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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TERAPÊUTICA E DA CONCENTRAÇÃO SANGUÍNEA DE ANTIMALÁRICOS NA MALÁRIA POR Plasmodium vivax NO CONTEXTO DAS INTERAÇÕES FRONTEIRIÇAS DO BRASIL COM A GUIANA FRANCESA. MARGARETE DO SOCORRO MENDONÇA GOMES BELÉM - PARÁ 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TERAPÊUTICA E DA CONCENTRAÇÃO
SANGUÍNEA DE ANTIMALÁRICOS NA MALÁRIA POR Plasmodium
vivax NO CONTEXTO DAS INTERAÇÕES FRONTEIRIÇAS DO
BRASIL COM A GUIANA FRANCESA.
MARGARETE DO SOCORRO MENDONÇA GOMES
BELÉM - PARÁ
2014
MARGARETE DO SOCORRO MENDONÇA GOMES
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TERAPÊUTICA E DA CONCENTRAÇÃO
SANGUÍNEA DE ANTIMALÁRICOS NA MALÁRIA POR Plasmodium
vivax NO CONTEXTO DAS INTERAÇÕES FRONTEIRIÇAS DO
BRASIL COM A GUIANA FRANCESA
Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação
em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutora em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Álvaro A. R. D’Almeida Couto.
Belém - Pará
2014
1
MARGARETE DO SOCORRO MENDONÇA GOMES
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TERAPÊUTICA E DA CONCENTRAÇÃO
SANGUÍNEA DE ANTIMALÁRICOS NA MALÁRIA POR Plasmodium vivax NO
CONTEXTO DAS INTERAÇÕES FRONTEIRIÇAS DO BRASIL COM A GUIANA
FRANCESA.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutora em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
__________________________________________
Orientador: Prof. Dr. Álvaro Augusto Ribeiro D’Almeida Couto
Universidade Federal do Pará, ICB-UFPA
Banca examinadora: __________________________________________
Prof.ª Dra. Maria Fâni Dolabela
Faculdade de Farmácia, UFPA
__________________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Revorêdo da Silva Ventura
Instituto Evandro Chagas IEC/SVS/MS
__________________________________________
Prof. Dr. Pedro Vitor Lemos Cravo
Universidade Federal de Goiás/IPTSP
__________________________________________
Profa. Dra. Maristela Gomes da Cunha
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
__________________________________________
Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado (Suplente)
Departamento de Patologia, UFPA
Belém, 21de fevereiro de 2014.
2
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Joaquim de Oliveira Gomes e Maria
José Mendonça Gomes, que desde sempre me
conduziram ao caminho do saber.
À minha família, em especial ao Adjalma Lamarão
meu companheiro de vida, por sua compreensão nos
momentos de minha ausência, pelo constante apoio,
carinho, atenção e estímulo ao meu desenvolvimento
pessoal e profissional, as minhas queridas e amadas
filhas Ariane e Ariadne, e enteada Patrícia.
3
“Conquistar-se é subir uma montanha íngreme cuja base é pedregosa, e
usufruir da paisagem repousante no cume da sua vitória”.
Luiz Antônio Gasparetto.
4
AGRADECIMENTOS
Este trabalho de pesquisa foi fruto da labuta coletiva de muitas pessoas, e da
participação de várias instituições. Sou agradecida a todas que contribuíram para a
realização deste trabalho. Corro o risco de deixar de citar algumas, mas desde já, gostaria
de registrar meus agradecimentos a essas pessoas que, direta ou indiretamente,
cooperaram para a produção desta pequena contribuição ao estudo da malária.
A Deus, que me deu equilíbrio para superar os muitos momentos difíceis, e força
para seguir adiante e manter a perseverança. “... É a fé que dá ao homem o ímpeto
indispensável para agir e o entendimento para perseverar” (Roger Gard).
Ao Professor Álvaro Augusto Ribeiro D’Almeida Couto, meu orientador, por ter me
oportunizado este trabalho, por tê-lo confiado a mim, por sua amizade e apoio, pela
dedicada orientação e sabedoria na abordagem dos problemas científicos.
Ao Professor José Luiz Fernandes Vieira, meu coorientador, por sua amizade, por ter
me disponibilizado o Laboratório de Toxicologia/UFPA, para dosagem sérica do teor dos
antimaláricos, juntamente com as suas bolsistas de iniciação científica do Curso de
Farmácia: Marcela Natalia Rocha de Castro, Hellen Caroline Oliveira Santos, Heliana
Barreto Huet de Bacelar, Ana Tereza Alves de Carvalho Chaves, as quais eu agradeço.
Bem como, por sua prestimosa atenção durante a fase de execução das análises
laboratoriais, pela criteriosa orientação e por ter compartilhado seus conhecimentos técnicos
e científicos relacionados com o presente estudo, o meu especial agradecimento.
