VARIABILIDADE GENÉTICA E MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE...

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA

VARIABILIDADE GENÉTICA E MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE METILXANTINAS E COMPOSTOS

FENÓLICOS EM ERVA-MATE (Ilex paraguariensis St. Hil.)

KEIKO LEONICE NAKAMURA

UMUARAMA 2008

UNIVERSIDADE PARANAENSE

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA


VARIABILIDADE GENÉTICA E MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE METILXANTINAS E COMPOSTOS FENÓLICOS EM

ERVA-MATE (Ilex paraguariensis St. Hil.)

Dissertação apresentada como parte das exigências para a obtenção do grau de mestre no programa de Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade Paranaense – UNIPAR, sob orientação do(a) Prof(a) Dr(a) Ivan Schuster.

UMUARAMA

Agosto de 2008

Dedico este trabalho a Deus, a minha família e todos que me apoiaram nesta fase de crescimento pessoal e profissional.

AGRADECIMENTOS

- A Deus, por estar comigo em todos os momentos.

- Ao meu marido Takayassu e minhas filhas Luciana e Mariana, pelo amor, carinho,

atenção, compreensão pela minha ausência e incentivo em todos os momentos.

- Aos meus pais e irmãos pelo encorajamento, compreensão, preocupação e

orações.

- Aos amigos pelo apoio, estímulo e confiança.

- Ao professor Dr. Ivan Schuster pela orientação, contribuição, estímulo e amizade.

- Ao professor Dr. Euclides Lara Cardozo Junior, pela co-orientação, apoio,

confiança e amizade e por ter proporcionado facilidade no acesso aos laboratórios

da UNIPAR - Universidade Paranaense e da PRATI, DONADUZZI & CIA LTDA.

- Ao professor Orlando Seiko Takemura pela disponibilidade, apoio, cooperação,

paciência e auxílio na execução de parte deste trabalho.

- A Ervateira Bitumirim, em especial ao Sr. Afonso Oliszeski e Dalnei Neiwerth, pela

disponibilização para coleta e apoio a pesquisa.

- Ao professor Dr. Nelson Colauto, coordenador do Mestrado em Biotecnologia

Aplicado a Agricultura, pelos esclarecimentos e apoio a pesquisa científica.

- A professora Giane Linde pelo apoio, esclarecimentos, amizade e incentivo.

- Aos professores, técnicos de laboratório, acadêmicos e funcionários da

Universidade Paranaense – Sede e campus Toledo, pela acolhida, disponibilidade e

colaboração no desenvolvimento deste trabalho.

- A PRATI, DONADUZZI & LTDA, pelo incentivo e cooperação no desenvolvimento

deste trabalho em especial a Dra. Carmem Maria Donaduzzi.

- A Biocinese – Centro de Estudos Farmacêuticos, pelo apoio e disponibilidade do

laboratório em especial a Dra.Josélia, Ana, Mariely e equipe.

- Ao laboratório de pesquisa e desenvolvimento analítico da PRATI, DONADUZZI &

CIA LTDA em especial a Márcia Mitsui e toda equipe, pelo incentivo e cooperação

incondicional no desenvolvimento do trabalho.

- A Ariane (PEBIC) e Jakeline (PIBIC) pela disposição, colaboração e amizade.

- Aos meus colegas do mestrado pela companhia, amizade e incentivo em todos os

momentos.

- A todos aqueles que de alguma maneira colaboraram nesta etapa de crescimento

profissional e pessoal.

“Na natureza se encontra a cura de todos os males, cabe a nós pesquisar e preservar”.


PARÂMETROS GENÉTICOS E MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE METILXANTINAS E

COMPOSTOS FENÓLICOS DA ERVA-MATE (Ilex paraguariensis St. Hil.)

RESUMO

A erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil) é explorada no sul da América Latina pela

capacidade de produzir bebidas tônicas e estimulantes. É consumida

tradicionalmente como infusão de suas folhas secas e trituradas em bebidas

conhecidas como chimarrão ou tererê, consideradas bebidas muito populares da

América do Sul. Na composição química dos extratos da planta destaca-se a

presença de saponinas triterpênicas responsáveis pela espuma e pelo sabor

amargo, metilxantinas responsáveis pelo efeito tônico e estimulante da erva-mate e

compostos fenólicos derivado do ácido clorogênico que apresentam grande

atividade antioxidante e dá coloração e sabor a erva-mate. Estes compostos são

capazes de prevenir e tratar uma série de problemas relacionados à saúde. O

conhecimento da contribuição genética na variabilidade destes compostos pode

auxiliar os programas de melhoramento da erva-mate na obtenção de progênies

com níveis melhorados destes compostos. Este trabalho teve como objetivos avaliar

o teor de saponinas triterpênicas, metilxantinas e ácido clorogênico e a atividade

antioxidante em oito progênies de erva-mate; analisar a variabilidade genética,

coeficiente de herdabilidade e correlação simples entre o teor destes compostos e

analisar a influência da temperatura nos processos extrativos por refluxo e

remaceração para estes compostos. A seleção de progênies foi realizada através de

dados fitoquímicos prévios de metilxantinas e compostos fenólicos, selecionando-se

progênies com alto grau de dissimilaridade. As amostras das progênies analisadas

foram provenientes de um teste de progênies de meio-irmãos do Programa de

Melhoramento Genético conduzido pela EMBRAPA Florestas (Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária) na Unidade experimental em Ivaí – PR. As análises de teor

foram realizadas em CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), a atividade

antioxidante com a utilização do radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) em CCD

(Cromatografia em camada delgada) e por espectrofotometria e análises estatísticas

pelo programa GENES. Os resultados evidenciaram uma diferença significativa

entre as progênies nos teores de saponinas triterpênicas (0,003-0,080%), cafeína

(0,226-1,377%), de teobromina (0,176-0,831%), ácido clorogênico (1,344-2,031%) e

na atividade antioxidante (31,251-51,406%). Foi observada uma correlação positiva

entre o teor de ácido clorogênico com a teobromina, e negativa entre teobromina

com cafeína e saponinas, e de cafeína com ácido clorogênico. O coeficiente de

herdabilidade para saponinas (75,09%), cafeína (75,19%) e teobromina (66,87%),

ácido clorogênico (52,86%) e na atividade antioxidante (67,75%) indicam a

possibilidade de ganhos genéticos por seleção para estas características. Os

resultados de comparação entre os métodos extrativos indicam que há uma

diferença significativa entre os teores de ácido clorogênico e teobromina entre os

métodos e que há possibilidade da alta temperatura ter influenciado nestas

diferenças.

Palavras-chave: Aquifoliaceae, compostos fitoquímicos, diversidade genética,

atividade antioxidante, métodos de extração.


GENETIC PARAMETERS AND EXTRACTION OF METHYLXANTHINES AND

PHENOLIC COMPOUNDS IN ERVA MATE (Ilex paraguariensis St. Hil.)

ABSTRACT

Erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil) is exploited in the South of Latin America due

to the production of tonic and stimulant beverages. Traditionally consumed as an

infusion of its dry leaves and triturated in beverages known as “chimarrão” or “tererê”,

they are considered to be the most popular drinks of South America. The extracts

reveal the presence of some chemical compounds such as, methylxanthines,

responsible for the tonic and stimulating effect of erva-mate; triterpene saponins,

responsible for the foam and the bitter taste; and phenolic compounds - derived from

chlorogenic acid - which presents high antioxidant activity and gives the distinctive

color and flavor to erva-mate as well. These compounds are able to prevent and treat

a series of health problems. Knowledge on genetic contribution regarding the

variability of these compounds may be of great help on erva-mate improvement

programs in order to obtain progenies having improved levels of these compounds.

Thus, this work had the objectives of assessing the content of methylxanthines,

triterpene saponins and chlorogenic acid of eight progenies of erva-mate; analyzing

genetic variability, herdability coefficient and simple correlation among these

compounds’ content and also comparing temperature influence on reflux and

remaceration extraction processes for these substances. Progenies selection was

carried out through previous phytochemical data on methylxanthines and phenolic

compounds obtained by Cardozo Junior (2006), by selecting high-degree dissimilarity

progenies. Samples of the progenies analyzed came from a half-brother progeny-test

design accomplished by the Genetic Improvement Program of EMBRAPA Forests at

Experimental Unit - Ivaí, Paraná. Content analysis were carried out on HPLC (High

Performance Liquid Chromatography); antioxidant activity by using DPPH- (2,2-

Diphenyl-1-Picrylhydrazyl) radical on TLC (Thin Layer Chromatography) as well as by

spectrophotometry and statistic analysis by the aid of GENES pc software. Results

highlighted a significant difference among the progenies on the contents of triterpene

saponins (0.003-0.080%); caffeine (0.226-1.377%); teobromine (0.176-0.831%);

chlorogenic acid (1.344-2.031%) and on antioxidant activity (31.251-51.406%). There

has been a positive correlation between chlorogenic acid content with teobromine;

and a negative one between teobromine content with caffeine and saponin contents,

as well as caffeine content with chlorogenic acid content. Heritability coefficient for

saponins (75.09%); caffeine (75.19%) and teobromine (66.87%); chlorogenic acid

(52.86%) and antioxidant activity (67.75%) indicates the possibility of genetic

selection profits for these characteristics. Comparative results between the extractive

remaceration and reflux methods point out that there is a significant difference

between the contents of chlorogenic acid, caffeic acid and teobromine under the

methods evaluated, indicating that, high temperature may have had some influence

on these differences.

Key Words: Aquifoliaceae ; phytochemical compounds; genetic diversity; antioxidant

activity; extraction methods.

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

FIGURA 1. Análise de agrupamento pelo método UPGMA de 51 progênies de erva-

mate, a partir de dados de distância generalizada de Mahalanobis, obtidos a partir

da composição de metilxantinas e de compostos fenólicos (Cardozo Junior, 2006). A

linha pontilhada horizontal indica o ponto de corte para formação dos grupos. As

progênies selecionadas estão marcadas com um retângulo.

CAPITULO II

FIGURA 1. Perfil cromatográfico dos padrões de (A) cafeína, (B) teobromina, (C)

ácido clorogênico e (D) ácido caféico.

FIGURA 2. Perfil cromatográfico da amostra de uma progênie extraído pelo

processo de remaceração (teobromina/cafeína) (A) e por refluxo

(teobromina/cafeína) (B) remaceração (ácido clorogênico) (C) e refluxo (ácido

clorogênico/ácido caféico) (D).

FIGURA 3. Estrutura química do ácido clorogênico (A) e ácido caféico (B).

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

TABELA 1. Resumo da análise de variância e herdabilidade para os teores médios

de saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico, cafeína, teobromina e ácido

clorogênico em oito progênies de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil) e da

atividade antioxidante. Valores expressos em %.

TABELA 2. Teores médios de saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico,

cafeína, teobromina e ácido clorogênico e atividade antioxidante a 0,5 mg/mL, em

oito progênies de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil). Valores expressos em %.

TABELA 3. Correlação entre as saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico,

cafeína, teobromina, ácido clorogênico e atividade antioxidante em oito progênies de

erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.)

CAPÍTULO II

TABELA 1. Teor médio de cafeína, teobromina, ácido clorogênico e ácido caféico em

extrato de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) obtido por dois métodos de

extração. Valores expressos em %. Os valores apresentados são as médias de oito

progênies de erva-mate (Ilex paraguariensis) coletadas em três blocos distintos

(n=24).

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO.......................................................................................... 16

CAPÍTULO I

Parâmetros genéticos e herdabilidade no teor de compostos fitoquímicos em progênies de Ilex paraguariensis ST. Hil.

Resumo ......................................................................................................... 21

Abstract ......................................................................................................... 22

1. Introdução ................................................................................................. 23

2. Materiais e Métodos .................................................................................. 26

2.1 Material vegetal ....................................................................................... 26

2.2 Processamento ....................................................................................... 28

2.3 Processo extrativo para saponinas triterpênicas ..................................... 28

2.4 Processo extrativo para metilxantinas ..................................................... 29

2.5 Processo extrativo para o ácido clorogênico ........................................... 29

2.6 Análise cromatográfica de saponinas triterpênicas ................................. 30

2.7 Análise cromatográfica de metilxantinas e ácido clorogênico ................. 30

2.8 Curva de calibração ................................................................................ 31

2.9 Avaliação da atividade antioxidante ........................................................ 31

3.0 Análise de dados ................................................................................... 32

3. Resultados e discussão ............................................................................ 32

4. Referências bibliográficas ......................................................................... 42

CAPÍTULO II

Influência da temperatura em métodos extrativos para as metilxantinas e compostos fenólicos em erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.)

