Validação analítica da cinarina

VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA

CINARINA

ACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVES

ORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS

UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA

UNISUL

CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL

JUNHO, 2012

INTRODUÇÃO

Originada do Norte da África e do Mediterrâneo, a cinarina é citada

desde o século 4 a.C. como alimento e medicamento. Foi muito apreciada

pelos antigos romanos como um vegetal com efeitos benéficos para a digestão.

(MARTIN BAUER GROUP).

As folhas da alcachofra se caracterizam pela sua composição em ácidos

fenólicos (até 2%), como ácido caféico, ácido clorogênico e cinarina;

flavonoides (0,1 a 1%), e óleos voláteis. (CARVALHO, 2004).

JUSTIFICATIVA

O grande objetivo de uma indústria farmacêutica é produzir produtos de

confiança e qualidade já que este tem o objetivo curativo ou preventivo de

doenças em seres humanos.

A Cinarina, princípio-ativo do extrato Alcachofra, é usado no produto

Alcagest, produzido pela empresa Airela Indústria Farmacêutica Ltda., o

mesmo não possui método validado para determinação do teor.

Sendo assim, viu-se a necessidade de desenvolver um método capaz de

determinar o teor de Cinarina, tanto na matéria – prima como no produto final,

um método eficiente e preciso, um método validado para o princípio-ativo

presente na Alcachofra.

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL:

Desenvolver um método eficaz para análise de teor da Cinarina,

avaliando-se a sensibilidade, através de um espectrofotômetro UV-VIS.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Realizar um levantamento bibliográfico com base na Resolução nº 899

da ANVISA e determinar quais parâmetros deverão ser avaliados na

validação do método analítico do princípio – ativo Cinarina.

• Desenvolver o Protocolo e o Relatório de Validação do Teor de

Cinarina, contendo todos os procedimentos detalhados a serem seguidos.

• Certificar através da seletividade que o método é capaz de determinar o

princípio ativo em presença de outros componentes.

• Construir uma curva de calibração avaliando a relação

CONCENTRAÇÃO X ABSORVÂNCIA.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Demonstrar com a linearidade que os resultados encontrados são

diretamente proporcionais às concentrações da substância ativa no

extrato, dentro de um intervalo especificado.

• Estimar a partir da precisão a concordância entre os resultados obtidos.

• Demonstrar através da exatidão que os resultados encontrados com o

método desenvolvido têm proximidade em relação ao valor verdadeiro.

• Certificar com a robustez a confiabilidade do método em estudo.

• Implantar o método validado para a determinação da cinarina, tanto para

matéria – prima como para o produto final.

CINARINA

Conhecida popularmente como Alcachofra, foi trazida para o Brasil

pelos imigrantes europeus.

O extrato de alcachofra é utilizado para tratar problemas como:

• Gastrite;

• Meteorismo;

• Flatulência;

• Doença do trato biliar funcional.

CINARINA

Figura 1. Estrutura química da cinarina. (1,5- dicafeoilquínico )

Fonte: http:www.scielo.br

ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS

A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas devido

a robustez, custo baixo e grande número de aplicações desenvolvidas.

Figura 2. Esquema espectrofotômetro UV-VIS.

Fonte: http:www.infoescola.com.br

METODOLOGIA VALIDADA

Categoria Finalidade do teste

ITestes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos

farmacêuticos ou matérias–primas

IITestes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas

e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas

III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo)

IV Testes de identificação

Quadro 1. Classificação dos testes, segundo sua finalidade.

Fonte: Resolução nº 899, ANVISA.

PLANO DE VALIDAÇÃO

PARÂMETROCATEGORIA

I

CATEGORIA IICATEGO

RIA III

CATEGORIA

IVQUANTITATI

VO

ENSAIO

LIMITE

Especificidade Sim Sim Sim * Sim

Linearidade Sim Sim Não * Não

Intervalo Sim Sim * * Não

Precisão

Repetibilid

adeSim Sim Não Sim Não

Intermediár

ia** ** Não ** Não

Limite de detecção Não Não Sim * Não

Limite de quantificação Não Sim Não * Não

Exatidão Sim Sim * * Não

Robustez Sim Sim Sim Não Não

Quadro 2. Plano de validação segundo a classificação do analito.

Fonte: Resolução nº 899, ANVISA.

METODOLOGIA

PREPARO DA SOLUÇÃO PADRÃO:

Pesar 2,5 mg de padrão referência de cinarina em uma balão de 25 mL, adicionar

15 mL de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10

minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.

