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ARTIGO ORIGINAL 1 Vicissitudes na análise de amostras biológicas com interesse forense em suportes de aço inoxidável José Nogueira Laura Cainé Maria de Lurdes Pontes Maria de Fátima Pinheiro Resumo Amostras biológicas que surgem com frequência na casuística laboratorial, como as manchas de sangue, são por vezes difíceis de analisar, tendo em vista a obtenção de um perfil genético com utilidade na conclusão de casos forenses. São disso exemplo amostras de sangue depositadas em lâminas de facas de aço inoxidável. Atendendo a que vicissitudes inerentes à amostra, nomeadamente o suporte onde está depositada, assim como os relativos ao seu processamento têm importância no sucesso dos resultados, foi efetuado um estudo com o objetivo de determinar se o suporte aço inoxidável poderia ter influência. Foram colocadas em lâminas de inox várias manchas de sangue semelhantes (morfologia e quantidade) e deixadas a interagir com o suporte durante períodos de tempo diferentes. Em cada período estabelecido foram extraídas por 4 métodos distintos e posteriormente quantificadas e fenotipadas. Os resultados da fenotipagem não mostraram influência do suporte de aço inoxidável sobre as manchas. Contudo, ficou evidente que a etapa de extração é determinante para o sucesso da perícia, sendo também de considerar o seu custo. Estudos complementares para avaliação das condições de conservação ou amostras de casuística laboratorial serão opções a seguir para esclarecer a influência que o aço inoxidável terá nas manchas de sangue depositadas. Palavras-chave Facas Aço inoxidável Mancha de sangue Quantificação de DNA Inibição de PCR STR Introdução As amostras biológicas com interesse forense podem surgir em vários tipos de suportes e o seu processamento (para fins periciais) deve ser corretamente executado para a obtenção de resultados com utilidade na conclusão de casos forenses (perfil genético completo ou parcial para um nº. > a 8 em 15 loci, para posterior comparação com o de um alegado suspeito) [1,2]. O sangue é uma das amostras mais frequentemente analisadas, podendo estar depositado em objetos de natureza diversa, evidenciando-se os cortantes (ex.: facas). O material constituinte do suporte onde se encontra a mancha de sangue a estudar pode exercer influência sobre os resultados obtidos, como já foi verificado em estudos prévios [3-6]. Foram registados alguns casos no Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, IP. (DN do INMLCF, IP.) em que não foi obtida informação útil (nº < a 8 em 15 loci) a partir de manchas de sangue visíveis depositadas em facas de aço inoxidável, utilizando as metodologias habituais. Por isso, pareceu pertinente investigar os motivos que podem justificar estes resultados, constituindo o principal objetivo deste trabalho. Vários podem ser os fatores que condicionam a obtenção de um perfil genético com utilidade forense, sendo de destacar os relacionados com a natureza da amostra e a qualidade e/ou quantidade do seu material genético. Atendendo aos fatores inerentes à própria amostra devem ser selecionadas as metodologias mais apropriadas para o seu processamento com vista à obtenção de um perfil genético completo. O percurso laboratorial habitualmente adotado para manchas de sangue inclui: (1) recolha da mancha a partir do suporte, (2) extração do ácido desoxirribonucleico (DNA) da mancha, (3) quantificação do DNA extraído, (4) amplificação de marcadores genéticos previamente selecionados por Polymerase Chain Reaction (PCR) e (5) análise dos produtos de PCR através de eletroforese capilar (CE) (fenotipagem) [1]. A técnica habitual de recolha consiste em usar uma zaragatoa húmida friccionando-a sobre a superfície que contém a mancha; estudos prévios mostraram que para garantir uma colheita do material genético mais eficaz podem ser usadas outras práticas alternativas, entre as quais a realização de uma segunda recolha com zaragatoa seca. Acresce que também foi sugerido que o humedecimento da zaragatoa fosse efetuado com soluções-tampão em vez de água purificada e posterior conservação por congelamento [7,8]. O desempenho de várias técnicas de extração foi já alvo de estudos comparativos que mostraram que o clássico método orgânico (fenol:clorofórmio:álcool-isoamílico) era, partindo de uma quantidade de amostra razoável, dos mais eficazes na obtenção de quantidades apreciáveis de DNA de boa qualidade para procedimentos utilizando a PCR. Contudo, além de se tratar de um protocolo moroso que inclui múltiplos passos de manuseamento da amostra, o que aumenta a possibilidade da sua contaminação, pressupõe também a utilização de substâncias potencialmente prejudiciais à saúde [1,9,10]. Os métodos de extração pelo Chelex, para além de mais rápidos e J. Nogueira () Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto Rua de Jorge Viterbo Ferreira n.º 228, 4050-313 Porto (Portugal) E-mail: [email protected] Telephone: +351 964 213 096 L. Cainé M.L. Pontes M.F. Pinheiro Serviço de Genética e Biologia Forenses, Delegação do Porto do Instituto de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. Jardim Carrilho Videira 4050-167 Porto (Portugal) E-mail: [email protected]