Resumo ......................................................................................................... 47

Abstract ......................................................................................................... 48

1. Introdução ................................................................................................. 49

2. Materiais e Métodos .................................................................................. 52

2.1 Local de coleta ........................................................................................ 52

2.2 Coleta e acondicionamento ..................................................................... 53

2.3 Processamento ....................................................................................... 53

2.4 Extração por refluxo ................................................................................ 53

2.5 Extração por remaceração ...................................................................... 54

2.6 Análise cromatográfica ............................................................................ 54

2.7 Curva de calibração ................................................................................ 55

2.8 Análise de dados ..................................................................................... 55

3. Resultados e discussão ............................................................................ 56

4. Conclusão ................................................................................................. 63

5. Referências bibliográficas ......................................................................... 64

CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 67

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 69

APÊNDICE .................................................................................................... 72

CBAB – Crop Breeding and Applied Biotecnology ........................................ 73

RBPM – Revista Brasileira de Plantas Medicinais …………………………… 76

Submissão do artigo ……………………………………………………………... 80

16

INTRODUÇÃO

A Ilex paraguariensis St. Hil é uma planta perene e nativa do Sul do Brasil,

Paraguai e Argentina. É fonte de matéria prima para chá e outras bebidas

(COELHO, 2001). Tradicionalmente é utilizada no preparo de chimarrão e tererê,

bebidas muito populares na América do Sul (SCHINELLA et al., 2005; REGINATTO

et al., 1999).

Aproximadamente 30% da população da América do Sul consome mais de

um litro/dia de alguma destas bebidas comprovando seu grande valor econômico

(FILIP et al., 2000; GNOATTO et al., 2005).

Os maiores produtores de erva-mate são o Brasil, Argentina e Paraguai. O

Brasil é o segundo produtor mundial e o estado do Paraná o maior produtor nacional

(NEUMANN, 2000). A erva-mate é cultivada em pequenas propriedades rurais e

ervateiras com uma produção anual de 500.000 t (TAKETA et al., 2004; GNOATTO

et al., 2007). A produção de erva-mate cancheada em 2006 foi de 233.360

toneladas, sendo 232.931 t produzida no Sul do Brasil e 152.971 t no Estado do

Paraná (IBGE, 2006).

O chimarrão é a forma mais comum de consumo, mas devido à grande

diversidade de compostos fitoquímicos a I. paraguariensis pode ser considerada

fonte de matéria prima capaz de suprir várias ramificações do setor industrial como

de insumos alimentícios, cosméticos, bebidas, produtos farmacêuticos e

fitoterápicos, demonstrando a importância de análises qualitativas e quantitativas

nos teores de seus compostos químicos e de pesquisas em melhoramento genético

desta espécie (JACQUES et al., 2006).

A I. paraguariensis apresenta classes de compostos fitoquímicos como as

metilxantinas, fenóis e ácidos fenólicos, aminoácidos e outros compostos

nitrogenados, ácidos graxos, antocianinas, flavonóides, compostos terpênicos,

alcanos e álcoois, carboidratos e carotenóides (ALIKARIDIS, 1987), taninos,

trigonelina, vitaminas como a B1 (thiamine), B2 (riboflavin), B5 (ácido pantotênico),

C, E, β-caroteno, sucrose, frutose e cholina (GUGLIUCCI; STAHL, 1995) cafearina,

ácido matetânico, ácido fólico, ácido virídico, clorofila, colesterina, óleos essenciais

(DA CROCE, 2002).

17

As metilxantinas cafeína, a teobromina e a teofilina são os compostos mais

conhecidos desta espécie, responsáveis pela ação estimulante atribuída à erva-mate

(GNOATTO et al., 2007). Os principais efeitos fisiológicos e terapêuticos da cafeína

são seu poder diurético, relaxamento da musculatura lisa dos brônquios, do trato

biliar e gastrintestinal, parte do sistema vascular, estimulante cardíaco e do sistema

nervoso central (DA CROCE, 2002; BRENELLI, 2003).

Os teores de metilxantinas na erva-mate são muito instáveis, podendo variar

de 0,16 até 1,4% (REGINATTO et al., 1999). Esta variação pode estar relacionada

com a variabilidade das populações da I. paraguariensis e também ao método de

extração aplicado na sua determinação (GNOATTO et al., 2007).

Pesquisas com as saponinas foram iniciadas recentemente. Estes compostos

são responsáveis pelo sabor amargo da erva-mate, pela solubilidade da bebida e

pela formação de espuma. Apresentam ação antiinflamatória, diurética e

hipocolesterolemiante (SCHENKEL et al., 2001). Contribuem no tratamento de

hepatopatias, reumatismo e obesidade. As aplicações biológicas são baseadas na

sua capacidade de causar a lise de membranas e formação de micelas (GNOATTO

et al., 2005). Devido a suas ações biológicas e terapêuticas tem-se despertado

grande interesse por este fitoquímico.

Outros compostos da erva-mate de grande importância são os compostos

fenólicos, derivados cafeoil, com a presença de ácido clorogênico (ácido 5-

cafeoilquínico), ácido caféico, ácido 3,4-dicafeoilquínico, ácido 3,5-dicafeoilquínico e

ácido 4,5-dicafeoilquínico e dos flavonóides rutina, quercetina e kaempferol

(CLIFFORD; RAMIREZ-MARTINEZ, 1990). Na erva-mate essas substâncias

contribuem para o odor e coloração. São utilizados como flavorizantes e corantes de

alimentos e bebidas. A presença do ácido clorogênico, além da atividade

hepatoprotetora, reforça a defesa antioxidante do organismo (BORRILE, 2004) atua

na redução da hemólise, peroxidação de hemácias e antienvelhecimento em

sistemas biológicos e químicos (DE MARIA; MOREIRA, 2004).

As ações dos radicais livres no organismo estão envolvidas com a gênese e

o agravamento de doenças crônicas degenerativas (FILIP et al., 2000; SOARES,

2002; MAVI et al., 2004). Com a maior expectativa de vida da humanidade, o uso de

antioxidantes naturais está se tornando uma necessidade para garantir melhor

qualidade de vida. Tendo em vista os indícios de que o uso de antioxidantes

18

sintéticos tem demonstrado efeito tóxico e mutagênico, tem-se voltado à atenção

aos antioxidantes naturais (BOTTERWECK et al., 2000; ANESINI, 2006).

A seleção de progênies de erva-mate com maior teor de saponinas,

metilxantinas e compostos fenólicos relacionadas a uma série de atividades

terapêuticas e biológicas são essenciais em um programa de melhoramento

genético da espécie.

Embora estudos da erva-mate tenham sido realizados sob ponto de vista

químico e terapêutico, há pouca informação sobre diversidade genética intra e inter-

populações ou fatores capazes de influenciar na variabilidade do teor de seus

compostos (DA CROCE, 2002).

Fatores ambientais como período de colheita, idade da planta, época de

poda, luminosidade, tipo de solo, adubação e suplemento de água podem influenciar

no teor dos compostos da erva-mate. Mas, pesquisas inter-espécies e a

variabilidade genética existente intra-espécie são aspectos que devem ser

analisados para o desenvolvimento de estratégias de melhoramento, que possam

selecionar progênies com níveis melhorados de seus constituintes (REGINATTO et

al., 1999; COELHO et al., 2001; COELHO et al., 2002; DA CROCE, 2002;

SCHUBERT et al., 2006; CARDOZO Junior et al., 2007; GNOATTO et al., 2007).

Pesquisas em melhoramento genético da erva-mate são recentes. No Brasil

tiveram início em 1986 pela EPAGRI/SC e em 1995 pela EMBRAPA/PR que iniciou

testes com 175 progênies de oito procedências em sete localidades do Paraná e

uma em Santa Catarina. De forma geral as pesquisas apresentam um enfoque na

produção de massa verde e resistências às doenças (COSTA et al., 2005;

CARDOZO Junior, 2006). Enfatiza-se a necessidade de selecionar progênies

através de parâmetros genéticos que possam proporcionar a melhora das

características de interesse da I. paraguariensis como o teor de seus compostos.

Além de todas estas variáveis ambientais e genéticas analisadas, um

processo extrativo adequado e eficiente é essencial, tornando a pesquisa fidedigna.

Os dados apresentados na literatura de compostos fitoquímicos não permitem

comparações em vista da grande diversidade de metodologias empregadas para

extração e quantificação destes metabólitos (SCHUBERT et al., 2006). Os extratos

de plantas são misturas complexas sendo necessárias técnicas apropriadas que

19

permitam uma melhor análise individual de seus compostos (JACQUES et al., 2007).

Portanto, além de pesquisas em melhoramento genético da espécie, também devem

ser pesquisados processos extrativos práticos, eficientes e fidedignos.

O presente trabalho teve como objetivos analisar a variação nos teores de

saponinas triterpênicas, cafeína, teobromina e ácido clorogênico em oito progênies

de erva-mate, avaliar as correlações entre os compostos e a herdabilidade de cada

um destes fitoquímicos avaliados e analisar a atividade antioxidante destas

progênies. Além disso, objetivou avaliar a influência da temperatura nos processos

de extração das metilxantinas e compostos fenólicos da erva-mate por meio de

refluxo e remaceração.

No capítulo I foi avaliada a herdabilidade e parâmetros genéticos

associados à variação nos teores de metilxantinas e de compostos fenólicos na

erva-mate. Este capítulo está no formato para envio à revista Crop Breeding and

Applied Biotechnology, utilizando as normas desta revista.

No capítulo II foi avaliada a influência da temperatura nos processos de

extração das metilxantinas e compostos fenólicos da erva-mate por meio de refluxo

e remaceração. Este capítulo está no formato para envio à Revista Brasileira de

Plantas Medicinais (RBPM) utilizando as normas desta revista.

20

Parâmetros genéticos e herdabilidade no teor de compostos fitoquímicos em

progênies de Ilex paraguariensis St. Hil.

NAKAMURA, K. L1*.; SCHUSTER, I2.; 1 UNIPAR Universidade Paranaense, Praça Mascarenhas Morais, 87.502-210, Umuarama – PR. [email protected] 2 UNIPAR Universidade Paranaense, Rua Rui Barbosa, 611, 85.810-240, Cascavel - PR. [email protected]

21

Parâmetros genéticos e herdabilidade no teor de compostos fitoquímicos em progênies de Ilex paraguariensis St. Hil.

RESUMO

A erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil) possui compostos fitoquímicos capazes de prevenir

uma série de problemas de saúde. O conhecimento da contribuição genética na variabilidade

destes compostos pode auxiliar os programas de melhoramento a obter progênies de erva-

mate com níveis melhorados destes compostos. Neste trabalho foram avaliadas a composição

de saponinas triterpênicas, metilxantinas, ácido clorogênico e a atividade antioxidante de 8

progênies de erva-mate. Os resultados evidenciaram uma diferença significativa entre as

progênies nos teores de saponinas triterpênicas (0,003-0,080%) cafeína (0,226-1,377%),

teobromina (0,176-0,831%), ácido clorogênico (1,344-2,031%) e na atividade antioxidante

(31,251-51,406%). Foi encontrada uma correlação negativa entre teobromina com saponina e

cafeína, e de cafeína com o ácido clorogênico. A teobromina apresentou uma correlação

positiva com o teor de ácido clorogênico. O coeficiente de herdabilidade para saponinas

(75,09%), cafeína (75,19%) e teobromina (66,87%), ácido clorogênico (52,86%) e na

atividade antioxidante (67,75%) indicam a possibilidade de ganhos genéticos por seleção para

estas características.

PALAVRAS CHAVE: Aquifoliaceae, saponinas triterpênicas, metilxantinas, ácido

clorogênico, atividade antioxidante.

22

ABSTRACT

Maté (Ilex paraguariensis St. Hil) has phytochemical compounds able to prevent lots of

health problems. The knowledge of genetics contribution in the variability of these

composites can help the programs of improvement to obtain mate progenies with improved

levels of these composites. In this work, the composition of triterpene saponins,

methylxanthines, chlorogenic acid and the antioxidant activity of 8 progenies of mate were

evaluated. The results showed a significant difference among the progenies in contents of

triterpene saponins (0.003-0.080%), caffeine (0.226-1.377%), theobromine (0.176-0.831%),

and chlorogenic acid (1.344-2.031%) and in antioxidant activity (31.251-51.406%). There is a

negative correlation between the contents of theobromine with saponins and caffeine, and

caffeine with chlorogenic acid. The theobromine has a positive correlation with chlorogenic

acid. The heritabilities for saponins (75,09%), caffeine (75,19%) and theobromine (66,87%),

chlorogenic acid (52,86%) and in antioxidant activity (67,75%) indicate the possibility of

genetic gain by selection for these characteristics.

KEY WORDS: Aquifoliaceae, triterpene saponins, methylxanthines, chlorogenic acid,

antioxidant activity.

23

INTRODUÇÃO

A Ilex paraguariensis St. Hil é uma planta nativa do Sul do Brasil, Paraguai e

Argentina. Conhecida como erva-mate, é a matéria prima do chimarrão e do tererê,

consideradas as bebidas mais populares da América do Sul (Reginatto et al. 1999). No

continente, aproximadamente 30% da população consome mais de um litro/dia de alguma

destas bebidas (Filip et al. 2000; Schinella et al. 2000; Gnoatto et al. 2005).

