mecanismo de reparo de DNA descrito. Em 1948,
Albert Kelner (KELNER, 1949) e Renato Dulbecco (DULBECCO, 1949) descreveram de
forma independente e concomitante a fotorreativação, ou reversão direta da lesão. A
fotorreativação envolve enzimas denominadas fotoliases, proteínas pertencentes à família das
fotoliases/fotorreceptores de luz azul, as quais promovem a reversão direta dessas lesões, sem
que haja, a excisão dos nucleotídeos ou bases nitrogenadas (YASUI e MCCREADY, 1998;
TODO, 1999; KOMORI et al., 2001). Basicamente, a fotoliase se liga ao dímero (num passo
independente de luz) e, após absorver um fóton de luz azul (cujo comprimento varia de 350 a
450 nm), quebra as ligações covalentes formadas entre as pirimidinas adjacentes, restaurando
os nucleotídeos a sua forma nativa (HEARST, 1995; DEISENHOFER, 2000; MEDVEDEV e
STUCHEBRUKHOV, 2001; ESSEN, 2006; BEUKERS et al., 2008). Este mecanismo é
extremamente eficiente no reparo dos fotoprodutos induzidos por UV, e está bem
representado nos três grandes domínios: Eubacterias, Arqueia e Eucaria (EISEN e
HANAWALT, 1999), contudo, curiosamente os ortólogos das fotoliases encontrados em
mamíferos placentários assumiram funções relacionadas com o controle do ritmo circadiano,
(THRESHER et al., 1998; VAN DER HORST et al., 1999).
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1.2.2 Reparo por excisão de nucleotídeos
Nos mamíferos placentários o mecanismo responsável pela remoção dos
fotoprodutos é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Trata-se de um mecanismo
extremamente conservado evolutivamente, baseado no reconhecimento da distorção da
molécula de DNA. Dessa forma o NER consegue reconhecer uma grande variedade de lesões
no DNA (SHUCK et al., 2008), sendo responsável pelo reparo não apenas de lesões induzidas
por luz UV, mas também outros tipos de lesões que promovem distorções estruturais na
molécula de DNA. O NER é caracterizado por envolver múltiplos passos intermediários e, no
homem, requer a ação coordenada de cerca de 30 proteínas (COSTA et al., 2003). Os três
passos básicos para a correção da lesão pelo NER são: o reconhecimento da lesão, a dupla
incisão com liberação do oligômero excisado e por último a ressíntese e ligação à fita de DNA
molde, conforme apresentado na figura 2, (COSTA et al., 2003; REARDON e SANCAR,
2005).
Figura 2 – Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) em células eucariontes. Inicialmente ocorre o reconhecimento da lesão pela via de Reparo do Genoma Global (GGR) ou de Reparo Associado à Transcrição (TCR). Em seguida, a dupla fita é aberta pela ação das helicases XPB e XPD. A região da fita contendo a lesão é clivada pela ação de endonucleases (XPF e XPG) e por último ocorre a síntese de DNA da região excisada e sua ligação a porção 3’ da fita adjacente.
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De acordo com a maquinaria envolvida no reconhecimento da lesão o NER é
subdividido em duas vias, que posteriormente convergem para o recrutamento e
funcionamento da mesma maquinaria: o reparo do genoma global (GGR) e o reparo acoplado
à transcrição (TCR). O GGR é responsável pela remoção de lesões ocorridas em regiões não-
transcritas do genoma e em fitas não-transcritas de genes ativos. O TCR reconhece danos que
causam distorções na cromatina transcricionalmente ativa (DE LAAT et al., 1999).
No GGR, o complexo XPC-hHR23B é responsável pelo reconhecimento primário da
lesão (VOLKER et al., 2001). O complexo XPC-hHR23B reconhece uma variedade de lesões
que promovam distorções na dupla fita de DNA. Essa versatilidade é gerada pela afinidade
que a proteína XPC tem por DNA de fita única, gerado em presença de distorções da dupla
fita de DNA (MAILLARD et al., 2007), o que em parte explica a maior afinidade do
complexo XPC-hHR23B por regiões com lesões que causam distorções maiores a dupla fita.
A proteína XPE também é proposta como participante para detecção da lesão (TANG et al.,
2000).
Para a via de TCR o complexo XPC-hHR23B e XPE são dispensáveis, o sinal
reconhecido para esta via é o bloqueio da elongação da RNA polimerase II frente à lesão.
Inicialmente a proteína CSA é rapidamente translocada para a matriz nuclear depois do dano
no DNA de forma dependente de CSB. Ainda não são bem conhecidas as funções das
proteínas CSA e CSB, contudo, foi demonstrado que CSA co-localiza com a forma
hiperfosforilada da RNA polimerase II na matriz nuclear durante o processo do TCR
(KAMIUCHI et al., 2002) e que CSB interage in vitro com a RNA polimerase II,
possivelmente recrutando o TFIIH ao sítio da lesão (TANTIN, 1998). Além disso, a proteína
CSB também é capaz de alterar a conformação do DNA e remodelar a cromatina in vitro em
uma reação dependente de ATP, que relaciona o reparo ao remodelamento da cromatina
(CITTERIO et al., 2000).
Os primeiros indicativos de TCR vieram com a observação de que CPDs localizados
na fita transcrita de genes ativos são mais rapidamente reparados do que aqueles distribuídos
no restante do genoma em células de ovário de hamster chinês (CHO) (BOHR et al., 1985).
Isso decorre do fato do reconhecimento das lesões presentes na fita de DNA transcrita pela
RNA polimerase II serem reparadas mais rapidamente do que aquelas em outras regiões do
genoma, incluindo as regiões de fita não-transcrita de genes ativos (HANAWALT, 2002).
Além das diferenças de discriminação entre áreas ativamente transcritas, existem
outras diferenças de acordo com o sistema de reconhecimento da lesão, o tipo de fotoproduto
e o grau de compactação da cromatina. A taxa de reparo para o GGR também depende do tipo
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da lesão. Apesar dos CPDs serem gerados em maior número após a radiação com UV, as
lesões 6-4PP geram distorções maiores na dupla hélice do DNA e são removidos do genoma
cinco vezes mais rapidamente do que os CPDs (TORNALETTI e HANAWALT, 1999). O
condensamento do genoma na cromatina também interfere na taxa de reconhecimento e
remoção da lesão (LINGER e TYLER, 2007).
Após os passos de reconhecimento da lesão, o TCR e o GGR convergem para uma
via comum. Primeiro ocorre o recrutamento do fator de transcrição H da RNA polimerase II
(TFIIH), incluindo as helicases XPB e XPD que são responsáveis pela abertura da dupla
hélice do DNA ao redor da lesão. Paralelamente, são recrutadas as proteínas XPA e RPA
para estabilizar as fitas abertas. A proteína RPA auxilia no posicionamento das nucleases, na
especificidade das incisões e na manutenção da abertura da fita que contém a lesão (DE
LAAT et al., 1998), ao passo que a proteína XPA dá estabilidade ao sistema. Após abertas as
fitas, as endonucleases XPG e XPF-ERCC1, fazem as incisões no lado 3’ e 5’ da lesão,
respectivamente. O oligonucleotídeo contendo a lesão, com tamanho entre 25-30
nucleotídeos, é removido e o espaço gerado na molécula de DNA é preenchido pela DNA
polimerase δ/ε.