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ARTIGO ORIGINAL        

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Vicissitudes na análise de amostras biológicas com interesse forense em suportes de aço inoxidável José Nogueira � Laura Cainé � Maria de Lurdes Pontes � Maria de Fátima Pinheiro

Resumo

Amostras biológicas que surgem com frequência na casuística laboratorial, como as manchas de sangue, são por vezes difíceis de analisar, tendo em vista a obtenção de um perfil genético com utilidade na conclusão de casos forenses. São disso exemplo amostras de sangue depositadas em lâminas de facas de aço inoxidável. Atendendo a que vicissitudes inerentes à amostra, nomeadamente o suporte onde está depositada, assim como os relativos ao seu processamento têm importância no sucesso dos resultados, foi efetuado um estudo com o objetivo de determinar se o suporte aço inoxidável poderia ter influência. Foram colocadas em lâminas de inox várias manchas de sangue semelhantes (morfologia e quantidade) e deixadas a interagir com o suporte durante períodos de tempo diferentes. Em cada período estabelecido foram extraídas por 4 métodos distintos e posteriormente quantificadas e fenotipadas. Os resultados da fenotipagem não mostraram influência do suporte de aço inoxidável sobre as manchas. Contudo, ficou evidente que a etapa de extração é determinante para o sucesso da perícia, sendo também de considerar o seu custo. Estudos complementares para avaliação das condições de conservação ou amostras de casuística laboratorial serão opções a seguir para esclarecer a influência que o aço inoxidável terá nas manchas de sangue depositadas.

Palavras-chave

Facas � Aço inoxidável � Mancha de sangue � Quantificação de DNA � Inibição de PCR � STR

Introdução

As amostras biológicas com interesse forense podem surgir em vários tipos de suportes e o seu processamento (para fins periciais) deve ser corretamente executado para a obtenção de resultados com utilidade na conclusão de casos forenses (perfil genético completo ou parcial para um nº. > a 8 em 15 loci, para posterior

comparação com o de um alegado suspeito) [1,2]. O sangue é uma das amostras mais frequentemente analisadas, podendo estar depositado em objetos de natureza diversa, evidenciando-se os cortantes (ex.: facas). O material constituinte do suporte onde se encontra a mancha de sangue a estudar pode exercer influência sobre os resultados obtidos, como já foi verificado em estudos prévios [3-6]. Foram registados alguns casos no Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, IP. (DN do INMLCF, IP.) em que não foi obtida informação útil (nº < a 8 em 15 loci) a partir de manchas de sangue visíveis depositadas em facas de aço inoxidável, utilizando as metodologias habituais. Por isso, pareceu pertinente investigar os motivos que podem justificar estes resultados, constituindo o principal objetivo deste trabalho.

