Varredura de uma biblioteca de cDNA da Lasiodora sp ...

Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Varredura de uma biblioteca de cDNA da aranha Lasiodora sp utilizando-se de antisoro policlonal anti-veneno total e clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 no vetor de expressão bacteriano pET-11a

André Luiz Gomes Vieira

Orientador: Dr. Ieso de Miranda Castro Co-Orientador: Evanguedes Kalapothakis

Ouro Preto Março 2005

Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do título de mestre em ciências biológicas. Área de concentração: Biologia Molecular.

Este trabalho tem sido desenvolvido com o apoio financeiro das seguintes instituições:

• Fundação de amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG • Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq • Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES • Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP

II

“Do trabalho das tuas mãos comerás, feliz serás e tudo te irá bem.”

Salmos 128:2

À

Ana Luíza

Vitória

Daniel

III

Agradecimentos

• A Deus, pela fidelidade inabalável e pela certeza de que, mesmo quando estou dormindo, o melhor tem sido planejado para mim.

• Aos meus pais (José Célio e Elza Gomes), meus irmãos (Helen, Jaqueline, Neemias

e Tiago), meus sobrinhos (Ana Luiza, Vitória e Daniel) e meus cunhados (Ronald, Patrícia e Glauciene), razão de tudo isso. Amo vocês!

• Ao professor Dr. Ieso de Miranda Castro, pelo exemplo de seriedade e compromisso

com a pesquisa. Muito obrigado pela orientação e oportunidade de realização deste trabalho.

• Ao co-orientador deste trabalho, professor Dr. Evanguedes Kalapothakis pela

indispensável participação na construção da biblioteca de cDNA e discussão dos resultados obtidos.

• Ao professor Dr. Rogelio Lopes Brandão pelo empenho em fazer do Programa de

Pós-graduação em Ciência Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto um programa de destaque.

• Ao professor Dr. Helio Hideo Babá pela amizade e pelas dúvidas científicas

esclarecidas.

• Aos professores Dr. Luciano Fietto e Dra. Juliana Fietto, pela amizade e pela boa vontade e prontidão com que compartilham seus conhecimentos científicos. Muito Obrigado por tudo!

• À minha colega de graduação que se tornou amiga e que se tornou irmã, Michelle

Bueno de Moura Pereira. Já estou com uma saudade!

• À Cida, como é difícil expressar a gratidão por toda sua simpatia e competência. Ninguém que passa por aqui te esquece!

• À Maria José Trópia (Zezé), simpatia do LBCM.

• Aos colegas de trabalho do LBCM: Maristela, Jú Boechat, Kátia, Pilar (saudades),

Michele Barbi (saudades), Tiago, Fernandinha, Raquel, Giovana, Matheus, Fred (Saudades), Ana Paula (saudades), Mr. Totola, Val, Lis, Aninha, Xisto, Murilo, Mônica, Lucas, Dani Mel, Ramon, Patrick e Sr. Brás. Não temos rádio, mas damos boas risadas...rs...

• À Milene, pela ajuda fundamental na realização deste trabalho e por me aturar nos

momentos difíceis.

IV

• À amiga Danizinha, pelo empurrão científico. Obrigado.

• Às amigas Inês e Mariinha pelo referencial de família que se tornaram para mim em

Ouro Preto.

• Aos amigos da república Brejo, Paulo Schermack, Vinícius Hermani e Wagner Couto pelo convívio e pelas risadas.

• Aos meus tios e primos que torceram e não se esquecem de mim.

• A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

V

Resumo

Venenos de aranhas são sistemas de multicomponentes que podem ser agrupados em 3

classes químicas principais: moléculas orgânicas de baixo peso molecular, peptídeos e

proteínas de alto peso molecular. A grande maioria de toxinas de aranhas identificadas até o

momento é composta de polipeptídeos com uma massa molecular de 3000-8000 Da

altamente reticulados por pontes dissulfeto. A purificação de peptídeos tóxicos de venenos

de aranhas nos propicia um arsenal de ferramentas moleculares para estudos

eletrofisiológicos, farmacológicos e estudo de canais iônicos. Este trabalho descreve o

resultado da varredura de uma biblioteca de cDNA, utilizando-se da técnica de ELISA, com

o objetivo de identificar proteínas imunogênicas. A biblioteca de cDNA foi construída a

partir do mRNA isolado de glândulas de veneno de Lasiodora sp. Anti-soro contra o

veneno total foi usado na varredura. Os clones positivos foram caracterizados por

seqüenciamento de DNA. Nossos resultados mostram que os precursores das toxinas

descritas apresentam um peptídeo sinal caracterizado por um alto conteúdo de aminoácidos

hidrofóbicos, um propeptídeo interposto entre a seqüência sinal e a toxina madura, e a

seqüência de aminoácidos da toxina madura. Os cDNAs que codificam as toxinas LTx1 e

LTx3 foram inseridos no vetor de expressão pET-11a, gerando plasmídeos com a

capacidade de codificar as toxinas maduras. O sistema pET-11a-LTx1 produziu a toxina

LTx1 recombinante na forma solúvel.

VI

Abstract

Spider venoms are multicomponent systems that can be grouped into three major chemical

classes: low molecular mass organic molecules, polypeptides and high molecular mass

protein. The vast majority of spider toxins identified up to date are polypeptides with a

molecular mass of 3000-8000 Da, highly reticulated by disulfide bridges. Purification of

peptides toxins from spider venoms gives an arsenal of molecular tools for

electrophysiological, pharmacological and structural studies of ion channels. The present

work describes the results of a screening carried out using ELISA and a cDNA expression

library for identification of immunogenic proteins. The cDNA library was previously

constructed with mRNA isolated from Lasiodora sp venom glands. Antibodies against the

whole venom were used in this screening. Positive clones were characterized by DNA

sequencing. The sequences revealed that the precursors of proteins contain signal peptides

characterized by a very hydrophobic core, an intervening propeptide region, and the mature

toxin. The cDNAs encoding the LTx1 and LTx3 toxins were inserted into the expression

vector pET-11a, generating plasmids with coding capacity for mature toxins. The

recombinant toxin LTx1 was found primarily in soluble fraction of the host cell.

Índice

Resumo V

Abstract VI

1 Lista de Figuras VII

2 Tabela IX

3 Abreviaturas X

4 Introdução 1

4.1 Aspectos gerais 2

4.2 Composição de venenos de aranhas 4

4.3Utilização de toxinas de venenos no estudo de canais iônicos e em neurobiologia 5

4.4 Atividade bioinseticida de venenos de aranhas 12

4.5 Atividade bactericida de venenos de aranhas 14

4.6 Bioquímica e biologia molecular de toxinas da aranha Lasiodora sp 15

5 Objetivos 18

5.1 Objetivos Geral 19

5.2 Objetivos Específicos 19

6 Materiais e Métodos 20

6.1 Construção da Biblioteca de cDNA 21

6.2 Dosagem do mRNA 23

6.3 Preparação do fago auxiliar M13 23

6.4 Titulação do fago auxiliar M13 24

6.5 Excisão em massa do fagemídeo pBK-CMV 24

6.6 Preparo do estoque de bactérias recombinantes 27

6.7 Preparo do extrato livre de células 27

6.8 ELISA (Enzyme Linked Imunosorbent Assay) 28

6.9 Extração do DNA plasmidial 29

6.10 Preparo do gel de agarose 30

6.11 Eletroforese do DNA em gel de agarose 30

6.12 Seqüenciamento do DNA 31

6.13 Purificação dos produtos de extensão 32

6.14 Análise das seqüências de nucleotídeos obtidas 32

6.15Clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 no sistema de expressão

bacteriano pET-11a e pET-21b Novagen

® 32

6.15.1Amplificação da região correspondente às toxinas maduras LTx1 e LTx3 para

clonagem em sistema PCR®

2.1 TOPO TA Cloning Invitrogen® 33

6.15.2 Preparo de gel de poliacrilamida 6 % 35

6.15.3 Purificação do produto de PCR em gel de poliacrilamida 35

6.15.4Clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 em PCR

®2.1-TOPO TA

Cloning Invitrogen®

36

6.15.5 Preparo de células E. coli Top 10 F’competentes (Método CaCl2) 38

6.15.6Transformação de células de E. coli Top 10 F’ com o produto de ligação em PCR

®

2.1-TOPO®

38

6.15.7Reação em cadeia da polimerase de colônias provenientes da transformação de E.

coli Top 10 F’ com o produto de ligação em PCR®

2.1-TOPO® 39

6.15.8Extração do DNA plasmidial de colônias provenientes da transformação de E. coli

Top 10 F’ com o produto de ligação em PCR®

2.1-TOPO® 40

6.15.9

Digestão dos plasmídeos PCR®

2.1-TOPO®-LTx1 (e LTx3) com as enzimas Nde I e

BamH I para clonagem do fragmento liberado no sistema de expressão pET-11a

(Novagen®)

41

6.15.10 Purificação dos produtos de digestão 41

6.15.11Digestão do vetore de expressão pET-11a com as enzimas de restrição Nde I e

Bam H I42

6.15.12 Purificação do vetor de expressão utilizando papel Whatman DE81 42

6.15.13Clonagem dos fragmentos que codificam as toxinas LTx1 e LTx3 no vetor de

expressão pET-11a44

6.15.14Transformação de células de E. coli Top 10 F’ com o produto de ligação no vetor de

expressão pET-11a 46

6.15.15

Reação em cadeia da polimerase de colônias provenientes da transformação de

células de E. coli Top 10 F’ com os produtos de ligação no vetor de expressão pET-

11a

46

6.15.16Transformação de bactérias de expressão (E. coli linhagem BL-21 DE3) com a

construção pET-11a-LTx1 e pET-11a-LTx348

6.16Indução da expressão da toxina recombinante LTx1 clonada no vetor de expressão

pET-11a 48

6.16.1 Produção da LTx1 recombinate e solubilidade da proteína 49

6.16.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 50

6.16.3 Coloração pelo método da prata 50

6.16.4 Western Blot 51

6.17 Genótipos das linhagens de bactérias hospedeiras utilizadas neste trabalho 52

6.18 Meios de cultura 52

6.19 Reagentes e material de uso 53

6.20 Soluções 54

6.20.1 Soluções utilizadas na ELISA 55

6.20.2 Soluções utilizadas no gel SDS-PAGE 56

6.20.3 Coloração pelo método da prata 57

6.21 Equipamentos utilizados no laboratório 58

7 Resultados 59

7.1 Varredura dos clones provenientes das excisões em larga-escala 60

7.2Análise das seqüências nucleotídicas dos cDNAs dos clones que apresentaram

similaridade com toxinas de aranhas 62

7.2.1 Tradução dos cDNAs que codificam para as toxinas LTx1, LTx2 e LTx3 64

7.2.2 Análise estrutural das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3 66

7.2.3

Alinhamento das seqüências peptídicas das toxinas das aranhas Lasiodora sp

(LTx1, LTx2, LTx3), E. Californicum (ESTx), B. smithii (BsTx), L. parahybana

(LpTx1 e LpTx2)

69

7.2.4Alinhamento das seqüências peptídicas completas das toxinas LTx1, LTx2, LTx3 e

HwTx-II (Ile)70

7.3 Clonagem das toxinas LTx1 e LTx3 em PCR®

2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen® 71

7.4 Clonagem das toxinas LTx1 e LTx3 no vetor de expressão pET-11a 73

7.5 Indução da toxina LTx1 recombinante 75

7.6Análise da seqüência nucleotídica dos cDNAs dos clones (16-19) que apresentaram

similaridade com a toxina Magi 7 da aranha Macrothele gigas 78

7.7Análise das seqüências que apresentaram similaridade com outras proteínas

depositadas no GenBank82

7.7.1 Análise da seqüência do DNA complementar do clone 20 82


7.8Análise das seqüências dos clones que codificam para peptídeos que não

apresentaram similaridades, quando submetidos à análise pelo BlastP88




8 Discussão 95

9 Conclusões 106

10 Perspectivas 109

11 Referências Bibliográficas 111

Anexo 119

VII

1- Lista de Figuras Figura 1 Foto de um espécime do gênero Lasiodora 3

Figura 2 Estrutura tetramérica da latrotoxina αLTX 7

Figura 3 Modelo de poro da toxina αLTX 7

Figura 4 Mecanismos de ação da αLTX 9

Figura 5 Localização de VDSC em células GH3 e co-localização de manchas AF568-TiTX-γ com AF488-TsTX

11

Figura 6 Construção da molécula de cDNA 22

Figura 7 Ligação do cDNA no vetor ZAP Express e excisão em massa do fagemídeo pBK-CMV 26

Figura 8 Mapa do vetor de clonagem PCR® 2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen® 37

Figura 9 Mapa esquemático do vetor de expressão bacteriano pET-11a Novagen® 45

Figura 10 Alinhamento dos cDNAs dos clones que apresentaram similaridade com toxinas de aranhas S. huwena, E. californicum, B. smithi e Lasiodora parahibana 63

Figura 11 Tradução das seqüências nucleotídicas que codificam para as toxinas LTx1, LTx2 e LTx3 65

Figura 12 Predição do ponto de clivagem entre os peptídeos sinal e peptídeo intermediário na seqüência dos precursores das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3 67

Figura 13 Gráfico de hidropaticidade das seqüências de aminoácidos traduzidas a partir dos cDNAs dos clones que codificam os precursores das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3 68

Figura 14

Alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas das aranhas Lasiodora sp (LTx1, LTx2 e LTx3), E. Californicum (ESTx), B. smithii (BsTx), e L. parahybana (LpTx1 e LpTx2)

69

Figura 15 Alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas das aranhas Lasiodora sp (LTx1, LTx2 e LTx3) e Selenocosmia huwena (HwTx-II) 70

Figura 16

PAGE dos produtos de PCR de colônias obtidas na transformação de células de E. coli linhagem TOP 10 F’ com os produtos das ligações das seqüências codificantes para as toxinas LTx1 e LTx3 com o vetor PCR® 2.1-TOPO

72

Figura 17

PAGE dos produtos de PCR de colônias obtidas na transformação de células de E. coli linhagem TOP 10 F’ com produto de clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 nos vetores de expressão pET-11a e pET-21b

74

Figura 18

Gel SDS-PAGE da indução da expressão de LTx1 recombinante

76

Figura 19

Western Bloting da toxina LTx1 recombinante

77

Figura 20

Tradução do cDNA que codifica a toxina LTx5

79

VIII

Figura 21 Alinhamento das seqüências peptídicas dos pró-peptídeos Magi 7 (Macrothele gigas) e LTx5 (Lasiodora sp) 79

Figura 22

Predição do ponto de clivagem entre os peptídeos sinal e intermediário na seqüência do precursor da toxina LTx5

80

Figura 23 Gráfico de hidropaticidade da seqüência de aminoácidos traduzida a partir do cDNA dos clones que codificam o precursor da toxina LTx5 81

Figura 24

Alinhamento da seqüência peptídica codificada pelo cDNA do clone 20 com a cadeia β-1 da hemoglobina de Mus musculus, cadeia β-2 da globina de Rattus norvegicus e hemoglobina quimérica humano/camundongo (zeta 2/beta 2)

84

Figura 25

Alinhamento da seqüência peptídica codificada pelo cDNA do clone 21 com as proteínas CG7580-PA da mosca Drosophila melanogaster, agCP10691 do mosquito Anopheles gambiae e Qpc-pending do camundongo Mus musculus

87

Figura 26

Predição do ponto de clivagem entre os peptídeos sinal e intermediário na seqüência do peptídeo LsC3a

91

Figura 27

Gráfico de hidropaticidade dos aminoácidos traduzidos a partir do cDNA dos clones que codificam o precursor do componente clonado LsC3a

92

Figura 28

Perfil molecular de peptídeos de venenos de 55 tarântulas utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF

99

Figura 29

Alinhamento das seqüências peptídicas das toxinas maduras das aranhas Lasiodora sp e Lasiodora parahybana

100

Figura 30

Alinhamento (ClustalW) de toxinas de tarântulas

102

Figura 31

Alinhamento dos precursores das toxinas da aranha Lasiodora sp LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5

103

Figura 32

Árvore filogenética das toxinas da aranha Lasiodora sp baseada no programa de alinhamento ClustalW

104

IX

2- Tabela Tabela 1 Resultados do teste de ELISA e similaridade utilizando o programa BlastP 62

X

3- Abreviaturas

ATP: adenosina trifosfato

Blast: “Basic Local Alignment Search Tool”

BsTx: toxina do veneno da aranha Brachypelma smithii

cDNA: ácido desoxirribonucléico complementar

DL50: dose letal mediana

DMSO: Dimetil sulfóxido

DNA: ácido desoxirribonucléico

dNTP: desoxirribonucleotídeo(n)trifosfato, n= adenosina, citosina, guanosina ou timina

DO: densidade ótica

EDTA: ácido etilenodiamino tetracético

ELISA: Enzyme Linked Imunosorbent Assay

ESTx: toxina do veneno da aranha Eurypelma californicumi

GABA: ácido γ-aminobutírico

HPLC: High-Performance Liquid Chromatography

HwTx-(I e II): toxinas I e II do veneno da aranha Selenocosmia huwena

IgG: imunoglobulina G

IPTG: isopropil-tio-β-D-galactosídio

LpTx : toxinas da aranha Lasiodora parahibana

LsC : componente do veneno da aranha Lasiodora sp

LTx: toxinas da aranha Lasiodora sp

MCS: “Multiple Cloning Site” (sítio múltiplo de clonagem)

mRNA: ácido ribonucléico mensageiro

NRX: Neurexina

OPD: O-fenilenodiamino

PBS: tampão de salina fosfato

PBST: tampão de salina fosfato tween 20

PCR: “Polymerase Chain Reaction” (reação da polimerase em cadeia)

PEG: polietilenoglicol

PLC: Fosfolipase C

XI

PMSF: fluoreto fenilmetilsulfonil

PSA: persulfato de amônia

rATP: ATP reativo

RNA: ácido ribonucléico

Rnase: ribonuclease

ssDNA: single strand DNA (DNA fita simples)

SDS: dudecil sufato de sódio

SDS PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS

TAE: tampão tris acetato EDTA

TE: tampão tris EDTA

TEMED: N, N, N`, N` tetrametiletilenodiamino

TiTx-γ: Tityus Toxina Gama

Tris HCl: tris(hidroximetil) aminometano acidificado com ácido clorídrico

TTX: tetrodotoxina

VDSC: Voltage Dependent Sodium Channel

X- Gal: 5-bromo-4-cloro3-indolil-β-D-galactosídio

2

4- Introdução

4.1- Aspectos gerais

A aranha Lasiodora sp é conhecida popularmente no Brasil como caranguejeira.

Assim como outras aranhas da família Theraphosidae (subordem Mygalomorphae), a

aranha caranguejeira pertence a um grupo de aranhas também conhecidas mundialmente

como tarântulas. Das 37.972 espécies de aranhas descritas até o momento (totalizando 3526

gêneros), apenas 860 espécies pertencem à família Theraphosidae (composta por 107

gêneros) (Escoubas & Rash, 2004). As tarântulas podem ser encontradas em áreas tropicais

e semitropicais, savanas, desertos, florestas úmidas ou ambientes semitemperado. Essa

diversidade de nichos ecológicos, associada à diversidade de comportamentos de captura de

presas, contribui para a grande diversidade de seus venenos. Assim como outras aranhas, as

tarântulas são predadoras e se alimentam de uma variedade de animais vertebrados e

invertebrados. A grande habilidade das tarântulas para capturar presas grandes e fortes sem

a ajuda de teias (as tarântulas são aranhas errantes) implica não apenas em força física, mas

também em venenos altamente eficientes que agem rapidamente sobre o sistema nervoso

central e periférico de suas presas. Esta característica sugere que estes venenos sejam fontes

promissoras de compostos a serem utilizados no estudo de receptores e canais iônicos de

vertebrados. Dentre as inúmeras espécies de tarântulas conhecidas podem-se citar

Cithariscius crawshayi, Scodra griseipes, Hysterocrates Hercules (encontradas na África),

Selenocosmia Lyra, Haplopelma lividum, Cyriopagopus paganus (encontradas na Ásia),

Brachypelma smithi, Avicularia magdalena, Aphonopelma texense (encontradas na

América Central e do Norte) e Lasiodora parahybana, Grammostola spatulata, Paraphysa

manicata (encontradas na América do Sul) (Escoubas & Rash, 2004). A toxicidade do

veneno das aranhas, na maioria dos casos, não está diretamente relacionada com o tamanho

corporal. Dados recentes sobre picadas de aranhas da família Theraphosidae da América do

Sul (48 casos), Ásia/África (4 casos) e Austrália (9 casos) sugerem que essas aranhas são

inofensivas a humanos (Escoubas & Rash, 2004). Dentre os sintomas decorrentes de

picadas de tarântulas em humanos estão dor local moderada a severa, coceira forte, edema,

eritema, inchaço, ardência e cãibra. Nos casos mais severos são observados cãibras fortes e

3

espasmos musculares, os quais podem persistir por várias horas (Escoubas & Rash, 2004).

A dor decorrente da picada pode estar relacionada a uma combinação de injúria mecânica

(provocada pelas grandes quelíceras), baixo pH do veneno (tipicamente pH 5), efeitos das

aminas biogênicas (serotonina e histamina), adenosina e ATP (Escoubas & Rash, 2004). No

entanto, até mesmo venenos de baixa toxicidade para humanos podem ser fontes muito

importantes de moléculas que podem ser usadas como ferramentas bioquímicas para

estudos de processos farmacológicos, fisiológicos e neurológicos de vertebrados.

A figura 1 ilustra um representante do gênero Lasiodora.