Ao Professor Ricardo Luís Dantas Machado, meu coorientador, por sua amizade
incondicional, por ter me hospedado junto com sua esposa Vera e filho Gabriel, os quais se
tornaram meus amigos; por ter me recebido no laboratório do Centro de Investigação de
Microrganismos/FAMERP-SP, para as análises de biologia molecular, por sua prestimosa
atenção durante a fase de execução das análises laboratoriais, pela dedicada orientação,
com o presente estudo, por tudo, agradeço de coração. Com também, as farmacêuticas
Valéria Fraga e Luciana Moran que deram suporte técnico durante as analises das variantes
do genótipo da CS do P. vivax e ao doutorando Gustavo Capatti Cassiano que deu
inestimável contribuição na análise estatística dos resultados, os meus agradecimentos.
Ao meu esposo e companheiro Adjalma Nobre Lamarão, e as minhas queridas e
amadas filhas Ariane Gomes Lamarão e Ariadne Gomes Lamarão, pela compreensão e
tolerância do tempo que deixei de me dedicar ao convívio com eles.
Aos meus pais Joaquim de Oliveira Gomes e Maria José de Oliveira Gomes, que,
apesar da idade avançada, compreenderam as minhas ausências justificada.
As amigas, Nelma Mesquita de Freitas, pelo apoio e atenção dedicada a mim e as
minhas filhas, e a Valdirene Barbosa dos Santos, por todo suporte emocional nos momentos
difíceis em que tive que conciliar minhas atividades profissionais e a realização da pesquisa.
5
À Diretora do Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá (LACEN-AP), Dra.
Ivanete Costa Amanajás, pela liberação remunerada das minhas atividades laborais,
durante a fase final de redação da tese. Ao Ex-Diretor LACEN-AP, Dr. Fernando Antônio de
Medeiros, por autorizar minhas atividades laborais e de pesquisa no Laboratório de
Fronteira (LAFRON) em Oiapoque, durante a fase de acompanhamentos clínico-laboratorial
dos pacientes inseridos na pesquisa. Assim como, à Dra. Milagros Maria Soto Zuniga Sobral
pelas análises no LACEN-AP da avaliação do controle de qualidade dos antimaláricos.
À Coordenadora do Curso de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários-UFPA, Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos, e em especial ao Prof. Dr.
Ricardo Ishak. Aos professores do Curso pelos conhecimentos repassados.
Às pessoas que me ofereceram moradia e me acolheram em Oiapoque, em Belém e
em São José do Rio Preto-SP, nas muitas vezes em que precisei me ausentar de minha
cidade para desenvolver as atividades da tese: Daniele Monteiro Nunes, Danielle Scerne
Fadul, Sandra Paes, Michelli Erica Souza Ferreira, Pedro Henrique Lamarão e Vera Lúcia
da Rocha Fernandes Machado, sou grata a todos.
Aos técnicos da Gerente de Endemias do Município de Oiapoque: Jair Moraes
Rodrigues, Joessy de Cássia Folgado Aguiar, Rubnilson dos Santos, por terem me
acompanhado na coleta de sangue e seguimento dos pacientes, diariamente, aos sábados,
domingos e feriados, os meus profundos agradecimentos. Assim como, aos microscopistas;
Marlinda Barbosa, Wellisson Cunha, Vanderson Pereira Pinto; aos revisores da microscopia,
por certificarem o diagnóstico da gota espessa e a parasitemia, Carlos Sampaio e Ederson
Tavares Nascimento; aos notificantes: Leudilene Marques, Leilane Carneiro, Janderlei
Monteiro, Luciaeni Barbosa, Francisca Sales, Ronilson dos Santos, Rosinaldo Forte; aos
agentes de endemias: Franciclea Oliveira, Rosiel dos Santos, Lex-Idelvan Teles, e em
particular a Raimundo Ademar dos Santos, por todas as vezes que me transportou durante
as madrugadas, ao chegar à rodoviária de Oiapoque, a todos sou sinceramente grata.
Ao farmacêutico Manoel do Carmo Barbosa da Cruz Gerente de Endemias do
Município de Oiapoque, por total apoio a esta pesquisa, pela amizade, por me acolher em
sua casa, pela ajuda e compreensão nos momentos mais difíceis do dia-a-dia.
Aos profissionais da Unidade Mista de Saúde de Oiapoque, aos enfermeiros: Beatriz
Fantin, Jax Sidnei, Walcíria Nóbrega (Diretora em 2011); ao farmacêutico Cesar Paulo Reis
Filho, e aos técnicos de laboratório Sergio Quintino e Raimundo dos Santos e ao médico Dr.
Luís Alexandre da Silva, os quais deram grande contribuição à pesquisa.
Ao biomédico do LAFRON Valmir Corrêa e Corrêa, e o técnico Benedito Rodrigues,
que realizaram as análises hematológicas, processaram e armazenaram todas as amostras
sanguíneas, isto, muitas e muitas vezes, em horários fora do expediente laboral.