Para o preenchimento da lacuna gerada pela remoção do fragmento contendo a lesão,
a polimerase δ/ε utiliza como iniciador o grupo hidroxil (OH) deixado na porção 3’ pela ação
do complexo XPF-ERCC1. O processo de síntese de DNA em substituição ao
oligonucleotídeo removido contendo a lesão é conhecido como síntese de reparo. Nesse
estágio a maioria das proteínas do NER deixa a área da lesão e a maquinaria de síntese de
DNA toma seu lugar, restando apenas RPA que é requerida para a síntese de DNA por
proteger a fita molde contra a ação das nucleases. Ambas as polimerases δ e ε estão
envolvidas na síntese do DNA (HUNTING et al., 1991; COVERLEY et al., 1992), assim
como a proteína PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) que atua como um fator de
processividade para as polimerases (SHIVJI et al., 1992). Outra proteína que também age
como um fator de processividade no NER é RFC (replication factor C). Estes co-fatores
atuam como um complexo e facilitam o recrutamento das polimerases supracitadas. Esse
complexo é formado depois da ligação do RFC com o terminal 3’do iniciador de DNA,
facilitando a chegada do PCNA (WOOD e SHIVJI, 1997).
Finalmente, a reação de ligação do oligonucleotídeo recém sintetizado é
desempenhada pela DNA ligase I (LINDAHL et al., 1997; CLINE e HANAWALT, 2003;
COSTA et al., 2003).
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1.2.2.1 As proteínas de reparo de DNA XPA e XPC
As proteínas XPA e XPC estão descritas a seguir mais detalhadamente por terem
sido amplamente utilizadas nos estudos apresentados nessa tese.
O gene XPA humano tem 25 Kpb de tamanho possui 6 exons e está mapeado no
cromossomo 9q22. A proteína XPA tem 42 KDa e domínios de “dedos de Zinco” (zinc
fingers) que medeiam sua ligação ao DNA (TANAKA et al., 1990). Está associada à proteína
de replicação A (RPA) e tem função central no posicionamento correto da maquinaria de
reparo de DNA em volta da lesão (HE et al., 1995; WAKASUGI e SANCAR, 1999) para a
formação do complexo de pré-incisão para do NER (EVANS et al., 1997; MU et al., 1997). A
maioria dos casos da síndrome xeroderma pigmentosum (XP) na África e no Japão estão
associados ao gene XPA, e grande parte destas alterações decorre especificamente de uma
mutação no último nucleotídeo do exon 3 (CLEAVER et al., 1999; TANIOKA et al., 2005).
O gene XPC tem 33 Kpb está localizado no locus 3p25 e é composto por 16 exons.
A proteína XPC, por sua vez, é composta por 940 aminoácidos e forma complexo ligado a
hHR23B e a centrina 2, com domínio C-terminal de ligação ao DNA e a TFIIH. Ensaios de
reconhecimento de dano no DNA (SUGASAWA et al., 1998) e de imunofluorescência em
microrregiões do núcleo irradiadas com luz UV (VOLKER et al., 2001) apontam que proteína
XPC está envolvida nas primeiras etapas de reconhecimento da lesão e recrutamento de outras
proteínas na via de GGR, sendo o complexo XPC-hHR23B essencial para os passos
subseqüentes de recrutamento de todos os fatores do complexo prévio a incisão, incluindo o
fator TFIIH. A afinidade da proteína XPC por DNA fita simples é apontada como um dos
motivos que permite a via de GGR a grande versatilidade no reconhecimento de lesões que
provocam distorção na dupla fita de DNA (MAILLARD et al., 2007). Alterações no gene
XPC, juntamente com o gene XPA são as mais freqüentes em casos de pacientes XP
(CLEAVER e KRAEMER, 1995).
1.3 Síndromes humanas causadas por deficiência em genes do NER
O número total de genes diretamente envolvidos no NER é estimado em torno de 30,
mas apenas alguns deles foram encontrados mutados em síndromes humanas relacionadas
com o NER. O restante dos genes, quando mutados, gera alterações letais ou fenótipos
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brandos (CLEAVER, 2005). Dentre as diferentes manifestações clínicas associadas a via de
NER, são conhecidas diversas síndromes autossômicas. Dentre essas podem ser citadas
xeroderma pigmentosum (XP), síndrome de Cockayne (CS), tricotiodistrofia (TTD), síndrome
cérebro oculofacial esquelética (COFS), síndrome de sensibilidade moderada à luz UV e
algumas síndromes com sintomas combinados de XP/CS e XP/TTD (LEHMANN, 2003).
Dentre essas, XP é a que causa maior sensibilidade à luz solar, com aumento na incidência de
tumores em regiões expostas da pele e em alguns casos degeneração neurológica progressiva
e envelhecimento prematuro (LEHMANN, 2003).
1.3.1 Xeroderma Pigmentosum (XP)
A síndrome xeroderma pigmentosum foi descrita em 1874 (HEBRA e KAPOSI,
1874). A associação da síndrome com deficiência de reparar os danos no DNA causados pela
luz UV foi feita em 1968 por James Cleaver (CLEAVER, 1968). A combinação e intensidade
dos sintomas variam de acordo com o gene alterado e o grau de evolução da doença. Os
sintomas mais freqüentes são: surgimento de sardas, pintas e bolhas na pele, mesmo sob
períodos curtos de exposição à luz solar ou outra fonte de luz UV (dermatitis solaris);
fotofobia; queratite (inflamação da córnea), com aumento da vascularização e opacidade;
espessamento e ressecamento da pele; incidência aumentada de tumores (cerca de mil vezes
maior que a média da população). Além destes sintomas, 30% dos pacientes XP apresentam
alterações neurológicas. O aspecto da pele dos portadores de XP originou o nome da síndrome
(do latin: xero = seco; derma = pele; pigmentosum = pigmentada). As alterações dérmicas
resultam de hiperplasia / hiperqueratosis persistentes e aumento da pigmentação de melanina
na epiderme, com risco a surgimento de neoplasias (NORGAUER et al., 2003).
Enquanto na população em geral o aparecimento dos primeiros tumores ocorre
acima dos 60 anos de idade em portadores de XP eles surgem antes dos 10 anos (KRAEMER,
1997). A alta incidência de tumores em pacientes XP é atribuída a deficiência do sistema
NER, que compromete a correção dos fotoprodutos e aumenta a taxa de mutação das células.
Os tumores mais comuns em XP são: carcinomas de célula escamosa (SCC), carcinoma de
célula basal (BCC) e melanoma maligno (MM) (GIGLIA-MARI e SARASIN, 2003).
