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Tesis de Posgrado

Valoración de nistatina residual enValoración de nistatina residual enalimentos aplicando un nuevoalimentos aplicando un nuevo

métodométodo

Cerdán, Carlos Julio

1958

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Cerdán, Carlos Julio. (1958). Valoración de nistatina residual en alimentos aplicando un nuevométodo. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0984_Cerdan.pdf

Cita tipo Chicago:Cerdán, Carlos Julio. "Valoración de nistatina residual en alimentos aplicando un nuevo método".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1958.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0984_Cerdan.pdf

CARLOS JULIO CERDAN

UNIVERSIDAD NACIONAL DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

VALORACIONy NISTATINA RESIDUAL

E ALIMENTOS APLICANDO U_NNUEVO METODO

TESIS

Para optar al título de:Doctor en Ciencias Químicas(Orientación QuímicaAnalítica).

fijaba? 7FJ/f.’ 98?;

-1958­

-1_.

En el presente trabajo se determina un nuevo método, deltipo turbidimétrico, para la valoración de la actividad de la nis­tatina, antibiótico fungicida obtenido por fermentacion del Streptgmyces neursei,y.se efectúan ensayos de aplicación de la mismaenla conservacion de vegetales, determinandolos valores residualesluego de diferentes tiempos de contacto del antibiótico con esosalimentos.­

PARTE EXPERIMENTAL

El trabajo fué desarrollado en la siguiente forma:

PRIMERA PARTE: ENSAYO Y AJUSTE DE UN NUEVO METODO

PARA VALORAR NISTATINA

I.- DETERMINACION PRIMARIA DE LAS CONDICIONES DE ENSAYO.­

La idea inicial fué probar la eficacia del germende en,sayo y el medio de cultivo del mismoutilizados para el método de

difusión en agar condicionándolos para obtener un procedimiento rápido para la valoración del antibiótico con lo que se logrará a­demás de rapidez, mayor exactitud y economia (menor número de opengdores,de material, medios, etc.)

FUNDAMENTODEL ENSAYOA DESARROLLAR:Medir el grado de crecimiento

del germen (fiaccharomyces Cerevfáe Amic 9763) en función de distigtas cdbentraciones de antibióticos standard; trazar con las dos variables una curva (curva standard) y leer en ella los valores delgrado de crecimiento obtenidos con la muestra problema los que, mgdiante el cálculo correspondiente, darán la potencia buscada.­

-2­

133% ‘¡IINACION DE LA CONCENTRACION DE INOCULO Y EL TIEMPO

y; INCUBACION NECESARIO

OBJETO:Determinar si con las condiciones impuestas es posible ob­tener un crecimiento del germen de ensayo que haga factible la ejecución del método proyectado y elegir las más convenientes.­

CONCLUSIONES:a) Las condiciones impuestas permiten el crecimientoadecuado del microorganismo de ensayo.

b) Las condciones elegidas son: concentración de inóculo: 6%;tiem­po de incubación 37°C: 3 horas.

II. ELECCION DEL SOLVENTE ABBOPIADO PARA LA DISOLUCIQN;DEL ANTIBIO­

TICO A DOSAR.­

a) ESTUDIO DE LA MISCIBILIDAD EN AGUA DE LOS POSIBLES SOL­

VáNTES A UTILIZAR.­OBJETO:Delimitar los solventes en los que se determinarán luego,la solubflidaddel antibiótico.­

b) PRUEBA DE LA SOLUBILIDAD DE LA NISTATINA EN LOS SOLVEN­

TES ELEGIDOS.­

OBJETO:Estudiar comparativamente, dentro de las condiciones requgridas para el ensayo, la disolución del antibiótico en los solven­tes definidos en el ensayo anterior.

c) INTERFERENCIA EN EL QBJCIMIENTO EQ; GERHEN DE ENSAYO

DE A UELLOS SOLVENTSS AUE CUMPLAN LAS CONDICIONES DE

LOS ITEMS a I b.­

OBJETO:Seleccionar aquellos solventes que no modifiquen el normaldesarrollo del germen durante el período de incubación del ensayo.

-3­

d) DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ANTIBIOTICO A UTI­

LIZAR EN LOS ENSAYOS.­

OBJETO:Determinar si dentro de las limitaciones establecidas en los

apartados anteriore; es posible obtener una concentración de antibiático conveniente, para la realización del ensayo.

' e) ESTABILIDAD DE LA NISTATINA EN LOS SOLVENTES NO INTER­

FERENTES.­

OBJETO:Elegir el solvente que produzca la menor variación en la agtividad biológica del antibiótico durante el mayortiempo posiblecon lo que se logrará: l) Eliminar del método los errores que se pproducirían por la variación de la potenmadel antibiótico duran­te el tiempo de ensayo. y 2) Usar la solución standard en más de un

ensayo con las consiguientes ventajas de comparación de datos y ecgnomía.

f) CONTROL DE LA SOLVBILIDAD DEL ANTIBIOTICO EN EL SOLVEN­

TE FINALELNTE ELEGIDO.­

OBJETO:Asegurar que la nistatina en las conditiones definidas sedisuelve totalmente.­

CONCLUSIONBS:De los ensayos realizados se determina:

a) Comosolvente más conveniente la mezcla al 50%de propilenglicol­metanol.

bV

La concentración de la solución de antibiótico a utilizar deberáestar comprendida entre lOO y 200 u/ml.

c) Se establece como tiempo máximo de conserVación de una soluciónstock de concentración 4.000 u/ml de mistatina en el solventeelegido: 3 días.­

III.- DETERMINACIONDEÍLAS CONDICIONES DEFINITIVAS DE ENSAYO.

-4­

OBJETO:Considerando las experiencias anteriores, determinar las ccondiciones óptimas de ensayo (concentración de inóculo y tiempode incubación).­

CONCLUSIONES:Se confirman las condiciones primarias determinadasanteriormente (concentración de inóculo: 6%y tiempo de incubacióna 37° C:3 horas).­

SEGUNDA PARTE: REPRODUCIBILIDAD DEL METODO EN LAS CONDICIO­

NES QUE PERMITAN SU APLICACION PARA LA DETERMINACION DE VA­

LORES RESIDUALES EN ALIMENTOS.

I.- REPRODUCIBILIDAD DE DATOSv­

OBJETO:Determinar si la variación de los resultados obtenidos con

la aplicación del método definido para las condiciones convenientes,está dentro de los límites aceptados para este tipo de ensayos.­

CONCLUSIONES:Realizados 188 ensayos individuales se obtiene como

variación máximade las potencias obtenidas un 4,2%. Este valor egtá dentro de lo exigido para este tipo de métodos.­

II.- COMPARACIONgDELOS RESULTADOS OBTENIDOS CQNÍEL PRESENQE METO­

DO Y EL DE DIFUSIQNgEN PLACAS DE AGAR.­

OBJETO:Determinar si los valores de la actividad biológica de lamuestra, resultantes del ensayo de reproducibilidad de datos, con­cuerdan con los obtenidos con el método de difusión en placas deagar al que se considera comoreferencia por ser el de uso comúnenla actualidad.­

CONCLUSIONES:Los resultados obtenidos con los dos métodos son comparables.­

-5­

TERCERA PARTE: EHSAYOS DE APLICACION DE LA NISTATINA PA­

RA LA CONSERVACION TEMPORARIA DE FRUTAS Y HORTALIZAS.- 1

I) EFECTO CONSERVADOR EN ACBLGAJ TOMATE, LIEQN Y UVAS.

OBJETO:Determinar si la aplicación de una solución de nistatina sgbre estos alimentos tiene algún efecto benéfico en su conservación.­

CONCLUSIONES:Se determina una evidente acción conservadora del an­

tibiótico en tomate y limón en los quek luego de un tratamiento conuna solución de lOOppmde nistatina, no se observó la aparición dehongos contaminantes hasta 4 a 5 dias después de su aparición en loscontroles. En uva, en casi todos los ensayos, las frutas tratadasse mantuvieron alrededor de ldia más que en los controles sin pre­

sentar aparición de hongos siendo además en ellas la cantidad de contaminantes menor.­

II) VALORACÉQE DEL ANTIBIOTICO RESIDUAL APLICANDO EL METODO ENSAYA­

m.­OBJETO:Determinar la cantidad de nistatina residual que hay en cgda uno de los vegetales tratados con el antibiótico, y su variaciónen función del tiempo, aplicando el método de valoración rápida ensayado.­

CONCLUSIONES:Luego del secado de la solución de 100 ppm. agregada

a los alimentos, en el que la potencia se reduce aproximadamenteun 40%,1a actividad del antibiótico residual se mantiene con valgres aceptables hasta los 7 días, no se observaron interferenciasentre los vegetales ensayadosy la nistatina.­4/

(mms m CERDA!

“MSIIMD IACIONAI.DE 3015303 AIRES

¡ACUMADDI CIENCIASmom Y IANRALES

!AIORACIOE QE NISTATINA RESIDUAL

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(OrientaciónQuino. Mítica).

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Brpreeo ¡1 reconocimientoel lr. AdolfoIn lentes, Profesor Ad­:unto de 1. cátedra de Brontologh yAnálisi- Industriales por haber tone­do bajo en dirección el presente tre­bajo.­

Agradezoo,“121m. a 3.2.Sqnibb e Sons. Argentina, 8.A.. porhaber facilitado ene Laboratorio. pe­re la ejecución del himno.­

7'“

4­VAIDRACION ¿El NISTATINA BESIDUAL El ALIMENTOS APLICANID

g!_NUEVD [ETODO

I-PARTE BIBLIOGRAPICÁ

1) Anteoodenteosobre el no de antibiótico. on elnentoav­2) Generalidades sobre la nistatinno­3) ¡atodos de valoracion a. antibiótico. y perticulononto de 1.

n13tat1na.­

II-PARTEMEME!“

1) Ensayoy ¡Justo do un nuevométodopara valorar mutua.­2) Reprodnoibilidad del mi.an en la. condiciones que permitan II. g

tuizaoión para la (¡atenuación de valores residuales en slip­nontoe.- .

3) koaon do aplicación de la Matutino para la conservaciónte.­porarta de frutas y hortalizas.

o) Efeoto conservadorb) Valoracióndel antibiótico residual

WNCLUSIOIES

4­ETROIUCCIO!

Varios fueron los nativos que impulsaron 1a realizacióndel presente trabajo.­

El ¡isno tuvo en origen en el interes de encontrar un nátodo pare le valoración de le actividad de le nistatina que resul­tara másenoto y rápido que los somente usados y que pudieresuministrar el Valor requerido con una Jornada de labor.­

lás tarde, ante el hecho de que le proliferaoián de hon­gos y levaduras constituía un grave problem en le conservación delos vegetales, se pensó en efectuar ensayos de eplicaoión de esteantibiótico, esencialmentefungicidn, para contrarrestar ese des­trucción.­

Por último, si las pruebasanteriores resultaran satis­factorias, ee decidió determinar los valores residuales del entibiático luego de diferentes tiempos de contacto con esos alimentos. atilizendc el Iétodo de valoración ensayedcw

-6—

ANTECEDENTESSOBREuso y: ANTIBIOTIOOS ¿211amamos

Generalidades

Desdeel descubrimiento de loa antibióticos, grupo deaustenciae con actividad snti microbiana, loa técnicos en_a11nenh¿ción han contemplado el neo de los nianoe comopreservativos en a;_ticuloa alimenticios.­

Loe resultados en un principio fueron bastante desslentgHdores puee loa primeroe antibióticos tenían un espectro antibscte­riano limitado. Sin embargo, más tarde con 1a aparición de otros,de eepectroe mas amplios, el panoramafue variando y sus posibili­dadea en el campode 1a tecnologia alimenticia aumentaron extraorbdinarianente.­

Se pudo obtener con el meode loa antibióticos de amplioespectro, particularmente los del grupo de las tstraciclinae, unaprolongación en 1a vida de una buena parte de los slilentos perqudores, retrasando 1a deetruoción bacteriana de loa mismos.­

En general, perecederos son loa alimentos que permiten ¡1crecimiento de una gran variedad de licroorganisnos, teniendo, encondiciones naturales, una vida extremadamentecorta, tan corta quealgunas voces se puede nedir en horas. Esto ee produce porque losgérmenespueden. en ellos, proliferar rápidamente, resultando de q;to una explosión nicrobiana (Fig.ll. El período de vida fresca deun alimento perecedero ea el intervalo de tiempo que transcurre agtee de que el número de microorganienoa contaminantes entre en eaeausente explosivo.­

En general, hay dos formas de ausentar el tiempo de vidafresca de loa alisentos: Primero: disminuyendols población inicial

.7.de sermones que son capaces de proliferar y Segundo: disminuyendols Velocidad de crecimiento. o sea aumentando el tiempo en que lapoblación total se pueda duplicar.­

Los antibióticos pueden actuar en ambasformas. En pro­sencia de una concentración efectiva de un antibiótico dc amplioespectro bacteriano, solo unas pocas bacterias podrán crecer y es­tas lo harán a velocidades reducidas. En la figura 1 se nuestra 1.‘"ventaja ds limitar el número inicial de gérmenes y de disminuir 1a

rníHones¿ebad’eriaa

velocidad de reproducción.­Fignra 1 ExplosionssI d. géHCHÓBsoeeoo00.000....-¡escasos-soesooeo35"” I MEP-x

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La acción de los antibióticos se ve muyfavorecida por lnretrigsrscián ys que solamente los germen“ psicrláfilos pueden ¡argbliferar a bajas temperaturas.­

Es tanbián muyimportante ls higiene durante la manufac­tura del producto ya que con ¿sta el númeroinicial de bacterias;yhongos se vs reducido.

-8—

E1 uso de los antibióticos en el procesamiento de los s­linentos es su: simple y es ademásadaptable s casi cualquier teo­nica existente. La nayor parte de ellos, a las concentraciones enque tienen que ser usados, son solubles en agua y además son gene­ralmente difisibles. pudiendoser varias las tecnicas eficaces pa­ra su aplicación. ¿si por ejenplo el alimento puede ser sumergido,enjuagado o hunedecido en sus soluciones aoucsas o bien estas seraplicadas o tunigadas sobre el nisnoi Pueden ser también agregadass los tanques de enfrianiento. o al hielo usado en la conservación,comotambién ser inyectadae en Los animales antes de su atenas.­

Por comparación con los preservativos quimicos conocidos.la cantidad de antibióticos. requerida para conseguir un alargamie;to significativo en la vida fiasco, es ¡uy pequeña. Concentracionesdel orden de l ppm. o nenores son menudo mrcadanente efectivas.­

Conrespecto a los residuos. no solo los niveles efecti­vos son bajos sino que ademásson relativamente inestables, sobretodo a las temperaturas empleadas en la cocción. Comparandolosconlos tipos comunesde pesticidas el problem residual con antibiotlcos es casi inexistente. Los residuos en los alimentos. cuandosonsonidos, son generalmente tan pequeños que no son detectables.­

Evidentenente, comopudiera haber manufactureras sin rs;ponsabilidad que usaran grandes cantidades de algunos antibióticospara la conservación de sus productos. o bien que usaran sntibióticos cuya toxicidad no ha sido perfectanente determinada, el LILA.(Food, Drug and Coeneteo Act) de los Estados Unidos, es sanamente

estricto en las regulaciones de estas sustancias. Así, el primer 3eo comercial de un antibiótico en ls conservación de un alinento

fu

-9­

perecederc pudo ser posible recién en novia-bre de 1955. en que elP.D.A. permitió usar la clorotetrsciclina “en y sobre" carne de e­ves nc cocidas. estableciendo la tolerancia de 1 partes por millón.Esta decisión se basó en la evidencia cientifica de que la coccióndestruiria esta cantidad de antibiótico, de tal maneraque no que­dara nada cuandola carne fuera utilizada.­

Los puntos de vista del F.D.A. sobre uso de antibióticosen alimentos son (30-11-55):

1) Constituye un riesgo para le salud pública, pues su consumepu;de producir la aparición de microorganismosresistentes n losmismos.­

2) La presencia de antibióticos en alimentos para uso humano, e snadición directa o indirecta e tales alisentoe puedeconsiderar­se comouna adulteración según el significado de ls sección 402del F.D.A. and Cosmetic Act (Sección 402-52 Stat. 1046; 21 0.8.C 342).­Esto no será obstáculo para el establecimiento de toleranciaspara antibióticos bajo las estipulaciones de la sección 408 delacta. cuando se pueda tener una adecuada evidencia de 1a utili­dad de los sismos y de la seguridad de los residuos.­

J.T.chue, H.Goldberg y R. Goodman.de la Universidad deMissouri, Columbia, han presentado un prograna de investigación s­eerca del significado de los residuos de antibióticos en la SaludPública.­

V3

Consideran que luego del priner paso. que es determinar:s) que antibióticos son efectivos en la producción, procesamientoy preservación de un producto; b) a quó niveles deberán ser usados

-10­

y o) que residuoa resultarán de tales usoe. 1a segunda etapa eeríestudiar experimentalmente el efecto de esoo residuos. alimentandouna variedad de animales de laboratorio y determinando la resisten;cia, al antibiótico. de la flora bacteriana normaly patógenay a­demásefectuando estudios toxicológicoo a fin de determinar ei o­eos niveles bajos, luego de un tiempo, interfieren con las funcio­nes fisiológicas normales. Así oe efectuarán estudios de 1a funciónhepática. renal,de la sangre, etc.

Lógicamente, siempre que oe pueda, la experimentaoion enaereo humanosserá muyvaliosa. Ademñe¡aquellas personas que estenen contacto con loe antibióticos. por nanipuleo prolongado durantela producción de alimentos, deberían ser sometidas a pruebas de nipereensibilided.­

RESULTADOS OBTENIIDS

PESCADOSg ALIMENTOSpg ¡un

Conesta clase de alimentos ee puede deoir definitivameg_te que un efecto oonoiderablenente beneficial puede ser obtenidocon el uso de antibióticos en su conservación. Evidentementeha:que dejar bien aclarado que este efecto ee obtiene en mayorgradocon la ayudade la refrigeración.­

marr H.L.; Southeott B. y Biaett 3.; estudiaron la pre­eervaoión del pescado con entreptomicina, penicilina. eubtilina.polimixinaB, neonicina. baoitracina. gramioinina, tirotrioina, r1mooidina.oxitetracíclina. cloramíenicol y olorotetraoiclina. Laolorotetraciolina, oxitetraoielina y oloramfeniool, en eee orden,demostraron ser loa más efectivos. a temperaturas entre 0‘ y 21’0..