PREPARO DA SOLUÇÃO AMOSTRA:

Pesar 500,0 mg do extrato de alcachofra em um balão de 25 mL, adicionar 15 mL

de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10

minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.

PROCEDIMENTO

REAGENTE

TUBOS TESTE TUBOS CONTROLE

BRANCO1 2 3 C1 C2 C3

Solução amostra

(mL)

0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1 -

Água purificada

(mL)

4,1 4,0 3,9 4,35 4,25 4,15 10,0

Tampão Acetato

(mL)

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5

NaNO2 40%

(mL)*

0,25 0,25 0,25 - - - 0,5

Deixar em repouso durante 3 minutos.

NaOH 10% (mL)* 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5

Quadro 3. Preparo das amostras.

Fonte: Acervo próprio.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

SELETIVIDADE

AMOSTRASAMIDO

(mg)

EXTRATO

ALCAHOFRA

(mg)

PADRÃO

CINARINA (mg)

CONCENTRAÇÃO

CINARINA (mg/mL)

Extrato - 500,30 - 0,0949

Extrato + Amido 50,20 501,07 - 0,0971

Branco - - - -

Padrão Cinarina - - 2,7 0,1132

Quadro 4. Preparo das amostras para o ensaio de seletividade.

Fonte: Acervo próprio, 2012.


SELETIVIDADE


Figura 3. Varreduras das amostras.


LINEARIDADE

Quadro 5: Concentrações dos padrões de cinarina.

CURVA AMOSTRACONC.

(mg/mL)

ABSORBÂNC

IACONTROLE

ABSORBÂNCI

A

ABSTUBON-

ABSCN

1ª CURVA

Tubo 1 – 80% 0,0144 0,396 C1 0,067 0,329

Tubo 2 – 90% 0,0162 0,454 C2 0,065 0,389

Tubo 3 – 100% 0,0179 0,514 C3 0,071 0,443

Tubo 4 – 110% 0,0197 0,569 C4 0,072 0,497

Tubo 5 – 120% 0,0215 0,628 C5 0,077 0,551

2ª CURVA

Tubo 1 – 80% 0,0144 0,399 C1 0,065 0,334

Tubo 2 – 90% 0,0162 0,463 C2 0,069 0,394

Tubo 3 – 100% 0,0179 0,516 C3 0,071 0,445

Tubo 4 – 110% 0,0197 0,553 C4 0,076 0,477

Tubo 5 – 120% 0,0215 0,615 C5 0,08 0,535



LINEARIDADE

Figura 4. Curva de Calibração



PRECISÃO

• REPETIBILIDADE

Quadro 6. Resultados do ensaio de repetibilidade no período da manhã.

AMOSTRAABSOR

BÂNCIA

CONTRO

LEABSORBÂNCIA

ABSTUBON-

ABSCN

CONC. NA

AMOSTRA

(mg/mL)

QUANTIDADE

(mg)

TEOR

(%)

Tubo 1 0,528 C1 0,119 0,409 0,0971 0,4856 0,486

Tubo 2 0,523 C2 0,121 0,402 0,0957 0,4786 0,479

Tubo 3 0,522 C3 0,121 0,401 0,0955 0,4776 0,478

Tubo 4 0,519 C4 0,121 0,398 0,0949 0,4746 0,475

Tubo 5 0,515 C5 0,120 0,395 0,0943 0,4716 0,472

Tubo 6 0,529 C6 0,120 0,409 0,0971 0,4856 0,489



PRECISÃO

• REPETIBILIDADE

Quadro 7. Resultados para o ensaio de repetibilidade no período da tarde.

AMOSTRAABSOR

BÂNCIA

CONTRO

LEABSORBÂNCIA

ABSTUBON-

ABSCN

CONC. NA

AMOSTRA

(mg/mL)

QUANTIDADE

(mg)

TEOR

(%)

Tubo 1 0,520 C1 0,127 0,393 0,0939 2,3487 0,470

Tubo 2 0,522 C2 0,123 0,399 0,0951 2,3785 0,476

Tubo 3 0,527 C3 0,123 0,404 0,0961 2,4034 0,481

Tubo 4 0,521 C4 0,122 0,399 0,0951 2,3785 0,476

Tubo 5 0,517 C5 0,122 0,395 0,0943 2,3586 0,472

Tubo 6 0,523 C6 0,121 0,402 0,0957 2,3934 0,479



PRECISÃO

Quadro 8. Comparação dos resultados no período da manhã e tarde para o

ensaio de repetibilidade.