Tumores primários do tipo SCC, BCC e MM foram extraídos de pacientes XP e
posteriormente seqüenciados para avaliar o espectro de mutações no gene supressor de tumor
p53 (TRP53). Noventa por cento dos tumores seqüenciados apresentaram mutações do tipo
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transição de C (citosina) para T (timina), localizadas nos sítios de dipirimidina, “hot spots”,
considerados como assinatura molecular de radiação por UV (GIGLIA-MARI e SARASIN,
2003). Na população em geral com câncer de pele, a porcentagem de mutação no gene TRP53
é de 50% (GIGLIA-MARI e SARASIN, 2003) A alta taxa de mutação presente em genes
supressores de tumor (como TRP53) e/ou proto-oncogenes (como genes da família RAS)
consiste em uma das prováveis causas da elevada e precoce incidência de câncer de pele em
pacientes XP. Outro fator que possivelmente influencia na alta incidência de câncer de pele
nos pacientes XP é o efeito imunossupressor da radiação UV (WYSENBEEK et al., 1986;
AHRENS et al., 1997; DE GRUIJL, 2008). A imunossupressão pode comprometer o
reconhecimento e eliminação de células em processo de transformação pré-maligna ou
maligna.
Os problemas oftalmológicos são mais comuns nas pálpebras e áreas mais anteriores
dos olhos, com relatos de inflamação da conjuntiva, blefaritis (inflamação das pálpebras) e
ulceração da córnea, com progressão para vascularização e aumento da opacidade da córnea
(GOYAL et al., 1994). Também podem ocorrer papilomas benignos de pálpebras, displasia da
córnea e neoplasias oculares como BCC e MM (VIVIAN et al., 1993).
A degeneração neurológica progressiva presente em 30% dos pacientes XP é um
fato ainda pouco compreendido e atribuído, em parte, à perda precoce de neurônios (KISBY
et al., 2004). A deficiência neurológica também é explicada pelo suposto envolvimento da via
de NER com a via de reparo por excisão de base (BER), cujo papel está na remoção de danos
no DNA induzidos por espécies reativas de oxigênio (ROS), como por exemplo, timina-
glicols e 8-oxoguaninas (REARDON et al., 1997). O consumo de oxigênio pelo tecido
nervoso supostamente resultaria em maior produção das ROS e a falta de reparo dessas lesões
poderia estar diretamente envolvida na neurodegeneração observada em XP. Apesar do
acúmulo de evidências in vitro reforçando a relação entre as vias de BER e NER e seu
envolvimento com a neurodegeneração observada em XP, há carência de dados demonstrando
como se dá essa relação in vivo no sistema nervoso central (ROLIG e MCKINNON, 2000).
Além do quadro clínico dos pacientes, a freqüência de ocorrência da síndrome XP e
dos genes afetados também é variável. O número de casos de XP aumenta em regiões com
maior número de casamentos consangüíneos. Na Europa e América do Norte é estimado 1
paciente para cada 250.000 habitantes, no Japão a prevalência sobe para 1:40.000 (CLEAVER
e KRAEMER, 1995). Alterações em XPA e XPC respondem por cerca da metade de todos os
casos XP detectados no mundo (ZENG et al., 1997). Nos caucasianos a maioria dos casos XP
resulta de mutação no gene XPC, nos orientais o gene afetado geralmente é o XPA. No Brasil,
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(FRIEDBERG et al., 2005). Nos CPDs as pirimidinas tornam-se covalentemente ligadas pela
formação de um anel ciclobutano entre os átomos de carbono C5 e C6 de ambas as bases
nitrogenadas (Figura 1A). No caso dos 6-4PPs, os carbonos covalentemente ligados são o C6
e o C4 das pirimidinas 5’ e 3’, respectivamente (Figura 1B). Ambos fotoprodutos promovem
distorções na molécula de DNA, sendo mais acentuadas as distorções causadas pelos 6-4 PPs.
Figura 1 – Principais lesões causadas no DNA pela luz UV. A - Dímero de pirimidina ciclobutano (CPD). B - Fotoproduto (6-4)-pirimidina-pirimidona (6-4PP).
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Além das diferenças estruturais, outras particularidades são inerentes aos tipos de
fotoprodutos. A proporção na formação de fotoprodutos é de 3 a 5 CPDs para cada 6-4PPs
(VAN HOFFEN et al., 1995; LO et al., 2005) sendo que os CPDs são removidos mais
lentamente do genoma (RIOU et al., 1999; HANAWALT, 2001), possivelmente em
decorrência do menor grau de distorção da dupla fita (MAILLARD et al., 2007). Essa maior
permanência das lesões CPDs no genoma pode explicar porque os CPDs são os maiores
responsáveis pelas mutações causadas por luz UV em roedores (YOU et al., 2001). Além
disso, o grau de empacotamento e condensação da cromatina também interfere na formação
das lesões, sendo que os 6-4PPs, diferente dos CPDs, são formados preferencialmente em
regiões de DNA internucleossômico (NIGGLI e CERUTTI, 1982; GALE e SMERDON,
1990; MITCHELL et al., 1990).
1.2 Reparo de lesões induzidas por UV
1.2.1 Fotorreativação
A fotorreativação foi o primeiro mecanismo de reparo de DNA descrito. Em 1948,
Albert Kelner (KELNER, 1949) e Renato Dulbecco (DULBECCO, 1949) descreveram de
forma independente e concomitante a fotorreativação, ou reversão direta da lesão. A
fotorreativação envolve enzimas denominadas fotoliases, proteínas pertencentes à família das
fotoliases/fotorreceptores de luz azul, as quais promovem a reversão direta dessas lesões, sem
que haja, a excisão dos nucleotídeos ou bases nitrogenadas (YASUI e MCCREADY, 1998;
TODO, 1999; KOMORI et al., 2001). Basicamente, a fotoliase se liga ao dímero (num passo
independente de luz) e, após absorver um fóton de luz azul (cujo comprimento varia de 350 a
450 nm), quebra as ligações covalentes formadas entre as pirimidinas adjacentes, restaurando
os nucleotídeos a sua forma nativa (HEARST, 1995; DEISENHOFER, 2000; MEDVEDEV e
STUCHEBRUKHOV, 2001; ESSEN, 2006; BEUKERS et al., 2008). Este mecanismo é
extremamente eficiente no reparo dos fotoprodutos induzidos por UV, e está bem
representado nos três grandes domínios: Eubacterias, Arqueia e Eucaria (EISEN e
HANAWALT, 1999), contudo, curiosamente os ortólogos das fotoliases encontrados em
mamíferos placentários assumiram funções relacionadas com o controle do ritmo circadiano,
(THRESHER et al., 1998; VAN DER HORST et al., 1999).
23
1.2.2 Reparo por excisão de nucleotídeos
Nos mamíferos placentários o mecanismo responsável pela remoção dos
fotoprodutos é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Trata-se de um mecanismo
extremamente conservado evolutivamente, baseado no reconhecimento da distorção da
molécula de DNA. Dessa forma o NER consegue reconhecer uma grande variedade de lesões
no DNA (SHUCK et al., 2008), sendo responsável pelo reparo não apenas de lesões induzidas
por luz UV, mas também outros tipos de lesões que promovem distorções estruturais na
molécula de DNA. O NER é caracterizado por envolver múltiplos passos intermediários e, no
homem, requer a ação coordenada de cerca de 30 proteínas (COSTA et al., 2003). Os três
passos básicos para a correção da lesão pelo NER são: o reconhecimento da lesão, a dupla
incisão com liberação do oligômero excisado e por último a ressíntese e ligação à fita de DNA
molde, conforme apresentado na figura 2, (COSTA et al., 2003; REARDON e SANCAR,
2005).