-llp

para inhibir la flora bacteriana normal. mientras la riuocidinammm! .1 crecimiento de levaduras.­

El mismoTerr H.L., después de estudiar las formas lasconvenientes en que la clorotetraciclina puede ser aplicada en lospescados, aconseja que las bacterias contaminantes sean expuestasa los antibióticos tan pronto comosea posible luego que el anilalha sido casado y considea que esto puede ser conseguido de variasnanerae:

(l) Incorporando el antibiótico a razón de 1 a Sfmgágo sea l a Sppmen hielo molido o en bloque. En esta última forma (en blo­que) encontraron que hay una migración de la clorotetraciclinaa un pequeñonucleo. Para evitarlo agregan al hielo 0.005! decarbozynetilcelulosa de alta viscosidad.­

(2) Sunergiendoel pescado entero y preferiblemente “sin vieceras',

en agua conteniendo 25 a lOO/pg/ul. de antibiGticoo­(3) Incorporando una muypequeña concentración de antibiótico, por

ejemplo: 0.5 a 0,1/ug/nl., en agua de lar refrigerada (-l,l° CJ,en la cuál el pescado ee guardado o transportado.­

Unavez que los pescados son traidos a tierra, los fileteso tajadas cortadas de ellos, pueden ser sumergida. en una solución

conteniendo aproximadamenteSlpg/hú. de clorotetraoiclina para ev1_tar ulteriores contaninaciones.­

En ballenas la destrucción bacteriana puede ser retardsdaconsiderablemente inyeotándoles grandes volúmenes de solución de zclorotetraciclina en agua de nar.­

El Problema de residuos de antibióticos en estos produc­tos debe ser considerado. ya que las ostras y les mejillones son

.12.

frecuentemente comidas crudos, y la carne de mariscos, por ejemplocangrejos y camarones, puedenser tratados con clorotetraciclinaluego del cocido usual, que precede e la separación de la corteza.­

S. Yamazakiy colaboradores del Instituto Nacional de a;1nd de Tokio y rakatsuka N. y Higeshi K. de la Tokyo Fishing Comp;ny, determinaron un métodopara la determinación de la clorotetra­ciclins en pescados, que es una adaptacion del metodo de la copadel F.D.A.. y comprobaron que en pescados preservados 12 dias en

hielo conteniendo 5 a lO/ug/k. de olorotetraciclina, no quedaba másde 0,005/pg/k. tanto en la piel cono en la carne de los mismos. E­videntemente este nivel no puede tener ningún significado para lasalud.­

C.L.Wrenshall da los siguientes resultados obtenidos usqgdc oxitetracielina, que muestran practicamente los beneficios quese pueden obtener con estos alimentos:

e) Cuandose usa para envaear pescados, hielo contenienpdo 5 ppm. de oxytetraoiclina ls vida fresca del pescado se alargaalrededor del 80 al 150 fi. El "Red fish" se mantuvo fresco durante20 dias conaervadden hielo con oxytetracicline, mientras el con­trol se echó a perder a los 14 dias. El pescado curado y seco semantiene con hielo-antibiótico, fresco durante 25 dias mientrasque los controles se arrainan en l} dias.­

h) Sumergiendofillets de bacalao en una solución de e­sus de mar con 25 ppm. de oxytetraciclina se triplicó la vida freeca de los mismose 0° c. Evidentemente ese prolongación de la vidapuederevolucionar ls distribución de tillets de pescadofresco.­

c) En cuanto a la carne de langosta cocida. que ee echaa perder en aproximadamente 6 dias mantenida a O°c.. sumergiéndola

.13­

instsntáneasente en una solución de 150 pps. de ozytetraciclins,semantiene fresca por más de un nes.­

d) Las almejas desosscaradas sumergidsa en una solucionde 5 pps. de entemoiolins y luego santenidas s 0°e., se ¡d‘unafrescas por 35 dias. Las almejas no tratadas se echan s perder ensenos de uns semana.­

Las Agencias reguladoras del Csnsdi ya han permitido eluso de estas sustancias para ls conservación de este tipo de slinegtes.­

CARNES

Estas son excelentes Indios de cultivo para las bacterias,produciéndose por lo tanto rápidamente su deeoosposición. Solo pe­queñas cantidades pueden ser saladas, desecadas. ahnmndas, enlstadsso aüobadas. nientras grandes cantidades son distribuidas s1 estadofresco. En estas condiciones, en las que hay mayores problemas, sedeben matener s bajas temperaturas para retardar la descomposiciónbacteriana, o sinó, en los países dondeno hay refrigeración, serusadas rápidamente.­

Los antibióticos de amplio espectro demuestran poder inn;bir el desarrollo bacteriana aún manteniendolas carnes a mayorestemperaturas.¿

F.E. aatherage y colaboradores, de ls Universidad deOhio, Estados Unidos, han desarrollado técnicas por infusión delas csrnes,csn soluciones salinas conteniendo antibióticos. En unode esos procesos el antibiótico es añadido a los cortes de carne:intentando ls solución. En otro, el animal es sangrado cortandole

-14­

le Venayugular, insertándolo una cánula en la arteria oarótida yhaciéndole pasar por ésta, a través del sistema circulatorio, unssolución conteniendo 3 gr. de antibiótico, el cual es luego drenadop

Cortes de carne, tales comobirteos, costillas y rosbifpueden ser lantenidos bacteriológicanente frescos muchomás tiempo,sumfgiéndoloso rumigándolos con soluciones antibióticas diluidas.Asimism. en los productos comosalchichas de cerdo, añadiendo 3 a5 pp). de ontetracielins. su vida i’reaca se alarga sn ur'SO a 100%.

UnadietribuciSn muyoospleta del antibiótico. ae obtiepne utilizando el sistema circulatorio de los ani-alos. antes de serestados. En esta forma el antibiótico sera llevado por la sangre yla linfa a las zonas másremotas del cuerpo y distribuido e travésde todos los tejidos.­

Pareee que la inyección intraperitoneal es ls vis másconvenientepara la introducción del antibiótico.­

Se han efectuado estudios con este sistema en vacunas. gvejas y cerdos. utilizando soluciones de oxytetraciolina. Se obtu­vieron los siguientes resultados:Vacunas: Niveles de oxytetraciolina en tejidos, del órden de 0,5ppm., son efectivos para inhibir las bacterias put-efectivas por48 horas a temperatura ambiente. koslentea bifteos se han cortadode res colgadas durante más de 6 Bananas, a temperatura ambiente(de 5 a 25° c. ), sin refrigeración.­

Iuamatanza de los anisalss se puede efectuar de 1 a 4 bgras después de las inyecciones.­Ovejas: Dosis de l s 3 mg. de ometraoiilinn por libra ds peseds cuerpo dan una proteccion adecuada para varios días, s teuperstara ambiente. Noparece haber diferencias significativas, en los ni

.15­

ídles de antibióticos encontrados en tejidos esperando. después dela inyección. l 62 horas para ¡atar loa animales.­gggggg: Dosis de 3 mg. de ozytetraciolina por libra de peso decuerpo, mostraron tener un erecto retardador en la putretaeción.Eltratamiento no es solo valioso para ls preservación de ls carnefresca, sinó que probablementereducirí la gran cantidad de bacte­rias nrrsigadss profundamente, de tal forma que ls descomposici6nde lgs carnes tratadas, comopor ejemplo Jamones. ser‘ reducida.­Aves de corral

En la historia de ls conservación de alimentos por anti­bióticos. estas carnes tienen un significado especial ys que conode dijo anteriormente, fueron los primeros productos que pudieronsalir el nerondo, luego de un tratamiento previo con estas sustan­cias.­

Los estudios que se efectuaron con ellas. indicaron queademásde ln olorotetraoiclinn, la oxytetraciolina y la tetraciolins resultan efectivas para controlar el crecimiento de los orgnis­nos causantes de su descomposición.­

La clcrctetraoiclins es absorbida mejor por la piel y tgJidoe superficiales a bajas temperaturas y es destruida en esos tgJidos por 15 a 30 minutos de cocción.­

Medioe pollos sumergidos lO minutos en;soluciones de lOppm. de elorotetraeiclina y mantenidos s 2° c.. prolongan en vidapor más de una semana. En general se mostrá que con un uso ¡propiado de antibióticos, el tiempo de conservación de las carnes de avespuede ser duplicado.­

-16­

msnm _!_mn;

h los EstadosUnidosse ha estime que el m de le pl!dnccián de frutas y e]. 13%de 1.a de vegetales se pierde durante olestacionamiento'ea los notando..­

Ia refrigeración es uns gran defensa pero tiene sus 1111taciones porque una vos que el producto ha sido sacado del trio.se produce un rápido deterioro.­

m las frutas, los mini-os responsables de ese deterioroson los hongos (especies de los géneros Bottytis, Ponicillinn y o­tros) y on los vegetales las bacterias, aunquelos hongostanbi‘lestán presentes.­

El notado actual do aplicación de].antibiótico es fini­gnr antes de le cosecha o sunorgir los prodnctos despues de 1a ni;na. Ambosprocedisiontcs son eficaces. lógica-ente aquí no se tro­te do esterilisar los vegetales o tratos sinó de poder prolongarsn vida útil en ¡no e dos días. particulsrssnte en le industria de].¡reenvasadow

¡n ensayos con papas, se observó que algunos antibióticosreducen o clininan las bacterias pero queuna ves que estos desapa­roocn, enpiozsn a proliferar en abundancia hongosy levaduras.­

Pnrs controlar ambostipos de ¡iz-senos se pensó en nes­chr un antibiotico del tipo entibactoriano conopor ejenplo leclorotctraciclinn con unoanti-icotico. In nyor parte del trabajosegún el Dr. Wilson L. Smith (en sn infone on una reciente disco­sión sobre nso de antibióticos en 1a conservación de alissntos, egtro nie-bros de nn Jurado de1"0.8. nep. of Real“ Education ¡alfa­ro. P.D.A..')se hs realizado con Niststins. Eh ese nio-o inform el

-11.

Dr. Smithaanifiesta que el trabajo efectuado en vegetales adolecede algunas fallas. tales como:l) Esceses en datos de valores res;duales; y 2) Utilización de altas concentraciones de antibióticos.­

En EE.UU., 3.3. Cox comprobóque la layer parte de la lgchngs sumergida en una combinación de estreptonicina y ozytetraci­clina en concentracióuea de 50 a 1.000 ppa., evita su infecciónbacteriana. El porcentaje de nuestras que no fueron tratadas y seecharona perder resultó del 60%,mientras que en nuestras trata­das fue del 2 al 9%.­

Brad: E. Francis y el sancionado Saith I.L., obtuvieronbuenos resultados tratando espinaca con 500 a 1.000 pplo de estrep_tcaicina. Logrsrcn así una reducción del decaimiento de la espina­ca del 50 fo si ¡sta se mantiene a 18' C. durante 4 días y del 40*santsniéndola 21 días a 7° C.­

Sin esbargc, recientemente 3.1. Becker. R.N. Good-sa y3.8. Goldberg, de la Universidaide Missouri. Coluabia, determina­ron estudiando el efecto conservador de la estreptonicina, clorotgtreciclina y ozytetraciclina en espinacas contaminadasartificial­nente con Erwinia carotovors. que las tree en concentraciones de

25/ng/ul. retardan el decaimiento de la verdura refrigerada antesde envaaar, pero que en el caso de la estreptoaicina quedan, des­

pués de la cocción, residuos de Z/ng/al., por lo que no se podrípensar en el uso de este antibiótico soso conservador de espinaca,hasta tanto no ae realicen estudios adicionales que determinen laimportancia que puedentener estos residuos en la salud.­

Se obtuvieron tanbiin resultados satisfactorios tratandoverduras para envasar con una solución de subtilina de 20 pps. e

toco-ola333k;alhanson!Icuando.la.gitana.o.unacanong:hnom-humano{inundan¡algang¡acecha3g.I¡0300.3-Ioho-u9-8-3.quoca-ga

A?

.19­

OTROS PRODUCTOS

ngggs En esta se demostró que tanto 1a Psnioilina como1a ee­treptonicina, Clorotetraoiolina y ozytstraciclins. sn ooncsntracfilnes de 25 ppl.. pnedsn alargar el tiempo de conservación de la ls­ohe pastenrizads, pero no de 1a cruda. Los dos priaeros aejoran q;sho tiempo en 7 a 8 días, nientras que los dos últimos lo hacen sndos o tres semanas.­

En la Universidad de Osaka. Japón, ss estudió .1 proble­de la leche cruda y se llegó a los siguientes resultados: l) Msn­elsa de patulina (0.01 f) y anrsonicina (0,01 fi), conservan la le­che durante 10 días; 2) Penioilins (0.01 fi) mi. anreoaioins (0.01%)por ocho días y 3) Penicilina ¡ás oloronioetinay patulinn afin anrg,onicina y penicilina más anreoaioina (cada ans 0.002%). durante 3dias. ­

Conssto se han dado los principales resultados obtenidosde ls aplicaoi6n de los antibióticos en 1a conservación de los al;mentos de layer importancia.­

Si se considera que los Estados Unidos. donde ae tienenlos mitades ¡is modernosde cosecha, sluacsnsniento. transporte,distribución, sanidad, refrigeración. ets. las autoridades sonaiigran que nns cuarta parte de la producción de aliasntos es perdida,se ooaprsnderí la iaportanoia que tiene para la hnlanidsd. todo a­delanto que se pnsda hacer en este campo.­

Evidsntsaents, controlando la proliferación aiorobianaen los alimentos, no solo se logra salvar gran parte de esa yirdi­da. sino que se puede mejorar la calidad, tanto de los aliaentoa

.20­

rrosool oonodo lo. envasados, congelados. m. lodo “to you'd”.­ri m man elevaciónde].un). nutritivo, a nobo- lngaru 6‘ando con¡camilo todavíarosario.­

GBNLRALIDADLS LA NISTATINA

La NISTATINAo FUNGICIDINA,antibiótico fungicida deeorbierto por E.L. Razon y R. Brownen 1950. ee obtiene por fermenta­ción del Streptonvcee nouraei.­

1) PROPIÜADES FISICAS _Y_QUIMICAS

Ee un polvo cristalino de eolor marino que poeee unepotencia que puede variar. según el grado de purificación, de2.500 e 3.500 dns.­Sglubilidadte) En insoluble en agua; oloroi’orno; hanna y “tetona.­b) Parcialmente soluble en netanol; solución ecuoee de etanol.

N-propanole iso propenol; butenol-turedo de agua y dionnowo) Solubleen piridinn, temida. ácido acético glacial, n-n un;

til acetamidey propilengliooL­In eolubilidad en eolventee polares ee incrementada por

le presencia de un lo e zo! de egue dependiendo en todoo los oaeoe.de la pureea de le mestre (el polvo eeniorietelino con potenciade 2.500 e 3.000 u/ng. ee más soluble en loe eolventee oomunee.queel polvoliorooristalino eltanente purificado debidoe le eolubililación de lee inpurezee presentes) y le Velocidad de dieolución,del tamañode lee particulas.­Puntg de Mig’n:

Se empieze e deeoolponer gmduelnente e lee 160%.. einfundir aún e 250° C..­

-22­

Rotación Esgccífica: (0012)5

- 10° (ácido acético glacial)+ 21° ( piridina )4-12° (dinctilfornanida)

Frente a diferentes reacciones oc obtienen los siguientesresultados:­a) 013 rc a negativo.­b) Reactivo fcnólico dc llinonc: negativo.­o) Reacción dc Moliccht positivo.­d) Reacción de Carbazolc: positivo.­f) + 504 32 cono: cambio dc color dol violeta c1 negro o nin]..­g) React. de Pabling: no hay reducción.­

h) o rc 613 K3 rc (C106 n fuerte color azul.­i) Reaccióndc ndehidc dc Schifft positiva (reacción lenta)1) Doooiora cl ¡ln 04x .‘—

k) Decolorajl 0140 k2 .­

AEALIsgs ELEMENTá;

o. 58.86 - 58,50 ..n; 6.97; 8.57 .­I. 1.7 - 1,6 .­

EguiValente de neutralización.956 z titulado cn ácido acético glacial con ácido porción».­922 l titulado comoun ácido cn piridina»

Estructura.

In llistatinn cc unn sustancia cnfótcrc (poco. un grupoácido y uno básico), con una composición que parecc sor: 04587511019.­

El tratamiento de la mismacon un exceso de álcali natsnólico seguido de una titulación nuestra el consumode un n01 adicional de e1­oali, ademásdel utilizado para neutralizar el grupo ácido. un:presente por lo tanto, un grupo ácido potencial tal comoserie unalactona o un estar, aunque el primero es las probable. pués no haydisminución en el peso equivalente básico del producto seponifioa­do, no habiendo aparentemente "ruptura" de la nochula.­

Nohay presencia de halógenos, aaufre o grupos tenólioo,acetilo o netdílo.­

La existencia de un grupo carbohidrato se estableció pormediode una reacción hidrolitica. Esta se pudo llevar a cabo conanhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado. Se obtuvo asi unfragmento que se caracterizó cono un derivado aeátilico de una en;no desoxihozoea, a la que se llamó 'MIOOSAHINA".Parece así que lanistatina posee una unión glucceídica. ademásde los grupos carbo­nilo y lactona y aún nas: que el aaino grupo esta presente en 1a ‘heroes.­

Resultó interesante encontrar que la nioosamina ee obtig_ne tambiénde ll hidrolisis de la Anfotericina B. otro antibióticoantinicótico. Esto, Junto a1 hecho de que el espectro de absorciónultravioleta de la Niatatina ee casi idéntico al de la Binocidina,también antibiótico fungicida, o al que surge de la oonparacián delas propiedades químicasy físicas de estos y otros polienos relo­cionados, todos antinicóticoe (Anfotericina n, Rimocidina, Candia;dina. ete.) fortifican aún másla teoria, que ya existía. de quedebenposeer caracteristicas similares en sus noléoulas. Conobasepara proseguir la investigación ee está tratando de determinar lanaturaleza del esqueleto carbonado de estos productos. El descubri

.miento de que el grupo animo y sois átomos de carbono de la moloqgla están presentes comouna amino desoxihoxosa, sugiere que la ro­laoión entre aquellou policnos que contienen nitrógeno, cono la Ni!tatina, y sqnellos que no lo contienen, comola Filipinn. Iungich:g_nina y irichonwcins, se que todos possen una parts ds carbono, hi­drógeno y oxigeno y que algunos están oonJugados con un azúcar su;

nado y otros no.- 'Es evidente que sl esclarecimiento definitivo ds ls 99­

tructura quimica de ésto grupo ds Instancias. Bari aulanonto inpqg,tanto para la Quimoterapia.­

Todos estos datos permiten la concepción de uns gran mo­lécula de Nistatins compuestadot

l) una unidad de 40 carbonoe conteniendo ligaduras poliánicas, un grupo carboxilo, un grupo laotonn y oncegrupos hieroziloe.­

2) Una unidad ds sois carbonos: azúcar sminado.­

EgTABILIDAD

La Iistatina sn solucionen no butarissdss os bastante i­neatable y es rápidamente inactivads por los iones hidrógeno u ong;drilo y ademáspor s1 calor, la luz y sl oxigeno. Sus soluciones enszclas: solventes orgánicos-agus, s temporaturaanbisntss, protagidaa ds ln lus y del airs, pierden sl 40 s1 50%do ls actividad encinco diso.- Los sólidos secos, guardados en frascos estrados sn ngfrigoraoión, no pierdan potencia sn 12 sesos.­

Sus sales sódicas o potásicss no son ni solubles sn aguani sstables. El clorhidrato ss solubls pero sltanente inestable.­

-25.

En el comercio el antibiátioo aa puede presentar tambiénen tabletas, las que mantenidas perfectamente secas y a 40° 0.. ggtienen su potencia durante 12 meses o en ungüentoa. en loq que laactividad se mantiene (a 25°C.). tres nenes.­

La solubilidad y estabilidad de una preparación de nietatina se muestra en la siguiente tablet

solvente BImitode solubilida Estabilidad__ n/ml. a

Agus 300 u 600. completamente estable por

Metanol y propa­nol 75% (agua)Isapropanol

Propilengliool

Dimetil formamidsN.N. Diletilaoeta­mida.

7.500 - 15.000

100.000

I 112.500 a 150.000

2 semanas.­

pérdida del 40 e 50%en 5dia..­

4 a 5% en 1 e;mans a 5°o.40 al 50% en 1semana a 30°c.

¡pérdida del

Degradación evidente en 1hora.