PERÍODO AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR

MANHÃ

Tubo 1 0,486

0,477 1,023

Tubo 2 0,479

Tubo 3 0,478

Tubo 4 0,475

Tubo 5 0,472

Tubo 6 0,489

TARDE

Tubo 1 0,470

Tubo 2 0,476

Tubo 3 0,481

Tubo 4 0,476

Tubo 5 0,472

Tubo 6 0,479



PRECISÃO

• INTERMEDIÁRIA


ANALISTA AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR

ANALISTA 1

Tubo 1 0,486

0,483 2,069

Tubo 2 0,479

Tubo 3 0,478

Tubo 4 0,475

Tubo 5 0,472

Tubo 6 0,486

ANALISTA 2

Tubo 1 0,461

Tubo 2 0,491

Tubo 3 0,496

Tubo 4 0,492

Tubo 5 0,494

Tubo 6 0,490

Quadro 9. Resultados para o ensaio de precisão intermediária.


EXATIDÃO

AMOSTRA

PADRÃO CINARINACONCENTRAÇÃO

CINARINA (mg/mL)

PESADO

(mg)

PUREZA

(%)

PESO

CORRIGIDO

CONC.

SOL. MÃE

(mg/mL)

80% 100% 120%

Sol. Mãe Padrão

de Cinarina2,75 99,49 2,74 0,10944 0,01523 0,01903 0,02284

Quadro 10. Concentração das soluções para o ensaio de exatidão.



EXATIDÃO

AMOSTRAABSORBÂN

CIA

CONTRO

LEABSORBÂNCIA

ABSTUBON-

ABSCN

CONC.

(mg/mL)

MÉDIA

(mg/mL)

MÉDIA

CORRIGIDA

(mg/mL)

Placebo- 1 0,006 C1 0,003 0,003 0,0028

0,0028 0,0001Placebo - 2 0,006 C2 0,003 0,003 0,0028

Placebo - 3 0,006 C3 0,003 0,003 0,0028

80% - 1 0,41 C1 0,067 0,343 0,0146

0,0149 0,014880% - 2 0,42 C2 0,067 0,353 0,0150

80% - 3 0,426 C3 0,067 0,359 0,0152

100% - 1 0,506 C1 0,074 0,432 0,0177

0,0180 0,0179100% - 2 0,52 C2 0,074 0,446 0,0182

100% - 3 0,518 C3 0,074 0,444 0,0181

120% - 1 0,63 C1 0,067 0,563 0,0222

0,0220 0,0219120% - 2 0,622 C2 0,067 0,555 0,0219

120% - 3 0,622 C3 0,067 0,555 0,0219

Quadro 11. Resultados obtidos no ensaio de exatidão.



EXATIDÃO

Quadro 12. : Recuperações obtidas no ensaio de exatidão para os 3 níveis

avaliados.

AMOSTRACONC. TEÓRICA

(mg/mL)

CONC. PRÁTICA

(mg/mL)

RECUPERAÇÃO

(%)

RECUPERAÇÃO

MÉDIA (%)

80% - 1 0,01523 0,01450 95,26

97,2380% - 2 0,01523 0,01485 97,53

80% - 3 0,01523 0,01506 98,89

100% - 1 0,01903 0,01758 92,65

94,23100% - 2 0,01903 0,01801 95,20

100% - 3 0,01903 0,01800 94,84

120% - 1 0,02284 0,02212 100,50

99,66120% - 2 0,02284 0,02184 99,24

120% - 3 0,02284 0,02184 99,24



ROBUSTEZ

Quadro 13. Resultados obtidos no ensaio de robustez.

PARÂMETRO MODIFICADOMÉDIA ABS.

TESTE

MÉDIA ABS.