Figura 2 – Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) em células eucariontes. Inicialmente ocorre o reconhecimento da lesão pela via de Reparo do Genoma Global (GGR) ou de Reparo Associado à Transcrição (TCR). Em seguida, a dupla fita é aberta pela ação das helicases XPB e XPD. A região da fita contendo a lesão é clivada pela ação de endonucleases (XPF e XPG) e por último ocorre a síntese de DNA da região excisada e sua ligação a porção 3’ da fita adjacente.
24
De acordo com a maquinaria envolvida no reconhecimento da lesão o NER é
subdividido em duas vias, que posteriormente convergem para o recrutamento e
funcionamento da mesma maquinaria: o reparo do genoma global (GGR) e o reparo acoplado
à transcrição (TCR). O GGR é responsável pela remoção de lesões ocorridas em regiões não-
transcritas do genoma e em fitas não-transcritas de genes ativos. O TCR reconhece danos que
causam distorções na cromatina transcricionalmente ativa (DE LAAT et al., 1999).
No GGR, o complexo XPC-hHR23B é responsável pelo reconhecimento primário da
lesão (VOLKER et al., 2001). O complexo XPC-hHR23B reconhece uma variedade de lesões
que promovam distorções na dupla fita de DNA. Essa versatilidade é gerada pela afinidade
que a proteína XPC tem por DNA de fita única, gerado em presença de distorções da dupla
fita de DNA (MAILLARD et al., 2007), o que em parte explica a maior afinidade do
complexo XPC-hHR23B por regiões com lesões que causam distorções maiores a dupla fita.
A proteína XPE também é proposta como participante para detecção da lesão (TANG et al.,
2000).
Para a via de TCR o complexo XPC-hHR23B e XPE são dispensáveis, o sinal
reconhecido para esta via é o bloqueio da elongação da RNA polimerase II frente à lesão.
Inicialmente a proteína CSA é rapidamente translocada para a matriz nuclear depois do dano
no DNA de forma dependente de CSB. Ainda não são bem conhecidas as funções das
proteínas CSA e CSB, contudo, foi demonstrado que CSA co-localiza com a forma
hiperfosforilada da RNA polimerase II na matriz nuclear durante o processo do TCR
(KAMIUCHI et al., 2002) e que CSB interage in vitro com a RNA polimerase II,
possivelmente recrutando o TFIIH ao sítio da lesão (TANTIN, 1998). Além disso, a proteína
CSB também é capaz de alterar a conformação do DNA e remodelar a cromatina in vitro em
uma reação dependente de ATP, que relaciona o reparo ao remodelamento da cromatina
(CITTERIO et al., 2000).
Os primeiros indicativos de TCR vieram com a observação de que CPDs localizados
na fita transcrita de genes ativos são mais rapidamente reparados do que aqueles distribuídos
no restante do genoma em células de ovário de hamster chinês (CHO) (BOHR et al., 1985).
Isso decorre do fato do reconhecimento das lesões presentes na fita de DNA transcrita pela
RNA polimerase II serem reparadas mais rapidamente do que aquelas em outras regiões do
genoma, incluindo as regiões de fita não-transcrita de genes ativos (HANAWALT, 2002).
Além das diferenças de discriminação entre áreas ativamente transcritas, existem
outras diferenças de acordo com o sistema de reconhecimento da lesão, o tipo de fotoproduto
e o grau de compactação da cromatina. A taxa de reparo para o GGR também depende do tipo
25
da lesão. Apesar dos CPDs serem gerados em maior número após a radiação com UV, as
lesões 6-4PP geram distorções maiores na dupla hélice do DNA e são removidos do genoma
cinco vezes mais rapidamente do que os CPDs (TORNALETTI e HANAWALT, 1999). O
condensamento do genoma na cromatina também interfere na taxa de reconhecimento e
remoção da lesão (LINGER e TYLER, 2007).
Após os passos de reconhecimento da lesão, o TCR e o GGR convergem para uma
via comum. Primeiro ocorre o recrutamento do fator de transcrição H da RNA polimerase II
(TFIIH), incluindo as helicases XPB e XPD que são responsáveis pela abertura da dupla
hélice do DNA ao redor da lesão. Paralelamente, são recrutadas as proteínas XPA e RPA
para estabilizar as fitas abertas. A proteína RPA auxilia no posicionamento das nucleases, na
especificidade das incisões e na manutenção da abertura da fita que contém a lesão (DE
LAAT et al., 1998), ao passo que a proteína XPA dá estabilidade ao sistema. Após abertas as
fitas, as endonucleases XPG e XPF-ERCC1, fazem as incisões no lado 3’ e 5’ da lesão,
respectivamente. O oligonucleotídeo contendo a lesão, com tamanho entre 25-30
nucleotídeos, é removido e o espaço gerado na molécula de DNA é preenchido pela DNA
polimerase δ/ε.
Para o preenchimento da lacuna gerada pela remoção do fragmento contendo a lesão,
a polimerase δ/ε utiliza como iniciador o grupo hidroxil (OH) deixado na porção 3’ pela ação
do complexo XPF-ERCC1. O processo de síntese de DNA em substituição ao
oligonucleotídeo removido contendo a lesão é conhecido como síntese de reparo. Nesse
estágio a maioria das proteínas do NER deixa a área da lesão e a maquinaria de síntese de
DNA toma seu lugar, restando apenas RPA que é requerida para a síntese de DNA por
proteger a fita molde contra a ação das nucleases. Ambas as polimerases δ e ε estão
envolvidas na síntese do DNA (HUNTING et al., 1991; COVERLEY et al., 1992), assim
como a proteína PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) que atua como um fator de
processividade para as polimerases (SHIVJI et al., 1992). Outra proteína que também age
como um fator de processividade no NER é RFC (replication factor C). Estes co-fatores
atuam como um complexo e facilitam o recrutamento das polimerases supracitadas. Esse
complexo é formado depois da ligação do RFC com o terminal 3’do iniciador de DNA,
facilitando a chegada do PCNA (WOOD e SHIVJI, 1997).
Finalmente, a reação de ligação do oligonucleotídeo recém sintetizado é
desempenhada pela DNA ligase I (LINDAHL et al., 1997; CLINE e HANAWALT, 2003;
COSTA et al., 2003).
26
1.2.2.1 As proteínas de reparo de DNA XPA e XPC
As proteínas XPA e XPC estão descritas a seguir mais detalhadamente por terem
sido amplamente utilizadas nos estudos apresentados nessa tese.
O gene XPA humano tem 25 Kpb de tamanho possui 6 exons e está mapeado no
cromossomo 9q22. A proteína XPA tem 42 KDa e domínios de “dedos de Zinco” (zinc
fingers) que medeiam sua ligação ao DNA (TANAKA et al., 1990). Está associada à proteína
de replicação A (RPA) e tem função central no posicionamento correto da maquinaria de
reparo de DNA em volta da lesão (HE et al., 1995; WAKASUGI e SANCAR, 1999) para a
formação do complexo de pré-incisão para do NER (EVANS et al., 1997; MU et al., 1997). A
maioria dos casos da síndrome xeroderma pigmentosum (XP) na África e no Japão estão
associados ao gene XPA, e grande parte destas alterações decorre especificamente de uma
mutação no último nucleotídeo do exon 3 (CLEAVER et al., 1999; TANIOKA et al., 2005).