2) ¿CTHIDAD BIOLOGICA2g LA NISTATgA

a) Acciónfungistatica: Inhibe el crecimiento o destruye activamqgte los hongos. especialmente las levaduras a hongos de ese tipo.Es menosefectivo sobre las esporas que sobre las oilulas vege­tativas. In vitro es fuertemente fungistatioo contra una vario­dad de formas saprófitas y parásitas. Las concentraciones nini­

-¿5..

masnecesarias para inhibir el mazuuisntu de un considerablenúmerode espacios (tabla I) fueron compiladas por la 3ra. Hazenon los Laboratorioa (191Departamento de Salud del ¿atado de Nu;va York“­

Eéïullrsgectro antigietítiü de ¿a 3:13“ng

c 1am ¿mw 1-1¡”5" q) to u/m1.lfihgiarn?.,(g)n cm e!

(s) kz) (n) (2)—

Canal...Alblcm 7,81¡Mew mn 7,81' maiden 7,81¡11mm cm. 15,62' manes-mn 1,81 " ¡mmm 15,62

' ILL-und. 7,81 WW becom- 7,81' 7,81mmm m- 31,25

CW m 3,9)Cmmu ¡pr 31,25Instalan-When“ line) 3,90mm»; ep. 31,25WM“ bmnm (') 3,90m sp. 1,81amm. daa-Istituto (') 1,95mama Macu 7,81Bporotflcln- ¡enmcu1 (') 31,2 ' Op. 7,81

machado. 1703611 <5oo’ " ¡atún 15,62

llanosporimmeapun- 42WWu: m 7,81¡BW upon-(Mm) 62,5 Alarma-1.a). 3,”mm VW 31.25“AspergillusIp. 31,25MW mutua-¡Who 31,25Bondad“ a). 7,81

" tpnmrrans. p.262mmm. amm 3990Carstan “(plant pm) 7,81 tal-¡nnIntl-sim. 7,81(¡actrichm 5,62 chun-yenmas. 7,81

47­¿eción Bactegigstátioa: Prácticasento no tiene actividad, in vita)contra las bacterias comunes.­

oxicidad: es no tGIica. Se realizaron gran númerode ensayos en r;tones, ratas. perros, y tanbien en el hoabre.Se obtuvieron los siguientes resultados!Ratones:

a) Via intraperitoneal {Ln ,0 s 29430a 50040una.“ peso.­IlD02. . d.p.50.­b) Vía oral: lo hubo Inertes ni efectos tóxicos luego de dosis de

8.100.000 a 12.500.000 u/Xz. de peso

¿2222*

I. n 5° a 35068 a 93440 n/Kg. de peso.­a) Via intraperitoneal ÉI. n 2 a 51152a 550405/“. a. peso.­

b) Via oral: no hubo suertes ni efectos tóxicos con dosis de7.630.000 u/kg. de peso.­

Ademáscon éste tipo de animales y con perros se estudiela toxicidad crónica del antibiótico administrado por via oral.Losgrupos de ratas en experiaentaeión recibieron listatina en dosisde 810.000 a 121.500 u/kg. de peso, diaria-ente. En todos los casosla dosis diaria se dió por sodio de un tubo estoaacal en dos dosisiguales, a la mañanay a la tarde, durante 90 a 93 días consecuti­vos. En estos animales, se estudiaron los efectos en sangre. peso.apariencia y en algunos de ellos. seleccionados. se les efectn6 laautopsia para observar cambios patológicos "grandes" y para exami­nar a1 microscopio secciones del corasán. pol-osos, tiroides, hig¡_do, bazo, pancreas. estómago. intestinos, riñones, etc. lo se not;

-28­

ron diferencias entre los grupos en experimentacióny los controlestanto en los recuentos de globales rojos y blancos, cono en la de­terminación de hemoglobina. Una disninnción de crecimiento se obsegv6 en las ratas machosque recibían dosis diarias de 202.500 e j540.000n/Kg. de peso. In dosis ¡ás alta. 810.000 n/kg. diarias,rgenltó ser tóxica tanto para los lechos cono para las hembras.­

Io se observaron lesiones patológicos. gruesas ni nicrog_cópicas en ningunode los animles sacrificados y no 'se pndo dar 3na explicación definitiva a la disminución de crecimiento viste enlas ratas lechos.

En los perros, la toxicidad crónica se eetnd16 adminis­trándoles Nietatina por vie oral y por inyección intravenosa. Porvia oral las dosis diarias fueron de 90.000 e 450.000 n/Kg. de pe­eo. durante 185 e 211 dias consecutivos. Todos los perros fueronsacrificados de ano e siete dias después de le terminación del en­ninistro del antibiótico y sus organismosfueron examinados.al i­gual que en las ratas, para poder deterninar cambiospatológicosgrandes o nicroecópicos (en corenón. pulmones, higado. pancreas,bano. riñones. intestino, tiroides. tino. vejiga y aorta). Ningunode los perros exhibió alteraciones o reacciones_signiticantes.­

Por via intravenosa 1. Histatina se administró en sti-pensión ecuoee al 0,1% en dosis diarias de 3.200 n/kg. de peso, por35 a 37 dias consecutivos.- Todoslos sninales fueron sacrificadosl e 2 dias después de terminar el tratlniento y ninguno nostró oq;bios en peso. apetito, apariencia, actividad o en el estudio nlte­rior microscopios.­En Hombre:Ningún signo de toxicidad se pudo observar luego de ls

administración diaria oral a. Nistatina, durante nn nos. ni tampoco'evidenciande sensibilización ¡1 sntibiático.­

Ads-ás no ss observaron signos ds irritación local cnpiel. tejido snbcutánso y músculo sn ninguna dc las personas trttgdas con Histatina al 0,2 s 0,8 fi un P1sstibass.­Acciónen cultivos en tejidos:­

Ls Nistatina, agregada cn cultivos un tejidos. on un ni­vel aproximadods 20 |/hl., previene contaninsciones do hongos ylevaduras y no afecta las célulss dc los tejidos. Por esta falta dstoxicidad ha sido asada con into para .1 tratamiento contra hongosds cultivos por Ward, Okar, Blowy otros. Girardi ha informado lsaislación exitosa del virus ds 1a policnislitis. cn cultivos sn tgJidos tratados con Nistatins y Granotf no observó efectos tóxicosdel antibiótico cn niveles ds 20 s 30 n/hl.. ni cn 01 virus dc laenfermedadde Newcastle. ni sn las células del cultivo en tejido.usado para sl mismo.­

-30­

Metodosde valoración de antibióticosPueden ser de dos tipos! quimicos o biológicos.Cuandose demuestra ls propiedad de un antibiótico de ng

tar o inhibir el crecimiento de un germenvivo tal cono ce hace snlos metodos nicrobiológicos. se obtiene lógicamente unn nedida de.”la actividad biológica o potencia a. dicho antibiótico. De esto r_e_salta que para que un nítodc quimicoo fisico tenga real-ente vs­lcr tiene que ser capaz de dar resultados que concuerden con losobtenidos en los métodosnicrobiolégicos. Obtenida tal oonccrdsn­cia, los ¡atodos quimicos o fisicos podrán ser asados sobre todopor tener le ventaja de ser másrápidos,-ls que resalta de sano ggterás en la fabricación de estas sustancias ya que posibilita seguirel curso del proceso muyde cerca. Dichos métodos quinioos en geng_ral se basan en reacciones que algún.grupo funcional de ls sustan­cia, puedadar con ciertos reactivos. ya sesn.del tipo colerim‘trlco. iodcnétrico, etc.. o en ls determinación de alguns constantefisica de los productos tornados en esas reacciones o de las snstuq;cias puras, tal comoocurre por ejemplo en el nótodo espectrofcto­métrico. Por todo eetc sus usos están bastante limitados, ya que .e_sas reacciones pueden algunas veces producirse igualmente con pro­ductos de degradacián o con otras sustancias.­

Loe metodosbiológicos que se describirán enseguida. ti;nen algunas ventajas sobre los anteriores, tales cono:1) Ser generalmente más sensibles.­2) Poder ser utilizados tanto para ls valoración de antibióticos

conocidos comode desconocidos.­

3) Ser asados sin grandes dificultades cuandols nuestra es quini­canente heterogenes y de conpcsición variable, conoserá el os­

-3l­

so de 1a valoración en alimentos, fluidos orgánicos, etc.­Métodos 3101591008:

Pueden ser;J.- Metodos por dilución. \2- Estados por difusión.3- :zátodoa turbidimétricos. ‘

En realidad la distinción entre metodospor dilución yturbidimétricos puede parecer injustificada pero es sin embargoeglamento práctica y conveniente, ya que tanto las condiciones gene­rales comoel cálculo de ambosnótcdcs, son diferentes.­1- Método¡gr dilución. Se base en preparar diferentes diluciones

del material cuya potencia se quiere determinar y agregarlo. encantidades crecientes e una serie de tubos e los que se les ed;cionari un volumendeterminado (generalmente 2.oc.) del nsdio decultivo en el que ee be inoculeds el microorganismo de ensayo.Se deberá observar. despues de una incubación, la minina ooncqgtración de la sustancia que inhibe el crecimiento o alguns otrafunción observable del germen. (Punto final). Conoel titulo pu;de variar con muchosfactores, ee necesario comparar el puntofinal obtenido con el de un ensayo completansnte similar en elque se usa una muestre del antibiótico de potencia perfectamen­te determinada (muestra standard).­

El cálculo a efectuar es el siguiente:a) Determinar el "factor standard" que es el númerode unidades del

antibiótico standard necesarias para no permitir crecimiento enel volumende caldo inoculado. agregado e cada tubo.­

Pare obtenerlo se multiplica el punto final de cada ense­

yo con "standard" por la concentración (unidades por ¡1) de lndilucián usada. El factor Standard finales nn pronedie de todo.los Valores parciales que son estadisticanente razonables.Factor Standard (u) 8 punto final standard (Il) Por concentre­ción standard (u/nl).­

b) La potencia de la muestra se calcule multiplicando el factor etqgdard por la dilución de la nienn y dividiendo por el punto finalde cada ensayo con ella.

Potencia (¡l/m- Factor standard(u) x dilución (¡J/mg.)punto final nuestra (mi)

Para ¡ete métodoy con algunas pequeñas variantes para tg.dos los métodosbiológicos se deberán tener en cuenta las siguien­tee condiciones:

l) Microgrganisnode ensgxg: debe ser: a) sensible al antibióticoa ser ensayado, b) fácilmente actiVado y mantenido. c) no suecatible e cambios de sensibilidad y d) preferentemente no patóge­no...

2) Mediode cultivos-conviene determinar perfectanente el medio ¡21;picio para el desarrollo del germenya que la composición delmismotiene gran influencia en la sensibilidad del punto final.­

3) ggéculgt ee preferible inocular el medio de cultivo antes de serdistribuido en lee tubos. Coneste se gana en tiempo y además

ee obtiene un inóculo homogéneopara todo el ensayo. lo qne eede fundamental importancia¡ La cantidad a inocnler. una vez stq!dardizadas tanto las condiciones del ensayo comolas de ¡antonimiento del germen, conviene que sea constante para no correr elriesgo de tener ensayos irregulares c malos, yn sea por estar tgtalnente crecidos o por falta de crecimiento.­

-31.

4) Tegperatnre de incubación: debe ser la apropiada para el creci­mientc del microorganismo de ensayo.­

5) 219229 de incubación! en realidad puede variar de unas pocas hg_ras s varios días según la Velocidad de crecimiento del germen.En este método gsneralnente es de 16 a 24 horas.­

6) rento el material comola técnica debenser estériles.­2- IétoúOS por difasiGn

En estos métodosse utiliza un medio de cultivo sólido.el cual es tracionadc en cajas de Petri. La inoculación se efectúaa granel, cuando el medio se mantiene todavía fluido, o sobre lasuperficie, una ven solidificadc.­

La solución cuya potencia se quiere determinar, se poneen contacto con el medio cálido y el conjunto es incubado. La dis­tancia entre el lugar original de contacto y el que alcanza por d;fusión una concentración inhibidora de la sustancia, se determinapor la ausencia o disminución de crecimiento del nicrocrganisno encss zona y con ella se tiene una medida de la concentración del inn;bidor en la solución original o en la muestra sólida. La distanciade difusión efectiva puede variar con machosfactores, pero si elmismotiempo se colocan soluciones conteniendo cantidades conocidasdel antibiótico (soluciones Standard) se puede obtener una curvacuyas coordenadas son en ordenadas las concentraciones de antibiófiicos y en absicaslas respuestas obtenidas y con ella, conocer la pgtencia de la muestra desconocida.­

Uno de los metodos por difusión más asados, es el métodode la copa. En ‘ste las soluciones s ser ensayadas se colocan den­tro de pequeños cilindros de 'a prox.10 Im de altura y 5 a 6 m dediámetro interno. que poeden.ser de vidrio. porcelana o acero inerg

-34­

dable. y que se disponen previamente sobre ls capa de agar nntriegte, inoculado y endnreoido. Despues de la incubación (generalmente16-20 horas) se observarí un crecimiento bomcgencodel hicroorganig.mo, excepto alrededor de los cilindros donde el antibiótico difun­de produciendo balon de inhibición circulares. Los diámetros de c­aos halos deben ser nedidos y comparados con los obtenidos con coacentraciones conocidas del antibiótico (soluciones standard). Otraposibilidad es la de colocar el material a ensayar en cavidades bgchas en el mismoagar. Este mótodc tiene la mismapreciai6n que elmétodode la copa y en algunas oportunidades tiene algunas ventajascomoen el caso de que se quiera determinar la potencia de una so­lución'qne tenga particulas en suspensión, que puedaninterferircon la difusión del antibiótico. Abrahamet al (1941) encontr6 quecuandoee queria deterninar potencia de penicilina en fluidos oonpteniendo globnlos rojos, por el sitodo de la copa. las celulas delos globalos interferian en la difusión de la penicilina.­

Otra alternativa conveniente a los dos metodosanterio­res. la constituye el neo de discos de papel de filtro. En ¿ste c5so los discos son embebidos en las solucionen en ensayo y luego cg_locados sobre la superficie del agar nutritivo. inoculadc y andar;01‘00­

lientras que en el mctodode la copa la concentración dela sustancia. es la que determina el diámetro de la sona de inhibíción, en el metododel disco la responsable es la cantidad de dichasustancia.­

Ios calculos son similares para todas las tecnicas por d;fusión y consisten en lo siguiente:

ï_-35­

l) Usandopapel semilcgaritnico se construye una linea standard.no absisas se colocan los diámetros de los halos de inhibicióny en ordenadas las unidades del antibiótico standard.­

2) Obteniendo los valores promedios de los diámetros de las sonasde inhibición producidas por cada dilución de la muestra y lle­vándolcs sobre la curva standard obtenida, se puedenhallar lasunidades de antibiótico que los provocan. Estas unidades multi­plicadas por ls dilución de ln muestra, dan ls potencia de lsmisma.­

3- ¡{É-todoturbidimétricgEn este método, al igual que sn el método por dilución,

se debenpreparar diferentes diluciones del standard y del materialcuya potencia se desea determinar, las que se agregarán en diferq!tes cantidades a tubos e los que se les adicionarí luego un volumendel medio de cultivo previamente inoculado.­

Luego de una corta incubación,generalmente de 3 a 5 hs..las variaciones de crecimiento del microorganismo de ensayo en elmedionutritivo liquido son determinadas turbidimetricamcnte. Lsturbidez o más s ¡cundo la transmisicn de luz es generalmente nod;ds rotcelectricamentc.­

Para efectuar el cálculo de potencia se hace uso de unacurva standard que se obtiene considerando en ordenadas las lectu­ras del galvnnómetroy en sbsisss las concentraciones del antibió­tico stlndard. Luego. con los valores obtenidos para cada diluciónde ls muestra s ensayar, se recurre e ls citada curva y se cbtienoIn valor que mediante una simple operación da ls potencia buscada.

En este método, comose dijo anteriormente, los tiempos

-3s—

de 1nenbec16ncon la: cortos con le que ee ahorra, en le ¿eta-nin;ción, moho tiempo. nte. unido e que le. resultados obtenido. cons1 tienen mayorprecisión quelos comunión con lee otros n‘thde valoración. lo hacen eminente ventajoso.­

-37.

METOIDEy; ummcxog y; I._A_ smcnm

¡auque la Nistatina tiene un espectro de absorción carasteristioo, la intensidad del miximono puede ser usada comouna ugdida de la potencia de la mismaya que se observó que en algunas gportunidades una casi completa pérdida de su actividad biológicano produjo ningún cambio en dicho espectro.­

Varios son los métodos biológicos que han aparecido parala valoración de la actividad de la nistatina a partir del comienzode su producción comercial en 1953.­

Gold w.. Stander B. y Pennyr. del "Squibb Institute forMedical Research: llewBrunswick. NewJersey describieron dos méto­dos, uno por difusián en agar y cl otro por diluciones!I - Métodomr difusig'n en ya (1)

Consiste en colocar en fuentes pyrez especiales 160 nl deagar-basal inoculadc con 2 al de un cultivo de Candidaalbicans, d;Jer solidificar y mantener 2 s 3 horas a 5°C.­

Para colocar las diferentes diluciones de la nuestra ydel standard se usan discos estériles de fi pulgada de papel absor­bente, los que son sumergidos 2 a J segundos en las soluciones ypuestos, luego de eliminar el exceso del liquido, sobre el agar.­

Las fuentes son incubadas a 37’0. durante 16 a 17 horas.La humedadambiente durante la incubación nc debe ser menor del

65%.­

Lss lecturas se efectúan fotografiando las fuentes y de­terminando las sonas de inhibición alrededor de cada disco. Luegopor comparaciónde los resultados obtenidos con el standard y conla nuestra desconocidaae obtiene la potencia de la lisas.­

.33.

II- Métodoggr diluciones (Para dosarel antibiático en fluidos ormdlnicos: sangre. orina y materias recalca).­

Conaiste en fraccionar cantidades de 0,5 nl de medio decultivo, caldo extracto de carne y levadura, en tubos de Waeeerman.

(A1medio de cultivo se le adiciona Estreptomicina (S/pg/ml) paraevitar el desarrollo de contaminacioneebacterianas durante el en­sayo) y luego agregar las diferentes dilucicnee del antibiótico.­

Se utiliza comomicroorganismo de ensayo el Saccharomyceecerevieiae.­

La incubación se efectúa a 25°C durante 16 horas.­

La lectura ee puede hacer visualmente examinandoel sed;mento producido por el crecimiento dal germen o bien. comofrecuen­tementese encontraron dificultades para determinar el punto finalcon eee procedimiento, ee pueden agregar a cada tubo 0,5 ml de so­lución de cloruro de trifeniltetra zolium; ponerlos nuevamenteaincubar a 37°Cpor media hora y luego efectuar la lectura. Cualquierpequeñodesarrollo es se! fácilmente visible por la formación de unsedimentode color rojo.­

Se han descripto además los siguientes metodos:III- Métodoespecia; 9252 sangre, definido por Tarbet J. Our! I. ySternberg, 1.3.