Figura 1: Foto de um espécime do gênero Lasiodora. (Disponível em: www.bioterium.com)

4

4.2- Composição de venenos de aranhas

Tal como venenos de outros animais, como serpentes e escorpiões, venenos de

aranhas são uma rica fonte de toxinas, incluindo peptídeos de baixo peso molecular,

neurotoxinas, toxinas dermonecróticas (que são um grupo de proteínas com intensa

atividade sobre a matriz celular), poliaminas livres, ATP, ADP, AMP, sais inorgânicos,

aminoácidos livres, nucleotídeos, acilpoliaminas (que em venenos de aranhas do gênero

Nephila agem como neurobloqueador com atividade letal), polipeptídeos com mais de 1000

aminoácidos (principais componentes letais do gênero Latrodectus, causadores de uma

liberação maciça de neurotransmissores de uma diversidade de terminais nervosos), fatores

que podem modificar vários componentes da circulação sanguínea (tal como as

esfingomielinases, às quais se tem atribuído ações hemolíticas que podem causar anemia,

insuficiência renal aguda bem como ulcerações cutâneas) e neurotransmissores, dentre os

quais pode-se citar o glutamato, aspartato, ácido γ-aminobutílico (GABA), histamina,

dopamina, serotonina e epinefrina (Tambourgi, e cols., 2004; Horni e cols., 2001; Savel-

Niemann, 1989; Chan e cols., 1975; Kalapothakis e cols., 2002; Turkov e cols., 1997;

Escoubas e cols., 2000; Atkinson & Wright, 1992a; Rash & Hodgson, 2002).

Nem todos os componentes encontrados em glândulas de venenos de aranhas são

produzidos por células desse órgão. A presença de nucleotídeos de adenosina (ATP, ADP e

AMP) em venenos de aranhas foi demonstrada em 1975 por Chan e cols. no veneno de

Dugesiella hentzi e da tarântula Aphonopelma sp. Demonstrou-se que o composto

adenosina 5`-trifosfato (ATP) é relativamente pouco tóxico para ratos comparado com a

necrotoxina purificada do veneno de D. hentzi, com uma DL50 (ATP) de 2.4 mg por grama

de peso corporal. A necrotoxina de D. hentzi apresentou uma DL50 de 8,5µg por grama de

peso corporal. Não obstante, a toxicidade da necrotoxina foi notavelmente aumentada pela

presença de ATP. Os nucleotídeos presentes em venenos podem ser produzidos diretamente

em glândulas de venenos, embora não haja evidência experimental da presença de

nucleotídeos em glândulas de venenos de tarântulas. O ATP, um composto rico em energia,

pode ser necessário para a liberação do veneno, sendo secretado juntamente com outras

substâncias quando a aranha é excitada (Chan e cols., 1975). Considerando-se as

concentrações relativamente altas encontradas nos experimentos de Chan e cols. (1975), o

5

ATP pode ter uma função especial no veneno de D. hentzi e Aphonopelma sp, agindo como

potenciador da toxicidade de fatores necróticos do veneno. É provável também que os

grupos fosfatos liberados a partir da hidrólise do ATP sejam usados para fosforilar um ou

mais resíduos de aminoácidos de peptídeos tóxicos do veneno, tornando-os mais ativos.

Em 1984, Geren & Odell observaram também a presença de fluidos digestivos em

venenos de aranhas. Tais enzimas digestivas não são produzidas nas glândulas de veneno,

mas, como sugerido por Atkinson & Wright (1992a), decorrem de uma contaminação

natural do veneno com fluidos digestivos. As enzimas colagenases são os principais

responsáveis pela ação necrótica de muitos venenos (Atkinson & Wright, 1992a).

4.3. Utilização de toxinas de venenos no estudo de canais iônicos e em neurobiologia

Os canais iônicos são proteínas integrais de membrana que formam poros capazes

de permitir a passagem de íons através da bicamada lipídica e, desta forma, possibilitam a

alteração do potencial de membrana de uma célula. Este fluxo de íons através dos canais

iônicos presentes na membrana celular gera os chamados potencias de ação, que são os

sinais elétricos responsáveis pela condução do impulso nervoso.

Alguns peptídeos tóxicos de baixo peso molecular de venenos animais agem

especificamente sobre canais iônicos incluindo canais de Ca2+ , canais de K+ , canais de

Na + e canais de Cl- , (Atkinson & Wright, 1992b e Rash & Hodgson, 2002). Atualmente,

muito se tem estudado a respeito das neurotoxinas. Os modos de ação dessas substâncias

têm permitido aos pesquisadores estudar os mecanismos envolvidos na neurotransmissão

uma vez que essas toxinas, ao interagir de forma específica com receptores de membranas

neuronais, podem estimular ou inibir a liberação de neurotransmissores, tais como o

glutamato (Barral e cols., 2001), bem como afetar a transmissão colinérgica. Peptídeos

tóxicos de venenos têm contribuído também com estudos de caracterização e

funcionamento de canais iônicos (Araújo e cols., 1993 e Rash & Hodgson, 2002).

Ushkaryov e cols. (2004) determinaram a estrutura tridimensional de uma toxina

presente no veneno de uma aranha pertencente ao gênero Latrodectus e conhecida

popularmente como viúva negra. As toxinas presentes no veneno da aranha viúva negra

6

(latrotoxinas) têm sido extensivamente usadas no estudo de mecanismos moleculares

envolvidos em neurosecreção em vertebrados, insetos e crustáceos. Recentes avanços nas

análises estruturais e funcionais das latrotoxinas, sobretudo da toxina αLTX, têm permitido

entender os mecanismos envolvidos na liberação de neurotransmissores e têm revelado o

grande potencial desses peptídeos tóxicos como ferramentas para compreender fenômenos

neurobiológicos. À exceção da toxina δLIT, todas as demais latrotoxinas agem somente

sobre células neuronais e a αLTX apresenta forte afinidade por receptores de membranas

neuronais de vertebrados (Ushkaryov e cols., 2004). A estrutura tridimensional da αLTX é

formada por um complexo que consiste em quatro monômeros (complexo tetramérico)

arranjados ao redor de um eixo central assemelhando-se a uma hélice de quatro lâminas

com um diâmetro de 250 Å e uma espessura de 100 Å (Figura 2 a-d) (Ushkaryov e cols.,

2004). Esse tetrâmero possui uma região composta por aminoácidos hidrofóbicos que,

provavelmente, interage com a membrana (Ushkaryov e cols., 2004). Somente através da

determinação da estrutura quaternária da toxina αLTX pôde-se explicar como essa

molécula é capaz de se inserir na membrana tornando-a permeável a íons Ca2+. A

característica mais relevante do tetrâmero αLTX é um canal central rodeado pelos

monômeros da toxina (Figura 2c e 2d). O tetrâmero formado pela αLTX é anfipático sendo,

portanto, capaz de se aderir em superfícies hidrofóbicas. Dessa forma, o tetrâmero αLTX

inserido na membrana tornaria a bicamada lipídica permeável a todas as substâncias que

pudessem passar pelo canal central (pequenas moléculas e cátions hidratados) (Figura 3). O

entendimento desse mecanismo de ação (mecanismo do poro) tem contribuído para a

identificação de seus efeitos específicos sobre a liberação de neurotransmissores e tem

ajudado no estudo das ações da αLTX mediadas por receptor (Ushkaryov e cols., 2004).

7

Figura 3: Modelo de poro da toxina αLTX. O tetrâmero está seccionado para permitir a visualização do poro. A base do tetrâmero penetra profundamente na membrana. Estruturas em forma de asas prendem-se no lado de fora da membrana. Cátions podem entrar no citosol através do poro, como mostrado pela seta. (Adaptado de Ushkaryov e cols., 2004).

Figura 2: Estrutura tetramérica da latrotoxina αLTX. Visão inclinada (a e b) e visão do lado que se liga à superfície da célula (c e d). O canal central rodeado pelos monômeros da toxina é indicado pelas setas vermelhas. (Adaptado de Ushkaryov e cols., 2004).

a b

c d

8

Embora as ações da αLTX sejam complexas, elas podem ser divididas em duas vias

principais. Após a ligação a um receptor neuronal específico, a αLTX pode desencadear

uma sinalização intracelular ou se inserir na membrana levando à formação de um poro.

Ambas as vias podem estimular a liberação de neurotransmissores, embora seus

mecanismos sejam diferentes. Os mecanismos de ação da αLTX são mostrados na figura 4.

Como pode ser visto na figura, a interação de αLTX com receptores específicos da

membrana neuronal, tais como latrofilinas (LPH) ou neurexinas (NRX), desencadeia um

influxo de Ca2+ através do poro formado pelo tetrâmero. Esse Ca2+ age sobre as vesículas

sinápticas desencadeando a liberação de neurotransmissores (via 1). A via 2 da figura 4

mostra um mecanismo de liberação de neurotransmissores independente de Ca2+, onde a

interação do tetrâmero com receptores específicos permite a saída dos neurotransmissores

através do poro formado pelo tetrâmero. A terceira via mostra a interação do dímero αLTX

com seus receptores específicos. Essa interação ativa uma proteína G que, por sua vez,

desencadeia uma cascata de reações envolvendo uma fosfolipase C (PLC) e

fosfotidilinositol (PIP3), culminando na liberação de Ca2+ de reservatórios intracelulares e,

conseqüentemente, na liberação de neurotransmissores das vesículas sinápticas. Um quarto

modo de ação da toxina αLTX na liberação de neurotransmissores independente de Ca2+

tem sido proposto, no entanto, o mecanismo envolvido nessa liberação ainda não foi

completamente esclarecido (Ushkaryov e cols., 2004).

9

Figura 4: Mecanismos de ação da αLTX. Em 1, influxo de Ca2+ através dos poros formados pela toxina após sua ligação a LPH ou NRX. Em 2, saída de neurotransmissores através dos poros formados pela toxina. Em 3, sinalização mediada por receptores dependente de Ca2+ levando à liberação de Ca2+ de reservatórios internos. Em 4, uma interação direta hipotética da αLTX com a maquinaria de exocitose dependente de Ca2+. (Adaptado de Ushkaryov e cols., 2004).

10

Um tipo especial de canal de Na+ (dependente de voltagem) têm sido alvo de muitos

estudos neurobiológicos devido ao fato desses canais apresentarem múltiplas funções na

geração de potenciais de ação em muitos tipos de neurônios do sistema nervoso central.

Além de produzir uma grande corrente transiente responsável pela mudança no potencial de

membrana, os canais de sódio afetam a duração e a freqüência de disparos neuronais

repetitivos (Massensini e cols., 2002). A distribuição diferencial dos canais de Na+

dependentes de voltagem (VDSC) é crítica na determinação de propriedades funcionais

distintas de um neurônio. Embora haja várias técnicas para a localização de VDSCs

(“patch-clamp”, “immunostaining”, marcadores específicos de canais iônicos e etc)

nenhuma delas é capaz de determinar a distribuição de VDSCs funcionais em toda a

extensão da membrana de células vivas (Massensini e cols., 2002). Contudo, toxinas de

venenos animais têm sido usadas como potentes ferramentas para distinguir as várias

isoformas de canais iônicos dependentes de voltagem presentes nas membranas celulares.

Algumas dessas toxinas são conhecidas por interagir especificamente com VDSCs e

portanto, estão sendo utilizadas como ferramentas no estudo de funções de canais iônicos e

de excitabilidade celular em tempo real.

Massensini e cols. (2002) localizaram canais de Na+ voltagem-dependentes (VDSC),

em células vivas, utilizando-se de toxinas do veneno do escorpião Tityus serrulatus

marcadas com fluorescência. A visualização da distribuição espacial dos VDSCs em células

GH3 foi revelada utilizando-se derivados fluorescentes das toxinas TiTX-γ marcada com

Alexa Flúor 568 (AF568-TiTX-γ) e TsTX marcada com Alexa Flúor 488 (AF488-TsTX)

(Molecular Probes Inc., Eugene, OR) do escorpião Tityus serrulatus juntamente com

técnicas de microscopia confocal de varredura a laser (LSCM). Esse método permitiu uma

localização precisa de grupos individuais de cada toxina marcada, AF568-TiTX-γ e AF488-

TsTX. Sobreposições de manchas fluorescentes das toxinas marcadas utilizadas também

foram visualizadas, indicando regiões de co-localização de VDSCs em partes específicas da

célula (Figura 5).

11

O uso de toxinas fluorescentes para localizar VDSCs tem a vantagem de permitir o

uso de células vivas ao invés de células fixadas, necessárias nos métodos de

imunofluorescência, permite resolução em tempo real (o que é apropriado para a

investigação de um grande número de fenômenos envolvidos na excitabilidade neuronal), é

um método aplicável a tipos diferentes de estudos envolvendo a distribuição de VDSC na

transdução de sinal além de permitir que medidas simultâneas sejam realizadas usando

diferentes sondas fluorescentes em uma mesma célula. Finalmente, essa técnica é

complementar e compatível com os métodos já existentes usados no estudo de proteínas

envolvidas na comunicação celular e transdução de sinal (Massensini e cols., 2002).

Figura 5: Localização de VDSC em células GH3 e co-localização de manchas AF568-TiTX-γ com AF488-TsTX . (A) DIC de células GH3. (B) O canal vermelho corresponde à marcação com AF568-TiTX-γ. A fluorescência indica a localização de VDSC na membrana da célula. Manchas características são observadas como pontos concentrados sobre as células. (C) O canal azul corresponde à fluorescência conferida pela marcação com AF488-TsTX . Pontos concentrados nas projeções isoladas indicam a localização de VDSC agrupados em regiões celulares específicas. (D) Canais marcados de vermelho e azul, após segmentação, indica regiões de co-localização (amarelo) tanto de AF568-TiTX-γ (vermelho) quanto de AF488-TsTX (azul). S1-S35: secções ópticas consecutivas segmentadas de (B) e (C) mostram a co-localização (amarelo) de VDSCs distribuídos pela membrana da célula em diferentes secções focais. Oito das 35 secções são mostradas. Escala = 10 µm. (Adaptado de Massensini e cols., 2002).

12

4.4- Atividade bioinseticida de venenos de aranhas

Os mecanismos de ação dos peptídeos tóxicos, em insetos e mamíferos, têm sido

estudados também com o intuito de se desenvolver novas drogas, tendo em vista as

diferentes atividades farmacológicas potenciais das neurotoxinas. Por outro lado, a

perspectiva de se descobrir, dentre os vários componentes de venenos de aranhas, algum

peptídeo que possa ser utilizado na produção de bioinseticidas, tem impulsionado várias

pesquisas com o objetivo de conhecer os mecanismos de ação envolvidos na paralisação e

morte de insetos atacados por aranhas.

O controle de pragas utilizando inseticidas químicos tem submetido diversas

populações de insetos à seleção darwiniana, ocasionando um inevitável desenvolvimento de

resistência. Estima-se que desde 1992, mais de 500 espécies de insetos adquiriram

resistência a uma ou mais classes de inseticidas químicos, incluindo 56 mosquitos do

gênero Anopheles e 39 do gênero Culex e nove espécies de carrapatos (Tedford e cols.,

2004).

Dentre os componentes de venenos de aranhas envolvidos na paralisação de insetos

estão as poliaminas e polipeptídeos. As poliaminas são inibidores pós-sinápticos capazes de

bloquear reversivelmente canais de cálcio, sensíveis ao glutamato, de músculos

locomotores de insetos o que leva à paralisia dos mesmos (Atkinson & Wright 1992b). Já

os polipeptídios tóxicos agem pré-sinapticamente de maneira essencialmente irreversível

induzindo ou inibindo a liberação de neurotransmissores (Atkinson & Wright 1992b).

Atualmente mais de 60 peptídeos tóxicos têm sido descritos. Muitos deles parecem agir

essencialmente sobre canais iônicos podendo bloquear a liberação de neurotransmissores,

por afetar a exocitose de vesículas pré-sinápticas, e induzir modificações anormais da

transmissão sináptica, resultando em paralisia flácida. Outros peptídeos podem provocar

paralisia excitatória induzida pela excessiva despolarização da membrana (Escoubas e cols.,

2000).

Três polipeptídios tóxicos com ação inseticida, isolados do veneno da aranha

Segestria florentina, causaram paralisia completa da larva Heliothis virescens (Ordem:

Lepdoptera/Família: Noctuidae). Uma toxina com atividade inseticida denominada SIT,

isolada do veneno da aranha Segestria florentina induziu também paralisia irreversível em

13

baratas (Lipkin e cols., 2002). A comparação da estrutura primária desses peptídeos com

peptídeos tóxicos de outras aranhas sugeriu que essa família de toxinas compartilha

relações estruturais e funcionais com outras neurotoxinas de aranhas, várias delas com

ações agonistas e antagonistas sobre diferentes canais de cálcio voltagem-dependentes

(Lipkin e cols.,2002).

Figueredo e cols. (1995) isolaram um componente neurotóxico denominado Tx4(6-

1) da fração PhTx4 do veneno da aranha Phoneutria nigriventer, que parece ser específica

para insetos. A seqüência completa de aminoácidos da Tx4(6-1) indica que se trata de um

polipeptídeo de cadeia simples contendo 48 aminoácidos com um peso molecular de

5251Da, e ensaios de atividade mostraram que a fração é capaz de agir sobre mosca

doméstica e barata.

Uma das principais vantagens do uso de inseticidas biológicos é a sua alta

especificidade em relação à praga alvo, não afetando outros insetos, plantas e animais

(Bergmann & Pinedo 2001). Portanto, vários peptídeos neurotóxicos com atividade

inseticida têm sido clonados a fim de se elucidar seus modos de ação sobre canais iônicos,

o que pode revelar a eficácia de tais peptídeos no controle de pragas agrícolas. Uma

estratégia que tem sido testada com sucesso consiste na utilização de baculovírus

geneticamente modificado para expressar neurotoxinas. Os baculovírus são patógenos

usados como inseticidas biológicos que agem especificamente em insetos. No entanto, os

baculovírus agem lentamente, permitindo, em muitos casos, que a praga destrua grande

parte da lavoura. Zlotkin e cols. (2000) clonaram uma neurotoxina do escorpião

Androctonus australis, denominada AaIT, em vetor de baculovírus e mostraram que o vírus

atua como um vetor da toxina recombinante dirigindo-a ao sistema nervoso central do

inseto, o que produz um aumento da toxicidade.

14

4.5- Atividade bactericida de venenos de aranhas

A perspectiva de se encontrar peptídeos de glândulas de veneno de aranhas com

atividade bactericida tem sido impulsionada pelo surgimento, cada vez maior, de bactérias

resistentes a antibióticos. O mecanismo de ação desses peptídeos, mais bem conhecido, é

através de sua inserção na membrana celular causando destruição ou permeabilização da

mesma, levando o microrganismo à morte. Alternativamente, os peptídeos antimicrobianos

podem se ligar a um receptor de membrana levando a uma perda específica de sua função.

Além disso, ao se translocarem através da membrana, essas moléculas com propriedade

antibiótica podem atuar intracelularmente, impedindo a síntese de metabólitos importantes

para o microrganismo (Lohner, 2001).

Em 1989, Xu & Qu encontraram um peptídeo antibiótico no veneno da aranha

Lycosa singoriensis. Recentemente, Yan & Adams (1998) descreveram a existência de

peptídeos com ação inseticida e bactericida no veneno da aranha Lycosa carolinensis,

denominados licotoxinas. Kuhn-Nentwig e cols. (1998) publicaram a estrutura de um

peptídeo com ação inseticida e bactericida, denominado CSTX-4, do veneno da aranha

errante Cupiennius salei. Dois anos depois, Haeberli e cols. (2000) caracterizaram com

maiores detalhes a atividade microbiana dos peptídeos do veneno desta mesma aranha.

Cinco diferentes peptídeos foram isolados do veneno da aranha Cupiennius salei e

suas atividades bactericidas foram testadas contra cinco diferentes espécies de bactérias,

tanto gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas putida, Paracoccus denitrificans)

como gram-positivas (Staphylococcus epidermidis e Bacillus subtilis). Todas as cinco

bactérias foram susceptíveis a todos os cinco peptídeos em concentrações que variaram de

0,18 a 18µM e o veneno bruto causou 100% de inibição no crescimento em diluições até

1:55.000 (Haeberli e cols., 2000).

Belokoneva e cols. (2004) descreverem a estrutura de dois peptídeos catiônicos

lineares denominados Pandinina 2 (Pin2 – 24 resíduos de aminoácidos) e Oxyopinina 1

(Oxki1 – 48 resíduos de aminoácidos) isolados do veneno bruto do escorpião Pandinus

imperator e da aranha Oxyopes kitabensis, respectivamente. Ambos os peptídeos

mostraram exercer efeitos inibitórios sobre o crescimento de bactérias tanto Gram-

negativas quanto Gram-positivas e atividade hemolítica sobre eritrócitos contendo

15

quantidades abundantes de fosfatidilcolina na membrana. Os peptídeos Pin2 e Oxki1 ligam-

se a fosfocolinas de membrana desencadeando a formação de poros na bicamada lipídica

(Belokoneva e cols., 2004). Os peptídeos antimicrobianos parecem fazer parte de uma

família de peptídeos catiônicos, α-helicoidais, anfipáticos e sem resíduos de cisteínas. Os

membros desse grupo de peptídeos são amplamente distribuídos em uma miríade de

venenos animais e fazem parte de um mecanismo inato de defesa contra diferentes tipos de

patógenos (Moerman e cols., 2003).

4.6. Bioquímica e biologia molecular de toxinas da aranha Lasiodora sp

Embora vários estudos tenham sido realizados com venenos de outras aranhas,

pouco se sabe a respeito das ações das toxinas presentes no veneno da aranha Lasiodora sp.