O gene XPC tem 33 Kpb está localizado no locus 3p25 e é composto por 16 exons.
A proteína XPC, por sua vez, é composta por 940 aminoácidos e forma complexo ligado a
hHR23B e a centrina 2, com domínio C-terminal de ligação ao DNA e a TFIIH. Ensaios de
reconhecimento de dano no DNA (SUGASAWA et al., 1998) e de imunofluorescência em
microrregiões do núcleo irradiadas com luz UV (VOLKER et al., 2001) apontam que proteína
XPC está envolvida nas primeiras etapas de reconhecimento da lesão e recrutamento de outras
proteínas na via de GGR, sendo o complexo XPC-hHR23B essencial para os passos
subseqüentes de recrutamento de todos os fatores do complexo prévio a incisão, incluindo o
fator TFIIH. A afinidade da proteína XPC por DNA fita simples é apontada como um dos
motivos que permite a via de GGR a grande versatilidade no reconhecimento de lesões que
provocam distorção na dupla fita de DNA (MAILLARD et al., 2007). Alterações no gene
XPC, juntamente com o gene XPA são as mais freqüentes em casos de pacientes XP
(CLEAVER e KRAEMER, 1995).
1.3 Síndromes humanas causadas por deficiência em genes do NER
O número total de genes diretamente envolvidos no NER é estimado em torno de 30,
mas apenas alguns deles foram encontrados mutados em síndromes humanas relacionadas
com o NER. O restante dos genes, quando mutados, gera alterações letais ou fenótipos
27
brandos (CLEAVER, 2005). Dentre as diferentes manifestações clínicas associadas a via de
NER, são conhecidas diversas síndromes autossômicas. Dentre essas podem ser citadas
xeroderma pigmentosum (XP), síndrome de Cockayne (CS), tricotiodistrofia (TTD), síndrome
cérebro oculofacial esquelética (COFS), síndrome de sensibilidade moderada à luz UV e
algumas síndromes com sintomas combinados de XP/CS e XP/TTD (LEHMANN, 2003).
Dentre essas, XP é a que causa maior sensibilidade à luz solar, com aumento na incidência de
tumores em regiões expostas da pele e em alguns casos degeneração neurológica progressiva
e envelhecimento prematuro (LEHMANN, 2003).
1.3.1 Xeroderma Pigmentosum (XP)
A síndrome xeroderma pigmentosum foi descrita em 1874 (HEBRA e KAPOSI,
1874). A associação da síndrome com deficiência de reparar os danos no DNA causados pela
luz UV foi feita em 1968 por James Cleaver (CLEAVER, 1968). A combinação e intensidade
dos sintomas variam de acordo com o gene alterado e o grau de evolução da doença. Os
sintomas mais freqüentes são: surgimento de sardas, pintas e bolhas na pele, mesmo sob
períodos curtos de exposição à luz solar ou outra fonte de luz UV (dermatitis solaris);
fotofobia; queratite (inflamação da córnea), com aumento da vascularização e opacidade;
espessamento e ressecamento da pele; incidência aumentada de tumores (cerca de mil vezes
maior que a média da população). Além destes sintomas, 30% dos pacientes XP apresentam
alterações neurológicas. O aspecto da pele dos portadores de XP originou o nome da síndrome
(do latin: xero = seco; derma = pele; pigmentosum = pigmentada). As alterações dérmicas
resultam de hiperplasia / hiperqueratosis persistentes e aumento da pigmentação de melanina
na epiderme, com risco a surgimento de neoplasias (NORGAUER et al., 2003).
Enquanto na população em geral o aparecimento dos primeiros tumores ocorre
acima dos 60 anos de idade em portadores de XP eles surgem antes dos 10 anos (KRAEMER,
1997). A alta incidência de tumores em pacientes XP é atribuída a deficiência do sistema
NER, que compromete a correção dos fotoprodutos e aumenta a taxa de mutação das células.
Os tumores mais comuns em XP são: carcinomas de célula escamosa (SCC), carcinoma de
célula basal (BCC) e melanoma maligno (MM) (GIGLIA-MARI e SARASIN, 2003).
Tumores primários do tipo SCC, BCC e MM foram extraídos de pacientes XP e
posteriormente seqüenciados para avaliar o espectro de mutações no gene supressor de tumor
p53 (TRP53). Noventa por cento dos tumores seqüenciados apresentaram mutações do tipo
28
transição de C (citosina) para T (timina), localizadas nos sítios de dipirimidina, “hot spots”,
considerados como assinatura molecular de radiação por UV (GIGLIA-MARI e SARASIN,
2003). Na população em geral com câncer de pele, a porcentagem de mutação no gene TRP53
é de 50% (GIGLIA-MARI e SARASIN, 2003) A alta taxa de mutação presente em genes
supressores de tumor (como TRP53) e/ou proto-oncogenes (como genes da família RAS)
consiste em uma das prováveis causas da elevada e precoce incidência de câncer de pele em
pacientes XP. Outro fator que possivelmente influencia na alta incidência de câncer de pele
nos pacientes XP é o efeito imunossupressor da radiação UV (WYSENBEEK et al., 1986;
AHRENS et al., 1997; DE GRUIJL, 2008). A imunossupressão pode comprometer o
reconhecimento e eliminação de células em processo de transformação pré-maligna ou
maligna.
Os problemas oftalmológicos são mais comuns nas pálpebras e áreas mais anteriores
dos olhos, com relatos de inflamação da conjuntiva, blefaritis (inflamação das pálpebras) e
ulceração da córnea, com progressão para vascularização e aumento da opacidade da córnea
(GOYAL et al., 1994). Também podem ocorrer papilomas benignos de pálpebras, displasia da
córnea e neoplasias oculares como BCC e MM (VIVIAN et al., 1993).
A degeneração neurológica progressiva presente em 30% dos pacientes XP é um
fato ainda pouco compreendido e atribuído, em parte, à perda precoce de neurônios (KISBY
et al., 2004). A deficiência neurológica também é explicada pelo suposto envolvimento da via
de NER com a via de reparo por excisão de base (BER), cujo papel está na remoção de danos
no DNA induzidos por espécies reativas de oxigênio (ROS), como por exemplo, timina-
glicols e 8-oxoguaninas (REARDON et al., 1997). O consumo de oxigênio pelo tecido
nervoso supostamente resultaria em maior produção das ROS e a falta de reparo dessas lesões
poderia estar diretamente envolvida na neurodegeneração observada em XP. Apesar do
acúmulo de evidências in vitro reforçando a relação entre as vias de BER e NER e seu
envolvimento com a neurodegeneração observada em XP, há carência de dados demonstrando
como se dá essa relação in vivo no sistema nervoso central (ROLIG e MCKINNON, 2000).