Utiliza el recuento microscópicodirecto de las blastoe­peras de Candidatropicallia, desarrolladas durante 15 a 18 horasen las nue-trae de sangre diluidaa en un mediosintético.­

El número de las mismas se una funcion de la cantidad de

nietatina presente. Comoen otros métodos, tambiín en ¡ete se detq;mina una curva standard cuyas coordenadas son: logaritmo del número

r__-39­

deblnstosporns (ordenada) y unidades de nists‘cina por nl (choice).IV- ¡“todo mr digsifin en 352 (2). descripto por DonaldGroveyy William Randall ("División of Antibiotics, Food and Drug Adminis­tration, ILS. Dopartnwntof Health, Education and Wolters").­

Eete método de difusión emplea para la colocación del en.tibiótico cilindros de acero inoxidable de diámetro interior iguale 6m (¿0,1 mm)y exterior a 8 mn(¿0.11113) y de altura iguala10II (3 0.1 m).­

Comosolvente para el standard y las maestras utilize to;mamide.E1 primero se mantiene diluido en este solvente n una conce;trecián de 1.000 n/nl, durante 3 dias. Ia posterior dilución e leconcentración de ensayo se efectúa con buffer ph 6.­

El microorganismode ensuo es el SeoohsronwcescerovisiseA.T.C.C. 9763.­

El ensayo se incnba 16 e 18 horas s 37’0.La lectura y c-ïloulo de potencia se efectúan de acuerdo

e lo expresado anteriormente para métodosde difusión de sntibióticos.­Y- Métodopgr difusión en agar (3), actualmente usado para la valgración del antibiótico.­

Se diferencia del anterior en lo siguiente (ademásde algnnos pequeños detalles de técnica)!l) Enle para la colocaciónde las soluciones de nistatine discos

de papel de filtro (s es: 740-1:de i pulgada).­2) Comosolvente utiliza propanol 70%. Las nuestras deben ser agita

das durante 3 horas pero favorecer ls disolución.­VI.)Métodoturbidimétrig, recientemente aparecido, tn‘ descripto

4o­por Julian Kramer del “Food and Drag Administration. Department ofHealth, education and Weuare, Washington".­

Conniatc, comotodos loa métodos turbidinétrioon, en pr;parar diferentes diluciones del antibiótico standard y do la nue.­tra incógnita y agregarlas en diferentes cantidades a tubos a lo.que ao los adicionará. luego, un volumendel medio de cultivo ino­culado, pero se diferencia de la mayoría do ellos gn que la inca]!ción (a 26°C)-dura 16 a 18 horas»­

Utiliza comomicroorganismo de ensayo Baochammycea cer;viaiae, A.‘I‘.C.C.9763, ol que se inocula. una vos ajustado a un v;lor de absorcián definido on fotocolorínetro. al 3 a 5130en el no­dio de ensayo.­

El solvente es NnE-dinetilformida ajustada a ph 6.5_‘_’D.3.Conél se diluye, el standard y las nuestras, a una concentraciónb1000 a 5000 u/ml y luego a 160 n/ml. Posteriormente a. efectúan nn;m diluciones en agua destilada estéril a concentracionesdel rango de 15 Vall.­

La solución stock de standard so usará solamente l din.

Se pide que todas las diluciones del ensayo. tanto del ¡tantard cgno de laa nuestras, ¡o preparen simultáneamentepara evitar error“por pórdida .do potencia del antibiótico on el solvente.­

Para efectuar las lecturas se utiliza un fotónetro apro­

piado, con una longitud de onda de 530 n}: (Benach/t CombSpectronio20).­

-41.

¿".ARIE EXPERIMENTAL

Per TRABAJOá DESARROLLAR

¡ga Parto:

ENSAYOI AJUSTE El! NUEVO MPÏIOTD PARA VAI/DRAE NISTATINA

I- Determinación primaria de las condiciones-de ensuyo.II- Elección del solvente apropiado para la disolución del antibiá_

tico a dosar.a) Estudio de la miscibilidad en agua de los posibles solventes

o utilizar.b) Prueba de la solubilidad do la Niatatina en loa uolvanton‘g

legidoo.o) Interferencia en el crecimiento del germen de ensayo de aqqg

llos que cumplanlas condiciones de los itons a y b.d) Deterninaoión do la concentración de antibiático a utilizur /

en los ensayos.o) Estabilidad de la Nistetina en los solventes no interforontoa.r) Control de solubilidad del antibiótico on el solvente una].

916.51onIII-Determinación de las condiciones definitivas de onaayo.­

23, Parto:

REPROWCIBILIDAD DEL MF‘TOIDE LAS CONDICIOEIES QUE PEBJEITQ 3-0. APE

CACIUI PARA lá DETÏRMINACION VALCRESR'ÏSIDUALL‘S ALIMENTOS.

1- Boprodnoibilidad do datos.II- Corporaoi6n do los resultados obtonidoo con ol presento método

y con ol do difusión on placa. do agar.

a, Parto:

a 3111032521401101011m: ag asume; pm a consmvncwnM-*'“g;z.mn ¿ag 195221151 maga;ng “g

I- Hocto conservadoren “olga. tonto, limóny mn.­II- Valoraciónde].antibiótico residual aplicando 01 “todo una";

“o

COICIBS IONE‘ GENERALES

-43­

BROGAS, APARATOS,I MATERIALES A UTILIZAR

Drogas:l-Agar, meto.2-Aleoholetílico3- ' hobutflioo4- " inapropflioo5- ' ¡etílico6- ' propdlioo1-Anh1dr1doacéticoB-Dextronn. Roto9-Dionno

lO-Etuenglieollil-Extractode mana, ¡acto12- " "- Malta, "13-thlkrornollHistntin16-P1r1d1m '17-mPflengliool18-mPtonn. ¡acto

Apu-¡tonl-Autochn2-3-1.“ analítica (a 0.1 Ig)34W. 0-100g (.t 0,015)

termostatlndo.¡arcalam. Son-nun5M ¡ariaS-cinrn hunden do 37°C

44­7-Cámra incubadora de 25’0Futura de enterilizacfinw‘otocurínetro marca Matton, modelo402 -—m"provisto lo r1;

tro 640 Ay tubo para lectura con drenaje accionado porlnoio.

¡{J-{oruga automática para 2 oo. marca Comtrquu-iíéquina agitadom rotativa12-Mun pipetaadora, marcaBrowerMotencióneü'o a electrodo de vidrio marca Bochum modeloGM-Rflfirigarudora.

Materiales:“ram de alambrepara 36 tubos de 18 X150unZ-Hntarial de vidrio estéril: pipetaa (1 m1. 1/10; 5 m1, 1/10;

10 ml. 1/10 y 25 ml. 1/10), probetaa (250 nl). Erlenneyora y;rex (250 nl) y tu.de de 13 I 150 mn con tapa de aluminio.

J-Ma‘terial de vidrio no estéril! pjpetas (5 nl y 10 nl). probo­taa (50 y 500 nl). francos graduados pyrex (de 3500 m1), or­lonneyera pyren (1000 y 2000 nl) y vasos de precijitado (100y 250 ml).

Maduro bnnsen5-Pape1absorbente estérilG-Pupelpara esterilizaciónT-Trípode con tela metálica.

4s­mmENA PARTE¡asno g AJUer 2g y; NUEVO¡mono PARAVAIDBARM

I-DETERMINACION PRIMARIA QE LAS CONDICIONES y ENSAYO

La idea inicial ha sido probar 1a eficacia delganen de ensayoy el aedio de cultivo do].aisno atilizgdos para el nótodo de difusión en agar condicionándoloepara obtener un procedimientorápido. del tipo turbiná­trico. para la valoración del antibiótico con lo qae eelagrar‘ ademásde rapidos, nayor exactitud y economia(nonor minero de Operadores. de laterial, aedioe eto.).

MAMENIO 2E_L ENSAYOA DESARROLLAR

Ea tenir el grado de oreoiliento del germende enano enfunción de distintas oonoentraoioneede antibiótico etandard. Ira­ear oon laa doe variablee una curva (curva etandard) y leer en analoa valores del grado de ereoiaiento obtenidos oon 1a nuestra pro­blema. Realizar con loa datoe resultante. el oflcnle oorreapondie;te para obtener 1a potencia bancada.

carmen de magos Saooharowoee oereviaiae 1.2.0.0.9763Hgdioai ¡tilizarz

a)ledig de ensalggonmeiciánzl‘ripgona 0.5i; Extrao­to de ¡alta 0.3%¡Ertraoto de Leva­dura 0,3%;Dextroea 1.0i.Pregaraciónareaar las drogae en elorden indicado.

Calentar hasta aprox.100.0 en Bañohria.

.46­

l'iltrar a traves de p;pe].de filtro para clarificar elmedie.

Ajustar el ph de mane­ra que despues de 1a esterilizaciónse obtenga ph 5.8.

Esterilizar en antoni;ve durante 15 minutos a 15 1h de pr:¡ión (121°C).

¡Medios de cultivo para el mantenimien­Mi1)lledio sólido: Idemanterior con

el agregado de 15h de agar.2)ledio líquido: Idemmedio de ens;

yo.Mantenimith de cepa: Se realizará con técnica esterilen la siguiente roms

1)Repiear semanalmenteel cultivo en egtries de mediosólido.

2)Inombar 16 horas a 37°C. Conservar enrefrigeradora.

3)E1 día antes del ensayo sembrar nn a3ea en 150 al de medio líquido.

4)Inonbar 16 a 20 horas 37°C.5)Usar este cultivo comoinócnls para

e]. ensayo.

¿47+

DETERMINACIONg}; a CONCENTRACIONgg moct_rm g g TIEMPO D_B

INCUBACIOI NECESAREO

OBJETO

Determinar ei con las condiciones inpneatae ee posible

obtener un crecimiento del germen de ensayo qne haga fectible 1a.;¡canción del métodoproyectado y elegir les nie convenientee,­

FUNDAMENTO

Realizar incubecionee vnriando el tienpo y ln concentre­oión del gerlon en el nedio de ensayo. Para obtener unn nedide del

grado de crecimiento erectnnr comparaciones en cada case contrn elmedio inoculndo ein incubar.­

QECNICA

1) Preparar 1500 nl de ¡odio de ensayo.2) Fraccionar en 3 porciones de 500 nl cada unn en erlenneyere de

1000 nl y taperloe con tapón de algodón y oepnchón de papel.3) Esterilizer durante 15 ninutoe e 15 libras de presión (121'C.).

Deeata maneralo. nedice e utilizar para la. distintae conoce,trnoiones de inócnlo provendrfin de unn nienn preparación.

4) Entrinr e temperatura ambiente.5) Identificar los erlenneyere como3° 1. I' 2 y N' 3 e inconlerloe

con las siguientes cantidades de cultivo líquido:H’ 1: 7,5 ¡1 (concentración 1.5%)r 2: 15.0 ¡1 ( ' 3.0%)N. 3! 30,0 nl ( ' 5,0f)(Estes concentraciones han cido elegidas por estar en 1a q;na de 1o habitual-ente utilizado en ensayos de este tipo a;rn etroe antibióticos).

6)

7)8)

9)

10)

-4a­

Fraccionar. cuidando las condiciones de noepnia. cada uno de e­llos por 10 nl en 24 tubos de la X 150 In oon tape de aluninioeetoriloo convenientementeidentificadoe.Separar de cada grupo 12 tubos y refrigerarlos.Colocar loe restantee en una ¿rodilla para cada tio-po de incu­bación comonuestra el eequennt

aim. 31m. una. 4m. She.si 'o o o "6'6'6' o o o o o o _._..3% -—- o o o o o o o o o o o o

1,5% —- ¿ooo ooo ooo oood—-— e

Incubar on baño de agua termostatizedo n 31'0. durante los die­tintoe tiempos.ledir en el rotocolorimetro Lumetron. calibrado e 100%con ei¡odio de ensayo sin inoculnr y con una sensibilidad, medida enel galvanónotro, de 15 divisiones para 10%de variación en lnescala del fotooolórínotro (100%:0div.- 10%de variaciónzlsdiv.), ln trnnsn1516n de los oultivoe sin incubar e inonbadoe.De esta manera ae obtendrán los vnloree del porcentaje de tran!nisión originados por la suspensión del germen en el medio decultivo en el momentoiztaiol del mm y los debidos al creci­miento del nisno durante los distintos tiempos de incubaoián.respectivamente.­Lne diferencian (JCBentre estao transmisiones posibilitnr‘nlos resultados para la discusión del ensayo.

+49­

DETERMINACIONgli ¿A ooncmwmczon pg mocum 1 g

2312:2590gg nnggacmn

Concentraciónd. lo, 5 3 fi 6 f

Ino'culo

Horas do Poroontajos de Transm1916nIncubación - A - Il 37° C.

2 i

A a — —— 23,095,0 70.7 90.3 62,0 77.5 43.0

3 95.0 71,0 90,3 59.5 77.0 ¡1,52h}. _-:'_. 0 221i 71.2 ¿.141

¿.8 70l8 90.3 60.3 77.3 42:0¿3 a 24.0 30,0 35.3

92.7 62.7 53.5 52.7 76.3 55.03 i 91,8 63,5 88,5 50.7 75,3 33.3

92,; 61,0 sono —— 12,1 32,892.3 62A 58.6 51.7 76.1 33.7¿su 29.9 36.9 42.4

93.5 58.0 89.0 46.7 76.7 28,796.0 57.3 88.3 44.3 76.0 28,5

4 29": 26.} 89.0 ¿id 16,0 21,194.6 5712 88.7 ¿15g? '16j2 28.3

Ax: 37.4 43.5 47.993.0 44.5 ‘53 32.792,8 42.7 85,5 32,7 .. _

5 23,0 ¿1,2 88 o ¿1d92.7 42.9 88.2 32.2

ZX: 49.8 56,0 -——.

e)

b v

o)

-50.

CONCLQSIOHEB

Inc condiciones ilpucstas (germen, mantenimiento del lisno y ngdios de cultivo) permiten el crecimiento sdecusdo del nicroor55_nisso de enssyc.- _Del estudio de los incrementos de crecimiento obtenidos cn funpción de les distintas concentraciones de inóaulo y tiempos deincubación se deduce que las condiciones sis propicios son:

Cono= de Inócg;o Tiempg de Inggbsción ¿31.5 S 4 e S horas 37.4 e 49.83,0 fi 3} a 5 " 36,9 e 56,06.0 f 3 e 4 ' 35.3 e 47.9

Considerando que será óptimo al menor tiempo de incubación noc;serio que produzca un crecimiento adecuado (¿3 - 30 s 40), y cgno de los datos consignados se deduce que pere un crecimiento ¿_gusl s1 obtenido con el 6%en 3 horas de incubación, se necesi­tan 3* horas con el 3* y-4-hoaa6—áe—inoubaeióny—eo—seceoitaa—3}

holas-oon—43—3#y 4 horao con el 1.5%. se eligen como condicio­nes s utilizar en los futuros ensayos los siguientes:

6 fi

3 hores1) CONCENTRACIoN DE INOCULO a

2) TIEMPO DE INCUBACION ¡

ILQECCICN DEL sommn APROPIAID PARA __T__L_A_DISOLUCION pg;

AN._'r14.3OlLCO¿mm

a) ESTUDIO DE LA MISCIBILIDAD EN AGUA DE LOS POSIBLES SOLVENTES A

UTILIEAR.

ogg¿mo

Realizada la dislluoión de la droga a donar en el eoívqgto aproyiado será necesaria una posterior dilución a la concentra­ción de ensayo. Conoeo conveniente 1a realización de la misma onagua, para disminuir ln posibilidad de interferencias en el creci­miento del organismoutilizado, este estudio delimitari loa salve!tee en-loe que ee deberá determinar o confirmar lo solubilidad delantibiótico .

Solulïlidud cn g. porHOlvente 100 ml de ggua

A100“). 0.60.0000.-00....OOIOUOODOOOOOOOmIOOIOOOOOIC.etílico.........,......................................propílico.................................Ï............cisopropílico.........o...................Ï............o

(20°c.)......( Ü

O0.0.0.0.,000000OCIOOOOOOOOI C.)OOOOO.

ooo-ooooooooooooOOOoooe-ooo7.9).0.0.0hobutílico 0.0.00ooo-oooooooooooooolo

isoamilico nooo-ooo...00000000000... 2 (14. Co)oocoeobOROíliCO ooooo-oooooeoooooeooeoeoeo 0.073(22° Co)oooooo

Acetato de etilo ooocoeoooeeoooooooooooooooo8,5 (15° Co)oooeeo. propilo oooooooooooooooooooeooooo1.‘ 31‘s co)oooooe' butilo o.¡ooo-ooooeoeooooooeoooeo 0.5 (20. Ce)oeoooo' ¡mile ooooooooooooooeoooooooooooe 0.18 ( . )Oooooo

-52­

ÉtilfiflfiliCOl o...000.00.90.0o00000oooottoooostoootoOOOOOOOOOOOGOGnPropilenglicol...oooo.......... OOOOoGotoGOGOOOG‘OtboGOGOO‘OOGCO.

0.0.6.60... 0.07 (22. c.)ooooooo0000000.... 0.05 (16° co)oooooooooo-009900. 0’08 (2°. co)ooooooo

enceno ooo-oooooooooooooooooooo

‘oluano ooooooóoooooooooooooooooretracloruro de carbono........L-l diCIOÏOGÑBHO00000000000000. 0.000000... 0'55 ( ' )oonoooo

l’z n OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOIOO0.9 ( )IOIO..O

.Pioxano OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOooooooooo;.o¡osoJÏaogosocoo-oooo

lnhidrido acético 00.00.0600... oooosoooooolz 000.000a0...0..0..O..0.00D0.000000.ÓOI.0O

.—?crmam1daoooooooooooooooooooóoo“Juridinaofoooooooooooooooooooooo .0....0....OOO7]O:OOO‘OOOI.00...

ENCLUS IONES

Considerando comolímite de solubilidad aplicable! 10%,los solventes a estudiar con:

ALmHCL ¡{UTIL-ICO

" ETII ICO

' PROPILICO" ISOPRCPILICO

" ISC-IÉUTILICO

ETILENGLI COL

FROPILEBGIICÜL

ANHIDRIIX.) A02721100

DIO RARO

P IR IDINA

FÓRMÁMIDA

¿sq-JJ..I

b) PRUEBA Dp LA SÜLUTITIÏKF DE IA NISTATINA EN ”" SO "'“”“" ELEGI­A/n, 1 il.L_.u

DOS.—OBJETO

Estudiar comparativnmonto, dentro do las condiciones ro­

qporidas para ol ensayo, la disolución do 1a nistatina en los sol­ventes elegidos.­

TECNICA

Disolver 10 mg de nistatinn en 2 y 5 y 10 m1 de cada solvento concentrado y diluido al 70 á on agua. Agitar durante 30 y

60 minutos y obaorVHr. Cono una de las ventajaa de los métodoa tu;lidinótrioos radica en su corto tiempo de incubación, que permitola realización completa del ensayo en una Jornada, es convenienteqno la preparaoi6n de las muestras insuman cl menor tiempo posible.

Por esta razón on el presente ensayo se limitan los tiempos de ag;tación para la selección de lo. solventea por su poder de disolu——ción del antibiótico a 30 y 60 minutos.­

RESULTAÏDS OBTHNIDOS"10“...­" ConmnNn'do' ¡Lhn¿o¡1 7° í

"1"“ 2.1 - su ion 2m 5m mui("Escow'nn"Emu/ml)(mamada)Ham (¿montovw

uflnlgnflüioo xa ¡xa un: z: ¡11'. O - - o - ‘l Mi” - - a. 0 I Il' inopnufihieo c- -' «a o - I' ¡conducto - - o no noo. un ¡su ¡.1701,

hnluunimn. I: al: ¡Il o - .broma-menea n n: n. - . .‘hmüdrukpomfinoo - o o no:úoo.dnxqgnnfl 70!¡kununo - o o I: un: xx:¡innumn ¡a III IIIanfllúdl ¡a ¡:1 3:: ¡ü

44­poco soluble I ­Algo soluble t xBastante soluble s zxSoluble a zx:

5925}no existieron diferencias apreciables en los resultados cbtgnidos en 30 y 60 ¡inutoe de agitación;­En los solventes en que se consideró el antibiótico solublese observaron algunas pequeñas particulas en suspensión lasque según lo determinado en el ¡Stado de difusión en agar setrata de material inerte.­

CONCLQSIONES

a) Los solventes que onnplsn las condiciones propuestas lan!ALCOHOLIETILICO

" PROPILICO 70%

ETILENGLICOL

PROPILENGLIOOL

momo 10%ÏIRIDINA

FORMAMIDA

b) El tiempode agitación propicio para ls disoluoi6n del antibiótioo en los solventes elegidos es de 30 minutos.

e) La concentración .4:1.. de nistatins que. de aonordocon las llnitaoionss ispuestee. puede ser obtenida con los solventes ens;ciados esti en ls sona de 2500 a 5000a/hl.­

-55­

o) mmrmmcn g gg CRECIMIENTODEI.03mm 21; ENSAYOgn; ¿302.199

sonvmss íïUE CUMPM ms CONDICIONESQE LOS mms 3 1 1.