O Brasil é considerado o segundo maior produtor mundial de erva-mate sendo o

estado do Paraná o maior produtor nacional com uma produção anual de 500.000 t (Neumann,

2000; Gnoatto et al. 2007). Em 2006, a produção de erva-mate cancheada no Brasil foi de

233.360 toneladas, sendo 232.931 t produzida no Sul do Brasil e 152.971 t no Estado do

Paraná (IBGE, 2006).

Devido à grande diversidade de compostos fitoquímicos a I. paraguariensis pode ser

considerada fonte de matéria-prima capaz de suprir o setor industrial de insumos alimentícios,

cosméticos, bebidas, produtos farmacêuticos e fitoterápicos (Jacques et al. 2006).


metilxantinas, fenóis e ácidos fenólicos, aminoácidos e outros compostos nitrogenados, ácidos

graxos, antocianinas, flavonóides, compostos terpênicos, alcanos e álcoois, carboidratos e

carotenóides (Alikaridis 1987), taninos, trigonelina, vitaminas como a B1 (thiamine), B2

(riboflavin), B5 (ácido pantotênico), C, E, β-caroteno, sucrose, frutose e cholina (Gugliucci;

Stahl, 1995) cafearina, ácido matetânico, ácido fólico, ácido virídico, clorofila, colesterina,

óleos essenciais (Da Croce, 2002).

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Compostos presentes na erva-mate como as saponinas, responsáveis pelo sabor

amargo da erva-mate, a solubilidade da bebida e a formação de espuma. Nas plantas em geral,

apresentam ação antifúngica, antiinflamatória, antiviral, expectorante, diurética e

hipocolesterolemiante (Schenkel et al. 2001). As saponinas presentes na erva-mate

contribuem no tratamento hipocolesterolêmico e antiinflamatório. As aplicações biológicas

são baseadas na sua capacidade de causar a lise de membranas e formação de micelas. Alguns

destes compostos como as saponinas triterpênicas que apresentam em sua estrutura o ácido

ursólico tem sido isolado das folhas de erva-mate (Schenkel et al. 2001; Gnoatto et al. 2005).

Estas atividades terapêuticas, biológicas e surfactantes tornam as saponinas um fitoquímico de

interesse

Dentre as metilxantinas, a cafeína e a teobromina são os compostos mais estudados.

Os principais efeitos fisiológicos da cafeína são seu poder estimulante e diurético. Também

causa relaxamento da musculatura lisa dos brônquios, do trato biliar e gastrintestinal e parte

do sistema vascular (Brenelli 2003). Sob o ponto de visto terapêutico, a cafeína é destacada

como substância tônica, estimulante cardíaco e do sistema nervoso central (Da Croce 2002).

Os compostos fenólicos na erva-mate contribuem para o odor e coloração. São

economicamente importantes pela sua utilização como flavorizantes e corantes de alimentos e

bebidas. A presença do ácido clorogênico, além da atividade hepatoprotetora, reforça a defesa

antioxidante do organismo (Campos et al. 1996). Como antioxidante, atua na redução da

hemólise, peroxidação de hemácias e antienvelhecimento em sistemas biológicos e químicos

(De Maria; Moreira 2004).

As ações dos radicais livres no organismo estão envolvidas em patologias como o

câncer, cardiopatias, infecções hepáticas e agravam o quadro clínico de mais de 100 doenças,

podendo causar alterações nas células e mudança no DNA (Filip et al. 2000; Mavi et al.

25

2004; Soares 2002). Estas evidências têm sugerido que doenças decorrentes de reações

oxidativas podem ser retardadas pela ingestão de antioxidantes naturais.

Com a maior expectativa de vida da humanidade, o uso de antioxidantes naturais está

se tornando uma necessidade para garantir melhor qualidade de vida. Tendo em vista os

indícios de que o uso de antioxidantes sintéticos tem demonstrado efeito tóxico e mutagênico,

tem-se voltado a atenção para os antioxidantes naturais (Botterweck et al. 2000; Anesini

2006).

Embora diversos estudos da erva-mate tenham sido realizados sob ponto de vista

químico e terapêutico, há pouca informação sobre a variação dos constituintes fitoquímicos do

mate e os fatores que são capazes de influenciar esta variabilidade (Da Croce 2002). Diversos

fatores podem influenciar nos teores dos compostos fitoquímicos da erva-mate, como a

variação intra-espécie, período de colheita, idade da planta, época de poda, luminosidade, tipo

de solo e teor de minerais, adubação, variabilidade genética, além dos métodos de extração,

isolamento e quantificação (Reginatto et al. 1999; Coelho et al. 2001; Coelho et al. 2002; Da

Croce 2002; Schubert et al. 2006; Cardozo Junior et al. 2007; Gnoatto et al. 2007). Mas há

pouca informação sobre os componentes genéticos desta variabilidade. A quantificação da

variação genética destes compostos é importante para o desenvolvimento de estratégias de

melhoramento que possam selecionar progênies com níveis melhorados destes constituintes.

O melhoramento genético da erva-mate é uma atividade recente. Na Argentina se

iniciou em 1974 e no Brasil, em 1986 pela EPAGRI/SC (Empresa de Pesquisa Agropecuária e

Extensão Rural de Santa Catarina) e em 1995 pela EMBRAPA/PR (Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária) que iniciou testes com 175 progênies de oito procedências em sete

localidades do Paraná e uma em Santa Catarina. De forma geral as pesquisas apresentam um

enfoque na produção de massa e resistências às doenças (Costa et al. 2005; Cardozo Junior

2006).

26

No entanto, em razão das suas qualidades nutracêuticas, os teores de seus compostos

químicos também devem ser considerados nos programas de melhoramento. Estimativas de

parâmetros genéticos são empregadas pelos melhoristas para maior conhecimento do

potencial genético dos indivíduos a serem selecionados ou recombinados para melhora das

características fitoquímicas de interesse.

O presente trabalho teve como objetivos analisar a variação nos teores de saponinas

triterpênicas, cafeína, teobromina, ácido clorogênico e atividade antioxidante em oito

progênies de erva-mate, avaliar parâmetros genéticos e as correlações entre os compostos e a

herdabilidade de cada um destes fitoquímicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal

As amostras de erva-mate analisadas são provenientes de um teste de progênies de

meio-irmãos do Programa de Melhoramento Genético conduzido pela Embrapa Florestas em

sua Unidade experimental, na Fazenda Vila Nova da Ervateira Bitumirim em Ivaí – PR.

Localizada no segundo planalto do estado do Paraná (25º 01’S 50º48’W) altitude

600m, precipitação 1500 – 1600 mm. A região se caracteriza pela formação de Floresta

Ombrófila Mista. A reserva de pesquisas da erva-mate se encontra a céu aberto, com

espaçamento 2x3m e com grande maioria das plantas femininas. O solo é caracterizado como

LATOSSOLO BRUNO Distrófico a moderado, textura argilosa (72% de argila) e de

coloração bruno avermelhado-escuro, fase relevo suave ondulado com declives de 4% e em

altitudes que variam de 700 a 750 metros, originários de rochas sedimentares (argilito).

27

Quimicamente são considerados solos ácidos com saturação de bases baixa e com

saturação com alumínio alta. O clima está sob influência do tipo Cfb, com verões quentes com

tendência de concentração de chuvas, sem estação de seca definida e baixa freqüência de

geadas. A temperatura média anual esta entre 17 ºC e 18 ºC, sendo que a média nos meses

quentes é superior a 22 ºC e a dos meses frios é inferior a 18 ºC (Sturion et al, 2003; Borrile

2004; Cardozo Junior, 2006).

A implantação das progênies foi em março de 1997, em um delineamento

experimental de blocos ao acaso com 10 repetições. As progênies foram implantadas com

espaçamento de 3 m entre linhas, 2 m entre árvores e 3 m entre blocos. A poda de formação

foi efetuada por volta de dois anos de idade; a segunda poda foi efetuada por volta de dois

anos após a primeira (Sturion et al. 2003).

De um total de 51 progênies, foram selecionadas oito das seguintes procedências:

Ivaí/PR, Barão de Cotegipe/RS, Pinhão/PR, Cascavel/PR, Quedas do Iguaçu/PR, para a

avaliação dos compostos fitoquímicos. O critério de seleção para as progênies foi à maior

produção de massa foliar e a análise prévia do conteúdo de metilxantinas e compostos

fenólicos (Cardozo Junior et al. 2007). Estes dados fitoquímicos foram utilizados em uma

análise de agrupamento, utilizando-se a distância generalizada de Mahalanobis e o método de

agrupamento UPGMA (Unweigthed pair group with mean average), conforme descrito por

Cruz e Carneiro (2003). As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do Programa

GENES (Cruz 2006). A partir deste resultado foi escolhida uma progênie de cada grupo, de

forma a se obter as progênies mais divergentes possíveis. As amostras foram coletadas em três

blocos do experimento.

A coleta das amostras foi realizada no dia 16 de Julho de 2007 no período da manhã.

Foram coletados os ramos com folhas, padronizadas na parte mediana das árvores e direção

leste. As amostras foram acondicionadas em sacos de papel craft devidamente identificados e

28

transportados ao laboratório para processamento e análise. A amostra coletada passou por um

processo de seleção, onde foram selecionadas as folhas íntegras, de coloração uniforme, sem

presença de fungos ou sujidades.

Processamento

As folhas selecionadas foram submetidas ao processo de inativação de enzimas

(branqueamento). Para isso, foram submersas em água fervente (100 ºC) por 5 segundos, em

seguida passaram por um processo de pré-secagem em centrífuga manual para retirada do

excesso de água e resfriadas por ventilação. Estas folhas foram secas em estufa com

circulação de ar a 45 ºC, durante 48 horas. Após este tempo foram trituradas em liquidificador

(5 pulsos – granulometria fina), identificadas e acondicionadas em vidro âmbar, lacradas e

armazenadas em geladeira.

Processo extrativo para saponinas triterpênicas

A obtenção do extrato aquoso e a hidrólise das saponinas (separação do açúcar e do

esqueleto triterpênico) foram realizadas conforme metodologia adaptada de Gnoatto et al

(2005). Quinze gramas de folhas secas e trituradas foram fervidas por 15 minutos com água

(planta:solvente 1,5:13 m/v). A solução extrativa foi filtrada a vácuo com papel filtro

(Whatman) e o volume final ajustado para 100 mL com água.

Cem mL do extrato aquoso de I. paraguariensis foi tratado com 33 mL de HCl (Ácido

clorídrico) P.A. obtendo uma solução na concentração de 3 mol L que foi mantida em refluxo

29

por 1 hora. As sapogeninas foram extraídas com 50 mL de clorofórmio, repetida por quatro

vezes. Toda a fração clorofórmica foi evaporada e seca em capela em temperatura ambiente e

o resíduo foi reconstituído com 50 mL de acetonitrila. Esta solução foi filtrada através de

membrana de 0,45 µm (Millipore, HVHP) e analisada em CLAE (Cromatografia líquida de

alta eficiência). Todas as fases do processo extrativo foram monitoradas por CCD

(Cromatografia em camada delgada) e comparadas com o padrão de ácido ursólico.

Processo extrativo para metilxantinas

Para obter o extrato de erva-mate para análise de metilxantinas, foi utilizado o sistema

de refluxo com 1,0 g da amostra em metanol 70% (5 x 50 ml) por 20 minutos cada 50 mL,

obtendo um produto final de 250 mL. O extrato foi tratado com Reagente de Carrez

(precipitação de proteínas) na proporção de 2 mL do reagente A (21,9 g de acetato de zinco

di-hidratado (2H2O) em 100 mL água destilada contendo 3 g de ácido acético glacial) e 2 mL

do reagente B (10,6 g de ferrocianeto de potássio tri-hidratado (3H2O) em 100 mL de água

destilada) e filtrado a vácuo (Whatman nº 4) (Clifford & Ramirez-Martinez, 1990).

Processo extrativo para o ácido clorogênico

Uma grama da amostra de folhas secas e trituradas foi colocada em vidro âmbar com

10 mL de metanol 70% (5x10 mL). Em dias alternados foi retirado o sobrenadante e

acrescentado mais 10 mL de metanol 70%, obtendo um volume final de 50 mL de extrato. As

amostras foram filtradas com funil e algodão, completando o volume de 50 mL com metanol

70% e armazenadas sob refrigeração (geladeira) até a análise em CLAE.