Além do quadro clínico dos pacientes, a freqüência de ocorrência da síndrome XP e
dos genes afetados também é variável. O número de casos de XP aumenta em regiões com
maior número de casamentos consangüíneos. Na Europa e América do Norte é estimado 1
paciente para cada 250.000 habitantes, no Japão a prevalência sobe para 1:40.000 (CLEAVER
e KRAEMER, 1995). Alterações em XPA e XPC respondem por cerca da metade de todos os
casos XP detectados no mundo (ZENG et al., 1997). Nos caucasianos a maioria dos casos XP
resulta de mutação no gene XPC, nos orientais o gene afetado geralmente é o XPA. No Brasil,
29
ainda não há estudos epidemiológicos oficiais, mas foram relatados pelo menos 16 casos de
pacientes XP no Hospital das Clínicas em São Paulo (informação obtida junto ao
Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo).
A presença de heterozigose não é descrita como capaz de gerar manifestações
clínicas, contudo estudos indicam que polimorfismos presentes no gene XPC podem ter
relação com maior propensão ao aparecimento de tumores (SHEN et al., 2001; MARIN et al.,
2004; KHAN et al., 2006) e que a freqüência de aberrações gênicas espontâneas é maior nas
células de heterozigotos XPA (BIELFELD et al., 1989; CASATI et al., 1991).
Contraditoriamente, também foi reportado que células com uma cópia mutada do gene XPA
apresentam níveis de sobrevivência e reparo normais quando expostas a luz UV
(MORIWAKI et al., 1993). Ou seja, ainda não há consenso sobre o efeito da heterozigose dos
genes da via de NER.
Para pacientes XP clássicos (XPA-/--XPG
-/-), o fenótipo XP é resultante da
deficiência na via de NER, enquanto que em 20 a 25% dos casos, os pacientes são
proficientes em NER e a deficiência decorre da incapacidade da maquinaria celular replicar o
DNA em presença de fotolesões (DE BOER e HOEIJMAKERS, 2000). A deficiência nestes
pacientes resulta de alteração no gene POLH que codifica para a DNA polimerase eta,
importante na síntese translesão do DNA, razão pela qual esse grupo foi denominado como
XP variantes (XPV-/-).
1.4 Camundongos deficientes em genes de reparo
Com o intuito de compreender melhor a síndrome XP e sua relação molecular com o
aumento da incidência de câncer, foram desenvolvidos camundongos nocaute para os genes
XPA e XPC (DE VRIES et al., 1995; SANDS et al., 1995). Como nos pacientes XP, nesses
animais existe alta predisposição para desenvolvimento de câncer de pele após exposição à
luz UV-B (NAKANE et al., 1995; CHEO et al., 2000). Em experimentos realizados com
camundongos nocaute para o gene XPC cruzados com camundongos sem pelos (hairless
mice) foi detectado o aparecimento de hiperplasia epidermal 10 dias após irradiação com luz
UV e ocorrência de carcinoma escamoso 9 semanas após a irradiação (BERG et al., 2000).
Ainda em camundongos XPC-/-, também foi relatada fotossensibilidade, bem como a
tendência ao incremento de patologias relacionadas ao tecido ocular (SANDS et al., 1995) e
29
ainda não há estudos epidemiológicos oficiais, mas foram relatados pelo menos 16 casos de
pacientes XP no Hospital das Clínicas em São Paulo (informação obtida junto ao
Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo).
A presença de heterozigose não é descrita como capaz de gerar manifestações
clínicas, contudo estudos indicam que polimorfismos presentes no gene XPC podem ter
relação com maior propensão ao aparecimento de tumores (SHEN et al., 2001; MARIN et al.,
2004; KHAN et al., 2006) e que a freqüência de aberrações gênicas espontâneas é maior nas
células de heterozigotos XPA (BIELFELD et al., 1989; CASATI et al., 1991).
Contraditoriamente, também foi reportado que células com uma cópia mutada do gene XPA
apresentam níveis de sobrevivência e reparo normais quando expostas a luz UV
(MORIWAKI et al., 1993). Ou seja, ainda não há consenso sobre o efeito da heterozigose dos
genes da via de NER.
Para pacientes XP clássicos (XPA-/--XPG
-/-), o fenótipo XP é resultante da
deficiência na via de NER, enquanto que em 20 a 25% dos casos, os pacientes são
proficientes em NER e a deficiência decorre da incapacidade da maquinaria celular replicar o
DNA em presença de fotolesões (DE BOER e HOEIJMAKERS, 2000). A deficiência nestes
pacientes resulta de alteração no gene POLH que codifica para a DNA polimerase eta,
importante na síntese translesão do DNA, razão pela qual esse grupo foi denominado como
XP variantes (XPV-/-).
1.4 Camundongos deficientes em genes de reparo
Com o intuito de compreender melhor a síndrome XP e sua relação molecular com o
aumento da incidência de câncer, foram desenvolvidos camundongos nocaute para os genes
XPA e XPC (DE VRIES et al., 1995; SANDS et al., 1995). Como nos pacientes XP, nesses
animais existe alta predisposição para desenvolvimento de câncer de pele após exposição à
luz UV-B (NAKANE et al., 1995; CHEO et al., 2000). Em experimentos realizados com
camundongos nocaute para o gene XPC cruzados com camundongos sem pelos (hairless
mice) foi detectado o aparecimento de hiperplasia epidermal 10 dias após irradiação com luz
UV e ocorrência de carcinoma escamoso 9 semanas após a irradiação (BERG et al., 2000).
Ainda em camundongos XPC-/-, também foi relatada fotossensibilidade, bem como a
tendência ao incremento de patologias relacionadas ao tecido ocular (SANDS et al., 1995) e
30
em animais tratados com a droga 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) ocorreu alta predisposição
ao desenvolvimento de câncer de pulmão e fígado (MEIRA et al., 2001).
Nos camundongos deficientes no gene XPA foram observadas hiperplasias e
carcinoma celular escamoso frente a doses prolongadas de luz UV-B (DE VRIES et al., 1998)
e também foi relatada maior ocorrência de tumores no fígado em resposta a droga aflatoxina
B1, em relação a camundongos normais (TAKAHASHI et al., 2002).
1.5 Tratamento para pacientes XP
O tratamento para pacientes XP consiste basicamente na remoção dos tumores e
orientação para mudança de hábitos a fim de evitar qualquer exposição à radiação UV, em
especial a luz solar. É relatado também que doses elevadas de isotretinoína (ácido 13-cis-
retinóico) ministradas a pacientes com alta incidência de câncer de pele são eficientes para
reduzir o surgimento e crescimento de neoplasias na pele (KRAEMER et al., 1988). A
restrição à exposição à luz solar é a medida mais eficaz para o aumento da expectativa de vida
dos pacientes XP e prevenção de complicações. A melhoria nas condições de vida dos
pacientes está diretamente relacionada a divulgação e esclarecimento da doença para os
responsáveis pelos pacientes XP e comunidade médica, que devem ser informados não
somente sobre a doença, mas principalmente sobre as conseqüências dramáticas da exposição
à luz solar. Mesmo com proteção ao sol, devem ser realizadas consultas rotineiras ao
dermatologista e a remoção de tumores deve ser feita o mais rápido possível (MAGNALDO e
SARASIN, 2004).