Aos pacientes de malária, que foram de fundamental importância para a realização
desse trabalho, os meus sinceros agradecimentos.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS............................................................................................ 8
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... 9
RESUMO............................................................................................................. 11
ABSTRACT......................................................................................................... 12
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 13
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS............................................................................... 13
1.1.1 Plasmódios humanos........................................................................................ 13
1.1.2 Vetores da Malária............................................................................................. 14
1.2 CICLO BIOLÓGICO DO Plasmodium vivax......................................................... 14
1.2.1 Sítio de Ação dos Antimaláricos no Ciclo Biológico do P. vivax.................. 15
1.3 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA.......................................................................... 15
1.3.1 Malária e a Fronteira do Brasil com a Guiana Francesa................................ 18
1.4 MALÁRIA POR Plasmodium vivax....................................................................... 20
1.5 ASPECTOS TERAPÊUTICOS DA MALÁRIA VIVAX.......................................... 21
1.5.1 Esquema Terapêutico para o P. vivax.............................................................. 22
1.5.2 Cloroquina no Tratamento da Malária Vivax................................................... 24
1.5.3 Primaquina no Tratamento da Malária Vivax................................................... 25
1.5.4 Classificação da Resposta ao Tratamento da Malária Vivax......................... 26
1.5.5 Resistência do Plasmodium vivax aos Antimaláricos................................... 28
1.5.6 Determinantes da Falha Terapêutica na Malária Vivax.................................. 31
1.6. PROTEINA CIRCUNSPOROZOÍTA E OS GENÓTIPOS DA CS DO P. vivax.... 35
1.6.1 Genótipos da CS do P. vivax........................................................................... 37
1.7 JUSTIFICATIVA................................................................................................... 39
1.8 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 40
1.8.1 Objetivos Específicos........................................................................................ 40
2 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 41
2.1 ÁREA DE ESTUDOS........................................................................................... 41
2.2 CASUÍSTICA........................................................................................................ 42
2.2.1 Abordagem epidemiológica.............................................................................. 42
2.2.2 Análise Retrospectiva dos Casos de P. vivax e da Precipitação.................. 42
2.2.3 Estudo longitudinal............................................................................................ 42
2.3 TRATAMENTO DA MALÁRIA.............................................................................. 43
2.3.1 Avaliação Clínica................................................................................................ 43
2.3.2 Esquema de Tratamento................................................................................... 43
2.3.3 Ajuste da Dose e Tempo de Administração da Primaquina.......................... 44
2.3.4 Avaliação de Adesão ao Tratamento............................................................... 45
2.3.5 Classificação da Resposta Parasitológica e Terapêutica.............................. 45
2.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS............................................................... 45
2.4.1 Amostras Sanguíneas para as Análises Laboratoriais.................................. 45
7
2.4.2 Avaliação da Qualidade Físico-química dos Antimaláricos.......................... 46
2.4.3 Diagnóstico e Tempo de Clareamento da Parasitemia.................................. 46
2.4.4 Teor Sanguíneo de Difosfato de Cloroquina e Primaquina........................... 47
2.4.5 Diagnóstico Molecular do Genótipo da CS do P. vivax.................................. 49
2.4.5.1 Reação em Cadeia da Polimerase...................................................................... 49
2.4.5.2 Digestão dos Produtos da PCR........................................................................... 50
2.5 Tamanho amostral............................................................................................. 50
2.6 Análises estatísticas.......................................................................................... 50
2.7 Considerações Éticas........................................................................................ 51
3 RESULTADOS.................................................................................................... 52
3.1. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA VIVAX NA FRONTEIRA DO
BRASIL COM A GUIANA FRANCESA................................................................ 52