30

Análise cromatográfica para saponinas triterpênicas

A análise em CLAE foi desenvolvida usando o cromatógrafo (Shimadzu, Sil 10 AF),

com 20 µl de injeção com detector UV (Ultravioleta) (203 nm) e bomba LC-10AT. O ácido

ursólico foi analisado usando a coluna C-18, 4 µm 150 mm x 4,5 mm (Kromasil). A fase

móvel utilizada foi uma mistura de acetonitrila: água (70:30 v/v). A solução foi degaseificada

no ultrasson e filtrada a vácuo com membrana (Millipore, PVDF). O fluxo foi de 1,0 mL min.

O sistema CLAE foi operado a temperatura ambiente (23± 1 ºC).

Análise cromatográfica de metilxantinas e ácido clorogênico

As quantificações foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE). O cromatógrafo (Shimadzu Mod. SLC-20A) foi equipado com injetor (SIL-20AT),

bomba (LC-20 AT), degaseificador (DGU-20AS) e forno (CTO-20AS) mantida a 30ºC. Para

a separação cromatográfica foi utilizada a coluna C18 (Supel LC-18 - 4,6 x 250 mm, 5 µm),

injeção de 20 µl da amostra e uma inferfase (Mod. Shimadzu LC solutions Release 1.22 SP1).

A fase móvel empregada foi um gradiente de (A): água acidificada com 0,3% de ácido acético

(pH 3,0) e (B): metanol. Gradiente: 15% a 20% B em 20 min; 20% a 85% B em 5 min e 85%

B em 5 min. Fluxo de 1,0 mL/min na temperatura constante de 30ºC. A detecção a 325 nm

para o ácido clorogênico e 265 nm para a cafeína e a teobromina num detector ultravioleta

UV-PDA (Photodiode Array) (SPD-20A). As amostras foram injetadas em triplicata e as

áreas dos picos comparadas com padrão de ácido clorogênico, cafeína e teobromina

respectivamente (Sigma Chemical) (Cardozo Junior et al. 2007).

31

Curva de Calibração

O padrão do ácido ursólico foi dissolvido em acetonitrila nas concentrações de 8,75 a

175,0 µg mL. O padrão de cafeína foi dissolvido na fase móvel e a escala foi linear de 0,025 a

0,4 mg/ mL , para a teobromina de 0,05 a 0,4 mg/mL e para o ácido clorogênico de 0,025 a

0,4 mg/mL.

Avaliação da Atividade Antioxidante

Devido à presença de compostos fenólicos na erva-mate, a atividade antioxidante foi

analisada através de duas metodologias com a utilização do DPPH (2,2-difenil-1-

picrilhidrazila).

- Análise Qualitativa em Cromatografia em Camada Delgada

A atividade antioxidante de cada progênie foi avaliada em cromatografia em camada

delgada, com gel de sílica, utilizando DPPH como reagente. Foram preparadas três diluições

de cada progênie em metanol P.A. nas proporções de 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL e 0,5 mg/mL. A

quercetina foi utilizada como substância de referência, dissolvida em metanol (1,5 mg/mL).

Foram aplicados 10 uL de cada diluição das progênies e da substância de referência sobre a

cromatoplacas ( Merck 25 TLC aluminium sheets 20x20 sílica gel 60). Após a evaporação do

solvente a placa foi nebulizada com a solução de DPPH. Após 30 minutos foi realizada a

leitura da placa, em que halos brancos ou amarelados no ponto de aplicação, sobre o fundo

violeta, foram positivos. O ensaio avaliou a capacidade do extrato metanólico da erva-mate

em prevenir a oxidação do DPPH (Souza et al. 2007)

- Análise Quantitativa em solução de DPPH

32

A redução do radical DPPH foi determinada conforme descrito por Schinella et al (2000),

com algumas adaptações. Os extratos metanólicos das progênies de I. paraguariensis foram

analisados através da redução do radical DPPH. Para análise foram realizadas seis diluições

de cada amostra com metanol P.A. nas proporções de 2,0 mg, 1,0 mg, 0,5 mg, 0,250 mg,

0,125 mg e 0,0612 mg/mL. As amostras foram analisadas em espectrofotômetro, na

absorbância de 515 nm após 20 minutos. O potencial de atividade antioxidante foi calculado

em relação à porcentagem de redução da quercetina (0,18mg/mL) utilizada como referência.

As análises foram realizadas em triplicata.

Análise dos Dados

O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com oito

progênies e três blocos. Os dados foram submetidos à análise de variância, e as médias foram

comparadas pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. As estimativas de herdabilidade no

sentido amplo foram obtidas a partir das esperanças dos quadrados médios da análise de

variância, conforme descrito por Cruz e Regazzi (1997). As características avaliadas foram

submetidas à análise de correlação simples (correlação e Pearson). As análises estatísticas

foram realizadas com auxílio do programa Genes (Cruz 2006).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De um total de 51 progênies (Figura 1), foram selecionadas oito para a avaliação dos

compostos fitoquímicos, com base na análise de agrupamento (UPGMA) utilizando dados dos

teores de metilxantinas e de compostos fenólicos, obtidos por Cardozo Junior et al. (2007).

33

DENDOGRAMA

Figura 1 – Análise de agrupamento pelo método UPGMA de 51 progênies de erva-mate, a partir de dados de distância generalizada de Mahalanobis, obtidos a partir da composição de metilxantinas e de compostos fenólicos (Cardozo Junior, 2006). A linha pontilhada horizontal indica o ponto de corte para a formação dos grupos. As progênies selecionadas estão marcadas com um retângulo.

34

Na análise cromatográfica, os cromatogramas dos padrões analisados em CLAE

(PDA) permitiram a análise simultaneamente dos três compostos (cafeína, teobromina e ácido

clorogênico) em comprimentos de ondas diferentes. As saponinas triterpênicas derivadas do

ácido ursólico foram avaliadas em comprimento de onda de 203 nm com o tempo de retenção

(TR) de 16 minutos. A cafeína e a teobromina foram avaliadas a 265 nm com TR de 20 e 7,7

minutos respectivamente e o ácido clorogênico a 325 nm com TR de 15,1 minutos.

A Tabela 1 apresenta a análise de variância para os teores médios de saponinas

triterpênicas derivadas do ácido ursólico, cafeína, teobromina e ácido clorogênico nas oito

progênies analisadas. Os resultados obtidos indicaram variação significativa nos compostos

avaliados entre as oito progênies, exceto para ácido clorogênico pelo teste de F. Mas o teste

de Duncan demonstrou haver variabilidade também nos teores de ácido clorogênico (Tabela

2).

TABELA 1. Resumo da análise de variância e herdabilidade para os teores médios de

saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico, cafeína, teobromina e ácido clorogênico

em oito progênies de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil) e da atividade antioxidante.

Valores expressos em %.

* e ** significativos a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente, pelo teste de F. ns Não significativo.

Progênie Ácido

ursólico Cafeína Teobromina Ácido

Clorogênico

Atividade

Antioxidante

GL 14 14 14 14 14

QMB 0.000006 0.096769 0.24467 0.257996 200.931448

QMT 0.002294* 0.488321** 0.134776* 1.058429 ns 203.792746*

QMR 0.000571 0.106514 0.044657 0.9978 65.726043

h2 75,09% 75,19% 66,87% 52,86% 67,75%

C.V. 52,49% 50,56% 49,98% 17,27% 20,48%

35

TABELA 2. Teores médios de saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico, cafeína, teobromina e ácido clorogênico e atividade antioxidante a 0,5 mg/mL, em oito progênies de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil). Valores expressos em %.

Progênie Ácido ursólico Cafeína Teobromina

Ácido Clorogênico % Inibição

C4 0.043 abc 0.440 bc 0.361 b 1.467 b 34.836 c

F8 0.031 bc 0.230 c 0.515 ab 1.651 ab 50.901 ab

G10 0.068 ab 0.607 bc 0.468 ab 1.365 b 31.251 c

BA25 0.041 abc 0.226 c 0.504 ab 2.031 a 51.406 a

Q65 0.077 a 1.377 a 0.176 b 1.501 b 44.459 abc

W84 0.080 a 1.027 ab 0.177 b 1.344 b 31.276 c

NA121 0.022 c 0.447 bc 0.831 a 1.603 ab 36.877 abc

AR152 0.003 c 0.810 abc 0.350 b 1.401 b 35.633 abc

Médias seguidas pelas mesmas letras em cada coluna, não diferem entre si pelo teste de

Duncan a 5% de probabilidade.

Vários fatores podem influenciar nos teores dos compostos analisados, como parte das

respostas à adaptação ao meio ambiente (Coelho et al. 2002; Da Croce 2002), a diferenças

intra-espécie (Coelho et al.2001), a época de colheita (Reginatto et al. 1999; Coelho et al.

2001; Schubert et al. 2006), a procedência e a variabilidade genética (Sturion et al. 2003;

Cardozo Junior et al. 2007). Os dados de h2 (herdabilidade) (Tabela 2) demonstram que a

variabilidade observada entre as progênies avaliadas neste trabalho apresentam um importante

componente genético. A herdabilidade corresponde à proporção da variabilidade total, que é

de natureza genética. Valores elevados de herdabilidade indicam que o controle genético é

alto e que mudanças no ambiente influenciam pouco no fenótipo (Cardozo Junior 2007).

36

A determinação cromatográfica das saponinas em plantas, ainda é um desafio para

fitoquímica. A quantificação de saponinas triterpênicas em erva-mate é recente, carece de

maior conhecimento e tem despertado interesse devido a suas atividades biológicas. A CLAE

fase reversa utilizada neste trabalho é considerada a melhor técnica e é amplamente utilizada

para determinação de saponinas (Oleszek 2002). No presente trabalho, a variabilidade

observada entre os teores de saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico entre as oito

progênies apresenta elevado componente genético, como pode ser observado pela elevada

herdabilidade (Tabela 1). Gnoatto et al. (2005) obteve teor de saponinas totais na erva-mate

de 352 µg/mL do seu peso seco (p/s) em amostra única. A progênie com menor teor de

saponinas triterpênicas foi a AR152 (0,003%) e a que apresentou o maior teor foi a W84

(0,080%) (Tabela 2). A diferença nos teores máximo e mínimo chega a 0,077%. Os resultados

obtidos são de grande relevância e podem ser um estímulo para novas pesquisas de

melhoramento genético da espécie em relação ao teor de saponinas triterpênicas derivadas do

ácido ursólico, pois pouco se conhece sobre este composto em decorrência da escassez de

literaturas e poucas metodologias de extração, isolamento e quantificação desenvolvidas.

Os teores de metilxantinas da erva-mate são extremamente variáveis dentre as

espécies. A I. paraguariensis apresenta maior teor de cafeína em relação a outras espécies

como a I. brevicuspis, I. theezans, I. microdonta, I. dumos,a I. taubertiana, I. pseudobuxus, I.

integérrima e I. argentina e, diferentes épocas de colheita influenciam na composição deste

fitoquímico (Coelho et al. 2001). Alguns autores afirmam que no mês de julho o teor de

metilxantinas na erva-mate é elevado (Da Croce 2002) enquanto que outros relatam que há

um decréscimo das metilxantinas nesta época do ano, em decorrência de menor biossíntese da

planta (Schubert et al. 2006). No Mato Grosso do Sul o teor de cafeína e teobromina

diminuem de fevereiro a setembro e o inverso acontece no Rio Grande do Sul, que há um

aumento nestes teores (Athayde e Schenkel, 2000).

37

Os teores de cafeína encontrados neste trabalho variaram entre 0,23 % (p/s) na

progênie F8 e 1,38 % na Q65. Estes valores são similares aos encontrados para cafeína (0,25 a

1,66%) por Cardozo Junior (2006) em amostras coletadas no teste de meio-irmãos em Ivaí-PR

em análise combinada de progênies e procedências, o que confirma a grande variabilidade

genética entre estas progênies analisadas. Scherer et al. (2002) encontrou uma diferença

significativa nos teores de cafeína e teobromina em progênies de erva-mate cultivadas em

Missiones-Argentina.

É importante destacar que no presente trabalho, as progênies C4, F8, BA25 e NA121

apresentaram teores muito baixos de cafeína. A seleção de progênies com alto teor de cafeína

e teobromina, responsáveis pelo efeito estimulante e tônico da erva-mate, é um parâmetro

fundamental para desenvolvimento de produtos que buscam estes efeitos. Mas, com o

aumento da procura por produtos descafeinados, a seleção de progênies com baixo teor de

cafeína pode ser uma alternativa aos consumidores tradicionais do chimarrão que apresentam

cardiopatias, problemas de insônia ou ansiedade, agravados pela ação estimulante da cafeína.

Os valores de teobromina obtidos no presente trabalho 0,176% (Q65) a 0,83%

(NA121) se comparam aos valores (0,106 a 0,807%) obtidos por Cardozo Junior (2006) para

as mesmas progênies, confirmando a existência da variabilidade deste composto na erva-mate.