Vários podem ser os fatores que condicionam a obtenção de um perfil genético com utilidade forense, sendo de destacar os relacionados com a natureza da amostra e a qualidade e/ou quantidade do seu material genético. Atendendo aos fatores inerentes à própria amostra devem ser selecionadas as metodologias mais apropriadas para o seu processamento com vista à obtenção de um perfil genético completo. O percurso laboratorial habitualmente adotado para manchas de sangue inclui: (1) recolha da mancha a partir do suporte, (2) extração do ácido desoxirribonucleico (DNA) da mancha, (3) quantificação do DNA extraído, (4) amplificação de marcadores genéticos previamente selecionados por Polymerase Chain Reaction (PCR) e (5) análise dos produtos de PCR através de eletroforese capilar (CE) (fenotipagem) [1]. A técnica habitual de recolha consiste em usar uma zaragatoa húmida friccionando-a sobre a superfície que contém a mancha; estudos prévios mostraram que para garantir uma colheita do material genético mais eficaz podem ser usadas outras práticas alternativas, entre as quais a realização de uma segunda recolha com zaragatoa seca. Acresce que também foi sugerido que o humedecimento da zaragatoa fosse efetuado com soluções-tampão em vez de água purificada e posterior conservação por congelamento [7,8]. O desempenho de várias técnicas de extração foi já alvo de estudos comparativos que mostraram que o clássico método orgânico (fenol:clorofórmio:álcool-isoamílico) era, partindo de uma quantidade de amostra razoável, dos mais eficazes na obtenção de quantidades apreciáveis de DNA de boa qualidade para procedimentos utilizando a PCR. Contudo, além de se tratar de um protocolo moroso que inclui múltiplos passos de manuseamento da amostra, o que aumenta a possibilidade da sua contaminação, pressupõe também a utilização de substâncias potencialmente prejudiciais à saúde [1,9,10]. Os métodos de extração pelo Chelex, para além de mais rápidos e

J. Nogueira (*) Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto Rua de Jorge Viterbo Ferreira n.º 228, 4050-313 Porto (Portugal) E-mail: [email protected] Telephone: +351 964 213 096

L. Cainé � M.L. Pontes � M.F. Pinheiro Serviço de Genética e Biologia Forenses, Delegação do Porto do Instituto de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. Jardim Carrilho Videira 4050-167 Porto (Portugal) E-mail: [email protected]

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menos laboriosos, podem levar à obtenção de DNA livre de algum tipo de inibidores, nomeadamente iões metálicos, embora com diferente qualidade[1,11,12]. Existem hoje métodos automatizados que proporcionam quantidades de DNA apreciáveis, minimizando a presença de produtos contaminantes. Mais recentemente foi demonstrado que não é obrigatório proceder à extração de DNA sem que haja prejuízo nos resultados finais [3,4,6,13,9]. A quantificação do material extraído realiza-se atualmente recorrendo a técnicas de PCR quantitativa em tempo-real (qPCR), utilizando Kits comerciais nos quais está incluído um controlo Interno (IPC) que permite verificar se existem inibidores na amostra que interfiram na PCR [14,15]. Existem evidências que a presença destes inibidores, tais como o grupo Heme (sangue), iões metálicos (possivelmente provenientes do suporte) ou ácido húmico (solo) podem interferir nos vários componentes da PCR, conduzindo à ausência de alelos ou mesmo a totalidade do perfil genético [7,16]. Posteriormente o DNA é amplificado por PCR, usando Kits que contêm primers específicos para a caracterização de marcadores genéticos denominados de Short Tandem Repeats (STR). O passo subsequente à PCR é a CE que usa métodos de separação e deteção de fragmentos de DNA por fluorescência, permitindo separar e detetar os alelos específicos presentes na amostra, para cada um desses loci. Estão disponíveis no mercado Kits que incluem combinações superiores a 13 STR diferentes, proporcionando um poder de discriminação de 1 em 109 [1]. Em alguns desses Kits estão incluídos marcadores de menor tamanho, designados de miniSTR, cuja caraterização é vantajosa em amostras com o material genético degradado [17,18].