3.1.1 Gênero e Faixa Etária........................................................................................ 52
3.1.2 Ocupação............................................................................................................ 53
3.1.3 Escolaridade....................................................................................................... 53
3.1.4 Local de Origem dos Pacientes........................................................................ 54
3.1.5 Local Provável de Infecção na Fronteira Franco-brasileira........................... 54
3.1.6 Variação Pluviométrica e a Incidência de Malária por P. vivax..................... 55
3.2 RESPOSTA PARASITOLÓGICA E TERAPUTICA PARA MALÁRIA VIVAX E
O CONTROLE DOS DETERMINANTES DA FALHA TERAPÊUTICA................ 56
3.2.1 Determinação da Densidade Parasitária dos Pacientes................................ 56
3.2.2 Sinais e Sintomas.............................................................................................. 57
3.2.3 Tempo de Clareamento da Parasitemia dos Pacientes com P. vivax........... 57
3.2.4 Números de Episódios Prévios de Malária...................................................... 58
3.2.5 Classificação da Resposta e Adesão ao Tratamento..................................... 58
3.2.6 Ajuste Peso/Dose/Tempo de Administração da Primaquina......................... 59
3.2.7 Qualidade Físico-química dos Antimaláricos................................................. 60
3.2.8 Dosagem Sanguínea do teor dos Antimaláricos............................................ 61
3.3 GENÓTIPOS DA CS DO P. vivax NA FRONTEIRA FRANCO-BRASILEIRA..... 62
4. DISCUSSÃO........................................................................................................ 65
4.1 Abordagem Epidemiológica da malária na Fronteira Franco-Brasileira...... 65
4.2 A Eficácia da Terapêutica para Malária Vivax................................................. 68
4.3 As Variantes do Gene CS do P. vivax na Fronteira Franco-Brasileira.......... 71
5 CONCLUSÃO...................................................................................................... 74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 76
APÊNDICE.......................................................................................................... 98
ANEXOS............................................................................................................. 102
8
LISTA DE FIGURAS
Página Figura 1 - Compartimentos da atividade dos antimaláricos mostrados no
ciclo de vida do Plasmodium vivax...................................................... 16
Figura 2 - Localização do município de Oiapoque.......................................... 19
Figura 3 - Ajuste da dose e do tempo de administração da primaquina para
pacientes com peso igual ou superior a 70 kg.................................... 23
Figura 4 - Esquema curto para o tratamento das infecções pelo P. vivax..... 23
Figura 5 - Distribuição por gêneros e faixas etárias dos pacientes com
malária vivax em Oiapoque................................................................. 52
Figura 6 - Distribuição das atividades exercidas pelos pacientes com
malária em Oiapoque nos 15 dias prévios aos sintomas.................... 53
Figura 7 - Distribuição percentual do nível de escolaridade dos pacientes
com malária vivax em Oiapoque......................................................... 53
Figura 8 - Proporção de pacientes com malária vivax em Oiapoque por
local de origem.................................................................................... 54
Figura 9 - Casos de malária por P. vivax segundo local provável de
infecção, e importados dos garimpos clandestinos da Guiana
Francesa para Oiapoque..................................................................... 54
Figura 10 - Taxas intra-anual de incidência de malária versus chuvas
mensais acumuladas em Oiapoque no período (2006-2011)............. 55
Figura 11 - Tempo de clareamento da parasitemia em horas dos pacientes
com P. vivax em Oiapoque.................................................................. 57
Figura 12 - Distribuição dos pacientes quanto ao número de infecções
maláricas............................................................................................. 58
Figura 13 - Perfil parasitológico do paciente com fracasso tardio ao
tratamento da malária por P.vivax....................................................... 59
Figura 14 - frequência em percentual dos genótipos da CS do P. vivax nas
amostras sanguíneas em Oiapoque.................................................... 62
Figura 15 - Restrições e digestão por PCR-RFLP com a enzima AluI para
identificação dos fragmentos das variantes do P. vivax VK210,
VK247 e P.vivax-like ........................................................................... 63
9
LISTA DE ABREVIATURAS
BAIP Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
CEM Concentração efetiva mínima
CQ Cloroquina
CS Proteína circunsporozoíta
D0 Dia de inclusão - primeira avaliação clínico-parasitológica
D1 Segunda avaliação clínico-parasitológica
D14 Sexta avaliação clínico-parasitológica
D2 Terceira avaliação clínico-parasitológica
D21 Sétima avaliação clínico-parasitológica
D28 Oitava avaliação clínico-parasitológica
D3 Quarta avaliação clínico-parasitológica