Todavia, estudos recentes com venenos desta aranha identificaram algumas das ações

farmacológicas deste veneno, tais como, bloqueio do canal de cálcio do tipo-L e modulação

da cinética e voltagem de canais de Na+ (Kushmerick e cols., 2001). Os experimentos

realizados demonstraram que, quando o veneno da Lasiodora sp foi administrado a células

GH3 na presença de TTX (tetrodotoxina), que bloqueia canais de Na+ sensíveis à TTX, as

oscilações de Ca2+ foram rapidamente abolidas, reduzindo assim o nível basal de Ca2+

intracelular. Quando administrado na ausência de TTX, o veneno causou um lento aumento

do Ca2+ intracelular, o que sugere que, substâncias tais como neurotransmissores ou outras

moléculas pequenas presentes no veneno bloqueiam canais de Ca 2+ Tipo-L (Kushmerick e

cols., 2001). Como a única diferença experimental foi a presença ou ausência de TTX, os

autores concluíram que, além de seus efeitos sobre canais de Ca2+, o veneno age também

sobre canais de Na+.

Kushmerick e cols. (2001) também observaram que quando o veneno foi

administrado em altas concentrações (500µg ml- de proteína) ou aplicado na presença de

nifedipina ou Cd2+ , ambos bloqueadores de canais do Tipo-L, não ocorre aumento do Ca2+

intracelular, o que sugere que este aumento depende da disponibilidade de canais de Na+ e

Ca2+ do Tipo-L. Os autores sugeriram então, que o veneno causa o aumento de Ca2+

intracelular via abertura de canais de Na+ causando, portanto, despolarização da membrana

16

e entrada de Ca2+ via canais de Ca2+ voltagem-dependentes. Assim sendo, os efeitos

observados pela administração do veneno da aranha Lasiodora sp demonstraram que o

mesmo é uma fonte de toxinas ativas em canais iônicos, possuindo, portanto, um valor

inestimável para a caracterização dos mesmos.

Kalapothakis e cols. (2003) obtiveram dados que sugerem que o veneno da aranha

Lasiodora sp ocasiona, em coração de rato, um aumento na liberação vesicular de

acetilcolina na extremidade de nervos parassimpáticos por ativar canais de Na + resistentes

à TTX. Uma dose equivalente a 100µg do veneno da aranha Lasiodora sp causou

bradicardia, distúrbios rítmicos e parada cardíaca transitória no modelo experimental

utilizado. Os resultados sugerem que o veneno dessa aranha parece agir sobre canais de Na+

resistentes à TTX uma vez que 200nM dessa substância não foram suficientes para inibir o

efeito do veneno sobre o coração.

O fracionamento do veneno total parcialmente purificado da aranha Lasiodora sp

através de cromatografia de filtração molecular em coluna Sephadex G50 Fine (Pharmacia)

foi realizado por de Deus e cols (2003). Os autores obtiveram três frações denominadas P1,

P2 e P3. A atividade tóxica de cada pico foi avaliada tanto em insetos quanto em

mamíferos. de Deus e cols. (2003) observaram que as três frações possuíam atividade sobre

mamíferos, enquanto que somente as frações P2 e P3 possuíam atividade sobre o sistema

nervoso de insetos.

Moura e cols. (2004) realizaram a varredura de uma sub-biblioteca de cDNA da

glândula de veneno da aranha Lasiodora sp utilizando-se de antisoro anti-P3. A fração de

IgG de coelho anti-P3 purificada a partir de IgGs totais foi utilizada como primeiro

anticorpo na varredura de sub-bibliotecas para identificar clones que codificam toxinas

presentes na fração P3 do veneno total, utilizando-se a técnica de ELISA como descrito por

Kalapothakis e cols. (2001). Na varredura, os autores encontraram sete clones que

codificam para a toxina LTx1. Essa toxina foi previamente descrita em nosso laboratório

(Vieira e cols., 2004) e é idêntica à toxina LpTx1 descrita por Escoubas e cols. (1997).

Outros quatro clones encontrados codificam uma toxina denominada LTx4 , similar

às toxinas Magi 1 e Magi 4 (Corzo e cols., 2003), isoladas da glândula de veneno da aranha

Macrothele gigas, à Conotoxina Vx-VIb (Wang e cols., GenBank: ANN71750 [gi:

25140450), isolada do molusco marinho Conus vexillum e à neurotoxina Tx3-2 (Cordeiro e

17

cols., 1993), isolada da aranha Phoneutria nigriventer. Ensaios biológicos utilizando as

toxinas Magi, realizados por Corzo e cols. (2003), demonstraram que a Magi 1 não possui

ação tóxica em larvas da lagarta do tabaco ou em camundongos. A toxina Magi 4 induz

paralisia flácida nas larvas podendo levá-las a morte, e é letal para camundongos na DL50

de 0,15 pmol/g. Cordeiro e cols. (1993) demonstraram que a neurotoxina Tx3-2 produz

efeitos motores e paralisia flácida em camundongos seis horas após a injeção intracérebro-

ventricular da toxina, e Kalapothakis e cols. (1998) demonstraram que a toxina Tx3-2

purificada bloqueia canais do tipo L em células GH3, sugerindo que a toxina é um novo

peptídeo que atua em canais iônicos do tipo L. Embora nenhum ensaio de atividade tenha

sido realizado com a toxina LTx4, Moura e cols. (2004) inferiram, baseados em ensaios de

atividade das toxinas com as quais LTx4 apresentou similaridades, que LTx4 possa também

possuir ação sobre o sistema nervoso de vertebrados.

Tendo em vista o vasto espectro de atuação das moléculas presentes em venenos de

aranhas, sobretudo sobre os canais iônicos, bem como a relação destes com distúrbios

neurológicos, faz-se necessário conhecer não só a estrutura e a função desses canais para a

identificação de outros distúrbios ligados aos mesmos, mas também a descoberta de novos

fármacos com eficácia terapêutica. Assim sendo, a utilização de neurotoxinas ativas para

esses estudos é de suma importância. Contudo, o fracionamento do veneno em seus

componentes tóxicos é um processo árduo e oneroso. Frente a isso, a clonagem de toxinas

surge como ferramenta fundamental deste trabalho, pois além do conhecimento molecular,

a obtenção em grandes quantidades das toxinas recombinantes será de enorme valor em

investigações neurobiológicas. Neste trabalho, propomos a caracterização de clones de

cDNAs utilizando-se de uma biblioteca de cDNA produzida a partir do mRNA extraído da

glândula de veneno da aranha Lasiodora sp bem como a clonagem, em vetores de

expressão, de genes que codificam para toxinas presentes no veneno da aranha em questão.

19

5. Objetivos

5.1. Objetivo Geral

Proceder a varredura de uma biblioteca de cDNA, preparada a partir de glândulas de

veneno da aranha Lasiodora sp, com o objetivo de identificar toxinas.

5.2. Objetivos Específicos

• Preparo de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNAs obtidos da glândula de

veneno da aranha Lasiodora sp;

• Varredura da biblioteca de cDNA utilizando a técnica de ELISA;

• Seqüenciamento e análise dos fragmentos gênicos que codificam para proteínas

imunogênicas;

• Clonagem, em vetores de expressão bacterianos, de fragmentos gênicos que

apresentarem similaridade com seqüências codificantes para toxinas depositadas no

GenBank;

• Expressão e purificação de toxinas recombinantes.

21

6. Materiais e métodos

6.1- Construção da Biblioteca de cDNA

A biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp foi construída

no Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do Departamento de

Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) pelos professores Dr.

Evanguedes Kalapothakis, Dr. Ieso de Miranda Castro e Dr. Elio Hideo Babá.

As glândulas de veneno das aranhas foram extraídas manualmente, pulverizadas em

presença de nitrogênio líquido usando pilão e pistilo e lisadas na presença de tiocianato de

guanidina, segundo o protocolo de Chirgwin e cols. (1979). O mRNA foi purificado através

de uma coluna de oligo (dT)-celulose usando Poly (A) Quick mRNA Isolation Kit

(Pharmacia) e o mRNA foi eluído de acordo com as recomendações do fabricante. A

síntese do DNA complementar foi realizada usando o Kit síntese ZAP-cDNA (Stratagene).

A figura 6 ilustra os passos de obtenção da molécula de cDNA. As moléculas de cDNA

foram inseridas direcionalmente entre os sítios Eco RI e Xho I do vetor Uni-ZapTM e

subseqüentemente empacotadas em partículas de fago Lambda ZAP usando o Kit Gigapack

III Packaging Extracts (Stratagene) (Figura 7).

22

Figura 6: Construção da molécula de cDNA. A transcriptase reversa catalisa a reação de síntese da primeira fita de cDNA usando como molde o mRNA isolado da glândula de veneno da aranha e um iniciador oligo(dT) contendo o sítio Xho I. O 5-metil dCTP é usado para adicionar grupos metil à primeira fita do cDNA. Uma RNase H cliva o mRNA molde permitindo assim a ação da DNA polimerase I e a síntese da segunda fita do cDNA. Com o auxílio da DNA ligase T4, adaptadores EcoR I são ligados às extremidades cegas do cDNA e em seguida são digeridas por suas respectivas enzimas de restrição (Xho I e Eco RI) (Figura adaptada do manual do fabricante Stratagene®).

5`GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGTTTTTTTTTTTTTTT3` AAAAAAAAAAAA 5`

5`GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGTTTTTTTTTTTTTTT3` AAAAAAAAAAAA 5`

CH3CH3 CH3

5`GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGTTTTTTTTTTTTTTT3`CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT GAGCTC A AAAAAAAAAAA

CH3 CH3CH3

3`

5`

5`GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGTTTTTTTTTTTTTT3`CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT GAGCTC A AAAAAAAAAA

3`5`

CH3 CH3CH3

dATP, dGTP, dTTP, 5-metil dCTP e MMLV-RT

RNase H, DNA polimerase IdNTPs e DNA ligase

Adapitadores Eco RIDNA ligase T4

Primer mRNA

5 CTCGAGTTTTTTTTTTTTTT3` C A AAAAAAAAAA

G 3`CTTAAG 5`

CH3 CH3 CH3

cDNA

GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGTTTTTTTTTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT GAGCTC A AAAAAAAAAA

CH3 CH3CH3

GAATTC 3`CTTAAG 5`

Xho I Eco RI

Enzimas de restriçãoXho I e Eco RI

5`GAATTC3`CTTAAG

23

6.2- Dosagem do mRNA

A quantificação do mRNA purificado foi realizada através de leitura no

espectrofotômetro a 260nm. O fator de conversão de densidade óptica (DO) = 1

corresponde à concentração de RNA de 40 µg/ml, de acordo com o protocolo descrito por

Sambrook e cols. (1989). As razões entre as leituras A260/A280 nm foram estimadas para

verificar a pureza do mRNA. A amostra foi considerada pura quando as razões acima

apresentaram valores entre 1.8 e 2.0.

6.3- Preparação do fago auxiliar M13

Inoculou-se 15µl de células E. coli, linhagem XL1-BLUE, em 10ml de meio

“superbroth” contendo tetraciclina na concentração de 12,5µg/ml e incubado a 37ºC por

uma hora. Em seguida, adicionou-se às células 2µl de fago e o sistema foi incubado a 37ºC

por 2 horas. Após esta incubação, as células foram transferidas para 500µl de meio

“superbroth” contendo tetraciclina na concentração de 12,5µg/ml e incubou-se sob agitação

à temperatura de 37ºC por 14-16 horas. No dia seguinte, as células foram centrifugadas por

15 minutos a 2500 g. O sobrenadante foi incubado por 20 minutos a 70ºC e então

novamente centrifugado. Após a centrifugação, o sobrenadante foi estocado em volumes de

50 µl a 4ºC, em presença de DMSO 7% (v/v).

24

6.4- Titulação do fago auxiliar M13

Cerca de 1µl de diluições seriadas do fago M13 (10-9, 10-10, 10-12, 10-38, 10-39, 10-40 e

10-42) em meio LB foram adicionados a alíquotas de 100µl de uma cultura de bactérias

XL1-Blue (DO600 = 1) e incubadas durante 30 minutos à temperatura de 37ºC. Após a

infecção, 5ml de meio top ágar foi adicionada à mistura que foi então semeada em meio

“superbroth” ágar. As placas foram incubadas por 16 horas a 37ºC. O título da preparação

em unidades formadoras de colônia por ml (pfu/ml) foi obtido através da fórmula:

Número de placas de lise (pfu) X fator de diluição X 1000µl/ml Volume plaqueado

6.5- Excisão em massa do fagemídeo pBK-CMV

Inicialmente, as células XL1-Blue e XLOLR, provenientes do estoque, foram

crescidas em meio LB-ágar tetraciclina (50µg/ml) com objetivo de se obter células novas.

No dia seguinte, uma colônia de cada bactéria foi novamente inoculada em 3 ml de meio

LB-caldo contendo tetraciclina na mesma concentração anterior, e procedeu-se o

crescimento por aproximadamente 3 horas a 37ºC. Em seguida, as células foram inoculadas

em 25 ml de meio NZY contendo maltose 0.2% e MgSO4 100mM. As células XL1-Blue e

XLOLR foram então centrifugadas a 1.000g durante 10 minutos e suspensas em Mg2SO4

10mM de forma a obter suspensões com DO igual a 5.0 e 0.75, respectivamente. O passo

seguinte consistiu na incubação de 100µl de biblioteca com 200µl de XL1-Blue e 1µl de

fago auxiliar M13 a 37ºC por 30 minutos. Decorridos os 30 minutos, foi acrescentado 1 ml

de meio NZY e o tubo foi incubado por 2 horas a 37ºC. Em seguida, o sistema foi incubado

por 15 minutos a 70ºC. Após a incubação, as células foram centrifugadas a 1000 g por 15

minutos. Após a centrifugação, uma alíquota de 200µl de sobrenadante foi recolhida e

adicionada a 200µl de XLOLR que foram então incubados por 30 minutos a 37ºC.

Transcorrido o tempo de incubação, foram adicionados 300µl de meio NZY e o sistema foi

incubado por 45 minutos a 37ºC sob agitação (shaker). Em seguida, alíquotas de 100µl

foram plaqueados em meio LB-ágar contendo canamicina (50µg/ml) e X-Gal, totalizando 7

25

placas. À placa controle, adicionou-se 100µl de XLOLR, apenas. Como a XLOLR usada na

placa controle não passou pelo processo de infecção, e portanto não possui o DNA

recombinante, ela é sensível à canamicina, e portanto não é capaz de crescer. As placas

foram incubadas a 37ºC durante a noite. As placas contendo colônias de bactérias

recombinantes foram estocadas a 4ºC, por no máximo uma semana.

A figura 7 ilustra a inserção do cDNA dentro do genoma do fago Lambda, bem como

sua posterior excisão e recircularização na forma de fagemideo pBK-CMV contendo o

inserto clonado.

26

Figura 7: Ligação do cDNA no vetor ZAP Express e excisão em massa do fagemídeo pBK-CMV. O cDNA (DNA insert) é inserido unidirecionalmente no sitio múltiplo de clonagem (CMV), flanqueado pelos promotores T3 e T7, do vetor ZAP Express, entre os sítios de restrição Xho I e Eco RI e posteriormente empacotado em partículas viáveis de fago (biblioteca). A excisão do fagemideo pBK-CMV contendo inserto, bem como sua infecção em células E. coli (linhagem XLOLR), foi realizada com o auxilio de um fago helper (fago auxiliar). (Fonte: http//www.stratagene.com).

27

6.6- Preparo do estoque de bactérias recombinantes

As colônias de bactérias provenientes da excisão em massa foram coletadas usando-se

um palito e inoculadas em tubos contendo meio LB-canamicina. Procedeu-se o crescimento

em um agitador rotatório (shaker) a 37ºC por 14-16 horas. No dia seguinte, as culturas

foram transferidas para tubos de microcentrífuga (1,7ml), identificadas, estocadas em

presença de glicerol (30% v/v final) e armazenadas à temperatura de –80ºC.

6.7- Preparo do extrato livre de células

As bactérias recombinantes foram crescidas em LB-caldo contendo canamicina

(50µg/ml) e IPTG (50µg/ml) por 14-16 horas, a 37ºC, sob agitação. No dia seguinte, as

culturas foram centrifugadas em tubos de vidro por 5-8 minutos a 1.000g e o sobrenadante

foi desprezado. As células foram suspensas em 500µl de água Milli-Q e submetidas a uma

nova centrifugação. O sobrenadante foi desprezado e as células suspensas em 400µl de uma

solução de tampão carbonato (Na2CO3 15mM, NaHCO3 35mM pH 9,6) contendo PMSF

0.5mM. As células foram rompidas com pérolas de vidro (aproximadamente 1/3 do volume

de solução de tampão carbonato) com o auxílio de um agitador de tubos. Após a lise,

procedeu-se nova centrifugação por 5 minutos a 1.000g e os sobrenadantes fora transferidos

para tubos de 1,5ml, devidamente identificados com o número do clone, e estocados a

–20ºC para posterior análise (ELISA).

28

6.8- ELISA (Enzyme Linked Imunosorbent Assay)

A varredura da biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp foi

realizada através da técnica de ELISA, como descrito por Kalapothakis e cols (2001).

Placas de ELISA com 96 poços foram sensibilizadas durante 16 horas com 100µl de

extratos celulares a 4ºC. No dia seguinte, as placas foram lavadas por 4 vezes com uma

solução de NaCl 0,15M - Tween 20 - 0,05%. Os poços foram bloqueados com 100µl de

solução de caseína 1% preparada em PBS 1x - Tween 20 - 0,05% e a placa mantida a 37ºC

por 1 hora. Após o bloqueio, as placas foram lavadas 4 vezes com NaCl 0,15 M - Tween 20

- 0,05%. Aos poços foram então adicionados 100µl de IgGs de coelho (anti-veneno total)

diluído 1:5000 (2µl para 10ml de PBS 1x - caseína 0,2% - Tween 20-0,05%). Incubou-se

novamente a placa, a 37ºC por 2 horas. Transcorrido o tempo de incubação, os poços foram

lavados 4 vezes com NaCl 0,15M - Tween 20 - 0,05%. Após a lavagem, adicionou-se a

cada poço 100µl de anti-IgG de coelho-peroxidase diluído 1:4000 (2,5µl em 10ml de PBS

1x -caseína 0,2% - Tween 20-0,05%). Incubou-se por mais 1 hora à temperatura de 37ºC e

em seguida lavou-se 10 vezes com NaCl 0,15M - Tween 20 - 0,05%. A cada poço foram

adicionados 100µl de OPD 0.2mg/ml solubilizado em tampão citrato (Na2HPO4 50mM,

ácido cítrico 24mM pH 5.0) mais H2O2 (30%v/v) 0,2µl/ml. A reação foi incubada na

ausência de luz por 25 minutos e em seguida, interrompida com 20µl de H2SO4 diluído

1:20. A leitura da placa foi feita a 492nm usando-se um leitor de placas de ELISA

(Molecular Devices Emax Spectrophotometer). Os clones que se mostraram positivos

foram confirmados em um segundo ensaio imunológico. Como controle negativo da reação,

nós utilizamos extratos de bactérias XLOLR não infectadas.

29

6.9- Extração do DNA plasmidial

Os clones que se mostraram positivos no teste de ELISA foram crescidos a 37ºC por

16 horas em 3 ml de meio LB-caldo contendo canamicina na concentração final de

50µg/ml. No dia seguinte, duas alíquotas de 1,5 ml de cada clone foram centrifugadas em

tubos de microcentrífuga (1,5 ml) por 3 minutos a 3000 g. O sobrenadante foi desprezado e

as células foram suspensas em 200µl de STET e 5µl de lisozima. Procedeu-se então uma

incubação por 5 minutos à temperatura ambiente e posteriormente a 95ºC por 60 segundos.

A mistura foi centrifugada por 10 minutos a 10.000g. Após a remoção dos restos celulares,

adicionou-se 8µl de CTAB e procedeu-se nova centrifugação, a 10.000g, por 10 minutos.

Após desprezar o sobrenadante, o precipitado foi suspenso em 200µl de uma solução 1,2 M

de NaCl. Os tubos foram levados rapidamente ao vortex e em seguida, adicionou-se 400µl

de fenol/clorofórmio a cada tubo. O conteúdo dos tubos foi agitado vigorosamente por 2

minutos com o auxílio de um agitador de tubos. Em seguida, os tubos foram submetidos à

centrifugação por 10 minutos a 10.000g à temperatura ambiente. Após a centrifugação, a

camada superior foi transferida para outro tubo de microcentrífuga e tratada com 5µl de

RNase por 30 minutos à temperatura ambiente. Decorridos os 30 minutos, o DNA foi

precipitado pela adição de etanol 100% (2,5 vezes o volume da solução de DNA) e

incubação por 1 ou 2 horas a –20ºC. Após a incubação, o DNA foi obtido por centrifugação

por 10 minutos, a 10.000g e o sobrenadante desprezado. O DNA foi lavado (1 ou 2 vezes)

com 400µl de etanol 70% e novamente centrifugado por 10 minutos a 10.000g. O etanol

residual foi eliminado por evaporação usando-se um bloco térmico (40ºC) ou o sistema

speed vac.

30

6.10- Preparo do gel de agarose

Pesou-se 1g de agarose e adicionou-se a 100ml de TAE 1x (40mM de Tris-acetato,

1mM de EDTA, pH 8,0 ajustado com ácido acético). A solução foi aquecida em forno de

microondas até completa solubilização da agarose.

6.11- Eletroforese do DNA em gel de agarose

Com o objetivo de quantificar o DNA plasmidial extraído, procedeu-se a eletroforese

de uma alíquota do DNA em gel de agarose 1% (p/v) durante 1 hora a 100mV. A um

volume de 3µl de DNA acrescentou-se 6µl de água e 1µl de tampão da amostra (0,25 % de

azul de bromofenol, 0,25 % de xilenocianol e 30% p/v de glicerol). Após a aplicação da

amostra e o desenvolvimento da eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de

etídio (0,5 mg/ml) diluído em TAE 1X, por 15 minutos. O gel foi visualizado em um

transluminador a 356 nm e fotografado por um sistema Sony (Modelo SSC-M 370CE)

acoplado a um visor e a uma impressora. No processo de quantificação utilizamos como

referência o padrão de DNA (1Kb - Invitrogen®)

31

6.12- Seqüenciamento do DNA

Os clones que se mostraram positivos após varredura utilizando a técnica de ELISA

foram seqüenciados de acordo com o método descrito por Sanger e cols. (1977) utilizando-

se do kit de seqüenciamento DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for

Mega BACE DNA Analysis System (Amersham Biosciences). O seqüenciamento foi feito

em ambas as fitas utilizando-se os iniciadores BK reverse e o T7 primer, que se anelam no

vetor pBK-CMV.