A presença de quantidade exígua de material genético é um dos fatores limitantes e mais frequentes em perícias de criminalística biológica [7,17]. No caso de amostras em que a quantidade não é problemática, interessa que o DNA possua a necessária qualidade, pois a sua degradação devido, por exemplo, à exposição a condições ambientais adversas, a deficientes condições de conservação ou mesmo à interação com o suporte condicionam a obtenção de resultados adequados [1,3,8,19]. Em relação a este última eventualidade, estudos prévios mostraram que são conhecidas interações entre manchas de sangue e o suporte onde se encontravam depositadas, nomeadamente plásticos e vidro [4]. Contudo, tanto quanto se conhece, não existe bibliografia que se refira à influência que um suporte de ácido inoxidável poderá ter em manchas de sangue ou no seu processamento. Existem, no entanto, como é sabido, dados referentes à obtenção de perfis genéticos a partir de quantidades de DNA vestigiais (Low Template DNA, LT-DNA) em facas, que demostraram proporcionar um sucesso de apenas 19% [2,20]. Da multiplicidade dos fatores que podem estar envolvidos na fenotipagem torna-se necessário determinar quais deles poderão estar associados ao relativo insucesso na obtenção de um perfil genético nas amostras de sangue depositadas em facas. Pretende-se, por isso, determinar a possibilidade do aço inoxidável poder exercer algum tipo de influência sobre a mancha de sangue ou no seu posterior processamento. O objetivo principal deste

estudo reside na identificação deste(s) fator(es), que permitirá incrementar o sucesso na resolução das perícias que envolvam manchas de sangue neste tipo de suportes. Materiais e métodos

Desenho do estudo

Foi realizado um estudo experimental que consistiu na colheita controlada de sangue capilar de um voluntário e sua deposição em facas de aço inoxidável estruturalmente semelhantes. As manchas de sangue foram posteriormente processadas em intervalos de tempo distintos, de modo a permitir que a amostra mantivesse contacto com as lâminas das facas durante períodos predefinidos. Em cada momento de processamento foram executadas recolhas através da utilização de zaragatoa humedecida, tendo sido usados 4 métodos de extração distintos, seguidos de quantificação do DNA para aferir a sua respetiva eficácia. Posteriormente procedeu-se à amplificação e à análise dos produtos amplificados por CE.

Suportes

Para a deposição das amostras foram escolhidas 3 facas de cozinha semelhantes usadas no quotidiano doméstico, com lâminas de aço inoxidável, numa tentativa de reproduzir mais fielmente o tipo de facas que surge habitualmente na casuística laboratorial. As facas encontravam-se lavadas e as lâminas foram limpas com álcool a 70º e secas ao ar antes da deposição das amostras.

Amostras

Foram utilizadas amostras de sangue obtidas por punção capilar de um dador voluntário que não o operador, de modo a permitir a avaliação de possível contaminação durante os procedimentos. Num mesmo período de tempo, foram colhidas amostras de 10 microlitros de sangue que foi imediatamente depositado com micropipeta nas lâminas das facas, num total de 40 manchas. Cada gota foi espalhada de forma individual na lâmina da faca, recorrendo a um compressor de ar para evitar contaminação (ex.: por gotículas salivares) e respeitando o objetivo de mimetizar o melhor possível as amostras provenientes de casos forenses. As manchas foram deixadas a secar ao ar por um período mínimo de 24 horas. Foram ainda recolhidas amostras de sangue em Whatman FTA™ Card com o objetivo de serem usadas como controlos positivos. As facas foram acondicionadas numa caixa de cartão e deixadas à temperatura ambiente e em condições idênticas durante todo o processo.