Também é proposto o uso de enzimas de reparo, como a T4 endonuclease V (T4
endo V) e a CPD-fotoliase, encapsuladas em lipossomos que reparam lesões do tipo CPD. A
enzima T4 endo V corta a fita de DNA que contém a lesão CPD, com atividade conjunta da
DNA glicosilase/AP liase, e gera produtos intermediários que podem ser reparados por outras
maquinarias de reparo presentes em pacientes XP. Outra enzima, a CPD-fotoliase age na
correção de CPDs, mas de maneira diferente da T4 endonuclease V, com ação direta na
quebra das ligações formadas entre o anel ciclobutano formado entre as pirimidinas
adjacentes.
Além dos CPDs, os 6-4 PPs podem ter papel importante na carcinogenese (LIMA-
BESSA e MENCK, 2005) e apesar de existirem enzimas específicas para a correção dos 6-
4PPs em alguns organismos, as 6-4 fotoliases, essas enzimas precisam ser excitadas por luz
31
UV-A para corrigir a lesão. Isso prejudicaria o uso deste tipo de enzimas em pacientes XP,
sendo que a luz UV-A gera outros tipos de lesões que também podem ser problemáticas para
estes pacientes.
A ausência de tratamento efetivo combinado com as limitações dos tratamentos
químicos e o fácil acesso à pele torna interessante a pesquisa de protocolos de terapia gênica
para pacientes XP. As expectativas com protocolos de terapia gênica são altas e as
perspectivas de sucesso aumentam com o crescimento do número de trabalhos (BREYER et
al., 2001; EDELSTEIN et al., 2004; EDELSTEIN et al., 2007). Contudo, assim como nas
outras formas de tratamento a terapia gênica também possui restrições. Apesar da vasta gama
de tecnologias de transferência gênica, é difícil encontrar um método seguro e eficaz
(SAKURAI et al., 2008). O desenvolvimento de um sistema melhor de transferência dos
genes com expressão contínua e modulada do gene terapêutico em células apropriadas é uma
esperança para tornar possível a transferência de genes humanos como medidas terapêuticas.
Uma ferramenta com potencial para utilização em terapia gênica são os vetores virais.
1.6 Diagnóstico de grupo de complementação de pacientes XP
O diagnóstico clínico para XP é baseado na observação da pele, dos olhos, de
alterações neurológicas, do histórico familiar e do grau de consangüinidade dos pais. Após o
diagnóstico clínico são necessários testes laboratoriais para confirmar a deficiência molecular
das células dos pacientes. Estes ensaios consideram a maior susceptibilidade de morte das
células XP em resposta a luz UV.
A determinação dos grupos de complementação de XP foi realizada pela fusão de
células somáticas de pacientes XP com complementação funcional confirmada por síntese de
DNA não programada (UDS – Unscheduled DNA Synthesis). Estes ensaios revelaram a
existência de diferentes grupos de complementação (XPA a XPG), decorrentes de mutações
em diferentes genes (BOOTSMA et al., 1975; HOEIJMAKERS, 2001). O ensaio de UDS
ainda é um dos mais utilizados para avaliação de reparo por NER e está baseado na
incorporação de timidina tritiada nas regiões onde ocorreu nova síntese de DNA decorrente do
reparo por NER. A timidina incorporada sensibiliza uma emulsão fotográfica sensível à
radiação formando grânulos escuros que podem ser contados, e permitindo a avaliação
quantitativa da taxa de reparo por NER.
32
Os diagnósticos laboratoriais de células XP continuam baseados na capacidade da
célula de responder a danos no DNA. Um dos modos utilizados avalia indiretamente a
capacidade de reparo da celular pela taxa de expressão de genes plasmidiais ou de outros
vetores genéticos inseridos na célula, contendo lesões no DNA (CARREAU et al., 1995a).
Também é possível a análise molecular dos genes por sequenciamento de DNA. Contudo,
estes ensaios são realizados apenas após a identificação prévia do grupo de complementação
da célula. Dentre os japoneses portadores de XPA, cerca de 90% dos casos são decorrentes da
mesma mutação, o que permite a amplificação e posterior análise do padrão de digestão do
DNA para caracterização da mutação (NISHIGORI et al., 1994). Esse tipo de diagnóstico
pode ser útil em casos de aconselhamento genético e pré-natal.
1.7 Terapia gênica para pacientes XP utilizando vetores virais
Os primeiros experimentos de complementação de fibroblastos XP utilizando
vetores virais foram descritos por Carreau e colaboradores (1995b). Mais tarde, retrovírus
portando genes de reparo, XPA, XPB, XPC e XPD, foram usados para infectar fibroblastos
humanos de culturas primárias (QUILLIET et al., 1997; ZENG et al., 1997). Outro trabalho
utilizou vetor retroviral portando o cDNA do gene XPC para corrigir a deficiência deste
mesmo gene em queratinócitos cultivados em sistema de pele artificial (ARNAUDEAU-
BEGARD et al., 2003).
Apesar do amplo potencial de uso de vetores retrovirais, algumas características
inerentes a esse tipo de vírus, podem inviabilizar o processo de terapia. Uma das
características relevantes é a integração aleatória do vetor retroviral no DNA, tendo a
possibilidade de acarretar alterações na expressão de genes vizinhos, com risco de ativação de
genes cancerígenos ou inativação de genes supressores de tumor (VERMA e SOMIA, 1997).
Além disso, foi relatado o silenciamento do promotor dos transgenes inseridos pelos vetores
retrovirais, o que impede tratamentos por longos períodos de tempo (PALMER et al., 1991).
Outra limitação crítica dos vetores retrovirais é a incapacidade de infectar células que não
estejam em divisão (MILLER et al., 1990), como por exemplo, neurônios, células musculares
e tecido pulmonar.
Os vetores adenovirais são uma alternativa para contornar dos problemas
apresentados pelos vetores retrovirais.
33
1.7.1 Vetores adenovirais
Inicialmente isolados a partir de tecido adenóide em 1953 (ROWE et al., 1953), os
adenovírus estão entre os grupos mais bem estudados de vírus. Além de infectar humanos,
também foram relatadas infecções por adenovírus em outros mamíferos, aves, répteis e
anfíbios. Em humanos a infecção acomete principalmente os tratos respiratório,
gastrointestinal, urinário e também os olhos (KOJAOGHLANIAN et al., 2003), sendo
facilmente controladas em indivíduos imunocompetentes.
Pertencentes ao gênero Mastadenovirus da família Adenoviridae os adenovírus
compreendem mais de 50 sorotipos agrupados em 6 espécies designadas de A até F
(GONÇALVES e DE VRIES, 2006). Possuem tamanho de 60 a 90 nm de diâmetro, formato
icosaédrico e genoma de 30 a 40 Kpb composto por DNA linear dupla fita. O capsídeo é
formado por 240 héxons, dispostos em 20 faces triangulares que compõem o formato
icosaédrico. A estabilidade do capsídeo é assegurada por 12 pentons com protusões em forma
de espículas, também conhecidas como fibras, localizadas em cada um dos 12 vértices
(VOLPERS e KOCHANEK, 2004). Além da função estrutural, os pentons e as fibras são as
proteínas responsáveis pela ligação e internalização do adenovírus na célula.