Uma proporção inversa de cafeína e teobromina foram observadas, reforçando resultados

obtidos em outros trabalhos (Cardozo Junior et al., 2007; Gnoatto et al., 2007), quanto maior

o teor de cafeína menor o de teobromina e quanto maior o de teobromina menor o de cafeína,

o que pode ser justificado pelo processo de biossíntese onde ambos os compostos utilizam as

mesmas enzimas

Ressalta-se a importância da seleção de progênies com valores extremos de cafeína e

teobromina em um programa de melhoramento para obtenção de produtos alternativos com as

características químicas de interesse com composição pré-definida.

38

A concentração de ácido clorogênico obtida neste estudo variou de 1,34% a 2,03%

com diferença significativa entre as progênies. Estes valores são próximos aos obtidos por

Filip et al. (2001) de 2,8±3% na I. paraguariensis quando comparadas a outras espécies e

valores similares (1,365% a 2,281%) aos obtidos por Cardozo Junior (2006). No entanto,

neste último trabalho, os teores observados foram mais homogêneos. O ácido clorogênico se

encontra em baixas concentrações na erva-mate (Clifford e Ramirez-Martinez 1990; Filip et

tal. 2001) com predominância de derivados di-cafeoilquínicos (3,4 –DCQ; 3,5-DCQ e 4,5-

DCQ). Entre os compostos analisados neste trabalho o ácido clorogênico foi o que apresentou

um baixo C.V. (coeficiente de variação) (17,27%) na Tabela 1, sugerindo que este composto é

menos dependente das condições ambientais.

Destacam-se, entre as progênies avaliadas, as progênies BA25, F8 e NA121 que

apresentaram um elevado teor de ácido clorogênico em relação as demais, o que justifica a

realização de maiores estudos com estas progênies para se obter clones com alto teor de

antioxidantes relacionados à presença deste composto e que possam diminuir a ação nociva

dos radicais livres.

O radical livre apresenta elétrons não pareados capazes de iniciar reações biológicas

ocasionando dano tecidual e eventos patológicos em organismos vivos. O consumo de plantas

com compostos antioxidantes reduzem o risco de doenças crônicas (Rivelli et al. 2007).

Compostos bioativos como os compostos fenólicos derivados cafeoil e flavonóides

apresentam atividade antioxidante in vivo e in vitro e são completamente absorvidos pelo

organismo (Bastos et al. 2006a; Bastos et al. 2006b, Gugliucci 1996). Apresentam capacidade

inibitória da peroxidação lipídica enzimática e não enzimática (Schinella et al. 2000) e

também atuam sobre a oxidação de LDL (Lipoproteína de baixa densidade) in vitro e in vivo

(Carvalho et al., 2001) e como agentes protetores contra doenças cardiovasculares,

gastrintestinais, câncer de pele e proliferação de fungos (Soares 2002; Schinella et al. 2005).

39

Saldanha (2005) destacou que extratos de erva-mate (I. paraguariensis) verde e

tostada e chá verde (Camellia sinensis) apresentaram elevada atividade antioxidante, devido à

presença de flavonóides e ácidos fenólicos, este último composto pode ser encontrado na

forma natural, ligada entre si ou com outros compostos, como o ácido caféico que se associa

com o ácido quínico e dá origem ao ácido clorogênico (Soares 2002).

Rivelli et al. (2007) observou que a presença do ácido clorogênico no extrato de erva-

mate apresentou atividade antioxidante e que mais estudos serão necessários para avaliar o

sinergismo desta atividade com os outros compostos como os ácidos 3-5 e 4-5

dicafeoilquínico. Bastos et al. (2007) observou no extrato aquoso e etanólico da erva-mate e

do chá verde uma excelente atividade antioxidante (>89%), mesmos os extratos etanólicos

com os mais baixos índices de compostos fenólicos apresentaram uma elevada atividade

antioxidante.

Enfatiza-se a importância na seleção de progênies de erva-mate com alto teor de

compostos antioxidantes para formação de pomar clonal capaz de resultar em um produto

com maior benefício ao sistema de defesa do organismo dos consumidores (Borille 2004).

Os programas de melhoramento genético da erva-mate têm o interesse voltado à

produção de biomassa foliar (Costa et al.2005; Resende et al. 2000; Simeão et al. 2002;

Sturion et al. 2003, Borille 2004). Mas, recentemente estimativas de parâmetros genéticos tem

sido empregados para conhecer o potencial fitoquímico da planta para seleção de progênies

que apresentem teores de compostos que atendam ao setor comercial e industrial.

As estimativas da herdabilidade para os teores de cafeína (75,19%), teobromina

(66,87%), ácido clorogênico (52,86%) e saponinas (75,09%) para as progênies de I.

paraguariensis analisadas confirmaram que o fator genético é relevante na variabilidade dos

compostos fitoquímicos, nestas progênies. Estimativas elevadas de herdabilidade para os

teores de cafeína, taninos e polifenóis também foram obtidos por et al. (2004). Cardozo Júnior

40

(2006) obteve estimativas de herdabilidade no sentido restrito de 60% para teores de cafeína,

57% para teobromina 23% para ácido clorogênico e 18% para ácido caféico.

As progênies de erva-mate analisadas por Scherer et al (2002) na Argentina

apresentaram elevada herdabilidade de (h2ns (sentido restrito) 83% e h2bs (sentido amplo)

94%) para cafeína e o inverso para (h2ns 31% e h2bs 77%) teobromina. Valores compatíveis

aos de saponinas (h2ns 59% e h2bs 86%) encontradas pelos mesmos autores (Scherer et al.

2003). Estes resultados indicam que é possível modificar os teores de cafeína, teobromina e

saponinas através de estratégias de seleção com intuito de melhorar o teor do composto de

interesse.

Estes elevados valores de herdabilidade indicam que é possível obter ganhos por

seleção inter e intra-progênies nos programas de melhoramento genético da erva-mate. A

variabilidade observada entre as progênies, associada à alta herdabilidade das características,

indicam que é possível obter progênies com uma composição mais adequada destes

fitoquímicos, o que resultará em um produto com mais benefícios à saúde dos seus

consumidores. Além disso, estas progênies podem ser utilizadas como matéria-prima para a

purificação destes compostos e utilização terapêutica.

Na Tabela 3 estão apresentados os coeficientes de correlação entre as características

avaliadas. Observa-se a correlação negativa (-0,58) e significativa entre os teores de cafeína

com ácido clorogênico e teobromina. Esta observação confirma os dados obtidos por Cardozo

Junior et al. (2007) e Gnoatto et al. (2007), que observaram que as progênies com alto teor de

cafeína, apresentam baixo teor de teobromina o que pode ser justificado pelo processo de

biossíntese onde ambos os compostos utilizam as mesmas enzimas, produzindo maior

quantidade de cafeína ou teobromina conforme a necessidade da planta. A teobromina

também é negativamente correlacionada com saponinas (-0,55), enquanto que com o ácido

clorogênico apresentam correlação positiva (0,43). Os resultados indicam que o aumento

41

simultâneo dos teores de teobromina com saponinas e cafeína deve ser dificultado nos

programas de melhoramento genético. Também deverá haver mais dificuldades para o

aumento simultâneo dos teores de cafeína e ácido clorogênico, enquanto que o acúmulo

simultâneo de teobromina e ácido clorogênico deverá ser facilitado.

TABELA 3. Correlação entre as saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico, cafeína,

teobromina, ácido clorogênico e atividade antioxidante em oito progênies de erva-mate (Ilex

paraguariensis St. Hil.)

Significativos a 5% de probabilidade pelo teste de t.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Sr. Afonso Oliszeski e ao Engenheiro agrônomo Dalnei Neiverth da

empresa Neiverth Filhos & Cia Ltda. – Chimarrão Bitumirim – de Ivaí – PR; ao Dr. José

Alfredo Sturion – EMBRAPA Florestas; a Dra. Carmem Maria Donaduzzi – PRATI

DONADUZZI & Cia Ltda – de Toledo-PR e a UNIPAR – Universidade Paranaense - de

Umuarama-PR e Toledo-PR. Pela disponibilidade, apoio e colaboração imprescindíveis no

desenvolvimento deste trabalho e ao grande incentivo as pesquisas.

Saponinas Cafeína Teobromina Ácido Clorogênico

% Atividade Antioxidante

Saponinas 1,00

Cafeína 0,38 1,00

Teobromina -0,55* -0,58* 1,00

Àcido clorogênico

-0,14 -0,43* 0,43* 1,00

% Atividade Antioxidante

0,00 0,23 -0,01 0,36 1,00

42

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46

Influência da temperatura em métodos extrativos para as

metilxantinas e compostos fenólicos em erva-mate

(Ilex paraguariensis St. Hil.)


47

Influência da temperatura em métodos extrativos para as metilxantinas e compostos fenólicos em erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.)


RESUMO: A erva-mate (Ilex paraguariensis St.Hil) é uma planta nativa do Sul do

Brasil, Paraguai e Argentina, utilizada no preparo do chimarrão e tererê, bebidas

muito populares da América do Sul. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência

da temperatura no processo de extração de metilxantinas (cafeína e teobromina) e

compostos fenólicos (ácido clorogênico e ácido caféico) por remaceração e refluxo.

As vinte e quatro amostras foram extraídas pelos dois métodos avaliados e

analisados por CLAE. Os resultados demonstraram uma influência significativa da

temperatura entre os métodos de remaceração e refluxo. Foi observado elevado teor

de ácido clorogênico e teobromina no processo de remaceração e menor teor de

cafeína e ácido caféico em relação ao processo por refluxo. Conclui-se com este

trabalho que no processo extrativo a influência da temperatura deve ser

considerada. Destaca-se a necessidade em se desenvolver métodos extrativos de

forma individual para cada composto.

Palavras-chave: Aquifoliaceae, cafeína, teobromina, ácido clorogênico, ácido

caféico.

48

ABSTRACT: Temperature influence in the extractive methods for

methylxanthines and phenolic compounds of Maté (Ilex paraguariensis St. Hil).

Maté (Ilex paraguariensis St. Hil) is a native plant from the South of Brazil, Paraguay

and Argentine used to prepare chimarrão and tererê and they are considered the

very popular drinks in South America. The objective of this work was to evaluate the

influence of temperature in the process of extraction phenolic compounds

(chlorogenic acid and caffeic acid) and methylxanthines (caffeine and theobromine)

by remaceration and reflux. The 24 samples were extracted by both evaluated

methods and analyzed by CLAE. The results showed a significant influence of

temperature between the methods of remaceration and reflux. A high content of

chlorogenic acid and theobromine was observed in the process of remaceration and

a lower content of caffeine and caffeic acid in relation to the process by reflux. In this

work was concluded that in an extractive process the influence of temperature must

be considered. It’s necessary to develop extractive methods of individual standard for

each compound.

Key words: Aquifoliaceae caffeine, theobromine, chlorogenic acid, caffeic acid.

49

Introdução

A Ilex paraguariensis St. Hil pertence à família Aquifoliaceae é popularmente

conhecida por erva-mate. É utilizada em infusões denominadas tererê no Paraguai e

Mato Grosso e o chimarrão nos estados do sul do Brasil. Estas são consideradas

bebidas muito populares na América do Sul (Reginatto et al., 1999; Borille, 2004;

Schinella et al., 2005).

Os maiores produtores de erva-mate são Brasil, Argentina e Paraguai. A

produção mundial de mate por extrativismo ou cultivo é de aproximadamente

1.000.000 toneladas por ano com um grande significado cultural, social e econômico

em toda América do Sul, pois é realizado por um grande número de pequenos

produtores e pelas próprias ervateiras (Taketa et al., 2004; Costa et al., 2005).

Aproximadamente 30% da população da América do Sul consomem mais de

um litro/dia de alguma destas bebidas comprovando seu consumo e, portanto,

grande valor econômico. O Brasil é considerado o segundo maior produtor mundial

de erva-mate sendo o estado do Paraná o maior produtor nacional (Neumann,

2000). A produção de erva-mate cancheada em 2006 (IBGE, 2006) foi de 233.360

toneladas, sendo 232.931 t produzidas no Sul do Brasil e 152.971 t no Estado do

Paraná.

Apesar do chimarrão ser a forma mais comum de consumo, devido a grande

diversidade de compostos fitoquímicos a I. paraguariensis pode ser considerada

fonte de matéria-prima capaz de suprir várias ramificações do setor industrial como

de insumos alimentícios, cosméticos, bebidas, produtos farmacêuticos e fitoterápicos

(Jacques et al., 2007).

50


metilxantinas, fenóis e ácidos fenólicos, aminoácidos e outros compostos

nitrogenados, ácidos graxos, antocianinas, flavonóides, compostos terpênicos,

alcanos e álcoois, carboidratos e carotenóides (Alikaridis, 1987), taninos, trigonelina,

vitaminas como a B1 (thiamine), B2 (riboflavin), B5 (ácido pantotênico), C, E, β-

caroteno, sucrose, frutose e cholina (Gugliucci; Stahl, 1995) cafearina, ácido

matetânico, ácido fólico, ácido virídico, clorofila, colesterina, óleos essenciais (Da

Croce, 2002).