Recolha das manchas

As recolhas foram realizadas recorrendo a zaragatoa estéril de algodão humedecido em água pura. Cada mancha de sangue da lâmina foi totalmente limpa com zaragatoa, após o que foi seca ao ar por um período de 24 horas. Foram realizadas recolhas em 3 tempos diferentes (T1 - 1 semana após colheita; T2 - 5 semanas após colheita; T3 - 10 semanas após colheita), de modo a verificar a eventual interação da mancha de sangue com o

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suporte. Os tempos das recolhas foram escolhidos de forma a tentar reproduzir o período de tempo a que estão sujeitas as amostras em casos forenses. Em cada tempo foram recolhidas 4 manchas em condições idênticas (triplicados, n=12) e 4 brancos, obtidos através de fricção de uma zaragatoa numa região não manchada da lâmina da faca (controlo negativo).

Extração

Das 40 manchas depositadas foram extraídas 36, recorrendo a 4 métodos distintos (adaptados dos protocolos usados pelo SGB da DN do INMLCF, IP.), de forma a testar a sua performance e consequente influência na fenotipagem. Para cada método foi utilizada uma amostra referente a cada tempo (em triplicado), um “branco” e um controlo positivo (DNA obtido a partir de 3 punchs de mancha depositada em Whatman FTA™ Card). Para os 4 métodos de extração foi utilizada zaragatoa completa obtida a partir da mancha. Os métodos utilizados foram os seguintes: (E1) extração orgânica utilizando um protocolo standard; (E2) extração mista que constou num primeiro passo de extração orgânica seguida de extração no robot Automate Express™ (Applied Biosystems®) com o kit PrepFiler Express™, com o objetivo de promover a purificação do DNA; (E3) extração no robot Automate Express™ (Applied Biosystems®), utilizando o kit PrepFiler Express™ do mesmo fabricante e o respetivo protocolo [21]; (E4) extração com Chelex a 5%, utilizando um protocolo standard. As extrações foram realizadas após cada tempo de recolha. O DNA extraído foi conservado a -20ºC até ser utilizado nas fases subsequentes.

Quantificação

A quantificação foi realizada recorrendo ao Kit Quantifiler Y Human Male™ no ABIPRISM 7500 Sequence Detection System™ (sistema de RealTime PCR) e SDS software v.1.0 (Applied Biosystems®). O protocolo executado foi o indicado pelo fabricante [22]. Os valores de Cycle threshold (Ct) relativos ao controlo interno (IPC) foram avaliados para identificação da presença de inibição.

Amplificação e Fenotipagem

A amplificação foi executada recorrendo ao Kit AmpFlSTR® NGM™ PCR Amplification. A análise de produtos de PCR foi efetuada no sequenciador ABI Prism 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems®). O protocolo executado foi adaptado do indicado pelo fabricante [18]. Foi utilizado um volume final de mistura de reação de 12,5 µl (como é habitual nos procedimentos de rotina). Os extratos que apresentaram maiores quantidades de DNA foram diluídos com água pura para normalizar a concentração de DNA a 1 ng/µl (recomendada pelo fabricante). Nos casos em que a quantidade era menor o extrato foi utilizado sem diluir.

Análise dos resultados

A fenotipagem das amostras foi realizada utilizando o software de análise GeneMapper® ID Software v.3.2.1 (Applied Biosystems®). Foi utilizado um limite mínimo de leitura de fluorescência de 80 RFU (Relative Fluorescence Units) para considerar um pico como verdadeiro alelo, minimizando interferências devido ao background dos eletroferogramas. Foram considerados apenas os picos relativos a ambos os alelos (caso de heterozigotia) correspondentes ao perfil genético (15 STR) do dador da amostra de sangue. Foi executada comparação com o perfil do operador para identificar possível contaminação.

Análise estatística

O tratamento estatístico dos dados foi realizado com o software IBM® SPSS Statistics 21. Para avaliar as diferenças entre os tempos de colheita e os métodos de extração foi utilizado o teste de Mann-Whitney (nível de significância p<0,05).