OBJETO

Seleccionar aquellos solventes que no modifiquen el nor­nal desarrollo del germenkdursnteel periodo de incubación del en­sayc.­

FUNDAMENTO

¡hair el grado de crecimiento del geraen de ensayo en ¡r3senoia de oantldadoa crecientes de cada uno de los solventes a ens!yar y deterlinar la Variación del mismopor comparación con ensayostestigos sin soIVento.­

:ggNICAl) Colocar en tubos estériles de 18 I 150 un con'tape de aluminio

las siguientes cantidades de los solvontes a ensayar: 0.0 - 0,05­0.1 -. 0.2 - 0.4 - 0.6 - 0.a y 1.o ni.­

2 Completarel volumena 1 nl con agua destilada estéril.­3) Extraer, esterilnsnte, 100 Il del nedio de ensayo para calibra­

ción del totcoolímetro.—4) Inocular el medio resjante al 6%con un cultivo de 16 a 24 horas

de Saccharonyosscerevisiae.­

V

V5 Fraccionar, cuidando las condiciones de asepsia, este medio enlos tubos anteriores colocando 9 nl en cada uno.­

C) Incubar en baño termostatizado a 37°C durante 3 horas.­7) Agregar a cada tubo 0.5 a1 de solución de torno]. 1:3 utilizando

una Jeringa Cronwall de 2 al y agitar vigorosanente.­

-56—

8) Leer el porcentaje de transniaión de cada ensayo con el fotoco­rínetrc Lunetrcn (Calibradc. 100%:0 div.) 10%de variaciónn 15div.).­

9) Calcular la variación en el grado de crecimiento del germendeensayo para cada concentración de lcc distintos aclventee uaadceefectuando las diferencian entre las lecturas de loa fi de tran;sición obtenidos con y sin ellcc (ruben teatigcaa 0.0 nl).­

ObaervacicnegtDeacuerdo a las cantidadea de solvente. agregadae a ca­

da tube, la concentración final de lea mismceen el medio de ensayoeerfit

Cantidades agregada. fl de solvente

de aclvÍ2Ï; por tubo obt.nido

0.0 00,05 0.50,1 l0,2 20.4 40,6 60,8 81,0 lo

Dichas cantidades ae han completado antea del agregado del mediede ensayo inoculadc al volumende l nl.con agua destilada estérilpara evitar la variación de la concentración del inóculc que de lecontrario ee produciría y obtener loa porcentajes de eclvente pre­vistos.­

-57.

El egresado de eolnoio'n de rom]. deepufie de h ineubeoión ee he gtechado para inpedir el crecimientopoeterior del screen de me­¡00"Conlos resultados obtenidos se han trazado lee eemapondienteeme de variación ueandocomoordenada-loe f de Misión yabsiaae las cantidades agregadas.­

¿58­

EMT}!C

sObe n

1JL'

C‘a0'11:I‘m‘n‘ófiP‘Gfi‘69:‘6'!‘99“89‘69¡‘69‘l-tWith ‘l-iSO"“y9‘61ros‘05esves‘as'zs'u.‘u.‘urueq‘asu‘mt‘o'L'tso'a;p'rs‘m'099‘09'09‘09"ce'aa"evn‘15"ISrms‘15:‘oí‘ls1'15--‘15L‘otB‘u‘oL‘óz‘Ee‘69‘íome‘09‘09¡0‘09‘t9«‘o6‘a9t‘c9b‘a9‘a9r‘ae¿“to‘aa‘ao‘99‘90‘10p‘la‘u"a.E‘oL‘u9‘.:‘u«‘uru'umep‘ce‘ce‘sele‘ta‘¿oI‘laoa'cop‘a‘cac'oo‘u.o‘u.ru.‘u.i‘mE‘vnn‘w‘59‘Lc‘93‘13p‘lg{o‘aah‘saVía"o't“¡InanmnïzÏrnnzbruta?. I'm-Innnm '‘'

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IvItctnnnaant Irwin-luna;

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fi‘8‘010‘818'69

o‘st‘gLo‘eL6‘41

E‘LaS‘Lq

¡‘910‘61

:11111!¡H‘flmnrjmnz.“dis:“WWWJ¿l

I

-69­

.60.

Cálgglg de ¿a variación máximaggeptable del porcentaje de tragggi­I

giga producida por la interferencia del solvente.Considerandolas limitaciones y conclusiones efectuadas

en los siguientes ensayos anteriores:1) Determinsgién de la concentración de inócglo l o; tiegpg de ¿gp

ggbacióg necesario:Conlas condiciones elegidas, ooncontrscián de inóculo: 6%ytiempo de incubación, 3 horas, se obtiene un incremento en elgrado de crecimiento de 35.3 (expresado en porciento de trenes;sión).

2) Mscib lidad en ua de os osibles solventes t lizar:Limite de solubilidad del solvente en agus no menor s 105

3) Prueba de solubilidad de nistatina en los solventes elegidos:Ls concentración máximado niststins en los solventes que puedeser obtenida, esta en ls sona de 2500 a 5000 u/hl..

se efectuara el siguiente planteo:Trabajando con:e) Solución del antibiótico en el solvente: 4000 n/hl (de acuerdo

el)b) Posterior dilución en agus e 400 u/sl, lo que corresponde s uns

concentración del solvente en agus igual sl 101 (de acuerdo s 2)yo) Incresente total en el crecimiento del germenen el ensayo de

35.0 (de acuerdo a l) que se establece cono posible vnriaoión sproducirse en el ensayo con antibiótico.

se obtendrá que: diferencias del lfi de transnisión serán debidass uns cantidad de antibiótico que results de ls siguiente proporción:

-61­

351 e 400 n i n 15 e ¡n

/ g. ¿ago-11.8 unidades de antiiiótice

Esta cantidad de antibiótico aignifica una Variación del2;9%en 1a potencia de ln solución empleada (400 u/bl).

Proporcionalmente a estos valores se obtendrá para un 2%de transmisión 3 2_z, s unidades de antibióticos y 5.3, 76de variacion

de potencia y para nn Ji de transmisión i 39.2 unidades de antibifltico y 8.63 de variación de potencia.­

¿etiaando comoerror aceptable en loa métodoa de valore­oión turlidinetriooe hasta un 6 fi ae deberí limitar 1a interferen­cia del aolvente a variaciones de hasta un 2%de transmisión.­

Comoel ensayo se basa en 1a comparación de 1a soluciónatandard con la solución de 1a nuestra incógnita dicha interferen­cia ee anula cuando ambas aolucicnea con equivalentes pues en estecaso 1a cantidad de oOIVenteque ateotarí a ceda tubo ¡eri identi­oe.­

La estimación aproximada de 1a potencia de la nuestra avalorar coloca a1 ensayo cerca de esta condición opti-a y permiteampliar 1a variación de transmisión producida por el solvente einque el nieto afecte aignitivnnente el ensayo.­

Aunadmitiendo un error en 1a potencia del deaoonoeidedel 50%1a cantidad del aolvente que interferir‘ en el ensayo que­dará reducida a 1a mitad. Por ello 1a limitación de transmisión ggro la elección de los solvontee de acuerdo a en interferencia abaglata será estimada en un 4%. 1a que por lo que antecede, en las pgcree condiciones ooeeionar‘ en el ensayo una interferencia relativade un 2%(correspondiente a un 5.81 de variación de potencia).

variaciones de crecimiangDe los datos obtenidos en el ensayo resulta ol siguientc

-62­

cuadro:

fi de Transmision

SOHEITE ‘H x. x, A. xz A2 x3 A3,ïxúgggquZQÉQ. xl-xn Efijfi!z_¿2:¿gLngz_gglv. x3rxn,

matan 45.9 47.2 1,3 48,1. 2,2 51,0 5.1LPl'opilcnglicol 45.9 47.2 1.3 48,7 2,8 51.4 9.5

tmenguooi 45.9 48.3 2.4 49.9 4.o 51.7 5,8omnidn 45.9 49.4 3.5 50,2 4,3 59.5 13.6Dioxnno 45.9 49,1 3.2 5391 792 6004 14”Alumni!!!) 45.9 68.3 22.9 77.2 31.3 81.4 35.5Piridina 45,9 69,1 23.2 78.5 32.6 80.5 34.6

¡GTA!No se tuvieron en cuenta laa variaciones obtonidaa con conce;tracionea superiores al 2%por resultar francamente interro­rentes.­

Isoasolventes elegido. y la. concentraciones finales máx;CONC SION

las a que los mismospueden usaran

Solvento Cono. final máxima

Alcohol metílicoPropilenglicol .E'bilenglicolFormamidaDioxano

-63­

d) DETERMINACION .123:¿LA CDNCENTRACIONQE; ANTIBIOTQCD á QEILIZAI fl

LOS ENSAYOS

OBJETO

Determinarsi dentro de las limitaciones establecidas en

los ensayos anteriores, es posible obtener una concentración de agtibiótico conveniente, para la realización del ensayo.­

ZQEQAMENTQ

COnsiderando;

l) Concentraciónprimaria de antibiótico en el soltente I 4000 u/nl(de acuerdo al apartado b) y

2) Concentración final máximano interferente de los solventes enel ensayo = 0.5% (de acuerdo al apartado o),

1a cantidad mínimade antibiótico por nl a utilizar en la determi­nación debera ser de 20 unidades (0.51 de 4000).

El presente ensayo consiste en medir el grado de creci-—niento del germen enfrentado con concentraciones de 0 a 20 I/hl denistatina para determinar cual de ellas resulta másconveniente.­

IÉQHIQA

l) Pesar 25 e 50 a5 (;_O,l mg) de antibiótico por duplicado.2) Disolver en la cantidad necesaria de alcohol ndtilico para obtg

ner una concentración de 4000 u/nl.3) ¿gitar durante 30 minutos en máquinaagitadora.4) Diluir cada una de las soluciones e una concentración de 200 u/hl

con agua destilada estéril.5) Pipetoar por duplicado cada una de las diluciones obtenidas en

tubos estériles de lB X 150 un con tape de aluminio las siguiqg

6)

7)

V

v9

10)

11)

12U

13)

tec cantidades!0.o - 0.1- 0.2- 0.3- o.+—0.5- 0.6- 0.7- 0.8- 0,9 y 1.o ni.Couplctar n 1 m1. el contenido dc cada tubo con agua destiladacstéril.Extraer, ostérilmento 100 ¡1 del medio do ensayo para calibra­ción del fotocolcrimetro.

Inocular 01 mediorestante al 6%con cl cultivo líquido dc ngcharomyceccercvisiae.Fraccionar, cuidando las condiciones dc esterilidad, 9 m1delmedio ensayo inoculado en cada tubo utilizando máquina pipetegdora. En esta forma las concentraciones de nistatina en cada gno dc ¡lloc serán:o. 2- 4- 6- 8- 10- 12- 14- 16- 18 y 20 u/hi.Inoubar los tubos en baño tornostatizado a 37°C durante 3 ho­ran.Agregar a cado tubo 0,5 ¡1 dc una solución dc formal 1:3 y ng;tar vigorosanento.Mcdir cl f de transmisión do cada ensayo con ol fotocoloríno-—tro Lunctron (calibrado 100%:0div.¡ 10%dc variaciónlIS div.)Calcular los incremento: (A) obtenidos antro la transmisio­nos originadas cun cada concentración de antibiótico y sin 61.

O

solventesMetanol

ENSAYOS.

mmsmacmn ¿A CONCENTRACIONDE .ANTIBIOTICO¿4,UTILIZAR

¡nea-ara:nietaunaenpolvo,pot2600¡1/114

Prap.delInóculo

CantdeCant.deCultivo MdeEan“11a.Agregado

(ml)ml)

delaaSolucione­

SolventeAeregaddp/ob-t.43oon/mJJ

1mm

lPrep. [iCant.peuada

(me)

I31,2

DilJnAgua det.p/obt. 200n/ml

20,31/20

700

18,5"

El! ze.

45­

-66—

Bosgltadoa Obtenidos:

Cant. UnidadesAgregada de Nistg fi de Transmisión801.Ant¿ tina Iden+ L [5biética por mLen

(ml) 108mboa I II I II ¡odia 11"!)0,5. ¡90.8 ¡e0,7 x70,5 12 X6 79,0 79.1 78.9 78.5 78.9 36,90,5 10 x5 78,0 77,9 77,9 77,4 77.8 35.80.48 R40,3 6 X3 739° 31.70,2 4 x2 59,9 70.0 69.9 69.9 69.9 27.9

o‘o o zo 42.5 41.6 42.0 42,1 42.0 I I

CONCIQ SIC 1115.2

Admitiendo comoincremento mínimo total de transmisión

para el ensayos 35,0% 1a concentración do ln solución de antibiót}oo a utilizar podrá esta: comprandidaentre 100 y 200 n/nl (conertración máximaque enfrentará al germen de ensayo: 10 y 20 n/Ilrespectivamente).

e) ESTABILIDADDE ¿A NISTATINAy; ¿gg SOLVENTES¿[q grmmzmns

Qfiiïgl_ Elegir el solvente que produzca le menor varinoi6n en In

actividad biológica del antibiótico durante el mayortiempo posiblecon lo que se logrurá! 1) Eliminar del método los errores que seproducirían por la variación de la potencia del antibiótico duranteel tiempo de ensayo y 2) Usar 1a solución standard en más de un q!nayo con las consiguientes ventajas de comparación de datos y eco­nomia.­

FUNDAMENTO

Compararla actividad biológica del antibiótico entre unsolución recibntumente preparada y otra conservada a 5°c duranteun tiempo determinado, para cada uno de loa solventes consideradosno interferentea.­

QEQNICA

A-Prepirición de la mgcstrg1) Pasar 25 a so mg (.t 0,1 mg) de antibiótico por duplicado.2) Disolver en cada uno de los solventes e ensayar para obtener

una concentración de 4000 u/nl. (Dílaa’o’n: fics)Asitar durante 30 minutos en máquina agitadora.V3

4) Conservar estao soluciones a É 5° C durante el tiempo estabigoido en los distintos ensayos.

5) El día a efectuar 1a deterninaoión preparar por duplicado ao­lución reciente procedimiento en la forma indicada en l),2)33).

6 Diluir las soluciones recientes y las conservadas n una con­V

ZÉÉ -68—

cent-ración de 200 u/nl con agua destilada estéril. (Dílva'oívrfio)7),?1petcar por cuatriplioado, cuidando las condiciones dc onto­

rilidad, cn tubos cct‘riloc de 18 X150 II con tapa dc ¿luli­nic, las siguientes cantidades dc catas solucionen: 0.0- 0,10,2- 0.3- 0.4- 0.5- 0,6- 0,7. 0.8- 0,9 y 1,0 ¡1.

B-¿gggplación y fraccionamiento del;ggdio de cuna1) Extraer, octárilmcnte, 100 m1 del medio de ensayo para ser u­

sado en la calibración del fotocolorímetro.

2) Inooular al medio restante al 6%con c1 cultivo líquido de Segcharomyccs cereviciae.

3) Fraccionar, cuidando las condiciones de esterilidad, 9 nl delmedio de oncayc inoculado en cada tubo utilizando níquinn pingtoadorl.

c-Incgbación del onagloColocar los tubos en el baño termostatizado n 37° O. durante 3ng1'83.

IbInnctivaciógAgregar a cada tubo, 0.5 ml de una lolución dc formal 1a 3 y 351tor vigoroaamcnte.

E-LegturaMedir ol porcentaje de transminión de cada ensayo con cl fotoco­lorímetro Lumetron (calibrado. 100%!0 div.¡ 10%dc variacion:15 div.).

P-Maroar dichos Valores cn un eiatoma do coordenadas utilizando p;pel milinotrado aritmética considerando en crdcnddaa los porcen­tajcc de transmisión y en nbeiana las cantidades de solución doantibiótico agregadasy trazar las curvas por ellos definidas.

¡naa pernitirán la visualización de la posible variación do lapotencia del antibiótico por efecto de an conservación en cadaeolventeo

G-CQQQQgo 1a ¡ciencia de las aglgoionoo conservadas on gada og;­lento.1) Proaodiar laa 1ectaraa de porcentajes de transmisión oorroopog

dientes a loa tubo- con 0.2- 0.3- y 0,4 nl de la viola.2)2) Leer en la curva obtenida con 1a colación reciente 1a cantidad

de antibiótico correspondiente a cada pronodio hallado para1a solución conservada.

3) Determinar con cada uno de estos valoren la cantidad niatati­na en u/nl aplicando la aigniento fórmula:

¡I

leot.en gráficoI factor dil. - n uno/¡1n’ nl de col. conomgreg. ‘

4) Eliminar-loa Valores aberranteo. Pro-odiar loa valoren restanteo y desechar loa «¡noee separen en más de]. 1071do]. valorpromedio. l

S) Obtener el 'pronedio final.ll-Deteminar e]. fi de variación en cada cano.

X Para +odo= €5+03 cnñd)‘°5 la ¿[Odón Final semi: %3(%"5'/¿°)

mas.70.W

¡dv-¡tmm mmm El!mmm“W lo1- mw M del1116:1111

l canaria-gmmmmu WhMfiofi a. . r to {diod. ná. 'm y I I 2331173561)mg?“ m (nl) «¡3,15011

M I 15,2 . 16,8_ ¡la1 n 27.8 ‘ 18,1. "

¡1- . . m 721' 29.2 19.0 "m _ yn a» 15,8 "

-71.Reenltadgg Obtenidos a

‘Cmtida f de Transmisión“una Solución Reciento Solución conservada 1 dia

(nl) I II #1 II rom. I II I II Prom.

1.o 76.3 75.6 75.0 75.3 75.5 70.! 270.0- 69.3' 69.6 69.80.o 74.7 74.3 13.8 74.0 74,2 68.3 67.7 68.8 68,3 68,20.a 72,1 72,7 72.3 11,1 72,3 66,8 66.8 68.0 67.5 67.20.1 72.5 71.1 71.3 71.0 71.6 65.7 66.5 66.5 66.0 66,1

0.6 69.7 70.3 70.3 v0.5 ho.2 63.9 64.3 64.5 64.3 64.20.5 944á'sa.o 67,7 67.7 7.a 60.3 61,3 60,9 59.8 60.50.4 66.1 64.8 65.0 64.3 5.2 53.5 54.3 56,3 55.9 55.10.3 60.3 59,3 56.7 57.7 8.5 44.3 44.3 46.3 46.3 45.80.2 48.1 48.5 46.7 46.1 7.5 38.0 38.5 37.7 38.8 38.20,1 40,7 39.3 38.0 38,3 9.2 34.5 34.0 34.0 35.3 34.4

0.o 31,7 31.7 32.0 32.8 32.1 30.7 32.3 32.6 |31.5 31.8

Variación de la Potencia deen

gráfico (n/il)

¡MvWwiz.«h

-73­

ESTABILQQ

[numMinimum 26mm.Preparaeióndel 116mm

¡a“m ma“ 5- "‘ “‘“"" 323;?m ¡mapuch-Aand-u- un! qu;1adapanel: “Aeris-b(la) meno J (11;

W‘ I 30.2 19.6 1fish1

“‘ n 29,3 la,» ' Jmas 7a

.1 ¡6.9 11,1. "

Ind-lb

n a!» 1.9.1 ' ü

Reggina“ Obtengdou-74­

W s u muda"2:3" 801mbhace. muakm 1 un

x n x n run. ‘ r n z n nu.