De acordo com a literatura, o teor de metilxantinas na erva-mate é

extremamente variável. O teor de cafeína, considerada uma das principais

metilxantinas, pode variar de 0,16 a 1,4% (Reginatto et al., 1999). Devido a uma

controvérsia em relação ao teor mínimo de cafeína nos produtos, a legislação que

exigia o teor mínimo de 0,5% foi revogada, o que pode estar relacionado com a

variabilidade das populações de planta de I. paraguariensis, mas também ao método

de extração aplicado na sua determinação (Gnoatto et al., 2007).

Outros compostos da erva-mate de grande importância são os compostos

fenólicos que contribuem para o sabor, odor e coloração. Como os compostos

fenólicos são altamente reativos e oxidáveis, tanto por enzimas, metais, calor e pela

luz, exigem cuidados no processo de extração nas plantas. Dentre os compostos

fenólicos, os derivados do ácido cinâmico podem se isomerizar em solução aquosa

sob influência da luz UV, pHs extremos e altas temperaturas (Carvalho et al., 2001).

Filip et al. (2001) verificaram para I. paraguariensis a presença dos derivados

do ácido cinâmico, o ácido clorogênico (ácido 5-cafeoilquínico), ácido caféico, ácido

3,4-dicafeoilquínico, ácido 3,5-dicafeoilquínico e ácido 4,5-dicafeoilquínico e Bastos

et al. (2007) com ESI-MS (electrospray ionisation mass spectrometry) identificou no

51

extrato aquoso e etanólico da erva-mate verde o ácido caféico, ácido quínico, glicose

de cafeoil, ácido cafeoilquínico, ácido feruloilquínico, ácido dicafeoilquínico e rutina e

após o a amostra ser tostada, foi observado o ácido cafeoilchiquímico e o ácido

dicafeoilchimiquímico.

A análise de compostos fenólicos de sete espécies de Ilex mostrou que a I.

paraguariensis apresenta a maior concentração de flavonóides e derivados cafeoil o

que sustenta a grande propriedade biológica e terapêutica como ação colerética e

hipocolesterolêmico de sua atividade antioxidante (Filip et al., 2000; Filip et al.,

2001). Essas evidências têm sugerido que doenças causadas pelas reações

oxidativas em sistemas biológicos podem ser retardadas pela ingestão de

antioxidantes naturais na dieta, principalmente os compostos fenólicos (Carvalho et

al., 2001). O que demonstra a importância do consumo de erva-mate para a saúde

humana e melhor qualidade de vida.

Pesquisas sobre a diversidade genética, variabilidade intra e inter populações

ou outros fatores que possam influenciar no teor dos compostos, como a

luminosidade, época de colheita, tipo de solo, localização geográfica, adubação,

suplemento de água, são importantes em um programa de melhoramento da planta,

além de se obter maior quantidade e melhor qualidade dos produtos (Coelho et al,

2001; Coelho et al, 2002; Reginatto et al., 1999; Cardozo Junior et al., 2007).

Enfatiza-se que além de todas estas variáveis ambientais, um processo

extrativo adequado e eficiente é primordial, o que torna a pesquisa mais fidedigna.

Os dados apresentados na literatura de compostos fitoquímicos não permitem

comparações em vista da grande diversidade de metodologias empregadas para

extração e quantificação destes metabólitos (Schubert et al., 2006).

52

Os extratos de plantas são misturas complexas de compostos orgânicos,

sendo necessárias técnicas de fracionamento apropriadas que permitam uma

melhor análise individual de seus compostos (Jacques et al., 2007). Esta otimização

e padronização nos processos extrativos para cada composto, analisando vários

parâmetros capazes de influenciar no produto final é essencial para avaliação do

teor total de cada composto na planta.

O processo extrativo eficiente é necessário em um processo de seleção das

melhores plantas e permite obter um produto final de qualidade sem interferentes de

degradação, atendendo de forma satisfatório o setor comercial e industrial.

Em decorrência desta busca em estabelecer os melhores parâmetros para

cada composto, este trabalho avaliou a influência da temperatura na extração de

algumas metilxantinas e compostos fenólicos pelos processos de refluxo e

remaceração.

Materiais e métodos

Local de coleta

O material vegetal da erva-mate (I. paraguariensis) foi coletado na Unidade

experimental da EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) em Ivaí

– PR em julho 2007, localizada na Fazenda Vila Nova da Ervateira Bitumirim.

53

Coleta e acondicionamento

Foram coletados os ramos com folhas na parte mediana das árvores, todas

na direção leste. As amostras foram acondicionadas em sacos de papel craft

devidamente identificados e transportadas ao laboratório para processamento e

análise. As amostras coletadas passaram por um processo de seleção, onde foram

selecionadas as folhas mais íntegras, coloração uniforme, sem presença de fungos

ou sujidades.

Processamento

As folhas selecionadas foram submetidas ao processo de inativação de

enzimas (branqueamento) onde foram submersas em água fervente (100 ºC) por 5

segundos, passando em seguida pelo processo de pré-secagem em centrífuga

manual para retirada do excesso de água e resfriadas por ventilação. Estas folhas

foram secas em estufa com circulação de ar a 45 ºC, durante 48 horas. Após este

tempo foram trituradas com liquidificador (5 pulsos), identificadas e acondicionadas

em vidro âmbar, lacradas e armazenadas em geladeira.

Extração por Refluxo

Para obter o extrato de erva-mate foi utilizado um sistema de refluxo com 1,0

g da amostra em metanol 70% (5 x 50 ml) por 20 minutos cada 50 mL, obtendo um

produto final de 250 mL. A temperatura foi controlada em torno de 80 °C, com

tolerância de variação de 10 % acima ou abaixo (72 a 88 °C)

O extrato foi tratado com Reagente de Carrez (precipitação de proteínas) na

proporção de 2 mL do reagente A (21,9 g de acetato de zinco di-hidratado (2H2O)

54

em 100 mL água destilada contendo 3 g de ácido acético glacial) e 2 mL do reagente

B (10,6 g de ferrocianeto de potássio tri-hidratado (3H2O) em 100 mL de água

destilada) e filtrado a vácuo (Whatman nº 4) com funil de Buchner sob pressão

reduzida (Clifford & Ramirez, 1990).

Extração por remaceração

Uma grama da amostra de folhas secas e trituradas foram colocadas em vidro

âmbar com 10 mL de metanol 70% (5x10 mL). Em dias alternados foi retirado o

sobrenadante e acrescentado mais 10 mL de metanol 70%, obtendo um volume final

de 50 mL de extrato. A amostra foi filtrada com funil e algodão, completando o

volume de 50 mL com metanol 70% e armazenada sob refrigeração (geladeira) até a

análise em CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência) (Cardozo Junior et al.,

2007). Todas as etapas foram conduzidas em temperatura ambiente (23 °C± 2).

Análise Cromatográfica

A quantificação das metilxantinas e compostos fenólicos foram realizados

por CLAE. O cromatógrafo Shimadzu Mod. SLC-20A foi equipado com injetor SIL-

20AT, bomba LC-20 AT, degaseificador DGU-20AS e forno CTO-20AS mantido a

30ºC. Para a separação cromatográfica foi utilizada a coluna C18 (Supel LC-18 - 4,6

x 250 mm, 5 µm), injeção de 20 µl da amostra e uma inferfase (Mod. Shimadzu LC

solutions Release 1.22 SP1). A fase móvel empregada foi um gradiente de (A): água

acidificada com 0,3% de ácido acético (pH 3,0) e (B): metanol. Gradiente: 15%-20%

B em 20 min; 20%-85% B em 5 min e 85% B em 5 min. Foram utilizados solventes

com grau HPLC (J.T.Backer e Merck). Fluxo de 1,0 mL/min na temperatura

55

constante de 30ºC. A detecção das metilxantinas foi realizada no comprimento de

onda de 265 nm e de compostos fenólicos a 325 nm com detector ultravioleta UV-

PDA (Photodiode Array) (SPD-20A). As amostras foram injetadas em triplicata e as

áreas dos picos comparadas com padrão de cafeína TR (tempo de retenção) =20,1

min.), teobromina (TR=7,5 min.) e ácido clorogênico (TR=15,8 min.) e ácido caféico

(TR=20,3 min.) (Sigma Chemical) (Cardozo Junior et al., 2007).

Curva de Calibração

A Curva de calibração foi efetuada com o padrão após diluição na fase móvel

(água acidificada 0,3%: Metanol 85:15 v/v). Após a injeção do padrão, a área do pico

foi avaliada. As curvas de calibração para a cafeína, ácido clorogênico e ácido

caféico foram lineares na escala de 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 mg/mL (r2= 0, 9992

para cafeína, r2= 0, 9995 para ácido clorogênico e r2=1 para o ácido caféico ). A

curva de calibração para a teobromina foi linear na escala de 0,05; 0,075; 0,1; 0,2;

0,4 mg/mL (r2= 1). As áreas dos picos correspondentes a cafeína, teobromina, ácido

clorogênico e ácido caféico foram analisadas e as concentrações calculadas por

meio das correspondentes curvas padrão (y=ax+b, onde y representa à área do pico

e x a concentração do composto analisado). Análise realizada em triplicata.

Análise dos dados

Os dados foram submetidos à análise de variância, e as médias comparadas pelo

teste de Duncan, a 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas

com auxílio do programa Genes (Cruz 2006).

56

Resultados e discussão

Entre os diversos compostos presentes na I. paraguariensis, pode se destacar

a presença das metilxantinas (cafeína e teobromina) e os compostos fenólicos

derivados cafeoil (ácido clorogênico e ácido caféico), os quais são associados a

algumas atividades biológicas e sensoriais do mate (Schubert et al., 2006; Cardozo

Junior et al., 2007).

Os cromatogramas dos padrões analisados em CLAE (PDA) permitiram a

análise simultânea dos quatro compostos em dois comprimentos de ondas

diferentes. O ácido clorogênico e o ácido caféico foram avaliados no comprimento de

onda a 325 nm. A teobromina e a cafeína avaliadas a 265 nm. A Figura 1 apresenta

o perfil cromatográfico dos padrões utilizados neste trabalho.

(A) (B)

57

(C) (D)

Figura 1. Perfil cromatográfico dos padrões de (A) cafeína, (B) teobromina, (C) ácido

clorogênico e (D) ácido caféico.

As 24 amostras extraídas pelo processo de refluxo e por remaceração

apresentaram perfil cromatográfico similar intra-processo e muito diferentes inter-

processos. A Figura 2 apresenta o perfil cromatográfico da amostra G10B3A3.

(A) (B)

58

(C) (D)

Figura 2. Perfil cromatográfico da amostra de uma progênie extraído pelo processo

de remaceração (teobromina/cafeína) (A) e por refluxo (teobromina/cafeína) (B)

remaceração (ácido clorogênico) (C) e refluxo (ácido clorogênico/ácido caféico) (D).

As análises dos cromatogramas são esclarecedoras e permitem diferenciar

visualmente todas as alterações que ocorrem nas áreas dos compostos analisados.

Para teobromina extraída por remaceracão (Figura 2A) observa-se um pico

relativamente maior que aquela extraída por refluxo (Figura 2B). O que pode ser

justificado pela diferença significativa observada na média do teor do composto na

tabela 1. O inverso acontece com a cafeína que apresenta maior área na extração

por refluxo (Figura 2B), entretanto sem diferença estatisticamente significativa.

59

TABELA 1. Teor médio de cafeína, teobromina, ácido clorogênico e ácido caféico em

extrato de erva-mate (Ilex paraguariensis) obtido por dois métodos de extração.

Valores expressos em %. Os valores apresentados são as médias de oito progênies

de erva-mate (Ilex paraguariensis) coletadas em três blocos distintos (n=24).

Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si, pelo teste de F a 5% de

probabilidade.

Em relação ao ácido clorogênico a Tabela 1 apresenta um teor elevado no

processo por remaceracão (1,54%) muito superior ao teor obtido pelo método de

refluxo (0,47%). Esta diferença pode ser observada na figura (2D) onde o pico do

acido clorogênico se encontra menor que o do isoclorogênico (TR=18min). Um

possível rearranjo estrutural do ácido clorogênico para isoclorogênico foi descartado,

pois não houve um acréscimo nas áreas do isoclorogênico proporcional ao

decréscimo do ácido clorogênico. Porém um rearranjo parcial desta molécula para

acido caféico pode ser considerado.

A figura 3 apresenta as estruturas químicas do ácido clorogênico e do ácido

caféico, o que justificaria um rearranjo estrutural por influências de variáveis nas

metodologias, como a temperatura.