Resultados

Colheitas

A colheita das amostras decorreu dentro do expectável, tendo sido possível a obtenção de manchas de sangue depositadas de forma a que a superfície de contacto com a lâmina fosse a maior possível. Por outro lado, apresentavam-se suficientemente distantes umas das outras de modo a possibilitar a recolha isolada e uniforme com a zaragatoa. O aspeto das manchas obtidas era semelhante (Fig. 1).

Recolha

A recolha das manchas sanguíneas foi realizada de modo semelhante nos 3 tempos estabelecidos. Verificou-se que apesar da manutenção das condições de conservação das facas, as manchas de T3 (10 semanas) não apresentavam diferenças macroscópicas. Contudo, foram mais difíceis de colher com zaragatoa humedecida, por se apresentarem mais aderentes e viscosas. Foram colhidas 3 manchas para cada método de extração (ntotal=36) e respetivos controlos negativos.

Fig. 1 Exemplo do aspeto das manchas de sangue após serem depositadas na lâmina de uma faca.  

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Quantificação

Foi possível avaliar a tendência da eficácia dos processos de extração nos vários tempos de recolha destas amostras (Tabela 1). A extração orgânica proporcionou a obtenção de baixas concentrações de DNA face aos restantes dois métodos que não envolveram esse tipo de extração. O método misto revelou as menores concentrações de DNA. Salienta-se que os tempos T2 da extração E1 e T2 e T3 da extração E2 apresentaram quantidades residuais de DNA, podendo traduzir uma eventual contaminação, não tendo, por isso, sido utilizado nas comparações com os restantes métodos. As extrações E3 (Robot) e E4 (Chelex) proporcionaram os melhores resultados nos 3 momentos de recolha, tendo também mostrado uma maior reprodutibilidade (Fig. 2). Tendo em conta estes métodos em cada tempo (E3+E4, n=6), não foi possível identificar diferenças na quantidade de DNA total obtida nos 3 tempos de recolha (-1,6<Z<-0,6; P>0,10). Comparando as amostras totais dos métodos E3 (n=9) e E4 (n=9) constatou-se que este último apresentou melhor desempenho (Z=-2,47, P=0,013). Ambos mostraram diferença significativa face ao método E2 (n=6; Z=-3,18, P=0,01). Os dados referentes ao IPC do kit de quantificação utilizado mostraram não ter havido fenómenos de inibição (Ct <30).

Amplificação e fenotipagem

Foi fenotipada a totalidade das amostras extraídas, incluindo os respetivos controlos negativo e positivo. Em praticamente todas as amostras com concentrações de DNA superior a 0,1 ng/microlitro foi obtido, pelo menos, um perfil incompleto útil (> 8 loci corretamente identificados) (Fig. 3). Os eletroferogramas do DNA resultante das extrações E1 e E2 apresentaram picos inespecíficos, devido à reduzida quantidade de DNA. O facto de terem sido registados alguns picos nos respetivos brancos, levaram a que estes resultados não tivessem sido tomados em consideração nesta avaliação, de acordo com o mencionado. As amostras com quantidades de DNA muito baixas (T2-E2) foram as únicas a não fornecer um perfil genético útil. Existiram ligeiras diferenças na detecção dos alelos entre os métodos que garantiram maiores quantidades de DNA (E3 e E4). A extração orgânica (T1) também proporcionou perfis genéticos completos.

Discussão

Os resultados obtidos mostraram que apesar de poder haver alterações nas características físicas das manchas de sangue depositadas em lâminas de aço

Tabela 1 Valores de concentração (ng/µl) obtidos para as amostras extraídas e respetivos controlos positivos e negativos por processo extrativo e tempo de recolha. T1 - 1 semana T2 - 5 semanas T3 - 10 semanas

Amostra C(+) C(-) Amostra C(+) C(-) Amostra C(+) C(-)