A reação de amplificação foi preparada como descrito abaixo:

• 4µl de Mix (kit seqüenciamento)

• 1 µl de iniciador (5 pMol) direto ou reverso

• 4 µl de DNA (200ng)

• 1 µl de água

As reações foram conduzidas em um termociclador (Mastercycler, Eppendorff),

conforme o programa descrito a seguir:

1. Rápida elevação da temperatura a 95ºC

2. 95ºC por 25 segundos

3. 50ºC por 20 segundos

4. 60ºC por 1 minuto

O ciclo foi repetido por 30 vezes.

Abaixamento da temperatura a 4ºC.

As seqüências dos iniciadores utilizados nas reações de sequenciamento encontram-se

descrita abaixo.

Iniciadores Seqüências BK-reverse 5`-ACAGGAAACAGCTATGACCTTG-3`

T7 primer 3`-CGGGATATCACTCAGCATAATG-5`

32

6.13- Purificação dos produtos de extensão

Adicionou-se 80µl de isopropanol (75%) a 10µl do produto da reação de

sequenciamento. Após 15 minutos, à temperatura ambiente, procedeu-se uma centrifugação

por 30 minutos a 1.000 g e desprezou-se o sobrenadante. Em seguida, lavou-se o

precipitado com 250µl de isopropanol a 75% e procedeu-se nova centrifugação por 5

minutos a 1.000 g. Desprezou-se o sobrenadante e secou-se o precipitado à temperatura

ambiente por 1 hora. Após a secagem, suspendeu-se o DNA em 10µl de tampão da amostra

(azul de bromofenol 0.25%, xilenocianol 0.25% e glicerol 30). Uma alíquota do DNA a ser

seqüenciado foi submetida à eletroforese em gel de agarose com o objetivo de estimar a

concentração de DNA obtida. Após a quantificação do DNA, procedeu-se à análise do

DNA em um aparelho de seqüenciamento automático Mega BACE 500.

6.14- Análise das seqüências de nucleotídeos obtidas

Todas as seqüências nucleotídicas dos clones que se mostraram positivos em dois

ensaios imunológicos de ELISA foram submetidas a análises pelos programas Blastn,

Blastx, BlastP (Basic Local Alignment Search Tool – Altschul e cols., 1990 – disponível em

http//:www.ncbi.nlm.nih.gov), SIXFRAME (disponível em http//:workbench.sdsc.edu),

SignalP e ProtScale (disponíveis em http//:www.cbs.dtu.dk) .

6.15- Clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 em sistema de expressão bacteriano pET-11a Novagen®

O procedimento de clonagem foi desenhado com o intuito de inserir apenas a

seqüência que codifica as toxinas maduras dos clones selecionados na varredura da

biblioteca de cDNA da aranha Lasiodora sp no vetor selecionado. O sistema de expressão

pET é um poderoso sistema desenvolvido para a clonagem e expressão de proteínas

recombinantes em células E. coli. Os vetores de expressão pET apresentam um sistema de

33

indução baseado no promotor da T7 RNA polimerase, desenvolvido por Studier e cols.

(1990). Nesses vetores de expressão, o operador Lac encontra-se inserido entre o promotor

T7 e seqüências de iniciação de tradução, o que permite desrepressão, mediada por IPTG,

do promotor T7 em adição à indução mediada por IPTG da T7 polimerase do promotor lac

UV5 em cepas de bactérias DE3. As etapas da clonagem das toxinas, no sistema de

expressão pEt-11a, estão descritas a seguir.

6.15.1- Amplificação da região correspondente às toxinas maduras LTx1 e LTx3 para clonagem em sistema PCR® 2.1 TOPO TA Cloning Invitrogen®

Com o objetivo de proceder a clonagem, apenas da região que codifica as toxinas

maduras LTx1 e LTx3, no vetor de expressão bacteriano pET-11a (Novagen®), desenhamos

pares de iniciadores contendo os sítios de restrição Nde I e BamH I. As seqüências dos

iniciadores utilizados nas reações de PCR para a amplificação das toxinas maduras LTx1 e

LTx3 encontram-se descritas abaixo:

Iniciadores Seqüências Forward 5’-CCATATGTTTTTCGAATGTAC-3’

Reverse 5’-GGGATCCCTAAAACTTCAAAC-3’

34

Para amplificar a região correspondente as toxinas maduras LTx1 e LTx3,

procedeu-se a reação em cadeia da polimerase utilizando-se o DNA plasmidial extraído

previamente como molde da reação (DNA template). O volume dos reagentes utilizados na

reação de PCR está descrito a seguir.

• 1µl de DNA plasmidial

• 3.0µl de dNTP (solução estoque 2.5mM)

• 3.0µl de tampão Taq 10x

• 1.5µl de MgCl2 (25mM)

• 1.0µl de iniciador F (20 pmoles)

• 1.0µl de iniciador R (20 pmoles)

• 0.5µl de Taq DNA polimerase

• 19µl de água Milli-Q estéril

Após a adição de uma gota de óleo mineral, procedeu-se a reação, em um

termociclador, conforme o programa descrito abaixo.

1. 95ºC por 4 minutos




5. Etapas 2 a 4 (34 vezes)


7. Abaixamento da temperatura a 4ºC, até purificação.

35

6.15.2- Preparo de gel de poliacrilamida 6 %

Para o preparo de gel de poliacrilamida 6%, procedeu-se à mistura dos seguintes

reagentes.

• 1.5 ml de acrilamida 40%

• 1.0 ml de TAE 10x

• 7.5 ml de água Milli-Q

• 75µl de persulfato de amônio 10%

• 5.0µl de TEMED

6.15.3- Purificação do produto de PCR em gel de poliacrilamida

Após a reação de amplificação da região correspondente às toxinas maduras LTx1 e

LTx3, o produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida (tampão

Tris-acetato 1X) por 50 minutos a 100 volts. O gel foi corado com brometo de etídio por 5

minutos sob baixa agitação. As bandas correspondentes às toxinas maduras LTx1 e LTx3

(aproximadamente 170 pares de bases) foram extraídas com o auxilio de uma lâmina de

bisturi e transferidas para um tubo de microcentrifuga (1.5ml) contendo 500µl de solução

TE 1X NaCl 1M. O conteúdo do tubo foi agitado com o auxilio de um agitador de tubos e

imediatamente incubado a 37ºC por 2 horas. Após incubação, procedeu-se uma

centrifugação por 10 minutos a 10.000g. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de

microcentrifuga ao qual adicionaram-se 400µl de fenol/clorofórmio alcalino. Após agitação

do conteúdo presente no tubo com o auxílio de um agitador de tubos, procedeu-se nova

centrifugação por 10 minutos a 10.000g. A suspensão aquosa (contendo o DNA) foi

transferida para outro tubo de microcentrifuga ao qual adicionou-se 2 volumes de etanol

100% e 1µl de tRNA (concentração estoque 10mg/ml). O conteúdo do tubo foi mantido a -

80ºC por 40 minutos. Após a precipitação, procedeu-se nova centrifugação por 15 minutos

36

a 10.000g. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 400µl de etanol 70%. Procedeu-se

nova centrifugação por 10 minutos a 10.000g. O sobrenadante foi desprezado e o DNA foi

mantido a 65ºC por 15 minutos em um bloco térmico. Após a secagem, o DNA foi

suspenso em 20µl de água Milli-Q estéril.

6.15.4- Clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 em PCR® 2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen®

A clonagem dos fragmentos (produtos de PCR) que codificam as toxinas maduras

LTx1 e LTx3 em sistema PCR® 2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen® foi realizada como uma

estratégia para facilitar a clonagem das toxinas maduras no vetore pET-11a. A figura 8

ilustra o mapa do vetor PCR® 2.1 TOPO TA Cloning Invitrogen® utilizado.

Após a purificação dos produtos de PCR, correspondentes aos fragmentos que

codificam as toxinas maduras (LTx1 e LTx3), como descrito em 6.15.3, os mesmos foram

inseridos no vetor PCR® 2.1-TOPO® conforme protocolo descrito a seguir:

• 2µl de DNA (produto de PCR)

• 1µl de salt solution

• 1µl de vetor TOPO®

• 2µl de água milli-Q estéril

A reação foi mantida à temperatura ambiente por 10 minutos.

37

Figura 8: Mapa do vetor de clonagem PCR® 2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen® (Disponível em: www.invitrogen.com)

38

6.15.5- Preparo de células E. coli Top 10 F’competentes (Método CaCl2)

Células de E. coli, linhagem TOP 10 F’, foram pré-inoculadas em 3ml de meio LB

caldo contendo estreptomicina (10µg/ml) e tetraciclina (10µg/ml). As células foram

crescidas sob agitação constante (200 rpm), por 14-16 horas, à temperatura de 37ºC. Após o

crescimento, as bactérias foram transferidas para um erlenmeyer contendo 100µl de LB

sem antibiótico. Procedeu-se nova incubação a 37ºC, 200 rpm por um período de 2-3 horas

até que as células atingissem uma densidade ótica entre 0.6 e 0.8. Atingida a densidade

ótica ótima, as bactérias foram submetidas à centrifugação por 8 minutos a 1.000g em

centrifuga refrigerada (4ºC). O sobrenadante foi desprezado e as células suspensas em 40

ml de CaCl2 0.1M gelado. Incubou-se em gelo por pelo menos 1 hora. Após incubação,

procedeu-se nova centrifugação por 5 minutos a 1.000g em centrifuga refrigerada.

Desprezou-se o sobrenadante, e as células foram suspensas em 1ml de CaCl2 0.1M.

Alíquotas de 100µl foram estocadas em tubos de microcentrífuga, contendo 30% de

glicerol, e mantidas a temperatura de -80ºC.

6.15.6. Transformação de células de E. coli Top 10 F’ com o produto de ligação em PCR® 2.1-TOPO®

Células de E. coli (linhagem Top 10 F’) competentes foram descongeladas e

mantidas em gelo. Adicionou-se 6µl do produto de ligação (PCR® 2.1-TOPO® mais

fragmentos) ao tubo contendo 100µl de células competentes. Incubou-se em gelo por 15-30

minutos. Após a incubação, a mistura foi submetida a um choque térmico a temperatura de

42ºC por 2 minutos. Imediatamente após o choque térmico, um volume de 1 ml de meio LB

foi adicionado à mistura. Procedeu-se nova incubação por 50 minutos a temperatura de

37ºC. Após incubação, procedeu-se uma centrifugação por 4 minutos a 3.000g. O excesso

de sobrenadante foi desprezado e as células foram suspensas em aproximadamente 100µl

39

de meio LB restante no tubo. As células foram semeadas em placas contendo meio LB

ampicilina com o auxilio de pérolas de vidro e incubadas a 37ºC por 14-16 horas.

6.15.7- Reação em cadeia da polimerase de colônias provenientes da transformação de E. coli Top 10 F’ com o produto de ligação em PCR® 2.1-TOPO®

Colônias de bactérias provenientes da transformação foram submetidas à reação em

cadeia da polimerase para confirmar a presença dos fragmentos que codificam as toxinas

maduras LTx1 e LTx3 no vetor PCR® 2.1-TOPO®. Os iniciadores utilizados na reação

foram:

Iniciadores Seqüências M13 Reverse Primer 5’-GTCCTTTGTCGATACTG-3’

M13 Forward Primer 5’-GACCGGCAGCAAAATG-3’

Para amplificar a região correspondente às toxinas maduras LTx1 e LTx3,

procedeu-se a reação em cadeia da polimerase utilizando-se 0.5µl de cultura dos clones

provenientes da transformação como molde da reação (DNA template). O sistema da

reação de PCR encontra-se descrito abaixo:

• 0.5µl da cultura (clone)





• 1.0µl de iniciador R (20pmoles)


• 19.5µl de água Milli-Q estéril

40

Após a adição de uma gota de óleo mineral, procedeu-se a reação em um








7. Abaixamento da temperatura a 4ºC, até purificação.

6.15.8- Extração do DNA plasmidial de colônias provenientes da transformação de E. coli Top 10 F’ com o produto de ligação em PCR® 2.1-TOPO®

As colônias que se mostram positivas na reação de PCR (apresentaram uma

amplificação de aproximadamente 374 pb) foram inoculadas em 5 ml de meio LB caldo

contendo ampicilina na concentração de 10µg/ml e incubadas por 14-16 horas a

temperatura de 37ºC sob agitação de 200 rpm. A extração do plasmídeo PCR® 2.1-TOPO®

contendo inserto foi realizada utilizando-se o kit de extração de DNA plasmidial Wizard

Plus SV DNA Minipreps Promega®.

41

6.15.9- Digestão dos plasmídeos PCR® 2.1-TOPO®-LTx1 (e LTx3) com as enzimas Nde I e BamH I para clonagem do fragmento liberado no sistema de expressão pET-11a (Novagen®)

Vetores PCR® 2.1-TOPO® contendo insertos que codificam para as toxinas LTx1 e

LTx3 foram digeridos com as enzimas de restrição Nde I e Bam H I para a posterior

clonagem do produto de digestão no sistema de expressão pET-11a, conforme protocolo a

seguir.

• 7.0µl de DNA plasmidial

• 3.0µl de tampão K (Amersham)

• 0.3µl BSA

• 0.7µl de Nde I

• 1.0µl de BamH I


Incubação por 2 horas a 37ºC.

6.15.10- Purificação dos produtos de digestão

Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida

por 50 minutos a 100 volts com o objetivo de purificar as bandas correspondentes aos

insertos que codificam as toxinas maduras LTx1 e LTx3 (aproximadamente 170 pb). A

purificação da banda de interesse foi conduzida conforme protocolo descrito em 6.15.3.

42

6.15.11- Digestão do vetores de expressão pET-11a e pET-21b com as enzimas de restrição Nde I e Bam H I

Vetor pET-11a (Novagen®) (Figura 9) obtido a partir de mini-preparação de DNA

plasmidial como descrito na secção 6.9, foi digerido com as enzimas de restrição Nde I e

Bam H I para a posterior clonagem dos fragmentos que codificam as toxinas maduras LTx1

e LTx3 seguindo o protocolo descrito abaixo.

• 7.0µl de pET-11a

• 3.0µl de tampão K (Amersham)

• 0.3µl BSA

• 0.7µl de Nde I

• 1.0µl de BamH I


A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 37ºC. Após a digestão, procedeu-se a

defosforilação do vetor com o objetivo de evitar a sua recircularização. Ao produto de

digestão, adicionou-se 3µl de tampão e 0.5µl de CIP (calf intestinal phosphatase). A

mistura foi incubada a 37ºC por 30 minutos. A inativação da enzima procedeu-se a 75ºC

por 10 minutos.

6.15.12- Purificação do vetor de expressão utilizando papel

Whatman DE81

Após a digestão do vetor de expressão pelas enzimas de restrição, todo o volume da

reação foi aplicado em gel de agarose 1% e submetido à eletroforese por 1 hora e 120 volts.

O gel foi corado com brometo de etídio e as bandas visualizadas em luz ultravioleta com o

auxílio de um transiluminador. Com o auxílio de uma lâmina de bisturi, procedeu-se um

corte no gel à frente da banda correspondente ao DNA digerido. Introduziu-se no corte

meio disco de papel Whatman DE81. O gel foi novamente submetido à eletroforese por 10

minutos e 120 volts para propiciar a ligação do DNA ao papel Whatman DE81. O gel foi

43

novamente levado ao transluminador para certificar que todo o DNA havia se ligado ao

papel. Com o auxílio de uma pinça, o papel foi transferido para um tubo de microcentrífuga

(1,5 ml) ao qual adicionou-se 500µl de TE 1X NaCl 1M. Agitou-se por 30 segundos com o

auxílio de um agitador de tubos e incubou-se por 2 horas em estufa a 37ºC. Após

incubação, centrifugou-se por 5 minutos a 10.000g e o sobrenadante foi transferido para um

novo tubo de 1,5ml. Adicionou-se 400µl de fenol/clorofórmio alcalino e o conteúdo do

tubo foi agitado vigorosamente com o auxílio de um agitador de tubos. Procedeu-se nova

centrifugação por 10 minutos a 10.000g. Após a centrifugação, o sobrenadante (fase

aquosa) foi transferido para outro tubo de microcentrífuga ao qual adicionou-se 2 volumes

de etanol 100%. O tubo foi mantido por 40 minutos à temperatura de -80ºC para permitir a

precipitação do DNA. Após a precipitação do DNA, procedeu-se nova centrifugação por

15 minutos a 10.000g. Desprezou-se o sobrenadante e adicionou-se 400µl de etanol 70%. O

tubo contendo o DNA foi submetido a uma nova centrifugação por 10 minutos a 10.000g.

Após desprezar o sobrenadante, procedeu-se a secagem do DNA em um speed-vac. O DNA

foi suspenso em 20µl de água Milli-Q estéril e estocado a -80ºC.

44

6.15.13- Clonagem dos fragmentos que codificam as toxinas LTx1 e LTx3 no vetor de expressão pET-11a

Após a digestão dos plasmídeos PCR® 2.1-TOPO®, contendo as seqüências

codificantes para LTx1 e LTx3, e dos vetores de expressão pET-11a (Figura 9) com as

enzimas de restrição Nde I e BamH I, ambos os fragmentos foram submetidos a reação de

ligação no vetor de expressão utilizando-se a enzima T4 DNA ligase, conforme o protocolo

descrito abaixo.

• 3µl de DNA vetor pET-11a

• 5µl DNA inserto

• 0.7µl de T4 DNA ligase Promega®

• 10µl de Tampão da ligase 2x


• Incubação por 14-16 horas a temperatura de 16ºC em um bloco térmico

(Termomixer Eppendorff®) mantido a 4ºC em câmara fria.

45

Figura 9: Mapa esquemático do vetor de expressão bacteriano pET-11a Novagen®. O sistema pET-11a possui um sistema de detecção e purificação da proteína recombinante baseado em uma pequena seqüência T7-Tag.

46

6.15.14- Transformação de células de E. coli Top 10 F’ com o produto de ligação no vetor de expressão pET-11a

Após a ligação dos fragmentos que codificam para as toxinas maduras LTx1 e LTx3

no vetor de expressão pET-11a, como descrito em 6.15.13, procedeu-se a transformação de

células de E. coli Top 10 F’ utilizando-se todo o produto das ligações. Os demais passos da

transformação foram conduzidos conforme descrito na secção 6.15.6.

6.15.15- Reação em cadeia da polimerase de colônias provenientes da transformação de células de E. coli Top 10 F’ com os produtos de ligação no vetor de expressão pET-11a

Colônias de bactérias provenientes da transformação descrita em 6.15.14 foram

submetidas à reação em cadeia da polimerase para confirmar a presença dos fragmentos

que codificam as toxinas maduras LTx1 e LTx3 no vetor de expressão pET-11a. Os

iniciadores utilizados na reação foram.

Iniciadores Seqüências PET-F PET-R

3’-TATAGGGGAATTGTGAGCGG-5’ 3’-CTTTCGGGCTTTGTTAGCAG-5’

47

Para amplificar a região correspondente às toxinas maduras LTx1 e LTx3,

procedeu-se a reação em cadeia da polimerase utilizando-se 0.5µl de cultura dos clones

provenientes da transformação como molde da reação. O sistema da reação de PCR

encontra-se descrito abaixo:

• 0.5µl de cultura





• 1.0µl de iniciador R (20 pmoles)



Após a adição de uma gota de óleo mineral, procedeu-se a reação, em um








Abaixamento da temperatura a 4ºC, até purificação.

48

6.15.16- Transformação de bactérias de expressão (E. coli linhagem BL-21 DE3) com a construção pET-11a-LTx1 e pET-11a-LTx3

Células competentes E. coli linhagem BL-21 (DE3) foram descongeladas em gelo e

transformadas com as construções pET-11a-LTx1 e pET11a-LTx3, como descrito em

6.15.6.

6.16- Indução da expressão da toxina recombinante LTx1 clonada no vetor de expressão pET-11a

Um volume de 20µl de células E. coli linhagem BL-21 transformada com a

construção pET-11a-LTx1 foi inoculado em 4ml de meio LB-caldo contendo ampicilina

(100µg/ml) e incubado a 37ºC, 200 rpm por 14-16 horas. No dia seguinte, o pré-inóculo foi

vertido em 100ml de meio LB-caldo contendo ampicilina (100µg/ml) e incubado a 30ºC,

200 rpm, até que a DO600 atingisse um valor entre 0,6-0,8. Ao atingir a DO600 desejada,

uma alíquota de 100µl de células (correspondente ao tempo zero de indução) foi

centrifugada em uma microcentrífuga por 2 minutos a 10.000g. Descartou-se o

sobrenadante e as células foram suspensas em 100µl de tampão da amostra (SDS-PAGE

2X) contendo agente redutor para posterior análise em gel SDS-PAGE. A expressão da

LTx1 recombinante foi induzida pela adição de IPTG (0,6mM concentração final) à cultura

e incubação à temperatura de 30ºC sob agitação (200 rpm) por 5 horas. Após diferentes

tempos de indução (1h, 2h, 3h, 4h e 5h), alíquotas de 100µl de células foram centrifugadas

e tratadas com o tampão da amostra (SDS-PAGE 2X) como descrito acima. A

quantificação da proteína de cada alíquota foi realizada pelo método de Bradford. As

alíquotas suspensas em tampão da amostra (SDS-PAGE 2X) foram submetidas à

temperatura de 95ºC por 5 minutos e um volume contendo 20µg de proteína foi analisado

em gel SDS-PAGE.

