Virologia, Epidemiologia e

Diagnóstico Laboratorial

UFF

28 de Abril de 2011

Flávia Barreto dos Santos, PhDLaboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ

flaviab@ioc.fiocruz.br

Família Flaviviridae

Gênero Flavivirus

Causa DC e FHD

É um arbovirus

Transmitidos por mosquitos

Possui 4 sorotipos distintos (DENV-1, 2, 3, 4)

Organização da Partícula e Genoma Virais

RNA fita simples (+)

prM

Bicamada

Lipídica

M

E

Nucleocapsídeo

3 ptns estruturais 7 ptns não- estruturais

30-50nm

Cada sorotipo confere imunidade sorotipo específica

permanente e contra outros sorotipos por curto período

Todos os sorotipos podem causar doença grave e fatal

Variação genética dentro dos sorotipos (Genótipos)

Algumas variantes genéticas (Genótipos) parecem ser

mais virulentas e possuir maior potencial epidêmico

Vírus DengueAlguns fatos...

Mosquitos do gênero Aedes.

Nas Américas, a espécie Aedes aegypti é a responsável

pela transmissão do dengue.

Aedes albopictus, um importante vetor na Ásia.

Aedes aegypti Aedes albopictus

Vetores Hospedeiros

O vírus Dengue é transmitido por fêmeas do

mosquito infectado

Principalmente se alimenta durante o dia

Possui hábitos domésticos

Coloca os ovos e gera larvas

preferencialmente em recipientes artificiais.

Aedes aegypti

ADSORÇÃOVírus – Célula

hospedeira

via

receptor

celular

CITOPLASMA

MONTAGEMdo nucleocapsídeo

Diminuição do pH

Fusão da membrana

do vírus

Ptn E sofre mudança

conformacional

Nucleocapsídeo é

liberado no

citoplasma

DESNUDAMENTO

ssRNA(+)

genômico

ssRNA(+)

TRADUÇÃO

Mediada pelo CAP

CITOPLASMA

poliproteína

ProteínasNão-estruturais

Proteínas

Estruturais

Proteases virais e celulares

Helicase + RNA polimerase RNA-dependente & Cofatores

Progênies de

ssRNA (+)Síntese de molde

de ssRNA (-)ENDOCITOSE

MORFOGÊNESEVIRALOcorre noRER LIBERAÇÃO

Via secretora do Complexo de Golgi

Replicação dos Vírus Dengue(monócitos, macrófagos, linfócitos B, células endoteliais e dendríticas

Barth OM, 2000

Replicação dos Vírus Dengue

ADSORÇÃOVírus – Célula hospedeira via

receptor

celular

Monócitos,

Macrófagos

Linfócitos B

Células Endoteliais

Células Dendríticas

Citoplasma

63.000X

Barth OM, 2000

Replicação dos

Vírus DengueENDOCITOSE

pH ÁCIDO

Rearranjo de dímeros trímeros

LIBERAÇÃO DO

NUCLEOCAPSÍDEO

Barth OM, 2000

40.000X

MORFOGÊNESE VIRAL

Montagem da particula

viral associada ao

retículo endoplasmático

rugoso

ÚCLEO

ITOCÔNDRIA

ETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

RUGOSO

Replicação dos Vírus Dengue

48000X

Barth OM, 2000

LIBERAÇÃOVia secretora do Complexo de Golgi

Replicação dos Vírus Dengue

Rico-Hesse (1990) definiu esses “genótipos” como grupos de vírus que apresentam

uma divergência em sua sequência nucleotídica menor que 6% dentro de uma

determinada região do genoma viral (junção E/NS1).

V Filipinas (1956), Japão (1973), China (1980) América do Sul (2002-2004)

Weaver & Vasilakis (2009)

Infecção por Dengue

Assintomática Sintomática

Febre indiferenciada

Dengue Clássico

Com manifestações hemorrágicas

Sem manifestações hemorrágicas

Febre do Dengue

Hemorrágico

Sem choqueCom Choque

(SCD)

Grau

I

•Febre acompanhada de sintomas inespecíficos. A única manifestação hemorrágica é o

teste de torniquete positivo.