Cafeína Teobromina Ácido

clorogênico

Ácido

Caféico

Refluxo 0,64 a 0,42 a 0,47 a 0,04 a

Remaceração 0,45 a 0,87 b 1,54 b -

60

(A) (B)

Figura 3. Estrutura química do ácido clorogênico (A) e ácido caféico (B).

A busca de um método de extração mais fácil, prático e eficiente é um

processo constante nas avaliações de compostos fitoquímicos, onde vários

parâmetros devem ser observados.

No presente trabalho, pode-se observar que as diferenças nos valores

médios dos teores de cafeína entre o processo de refluxo (0,64%) e de remaceração

(0,45%) não foram significativas. O teor de cafeína (0,56%) de amostras

remaceradas, coletadas no mesmo local deste trabalho (Ivaí-PR) por Cardozo Junior

et al. (2007) são similares aos obtidos neste trabalho.

A diferença no teor de cafeína, apesar de não ter sido significativa entre os

dois processos, pode estar relacionada com a temperatura utilizada no processo de

extração, que atuaria sobre a complexação da cafeína e também ocasionaria o

aumento na solubilidade, já que a cafeína estaria na forma livre e mais solúvel

(Gnoatto et al., 2007).

Reginatto et al. (1999) obtiveram teor de cafeína de 0,64% utilizando

aquecimento por 10 minutos da amostra no processo de extração e Gnoatto et al.

(2007) obtiveram teor de 0,67% utilizando extração por decocção, que se mostrou

61

mais eficiente que extração por soxhlet quando não se utiliza o ácido sulfúrico. Este

rendimento pode estar relacionado ao aumento da temperatura na decocção

segundo a autora.

Pesquisas com o teor de cafeína (2,7 g%) do café solúvel apresentaram

grande estabilidade térmica da cafeína no processo de torrefação, mesmo em

temperaturas elevadas (Nogueira et al., 2003). Esta estabilidade térmica poderia

justificar a integridade da cafeína no processo extrativo com utilização de altas

temperaturas.

Apesar da teobromina também ser uma metilxantina, o seu teor sofreu maior

alteração pelo método de extração utilizado do que a cafeína. No processo de

extração por remaceração o teor encontrado foi o dobro (0,81%) do observado na

extração por refluxo (0,42%) (Tabela 1). Os teores de teobromina obtidos em ambos

os processos são muito superiores aos encontrados na literatura. Cardozo Junior et

al. (2007) obtiveram 0,13% de teobromina em amostras de erva-mate com

procedência em Ivaí-PR e Reginatto et al. (1999) obtiveram teor de 0,12% de

teobromina na I. paraguariensis, quando comparadas as outras espécies de Ilex.

Gnoatto et al. (2007) obtiveram um rendimento maior da teobromina (0,51%) e

cafeína (0,71%), justificado pela pré-acidificação que provoca descomplexação e

protonação das metilxantinas e aumento da solubilidade em água.

Schubert et al. (2006) compararam vários parâmetros em relação às

metilxantinas entre elas a solubilidade, que foi diferenciada em relação à cafeína (1

em 60 mL de água), teobromina (1 em 2.000 mL) e teofilina (1 em 120 mL).

Demonstrando que mesmo dentro de um grupo, cada metilxantina apresenta suas

características próprias (Rates, 2001). Gnoatto et al. (2007) afirmam que baixos

62

teores de teobromina encontrados em alguns trabalhos poderiam ser, em parte,

devido a processos extrativos adequados a cafeína e não a teobromina.

A diferença significativa observada nos teores de ácido clorogênico entre os

dois processos foi observada em todas as 24 amostras de erva-mate analisadas,

tendo como variável apenas o processo extrativo. É possível que esta variação

observada se deva principalmente a temperatura utilizada no processo de refluxo.

Nogueira et al. (2003), analisaram o teor de ácido clorogênico (0,6 a 5,9g%.),

cafeína (2,7g%) e trigonelina (0,3 a 1,0g%) do café solúvel. Segundo a autora as

amostras com baixo teor de ácido clorogênico foram provavelmente aquelas obtidas

de grãos submetidos à torrefação intensa. Bastos et al. (2007) obtiveram menor teor

de compostos fenólicos no mate tostado em relação ao mate verde. Já Cardozo et

al. (2006) obteve um teor de fenóis 47% superior utilizando o vapor superaquecido

no processo de secagem das folhas em relação as folhas secas ao ar quente. Isso

indica que a temperatura pode interferir nos teor do composto independente da fase

de processamento.

Outras pesquisas têm sido desenvolvidas em busca de um método extrativo

eficiente como a sonicação e maceração (Jacques et al., 2007); sonicação e refluxo

(Lago et al., 2007), sublimação e extração por fluído supercrítico (EFSC) (Rates,

2001); extração convencional e EFSC (Cardozo et al, 2006); extração a frio e soxhlet

(Furlong et al., 2003). Outros parâmetros também são considerados como solvente,

temperatura e tempo de extração (Jacques et al., 2007), alcalinização ou

acidificação (Gnoatto et al., 2007).

Devido à variabilidade de compostos presentes na erva-mate se faz

necessário pesquisas relacionadas às variáveis metodológicas a cada composto

respeitando suas características individuais.

63

Conclusão

A temperatura demonstrou exercer uma forte influência nos teores de ácido

clorogênico, ácido caféico e teobromina em processos extrativos da erva-mate.

No método de extração por remaceracão em temperatura ambiente, foram

obtidos maiores teores de ácido clorogênico e teobromina.

Processos extrativos envolvendo aumento da temperatura foram mais

eficazes com relação à cafeína e o acido caféico sendo o último somente detectado

na técnica de extração por refluxo.

Estes dados demonstram a necessidade de estudos individualizados para a

extração de diferentes compostos presentes na erva-mate.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Sr. Afonso Oliszeski e ao Engenheiro agrônomo Dalnei

Neiverth da empresa Neiverth Filhos & Cia Ltda. – Chimarrão Bitumirim – de Ivaí –

PR; ao Dr. José Alfredo Sturion – EMBRAPA Florestas; a Dra. Carmem Maria

Donaduzzi – PRATI DONADUZZI & Cia Ltda – de Toledo-PR e a UNIPAR –

Universidade Paranaense - de Umuarama-PR e Toledo-PR. Pela disponibilidade,

apoio e colaboração imprescindíveis no desenvolvimento deste trabalho e ao grande

incentivo as pesquisas científicas.

64

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67

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O trabalho teve como objetivos avaliar os parâmetros genéticos nos teores

dos compostos fitoquímicos da erva mate (Ilex paraguariensis St. Hil.), saponinas

triterpênicas, as metilxantinas, os compostos fenólicos e a atividade antioxidante, e

analisar a influência dos métodos extrativos de remaceração e refluxo nos teores de

cafeína, teobromina, ácido clorogênico e ácido caféico.

Para o desenvolvimento do trabalho, oito progênies de erva-mate coletadas

em três blocos, foram analisadas em relação aos teores de saponinas triterpênicas

derivados do ácido ursólico, ácido clorogênico, cafeína e teobromina. As análises

realizadas por CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência) demonstraram

diferenças significativas nos teores de todos estes compostos, entre as progênies

avaliadas.

Os resultados indicaram importante componente genético na variabilidade

observada. A obtenção de progênies com teores aprimorados de seus compostos,

melhora a qualidade do produto final, atendendo as exigências cada vez maiores do

mercado comercial e industrial.

A influência genética nos teores dos compostos fitoquímicos da Ilex

paraguariensis St. Hil. através das estimativas de herdabilidade no sentido amplo

para todos os compostos foram elevadas, o que indica possibilidade de ganhos por

seleção nos programas de melhoramento genético de plantas para as características

de interesse.

A análise de correlação entre os compostos analisados indicaram a existência

de correlação negativa de teobromina com cafeína e saponinas, correlação negativa

de cafeína com ácido clorogênico, e correlação positiva de ácido clorogênico com

teobromina e com a atividade antioxidante da Ilex paraguariensis St. Hil. Os

resultados demonstram que estratégias de seleção para progênies que apresentem

teor elevado de ácido clorogênico, podem proporcionar melhor qualidade de vida

aos consumidores, devido à atividade antioxidante atribuída a este composto.

As análises realizadas com equipamentos modernos e precisos como a CLAE

- PDA (Photodiode Array) proporcionam uma varredura em vários comprimentos de

onda de forma simultânea, o que permite selecionar o comprimento de onda com

68

maior absorbância e detecção para os compostos, tornando as análises mais

fidedignas.

Através de análises em CLAE foi observada uma diferença significativa nos

teores de teobromina e ácido clorogênico entre os métodos de remaceração e

refluxo, o que podem ser justificados pela diferença de temperatura utilizada em

ambos os processos. Fica evidente a necessidade de pesquisas em relação ao

método extrativo eficiente para cada composto respeitando suas características

individuais e observando outros parâmetros que podem influenciar no resultado final.

69

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SCHENKEL, E. P., GOSMANN, G.,ATHAYDE, M. L., Saponinas. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: Da planta ao Medicamento, 3º ed., Porto Alegre, ed. UFSC, 2001. p.607-621. SCHINELLA, G. R.,FANTINELLI, J. C., MOSCA, S. M. Cardioprotective effects of Ilex paraguariensis extract: evidence for a nitric oxide-dependent mechanism. Clinical Nutrition, v. 24, n.3, p. 360-366, 2005. SCHUBERT, A., ZANIN, F. F., PEREIRA, D. F., ATHAYDE, M. L. Variação anual de metilxantinas totais em amostra de Ilex paraguariensis St. Hil. (Erva-mate) em Ijuí e Santa Maria, Estado do Rio Grande do Sul. Química Nova, v.29, n.6, p.1233-1236, 2006. SOARES, S. E. Ácidos fenólicos como antioxidantes. Revista de Nutrição, Campinas, v.15, n.1, jan. 2002. TAKETA, A. T. C., BREITMAIER, E.; SCHENKEL, E. P. Triterpenes and triterpenoidal glycosides from the fruits of Ilex paraguariensis (Mate). Journal of the Brazilian Chemical Society, v.15, n.2. p.205-211,2004.

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APÊNDICE

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CBAB - CROP BREEDING AND APPLIED BIOTECHNOLOGY

Instruções aos Autores

Política geral e escopo da revista

A CBAB - CROP BREEDING AND APPLIED BIOTECHNOLOGY (ISSN 1518-7853) - é a revista trimestral oficial da Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas (http://www.sbmp.org.br). O nome internacional abreviado é CROP BREED APPL BIOTECHNOL. A revista está indexada no AGRIS da FAO, CAB International Abstracts, Periódica, Scopus, Chemical Abstracts Service, Agrobase and Acervo Documental da Embrapa e destina-se à publicação de artigos científicos originais que possam contribuir para o desenvolvimento científico e tecnológico do melhoramento e da agricultura. Os artigos deverão contemplar as pesquisas básica e aplicada em melhoramento de plantas perenes e anuais, nas áreas de genética, conservação de germoplasma, biotecnologia, genômica, citogenética, estatística experimental, sementes, qualidade de alimentos, estresse biótico e abiótico, e áreas correlatas. O artigo deve ser inédito, sendo vetada a submissão do mesmo a outro periódico. As opiniões e conceitos emitidos são de exclusiva responsabilidade dos autores, não refletindo necessariamente as idéias da Editoria. A Editoria, porém se reserva o direito de sugerir ou solicitar as modificações que se fizerem necessárias. A reprodução completa ou parcial dos artigos é permitida, desde que citada a fonte.