D7 Quinta avaliação clínico-parasitológica
DCQ Desetilcloroquina
dL Decilitro
DNA ácido desoxirribonucleico
DP Desvio padrão
DR Dia de recorrência parasitária
FAMERP Faculdade de Medicina de Rio Preto
FPT Fracasso precoce do tratamento
FTT Fracasso tardio do tratamento
G6PD Glicose-6-fosfato-desidrogenase
IC Intervalo de Confiança
IPA Índice parasitário anual
kg Quilograma
LACEN/AP Laboratório Central de Saúde Pública Amapá
LAFRON Laboratório de Fronteira
LVC Lâmina de verificação de cura
M Mol
mg Miligrama
10
mL Mililitro
µL Microlitro
mm3 Milímetro cúbico
MS Ministério da Saúde
ND Não detectado
ng Nanograma
OMS Organização Mundial de Saúde
OPAS Organização Pan-Americana de Saúde
P. vivax Plasmodium vivax
PCR Reação em cadeia da polimerase
PNCM Programa Nacional de Controle de Malária
PPSUS Programa de Pesquisa para o SUS
RAVREDA Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas
Antimaláricas
RCA Resposta clínica adequada
RFLP Polimorfismo de fragmentos de restrição
RI Resistência Tipo I
RII Resistência Tipo II
RIII Resistência Tipo III
S Sensível
SIVEP_MALÁRIA Sistema de Informações de Vigilância Epidemiológica em Malária
SVS Secretaria de Vigilância em Saúde
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
TCP Tempo de clareamento da parasitemia
UFPA Universidade Federal do Pará
11
RESUMO A malária é um problema de saúde para as pessoas que vivem e viajam na fronteira entre Brasil e Guiana Francesa, ao longo do Rio Oiapoque, sobretudo devido à mineração ilegal de ouro na Guiana Francesa, com convergência para a cidade de Oiapoque, onde 85% dos casos são devidos ao Plasmodium vivax. No Brasil o tratamento para a malária pelo P. vivax usando cloroquina + primaquina ainda mantém a sua eficácia terapêutica, contudo, no Estado do Amapá, há casos de recidivas, sobretudo nos pacientes oriundos dessa região de fronteira, entretanto, vários fatores influenciam o sucesso ou insucesso terapêutico e foram considerados nesse estudo. As variantes da proteína circunsporozoíta do P. vivax, VK210, VK247 e P. vivax-like, também foram contextualizada nessa fronteira. Como objetivo, este trabalho avaliou o perfil dos pacientes infectados com P. vivax; descreveu as características locais da transmissão; avaliou a resposta parasitológica e terapêutica dos pacientes com malária vivax frente ao esquema padrão considerando os determinantes externos da falha terapêutica, e, descreveu a distribuição e as frequências genotípicas da CS do P. vivax no contexto da fronteira Franco-brasileira. Metodologia: esta pesquisa foi realizada em 2011, na cidade de Oiapoque, com o descritivo das características sócio demográficas de 103 indivíduos com malária por P.vivax, usando formulários estruturados. Ainda, foi efetuado o estudo de seguimento do tratamento destes indivíduos com cloroquina por 3 dias e primaquina de 7 a 10 dias conforme peso corpóreo, acompanhados em D0, D3, D7, D14, D21 e D28. Foi avaliado o controle de qualidade dos comprimidos, revisão do diagnóstico microscópico, ajuste da dose de primaquina em função do peso do paciente, a aderência ao tratamento, concentrações sanguíneas de cloroquina e primaquina e as respostas parasitológica e terapêutica. Assim como, o estudo dos genes da CS do P. vivax em 91 amostras sanguíneas desses pacientes, por extração de DNA, em seguida análise por PCR/RFLP de um fragmento desse gene. Resultados: os casos predominaram em homens adultos (63,4%), com baixa escolaridade, sobretudo na faixa etária de 20-29 anos, e a garimpagem ilegal foi a principal atividade ocupacional. Migrantes dos estados do Pará e Maranhão representam 55,4% dos pacientes e 31,7% dos casos de P. vivax foram importados da Guiana Francesa. Houve correlação negativa entre a precipitação mensal acumulada de chuva e a ocorrência de casos por P. vivax, com mais casos nos meses menos chuvosos (p = 0,0026). A resposta parasitológica e terapêutica foi adequada em 99,0% dos casos. Os comprimidos estavam dentro dos limites ideais de qualidade. Não foi observado discordância do diagnóstico; 95 pacientes foram acompanhados por 28 dias e aderiram ao tratamento, 32.6% receberam o ajuste de dose/peso para primaquina, todos os acompanhados alcançaram níveis sanguíneos ideais de antimaláricos. O genótipo VK210 foi o mais comum (62,6 %), seguido pelo P. vivax-like (2,2 %) e VK247 (1,1 %) em infecções simples. Foram detectados todos os três genótipos CS presentes em infecções mistas: VK210 + VK247 (26,37 %) e VK210 + P. vivax-like (7,69 %). Conclusão: As migrações relacionadas com a mineração ilegal de ouro foram identificadas como um importante propulsor da malária neste local. Em Oiapoque, desde que seja assegurada a boa qualidade dos antimaláricos, o diagnóstico preciso, o ajuste do peso/dose de primaquina e a adesão ao tratamento, o atual esquema terapêutico ao tratamento da malária por P. vivax permanece altamente eficaz. Os mesmos genótipos da CS do P. vivax VK210, VK247 e P. vivax-like circulantes nos garimpos da Guiana Francesa foram encontrados no município de Oiapoque, no Brasil. A malária vivax no contexto da fronteira Franco-Brasileira tem como principal característica a intensa mobilidade da população em fluxo contínuo nos dois sentidos, que contribui para a manutenção da doença.
Palavras chaves: Malária; Plasmodium vivax; Eficácia Terapêutica; Proteína Circunsporozoíta; Oiapoque; Fronteira Franco-Brasileira.