CONTROLETEOR (%) DPR

Tempo de extração

(min)

8 0,518 0,124 0,52 0,00

10 0,512 0,119 0,52 -

12 0,505 0,110 0,52 0,00

Tempo de reação do

nitrito de sódio

(min)

2 0,505 0,115 0,52 1,30

3 0,523 0,120 0,53 -

4 0,532 0,121 0,54 1,30

Tempo de leitura no

uv-vis (min)

Imediatamente 0,523 0,120 0,53 -

5 0,56 0,121 0,57 5,10

10 0,55 0,109 0,58 6,40

Marca do nitrito de

sódio

Fmaia 0,523 0,120 0,53 -

Synth 0,524 0,126 0,52 1,30

Marca do hidróxido

de sódio

Vetec 0,523 0,120 0,53 -

Synth 0,530 0,125 0,53 00

Temperatura das

soluções (ºc)

23 0,512 0,119 0,52 -

15 0,520 0,120 0,53 1,30



ADEQUABILIDADE DO SISTEMA

Quadro 14. Resultados conforme o dia de análise.

REAGEN

TESAMOSTRA ABSORBÂNCIA

CONTRO

LEABSORBÂNCIA

CONC. NA

AMOSTRA

(mg/mL)

TEOR

(%)DPR

Soluções

preparadas

no dia

Tubo 1 0,489 C1 0,116 0,0900

0,477

0,562

Tubo 2 0,517 C2 0,122 0,0943

Tubo 3 0,56 C3 0,127 0,1019

Soluções

após 24 h

do preparo

Tubo 1 0,485 C1 0,112 0,0900

0,471Tubo 2 0,511 C2 0,118 0,0939

Tubo 3 0,543 C3 0,124 0,0991


CONCLUSÃO

Segundo a RE nº 899 da ANVISA uma validação analítica tem como

objetivo demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida,

ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de

fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos

Com os resultados aqui demonstrados é possível afirmar que o método

desenvolvido utilizando espectrofotômetro UV-VIS, é confiável na

determinação do teor. O método desenvolvido e validado mostrou resultados

positivos na seletividade, linearidade, precisão exatidão e robustez, que são

critérios para que um método possa ser validado.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por toda força e determinação para realizar este

trabalho.

Aos meus pais, pelo apoio e confiança à mim depositada durante todos

estes anos.

À orientadora de estágio, Professora Maria Ana Pignatel, pela dedicação

durante a realização deste trabalho.

À supervisora de campo, Letícia Rechia, pela dedicação e ajuda durante o

período de estágio.

À empresa Airela Indústria Farmacêutica por me proporcionar a realização

desta pesquisa e por fim, a elaboração deste método .

À todos meus colegas, de trabalho e do próprio curso, que me apoiaram e

me ajudaram nesta etapa.

REFERÊNCIAS

• ANVISA. Guia Para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos.Resolução No 899 de 29 de maio de 2003.

• CALIXTO; J.B. Medicamentos Fitoterápicos. In: YUNES, R. A. & CALIXTO, J. B. (Orgs.). Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna.

Chapecó: Argos, 2001. p.297-315

• CARVALHO, J.C.T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E.P. Compostos fenólicos simples e heterosídicos. In: Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5 ed. rev. ampl., primeira reimpressão. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004. p. 371-400.

• MIGUEL, M.D.; MIGUEL, O.G. Desenvolvimento de fitoterápicos. Ribeirão Preto: Tecmedd, 2004. 115p.

• NOLDIN, F.V.; CECHINEL, V. et al. Composição química e atividades biológicas das folhas de Cynara scolymus L. (alcachofra) cultivada no Brasil. Química Nova: vol.26 no.3 São Paulo May/June 2003. Disponível em:http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422003000300008&script=sci_arttext. Acesso em: 11 jun, 2012.

REFERÊNCIAS

• PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S. et al. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Quím. Nova, São Paulo, v. 25, supl. 1, p.45-61, 2002.

• VEIGA JUNIOR, V.F.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M. Plantas medicinais: cura

segura ? Quím. Nova, São Paulo, v. 28, n. 3, p.519-528, 2005.

• SIANI, A.C. (Coord.). Desenvolvimento tecnológico de fitoterápicos:

plataforma metodológica. Rio de Janeiro: Scriptorio, 2003. 97p.

• RIBEIRO, C.A.F. Justifica-se o uso de extractos de plantas medicinais na terapêutica da ansiedade e da depressão? Revista Saúde Mental, v. II, n.4, p. 9- 14, 2000.

• MARTIN BAUER GROUP: Encarte de apresentação

• MARTINEZ, Marina. Materiais de Laboratório. Espectrofotômetro. Publicado em: 21/07/2010. Disponível em:http://www.infoescola.com/materiais-delaboratorio/espectrofotometr Acesso em: 11 jun, 2012.

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CINARINA

ACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVES

ORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS

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JUNHO, 2012

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