1,0 11.5 71.5 19.5 71.5 71.7 63.5 ¿Mi “.0 63.5 6M

0.9 me 13.6 71.5 11,5 70.9 62,0 60.0 62.2 63.0 62.5

0,8 7a,. 70,0 11,8 70,5 70,5 61,5 60,0 61,¡ 61,9 61,1

0.1 69.0 69,0 68,: 63,2 63,6 60,5 60.5 60,0 60,9 60,5

0.6 67.0 67.0 67.5 67.6 67,! 57.7 57.3 57.9 58.2 57.!

0.5 63.0 63,0 6h) 65,0 63.3 52.6 Si) 58.7 52.3 58.!

o» 58.6 57.5 55.1 99,6 57.8 ¡5.6 ¡5,2 ¡6.o ¡5.6 ¡5.6

0,3 50,0 ¡9,6 ¡7.o ¡9.5 l¡9.o ¡0,6 ¡9.o ¡1.¡ ¡0,0 ¡un

9,: ¡3,6 ¡2,6 ¡1,9 ¡1,5 ¡2,2 36,0 36,¡ 36,: 37,0 36,6

0,1 37.0 37.0 35.0 31.0 36.5 32.0 33.0 32.6 .h 32.3

-o,o 29.5 ¡6,1 29,0 30.1 29,3 39.0 9.013,1 :0 En

W‘W hemunm. M M m

Lwash (fé) (ul-4) (v/II) (i)o,¡ 5°,: ¡su

0.3 35.3 2350 m ¡2,0

0,: 21,0 noo

-7s­

ogsmncgogm ENSAYOE s (Corresponde.¡»8. 86)

Si bien los resultados obtenidos con lo. nolvvntoo proa;langlicol y otilongltool son igualncntq satisfactorios. su ¡lo ro­snlta poco práctico ¿debido a la viscosidad do los ¡18.05.­

Para trntar de eliminar esta inconvontonto. Cl la próxi­Il determinación, ¡o onsaylrí a uno de 0119- en ¡ancla con notanolm­

EESAEILIQAB

mas un 3

posada(me)

33.3 21.7

31.3 20.3

29.9 19.4

oa ado b an 8!

Can't. í de TransmieiágMr°g' Sol. reciente Sol. coa-¿mmm5 digi­

ml) i II I II ¿om I 11 I ¿I PrggH1.0 79.6 79.0|80a0 0.4 79.7 Emili-M3 Wifi 76.0 74.0099 79.0 79.0 79.2 9.2 79.1 73.0 71.8 75,0 75.0 73.70.8 78.0 73.0 73.0 {3.3 73.0 72.5 71.7 72.7 73,5 72"

0.7 77.0 L77.377.0 71.3 bom 72.7 72.9 11.30.6 75.5 75.5 74.8 67.0 9.4 71.5 70.6 ¡9"0.5 74.0 bm 74.0 65.5 ¡.5 9.o 67.6 66.60.4 L12.5h2.5 71.3 60,0 3.o 5.o 63,6 62,9

0.3 9.9 9.5 69.9 5x6 5.o '.o 54.5 57.30.2 3.5 .6 64.6 51.6 1.6 1.3 52.3 51,70.1 .0 0.a 49.5 41,0 1.o 0,4 43.0 41.20.0 33.3 33,0 33.7 37.5 .0 9.0 33,6 38.2

Variación do 1.a Potencia de Sol. Cana. 5 diasSantidad. Lectura en Potencia Potencia Promedio PérdidaPgregada Gráfico dal) ulnl fi(m1) (MMM

0.4 37.5 18800.3 30.0 aooo 2030 49,20.2 22,0 2200

3.79- {WETHESGLICOL mm msnm“ ENPOLVO;Mmm u/m

r Reggaetóndella Soluciones delInkquLCantidad solvením-g n11ch fent.“ lh- canas cu;“¡Mmmm gadopnrnob-enkguadee “¡nativo q.(ng) me: hoooumum. p/oïísin

¿“l

ELz 29,8 ' 19.3 1/20 '

n 29,7 19,3 z un {La

r 30.7 l 19.9 ' m u: 3

n 32,8 21.3 "

Beaultadga thenidgsn

Cantidad1 it de TransmisiónAgrogadal

(m1) 80;, rflgte ahogger'mda 2 <ng_g__I L1: 1 II Prom. I II I II Prom.

1.0 79. 79.9 79.0 79.2 79.5 79.0 80.0 30.0 79.9 79.7

2.9 79. 73.0 79,3 79.379"? 79.0 79,1 79.7 79.5 79.3.8 79. 92.4 78.6 79.1 78.9 18.9 79,0 79.4 78.5 78.90,7 78, 78.0 17,6 78.0 77,9 73.0 77,6 78,1 78,3 73,0096 77. 77.2 77.6 77.5 77.3 17,0 76,8 77,0 77.6 77,10.5 75. 75,9 75,5 75.9 75.9 75.2 75,8 75.4 76.3 75.90.4 75. 74,2 75.0 75.1 74.8 73.9 74.3 74,9 74.9 74.50.3 71. 71,5 72.0 72,2 71.3 72.5 71.6 72.0 71.6 71.90.2 — 67,8 68,0 68,6 67.8 66.8 — 67,6 67,2 66,90,1 53. 53.5 55.0 55.0 54.0 52.3 54.5 52.4 54.5 53.4

0.o 33.9 37.5 38.6 33.3 38.0 38.1 39.3 33.0 38.3

Variación de la Potencia de Solución Conacrvada 5 ciasCantidad Lectura en Potencia Potencia PérdidaAh: réf ico u/mlz Promedio f

(mi) {yidadeel n/ml0.4» 79.5 3970

0,3 60.0 4000 3940 1.50.2 38.5 3850

-82­

., ESTABILIDAD

M122

361.1!thFERROL mm: “¡him m Domo-roma m n/nz.

hopqracián de lu sanciones Prepa-¿ción m Itñculq'

Cmudnd‘lMvenh mm Bmfldiíh aut. dempuedaAmadomm. Idioülgthough­(m) plate“: n/ob' wo HaedoMMM“LJLH

Con. 22,8urna”. I 35,0 1/3 h ¡k d5 ¿{a

n 3'52 22,3 ' mm 491

I 33,2 21:5 "¡calmo w n 321,3 "

Reeg;jadga Obtenidoat

-83­

Cantidad f d. TransmisiónAgregada Sol. reciente Sol.Conaervada 5 días

("1) I II I II Proa. I II I II Prom.

1.o 6,6 80.6 80,6leo,5 80,6 80,5 80.5 80.6 0.2|80.40.9 79.6 79.9 80.0 79.7 79.3 79.5 79.5 79.8 79.6 79.60.a 79.0 79.0 79.5 79.1 79.1 79.3 79.0 79.5 79.2 79.30.7 58.9 78.3 78,6 78.5 78.6 78.3 78.0 78.3 78.5 78.40.6 fia,o 77.6 77.6 77.7 77.7 77.5 77.6 77.5 - 77.50.5 76.8 76.8 76.8 76.7 76.8' 76.4 76.3 76.6 - 76.40.4 75.5 75.5 75.4 75.5 75.5 74.6 74.3 74.8 75.0 14.70.3 73.9 73.4 72.6 W3.273.3 12.1 71.5 73.2 ¿2.o 72,2

0,2 59.559,5 69.6 ¡69.4 69,5 68.4 ¿8.5 fióBJ 68.5 68,50.1 56.1 58.1 61,4 58.4 58.5 53.0 52.4 54.6 2.5 53,10.o 37.9 38.6 38.5 9.o 38.2 38.7 38.3 38.0 8.2 33,3

Variación de la Potencia de Solución Cnnservadn 5 días

Cangidzs LEOÏÉÏ: en Potonoia ggfogfga PérdidaASÏmÏÏ (¿ÏdaggaL "{"L "'1- "

0.4 72.5 3630*0.3 54.0 3600 3680 3.o0,2 38.0 3800

+35­

ESTABIle

mazo N1 Q;

aah-nmmmm m: ¡num mmw-Pot.esoou/ug.W161: u 1a“1mm- más m Inóculo

cunas: BolventeFnucia’nen ¡íth í T.panda Agregado Manaus. llodiodelg cülo lfq. A­

‘W‘ (a) manc- pfobtener uuu. .u/n anou/nl (al) nl)111)

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Obser vaciones: Ver Pag 88.

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QQEA;1) Los resultados obtenidos con formanida contradicen 1o o;preaado on el libro "AzuayIcthodn of Antibotioa' de Grg_

ve D. y gandall w.. pág. 116, donde ae considera que unasolución de 1000a/il del antibiótico en el aotvcnte eocetable, lantenida a É 5°c,durante 3 días.

2) E1 hecho de que 1a solución Standard pueda utilizarsedurant. 3 dias resulta sumamenteconveniente si ne tic­ne en cuenta ¡no cn los métodos on uso ¡e cita ln nec;

-110;

nidad do exponnr ol ontibtátioo 01 ¡{nino tio-po posiblefront. al solvente aunado (propano).70! on 61 do ph­ou y ¡.1 anota torna-¡idaen .1 mbmnótruo aaamo­llado por P.D.A.)o­

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o) Doacuerdo ¡1 estudio del porcentajo do p‘rdida do potencia do

bV

la ooluotón ¡took del antibiotioo lo. oolventoo nio oonvonicntonresultan nor!rnonnmcucoz.y ¡Ezcu 501a. mormcncomruou Doma.o qu. la viscosidad del propilongliool 1o hace poco práctico.ol solvente de elección oo:¡32cm50%dempmcucomuonSo establece comotiempo máximodo conservación do la solucionIto’k (¿oooVal): 3 diu.

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1>LL_MR0DEQWQEBWEHiLW mg:­IENTE ELEGIID w

Asegurarque la'nlstatina en las condiciones dofinidas ndisuelve totallonto, oonfirnando lo apuntado on ol 1ta b. do quoha partículas chau-md“ en suspensl‘n corresponden.¡anual noactivo.­

MMTratar de disolver la droga a la concentración do 4000

l/IJ. agttindola durant. 30y 90 unha y dotar-1m la potenciado onda una do ha solucion“ aplicando ol ¡{todo de rutina.­m1) rozar. por duplicado. 25 a 501g (3 0,1 l‘) de Mat-tina.­2) Agregarla cantidad necesaria do inch SOSInhml-Propllongu

col obtuer unaoonoontraol‘ndo4000¡Il-l.­3) ¡altar “tu ¡upon-tono-Jo y 90llanto- respectivas“. on4

quina agitador..­4) num ln ¡tam a la oonoontrnclónde mayo instantanea“

despu‘ndo ser rotuhm do asunción.­9) Valorar 1a actividad do “tu. solucion” ningún.1 ¿todo do at­

fuián onagar utilizando discos absorben“.­

-112­

comnggsoumnmgumxmcoggsowmnmMr].Bolvonte:meu 50%mmmcomr. mmzm'r.» polvo.pot:2600u/Ïn

mmm de 1a mmm

Solución Posada Cantidad. de solvente(ns) p/obtener nooo u/ml

(al)

1 26,7 18,7

2 30,1 19,6I

Resultados Obtenidos:

3810-3660.

Tiempode Resútadosiurclales Obtenido ¡“tedioSoluciü Aptacion con'el métodode dimisión en nm

o (minutos) fit (u/mll (u/nl)

1 30 #510 - #110 o ¡1020

3600 - 352° - 3660 3965

uno - hllo.

3920 - 3920 - 3360

2 9° 3730 - 3360 - 3610 3670

.113.

mmggmmmwgmrmcoggmmmmEngel!!!- 2

Bolvsntezmcu50%mmm Muestrszm'rmnpolvo-pot.2600u/mmm d. ls MUESTRA

Solución Palad- Cuuu a. lolvents(le) p/obtener nooou/¡n

(al)

1 32, 5 21,1

. 2 29,1 18,9

Resultados Obtenidos:

, Tingo de ResultadosParciales Obt. trueno“mi” mación cons1nétododedifusión nm

0‘Mmtoe) en agar (u/nl) (ll/¡1)

un o 38m o ¡mo ’

1 30 3560 «obom - han han

kono - kono

‘31’o“a Cm2 90 3800- lanzo- han han

kg”DHamnfl'13am mami ya

30 nooo

9o 39'00

QUEQConsiderandoles experiencias anteriores. detsrninsr las

oondioionos óptimas de ensayo (concentración de inóculo y tiempo deincubación) para soluciones de antibiótico de 100 y 200 ulnl.

EQEDÉMENTO

Determinar el grado de oreoiniento del gornen de ensayoen tubos sin antibiótico y con 100 y 200 unidades del mismo. Variqndo 1a concentración del inóculo y los tiempos de incubación. Gonestos valores obtener el incremento correspondiente n-osde uns delas condiciones de ensayo y elegir 1a más propicie.­

:mNICA

1) Pesar 25 e 50 ng (;_O,1 ng) do entibi6tioo por duplicado.­2) Disolvor en la cantidad necesaria de nosols 50%de propilengli­

ool-nstanol para obtener uns concentración de 4000u/¡l.­J) Agiter durante JO ninutoe en máquinangitedors.­4) Diluir ceda uns de les solucionestn 100 y 200 ¡lui oon ¡gun dq!

tilsds ostárilo­5) Pipetsar en 16 tubos estériles de 18 X 150 In. con tope de slug;

nio. 1 ¡1 de onda uns de las dos diluciones correspondientes eoads concentración.­

6) Distribuir los tubos en 9 grupos oadn uno de los ounlee entar‘tornado de le nsnern que nuestra el esquema.

1)

8 V

9)

10)

11)

13)

14)

antibiótico o

“¡Ill 0

u/IIJ.

Identificar e 3 erlonmeyern conteniendo cada uno 600 ¡1 de meatde ensayo estéril con los números 3, 6 y 8 respectivamente.­Retirar de uno do ellos 100 al para la posterior.cclibrcción delfotocolorinetroo­Inocular las 3 fraccionoe con cenccntrccionce de 3. 6 y 8! delcultivo líquido del germen.­Do cada una de estao agregar 9 m1en'los tubos correspondientese 3 de los grupos esquematizadoc dejando lo que recto do ella.c 5°C comotestigo sin incubar.- Irar-ar 3 conjunto! de tubos (A, n y c) constituido. con 1 grupode cada una de las treo conoontrocioneao- iIncubar el conjunto A: 2} horas, el la 3 horas y el C: 3} horas.cn baño tormoatatizcdo a 37°C.­Loer en el fotocolorí-otro Lumotrcn. (calibrado 100i: 0 div.¡10 f de Variación: 15 div.), los fi do transmisión de cada ensayo.Pronodicr los valores correspondientes c cada condición de cnc;,0 e­

15) Mercat Ice pro-edic- obtenidos pare cada tiempo de incubaciónenscycdo en un eintena de coordenadas cobre papel lllinetrado.considerando en ordenada í de transmisión y en ebeiece oentidg

dosdochinita. m ¡aroom _u) ¡mai no condicion“¡la miniatura

oll8­

WM ¡BIMCNICIONESWAS D!MAYO— _ .——_-—.—

Resultados Obtenidos;

5‘91L‘91‘916‘919‘91t‘oe9‘099‘09t‘099‘090‘999‘699‘999‘19:‘19¡n"m",,¡’9‘119‘119‘I1.0‘119‘316‘11.9‘11.9‘113611,9‘112‘999‘999‘990‘99¿‘99.00:19(0)9‘993‘199‘999‘190‘999‘31k1).t‘31,9‘319‘91q‘t99‘I93‘t99‘I91‘19tu/rloot/a{6

6‘93b‘ge9‘93!0‘93¡0‘936‘12Fu: 0‘350‘360‘369‘990‘992‘999‘999‘19‘mm

1‘310‘31.9‘91.9‘310‘31.6‘91¡9‘91¿‘910‘91.0‘919‘999‘9919‘99I‘qg9‘99IIK/nooa/o(a)9‘196‘199-‘19‘19P9‘199‘319‘310‘91.9‘31.9‘616‘399‘39-“(‘999‘39tI/noot/oí

1‘630‘069‘9‘630‘092‘920‘9':0‘95E‘9íU9‘9EE‘r99‘t99‘090‘199‘39wmun

9‘119‘119‘I19‘110‘319‘910‘910‘119‘91‘t‘u.[‘99{‘990‘991‘999‘99.003/:(v)0‘690‘690‘696‘690‘690‘919‘910‘910‘91.I11‘9m9‘999‘690‘990‘999‘39Ill/mot/a{a

0‘090‘923‘969‘99t‘eE0‘999‘290‘590‘99¿‘996‘t90‘199‘1910‘192‘39‘Wm

oauyv-uauvrrï_Zwnznzmnznzrunznzn,m”m

iei91»E‘_

om«una

Unamops

-120—

CDNCLUSIONES

Ia ¡{nina concentración de 111601110y 01 ¡mr ttupo do 1gcabecián neeoaarios para obtener una variación tota). on 01 grado decrecimiento del ensayo do aproximada-ente 35%resultan ser!

CONCENTRACIONDE INOCUID: si

TIEMPODE IICUBACIÜI l 37. Cl 3 horas

Conestos resultados definitivos se confirman las conductanos primarias que fueron determinadas para la realización de los oncayos quo ¡“atendem­

am­

Entnprima parto do].trabajo nrealisá con 1a colaboración del Sr. Angol3.­ran Mao. conun” de u trabajo dotoni""lindo umbiológioo pnra la "¡oración doun antibiótico contra hongos:In Ihtnttn yun aplicación a nacho conteu-actuan". (1';cultad de Quino. y rar-acta. ¡haver-14:4u­otonal de Ia Plata).

.122.

SEGUNDAPfiTE: amonucnspgin DEL¡(2mm g LAECONDICIONESm

EHRMITANfl APLICÁCIÓN PARA ¿A DETERMINAC;U! 2B; VAIDRES BESIWALE!

' m 9151123. '

I-REPROECIBMDQ EE. DALog

OBJE

Determinarsi la variación de los resultados obtenidoscon la aplicación del notado definido (ntilisando la concentraci6nde solución de antibiótico de 100 n/il) esta dentro de los límitesaceptados para este tipo de ensayos.­

M12Obtener por ensayos sucesivos un número conveniente de

datos de la potencia de una nuestra de nistatina y con ellos ca1q¡_lar la variación¡inn registrada.