Orgânica (E1) [0,51] - 0 [0,10]* 1,43 0,01 [0,10]* 0,16 0

Mista (E2) [0,18] - 0 [0,04] 0,11 0 [0,01]* 0,04 0,03

Robot (E3) [3,91] - 0 [2,13] 1,65 0 [1,78] 2,62 0

Chelex 5% (E4) [1,27] 1,77 0 [0,93] 2,53 0 [0,55] 2,24 0

Os valores entre parêntesis retos indicam a mediana da concentração obtida (n=3, ng/µl). Os valores assinalados com asterisco não foram utilizados em comparações face à detecção da presença de picos no respetivo branco. C(+) – controlo positivo C(-) – controlo negativo

Fig. 2 Mediana da concentração obtida (ng/µl) no processo de quantificação das amostras (n=3) por tempo e método de extração utilizados. T1- 1 semana, T2 – 5 semanas, T3 – 10 semanas, E2 – Extração mista, E3 – Extração por Robot, E4 – Extração por Chelex. CI – Intervalo de confiança

Fig. 3 Média da percentagem de um perfil completo de 15 STR identificado por tempo e tipo de extração efetuada. T1- 1 semana, T2 – 5 semanas, T3 – 10 semanas, E1 – Extração orgânica, E2 – Extração mista, E3 – Extração por Robot, E4 – Extração por Chelex, SD – Desvio padrão

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inoxidável (maior viscosidade) e de aderência ao suporte, estas não se traduziram em insucesso na obtenção de perfis genéticos. Os distintos processos de extração utilizados mostraram diferenças em termos de recuperação de DNA. A extração orgânica mostrou-se ineficaz e propensa a contaminação, enquanto as extrações automatizadas e com Chelex foram mais reprodutíveis. Não foi possível evidenciar a presença de inibidores que pudessem afetar a obtenção de resultados. Para concentrações de amostra inferiores a 0,1 ng/µl não foi obtido um perfil genético útil. Com estes resultados não foi possível identificar o eventual efeito do aço inoxidável da lâmina nas manchas de sangue depositadas, uma vez que não ocorreu uma diminuição significativa da quantidade de DNA obtida ou uma maior dificuldade de obtenção de um perfil genético à medida que o tempo de interação sangue-lâmina foi aumentando. O período de 10 semanas estabelecido, muito embora tente reproduzir o tempo em que as manchas de sangue dos casos forenses podem demorar a ser processadas desde a data do crime, pode não ter sido suficiente para evidenciar potenciais alterações. Por outro lado, condições de conservação diferentes das utilizadas neste estudo podem ter influência na qualidade do DNA a estudar. Apesar de ter sido pensado que a lâmina metálica pudesse de alguma maneira introduzir inibidores (iões metálicos)[1,4] tal facto também não se verificou. O método de colheita com zaragatoa húmida mostrou-se reprodutível e adequado para recuperação da totalidade da amostra de sangue depositada na faca. No entanto, foi necessária a utilização de todo o algodão da zaragatoa, mesmo nos processos de extração em que habitualmente é apenas usada metade.

O recurso a vários métodos de extração tinha duas finalidades: a de garantir que por um lado se conseguia obter DNA em quantidade suficiente para uma fenotipagem eficaz e, por outro lado, que se conseguia obter DNA de qualidade para o mesmo efeito, mesmo que a quantidade fosse menor. Assim, tendo-se utilizado métodos com eficácias diferentes já anteriormente estudados [11,9,10] tornou-se menor a probabilidade do insucesso ocasional se dever ao método de extração. Foi possível avaliar a importância desta etapa de processamento da amostra. O insucesso verificado na extração orgânica (E1) poderá dever-se a factores como a inexperiência do operador e/ou aos vários passos de manipulação com a consequência de perda de material genético. Para além disso, as exíguas quantidades de DNA obtidas contrariam a bibliografia que aponta esta metodologia como sendo suscetível de proporcionar grandes quantidades de DNA [1,10]. A circunstância de se ter usado a totalidade da zaragatoa poderá também não ter sido adequada ao protocolo utilizado em que, geralmente, apenas é usada metade. O método misto (E2) pretendia contornar a eventual presença inibidores com a concomitante perda de DNA devido aos vários passos de purificação, mas com a obtenção de DNA com elevada qualidade. Todavia, a perda de DNA na primeira parte do processo levou a que as quantidades obtidas fossem inferiores aos limites estabelecidos para que os procedimentos de quantificação e fenotipagem fossem fiáveis [1,7,17]. Assim, os métodos de extração com