O domínio terminal, de formato globular, da fibra é responsável pelo primeiro
contato do vírus com os receptores CAR da célula (Coxsackie-Adenovirus Receptor)
(HENRY et al., 1994). Depois da ligação ao CAR, ocorre a interação entre o motivo RGD
(arginina, glicina, aspartato) da proteína da base do penton com a integrina da superfície
celular (αvβ1, αvβ3 ou αvβ5). Esta ligação serve como sinal de internalização por endocitose
através de receptores dependentes de clatrina (WICKHAM et al., 1993; MEIER e GREBER,
2004). Depois de internalizado pela célula, o vírus é liberado do endossomo no citoplasma, o
capsídeo é desmontado e o material genético do vírus, associado a proteínas (core do vírus) é
transportado eficientemente até o núcleo através de microtubulinas (GREBER et al., 1993;
MEIER e GREBER, 2004).
O genoma adenoviral é didaticamente separado em dois grupos, de acordo com a
ordem de expressão e função gênica. O primeiro grupo de genes expressos (“early genes”)
codifica proteínas necessárias a internalização e replicação do vírus, enquanto o segundo
grupo (“late genes”) codifica proteínas estruturais para a formação do vírus. A replicação do
genoma viral dependente das ITRs, da proteína terminal e começa de 5-6 horas depois da
infecção. Os genes do cerne e do capsídeo e também outros genes que serão traduzidos em
34
proteínas estruturais são expressos por um promotor tardio comum e o recrutamento
intranuclear do vírion começa 8 horas depois da infecção. A liberação das partículas virais
maduras, com a lise celular, ocorre cerca de 30 horas após a infecção.
Para a construção dos vetores genéticos, algumas regiões presentes nos adenovírus
selvagens foram removidas e em seu lugar foram adicionados genes de interesse. Nos vetores
adenovirais de primeira geração, o gene E1 (E1A e E1B), responsável pela codificação de
proteínas relacionadas a transcrição do vírus e transformação da célula, é deletado e o vírus é
propagado em linhagens celulares complementadas com o gene E1, como a linhagem HEK
293 (GRAHAM et al., 1977). O gene E3, relacionado à tradução de proteínas que modulam a
defesa da célula hospedeira (BETT et al., 1994), também é frequentemente deletado para
aumentar a capacidade de clonagem do transgene (até 8 Kpb).
Os vetores adenovirais estão entre os vetores mais utilizados para terapia gênica,
sendo amplamente usados como vetores para transferência gênica devido a características
como: (i) presença de muitos sorotipos (humanos e animais) não patogênicos para seus
hospedeiros, (ii) capacidade de infecção de variados tipos celulares, tanto em fase
proliferativa quanto quiescente, (iii) produção em altos títulos, (iv) maquinaria viral eficiente
e altamente especializada na invasão e expressão de genes na célula alvo (v) e tolerância a
grandes inserções de DNA (até 8 Kpb) (BANGARI e MITTAL, 2006).
O laboratório onde foi desenvolvido este trabalho obteve sucesso na produção de
vetores adenovirais, portadores de genes de reparo. Foram obtidos adenovírus recombinantes
para os genes XPA, XPC, XPD e XPV que foram eficientes para transdução e complementação
de células humanas deficientes nestes genes (MUOTRI et al., 2002a; ARMELINI et al., 2005;
LIMA-BESSA et al., 2006). Além destes trabalhos, também foi demonstrada
complementação em camundongos deficientes no gene XPA, utilizando adenovírus
recombinantes portando a seqüência funcional deste mesmo gene (MARCHETTO et al.,
2004). Neste mesmo artigo, foi mostrado que a entrega eficiente do transgene por esses
vetores foi capaz de proteger a pele do dorso dos camundongos após exposição à luz UV-B,
enquanto nos camundongos deficientes não infectados, expostos à mesma dose de radiação,
foi observado o aparecimento de câncer de pele depois de alguns meses.
4
CONCLUSÕES
Dos ensaios in vitro realizados nesta tese, o primeiro ponto abordado foi a validação
dos vetores adenovirais, portando genes de reparo XPA ou XPC para diagnostico de grupo de
complementação gênica de pacientes XP. A identificação do grupo de complementação foi
determinada como sendo XP-C nas duas famílias de pacientes estudadas e essa informação foi
confirmada pela caracterização molecular das mutações. A investigação molecular apontou
para o comprometimento de domínios funcionais da proteína XPC em todos os pacientes
estudados permitindo a correlação das mutações com os fenótipos dos pacientes.
A caracterização molecular do gene XPC nas células dos irmãos portadores de XP,
pacientes XP03SP e XP04SP, revelou a mutação c.1643_1644delTG. Esta mutação foi
previamente descrita em outros pacientes portadores de XP sem vínculos de parentesco e mais
freqüente em relação a outras mutações no gene XPC. A alta freqüência dessa mutação pode
caracterizar um ponto de maior susceptibilidade a mutações no gene XPC, sendo que a maior
incidência desta mutação provavelmente resulta do deslize da DNA-polimerase durante a
replicação nesta região, formada por uma seqüência contínua composta por três repetições de
TG. A mutação encontrada na outra família, paciente XP02SP, não havia sido descrita
anteriormente e também compromete domínios funcionais da proteína XPC.
O segundo conjunto de objetivos abordados nesta tese compreendeu a avaliação dos
efeitos nocivos da radiação UV-B em camundongos deficientes nos genes XPA e XPC,
padronização de protocolos experimentais em linhagens de camundongos e a avaliação do
período de expressão dos transgenes adenovirais na pele destes animais.
Dentre os ensaios realizados in vivo foi estabelecida a doses de irradiação UV-B
para avaliação dos efeitos nocivos em camundongos deficientes no gene XPA e XPC.
Contudo, os ensaios funcionais com infecção dos vetores adenovirais in vivo foi limitada ao
uso do AdyXPA.
A busca de métodos para melhorar a distribuição da solução de vírus e facilitar a
infecção pelo AdyXPA na pele dos animais resultou na avaliação do efeitos do colágeno
sobre a infecção. Diferente da nossa hipótese inicial o colágeno aparentemente exerce efeito
inibitório sobre a infecção pelo AdyXPA.
A expressão dos transgenes adenovirais do AdyXPA foram confirmadas por dois
métodos diferentes. Por western blot, com detecção da proteína XPA em camundongos
5
deficientes neste gene e por visualização de fluorescência decorrente da expressão do EGFP
do vírus, diretamente na pele dos animais. Estes dados permitiram determinar o título mínimo
de AdyXPA necessário à detecção dos transgenes adenovirais na pele e acompanhar a cinética
de expressão do adenovírus nos camundongos, sendo mais intensa a presença dos transgenes
24 horas após a infecção e detectável por até 7 dias após a infecção dos animais infectados
com o maior título de AdyXPA.
Em resumo este trabalho valida o uso dos adenovírus recombinantes como
ferramentas alternativas aos métodos convencionais de identificação de grupo de
complementação dos pacientes XP e como ferramenta para ensaios in vivo em modelos
animais, com implicações no estabelecimento de protocolos de terapia gênica.
6
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