12
ABSTRACT
Malaria is a health problem for people who live and travel on the border between Brazil and French Guiana, along the Oiapoque River, mainly due to illegal mining of gold in French Guiana, with convergence for the city of Oiapoque, where 85% of cases are due to Plasmodium vivax. In Brazil the treatment for malaria by P. vivax using chloroquine + primaquine still retains its therapeutic efficacy, however, in the State of Amapá in Brazil, there are cases of relapses, especially in patients from this border region, but several factors influence the therapeutic success or failure and were considered in this study. Circumsporozoite protein (CS) variants of P. vivax, VK210, VK247 and P. vivax-like, also were contextualized in this border. As objective, this study evaluated the profile of patients infected with P. vivax; described local characteristics of transmission; evaluated the therapeutic and parasitological response of patients with vivax malaria using the standard scheme, considering external determinants of therapeutic failure, and described the distribution and genotype frequencies of CS of P. vivax in the context of Franco-Brazilian border. Methodology: this survey was conducted in 2011, in the city of Oiapoque, with the description of the sociodemographic characteristics of the 103 patients with P. vivax malaria, using structured forms. Also, was effected the study of follow up of treatment of these individuals with chloroquine for 3 days and 7 to 10 days with primaquine in body weight relation, accompanied in D0, D3, D7, D14, D21 and D28. The quality control of tablets, the revision of the microscopic diagnosis, the dose adjustment of primaquine, depending on the patient's weight, the adherence to treatment, blood concentrations of chloroquine and primaquine and therapeutic responses were rated. As well as the study of the genes of the CS of P. vivax in blood samples of those 91 patients, for DNA extraction, followed by PCR/RFLP analysis of a fragment of the gene. Results: the cases predominated in adult males (63.4%), with low educational level, especially between the ages of 20-29 years, and the illegal gold prospecting was the main occupational activity. Migrants from the States of Pará and Maranhão represent 55.4% of patients and 31.7% of the cases of P. vivax were imported from French Guiana. There was negative correlation between the accumulated monthly precipitation of rain and the occurrence of cases by P. vivax, with more cases in the months less rainy (p = 0.0026). The parasitological and therapeutic response was adequate in 99.0% of cases. The tablets were within optimal limits of quality. Wasn't observed disagreement of diagnosis; 95 patients were followed for 28 days and adhered to treatment. 32.6% received the dose adjustment/weight to primaquine; all accompanied patients achieved optimal blood levels antimalarials. The VK210 was the most common genotype (62.6%), followed by P. vivax-like (2.2%) and VK247 (1.1%) in single infections. All three CS genotypes were detected present in mixed infections: VK210 + VK247 (26.37%) and VK210 + P. vivax-like (7.69%). Conclusion: migrations related to the illegal mining of gold have been identified as an important propellant of malaria in this location. In Oiapoque, provided it is ensured the good quality of antimalarials, accurate diagnosis, adjusting the weight/dose of primaquine and adherence to treatment, the current therapeutic regimen for the treatment of vivax malaria remains highly effective. The same genotypes of the CS of the P. vivax VK210, VK247 and P. vivax-like circulating in French Guiana goldfields were found in the municipality of Oiapoque, in Brazil. The vivax malaria in the context of Franco-Brazilian border has as main characteristic the mobility of the population in continuous flow in both directions, which contributes to maintaining the disease. Key words: Malaria; Plasmodium vivax; Circumsporozoite Protein; Therapeutic Efficacy; Oiapoque; Franco-Brazilian Border.
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
A malária é uma doença infecciosa parasitária, febril aguda, causada por
protozoário intracelular, caracterizada por febre alta, acompanhada de calafrios,
sudorese intensa e cefaleia, que ocorre em padrões cíclicos, a depender da espécie
de plasmódio infectante, tem como sua principal via de transmissão ao homem a
picada das fêmeas de insetos dípteros culicídeos do gênero Anopheles, que
requerem sangue para maturação de seus ovos (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
Considerada um dos maiores flagelos da humanidade, devido, sobretudo, às
alarmantes taxas de morbi-mortalidade, a malária constitui também um sério
obstáculo para o desenvolvimento econômico das nações onde ocorre (Saches &
Malaney, 2002). Visto que, a despeito da sua longevidade, a malária continua sendo
uma das mais severas doenças parasitárias no mundo. Cerca de 40% da população
mundial, na maior parte aquela que vive nos países mais pobres, apresenta risco de
contraí-la. A doença foi eliminada com sucesso em muitos países, particularmente
naqueles de clima temperado, durante meados do século vinte, sendo atualmente
encontrada em todas as regiões tropicais e subtropicais (WHO, 2013).
1.1.1. Plasmódios humanos
Os agentes etiológicos da malária são protozoários intracelulares obrigatórios,
pertencentes ao Filo Apicomplexa, Ordem Eucoccidiidae, Subordem
Haemosporinae, Família Plasmodiidae, Gênero Plasmodium, com espécies que
infectam aves, répteis e mamíferos (Levine, 1988). Segundo Garnham & Duggan
(1986) quatro dessas espécies infectam naturalmente o homem: Plasmodium
malariae (Laveran, em 1881), Plasmodium vivax (Grassi & Feletti em 1890),
Plasmodium falciparum (Welch em 1897), e Plasmodium ovale (Stephens em 1922),
e mais recentemente uma quinta espécie o Plasmodium Knowlesi foi encontrado
infectando humanos na Malásia (Cox-Singh et al., 2008; Daneshvar et al., 2009).
Estes protozoários têm alto nível de especificidade de hospedeiro, resultante
de um longo processo de adaptação e evolução. Assim, os parasitos da malária
humana são específicos para o homem, apesar de poderem infectar outros primatas,
não são usualmente encontrados em condições naturais (Silva et al., 2002).