Grau II

• Sangramento espontâneo, além das manifestações apresentadas no Grau I. Geralmente sangramentos na pele

e outras formas de sangramento.

Grau III

• Insuficiência circulatória manifestada por pulso rápido e fraco, redução da

pressão do pulso ( 20mmHg) ou hipotensão, com a pele pegajosa e

fria, inquietação

Grau IV

• Choque profundo com pressão arterial e pulso não detectáveis.

Foi em grande parte baseada em estudos em crianças na Tailândia na

década de 60

Insatisfação devido a dificuldade de uso em diversas situações

Ex.:casos de choque sem plaquetopenia

Pacientes que evoluem a óbito sem apresentarem os critérios

estabelecidos

É insuficiente para contemplar os casos graves

Ex.: casos que apresentam comprometimento hepático e

manifestações neurológicas.

Necessidade de Revisão da

Classificação da OMS

Classificação dos casos de dengue de acordo com observações do DENCO (OMS, 2009)

Nív

eis

de a

nti

co

rpo

se a

ntí

gen

o

IgM

IgM

IgG

Infecção Primária(início dos sintomas)

Infecção Secundária(início dos sintomas)

Vírus Vírus

NS1NS1

Tempo

RESPOSTA IMUNE NAS INFECÇÕES POR DENGUE

1 2 3 4 5 6 7 8 9 >10

Diagnóstico Laboratorial do DengueIsolamento Viral

• Cultura de células de mosquito A. albopictus clone C6/36

Detecção de ácido nucléico viral

• RT-PCR, PCR em tempo real

Sorologia

• Mac-ELISA,IgG-ELISA,Captura de antígeno NS1, Kits comerciais, PRNT

Histopatologia e Imunohistoquímica

Kits comerciais para o diagnóstico do dengue

Coleta e Processamento de Amostras para

o Diagnóstico Laboratorial do Dengue

Tipo de

Espécime

Momento da

Coleta

Tipo de

Análise

Soro de fase

aguda

De 0-5 dias após o

início dos sintomas

Isolamento viral,

métodos sorológicos,

moleculares e captura

de NS1

Soro de fase

convalescente

Entre os dias 6-21 após o

início dos sintomas

Métodos

sorológicos

Cultura de células de mosquito A.

albopictus clone C6/36Imunofluorescência IndiretaAnticorpos Monoclonais tipo-específicos (Gubler et al., 1984)

Isolamento Viral (Igarashi, 1978)

MAC-ELISA (PanBio)Captura de anticorpos IgM

Placa

Substrato

Título

IgG> 40,960

< 40,960

> 10 dias

> 10,240

< 10,240

6 – 9 dias

Secundária

Primária

Resposta

Imune

> 160

< 160

< 5 dias

Dias após o início dos sintomas

Placa

Fluidohiperimune

Antígeno Dengue

Soro paciente

IgG

AnticorpoSecundário

Anti-IgG

Substrato

IgG-ELISADetecção de anticorpos IgG

Segunda etapa de amplificação – Nested PCR

Amplicon DENV-1 (482 bp)

D1

5’ 3’

TS1TS4TS3TS2

511 pb

produto

Amplicon DENV-4 (392 bp)

Amplicon DENV-3 (290 bp)

Amplicon DENV-2 (119 bp)

Transcrição reversa e primeira etapa de

amplificação

cDNA

produto 511 pb

5’

CAPSIDEO prM

5’3’D2

DENVRNA

1 hora/ 42ºC

3’ 5’

5’ 3’

D1

5’

3’

3’

5’

35 ciclos30sec/ 94ºC1 min / 55ºC2 min / 72ºC

3’

RT- PCR para a Tipagem dos vírus Dengue (Lanciotti et al, 1992)

7

43 2 1 1

17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Fígado Pulmão Cérebro Rim Baço Líquor Soro

DETECÇÃO DE DENV-3 POR RT-PCR E/OU ISOLAMENTO VIRAL

INVESTIGAÇÃO DE ÓBITOS, RIO DE JANEIRO, 2002

Detecta sequências específicas de produto de PCR conforme estas se

acumulam em tempo real durante o processo de amplificação por PCR.