¿034: Para posibilitar la aplicación del ¡hace sn 1- determinaci6nde cantidades pequeñas del antibi6tioo. coso son en.gencrallos residuos en aliasntcs de este tipo de sustancias, se nt;lisarí la ¡{nina concontracián de nistatina que permita larcalisación del ensaya dentro de las limitaciones sstableci­tu (100dni).­

MSAA. e arao e arWM (3-wow-riporduplicado)l) Pesar 25 a 50 ag (¿_0,l a3) ¡e antibiótico standard.2) Disolver en aesola 50%de propilengliccl-aetanol para obtener

una concentración de 4000 n/hla­

-123­

3) Agitar durante 30 minutos In ¡{quina agitadora. Esta soluciónpodra oonsorvarac durante 3 dias a una temperatura ESs°c.­

3933355 Siagdarg go trabaja

1) El día que ao efectúe la valoración, diluir laa dos aoluoio—­nos ¡took a 100 u/hl con agua destilada oat‘ril.­

2) Pipotaar do cada colación standard obtenida, por triplicadoun tnboa do 18 I 150 II oat‘rilca con tapa do aluminio. lassiguientes cantidades:0.o - 0.1 - 0,2 - 0.3 - 0.4 - 0.9 - 0,1 - 0,9 y 1.o ni.­

B-Pronargogóg go la ¡gangas1) Pesar 25 a 50 ng (:_O,l ng) do la nuestra a valorar, por dn­

plioado.2) Disolver en ¡ancla 50%do propilonglioolpnetanol para obtcner

una concentración aproximada de 4000 u/hl.­3) Agitar durant. JO minutos on náquina agitadorno­4) Diluir a aproximadamente100 n/hl.S) Pipotoar do cada solución obtenida. por triplicado. en tubo­

do 18 X 150 m oatírilea con tapa de aluminio, ha cimiento.cantidadoat001 " 002 ' 093 Y 0.4 ll.­

G- c ao fra c onauiento de nod de ones

1) Extraar, oatárilnento, 100 al del ¡odio de ensayo para lor u­aado on la calibración del fotooolorílotroo­

2) macular .1 mediorestante al si con .1 cultivo liquido do 3-3charonvoaacaroviaiao.­

3) Fraccionar. cuidando las condicional do eatcrilidad 9 ll dal

.124.

ledic de ensaya inoculado en cada tubo ntiliaando maquina pipgteadorao­

D- c bac e e s

Colocar los tubos en el bano termostatiaado a 31° C durante 3 hs.

LgnagtivaciénAgregar a cada tube 0.5 al de una solución de tor-cl 133 y agitarvigoroeancnte.

Í-Leg‘tgsIedir el porcentaje de transmisión de cada ensayo con el fotoco­lorinetrc Innetrcn (calibrado, 100%:O div. lOf de variaciónzlsdiv.).o

0-Ca c de tene

1) Pronodiar las lecturas de transmisión gara cada cantidad de aglución standard agregada.

2) Iarcar dichos Valores en un sietena de coordenadas utilizandopapel ailiaetradc arita‘tico considerandoen ordenadaslos pc;cientos de transmisión y en abeieas las cantidades de soluciónde standard agregadas.­

3) trazar la curva representativa con los puntos obtenidos.­4) Proaediar las lecturas de los porcientce de transmisión corre‘

pendientes a cada cantidad de la solución de mentre agregada.5) Leer en la cnrva la cantidad de standard correspondiente a o;

de valor promediohallada para la ¡teatra­6) Determinar con cada uno de estos valores la cantidad de nieta

tina en n/Is. aplicando la siguiente fórmulasect en réf c fa r e d lució

n' nl de aol. de muestrammm“. rrl cien/s5.

.125­

7) Eliminarlos valoro- abomntcs. Promediolo. valoro. mts;toa y dos-char los que n ¡cpu-en en ¡fis de]. 101€del valor mM4100“

8) Oman 01 pronodiofinal.­

E-Dotmtmro].porcientoa. variación antrolos valor“ o!tenido-.­

m2.;

nep. del Standard Pnep.de 1: nuestra i del InóculoCant. Salvo! Jn v0! .- . nn . ‘lesa- te Ip- ñesal te A-o Mus D110- Cultivo "‘--_

P1 da gres. 001:. IS d. . Int. ción 80 ¡003 11g. W(-3.) ¡V5000 (IB) /m «tay Pin-1vo 'u/nl 4 A (ll) (¡1)

(n11 m1) (

I 31.5 20,8 1/¡0 x 28,6 18,6 1/80 L/zó 1000 60

n 32,3 a» ' n 30,5 19,8 " "

mw obama:

srAnnann

Conti“ S F MisiónEn.) I n I n I n nin-01o1,0 82,5 82,0 83,0 83,1 83,2 82,9 82,8

0,9 82,0 81,9 82,0 81,9 82,8 81,8 82,0

0,1 80,2 80,0 80,0 80,0 b,0 19,9 80,0

0.5 73,2 77.2 78.0 73,0 77,3 77,3 77,6

o» 75.1 7h, 78.9 75.5 73,5 78,9 78,9

0.3 73.3 70.0 70.9 69,7 69.0 59.9 70,0

0,0 60,8 60,2 61,2 59,1 60,2 60,5 60,8

0,1 503° b9:5 “,5 ¡03,5 “9,8 .9), ‘90,

0,0 81,6 80,0 bm u,5 81,3 81,8 81,5

.m­

Cantidad ‘L de him-misión _I.ect.onvreunen¡pesada fi Guru u/n‘{al} I II I II I II Mo

o,» 7m 1MB m6 75.0 75,6 m9 me ¡ ¡0,0 asco

0,3 70,0 70.0 ¡9,5 70,3 70.3 63.3 69.7 29.5 2510

o)! 1,5 üya“,5 “,5 61,. ag,0,1 .5 k9» 1.9.5 59,1 ¡9.5 ¡8,7 ¡9,3 10,0 aseo

.Prauüo 81de¿tuM1

2535 ü

-129.

mm H32

l’l'ep- del Standard Preparación de 1a Magma pm. del InóculqCant. Solveg Dil.en. Cant. Solveg ¡911.000 10012.40 Cant. depesa- te A- Agus pes- te A- Agua lu Medio Cultivo

1|: de pag. aut. u: da. grua. deat. ciáï le lung líq.(ng) ¡VM-000estéril (u) p/qnl. estéril nl).ya (ll)

u/nl 1/190 mts/Il p/lowfill (-1)“¿ImI 33,8 22.5 W 1 30,1 19,5 1/100 1/26 1000 60

II 35,0 23,1 ' II 29,7 19A ' '

Buultadon Obtenidos;

STANDARD

muda a; DEmmmbancada

(¿1) I II I II II Prandi»F1,0 82,2 81,8 81,7 81,0 81,8 82,0 81,6

0,9 81,2 81,2 81,2 81,0 81,5 81,0 81,1

0.7 78,6 78,9 79.9 73.3 79.0 79,0 78.8

0.5 76.1 76.5 76.1 76,0 75.7 75.9 16,0

0,8 73,9 73,5 73.6 me 73,5 73,8 73,8

9,3 70,0 “,5 69,2 69:2 69,8 69:3 69,1

0,2 59.3 59,3 53,5 53,5 59:2 59,1 59:0

0,1 13,0 ¡mo ¡16,5 ¡17.2 ¡mo ¡7,0 WA

0,0 ¡10,0 ¡»0,5 h0,6 81,0 h0,6 80,8 l¡0,5

.130.

I u n a r n A

Cantidad 1 a. mmm het.“ PotenciaGuru u/ng

im.) I II I II I n Fran-dio

0,1. 1m 7MB 73.2 13,2 7m 73.2 73.7 39,5 2560

0,3 69.7 69,3 60,0 69.1 63.0 68.2 69.2 30,0 8500

.32 59,8 &,a 59,5 “1° 57,8 59" “,5 m0.1 ha» ¡6,5 ¡8.5 km 37.1 56.0 km ¡»,5 2650

WW‘Prcnediou

2615

ekifiaáïï.Esfiiïáfi.‘«fl.79€?“Eee,

w443mmm»

«1aunin?É ,si,¿af

,z¿mi?

432­

lnsgo H3 3

Prep. pel suman mp; de 1.0.Muestra . de]. InóculoCant. Eoler ELen C2113. Sol-¡ogEÏIABOII “Cant.de aut. de

B3 pesa.- te Ap- Agua peen- te A-o Agua medio Cultivoda arca. dest. B3 da srcg. dest. Dilu- de ¡una 11g. Agrq(ns- p/WO est-p/ (nz) p/m estop/ ción yo

u/ml loan/ü l¿occufit‘ m1 nun (-1) (al)(11) ¿EL

I 29,5 19.5 1/ko I 28,1 18,3 1/00 1/26 1000 60

II 31,0 20,6 ' n 31,8 3,7 ' '

Resultado. Obtenidos:

arAnnAnn

Cantidad. * a. “Wi-'16“¡crew

(m1 I II I II I II medio1,0 81,9 81,5 80,8 81,2 81,7 81,6 81,0

0,9 80,6 80,6 81,2 81,2 81,2 80,8 80,9

0,7 30,2 30,0 79,9 79,0 79.3 30,0 79,7

.15 77,2 76's “Ia 7792 ",1 77,.o» 76,6 76,0 75.5 15,3 m9 78.7 75.5

0.3 73.0 71.3 72,3 72.9 71,0 11,0 71,9

0,2 55.0 03.9 611,0 65.0 53.1 63.3 63,9

0,1 53,2 52,0 52,0 53.11 50,8 52,0 52,:

0,0 ¡6,0 ¡6p 115,9 “1.8 l¡5.5 ¡15,1 ¡5,5

433­

IUIB‘TIAsztifiad 1 dc Maga LennonPotenciaA6383“ 1 n I n I n Promedio m. u/mc

0,! 77,9 76,9 763 16A 76,3 76,3 76.7 km 2km

0,“ 7*,3 76.2 76,0 75.5 75,9 73.9 75.1 39,0 25'00

0,3 71,6 72.0 72,5 72,5 71.3 71.3 71.9 30,0 2600

0,2 65,0 63,0 53,5 6155 651 6b,o 6M: 20,2 2630

u: n:deanto­2560 2k

30,5

30,1

axe

19,9

mo

Resultados Chi-caidos:

III ,5

srnnrannGamma, 5 de human

ul) r II I n I n Pmdio

1,0 77,5 76,5 76,2 76,8 76,5 77,0 76.8

0.9 76,0 76,5 75,5 75,9 75,3 76,5 75,0

0,7 75,0 73,5 79,7 73:5 72,6 7*,0 73,5

0.5 70,3 71,3 69,5 69,8 69.1 70,2 70,1

o» 69,0 68,8 67,3 67,3 67.3 67,5 67.8

o, 3 63,0 63,1. 61,1. 61,0 63.2 60,0 62,0

0.2 53.5 52,1 51,9 52.5 51,5 52,0 52,6

0,1 lol»,6 ¡8,5 53,5 um w. #334 ¡»3,8

0,0 363 37.1 36,7 36.7 39,0 37.6 37.!

.136.

MUESTRA

Cantidad 17 ¿o Tmmisión ¿ect .en 1’otencilAgregada. Curva. u/rgml I II I n I n

0,5 70,5 70,0 71,6 69.7 69,7 10,5 70.3 51,0 2550

0,3; 68,0 69,1 68,0 67,2 66,8 68,1 67,8 ¡0,0 2600

0,3 6k,2 62,0 61,8 59,1; 60,0 62,5, 61,6 29,6 2560

0,2 53,0 51,5 53,6 53,5 52.9 20,2 aóao

PotenciaPranedio ¡1/5

510 22

N360th

Mx W.34M: an , ‘

pyan:

4 Ryvümhtum. ,

.1».Ens ‘ n!

Prep. de Gundam Prep. de la. r-hieatra .de Inóculo

Cunt. Solveg ñïÍJon Tñant. 161x12 11.661: an . [Em"t'.'“pesan te a- 1-312. pcaa- te a.»- a D111: medio da Cu];

na. da gres. dust. n: da m. put. c165 dde Ensg tivopj-‘¿OOOest.p/ mg- ust.p Final yo líq.. u/nl oo lOO'u (ll) Agres­ml 111m1

I 26,1 18,6 1/100 I 29,8 19,3 1/350 1/26 loco. 60

II 31,0 20.6 " II 30,5 19.3 ' "

Resultados Obtenidos;

STANDARD

Cantidad_ i de hanmisn'in

W‘ 1 n z n 1 n Eau-nue1.0 77,0 76,8 76,3 77,0 77,0 77,0 76,9

5,9 77,0 m2 76.6 76.7 E‘15,”?_75,7 75,8

___o,1 72,0 75,6 7m 7a,: 7MB "fina 71m

0,5 73,1 72.9 72,1 71,0 71,0 71,0 71,8

o,¡+ 68,6 69,6 68,1 67,1 58,8 68,0 68);

0.3 66,1 65.1 65.3 63.2 93.0 63.2 “.6

0,2 “,1 56,3 5235 5‘160,1 “,6 lo” Hue “no l8,9 ha» “,20,0 36,0 36,0 35.8 37,2 37,7 363 36.5

.139.

IUIIEIA1 W013 het.” launch

‘r n 1 n 1 n han-ua um" V"Lg?0.5 71,6 71,6 71,0 71,0 10,1 71,0 71,1 1.7.6 2m

0,». mo 69,3 68,8 68,3 68,0 66,9 68,6 ¡0,3

0,3 5,7 66,1 60,8 63,1 62,5 62,0 6b,1 30,0

0,2 ,6 50,6 53,2 52.6 53.6 52,9 53,6 19,5 2530

3‘?

Totanle¡rm-dioum. I: a. W

850 ah

4.5].­

EnsaE N3 6

Prep. del Standard Prep. de lo Muestra “¿el Inómno

Cant. ¿DLA- 114m1 Can-b. 5011125 il.con \ ant.de Font.“pesa- greg. Agua. pesa;- tc a» agua lu edio cultivoN3 de p/ït-OOOdust. l: da antes. dani... E16; de Enag líq.

(mg) 11/1211 cst.p,’ mamen. eut.p/ Pinal bro Agre‘.nl 1mm mm lOOu/nl (nl) (m1)

(El)

I 25,1 16,6 1/150 I 31,9 20,6 l/lto 1/26 1000 I 60

II 30,7 20,3 ' II ¡3,0 21,3! ° '

Resultados Gatenibo:

BTAHDARTanti“ í dj Transmisión

u." ‘ . ‘ '

¡7731) z n 'I n I n Praaedio

2,0 79.2 73.3 77,8 73.0 77.3 77.5 78,0

0,9 73,0 77.5 77,3 77,3 71',5 77.5 77,6

0,7 76,: 76,5 76,1 76,0 76,0 76,1 76,1

0.5 75,2 75,7 73,9 no 73,5 73,1 71m

o,“ 73,1 72,5 72,0 72,0 71.9 71.9 72,2

0,3 7o,» 70,0 67,8 68,0 68,0 68,2 68,7

0,2 63,0 63,9 61,3 00,8 60, 3 61,0 61,5

0,1 51.0 51,3 50,0 50,3 5°, 3 51.5 50,8

0,0 “,9 ha,9 ha te; ¡»3,3 me ¿2,6

cunda” i a. transmisión met.» Potencia.W Curva u¡anl I n 1 n s n0.5 73.3 w'flbs. 73.9 73,2 73,5 73.2 73.7 88,5 2530

mi 72.2 72.2 71,9 71.6 11,9 71,9 71,9 39,0 2530

0,3 69,0 69,0 68,1 68,5 68,6 68,0 68,5 29,5 2560

0,2 60,8 61,5 62,2 66,8 60,3 61,0 61,1 19,6 2550

.1“­M¡“p.461IW Duplohlluutn .mznócmlotant. ¡olaaa-¡1.a Cant. 061m2 t.“ aut.“poso- Am. Agua pell- to 0- n ¡odio cultivo

i: 20 ) ¡1m dost./ I: ,20 ) m. est. 0161-:Ilo¡mg líq.n u ¡1 ent.) n {cpu tira 71m1 yo 7 .¡1 mou/¡1 EMA jmo (¡1) En;

(¡1) un.

l 35,6 m3 1/¡0 z 30,5 19,8 1/100 1/06 1000 60

n 26,0 18,5 " n 30,0 19,5 " "

¡”alt-¡00 000mm:

ITAIIAIIwa­

‘ln I n I II I n Mi.1.0 73.5 75.! 73.1 7a,: 10.7 15.7 “(no

0.9 73,3 73,3 73.3 T351 73.9 73.1 73,5

0,7 72,0 71.1 72.3 72.3 71,3 79.5 “,0

0.5 70.1 70,0 70.1 70,1 70.1 70,1 70.0

0,1; 67,0 67,9 67,3 67,8 67,0 68,0 67,5

0,3 62,5 63,1 63,). 63,6 63,0 60,6 60,3

0,2 57,0 56,6 55,6 56,1; 56,6 56,6 56,»

0,1 09,8 ¡8,2 ¡7,0 07,0 ¡7,3 ¡7,0 ¡7,7

0,0 h0,5 ¡0,5 39.5 ¡0,1 “,1 ¡0,0 Mm

IUII'I'RAcantina. j de humisión net... Potencia

FÉÏM‘ z n I TT”?! Prandioemm u/w0,5 70.1 70,1 70,1 69,9 69.9 69,9 70.0 50.0 2500

o); 61,1 67,1 67,1 67,1 67,2 67,0 61,1 39,0 25M

0,3 63,2 63,0 63,0 6m ¿616/ 6k,9 63,6 30,3 asao

0,2 56,6 56,: só,» 56,: M 55,0 56,3 19,5 asno

otcncia N-‘ÍdedatosPromedioya.

2575 22

In

.¡Ïmm‘fiuAuhmamWfiifl3.

4.;

y.

.EN:‘ «Pi:¡.53

¡393 n: a

rm. m SW machine-tn Prepa).InóculoCNE.del"! ¡n . n2- .em . de Unit-.5­:I'" ‘°““1fi. a; y. ¿2.? 22.“.mu fit... Si?”rbd¡Fm (annalu)

1 29,. 19.2 1/1» 1 25,9 ¡6.a un 1/26 nao so

n 32,5 21.5 ' n, 33,1 11.5 " '

¡matado- mot-manu

n 'r A I a A n n

cm S lo hgs%WM z n I II X n Pra-¡dio

1,0 79.1 73,6 73.6 79.1 79.5 79.1 79,1

0.9 78.2 78.2 78.3 78.6 78.6 78,9 76.5

6.7 76.7 76.1 75.5 76.1 76.3 76.9 76,3

0,5 “.1 “.3 7M). 73.5 “.1 73,7 73.!

03 72,0 723 71,9 71.5 71.5 72,0 71.9

0.3 no 68.3 67.3 67.0 66.5 66.5 67.5

0.2 59.5 59» 58,8 58.5 56,6 58,0 53,9

0,1 ¡3,0 ¡8,0 57,5 ¡8,3 ¡7,6 ¡»1,0 ¡7,1

0,0 33.5 30,0 NJ! 33.0 33,5 33.5 33,2

ma.

I u z s r n A

cuna-a. s m Tun-¡1.1611 ¡actúa MencíaAgregada“ cum u/nunl I II I n I II PaladinW _._——

0,5 TMS 7m 1M 7M 75,5 1m 1m l¡9,5 2m

o) 71.6 72,0 71,5 71.5 72.6 72,1 71.9 ¡00,0 260°

0,3 79,0 67.3 67,2 68.0 6m 6m 67.9 30,6 8650

0.2 58.3 59,0 58,5 57,3 59,5 59,9 56,8 19,7 2560

Ñtmcia ¡facinaPromedio 1:15.

2595 ab

4NÏhN‘

-150­

¿rm ggm umgms ommzmg

Ensayo Fotonotn. Potencia Promedio¡E (alma! (un) Ets:1 2600-610-200-2600 asas 2‘

2 2560-2600-2660-2650 2615 24

3 2470-2540-2600-2630 2560 24

4 2650-2600-2560-2620 2610 22

5 2470-2610-2600-2530 2550 24

6 2520-2530-2560-2550 2340 24

7 2600-2540-2630-2540 2575 22

8 2570-2600-2650-2560 2599 24

l .LPotencia final ¡3 do dato.m AI

2580 188WBelli-ados 188 ona-yo. individuales lo. que dieron lugar

I 32 pronodiol parcial.- ano derivan de los datos correspondientesa eau cantidadao soluciónaommm” nun-du. u ameno _con. vnrinciJn ¡‘11nl antro cotos! 4.2 f. Ente valor ost! dentrodo lo ¡113160 para onto tipo do n‘todol (5 ¡1 10*).­

+151­

IÏPWIPARACEOI E 2:3 REEQLTAmS OBTENIIDS _CO_I[a PRESENTEIBTON

Lg; gg; DIFUSIO! _E_N_PLACAS gg _A_G_A_1_z_,_­

OBJETO

Determinarei los valores de le actividad biolágioe de ln¡Inem reenltentee del ensayo de reproduoibilidad de dato- cancun;dan con lo. obtenidos con el ¡{todo de difusión en placas de agarel que se considere cone referencia por ser el de uno comúnen 1aactualidad.­

RESUIEAIDS OBTENIIDS

¡{todo en Discusión Met. difusión encas de ar _

2585 2600

2615 2910

2560 2160

2610 2450

¿2550 2590

2540 2460

2575 2530

2595 2330

‘ 2850

2529

Promedio: 2580 2950

MCQSIONES

Io- resultados obtenidos con el metodoajustado son con­pnrablee e los del nétode de difusión en places de agar.