14
O P. falciparum é o causador da terçã maligna; o P. vivax, responsável pela
terçã benigna; o P. malarie, determinante da forma quartã, e distribuem-se pelas
regiões tropicais e subtropicais. Já P. ovale, causador da terçã benigna é restrito a
África tropical, Filipinas, Nova Guiné e Vietnã (Bruce-Chwatt, 1985).
1.1.2. Vetores da malária
Os vetores da malária humana são insetos da ordem Diptera, da família
Culicidae, do gênero Anopheles (Russel et al., 1946; Forattini, 2002). As principais
espécies transmissoras no Brasil pertencem a dois subgêneros: Nyssorhincus e
Kerteszia (por Rachou, 1958, Deane, 1986). No primeiro, destacam-se as espécies
Anopheles (N.) darlingi (por Root em 1926), Anopheles (N.) aquasalis (por Curry em
1932), e Anopheles (N.) albitarsis (por Lynch Arribalzaga em 1878), e no subgênero
Kerteszia, as principais espécies são Anopheles (K) cruzii (por Dyar & Knab em
1908) e Anopheles (K) bellator (por Dyar & Knab em 1908).
O Anopheles (N.) darlingi é considerado o vetor mais importante vetor da
malária no Brasil, particularmente na região Amazônica brasileira (Shannon, 1933;
Rachou, 1958). Esta espécie possui maior importância epidemiológica, pela
abundância, ampla distribuição no território nacional, atingindo todo o interior do
país, alto grau de antropofilia e endofagia e pela capacidade de transmitir diferentes
espécies de Plasmodium. Possui como criadouros preferenciais às coleções de
águas limpas, quentes, sombreadas e de baixo fluxo, frequentes na Região
Amazônica (Deane, 1989; De Oliveira-Ferreira et al., 1990; Forattini, 2002).
Estudo realizado por Segura (1998), em áreas próximas a Macapá,
demonstrou que o Anopheles aquasalis e o A. marajoara (por Galvão e Damasceno
em 1942), também são vetores importantes da malária urbana em Macapá - AP.
1.2 CICLO BIOLÓGICO DO Plasmodium vivax
A transmissão da malária ocorre após a picada infectante da fêmea do
anofelino, que inocula esporozoítos de plasmódios humanos nos capilares
subcutâneos, os quais ganham a corrente sanguínea e se aderem à superfície dos
hepatócitos com posterior invasão. (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
No interior das células hepáticas, os esporozoítos se desenvolvem e originam
milhares de merozoítos que podem invadir os eritrócitos, possibilitando o início do
15
ciclo eritrocitário. No hospedeiro humano, os períodos médios de incubação das
espécies P. vivax e P. falciparum são, respectivamente, de 12-17 dias e 7-10 dias.
Após a multiplicação parasitária assexuada nos eritrócitos o ciclo continua pela
reinfecção promovida pelos merozoítos em outras hemácias. Uma pequena
quantidade de parasitos se diferencia em gametócitos, que são essenciais na
transmissão da infecção através da picada do vetor. No interior do trato digestivo do
anofelino, as células sexuadas por sua vez irão desenvolver o ciclo evolutivo sexual
dos plasmódios e, posteriormente, irão infectar seres humanos a partir da inoculação
de esporozoítos (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
O ciclo de diferenciação e multiplicação do plasmódio nos hepatócitos possui
algumas peculiaridades para as espécies P. vivax e P.ovale. Algumas formas
dormentes desses parasitos não desenvolvem a esquizogonia tissular (esquizontes
pré-eritrocíticos) e interrompem o ciclo replicativo assexuado no interior do
hepatócito (hipnozoítos), podendo vir a ser continuado posteriormente, promovendo-
se assim o quadro de recaída da malária (Krotoski, 1985; Lopez-Antuñano, 1990;
Warrell, 1998).
Estudos relativos aos hipnozoítos do P. vivax postulam a existência de
populações de esporozoítos geneticamente distintos que se desenvolvem em
merozoítos no interior dos hepatócitos, enquanto outras permanecem dormentes
nestas células por um período maior, em estado de latência. Proporções variáveis
dos esporozoítos podem originar hipnozoítos com diferentes períodos de
quiescência e variações médias que vão de 15 dias (zonas tropicais) a 20 meses
(zonas temperadas), podendo se estender por anos (Krotoski, 1985; Warrell, 1998;
Harinasuta & Bunnag, 1998).
1.2.1 Sítio de Ação dos Antimaláricos no Ciclo Biológico do P. vivax.
Os principais fármacos antimaláricos podem ser classificados em função do
alvo de ação no ciclo biológico do parasito em: esquizonticidas teciduais ou
hipnozoiticidas (cura radical do P. vivax e P. ovale); esquizonticidas sanguíneos
(promovem a cura clínica); gametocitocidas (bloqueiam a transmissão), apresentado
na figura 1.