RNA

PCR em Tempo Real (real time PCR)

0/11

2/11

3/11

6/11

Investigação de Casos Fatais por Dengue

Rio de Janeiro, 2002PCR em Tempo Real em 11 espécimes de cérebros de casos fatais

Isolamento Viral Imunohistoquímica RT-PCR PCR em Tempo Real

Soro Paciente (Ag NS1)

Anti-NS1 mAb

Anti-NS1 mAbHRP

Substrato (TMB)

Unidade

BioRad

RESULTADO INTERPRETAÇÃO

< 0,5 negativoNão há evidencia do

antígeno NS1 do

dengue.

0,5 ≤ a <1,0 inconclusivo

Amostra considerada

dúbia quanto a

presença do antígeno

NS1 dengue.

≥ 1.0 positivoPresença do antígeno

NS1 do dengue.

Solução de Parada

Platelia NS1

(Biorad Laboratories)

Resultado Positivo

Resultado Negativo

Prova Inválida

NS1 Ag STRIP

(Biorad Laboratories)

Sensibilidade dos testes de captura de NS1 de acordo com

o número de dias de sintomas (n=220)

Sensibilidade total dos testes de captura de NS1 em

relação ao diagnóstico por MAC-ELISA, isolamento viral e

RT-PCR, de acordo com o número de dias de sintomas

SD BIOLINE DENGUE DUO TEST

Teste de uma etapa para detecção de NS1 e IgG/IgM em soro ouplasma2cassetes: Dengue NS1 Ag test e Dengue IgG/IgM test

Novembro de 2008 :pactuadas 68

Unidades Sentinela para

monitoramento viral, utilizando o

teste NS1 como triagem

Total: 25 municípios em16 Estados

PE

RR

RO

AC

AP

CE

PB

SEBA

GO

MS

PR

SP

MGES

RJ

Epidemiologia do

Dengue

Novas estimativas:

~70-500 milhões de pessoas contraem a doença

Cerca de 3,6 bilhões de pessoas (55% da população mundial)

vivem em risco de contrair a doença

124 países endêmicos

Distribuição global dos

sorotipos de vírus dengue,

1970

Distribuição global dos sorotipos de

vírus dengue, 2004

Mackenzie et al., 2004

Mudança na distribuição dos sorotipos

de dengue nos últimos 30 anos

http://www.paho.org/English/AD/DPC/CD/dengue.htm

BRASIL

(560,000)~90%

630,0002007

BRASIL

(734.384)

865.6972008

~85%

BRASIL

(332.083)

480.9092009*

~69%

1.015.420BRASIL

(780,644)~80%

2002

741,865BRASIL

(535,388)~73%

1998

Casos de Dengue Clássico nas Américas,

1980–2009*

2000 - DENV-3

Rio de Janeiro

1986 - DENV-1

1990 - DENV-2

Roraima

1982 - DENV-1

DENV-4

2010-DENV-4

São Paulo

1998- DENV-3

Caso Importado

Belém

1989- DENV-2

Caso Importado

Casos notificados e Hospitalizações*

por Dengue no Brasil, 1986-2007

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07

Caso

s n

oti

ficad

os

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Ho

sp

itali

zaçõ

es

Casos notificados Hospitalizações

DENV2DENV1

DENV3

Without positive

Without virus circulation

DEN 1

DEN 2

DEN 3

DEN 1, DEN 2

DEN 2, DEN 3

DEN 1, DEN 2, DEN 3

Without positive

Without virus circulation

DEN 2

DEN 3

DEN 1, DEN 2

DEN 2, DEN 3

DEN 1, DEN 2, DEN 3

Source: CGLAB/SVS/MS

Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos

circulantes no Brasil, 2009

Casos de DC: 529.237

FHD: 2.271 e 154 óbitos

DCC: 5.952 e 144 óbitos

Fonte: SVS-MS

Nordeste: 170.674

Sudeste: 152.119

Centro-Oeste: 125.722

Norte: 70.399

Sul: 10.323

Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos

circulantes no Brasil, 2010*

Casos NOTIFICADOS de DC:

942.153

Casos CONFIRMADOS:

482.284

FHD: 2.271

Óbitos : 367

Até a 26º SE (03/07/2010)

Fonte: SVS-MS

Predomínio DENV-1

Isolamento DENV-4

Isolamento

DENV-4

ISOLAMENTO DO DENGUE TIPO 4 NO BRASIL

2010

três casos confirmados de DENV 4 no município de Boa Vista, classificados clinicamente como dengue clássica. Houve evolução para cura sem necessidade de internação de nenhum dos casos.

data de inicio dos sintomas do primeiro caso:26.06.2010

Casos de Dengue, FDH, Óbitos e sorotipos

circulantes no Brasil, 2011*

Casos NOTIFICADOS de DC: 254.734

Casos graves:2.208 confirmados

Óbitos : 95 confirmados

Até março de 2011

Fonte: SVS-MS

Região Sudeste - 81.179; 32%

Região Norte – 76.671; 30%,

Região Nordeste - 47.404; 19%

Região Sul - 28.445; 11%

Região Centro-Oeste 21.035; 8%

Predomínio DENV-1

Dispersão DENV-4(RR,AM,PA,PI,BA,RJ,SP,PE)

7732

957

1188

446378

532580

448

79

1627

615

363

6390 12

76

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2007 2008 2009 2010 2011

DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4

Sorotipos de DENV isolados no Brasil, 2007-2011

Introdução do DENV-4

Incidência de dengue no Brasil, 2010-2011

•Até março 2011

•Fonte:SVS/MS

Dengue no Brasil por Regiões, 1982–2011*

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

Norte Nordeste Sudeste Sul Centro-Oeste

Vigilância Epidemiológica

do Dengue

no Rio de Janeiro

DENV-1 DENV-2 DENV-3

1986 1990 2000

Introdução do Vírus Dengue no Estado

do Rio de Janeiro

Região

Metropolitana

Fatores responsáveis pela

ocorrência de epidemias de

dengue no Rio?

Crescimento sem precedentes

da população

Urbanização não planejada e

não controlada

Abastecimento de água e

tratamento de resíduos

inadequados

Ausência no controle efetivo do

mosquito

Aumento na disseminação do

vírus

EPIDEMIA DE DENGUE

NO RIO DE JANEIRO

2008

Re-emergência do DENV-2

0

10

20

30

40

50

60

70

J M M J S N J M M J S N J M M J S N J M M J S N

0

20

40

60

80

100

120

140

160

J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D

DENV-1 DENV-2 DENV-3

2001 2002 2003

0

1

2

3

4

5

6

7

8

J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D

2004 2005

2006 2007 2009

Sorotipos de Dengue circulantes no Rio de Janeiro, 2001-2009

Re-emergência do Dengue tipo 2

DENV-2

2008

Impacto da re-emergência do DENV-2Casos Notificados de Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2007-2008*

SES/SVS

2007 2008

Impacto da re-emergência do DENV-2Internações por Dengue por mês no Estado do Rio de

Janeiro, 2007-2008*

2007 2008

Percentual de Internações por Dengue de

acordo com faixa etária, 2001-2008

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Ano

< 15 ANOS >=15 ANOS

Perc

en

tual d

e I

nte

rnaçõ

es (

%)

Fonte: SESDEC-RJ/SAS/SVS/CVE/DDT/GDTVZ * Dados sujeitos à revisão

Dengue no Rio de Janeiro:2002-2008

Casos notificados, FHD, Internações e óbitos,

Ano Notificados FHD Internações Óbitos

2002 285702 1689 2397 91

2003 9460 48 540 3

2004 2936 5 533 0

2005 3140 17 326 5

2006 30567 77 1431 17

2007 67275 21 452 46

2008 250026 1632 13808 181

Experiência do Laboratório de

Flavivirus, IOC - FIOCRUZ

EPIDEMIA DE DENGUE

NO RIO DE JANEIRO

2007-2008

Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2008Laboratório de Flavivírus IOC/FIOCRUZ