-152­

sïtmm PARTE: ENSAYOSma APLICACION _D_E_LA NESTATEA mu ¿.5 9311+

BBRVACIONTEMPORARIAgr; ramas _!_gamma:

a) Efcggg ggggcgzgdor cg Agc;ag¡ Tgnafic. Limon g 2135;

92.21).Determinarai ln aplicación dc una ¡clución dc Iistatina

cobro estos clincntcc ticnc algún efecto boniticc cn cu conserva­ción.­

IEEEEEEEEl

Snncrgir los alimento. lenoionndoc cn una cclnci6n dc100 pp. del antibiótico dejando en cada caso ¡nostres testigo. trg_tada: con ¡gun destilada. Unavoz cocos, dichos clinenjoc serán cc;taninndoc con hongos y colocados cn condicicncc cspccialcc dc inqgbcción, durante la cual cc dctcrninari ci czictc cn alguno dc olla!crccinientc dc g‘rnencco­

EN35293 PRELIMINARES

NIC

l) ggcnaracién dc ¿a gglgciág ggggcrvadgga.

1) ¡ocur dc 25 c 50 ng (3_0,1 lg) dc antibiótico.2) Dinolvcr cn agua destilada cstéril para cbtcncr una concentra­

ci6n dc 100 pnl (260 n1h1).­J) Agitnr durante una hora cn ¡{quina agitadorl.­b)WWW­1) Rcvicnr cuidcdccancntc dos nucctrcn dc cada una dc los vlgctalcl

n ensayar. clininnndc ic- qnc proccnfinrcn ¡into-nc dc deterioro.contnninaelcncc. ctc. En 01 caso dc lc ¡vn una nuestra está ccn¡_

.153­

tituída por tree unidades.­2) Invarlac con agua destilada, eccurrirlae y eeoarlnc cuate-ente

con papel absorbente.­3) Bunergir una nuestra de cada vegetal. durante 30 eegundoa, en

1a solución acuosa de 100 pp. de nictatina. La otra aneatra cn­trirí el aienc tratamiento pero con agua deetilada (nuestra te!tigo).­

4)'De1ar1aa durante 24 horas a telperatnra-aabiente para permitirel secado de ¡ae mismas.­

S) Contaainarlae con esporas de un hongo del género Penicillinn.­6) Colocarlaa en un naciente de 25° c. y humedad 2=70fi (condicio­

nes propicia. para el desarrollo de hongos).­1) Observar diarianente todas laa nuestra- ennayadany expresar loa

reenltadoe obtenidos de la siguiente lunaresSin crecimiento de ¿ernenecl oConprincipio de eontaninaciónn eContaninndol e o ­

la: contaminado: o + +

W161: ¡lola sumido ¡aman da 100pp.

Inem utilizada:list-min cn¡unPotencia222 ya.

W ¡nula Val.d. Aut.“yu '12?)26,0 ¿o

goodouuunp

EL]! LD. WAcnt. room giant.mant. ¡“En

. ’ . - . ­o Ó - - . ­

o “’ * - .. .

o “o * o o o- u * - - ­. H * - . .

c mt.

MlztMénuh “¡mamando 1mm.hasta utilizada:W un¡uva

Potenciaga ¿su ‘Caudalm ¡01.h ¡susun. han. ­

(a) El)25,5 255

¡estatuas-abunda.

mm mn LM WA

reith czant. Tenga ¡az-nt. haga-Í o nt. fuga clama

:‘CNOU'UÜngcu

456­m common

Mo R33._/

Preparacióndo 1.aoclusión ¡num a. mo 1p.

¡hasta utilizada: Mantilla cn polvo.Pótencia 2 u

Canta: posada V01.le Gent.apta.25.“ 25k

Resultados Obtenidos.

I! MEIGA mn mag! un

¿.21 rest c mt. 1%ng e aut. num c Int. huge c mt.1 - . - . - . ­a . . - - - . .3 o . . . . . .u' - - . - - - ­

5 o - + - J... - o

6 - - o - o . .

7 - - * ° .9 0 '8 o o o o o - ­

1.o o - 9+ o o o o

ao - o m o o o ­

.157.

WM. (¡"4!5).2391125

Seguir una técnica similar s Is de los ensayos prelising_res son uns modificación en el item 2, el cual se efectuar‘ de lssiguiente torna!2) levar Isa muestras con agua dostilsds. escurrirlss. secarlss son

¡enel absorbente. Enel esao del lines oortsrle uns tsjsds y esel de ls uva remperls. Coneste ¡edificación se ooloes s las dosfrutas en peores condiciones de conservación trstsnno de tirar;cer el crecimiento del hongo.Resultados obtenidos!

Minh

Preparación de la. solución Matatina de 100 mn.

Nuestrautilizada: Innatia. en polvoPotegcia 2550 u/eg.

Cantidad pesada #01. do aguaautos-eg.{nl-1)(ng) —

32,6 326

¡esz matenidos.

e ¿aga mmm m_m_n tm

¿ÉL-1Tee c un. Team c qum c un. Test1 . - - - - . .a . . . - .. - - ­

3 . - . - . - ­lb o o o - - . .

5 o - ‘ 4 - M o o

6 o - o o - m o

7 o o o J» - m o

3 0 O H 4 o o» +

9 - - H # : 1-“ 4

1° ' - 4* ++ o - ¿H 4­I

o Apuicióndootroüphhonaow

Pnepanción de la solución Mahatma de 100 wm.

Mmm Bulimia: ¡list-tin. unpolvoJotemh 2550u/Ig.

Cantidad pesada Vol. de agua dutmgrq.(me) (al)

25.5 255

Bemltadou Obtenidon.

83 MEIGA mn LIMON WA

¿51+ T1522 c mt. Teotie c mt. Teatng c mt. Tutte1 - - - - . - ­2 t - o o - - ­

3 o - - o - . ¿

h o - - - 0 - “0

5 t o & - 4' o u

6 o a- Q o u o m

7 o o o o «o - m

l o - H» o H - m

9 o - n - w o mn 0 o +0 - H o m

es: enelcgnuhacelgn,heont-1nnc16nqnm16mnmd.o harian h om tipod. map.­

-160­

ti Ens o l (R3 6, 7 y 8)

En onto. no siguió 1a nio-n t‘cnica para lo. contaminan­tes fueron en el caso del tomate, limón y uva hongos, que pudtornnser obtenidos de alimentos ainilaree echado: a perder y luego aio­Indo- y aonbradoa en cada uno de los tipos do muestran a ensayar.­

L- ¡caiga ¡o oontaninó con el hongo que crac16 sobre eo­

to alilento on el ensayoanterior¡­

Emsa N36

dob­

Preparación de la solución nstatina de 100nn.

Nuestra utilizada a Bio-hau»;en polvoJotoncia fijen/na.

Canïidad peatón“al. de agua desk. agree.__(m1)gg)

¡“,7 2*?

¡”ultima Obtenidos}

a: ¡cum mmm mx!!! mn

¿231 {esta clont. Test c ant. Testigg c ent. Teng e ent.l .. .. ... .. .. - - ­e - - - - - - 4. ..

3 .. - - - - - ntk - - ‘ - - - 1,;5 - - o - o - +0 4»5 - - ++ o ui- - H; ++

7 - - 4+ - + o +++ ++

3 - - ++ - + <- +++ ++

9 o - ++ - + - +++ +4

3-9 - - +1 4- L - T+ ++

4.52.

av.-—.---...Mi].napa-¿ación de 1a solución Matutino. de 100 m.

Muestra utilizada; Ninguna en polvo. Potencia 2550u/mg.

Cantidad. pesada Vol.6.e Agua Gent. seres.(lll)

29,8 258

Mundua. armados.

N3 ACFLGA MA?! mm UVAde T " F

días test Test c 'ant. Testig cLant. Tes‘gga c/snt.1 o o o o c a .- o

2 - - - - - - + ­

3 . . o - o - ln o

ñ o o - - o o H o

f o - o - +4 o 4» o

6 . - 9 - n - 9* ff

1 . . ‘ o 0Q a “O Of

a - - 1» o u» + “9 M»

9 - - h «r +0 + o.» n

m . o fl + H + GH n

.163­

mc'm QHSIWABOS

¿ESE m: B

más: deInclusiónmmum de100pp.

hasta utiliza“ ¡num enpolvo.ktemin ya. lentidad panda

4.

Val.“ dont. lares.Ï-ï)28,0 ano

¡cantadas Winnidog.

y: ‘ mm mn mm mm¿(“En Testigo _ c cut. Testifirc aut. Tes cfm . Testigg e ut.1 - - . - - - - .2 - - - - - - o ­

3 0 - ' ’ " ’ ‘ ‘P

ll o - 0 4- o o H Ó

5 - - 4 _ 4+ - H +

ó o - O - ++ 0 W +6

7 - - + - H - 4-“ n

a - - 4 . ++ ‘ m n

9 - o 4 o H 6 44+ H

10 O - ++ # H’ 0 H H

-164—

¡gggl Se efectuó, edenfie. nn ensayo en el que oe niolnron Ice hcg¡oe que oontaninaron elgunno nuestra. de qnoao tronco y doembutidoe,­Se determinó que coco hongos están dentro del espectro de leniotntinn por lo que 1o aplicación de la mismoen 1o conser­vnoión de eetoe tipoe de elinontce poeiblenonte resultará

l tanbien boneficioee.

CO S 0 ES:

Be oboervn unn evidente noción conservador. del antibió­tico en tonate y lilón. Bota noción reoulte nenco etica: para con­trarrestar lao ccntnninacionee de hongos en uvas, aunque en este ualimento tanbien ee puede considerar en erecto cono bonotico.

En ecelgn, calvo en nn eneeyo. no ee pudo obtener creci­niento de hongce. no hebiíndoee apreciado diferencian entre ol vo­getal tratado con solución antibiótico y el nc tratado.

nn general. luego del tratamiento con unn solución do 100py. do nietatinn. tonto en tomate cono on lilón. loa hongos contentnante. ee pudieron observar 4 o 5 ¿{no después de en aparición on1o- controles.

En nvn, en casi todoo 10o ensayoe. lao trntae trctndeeee nantuvioron alredodcr de 1 die nin quo los controlo. nin preseater aparición de hongoo. siendo edemáoen ollne 1o oentidnd de conninantee nenor.

Detorntnu'¡a cantidaddo“num residual quow Clun no dolo. vegetalestratados un 01antibiótico. y n uru­016: n función«1 un”. aplicando01 ¡“odo do Vila-¡0161:rip;‘l W‘Oo’

1mmmm ondatipo do"¡om a mm: conun entidad

moi“ ¡o h ¡citaciónminutas do100nl. reunir 01una“dola ¡un y 1am a difunto- fiupon ¿o¡anahan ¡{cota-r.u un ono. un ¡Month ¡mas onn qu novaloru‘h uu­vuu mmm 4.1mamita».run-¡unn n uuu-d 1.n­un“: doh potonou“1 una n condiciona-“¡atte-s. perosu“tu n conta.“conlu mom (controla).So40W un¡1h h "tancia m1 lo ¡a saludas:do100pp y h ¡han dohuna durant. In hongo“. do40bom a 25°0.­

1) Pon a 25 A50 ¡u (33.1 u.) ¡o antibiótico.2) Mulm onun «atun. ostia-11¡nn ohne m concentrao

01611do 100 m.­J) min:- Cnruto m han en ¡(quan “¡adorno4) Dividirh sanción"unan. cntros tracción”. n mm. n

and para o].agregue a ha mostra. y ha los ¡"tanto- u d;Jan-(n.m en aman-don y otra a 25’ 0.. ¿mato 4ohomo­

-166­

b) am en e e a .­

1) Revisar cuidadosamente dos nuestras de cada vegetal a ensayareliminando los que presentaren sintonne de deterioro. contaminaciones, ete. En el caso del tomate y del limón se usarán unida­des pequeñas. Para 1a uva cada nuestra eetarí oonpnesta por treeunidades y para 1a acelga ee oortarín trozos de hoja de ayroxi­¡adelante 5 el. de lado.­

2) Lavar las nuestras con agua destilada, esourrirlas, eecarlae en;venente con papel absorbente y colocarlas en un vaso de preciyitado de 250 ¡1.- ‘

3) Agregar sobre cada una de ellas, tratando de ¡ojerlae bien, 5.0¡1 de 1a eolnoián de 100 pp! de Iistatina. En dos vasos de pre­cipitado vacios ee agregarín 5.0 nl. de 1a niena eolaoi6n (een­

_ trolee).­4).Dejar todas las nuestras durante 40 horas a una temperatura de

25° c. para pernitir el secado de la solución agregada.­5) Inoubar a 25° O. y 70%de humedaddurante distintos tiempos. e;

gún el ensayo e efectuar.­

0)mm.­¡"MW­gg;ng¿ág standard stggg (ee prepararán en igual terna dos agluciano. stock)

1) Pesar 25 a 56 ng (10,1 nas.) de Nistatina standard.2) Disolver en 1a mezcla de propilenaliool-aeSanol el 50* para ob­

tener una concentración de 4.000 a/hl.3) Agitar durante nedia hora en ¡{quina agitador..­4) Esta solución podrí conservarse a una temperature :í 5° 0., d!

-161­

rante tres días.­

Solgcién standard de trabajo.l) El día que ae efectue la valoración diluir las dos_solucionas

stock s 100 u/hl, con agua destilada estéril.­2) Pipetosr de cada solución standard obtenida, por triplicado en

tubos de 18 por 150 II estiriles con tape de aluminio, las airguientae cantidades: 0,0 - 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0.4 - 0.5 - 0,7­0.9 o 1.0 sl.­II.- Preparación ge las mgestggg.

a) gglgcigneg de 100 22m.­1) Efectuar de cada una de las soluciones (conservadas a 5° C. y s

25° c.) dos diluciones de 1:2 en agua destilada estiril de tal!torna de toner aproximadamente100 a/hl.­

2) Pipetear de cada solución obtenida, por triplicado. en tubos e¿_teriles de 18 por 150 ss. con tapa de aluminio. las siguientescantidades: 0.2 - 0,3 - 0,4 - y 0.5 s1.

b) Vegetales tratadosÑ!_ggntroles.l) Eluir cuantitativamente dos nuestras de cada tipo y dos contre­

les son 10 s1. de agua destilada “th-11 ayudindose con uns pe­quens estátuls y tofando varias veses la nuestras en el Vaso ngrs arrastrar bien el antibi6tico que hubiera sn las ademas.­

2) ¡gitar internitontenente con cuidado de no romper las nuestras.durantesediaun.

3) Pipetear de las soluciones obtenidas. por triplicado, en tubosestériles de 13 por 150 ss. con tapa de alusinio, las siguientescantidades: 0.2 - 0,3 o 0-4 I'C -5 Il.

.168­

¡IL- o a m en da ad a .

1) ¡mula! a1“¡í al ¡odio da mayo aatirn con el cultiva 11cm.do da SanchorowoaaCaravana..­

2) Fracciona- ouidandolaa condicion” da esterilidad, 9 al. de a;dio ¿a mayo inoculado an cada tubo. utilizando ¡{quina punta;aora.­Ivo-WW' ’

Colocar loa tuboa an 01 baño tamatattaada a 37’ o. daranta traa torna.­VO'W'

“¿rogar a cada tubo 0.! al. da 1a aoluctón da torno]. 1a 31 agitar monoman­VIo-W­

1) ¡por an al rotonda-(acta macho: (calibrado 100%:o un; ¡o!la variación; 1! div. laa fi da tran-Mafia ¡la cada mayo.­

2) Pro-odiar laa valoraa aorrnpondiantaa a cada cantidad da acla­

3)

4)

5)

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m 57,0 53.3 ¡13,0 ¡2,9 28,5

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Noee observeron interferencias entre lee vegetelee en­eayadoey le nietatine pues los valoren reeldnnlee halladoe con»euerdnneon los de los controle-.­

Lnego del secado de le ablación de 100 Pplb egresada n¡oe alimentan, en el que le potencia ee reduce aproximadnnenteun40A u “unan del mtibiánoo reeidunlse meten eenvelo­ree eoeptahles haete los 7 días.­

Logicanento todoe eetoe reeultedon dependen tento de la.oontnminaaionaa inicialee de ¡oe vegetales. eeno de 1e- del medieambiente durante el període de conservación.­

.211!»

¡a PARIE. S AJUSTE UN HUB“) JIO P

a) s. dom. unnum “todo. del tipo turbidu‘trico, pa­n n dota-¡mafia deannual. .1 quou ¡puc-M pantanos-nato¡un h valoracióndel antibiótico residual en ¡lu-ato- mudo- con01nun.­

b) El ¡»reanimaon ajustadorunn- de una: nom d oojocuoióny I‘I económicoqu. los “todo. conocidos hasta la tech.para valorar ¡ni-tatian­a: Pfil‘g.

a) finalizandolos mm. a unaconcentrada ¡loantibiót­oo ao 100n/nl. nom a. incubaciám 3 nom y concentraciónu 1­nóonlol 6 fi. n ubuntu fluctuacione- on ha potonom obtenidas,que no excedan ¡lo 3 5 fi.­

b) DI 1. oouparaofin de lo. resultado. obtenidos con lo.del. ¡{todo de 4121:3161:on placas do ¡gar no dot-mm m mor onguna del“todo ¡”puntu­M 1 oso‘4:10 " e_4 mmmco

rgflwgg“ gs maga; g mmHg/253.­m h aplicación do n nintatm conocamu-nao: do tipo

antuiodtioo en vegetal“, no observa:a) m evidentenociónpresentan on ton-io y 11an en

1“ que 10- hongoocontaminante- ¡parce-n 4 a S diu ¡lo-pun qm cnlos annual“.­

b) un erecto bcn‘floo. aunquo do ¡901611¡nos atacan. cn

-212­

ma. dondeaa rata-da 1a proliferaoián da hongo. an 1 día dini­mondo. admin, 1a cantidadda loa lima.­

D01aatudio da loa valor-a midualoa dal antibiótico Inloa momo. tratado. aa determinaqua:

a) 1a actividad da 1a niatatina oa nation. connin]... a­ceptable. hasta aproximan-nte 1 diu dnpu‘a da ¡gn-osadoa loaaiaaoa y

1) ao um." interferencia entre nos ani-onto. y al anti­ubico.­

.213­W‘ln Andoraon.Arial A. y Michcncr nnvid.l., Proaorvatlon of food. w‘

with Anttbtotlowo the complementar: nation of aubttltn and n11! xheat.¡ooo Technology4m. 168-189. 1950. nongtou nou-not 1949­26387.­

2. Boom n. r., Goodmana. n. and couoorg m. Prolongtng theIhwlt 11‘. o! rotrigorutod prOpactagodaptnaeh with antibiottow.1.1}- Antibiotiow A nnnll 1957-1958. NowIbrk. Iodioal Enoyolongm. Inc. 1958.­

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