49

6.16.1- Produção da toxina LTx1 recombinante e solubilidade da proteína

Após 5 horas de indução (como descrito em 6.16), a cultura (100ml) foi

centrifugada por 15 minutos, 4ºC, 1.000g. O sedimento celular foi suspenso em 10ml de

solução de lise (50mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl e 10mM imidazol) contendo 80µl de

lisozima (solução estoque 50mg/ml), 1µl de aprotinina (solução estoque 10mg/ml), 1µl de

pepstatina (solução estoque 10mg/ml) e 200µl de PMSF (solução estoque 50mM) e

mantido em gelo por 30 minutos. Após incubação, as células foram submetidas à sonicação

(200 a 300 w) por 6 vezes com pulsos de 10 segundos e intervalos de 10 segundos em gelo.

Após a sonicação, adicionou-se à solução 0,1% de Triton X100. As células sonicadas foram

submetidas à centrifugação por 30 minutos, 1.000g, a 4ºC. O sobrenadante foi transferido

para um tubo falcon (15ml) e concentrado para análise em SDS-PAGE.

Para testar a produção da proteína sob a forma de corpos de inclusão, o sedimento

proveniente da sonicação da cultura de células induzidas por 5 horas foi submetido a 2

lavagens (20ml cada) com tampão de ligação 1 (50mM Tris, 500mM NaCl, 10mM

mercaptoetanol e 2M uréia). Após as lavagens e centrifugação por 5 minutos, a 4ºC,

1.000g, o precipitado foi suspenso, com o auxílio de uma pipeta, em 375 µl de tampão X

(50mM Tris, 500mM NaCl, 10mM β-mercaptoetanol e 8M uréia). Um volume de 35ml de

tampão de ligação 2 pH 8.0 (50mM Tris, 500mM NaCl e 5mM imidazol) foi

vagarosamente adicionado ao tubo contendo o precipitado suspenso em tampão X e

incubado por 24 horas à temperatura de 4ºC para permitir a renaturação das proteínas

eventualmente presentes nos corpos de inclusão. No dia seguinte, procedeu-se nova

centrifugação por 15 minutos, 1.000g, a 4ºC. O sobrenadante (35ml) foi concentrado para

análise posterior.

50

6.16.2- Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE

Para a eletroforese das frações contendo, eventualmente, a toxina LTx1

recombinante, adotou-se o sistema de gel desnaturante (SDS-PAGE) descrito por Laemmli

e cols. (1970). As concentrações dos géis foram de 4% para o gel de concentração e 18%

para o gel de separação. As amostras (30µg) foram tratadas com o tampão da amostra SDS-

PAGE 2X contendo o agente redutor β-mercaptoetanol, fervidas durante 5 minutos, e

aplicadas no gel. A eletroforese procedeu-se verticalmente a 100V, em tampão Tris 0,025M

pH 8,3 contendo 0,96M de glicina e 0,1% de SDS. Após a eletroforese o gel foi revelado

em solução de nitrato de prata. As soluções usadas encontram-se descritas no final deste

capítulo.

6.16.3- Coloração pelo método da prata

Após a eletroforese, o gel foi transferido para uma cuba contendo solução fixadora e

procedeu-se a incubação por 1 hora. Em seguida o gel foi lavado com etanol 50% (solução

de lavagem), por 3 vezes, por 20 minutos. Após as lavagens, o gel foi tratado com uma

solução de tiossulfato de sódio (0,4g/ml) por 2 minutos. Em seguida, procedeu-se nova

lavagem com água destilada, por 3 vezes, 20 minutos. Após as lavagens, procedeu-se a

incubação do gel por 20 minutos em solução de impregnação. Após a impregnação, o gel

foi incubado em solução de desenvolvimento até o aparecimento das bandas. A reação foi

interrompida pela adição da solução de parada. A composição das soluções utilizadas nesse

método de coloração encontra-se no final deste capítulo.

51

6.16.4- Western Blot

As proteínas separadas eletroforeticamente em gel de poliacrilamida-SDS 18%

foram transferidas para um filtro de nitrocelulose (Amersham, poros de 0,45 µm), com o

auxílio de um sistema de transferência Pharmacia LKB-PhastSystem, por 40 minutos, 5 v,

50mA. O sistema foi montado fazendo-se um “sanduíche” com 3 folhas de papel de filtro

3mm, 1 folha de membrana de nitrocelulose, o gel contendo amostras a serem transferidas e

mais 3 folhas de papel de filtro 3mm, todos embebidos no tampão de transferência contínua

descrito no manual. Após a transferência, a membrana foi bloqueada, durante 1 hora, com

leite em pó 5% em 0,05% Tween/PBS (PBS-T). Após o bloqueio a membrana foi lavada 3

vezes com PBS-T por 10 minutos e incubada com antisoro policlonal anti-veneno total

diluído 1:2000 em leite em pó 5% PBS-T por 1 hora. Procedeu-se nova lavagem como

descrito acima. A membrana foi incubada com anti-IgG de coelho-peroxidase diluído

1:20000 em leite em pó 5% PBS-T, lavada conforme descrito acima e revelada com ECL

reagente (Amersham).

52

6.17- Genótipos das linhagens de bactérias hospedeiras utilizadas neste trabalho

Linhagem XL1-Blue MRF`: ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 supE44

thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F`proAB laclqZ∆M15 Tn10(Tetr)]

Linhagem XLOLR: ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 thi-1 recA1 gyrA96

relA1 lac[F`proAB laclqZ∆M15 Tn10(Tetr)] Su- (nonsuppressing) λr (lambida resistent).

Linhagem TOP 10F’: F’, mcrA, (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80∆lac∆-M15, ∆lacX74, deo R,

recA1, ara∆139, ∆ (ara, leu), 7697, galU, galK, λ-, rslp,endA1, nupG.

Linhagem BL-21 (DE3): F-ompT hsdSb(r-B m-B) gal dcm.

6.18- Meios de cultura

LB Broth: 10g de NaCl, 10g de bactotriptona e 5g de extrato de levedura. O pH foi

ajustado para 7,5 com NaOH e o volume acertado para 1 litro. Autoclavar a solução.

LB-ágar: Possui a mesma composição do LB Broth, acrescido de 20g de agar por litro de

solução. Autoclavar a solução.

LB-ágar canamicina: Possui a mesma composição do LB-ágar acrescido de kanamicina na

concentração de 50µg/ml.

LB-ágar tetraciclina: Possui a mesma composição do LB-ágar acrescido de tetraciclina na

concentração final de 12,5µg/ml.

LB top ágar: Possui a mesma composição do LB-broth acrescido de agarose 0,7% (w/v).

LB XIA: LB agar contendo 20µg/ml de ampicilina e 1mM de IPTG

53

2xYP: 16g de bactopeptona, 10g de extrato de levedura, ajustar o pH para 7.5 e o volume

para 1 litro. Autoclavar a solução.

6.19- Reagentes e material de uso

Tetraciclina: A tetraciclina foi dissolvida em H2O estéril na concentração de 15mg/mL e

estocada a –20ºC. A solução foi utilizada na concentração final de 12,5 µg/mL.

Canamicina: A canamicina foi dissolvida em H2O estéril na concentração de 50mg/mL e

estocada a –20ºC. A solução foi utilizada na concentração final de 100µg/mL.

Ampicilina: A ampicilina foi dissolvida em água deionizada estéril na concentração final

de 100mg/ml (solução estoque 1.000X concentrada) e estocada a -20ºC.

Estreptomicina: A estreptomicina foi dissolvida em água deionizada estéril na

concentração de 20mg/ml (solução estoque 1.000X concentrada) e estocada a -20ºC.

IPTG: O IPTG foi dissolvido em água Milli-Q estéril na concentração de 500mM e

estocado a -20ºC.

Maltose: Dissolveu-se 20g de maltose em 100 ml de água (solução 20%). Autoclavar a

solução.

PMSF: O PMSF foi dissolvido em isopropanol na concentração final de 100mM e estocado

a 4ºC

X-Gal: O X-Gal foi dissolvido em dimetilformamida na concentração de 20mg/ml e

estocado a –20ºC.

Β-Mercaptoetanol 700mM: 5 µl de β-mercaptoetanol 14 M e 95 µl de água deionizada.

54

6.20- Soluções

TAE (Tampão Tris-acetato): Solução estoque 50X: 242g de Tris, 57,1mL de ácido

acético glacial e 100mL de EDTA, pH 8,0. Completar o volume para 1 litro.

TE (Tampão Tris-EDTA): Solução estoque Tris-HCl 1M, pH 8,0 e EDTA 0,5M (pH 8,0).

Juntar as soluções estoque nas concentrações Tris-HCl 10mM pH 8,0 e EDTA 1mM pH 8,0

de acordo com o volume a ser preparado. Autoclavar e guardar à temperatura ambiente.

Solução de MgCl2: Solução preparada em duas concentrações, 100mM e 10mM.

10x sample buffer: Tris-HCl 10mM (pH 7.5), EDTA 1mM, NaCl 5M.

Corante: 0.25% de azul de bromofenol, 0.25% de xilenocianol FF e 30% de glicerol.

STET: 8% p/v de sacarose, 0.1% v/v de Triton X-100, 50mM de EDTA, 50mM de Tris-

HCl. Ajustar o pH para 8,0.

Lisozima: A lisozima foi diluída em água deionizada para uma concentração de 50mg/ml.

CTAB: Cetil trimetil brometo de amônio diluído em água deionizada para uma

concentração de 50mg/ml.

Solução saturada de fenol/clorofórmio: 500g de fenol (Sigma-P1037) são aquecidas

(68ºC), até a completa dissolução. Hidroxiquinolina é adicionada na concentração de 0,1%.

Ao fenol dissolvido adiciona-se 1 volume de tampão Tris-HCl 0,5M, pH 8,0. A mistura é

mantida sob agitação por 15 minutos e depois em repouso até ocorrer a separação completa

das fases. A fase aquosa é então removida e adiciona-se 1 volume de solução Tris-HCL

0,1M, pH 8,0 repetindo o procedimento acima, até obtenção da solução final com pH> 7,8.

Após o equilíbrio da solução e remoção da fase aquosa, adiciona-se 0,1 volume de Tris-HCl

0,1M, pH 8,0 contendo 0,2% de β-mercaptoetanol. A está mistura adicionou-se igual

volume de clorofórmio (MERCK). Armazenar a 4ºC, protegido da luz.

55

6.20.1- Soluções utilizadas na ELISA

PBS pH 7,4: 0,05M Na2HPO4 e 0,15M de NaCl.

Tampão de ligação: Na2CO3 1,59g, NaHCO3 2,93g pH 9,6. Diluir em água q.s.p 1L.

Estocar a 4ºC.

Solução de bloqueio: Caseína 2%, diluir em PBS 1X. Estocar a –20ºC.

Tampão de incubação: Caseína 0,25%, Tween20 0,05%, diluir em PBS 1X. Estocar a –

20ºC.

Solução de lavagem: NaCl 9,0g, Tween 20 0,5ml, diluir em água q.s.p. 1L. Estocar a 4ºC.

Solução reveladora: 10ml de tampão citrato, 4mg de OPD, 2µl de água oxigenada 30%.

56

6.20.2- Soluções utilizadas no gel SDS-PAGE

Solução A: 39g de acrilamida, 1g de bisacrilamida, água q.s.p. 100ml. Filtrar a solução e

armazenar em frasco escuro a 4ºC.

Solução B: 18,15g de Tris, ajustar o pH para 8,8 com HCl concentrado, água deionizada

q.s.p. 100ml. Armazenar a 4ºC.

Solução C: 6g de Tris, ajustar o pH para 6,8 com HCl concentrado, água deionizada q.s.p.

para 100ml. Armazenar a 4ºC.

SDS 10%: 10g de SDS diluídos em água deionizada q.s.p. 100ml. Armazenar à

temperatura ambiente.

PSA 10%: Persulfato de amônio dissolvido em água deionizada na concentração de

0,1g/ml.

Tampão da amostra (sem agente redutor – 2X concentrado): 1ml de solução C, 0.8 ml de

glicerol, 1.6ml de SDS 10%, 0.2ml de azul de bromofenol 0.2%, 0.4ml de água deionizada.

Armazenar à temperatura ambiente.

Tampão da amostra (com agente redutor – 2X concentrado): Substituir a água do tampão

sem agente redutor por 0,4ml de β-mercaptoetanol.

Tampão de corrida (5X concentrado): 4,5g de Tris (0,125M), 21,6g de glicina (0,96M),

1,5g de SDS (0,5%), água deionizada q.s.p. 300ml. Acertar o pH para 8,3. Armazenar a

4ºC.

57

6.20.3- Coloração pelo método da prata

Solução fixadora: 50ml de metanol, 12ml de ácido acético, água deionizada q.s.p. 100ml.

Solução de lavagem: 50ml de etanol e água deionizada q.s.p. 100ml.

Solução de tratamento: tiossulfato de sódio diluído em água na concentração de 0,4g/l.

Solução de impregnação: 0,1g de prata, 75µl de formaldeído e água deionizada q.s.p.

100ml.

Solução de desenvolvimento: 6g de carbonato de cálcio, 50µl de formaldeído, 2ml da

solução de pré-tratamento e água deionizada q.s.p. 100ml. Preparar a solução no momento

do uso.

Solução de parada: 50ml de etanol, 12ml de ácido acético e água deionizada q.s.p. 100ml.

60

7- Resultados

7.1- Varredura dos clones provenientes das excisões em larga-escala

Neste trabalho, realizou-se a varredura de aproximadamente 500 clones

provenientes de excisões em massa de três diferentes sub-bibliotecas. Para a realização da

varredura utilizou-se a técnica de ELISA (Enzyme Linked Imunosorbent Assay) conforme

descrito em materiais e métodos. O anticorpo primário foi obtido a partir da imunização de

coelhos com o veneno total da aranha Lasiodora sp. A reação foi revelada utilizando-se de

o-fenilenodiamino (OPD).

Um total de 43 clones mostrou-se positivo em dois ensaios imunológicos. Dezenove

clones apresentaram similaridade com toxinas, 2 clones apresentaram similaridade com

outras proteínas e 22 clones não apresentaram similaridade significativa com proteínas

depositadas no banco de dados quando suas seqüências nucleotídicas traduzidas foram

submetidas a análise pelo programa BlastP (tabela 1).

A reação de seqüenciamento dos insertos clonados nos plasmídeos e a posterior

análise de suas seqüências nucleotídicas revelou que alguns cDNAs apresentam

similaridade com seqüências de proteínas depositadas no GenBank, que vão desde

peptídeos tóxicos como BsTx, ESTx, HwTx-II, Magi 7 e LpTx (1 e 2) das aranhas

Brachypelma smithii, Eurypelma californicum, Selenocosmia huwena (atualmente

conhecida como Ornithoctonus huwena), Macrothele gigas e Lasiodora parahibana,

respectivamente, assim como similaridade com algumas proteínas como a cadeia beta da

hemoglobina de camundongo (Mus musculus). Todas as seqüências nucleotídicas dos

clones que se mostraram positivos em dois ensaios imunológicos de ELISA foram

submetidas a análises pelos programas Blastn, Blastx e BlastP (Basic Local Alignment

Search Tool – Altschul e cols., 1990 – disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov). A

análise pelo Blastn foi realizada com o objetivo de se detectar a presença de seqüências de

vetor de clonagem (vetor pBK-CMV). Após a eliminação dessas seqüências, apenas a

seqüência correspondente ao inserto clonado foi submetida à análise pelo Blastx, que

compara uma determinada seqüência nucleotídica, traduzida em suas seis possíveis janelas

de leitura (frames), com seqüências depositadas no GenBank. A análise inicial das

61

seqüências utilizando o programa BlastX faz-se necessária porque essa análise permite a

detecção de similaridades mesmo quando as seqüências nucleotídicas são de baixa

qualidade. Após a análise pelo programa BlastX, as seqüências dos cDNAs foram

traduzidas em suas seis possíveis janelas de leitura utilizando o programa SIXFRAME

(disponível em http://workbench.sdsc.edu). As seqüências peptídicas obtidas a partir da

tradução das seqüências de cDNAs dos clones positivos foram submetidas à análise pelo

BlastP. A análise pelo programa BlastP compara uma seqüência peptídica com outras

seqüências depositadas no banco de dados de proteínas.

As seqüências peptídicas que apresentaram similaridades com toxinas de outras

aranhas depositadas no banco de dados foram designadas pela sigla LTx (toxina de

Lasiodora sp). Os clones cuja seqüência nucleotídica apresentou similaridades com outras

proteínas ou que não apresentou similaridades com proteínas depositadas no GenBank mas

apresentou pelo menos uma matriz aberta de leitura (ORF), foram designados pela sigla

LsC (componente clonado da glândula de veneno de Lasiodora sp). A tabela 1 apresenta os

resultados obtidos na varredura utilizando o teste de ELISA bem como o resultado da

análise de similaridade (BlastP).

62

Tabela 1: Resultados do teste de ELISA e similaridade utilizando o programa BlastP.

Clone Similar a Identidade Organismo Referências

1 a 15* BsTx 80% Brachypelma smithii Kaiser e cols., 1994

ESTx 80% Eurypelma californicum Savel-Niemann e cols.,

1989

LpTx1/LpTx2 95-100% Lasiodora parahibana Escoubas e cols., 1997

HwTxI/HwTxII 69% Selenocosmia huwena Shu & Liang, 1999

16 a 19* Magi 7 32% Macrothele gigas Satake e cols., 2004

20 Cadeia β-1 de hemoglobina 98% Mus musculus

Cadeia beta-2 de globina 92% Rattus norvegicus

Hemoglobina quimérica

humano/camundongo(zeta

2/beta 2) 100%

21 CG7580-PA 62% Drosophila

melanogaster

Proteína agCP10691 58% Anopheles gambiae

Proteína Qpc-pending 46% Mus musculus

22 a 43 Sem similaridade

significativa

* Clones 1-12, 13, 14-15 e 16-19 correspondem, respectivamente, às toxinas LTx1, LTx2, LTx3 e LTx5.

7.2- Análise das seqüências nucleotídicas dos cDNAs dos clones que apresentaram similaridade com toxinas de aranhas

Dos 19 clones que apresentaram similaridade com peptídeos tóxicos de outras

aranhas, 15 codificam toxinas pertencentes a uma mesma família (LTx1, LTx2 e LTx3),

sendo que 12 clones codificam a mesma toxina, denominada nesse trabalho LTx1. O clone

que codifica a toxina LTx2 foi encontrado apenas uma vez e dois clones encontrados

codificam a toxina LTx3.

A análise das seqüências dos cDNAs desses 15 clones (utilizando o programa

SignalP – disponível em http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/) revelou a presença de um

peptídeo sinal, um peptídeo intermediário e um peptídeo maduro compostos

respectivamente por 23, 27 e 49 resíduos de aminoácidos.

A figura 10 apresenta apenas as seqüências nucleotídicas alinhadas dos cDNAs que

codificam para as toxinas LTx1, LTx2 e LTx3.

63

1 60

LTx1 ggcaccag------c------------------ttcgtagtatctgaactt-caggagaa

LTx2 ggcaccag------cgcaaatagcagatttcattccgtagtatctgaactt-caggagaa

LTx3 ggcacgagtattttcgcaaataccgagatttcattcgtagtatctgaactttcaggagaa

***** ** * * **************** ********

61 120

LTx1 tttcaagcaaaagATGAGATCTTTGACGTTGGCTGCTCTTCTGCTATGCAGCTTGCTGTT LTx2 tttcaagcaaaagATGAGATCTTTGACGTTGGCTGCTCTTCTGCTATGCAGCTTGCTGTT LTx3 tttcaagcaaaagATGAGATCTTTGACGTTGGCTGCTCTTCTGCTATGCAGCTTGCTGTT *************...********************************************

121 180

LTx1 AGTTTTTCACACTTCAGCAGCTGCAGAGCTTGAAGCTCAGGAAGGCCATCTGATGATCCC LTx2 AGTTTTTCACACTTCAGCAGCTGAAGAGCTTCAAGCTCAGGAAGGCCATCTGATGATCCC LTx3 AGTTTTTCACACTTCAGCAGCTGCAGAGCTTGAAGCTCAGGAAGGCCATCTGATGATCCC *********************** ******* ****************************

181 240

LTx1 CGGTGATACTGACACCGCCCTAGAAACTGTCGATGATGAAAGATTTTTCGAATGTACTTT LTx2 CGGTGATACTGACACCGCACTAGAAACTGTCGATGATGAAAGACTTTTCGAATGTACTTT LTx3 CGGTGATACTGACACCGCCCTAGAAACTGTCGATGATGAAAGATTTTTCGAATGTACTTT ****************** ************************ ****************

241 300

LTx1 TGAATGCGACATTAAAAAAGAAGGCAAACCATGCAAACCCAAGGGATGCAAGTGTAAGGA LTx2 TGAATGCGACATTAAAAAAGAAGGCAAACCATGCAAACCCAAGGGATGCAAGTGTGACGA LTx3 TGAATGCGACATTAAAAAAGAAGGCAAACCATGCAAACCCAAGGGATGCAAGTGTGACGA ******************************************************* * **

301 360

LTx1 CAAGGATAACAAGGATCACAAGAAATGTTCTGGTGGATGGAGATGTAAGCTCAAGCTCTG LTx2 CAAGGATAACAAGGATCACAAGAAATGTTCTGGTGGATGGAGATGTAAGCTCAAGCTCTG LTx3 CAAGGATAACAAGGATCACAAGAAATGTTCTGGTGGATGGAGATGTAAGCTCAAGCTCTG ************************************************************

361 420

LTx1 TTTGAAGTTTtagtatgaaaactggccaggtgctgccatcactacgagaaaactcaccat LTx2 TTTGAAGATTtagtatgaaaactggccaggtgctgccatcactacgagaaaactcaccat LTx3 TTTGAAGTTTtagtatgaaaactggccaggtgctgccatcactacgagaaaactcaccat ******* ****************************************************

421 480

LTx1 aacatgcacacgaagagctattcttggtgatgctgtagcaaatgtattaacatgttagcc

LTx2 aacatgcacacgaagagctattcttggtgatggtgtagcaaatgtattaacatgttagcc

LTx3 aacatgcacacgaagagctattcttggtgatgctgtagcaaatgtattaacatgttagcc

******************************** ***************************

481 540

LTx1 agaaatgttgtttgaattatattatgtatctgaaaaatcgttaataaaatagtttcaac-

LTx2 agaaatgttgtttgaattatattatgtatctgaaaaatcgttaataaaatagtttcaac-

LTx3 agaaatgttgtttgaattatattatgtttctgaaaaatcgttaataaaatagtttcaaca

*************************** **************.......**********

541 570

LTx1 ctttcaaaaaaaaaaaa



*****************

Figura 10: Alinhamento dos cDNAs dos clones que apresentaram similaridade com toxinas de

aranhas S. huwena, E. californicum, B. smithi e Lasiodora parahibana. As regiões 5’ e 3’ não

codificantes são mostradas em letras minúsculas. Em vermelho aparece a seqüência que codifica

para o peptídeo sinal seguida da seqüência codificante do peptídeo intermediário (verde). A

seqüência nucleotídica correspondente à região da toxina madura é mostrada em azul, enquanto o

códon de parada é mostrado em rosa. O códon de iniciação e o sinal de poliadenilação estão

indicados por pontos (.). Asteriscos (*) indicam regiões consenso a todas as seqüências.