Informação para aquisição

Para associar-se à Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas ou adquirir exemplares avulsos da CBAB envie e-mail para [email protected]

Artigo A CBAB publica artigo exclusivamente em inglês, porém faculta ao autor a possibilidade de submetê-lo em português para, após o aceite, providenciar a sua tradução. O ônus da tradução é de responsabilidade do autor, porém a CBAB http://www.sbmp.org.br/cbab/index.htm, clicando Submission. O sistema de gerenciamento de artigos solicitará o e-mail do autor correspondente e a geração de uma senha. Os manuscritos deverão ser inseridos sem os nomes dos autores e seus endereços, os quais deverão ser disponibilizados em um formulário à parte. Com seu e-mail e sua senha pessoal, o autor poderá acompanhar toda a tramitação do seu artigo. A avaliação do artigo será feita por revisores ad hoc especialistas, para auxiliar a Editoria quanto à decisão final de aceite, modificações ou rejeição do mesmo. Ao autor responsável pelo artigo será fornecido, gratuitamente, um exemplar da revista. Separatas serão fornecidas a preço de custo pelo e-mail [email protected]. O artigo completo deverá conter, preferencialmente, a seguinte sequência: title, abstract, key words, introduction, material and methods, results and discussion, acknowledgements, título, resumo, palavras-chave, references, and tables and black-and-white figures. Ilustrações coloridas serão permitidas, porém com ônus para o autor correspondente. A digitação deverá ser feita em Word for Windows versão 6.0 em diante, em fonte times new roman, tamanho 12, espaçamento duplo, formato A4, com margens de 20 mm e paginação consecutiva no topo à direita. O artigo não deverá exceder a 18 páginas, incluindo tabelas e figuras digitadas em páginas separadas (uma por página) ao final do texto. O Título deverá ser claro, conciso e refletir a essência do artigo. Escrito com a inicial maiúscula e posto a esquerda, não deve conter mais de 15 palavras digitadas em times new roman 14, bold. O Abstract, tanto quanto o Resumo, não deve exceder a 150 palavras. Um máximo de cinco palavras-chave (key words) será permitido. A introdução deve incluir uma breve revisão de literatura sobre o tema e os

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objetivos da pesquisa. O Material e Método deve ser redigido de modo que outro pesquisador possa repetir a experiência. Preferencialmente, Resultados e Discussão devem ser apresentados em conjunto, para maior dinâmica de leitura. Os agradecimentos devem ser suscintos, limitados a colaboradores efetivos e agências financiadoras. O Resumo deve ser precedido do título do artigo em português. Cuidado com as Referências. Não citar resumos de eventos e nem artigos não publicados. Citar preferencialmente o artigo de tese, ao invés da própria tese. Esses cuidados darão maior credibilidade ao artigo e a revista. As citações feitas no texto pelo sobrenome do autor e ano (por exemplo, Liu 1998, Pereira and Amaral Júnior 2001, William et al. 1990) deverão ser ordenadas alfabeticamente no item Referências, seguindo os exemplos abaixo:

Artigos em periódicos: Pereira MG and Amaral Júnior AT (2001) Estimation of genetic components in popcorn based on the nested design. Crop Breeding and Applied Biotechnology 1: 3-10.

Tese: Resende MDV (1999) Predição de valores genéticos, componentes de variância, delineamentos de cruzamento e estrutura de populações no melhoramento florestal. PhD Thesis, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 419p.

Livro: Ramalho MAP, Ferreira DF and Oliveira AC (2000) Experimentação em genética e melhoramento de plantas. Editora UFLA, Lavras, 326p.

Capítulo de livro: Sakiyama NS, Pereira AA and Zambolim L (1999) Melhoramento do café arábica. In: Borém A (ed.) Melhoramento de espécies cultivadas. Editora UFV, Viçosa, p. 189-204.

Congresso: Frey KJ (1992) Plant breeding perspectives for the 1990s. In: Stalker HT and Murphy JP (eds.) Proceedings of the Symposium on Plant Breeding in the 1990s. CAB, Wallingford, p. 1-13.

A CBAB publica ainda outras modalidades de trabalhos, todos submetidos ao crivo de revisores ad hoc, do mesmo modo que os artigos.

Revisões As Revisões, também limitadas a 18 páginas digitadas, serão solicitadas pela Editoria a(os) autor(es) consolidados nas pesquisas que envolvem o tema da revisão. Elas serão elaboradas com o objetivo de lançar luz a um tema instigante que mereça uma análise aprofundada sobre o seu estado-da-arte.

Notas As Notas são limitadas a 12 páginas digitadas e destinadas a informar pesquisas ou observações novas, para as quais as ferramentas analíticas não se aplicam. Elas podem focar tema de amplo interesse; relato curto de uma pesquisa original; relato de pesquisa participativa; observações de especial interesse nas áreas de pesquisa, ensino, extensão; lançamento de um novo software relacionado com a área de melhoramento.

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Programas de melhoramento Programas de melhoramento inovadores ou que se destaquem pela eficiência, impacto e/ou continuidade poderão ser retratados na CBAB, limitados a 18 páginas digitadas.

Lançamento de cultivares Os novos cultivares merecerão uma seção especial pela importância que representam para o melhoramento e, por conseguinte, para a agricultura nacional. A seção Lançamento de novos cultivares deverá conter abstract, limitado a 50 palavras, introdução, métodos de melhoramento utilizados, características de desempenho, produção de sementes básicas e um mínimo de referências, tabelas e figuras. Todo o texto ficará limitado a 12 páginas digitadas.

Resenha de livro Esta nova seção foi criada para anunciar novos livros relacionados ao melhoramento de plantas. A contribuição para essa seção se dará mediante envio, pelo autor, de dois exemplares da obra. O livro será encaminhado para um revisor especializado, escolhido pela Editoria, para elaborar a resenha.

Pontos de vista Pontos de vista, assim como as revisões, serão elaborados para a CBAB a convite da Editoria, para retratar temas de interesse dos melhoristas e da sociedade.

Cartas Cartas breves, também de interesse geral, serão aceitas para publicação. A Editoria se reserva o direito de editar as cartas por limitações de espaço e clareza de exposição.

Autores de artigos na CBAB - CROP BREEDING AND APPLIED BIOTECHNOLOGY terão como benefícios:

� Submissão e revisão de artigos eletronicamente � Rápida publicação: tempo médio de 4 meses � Artigos disponibilizados em pdf na WEB

Envie artigos acessando http://www.sbmp.org.br/cbab/index.htm clicando em Submission

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REVISTA BRASILEIRA DE PLANTAS MEDICINAIS – RBPM

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

A Revista Brasileira de Plantas Medicinais - RBPM é publicação trimestral e destina-se à divulgação de trabalhos científicos originais, revisões bibliográficas e notas prévias, que deverão ser inéditos e contemplar as grandes áreas relativas ao estudo de plantas medicinais. Manuscritos que envolvam ensaios clínicos deverão vir acompanhados de autorização de Comissão de Ética constituída, para realização dos experimentos. Os artigos podem ser redigidos em português, inglês ou espanhol, sendo sempre obrigatória a apresentação do resumo em português e em inglês, independente do idioma utilizado. Os artigos devem ser enviados por email: [email protected], em espaço duplo, com margens de 2 cm. A digitação deverá ser feita no “Word for Windows” (em letra Arial 12) e editores gráficos compatíveis, como Excel, etc. Artigos muito extensos, fotografias e gráficos coloridos podem ser publicados, a critério da Comissão Editorial, se o autor se comprometer, mediante entendimentos prévios, a cobrir parte das despesas de publicação. No e-mail, enviar telefone para contatos mais urgentes. Assinaturas podem ser feitas em www.ibb.unesp.br/rbpm

REVISÕES BIBLIOGRÁFICAS E NOTAS PRÉVIAS

Revisões e Notas prévias deverão ser organizadas basicamente em: Título, Autores, Resumo, Palavras chave, Abstract, Key words, Texto, Agradecimento (se houver) e Referência Bibliográfica.

ARTIGO CIENTÍFICO

Os artigos deverão ser organizados em:

TÍTULO: Deverá ser claro e conciso, escrito apenas com a inicial maiúscula, centralizado, na parte superior da página. Se houver subtítulo, deverá ser em seguida ao título, em minúscula, podendo ser precedido de um número de ordem em algarismo romano. Os nomes comuns das plantas medicinais devem ser seguidos pelo nome científico (binômio latino e autor) entre parênteses.

AUTORES: O último sobrenome dos autores deverá ser colocado por extenso (nomes intermediários somente iniciais) em letras maiúsculas, 2 linhas abaixo do título. Após o nome de cada autor deverá ser colocado um número sobrescrito que deverá corresponder ao endereço: instituição, endereço da instituição (cidade, sigla do estado, CEP, e-mail). Indicar o autor que deverá receber a correspondência. Os autores devem ser separados com ponto e vírgula.

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RESUMO: Deverá constar da mesma página onde estão o título e os autores, duas linhas abaixo dos autores. O resumo deverá ser escrito em um único parágrafo, contendo objetivo, resumo do material e método, principais resultados e conclusão. Não deverá apresentar citação bibliográfica.

Palavras-chave: Deverá ser colocada uma linha abaixo do resumo, na margem esquerda escrita em negrito, podendo constar até cinco palavras.

ABSTRACT: Apresentar o título e o resumo em inglês,no mesmo formato do redigido em português, com exceção do título, apenas com a inicial em maiúscula, que virá após a palavra ABSTRACT.

Key words: Abaixo do Abstract deverão ser colocadas as palavras-chave em inglês.

INTRODUÇÃO: Na introdução deverá constar breve revisão de literatura e os objetivos do trabalho. As citações de autores no texto deverão ser feitas de acordo com os seguintes exemplos: Silva (1996); Pereira & Antunes (1985); (Souza & Silva, 1986) ou quando houver mais de dois autores Santos et al.(1996).

MATERIAL E MÉTODO (CASUÍSTICA): Deverá ser feita apresentação completa das técnicas originais empregadas ou com referências de trabalhos anteriores que as descrevam. As análises estatísticas deverão ser igualmente referenciadas. Na metodologia deverão constar os seguintes dados da espécie estudada: Nome popular; Nome científico com autor e indicação da família botânica; Nome do botânico responsável pela identificação taxonômica; Nome do herbário onde a excicata está depositada e o respectivo número (Voucher Number); época e local de coleta, bem como, a parte da planta utilizada.

RESULTADO E DISCUSSÃO: Poderão ser apresentados separados ou como um só capítulo, contendo no final conclusão sumarizada.

AGRADECIMENTO: deverá ser colocado neste capítulo (quando houver)

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA: As referências devem seguir as normas da ABNT 6023. Colocar até três autores, quando mais colocar o primeiro seguido de et al. Exemplos:

Periódicos:

AUTOR(ES) separados por ponto e vírgula. Título do artigo. Nome da Revista, por extenso, volume, número, página inicial-página final, ano.

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KAWAGISHI, H. et al. Fractionation and antitumor activity of the water-insoluble residue of Agaricus blazei fruiting bodies. Carbohydrate Research, v.186, n.2, p.267-73, 1989.

Livros :

AUTOR. Título do livro. Edição. Local de publicação: Editora, Ano. Total de páginas.

MURRIA, R.D.H.; MÉNDEZ, J.; BROWN, S.A. The natural coumarins: occurrence, chemistry and biochemistry. 3.ed. Chinchester: John Wiley & Sons, 1982. 702p.

Capítulos de livros:

AUTOR(ES) DO CAPÍTULO. Título do Capítulo. In: AUTOR (ES) do LIVRO. Título do livro: subtítulo. Edição. Local de Publicação: Editora, ano, Página inicial página final.

HUFFAKER, R.C. Protein metabolism. In: STEWARD, F.C. (Ed.). Plant physiology: a treatise. Orlando:Academic Press, 1983. p.267-33.

Tese ou Dissertação:

AUTOR. Título em destaque: subtítulo. Ano. Total de Páginas. Categoria (grau e área de concentração) – Instituição, Universidade, Local.

OLIVEIRA, A.F.M. Caracterização de Acanthaceae medicinais conhecidas como anador no nordeste do Brasil. 1995. 125p. Dissertação (Mestrado - Área de Concentração em Botânica) – Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco, Recife.

Trabalho de Evento:

AUTOR(ES). Título do trabalho. In: Nome do evento em caixa alta, número, ano, local. Tipo de publicação em destaque. Local: Editora, ano. página inicial-página final.

VIEIRA, R.F.; MARTINS, M.V.M. Estudos etnobotânicos de espécies medicinais de uso popular no Cerrado. In: INTERNATIONAL SAVANNA SYMPOSIUM, 3., 1996, Brasília. Proceedings… Brasília: Embrapa, 1996. p.169-71.

Publicação Eletrônica:

AUTOR(ES). Título do artigo. Título do periódico em destaque, volume, número, página inicial-página final, ano. Local: editora, ano. Páginas. Disponível em: <http://www........>. Acesso em: dia mês (abreviado) ano.

PEREIRA, R.S. et al. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária.

Revista de Saúde Pública, v.38, n.2, p.326-8, 2004. Disponível em: http://www.scielo.br. Acesso em: 18 abr.2005.

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Não citar resumos e relatórios de pesquisa a não ser que a informação seja muito importante e não tenha sido publicada de outra forma. Comunicações pessoais devem ser colocadas no rodapé da página onde aparecem no texto e evitadas se possível. Devem ser, também, evitadas citações do tipo Almeida (1994) citado por Souza (1997).

TABELAS: Devem ser enviadas em formato TABELA, inseridas no texto, com letra do tipo Arial 10, espaço simples. A palavra TABELA deve ser em letras maiúsculas seguidas por algarismo arábico, quando citadas no texto devem ser em letras minúsculas (Tabela).

FIGURAS: As ilustrações (gráficas, fotográficas, desenhos, mapas) devem ser em letras maiúsculas seguidas por algarismo arábico, quando citadas no texto devem ser em letras minúsculas (Figura).

ATENÇÃO: Artigos que não estiverem de acordo com essas normas serão devolvidos.

Observação: São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos trabalhos. Contudo, reserva-se ao Conselho Editorial, o direito de sugerir ou solicitar modificações que julgar necessárias.

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COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO

VARIABILIDADE GENÉTICA E MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE...

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