Casos confirmados/ estudados: 310 / 754 (41 %)

Sorotipos identificados: DENV-2: 138 DENV-3: 68

ÓBITOS

Óbitos confirmados / estudados: 73/146 (50%)

Virus identificados: DENV-2 : 46 (92 %)DENV-3: 4

0

10

20

30

40

50

DENV-2 DENV-30

10

20

30

40

50

Primária Secundária

EPIDEMIA DE DENGUE

NO RIO DE JANEIRO

2009-2011Re-emergência do DENV-1

Introdução do DENV-4

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2007 2008 2009 2010

DENV-1 DENV-2 DENV-3

Sorotipos de DENV isolados no Brasil, 2007-2010

Emergência do DENV-1

Vigilância Epidemiológica de Dengue,2011Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ

DENV-1

DENV-2

DENV-3

DENV-4 ?

RT- PCR (Tipagem de DENV)

DENV-1

482pb

DENV-2

119pb

DENV-3

290pb

DENV-4

392pb

Repetição da extração do RNA do material original

Amplificação com primers tipo-específicos separados

Sequenciamento do genoma

Isolamento viral em cultura de células

Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*Até a 16ª semana epidemiológica de 2011 (23 de abril): 63.996 casos notificados

+500% em relação 2010

41 municípios (44,6%) : alta incidência

25 municípios (33,5%) : média incidência

5654

17312

28312

12719

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Jan Fev Mar Abr

Fonte: Lacen-RJ e FIOCRUZ/GDTVZ/SESDEC-RJ, dados atualizados em 20 ABR 2011 e sujeitos à revisão.

Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*

Sorotipos circulantes

Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*

Distribuição dos Óbitos e Casos Graves Confirmados

Casos Notificados no Estado do Rio de Janeiro,

2009-2011*

3330 2506 214212471445 2052

331253485654

17312

28312

12719

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Jan Fev Mar Abr

2009 2010 2011

Fonte: SINANNET/GDTVZ/SESDEC-RJ, dados atualizados em 27 ABR 2011 e sujeitos à revisão.

Dengue no Estado do Rio de Janeiro, 2011*

Laboratório de Flavivirus, IOC/FIOCRUZ

Total confirmados/ Total recebidos: 207/677 (30.6%)

Isolamento viral e/ou PCR: 80 DENV-1

20 DENV-2

6 DENV-4*

*2 casos (+) de Niterói em 27/04/2011 por PCR

Óbitos: 20/41 (48.8%) – 10 DENV-1 e 2 DENV-2

Não há uma tratamento específico

Indica-se repouso e hidratação

Vacina contra a dengue?

Não há uma vacina licenciada no momento.

Maior Desafio:

Necessidade do desenvolvimento de 4 vacinas que sejam

combinadas em uma única (tetravalente)

Induza um nível de proteção permanente e contra infecção

por qualquer um dos 4 sorotipos.

Vacinas candidatas para dengue em desenvolvimento

Tipo de Vacina Fabricantes

Viva atenuada WRAIR/GSK Biologicals*

Viva atenuada Mahidol Universidade/Sanofi Pasteur

Viva atenuada,quimérica NIAID, NIH

Viva atenuada,quimérica Acambis/Sanofi Pasteur*

Viva atenuada,quimérica CDC/ InViragen*

Vírus Inativado WRAIR

Subunidade Hawaii Biotech

DNA Navy Medical Research Center

Revisado em Whitehead et al., 2007

+ adiantada: Sanofi Pasteur

envolve o Núcleo de Doenças Infectocontagiosas da Universidade

Federal do Espírito Santo e 11 países tropicais.

Administração de 3 doses, com intervalo de 6 meses.

Meta: ter produto no mercado em 2015

Bio-Manguinhos (Fiocruz), RJ-em parceria com a GlaxoSmithKline

Instituto Butantan (SP) -com os Institutos Nacionais de Saúde dos

EUA (NIH)

Vacina contra a dengue?

Obrigada !