64

7.2.1- Tradução dos cDNAs que codificam para as toxinas LTx1, LTx2 e LTx3

A figura 11 mostra a tradução das seqüências nucleotídicas dos cDNAs que codificam

para as toxinas LTx1, LTx2 e LTx3. As regiões das seqüências nucleotídicas destacadas em

vermelho, verde e azul, codificam para o peptídeo sinal, peptídeo intermediário e toxina

madura, respectivamente. A tradução das seqüências nucleotídicas foi obtida pelo programa

SIXFRAME (http://workbench.sdsc.edu).

65

Toxina LTx1

ATG AGA TCT TTG ACG TTG GCT GCT CTT CTG CTA TGC AGC TTG CTG TTA GTT M R S L T L A A L L L C S L L L V TTT CAC ACT TCA GCA GCT GCA GAG CTT GAA GCT CAG GAA GGC CAT CTG ATG F H T S A A A E L E A Q E G H L M ATC CCC GGT GAT ACT GAC ACC GCA CTA GAA ACT GTC GAT GAT GAA AGA TTT I P G D T D T A L E T V D D E R F TTC GAA TGT ACT TTT GAA TGC GAC ATT AAA AAA GAA GGC AAA CCA TGC AAA F E C T F E C D I K K E G K P C K CCC AAG GGA TGC AAG TGT AAG GAC AAG GAT AAC AAG GAT CAC AAG AAA TGT P K G C K C K D K D N K D H K K C TCT GGT GGA TGG AGA TGT AAG CTC AAG CTC TGT TTG AAG TTT S G G W R C K L K L C L K F

Toxina LTx2

ATG AGA TCT TTG ACG TTG GCT GCT CTT CTG CTA TGC AGC TTG CTG TTA GTT M R S L T L A A L L L C S L L L V TTT CAC ACT TCA GCA GCT GAA GAG CTT CAA GCT CAG GAA GGC CAT CTG ATG F H T S A A E E L Q A Q E G H L M ATC CCC GGT GAT ACT GAC ACC GCC CTA GAA ACT GTC GAT GAT GAA AGA CTT I P G D T D T A L E T V D D E T L TTC GAA TGT ACT TTT GAA TGC GAC ATT AAA AAA GAA GGC AAA CCA TGC AAA F E C T F E C D I K K E G K P C K CCC AAG GGA TGC AAG TGT GAC GAC AAG GAT AAC AAG GAT CAC AAG AAA TGT P K G C K C D D K D N K D H K K C TCT GGT GGA TGG AGA TGT AAG CTC AAG CTC TGT TTG AAG ATT S G G W R C K L K L C L K I

Toxina LTx3

ATG AGA TCT TTG ACG TTG GCT GCT CTT CTG CTA TGC AGC TTG CTG TTA GTT M R S L T L A A L L L C S L L L V TTT CAC ACT TCA GCA GCT GCA GAG CTT CAA GCT CAG GAA GGC CAT CTG ATG F H T S A A A E L Q A Q E G H L M ATC CCC GGT GAT ACT GAC ACC GCC CTA GAA ACT GTC GAT GAT GAA AGA TTT I P G D T D T A L E T V D D E R F TTC GAA TGT ACT TTT GAA TGC GAC ATT AAA AAA GAA GGC AAA CCA TGC AAA F E C T F E C D I K K E G K P C K CCC AAG GGA TGC AAG TGT GAC GAC AAG GAT AAC AAG GAT CAC AAG AAA TGT P K G C K C D D K D N K D H K K C TCT GGT GGA TGG AGA TGT AAG CTC AAG CTC TGT TTG AAG TTT

S G G W R C K L K L C L K F

Figura 11: Tradução das seqüências nucleotídicas que codificam para as toxinas LTx1, LTx2 e

LTx3 utilizando-se o programa SIXFRAME. A seqüência correspondente ao peptídeo sinal,

peptídeo intermediário e à toxina madura são mostrados em vermelho, verde e azul,

respectivamente.

66

7.2.2- Análise estrutural das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3

A figura 12 mostra o gráfico gerado pela análise das seqüências peptídicas das

toxinas maduras de LTx1, LTx2 e LTx3 no programa SignalP, que prediz o sítio de

clivagem de peptídeos sinal. A figura 13 mostra o gráfico de hidropaticidade bem como o

alinhamento das seqüências peptídicas das regiões correspondentes ao peptídeo sinal

(vermelho), peptídeo intermediário (verde) e proteína madura (azul) das toxinas LTx1,

LTx2 e LTx3 encontradas neste trabalho. O gráfico de hidropaticidade gerado pela análise

das seqüências peptídicas das três toxinas, quando submetidas ao programa ProtScale

(disponível em http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/), revelou uma região inicial da

seqüência composta predominantemente por aminoácidos hidrofóbicos, característica de

peptídeos sinal, comum em toxinas. A região do peptídeo intermediário é rica em

aminoácidos hidrofílicos e concentra a maior parte dos resíduos de glutamato (E) do pró-

peptídeo. A toxina madura apresenta um perfil predominantemente hidrofílico.

67

Figura 12: Predição do ponto de clivagem entre os peptídeos sinal e peptídeo intermediário na

seqüência dos precursores das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3. O pico em vermelho indica o ponto de

clivagem entre os peptídeos sinal e intermediário (SAA-AE). O pico em azul escuro indica o caráter

hidrofóbico comum aos peptídeos sinal. Os picos verde e azul claro indicam as regiões N- e C-

terminais do peptídeo sinal, respectivamente.

68

Figura 13: Gráfico de hidropaticidade das seqüências de aminoácidos traduzidas a partir dos cDNAs

dos clones que codificam os precursores das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3. Neste gráfico estão

representados o peptídeo sinal hidrofóbico (23 aminoácidos), o peptídeo intermediário (27

aminoácidos) e a toxina madura (49 aminoácidos). As regiões acima e abaixo do ponto 0 (seta

vermelha) indicam a presença de aminoácidos com características hidrofóbicas e hidrofílicas,

respectivamente.

Peptídeo sinal Peptídeo intermediário Toxina madura

MRSLTLAALLLCSLLLVFHTSAA MRSLTLAALLLCSLLLVFHTSAA MRSLTLAALLLCSLLLVFHTSAA ---------23-----------

AELEAQEGHLMIPGDTDTALETVDDER EELQAQEGHLMIPGDTDTALETVDDER AELQAQEGHLMIPGDTDTALETVDDER ------------27-------------

FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF LFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKI FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF -----------------------49------------------------

69

7.2.3- Alinhamento das seqüências peptídicas das toxinas das aranhas Lasiodora sp (LTx1, LTx2, LTx3), E. Californicum (ESTx), B. smithii (BsTx), L. parahybana (LpTx1 e LpTx2)

A figura 14 mostra o alinhamento das seqüências peptídicas das toxinas da aranha

Lasiodora sp (LTx1, LTx2 e LTx3) com toxinas das aranhas E. Californicum (ESTx), B.

smithii (BsTx), e L. parahybana (LpTx1 e LpTx2).

LTx1 FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF LTx2 LFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKI LTx3 FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF LpTx1 FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF LpTx2 FFECTLECDIKKEGKPCKPKGCKCNDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF ESTX IFECVFSCDIEKEGKPCKPKG----------EKKCSGGWKCKIKLCLKI BsTx IFECVFSCDIEKEGKPCKPKG----------EKKCSGGWKCKIKLCLKI

Figura 14: Alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas das aranhas Lasiodora sp

(LTx1, LTx2 e LTx3), E. Californicum (ESTx), B. smithii (BsTx), e L. parahybana (LpTx1 e

LpTx2). Os resíduos completamente conservados entre as seqüências são mostrados em azul. Em

verde são mostrados os resíduos altamente conservados enquanto aqueles pouco conservados são

apresentados em vermelho. Em preto é mostrada uma região onde não há consenso com as

seqüências dos peptídeos ESTx e BsTx.

70

7.2.4- Alinhamento das seqüências peptídicas completas das toxinas LTx1, LTx2, LTx3 e HwTx-II (Ile)

A figura 15 mostra o alinhamento das seqüências peptídicas das toxinas da aranha

Lasiodora sp (LTx1, LTx2 e LTx3) com uma toxina composta por 37 resíduos de

aminoácidos, com atividade inseticida, encontrada na glândula de veneno da aranha

Selenocosmia huwena.

LTx1 FFECTFECDIKKEG-KPCKPKGCKCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF LTx2 LFECTFECDIKKEG-KPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKI LTx3 FFECTFECDIKKEG-KPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF HwTx-II LFECSFSCEIEKEGDKPCK-------------KKKCKGGWKCKFNMCVKV

Figura 15: Alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas das aranhas Lasiodora sp

(LTx1, LTx2 e LTx3) e Selenocosmia huwena (HwTx-II). Os resíduos completamente conservados

entre as seqüências são mostrados em azul. Em verde são mostrados os resíduos altamente

conservados enquanto aqueles pouco conservados são apresentados em vermelho. Em preto são

mostradas as regiões onde não há consenso com a seqüência do peptídeo HwTx-II.

71

7.3- Clonagem das toxinas LTx1 e LTx3 em PCR® 2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen®

Com o objetivo de facilitar a clonagem dos fragmentos que codificam as toxinas

LTx1 e LTx3 no vetor de expressão pET-11a Novagen®, os fragmentos obtidos por PCR

utilizando iniciadores contendo os sítios de restrição Nde I e Bam H I foram primeiramente

clonados em vetor PCR®

2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen®. Essa estratégia faz-se

necessária devido à dificuldade apresentada por varias enzimas de restrição, por exemplo

Nde I, em digerir sítios localizados nas extremidades de fragmentos de PCR. A figura 16

mostra o produto da amplificação dos fragmentos correspondentes às toxinas maduras

LTx1 e LTx3 clonadas em vetor PCR® 2.1-TOPO TA Cloning Invitrogen

®. As amostras

foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 6%. Na canaleta 1, aplicou-se 6µl

de padrão de peso molecular 1kb da Invitrogen®. Nas canaletas (2 e 3) e (4 e 5), são

apresentados os produtos de PCR (aproximadamente 350pb) dos fragmentos que codificam

para a toxina LTx1 e LTx3, respectivamente.

72

Figura 16: PAGE dos produtos de PCR de colônias obtidas na transformação de células de E. coli

linhagem TOP 10 F’ com os produtos das ligações das seqüências codificantes para as toxinas LTx1

e LTx3 com o vetor PCR® 2.1-TOPO. Canaleta 1: Padrão 1Kb DNA. Canaletas 2 e 3: LTx1.

Canaletas 4 e 5: LTx3.

1 2 3 4 5

Canaletas

100pb

200pb

300pb

400pb

73

7.4- Clonagem das toxinas LTx1 e LTx3 no vetor de expressão pET-11a

Após a digestão de DNAs extraídos dos clones obtidos com o sistema PCR® 2.1-

TOPO®, com as enzimas de restrição Nde I e BamH I, os fragmentos que codificam as

toxinas LTx1 e LTx3 foram purificadas como descrito em Materiais e Métodos. Procedeu-

se então a clonagem no vetor de expressão pET-11a. As colônias selecionadas na

transformação foram submetidas a uma PCR para verificar a presença do fragmento

clonado (Figura 17). O produto de amplificação correspondente à clonagem das toxinas

LTx1 e LTx3 no vetor pET-11a é de aproximadamente 240 pb (canaletas 2 e 3).

74

Figura 17: PAGE dos produtos de PCR de colônias obtidas na transformação de células de E. coli

linhagem TOP 10 F’ com produto de clonagem das seqüências codificantes para LTx1 e LTx3 no

vetor de expressão pET-11a (canaletas 2 e 3). Na canaleta 4 foi aplicado o produto de amplificação

do vetor pET-11a vazio.

200pb

300pb

400pb

100pb

1 2 3 4

75

7.5- Indução da toxina LTx1 recombinante Após a expressão da toxina LTx1 recombinante em diferentes tempos de indução (1,

2, 3, 4 e 5 horas) como descrito em materiais e métodos (6.16), os extratos celulares foram

submetidos à eletroforese em gel SDS-PAGE. A análise da expressão de LTx1 revelou

uma indução basal (tempo 0) e um tempo ótimo de indução em torno de 5 horas após a

adição de IPTG 0.6mM (concentração final) e incubação a 30ºC (200 rpm) (Figura 18).

Alíquotas de aproximadamente 20µg de proteínas provenientes do veneno bruto, da fração

solúvel e da fração insolúvel (corpos de inclusão) foram submetidas à eletroforese em gel

SDS-PAGE. As proteínas presentes no gel foram transferidas para uma membrana de nylon

e analisadas por western bloting usando o antisoro contra veneno total como anticorpo

primário. A figura 19 mostra o reconhecimento de proteínas do veneno bruto de Lasiodora

sp (canaleta 1) e da toxina LTx1 recombinante (canaletas 2). Como pode ser observado, a

toxina LTx1 recombinante foi encontrada, sobretudo na fração solúvel, sugerindo que não

há formação de corpos de inclusão uma vez que não foi observada a presença mensurável

de LTx1 no precipitado da sonicação (canaleta 3).

76

Figura 18: Gel SDS-PAGE da indução da expressão de LTx1 recombinante. Os tempos de indução

são indicados acima de cada canaleta. A toxina LTx1 recombinante está indicada pela seta. Uma

indução basal pode ser observada (0 hora de indução).

0 1 2 3 4 5

Tempos de Indução (h)

LTx1

77

Figura 19: Western Bloting da toxina LTx1 recombinante. Uma fração do veneno bruto e as

eluições de LTx1 (sobrenadante e corpos de inclusão) foram aplicados nas canaletas 1, 2 e 3,

respectivamente. A toxina LTx1 recombinante, presente no sobrenadante está indicada pela seta.

1 2 3

Canaletas

78

7.6- Análise da seqüência nucleotídica dos cDNAs dos clones (16-19) que apresentaram similaridade com a toxina Magi 7 da aranha Macrothele gigas

Dos 19 clones que apresentaram similaridades com toxinas de outras aranhas, 4

apresentaram similaridade com o peptídeo precursor da toxina Magi 7, descrito por Satake

e cols. (2004), composto por 124 resíduos de aminoácidos, presente na glândula de veneno

da aranha Macrothele gigas. O cDNA dos 4 quatro clones que apresentaram similaridade

com o precursor da toxina Magi 7 foi traduzido no frame +2 (utilizando o programa

SIXFRAME) e originou uma janela aberta de leitura que codifica 116 resíduos de

aminoácidos (Figura 20). A figura 21 mostra o alinhamento do peptídeo precursor de LTx5

com o peptídeo precursor de Magi 7. O novo peptídeo encontrado foi designado pela sigla

LTx5. A análise do peptídeo LTx5 pelo programa SignalP (disponível em

http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/) revelou a existência de um peptídeo sinal

composto por 17 resíduos de aminoácidos, com o sítio de clivagem entre o peptídeo sinal e

o peptídeo intermediário localizado entre os aminoácidos das posições 17 e 18 (AVA-TW)

(Figura 22). O peptídeo intermediário apresenta 28 resíduos de aminoácidos, com o ponto

de clivagem localizado no resíduo de arginina (R) da posição 45 (Arg45). A análise do

peptídeo LTx5 pelo programa BlastP revelou 32 % de similaridade com o peptídeo

precursor da toxina Magi 7. A figura 21 mostra o alinhamento das seqüências peptídicas de

Magi 7 e LTx5 obtido na análise pelo programa ClustalW.

A figura 23 mostra o perfil de hidropaticidade bem como as regiões correspondentes

ao peptídeo sinal (vermelho), peptídeo intermediário (verde) e proteína madura (azul) da

toxina LTx5. O gráfico de hidropaticidade gerado pela análise da seqüência peptídica da

toxinas LTx5 quando submetida ao programa ProtScale (disponível em

http://www.cbs.dtu.dk/services/protscale/) revelou características similares às seqüências

LTx1, LTx2 e LTx3, isto é, uma região inicial composta predominantemente por

aminoácidos hidrofóbicos, uma região rica em aminoácidos hidrofílicos e concentrando

grande parte dos resíduos de glutamato. A toxina madura apresenta um perfil

predominantemente hidrofílico.

79

gaattcggcacgagcagaaacaaatattgctggaatttcactcaagATG AAG CTG AGC ACT TTT ATC M K L S T F I ATA ATG ATA AGT CTG GCT GTG GCC GTT GCT ACC TGG CCT TCA GAG CAC ATT GAA I M I S L A V A V A T W P S E H I E GGA AGT GAT TCT GAA ACC AAA CTG AAT GTG GAA CTC GGG CCA TAT GCA TTA GCT G S D S E T K L N V E L G P Y A L A GAT CGT GCA GAA AAG GGA AAA AAG GAC TCC CTT AAC AAA GGA GAG CCA TGC CAA D R A E K G K K D S L N K G E P C Q TTT CAT TGC GAG TGT CGT GGT GCT AGT GTT CTC TGC GAA GCT GTT TAT GGA ACA F H C E C R G A S V L C E A V Y G T AGA AGT CCG ATG TAT AAA TGC ATG ATC AAA AGA TTA CCT ATT TCG GTA TTG GAC R S P M Y K C M I K P L P I S V L D ATA ATG TAT CAG GCA GAG CGT GCT TTA GAA AAA CTT GCT TCT TCA TTT CGG TGT I M Y Q A E R A L E K L A S S F R C GAGTAAataaggttaactcgttcagggcaacgaatgactgaatgttacataacaatgcataatacttctgtaa E * aatctgtattggcaaaagaattcgtttagaaaaaaacaataaagcgagatatatgcagaaaaaaaaactcgag

Figura 20: Tradução do cDNA que codifica a toxina LTx5. As regiões 5’ e 3’ não traduzidas são

mostradas em letras minúsculas enquanto a região codificante aparece em maiúsculas. As regiões

que codificam para os peptídeos sinal, intermediário e maduro são mostrados em vermelho, verde e

azul, respectivamente.

Magi_7 MKLSALVFVASVMLVAASPVKDVEEPVETHLAADLKTIEELAKYEEAAVQKRSCIVGSKN LTx5 MKLSTFIIMISLAVAVATWPSEHIEGSD----SETKLNVELGPYALADRAEK-GKKDSLN Magi_7 IGETCVASCQCCGATVRCIGEGTKGICNNYQTNNILGQILLYAKDTVVNTAGLLVCAQDL LTx5 KGEPCQFHCECRGASVLCEAVYGT---RSPMYKCMIKRLPISVLDIMYQAERALEKLASS Magi_7 SEYE LTx5 FRCE

Figura 21: Alinhamento das seqüências peptídicas dos pró-peptídeos Magi 7 (Macrothele gigas) e

LTx5 (Lasiodora sp). Os resíduos completamente conservados entre as seqüências são mostrados

em azul. Em verde são mostrados os resíduos altamente conservados enquanto aqueles pouco

conservados são apresentados em vermelho. Em preto são mostradas as regiões onde não há

consenso com a seqüência do peptídeo.

80

Figura 22: Predição do ponto de clivagem entre os peptídeos sinal e intermediário na seqüência do

precursor da toxina LTx5. O pico em vermelho indica o ponto de clivagem entre os peptídeos sinal

e intermediário (AVA-TW). O pico em azul escuro indica o caráter hidrofóbico comum aos

peptídeos sinais. Os picos verde e azul claro indicam as regiões N- e C-terminais do peptídeo sinal,

respectivamente.

81

Figura 23: Gráfico de hidropaticidade da seqüência de aminoácidos traduzida a partir do cDNA dos

clones que codificam o precursor da toxina LTx5. Neste gráfico estão representados o peptídeo

sinal hidrofóbico (17 aminoácidos), o peptídeo intermediário (28 aminoácidos) e a toxina madura

(71 aminoácidos). As regiões acima e abaixo do ponto zero (seta vermelha) indicam a presença de

aminoácidos com características hidrofóbicas e hidrofílicas, respectivamente.