Chelex 5% e através de Robot mostraram-se mais adequados à obtenção de DNA em quantidade suficiente para os processos seguintes, a partir de manchas de sangue semelhantes, tal como já havia sido mostrado em estudos anteriores [11,13]. É de evidenciar que o Chelex requer menos meios técnicos do que o método automatizado o que implica um menor custo por amostra e permite o uso de uma zaragatoa completa. Em face do exposto, torna-se evidente que a etapa de extração é decisiva e deve garantir uma quantidade mínima de DNA para que seja possível a obtenção de resultados adequados tal como o descrito previamente para outros tipos de amostras [6]. A escolha de um dos métodos com maior eficácia ou a opção por uma metodologia alternativa pode diminuir as probabilidades de insucesso [4].

A fenotipagem permitiu obter um perfil genético com mais de 8 STR identificados nas amostras com quantidade suficiente (> 0,1 ng/µl de DNA extraído). A quantidade de DNA foi o único fator limitante identificado na obtenção de um perfil genético útil, descartando-se a hipótese de degradação do DNA. O uso de um limite mínimo de 80 RFU, ao contrário dos 50 utilizados em estudos semelhantes [4], pode ter levado à ligeira diferença de resultados verificada entre as amostras extraídas por E3 e E4.

Assim, apesar de não se ter detetado o efeito do aço inoxidável quer nas amostras de sangue quer no procedimento, evidenciou-se que o método de extração é um passo determinante no sucesso da caracterização. O recurso à técnica de extração por Chelex ou pelo método automatizado pode garantir sucesso na fenotipagem de amostras de sangue a partir de facas, mesmo quando o tempo de deposição do sangue for superior a 10 semanas, admitindo-se que, se este período for aumentado, o sucesso dos resultados destes métodos seja superior ao dos restantes. É de considerar, no entanto, a preferência pelo método do Chelex por se tratar de um processo muito pouco oneroso[1]. A quantificação é sempre recomendada neste tipo de casos pois permite avaliar a presença de inibidores (incluindo outros que não os iões metálicos do aço) e normalizar as quantidades de DNA a utilizar na PCR de modo a conseguir obter um perfil com mais de 8 STR [1,9]. Também se poderá inferir que, face à sensibilidade dos métodos de fenotipagem utilizados, será preciso verificar outras condições não avaliadas neste estudo que possam interferir no processamento da amostra, tais como condições de conservação da faca onde se encontra o sangue. Para além disso, seria importante efetuar experiências análogas às efetuadas neste estudo em amostras de casos forenses.

Agradecimentos

Devo agradecimentos a todo o staff do Serviço de Genética e Biologia Forense da Delegação Norte do INMLCF, IP pelo apoio técnico e orientação para a execução deste trabalho, com especial consideração à paciência das orientadoras. Fico grato de forma especial à instituição por ter permitido a concretização deste trabalho sem financiamento externo. Agradeço ainda ao colega Carlos Matos pelas considerações tecidas sobre o trabalho e à amiga Nicola Viebig por se ter

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disponibilizado para a revisão da versão inglesa deste artigo.

Conflito de interesses

Nenhum a declarar.

Padrões Éticos

A utilização de amostras de um dador voluntário foi autorizada mediante Consentimento informado para participação em investigação de acordo com a Declaração de Helsínquia e a Convenção de Oviedo. A execução do trabalho e o uso de amostras anonimizadas foi devidamente autorizada pela Comissão de Ética do INMLCF, IP.

Material Suplementar

Os protocolos detalhados estão disponíveis para consulta.

Referências Bibliográficas

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