Peptídeo

Sinal Peptídeo

Intermediário Toxina Madura

MKLSTFIIMISLAVAVA

----17----

TWPSEHIEGSDSETKLNVELGPYALADR

------28------

AEKGKKDSLNKGEPCQFHCECRGASVLCEAVYGTRSPMYKCMIKRLPISVLDIMYQAERALEKLASSFRCE

------------------------71-----------------------

82

7.7- Análise das seqüências que apresentaram similaridade com outras proteínas depositadas no GenBank

Em uma primeira análise (BlastN e BlastX apenas), dos 43 clones que apresentaram

reação positiva no teste de ELISA 22 apresentaram similaridades com outras proteínas

depositadas no GenBank. Esses clones foram posteriormente analisados utilizando os

programas SIXFRAME (workbench.sdsc.edu) e BlastP. A seguir são apresentadas as

análises apenas dos clones que apresentaram uma ou mais janelas de leitura abertas e cujo

peptídeo codificado apresentou alguma similaridade com proteínas depositadas no

GenBank quando submetidos à análise pelo BlastP.

7.7.1- Análise da seqüência do DNA complementar do clone 20

A seqüência do cDNA do clone 20 apresenta 629 pares de bases. Os sítios de

restrição Xho I e Eco RI são mostrados em vermelho. O códon de iniciação e o de parada

são mostrados em rosa e verde, respectivamente. A tradução do cDNA do clone 20

utilizando o programa SIXFRAME procedeu-se no frame +2 e originou uma proteína

composta por 109 aminoácidos denominada LsC1, cuja seqüência é mostrada a seguir.

cDNA

GAATTCGGCACGAGCAGAAACAGACATCATGGTGCACCTGACTGATGCTGAGAAGGCTGCTGTCTCTGGC CTGTGGGGAAAGGTGAACGCCGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTTGTCTACCCTT GGACCCAGCGGTACTTTGATAGCTTTGGAGACCTATCCTCTGCCTCTGCTATCATGGGTAATGCCAAAGT GAAGGCCCATGGCAAGAAAGTGATAACTGCCTTTAACGATGGCCTGAATCACTTGGACAGCCTCAAGGGC ACCTTTGCCAGCCTCAGTGAGCTCCACTGTGACAAGCTGCATGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTCCTGG GCAAATGATCGTGATTGTGCTGGGCCACCACCTGGGCAAGGATTTCACCCCCGCTGCACAGGCTGCCTTC CAGAAGGTGGTGGCTGGAGTGGCCGCTGCCCTGGCTCACAAGTACCACTAAACCCCCTTTCCTGCTCTTG CCTGTGAACAATGGTTAATTGTTCCCAAGAGAGCATCTGTCAGTTGTTGGCAAAATGATAAAGACATTTG AAAATCTGTCTTCTGACAAATAAAAAGCATTTATTTCACTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAG

83

LsC1

MVHLTDAEKA AVSGLWGKVN ADEVGGEALG RLLVVYPWTQ RYFDSFGDLS SASAIMGNAK VKAHGKKVIT AFNDGLNHLD SLKGTFASLS ELHCDKLHVD PENFRLLGK

A análise da seqüência do cDNA do clone 20 revelou alta similaridade (98%) com a

cadeia β-1 da hemoglobina do camundongo pertencente à espécie Mus musculus. A cadeia

β-1 possui 146 aminoácidos. Uma elevada similaridade (92%) com a cadeia β-2 da globina

do camundongo Rattus norvegicus também foi detectada. Esta cadeia apresenta 147

resíduos de aminoácidos. A seqüência do cDNA do clone 20 apresentou uma terceira

similaridade (100%) com uma hemoglobina quimérica humano/camundongo (cadeias zeta

2/beta 2) de 146 aminoácidos.

A figura 24 mostra o alinhamento da seqüência peptídica codificada pelo cDNA do

clone 20 com as proteínas com as quais apresentou similaridade.

Cadeia ββββ-1 da hemoglobina do camundongo Mus musculus

Score = 210 bits (535), Expect = 3e-54 Identities = 106/108 (98%), Positives = 107/108 (99%)

Query:1 MVHLTDAEKAAVSGLWGKVNADEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAK 60 MVHLTDAEKAAVS LWGKVN+DEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAK Sbjct:1 MVHLTDAEKAAVSCLWGKVNSDEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAK 60

Query:61 VKAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG 108 VKAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG Sbjct:61 VKAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG 108

• Query: clone 20

• Sbjct: β-1 hemoglobina

(a)

84

Cadeia beta-2 da globina do camundongo Rattus norvegicus

Score = 202 bits (515), Expect = 7e-52

Identities = 100/108 (92%), Positives = 103/108 (95%)

Query: 1 MVHLTDAEKAAVSGLWGKVNADEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAK 60 MVHLTDAEKAAV+GLWGKVN D+VGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGN K Sbjct: 1 MVHLTDAEKAAVNGLWGKVNPDDVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNPK 60

Query: 61 VKAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG 108 VKAHGKKVI AFNDGL HLD+LKGTFA LSELHCDKLHVDPENFRLLG Sbjct: 61 VKAHGKKVINAFNDGLKHLDNLKGTFAHLSELHCDKLHVDPENFRLLG 108

• Query: clone 20

• Sbjct: β-2 globina

Hemoglobina quimérica humano/camundongo(zeta 2/beta 2)



Query: 2 VHLTDAEKAAVSGLWGKVNADEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAKV 61 VHLTDAEKAAVSGLWGKVNADEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAKV Sbjct: 1 VHLTDAEKAAVSGLWGKVNADEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAKV 60

Query:62 KAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG 108 KAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG Sbjct:61 KAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLG 107

• Query: clone 20

• Sbjct: Hemoglobina quimerica

Figura 24: Alinhamento da seqüência peptídica codificada pelo cDNA do clone 20 com a cadeia β-1

da hemoglobina de Mus musculus (a), cadeia β-2 da globina de Rattus norvegicus (b) e hemoglobina

quimérica humano/camundongo (zeta 2/beta 2) (c). Os resíduos altamente conservados são mostrados

em azul enquanto os grupos fortemente conservados aparecem em verde. Em preto são mostrados

resíduos que não apresentam consenso.

7.7.2. Análise da seqüência do DNA complementar do clone 21

(b)

(c)

85

A seqüência do cDNA do clone 21 apresenta 434 pares de bases. Os sítios de

restrição Xho I e Eco RI são mostrados em vermelho. Os códons de iniciação e parada são

mostrados em rosa e verde, respectivamente. A tradução do cDNA do clone 21 realizada

pelo programa SIXFRAME procedeu-se no frame +2 e originou uma proteína de 82

aminoácidos denominada LsC2, cuja seqüência é mostrada a seguir.

cDNA

GAATTCGGCACGAGTGATTTAGTTGTTCCGATCGGGAAGTACTGGAATAAAGGAAGCAATGGGTAAACAG TTTGGACAGCTAGCAAAAATGAGGGGCATTGTACAATTCAGAATATCACCGTATGAGCAAAATCCACTTG CTGGAATAATTTCTAAAGGGTTTCCAAATATGATTCGACGTATTCGTTCCAATATATTTTCCATGGCTCC ACCATTTGTCCTTGGATATCTCGTTTATGATTGGACTGAAAAAGAACATGCCCGTCTGCAGAGGAAGAAC CCAGCTGATTATGCAAATGATGAATGAATGATATTTGTTTACATAGAAAATTCTGTAGTTCAGTTATTCT GTACATTTTTGTAGTTCATTATTGAAATAAATATAAGAAAAATAAAGAAGTGATTCTGGTTTCTAAAAAA AAAAAAAACTCGAG

LsC2

MGKQFGQLAK MRGIVQFRIS PYEQNPLAGI ISKGFPNMIR RIRSNIFSMA PPFVLGYLVY DWTEKEHARL QRKNPADYANDE

A análise da seqüência do cDNA do clone 21 apresentou uma similaridade de 62%

com uma proteína de 89 aminoácidos da mosca Drosophila melanogaster, denominada

CG7580-PA. Uma similaridade menor (58%) foi verificada entre o peptídeo codificado

pelo cDNA do clone 21 e uma proteína de 88 aminoácidos do mosquito Anopheles

gambiae, denominada agCP10691. A seqüência do cDNA do clone 21 apresentou uma

terceira similaridade (46%) com uma proteína de 88 aminoácidos denominada Qpc-pending

do camundongo Mus musculus.

A figura 25 mostra o alinhamento da seqüência peptídica codificada pelo cDNA do

clone 21 com as proteínas com as quais apresentou similaridade.

86

Proteína CG7580-PA da mosca Drosophila melanogaster



Query: 2 GKQFGQLAKMRGIVQFRISPYEQNPLAGIISKGFPNMIRRIRSNIFSMAPPFVLGYLVYD 61 G+ FG LAK+ GIV +++SP+EQ AG ISKG PNM+RR RSN+F + PPF++GYL+YD Sbjct: 9 GQHFGNLAKVHGIVTYKLSPFEQRAFAGAISKGLPNMVRRFRSNVFIVTPPFIVGYLIYD 68

Query: 62 WTEKEHARLQRKNPADYANDE 82 TE++H L RKNPADYANDE Sbjct: 69 LTERKHTALLRKNPADYANDE 89

• Query: clone 21

• Sbjct: CG7580-PA

Proteína agCP10691 do mosquito Anopheles gambiae



Query: 1 MGKQFGQLAKMRGIVQFRISPYEQNPLAGIISKGFPNMIRRIRSNIFSMAPPFVLGYLVY 60 MG FG+LAK+RGIV +ISP+EQ A +ISKG PN +RRIRS +F +APPFV+GY+VY Sbjct: 7 MGHGFGELAKVRGIVTHKISPFEQRAFANVISKGVPNTLRRIRSQVFIVAPPFVMGYMVY 66

Query: 61 DWTEKEHARLQRKNPADYAND 81 ++ E H ++ RKNPA++ ND Sbjct: 67 NYIENLHTQMNRKNPAEFEND 87

• Query: clone 21

• Sbjct: agCP10691

Proteína Qpc-pending do camundongo Mus musculus

(a)

(b)

(c)

87

Score = 84.0 bits (206), Expect = 4e-16


Query: 1 MGKQFGQLAKMRGIVQFRISPYEQNPLAGIISKGFPNMIRRIRSNIFSMAPPFVLGYLVY 60 MG++FG LA++R ++ + +SP+EQ SKG PN++RR R I +APPFV+ YL+Y Sbjct: 1 MGREFGNLARIRHVISYSLSPFEQRAFPSYFSKGIPNVLRRTRERILRVAPPFVVVYLIY 60

Query: 61 DWTEKEHARLQRKNPADYANDE 82 W +E + +RKNPA Y ND+ Sbjct: 61 TWGNQEFEQSKRKNPAMYENDK 82

• Query: clone 21

• Sbjct: Qpc-pending

Figura 25: Alinhamento da seqüência peptídica codificada pelo cDNA do clone 21 com as proteínas

CG7580-PA da mosca Drosophila melanogaster (a), agCP10691 do mosquito Anopheles gambiae (b)

e Qpc-pending do camundongo Mus musculus (c). Os resíduos altamente conservados são mostrados

em azul enquanto os grupos fortemente conservados aparecem em verde. Em preto são mostrados

resíduos onde não há consenso.

7.8- Análise das seqüências dos clones que codificam para peptídeos que não apresentaram similaridades, quando submetidos à análise pelo BlastP

88

Dentre os clones que apresentaram alguma similaridade com proteínas depositadas

no GenBank, quando submetidos a uma análise geral utilizando os programas BlastN e

BlastX, alguns não apresentaram qualquer similaridade quando os peptídeos codificados

por eles foram submetidos a uma análise mais detalhada pelo BlastP. A seguir são

apresentadas as análises apenas dos clones que apresentaram uma ou mais janelas de leitura

abertas (ORFs) e cujo peptídeo codificado não apresentou similaridade com proteínas

depositadas no GenBank quando submetidos à análise pelo BlastP.


89

A seqüência nucleotídica do clone 22 apresenta 1403 pares de bases. A tradução

dessa seqüência utilizando o programa SIXFRAME revelou a existência de uma janela de

leitura no frame +2 (vermelho) e +3 (azul). A tradução nos frames +2 e +3 originou

peptídeos compostos por 72 e 67 resíduos de aminoácidos, respectivamente.

cDNA

CCCCCTCTGTCTGGGGNTTGGCCCCACNNGGTTGTATGTGTGTGTCTNCTCGCCTCTGCCAATATGGCTG GTTGTCTNGCCGNTGGGGGNTTTTTTATCCGGCCGCGTGTTTGTGTTCCCTTNTGNTTCCGTTGTCCCGC GNTTTCCGTGTTGGGTTTGGTCCTTCATTGGGCCCCCCNGGCTTGTCCAAGTGTGTATACTTTCCGGCTN CGTTGATTNATTGTGGGGGGATTCTGTGATCCTGGGTTAACCCTATTGTTCNAGTCANCCAGGGGGCTCC GACTGTTTGACCCTTTGGNTTTACCGCCCCATANGCCTCGGGTAGTTNTAGCCCCGTNCACTTTATAGAG GGGANCCAANATAGGCCTGTGGGGATGGCTTNACAGGCGCCGCCCCATTGTCCAAGGGTTNGNACAACTT TAACGGTTGGGATTCCCNCAAAGTAATGTTCGGTGGGCAAACGGTGAGNCCAATGCTAACTCCCAAAATG TAATGTTGCGCCGTGGGGAAATTTTTCAACCGTCCAGAAGTATGTGATAGCTGGAGCCCAACTTTGTTAA TCAATTNAATTGGGATTACAGGNTCCATGGGTCTATGGTTGCCCNCAGTGTGTTGCGCTGTTACCCACTT GGGCCCATTCCTAANGGAAGGCCAACCAAGTTTTGGAAACGGGAAAAGTGCTGGCATNTTTCCTGGTAAA TNNACCCCATTGCCTGTGGGTAAATGGTTGTGGAAACCCTTCCGGGCGCGCCAATTAAATCGNGCCAATG TTAAGGCCCTTGGGTATTTCGTTGGCAGGNCATAAAAGGGGGGCACAAATAATAGGGTAACTTCCCNNNG TGNTGAACCACAAACAGGGTAGNGACCCAATGTCCCAAAAGTGTTCAATGTGGCGGGAANGTTGNTTCGT TGGGGTTGTCACTTAGGTGTTTCCTCCTTGCGGAAAGGCCGTGTTTNTATTGGGAAACAATGGAAAGGTT CCCGAATGGTTTANTAAAGTGCCAATTGGAATGCCACTAAAAGGAATGTTTACCCTATTTCGGGTATTTG GACATAAATGGTTAATCAGGCCAGAGCGTGGCCTTTAGTTAAACGTTGCCTTCGTTCAGTTTCGGCTGTG AGTANATTAAGGTTAACTCGTTCAGGGCATACGATATGACTGAATGTTACATAACNAAGTGCATAATACT TCTGTAAAATCTGTATTTGGCAAAAAGAATTCGCTTTAGATATTGGTACATATTATAGCCGAGATATATG CAATGATTTGGAAGCTGTGAGTAGTGATACTCGAGAGTACTTCTAGAGCGCCCGCGGGCCCATCGATTTT CCACCCGGGTGGGTTTACAGCTAAGTACCCTATTCGCCTATAGTGAACTCATGGATTCATGCACACGTTC NAA

LsC3a (Tradução no frame +2)

MGLWLPXVCCAVTHLGPFLXEGQPSFGNGKSAGXFPGKXTPLPVGKWLWKPFRARQLNRANVKALGYFVGRX

LsC3b (Tradução no frame +3)

MCVSXRLCQYGWLSXRWGXFYPAACLCSLXXPLSRXFRVGFGPSLGPPGLSKCVYFPAXLIXCGGIL

A análise da seqüência peptídica de LsC3a pelo programa SignalP revelou a

provável existência de um sítio de clivagem para peptídeo sinal (Figura 26). O caráter

hidrofóbico do peptídeo sinal pode ser visto com maior clareza no gráfico de

90

hidropaticidade gerado pelo programa ProtScale para a seqüência peptídica de LsC3a

(Figura 27). A análise da seqüência peptídica LsC3b pelo programa SignalP não revelou

existência de um provável sítio de clivagem para peptídeo sinal.

91

Figura 26: Predição do ponto de clivagem entre os peptídeos sinal e intermediário na seqüência do

peptídeo LsC3a. O pico em vermelho indica o ponto de clivagem do peptídeo sinal. O pico em azul

escuro indica o caráter hidrofóbico comum aos peptídeos sinais. Os picos verde e azul claro indicam

as regiões N- e C-terminais do peptídeo sinal, respectivamente.

92

Figura 27: Gráfico de hidropaticidade dos aminoácidos traduzidos a partir do cDNA dos clones que

codificam o precursor do componente clonado LsC3a. As regiões acima e abaixo do ponto 0 (seta

vermelha) indicam a presença de aminoácidos com características hidrofóbicas e hidrofílicas,

respectivamente. A região inicial hidrofóbica (~20 a.a.) sugere a existência de um peptídeo sinal na

seqüência peptídica de LsC3a.

93


A seqüência nucleotídica do clone 23 apresenta 722 pares de bases. A tradução da

seqüência do cDNA do clone 23 utilizando o programa SIXFRAME revelou a existência de

uma janela de leitura no frame +1 (azul) e +2 (vermelho). A tradução nos frames +1 e +2

originou peptídeos compostos por 46 e 42 resíduos de aminoácidos, respectivamente. A

análise desses peptídeos pelo programa BlastP não revelou identidade com seqüências

protéicas depositadas no GenBank.

GAATTCGGCACCAGAGAAAGCTCAACTTGCAGTGCCCGGGAGGGGACAGCTGTTTTTGGAAAAATCCTCC GATGGTGAAATACCATGTCAAGTATATCTATGGAGAGTATGATCAATGTGTGGCCTTTACATGATGTAAA CCCTTCAGTCTCCATACTCATTTCTCTAGGTGATCCCACNAAAGCCCATTTCTCANTTAAGATACCTCTG AACGAGGAGGAGTGACCAAGATCTTTAGGTCACTCTGACTGTTCTGTGGCAGCAGAAGGTTGCCAATGGC AGCAAGGCACTGAGTAAGGGATTTCGTCTTGTGGATGAACTGATGGACCCCATGGTTGTCAGTCTGTTTA TCACTTGCACATCCATGTTTTGGTGGAAGGCAGATGGGCTGGCCACCTGGCTAAGGATAAAAAAACAGGG CCTGTTAGTTTCACTGGATCACTGCTTGTGAATCCTGCTTGACCAGAACTTATAGGGGTTGTAACTAATG ACACACTTATAATACAAAATCTCTTGTTATACTGGCAACTTTTTCTGGGAAGCATTTGTTTTGTTTGATA TTCAAATCAAATTTAGATTTGGCCCGTAACCAATGCCAATTACCAAAACTTATTGCTTTGTTCATGAAAA TACATACATGTATGTGTACTTACCTTTTCTTTTTGTTTGCCTGTTTTGAATAAACCAAACTTTAAGCAAA AAAAAAAAAAAAAAAACTCGAG

LsC4-a (Tradução no frame +1)

MSSISMESMI NVWPLHDVNP SVSILISLGD PTKAHFSXKI PLNEEE

LsC4-b (Tradução no frame +2)

MDPMVVSLFI TCTSMFWWKA DGLATWLRIK KQGLLVSLDH CL

94


A seqüência nucleotídica do clone 24 apresenta 893 pares de bases. A tradução do

cDNA do clone 24 realizada pelo programa SIXFRAME procedeu-se no frame +1 e

originou um peptídeo de 62 aminoácido denominado LsC5. A análise desse peptídeo pelo

programa BlastP não revelou identidade com outras proteínas depositadas no GenBank.

AAAATGTCGCGNCAATCCCTTATCTGATGCCCCAGGGTACCTGNCTCCGAATATTTCCAAGNCCCCAGGT GTGGGCCATAAAGANGTCAAAGTTGTCTTGATCCNAAACAAGAGGGCTTAATGTCAATAGGAAAGGAATG TGAGNNCGTCTTCAATCCCCCGGGGACCGAGAAGGTTTTTTCGTCACCCCGGATATTTAATTTTGGCCCC TTCAGAATATGGAAAGATATTTTGTGGGATAGTCCTTGTGTGTTGCGCCCAGAAATTAATGACGGGAGGG GTTATCCAACAGGCCGTGCATTTCAATAAAGATGGCTCCCTGGGGTTTTCCGTTTGACCAAAAATGATCG TTAAGAAATTAAAATGAAAATTGAAGACGAGTTGAATGAGGACTTATTCCACAAGTCATTCTAGAAACTA AGGGAATACCATATAACCTCACAGGCAAGAAACTGGAAAAGTTGTTTCCAAAGATCATTGATTACAATCA GATTCCAGAAGTGAACAATGTGAAAAATCCGTATTGCCNGAAATCTTTCCTGAATATACCTGAACTTCAG AACTTCTAGGTGAAATGAAATGAGAAACGGGACTTGTTTATTTCTGAATTTTCTTGTTTTCTAATTGTAA CACACGTGATATCCATCTCTGTCGATAGCGAGCTTCAATGAACAGGAATTTTCAAAAATTAGGCCATTGG AGTAACTCAGTGGCATAAAAAAAACAATAATATGCTAAACCCCAAGATAAATAAAAGAATAATAATTTAA GNTGAGATGGAAAACTCGAGAGTAGCTTCTTAGAGCGGCCCGCGGGCCCATCGATTTTCCACCCGGTGGG TTACACAGCTAAGTTACCCATTCGCCTATATCANCGTATGCATCATGGCANTG

LsC5

MSIGKECEXVFNPPGTEKVFSSPRIFNFGPFRIWKDILWDSPCVLRPEINDGRGYPTGRAFQ

96

8- Discussão

Os estudos realizados com venenos de aranhas mostram que a maioria das toxinas

de aranhas descritas até o momento tem ação sobre receptores neurais, canais iônicos ou

proteínas de membranas pré-sinápticas envolvidas na liberação de neurotransmissores.

Embora haja poucos estudos envolvendo componentes tóxicos do veneno da aranha

Lasiodora sp, sabe-se que o veneno é capaz de inibir canais de Ca2+ do tipo L e modular a

cinética de canais de Na+ bem como a entrada de íons para dentro da célula (Kushmerick e

cols., 2001). Os estudos realizados por Kalapothakis e cols. (2003) sobre os efeitos do

veneno da Lasiodora sp em coração isolado de rato sugeriram que o veneno dessa aranha

possa estar envolvido no aumento da liberação vesicular de acetilcolina da extremidade de

nervos parasimpáticos.

Os peptídeos compreendem a principal classe de componentes tóxicos dos venenos

de aranhas, e apresentam uma massa molecular geralmente entre 4 e 10kDa (Savel-

Niemann, 1989). O isolamento e a caracterização funcional desses peptídeos têm sido

descritos em vários trabalhos, contudo, informações acerca da estrutura primária desses

peptídeos ainda são escassas e limitadas a poucas espécies.

Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de se poder inferir a seqüência de

aminoácidos de componentes do veneno bem como expressar as proteínas utilizando-se de

diferentes sistemas, dado a dificuldade de se obter grandes quantidades de veneno bruto.

97

Para a realização da varredura dos clones provenientes da excisão em massa do

fagemídeo pBK-CMV adotou-se a técnica de ELISA. Esta técnica foi escolhida devido a

sua sensibilidade e especificidade na detecção da presença do antígeno. Esse sistema de

varredura foi utilizado na identificação de proteínas imunogênicas de venenos de outros

animais, como por exemplo, os escorpiões Tityus bahiensis e Tityus serrulatus, podendo

gerar uma grande quantidade de informação em um curto período de tempo bem como

contribuir não só para projetos genomas como também para projetos proteomas, por meio

da identificação de proteínas e toxinas importantes, e para o desenvolvimento de

antivenenos para uso clinico (Kalapothakis e cols. 2001).

O seqüenciamento dos clones que apresentaram similaridade com toxinas de veneno

de outras aranhas forneceu a seqüência completa de nucleotídeos que codificam para as

toxinas denominadas LTx1, LTx2, LTx3 e LTx5. Todos os peptídeos precursores

apresentaram a mesma organização estrutural: peptídeo sinal, um peptídeo intermediário e

uma cadeia polipeptídica correspondente à toxina madura. Essa organização tem sido

encontrada em polipeptídeos tóxicos de venenos de outras aranhas e parece ser uma

característica estrutural comum a toxinas de aranhas (Cardoso e cols., 2003; Kalapothakis e

cols., 2002; Penaforte e cols., 2000).

Doze clones codificam seqüências de aminoácidos idênticas à seqüência da toxina

LTx1, um clone apresentou a seqüência codificante para LTx2, dois clones mostraram

codificar para a toxina LTx3 (Vieira e cols., 2004) e quatro clones codificam a toxina

LTx5. O fato do cDNA que codifica a toxina LTx1 ter sido encontrado 12 vezes sugere

uma maior imunogenicidade para LTx1 ou mesmo que o nível de expressão dessa toxina

seja maior, e que a mesma possa desempenhar um papel importante na paralisação e/ou

morte das presas. Essas hipóteses têm sido reforçadas ainda mais pelos achados de Moura e

cols. (2004). Utilizando anticorpos anti-P3, Moura e cols. realizaram a varredura de outras

sub-bibliotecas de cDNA da aranha Lasiodora sp e encontrou 11 clones com similaridade

com toxinas de aranhas, sendo que sete deles codificam para a toxina LTx1.

Os precursores das toxinas LTx1, LTx2 e LTx3, deduzidos a partir das seqüências

de cDNAs apresentaram um peptídeo sinal hidrofóbico, um peptídeo intermediário rico em

resíduos de glutamato e um peptídeo maduro, composto por 49 resíduos de aminoácidos

muito similares entre si diferindo-se em apenas 1-3 resíduos de aminoácidos. A

98

comparação das seqüências de aminoácidos das toxinas maduras LTx1 e LTx2 mostra que

elas se diferem em três resíduos de aminoácidos (posições 1, 25 e 49 – F/L, K/D e F/I). As

toxinas LTx1 e LTx3 diferem-se apenas no resíduo 25 (K/D). Entre as toxinas LTx2 e

LTx3 foram observadas discrepâncias nos resíduos 1 e 49 (L/F e I/F). As toxinas LTx2 e

LTx3 provavelmente exercem funções similares uma vez que os aminoácidos discrepantes

compartilham as mesmas características químicas (não polares). A discrepância observada

no resíduo da posição 25 (K�D) pode conferir às toxinas LTx1 e LTx3 diferentes modos

de ação, sobretudo no que diz respeito a alvos (canais iônicos e/ou receptores) ou

mecanismos de ação dessas toxinas. Estudos realizados com peptídeos de venenos de

tarântulas utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF têm revelado que a diversidade

farmacológica dos peptídeos tóxicos está baseada em peptídeos de tamanhos pequenos e

com um número limitado de modelos estruturais (Escoubas & Rash, 2004), de tal maneira

que mesmo diferenças sutis (como a troca de um único aminoácido) na estrutura primária

dessas toxinas podem resultar em diferentes estruturas tridimensionais e conseqüentemente,

em diferentes funções. Isoformas que se diferem em 1 ou 2 resíduos de aminoácidos

encontradas em venenos de aranhas têm sido descritas por outros autores. HaTx1/HaTx2

(Swarts & MacKinnon, 1995), HnTxIV/HnTxV (Liu e cols., 2003; Xiao & Liang, 2003) e

ESTx1/ESTx2 (Savel-Niemann, 1989) são exemplos de isoformas que se diferem em

apenas 1 resíduo de aminoácido; LpTx1/LpTx2 (Escoubas e cols., 1997) diferem em 2

resíduos de aminoácidos.

O tamanho das toxinas descritas neste trabalho, 49 (LTx1, LTx2 e LTx3) e 71

(LTx5) aminoácidos, está de acordo com dados obtidos a partir de estudos de evolução

molecular utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF realizado com venenos de 55

tarântulas (Escoubas & Rash, 2004). Esse estudo mostrou uma distribuição bi-modal de

pesos moleculares, onde 57,8% dos peptídeos apresentaram pesos moleculares entre 3500-

4500 Da e 6,9% dos peptídeos possuem massa entre 6500-7000 Da (Figura 28). Isto

significa que a maioria dos peptídeos de venenos de tarântulas possui um tamanho que

varia em média de 31-40 resíduos de aminoácidos (Escoubas & Rash, 2004).

99

Figura 28: Perfil molecular de peptídeos de venenos de 55 tarântulas utilizando espectrometria de

massa MALDI-TOF. A curva representa a freqüência de distribuição de pesos moleculares em

classes de 500 Da para as 1516 massas de peptídeos analisados, mostrando a distribuição bi-modal

(setas). As linhas representam números teóricos de aminoácidos para as classes de pesos

moleculares correspondentes (Adaptado de Escoubas & Rash, 2004).

A figura 29 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas

maduras da aranha Lasiodora sp com a seqüência de duas outras toxinas (LpTx1 e LpTx2)

da aranha Lasiodora parahybana, também de 49 resíduos de aminoácidos, previamente

descritas por Escoubas e cols. (1997). Uma elevada similaridade foi obtida entre as toxinas

isoladas do veneno da aranha Lasiodora parahybana (LpTx1 e LpTx2) e as toxinas

descritas neste trabalho (LTx1, LTx2 e LTx3). A toxina LTx1, descrita neste trabalho, é

idêntica à LpTx1 descrita por Escoubas e cols. (1997). Contudo, LTx2 apresenta diferença

em três resíduos de aminoácidos em relação à LpTx1 (posições 1, 25 e 49) e em 4 resíduos

quando alinhada com LpTx2 (posições 1, 6, 25 e 49). A toxina LTx3 difere de LpTx1

apenas no resíduo da posição 25 e difere da LpTx2 em dois resíduos de aminoácidos

(posições 6 e 25). Escoubas e cols. (1997) mostraram que as frações do veneno da aranha

Lasiodora parahybana tóxicas para insetos contêm peso molecular que varia entre 5000-

Classe Principal

Classe Secundária

100

6000 Da. A alta similaridade entre as toxinas descritas neste trabalho e as toxinas da

Lasiodora parahybana descritas por Escoubas e cols. (1997) poderia levar à especulação de

que se trata da mesma espécie de aranha. Contudo, a espécie Lasiodora parahybana não

tem sido descrita no estado de Minas Gerais, sendo nativa da região Nordeste do Brasil em

áreas como Campina Grande no Estado da Paraíba. Além do mais, pequenas diferenças ou

até 100% de identidade tem sido descrita na literatura entre toxinas de aranhas de espécies

distintas. Esse é o caso da toxina µ-Aga-III isolada do veneno da aranha Agenolepsis aperta

(Skinner e cols., 1989) que é idêntica à toxina CT-II, purificada da aranha Hololena curta

(Stapleton e cols., 1990). As toxinas GsMTx2/PaTx2 (Grammostola

spatulata/Phrixotrichus auratus) (Diochot e cols., 1999; Oswald e cols., 2002) e

TxP1/ESTx2 (Brachypelma smithi/Erypelma californicum) (Savel-Niemann, 1989; Kaiser

e cols., 1994) têm seqüências idênticas, mas foram descritas em diferentes, embora

relacionadas, espécies de aranhas.

1 6 25 49

LTx1 FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF

LTx2 LFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKI

LTx3 FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCDDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF

LpTx1 FFECTFECDIKKEGKPCKPKGCKCKDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF

LpTx2 FFECTLECDIKKEGKPCKPKGCKCNDKDNKDHKKCSGGWRCKLKLCLKF

Figura 29: Alinhamento das seqüências peptídicas das toxinas maduras das aranhas Lasiodora sp e

Lasiodora parahybana. Em azul são mostrados domínios conservados em todas as cinco toxinas.

As posições conservadas dos resíduos de cisteína (em vermelho) nas diferentes seqüências sugerem

que todas podem compartilhar semelhanças na estrutura tridimensional. Os aminoácidos que se

diferem em pelo menos uma delas são mostrados em preto.

101

As toxinas LTx1, LTx2 e LTx3 apresentaram aproximadamente 65% de identidade

com a seqüência de aminoácidos da toxina TXP1, uma neurotoxina descrita por Kaiser e

cols. (1994) purificada do veneno da tarântula mexicana “red knee” (Brachypelma smithii),

e ESTx, uma toxina presente no veneno da aranha Eurypelma californicum descrita por

(Savel-Niemann, 1989). A elevada similaridade compartilhada pelas toxinas LTx1, LTx2,

LTx3, TXP1 e ESTx está relacionada, provavelmente, com o fato dessas aranhas

pertencerem à mesma família, Theraphosidae.

A maioria das seqüências primárias de toxinas de venenos de tarântulas

identificadas até o momento possui em média 31-41 aminoácidos, reticulados por três

pontes dissulfeto (Escoubas & Rash, 2004). O alinhamento das lasiotoxinas (LpTx1 e

LpTx2) descritas para L. parahybana com as toxinas ESTx e HwTx-II (Figura 30) indica

que elas podem adotar uma conformação tridimensional parecida, modificada por um

trecho de 10-13 aminoácidos extras e uma ponte dissulfeto adicional. A conservação dos

resíduos de cisteína sugere que ao longo da evolução muitos domínios protéicos tendem a

ser conservados, e que pequenas modificações de resíduos de aminoácidos observadas nas

seqüências dessas proteínas são suficientes para conferir atividades diferentes. A estrutura

de proteínas tóxicas de escorpiões e serpentes tende a conservar o arranjo das pontes de

dissulfeto e modificar as seqüências peptídicas que estão expostas na superfície da

molécula (Menez e cols., 1992). Ao que parece, os peptídeos tóxicos de aranhas apresentam

a mesma tendência evolutiva. O mecanismo evolucionário envolvido no aumento da

diversidade de toxinas animais parece estar relacionado com mutações pontuais seguidas de

rápidas duplicações gênicas e recombinações. Modificações pós-traducionais do produto

gênico também levam ao aumento de peptídeos e proteínas tóxicos (Mebs, 2001). Um

fenômeno paradoxal que venenos animais podem ter em comum é o fato das regiões não

codificantes de genes de toxinas (regiões 3’ e 5’-não traduzidas e íntrons) apresentarem

elementos estruturais altamente conservados enquanto que partes codificantes (éxons)

freqüentemente exibem grande variabilidade, contrário ao que ocorre normalmente em

outros genes (Mebs, 2001; Afifiyan e cols., 1999; Chuman e cols., 2000; Kuch e cols.,

2003; Chang e cols., 2003; Tani e cols., 2002).

102

Figura 30: Alinhamento (ClustalW) de toxinas de tarântulas. As prováveis interações entre os

resíduos de cisteínas das toxinas HwTx-II (Ile/Gln), ESTx1, ESTx2/TxP1, LpTx1 e LpTx2 são

mostradas pelos algarismos romanos (Adaptado de Escoubas & Rash, 2004).

A análise da expressão de LTx1 revelou uma indução basal (tempo 0) e um tempo

ótimo de indução em torno de 5 horas após a adição de IPTG 0.6mM e incubação a 30ºC

(200 rpm). A toxina recombinante foi também analisada por western bloting juntamente

com uma fração do veneno bruto de Lasiodora sp. A toxina LTx1 foi encontrada sobretudo

na fração solúvel sugerindo que não há formação de corpos de inclusões uma vez que não

foi observada a presença mensurável da mesma no precipitado da sonicação de células

induzidas.

Quatro clones positivos em ensaios imunológicos de ELISA codificam o precursor

da toxina LTx5. A toxina LTx5 é sintetizada na glândula de veneno da aranha Lasiodora sp

inicialmente como um pré-peptídeo contendo um peptídeo sinal hidrofóbico composto por

17 resíduos de aminoácido, um peptídeo intermediário contendo 28 resíduos de

aminoácidos e o peptídeo maduro composto por 71 resíduos de aminoácidos. De acordo

com o perfil molecular do veneno de 55 tarântulas obtido por Escoubas & Rash (2004),

LTx5 pertence à segunda classe de peptídeos encontrados em glândula de veneno de

tarântulas, com peso molecular variando em torno de 7000-8000 Da (Figura 28).

O alinhamento das toxinas da aranha Lasiodora sp LTx1, LTx2, LTx3, LTx5

(descritas neste trabalho) e LTx4 (descrita por Moura e cols., 2004) (Figura 31) sugere

(baseado na similaridade entre as seqüências), a existência de pelo menos três famílias de

103

proteínas de baixo pelo molecular codificadas na glândula de veneno da aranha em questão

(Figura 32).

Figura 31: Alinhamento dos precursores das toxinas da aranha Lasiodora sp LTx1, LTx2, LTx3,

LTx4 e LTx5. Os resíduos destacados em roxo são comuns a todas as seqüências. Os resíduos

conservados nas seqüências de LTx1, LTx2 e LTx3 (azul claro) sugere que essas toxinas

compartilham a mesma família de proteínas. A ausência de domínios conservados entre LTx4

(Moura e cols., 2004 dados não publicados), LTx5 e as três primeiras toxinas sugere a existência de

pelo menos três famílias de proteínas de baixo pelo molecular codificadas na glândula de veneno da

aranha Lasiodora sp.

104

Figura 32: Dendograma das toxinas da aranha Lasiodora sp baseada no programa de alinhamento

ClustalW. Pelo menos três famílias de proteínas parecem ser codificadas na glândula de veneno da

aranha em questão.

A análise do peptídeo codificado pelo cDNA do clone 20 apresentou elevada

similaridade com cadeias β de globinas de diferentes organismos. Embora a probabilidade

de contaminação, no momento da construção da biblioteca de cDNA, com RNAs de

animais utilizados na alimentação das aranhas não seja descartada, fragmentos de

hemoglobina com atividade antimicrobial têm sido descritos. Fogaça e cols. (2000)

identificaram um fragmento da cadeia α da hemoglobina bovina referente à região

compreendida entre os resíduos 33 ao 61, com propriedades antimicrobianas. Esse

peptídeo, com massa molecular de 3.205,6 Da, foi inicialmente isolado do intestino do

carrapato Boophilus microplus. Observou-se que o fragmento da cadeia α da hemoglobina

bovina age em concentrações micromolares apenas contra bactérias Gram-positivas e

contra fungos, não tendo sido ativo contra bactérias Gram-negativas (Fogaça e cols. 2000).

Cadeias de hemoglobina têm sido descritas como uma fonte de peptídeos bioativos

endógenos. Froidevaux e cols. (2001) têm obtido diferentes peptídeos a partir da hidrólise

105

peptídica de hemoglobina bovina. Esses autores obtiveram um fragmento correspondente

aos primeiros 23 resíduos de aminoácidos da extremidade N-terminal da cadeia α da

hemoglobina bovina e testaram sua atividade contra Micrococcus luteus. A inibição do

crescimento das células microbianas foi obtida a uma concentração de 1,5mg/ml (671µM)

de peptídeo α 1-23. A clivagem das subunidades α e β de hemoglobina (inclusive a

humana) utilizando-se brometo de cianogênio tem fornecido fragmentos com atividade

antimicrobial mensuráveis (Parish e cols., 2001). Regiões específicas da molécula de

hemoglobina humana, responsáveis por atividade antimicrobiana, têm sido mapeadas. Os

trinta aminoácidos da extremidade carboxila da subunidade β, responsáveis pela formação

de uma α-hélice catiônica baseada na estrutura cristalina do tetrâmero intacto, apresenta

atividade contra Escherichia coli, Staphilococcus aureus e Candida albicans (Parish e

cols., 2001). Os autores postulam que, em adição à sua função no transporte de oxigênio, a

hemoglobina age como um importante agente antibiótico contra um amplo espectro de

microrganismos.

A análise da seqüência do cDNA do clone 21 apresentou 62% de similaridade com

a proteína CG7580-PA da mosca Drosophila melanogaster, 58% de similaridade com a

proteína agCP10691 do mosquito Anopheles gambiae e 46% de similaridade com a

proteína Qpc-pending do camundongo Mus musculus. Nenhuma atividade tóxica tem sido

descrita para os peptídeos com os quais o cDNA do clone 21 apresentou similaridade.

107

9- Conclusões

� A varredura da biblioteca de cDNA, utilizando-se da técnica de ELISA,

permitiu o isolamento de clones que apresentaram insertos que codificam

seqüências com similaridade com toxinas das aranhas Brachypelma smithii

(TxP1), Eurypelma californicum (ESTx), Selenocosmia huwena (HwTx-II),

Lasiodora parahibana (LpTx1 e LpTx2) e Macrothele gigas (Magi 7).

� As seqüências primárias dos peptídeos precursores para LTx1, LTx2, LTx3 e

LTx5 apresentaram a mesma organização: um peptídeo sinal hidrofóbico

localizado na extremidade N-terminal, um peptídeo intermediário e uma região

correspondente à seqüência da toxina madura.

� O tamanho das toxinas descritas neste trabalho, 49 (LTx1, LTx2 e LTx3) e 71

(LTx5) resíduos de aminoácidos, está em acordo com dados obtidos a partir de

estudos de evolução molecular realizados com venenos de aranhas.

� A análise das seqüências peptídicas de LTx1, LTx2 e LTx3 sugere uma

estrutura organizacional que compreende a presença de quatro ligações

dissulfeto, enquanto a toxina LTx5 deve apresentar apenas três pontes

dissulfeto.

� O cDNA que codifica a toxina LTx1 foi encontrado em 12 clones, em um total

de 19 clones positivos com similaridades com toxinas de outras aranhas. Esse

resultado sugere que LTx1 seja mais imunogênica ou mesmo que LTx1 tenha

um nível de expressão maior.

108

� As toxinas LTx2 e LTx3 provavelmente possuem atividades similares uma vez

que os aminoácidos discrepantes entre as toxinas (posições: 1 e 49)

compartilham as mesmas características químicas, enquanto que a discrepância

observada entre as toxinas LTx1 e LTx2/LTx3 (K�D) pode conferir à LTx1

uma atividade distinta.

� Uma elevada similaridade foi obtida entre as toxinas isoladas do veneno da

aranha Lasiodora sp (LTx1, LTx2 e LTx3) e as toxinas LpTx1, LpTx2 descritas

para L. parahybana, sendo a toxina LTx1 idêntica à LpTx1.

� O alinhamento das toxinas da aranha Lasiodora sp LTx1, LTx2, LTx3, LTx5 e

LTx4 sugere a existência de pelo menos três famílias de toxinas no veneno da

aranha.

� Os experimentos de indução da toxina LTx1 recombinante revelaram um tempo

ótimo de indução em torno de 5 horas e produziu a toxina na sua forma solúvel.

110

10- Perspectivas

Pouco se conhece sobre a composição qualitativa e/ou quantitativa do veneno da

Lasiodora sp. Neste sentido, pretendemos:

� Expressar em outros sistemas as diferentes toxinas identificadas.

� Purificar as toxinas recombinantes.

� Produzir anticorpos específicos contra as toxinas que se mostrarem

ativas. Estes anticorpos poderão ser usados para monitorar processos de

purificação, desenvolvimento de vacinas ou na varredura de outras sub-

bibliotecas.

� Proceder estudos funcionais: ensaios farmacológicos e eletrofisiológicos.

� Estudar a ação das toxinas recombinantes em insetos

� Realizar mutações sítio-dirigidas em aminoácidos que possam ser

críticos do ponto de vista toxicológico ou imunológico.

112

11. Referências Bibliográficas

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