16
A infecção inicia-se quando os esporozoítos são inoculados através da pele
pela picada do vetor, e atingem a corrente sanguínea, os quais irão invadir os
hepatócitos. Os medicamentos que atuam nesta fase do ciclo são chamados
esporonticidas, (impedem a infecção pelos esporozoítos). Nenhuma fármaco deste
grupo está disponível, até o momento, para uso em humanos. Esporozoítos invadem
hepatócitos podendo posteriormente se dividir em esquizontes ou originar
hipnozoítos que mais tarde tornarão a se dividir em esquizonte tecidual. Os
antimaláricos que agem nesta fase do ciclo são denominados esquizonticidas
teciduais ou hipnozoiticidas, e promovem a cura radical da infecção pelo P. vivax
(Baird, 2009).
Na fase sanguínea do ciclo, os merozoítos formados rompem a hemácia e
invadem outras, dando início a ciclos repetitivos de multiplicação eritrocitária. Nesta
Figura 1: Compartimentos da atividade dos antimaláricos mostrados no ciclo de vida do Plasmodium vivax. Figura adaptada de Baird, (2009), (Cortesia de Wallace Peters e Andrea Darlow.)
Primaquina, cloroquina e
quinina.
Cloroquina, quinina, amodiaquina, mefloquina,
halofantrina, artemisina
Primaquina, pirimetamina
Gametoticida
Esquizonticida
17
fase do ciclo os medicamentos utilizados são denominados esquizonticidas
sanguíneos (promovem a cura clínica) (Baird, 2009). Alguns merozoítos do fígado
que ao invadir as células dos glóbulos vermelhos não se tornam esquizontes
assexuados sanguíneos, mas ao invés, diferenciam-se em machos e fêmeas
sexuados chamados gametócitos, os quais são alvos dos fármacos gametocitocidas,
que bloqueiam a transmissão (Baird, 2009).
1.3 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA
De acordo com as estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS),
ocorreram cerca de 207 milhões de casos de malária em 2012 (135-287 milhões),
em 104 países e territórios endêmicos, com destaque para África, Ásia e América
Latina. Destes foram registrados cerca de 627 000 óbitos (473.000-789.000),
principalmente em crianças menores de cinco anos de idade na África subsaariana,
onde uma criança morre a cada minuto, vitimada por esta doença (WHO, 2013).
Na Região das Américas, onde em vinte e um países a malária é endêmica, o
número de casos notificados foi reduzido para menos de 500 mil em 2011, apesar
do aumento registrado nos últimos dois anos, continua a tendência geral de declínio
na última década, em cerca de 58%. Neste período, o declínio tem sido muito maior
para o Plasmodium falciparum e infecções mistas (57%) em comparação com P.
vivax (23 %) (PAHO, 2011), como também, doze destes países já atingiram as
metas dos Objetivos de Desenvolvimento do Milênio (ODM) com redução superior a
75% dos casos em comparação com aqueles registrados em 2000.
A malária é a mais expressiva das endemias no Brasil, presente
principalmente na Amazônia Legal, composta pelos Estados do Acre, Amapá,
Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins, Mato Grosso e Maranhão, onde
ocorrem 99.7% dos casos, propiciado pelas suas condições climáticas, com
hidrografia abundante, altas temperaturas, elevada umidade relativa do ar, altos
índices pluviométricos e a presença das florestas que favorecem a manutenção dos
criadouros e consequentemente a proliferação dos vetores. Entretanto, em 2011,
98,0% dos casos foram concentrados em seis Estados: Pará, Amazonas, Rondônia,
Acre, Amapá e Roraima (Brasil, 2013).
Todos os Estados da Região apresentaram uma redução no número de casos
no período de 2000 a 2011; com exceção apenas do Estado do Acre, que
18
apresentou um incremento final de 4,8%. Em 2011, apenas o Estado do Amapá
apresentou incremento – de 23,4% – no número total de casos em relação ao ano
de 2010, com decréscimo nos demais Estados (Brasil, 2013).
Observou-se redução na notificação de casos de P. vivax em praticamente
todos os estados da Região Amazônica quando comparado o ano de 2010 com
2011; com exceção apenas dos Estados do Amapá e Maranhão, cujas notificações
apresentaram crescimento de 18,7% e 2,3%, respectivamente. É relevante destacar
que para a infecção por P. falciparum, apenas no estado do Amapá houve um
incremento no número de casos em 2011, da ordem de 45,7% (Brasil, 2013).
Na Região Amazônica, no período de 2000 a 2011, as infecções por P. vivax
representaram 78,7% dos casos notificados. As infecções por P. falciparum, que em
2006 constituíram mais de 20,0% dos casos registados na região, caíram para
menos de 12,0% em 2011. Atribui-se essa redução expressiva do P. falciparum à
mudança, a partir de 2006, no tratamento de primeira escolha desta malária para
combinações com derivados da artemisinina (Brasil, 2013).
1.3.1 Malária e a Fronteira do Brasil com a Guiana Francesa
O conceito de fronteira ultrapassa a dimensão da fronteira interna de um
determinado país, pois implica a conexão entre Estados diversos, a partir de limites
físicos. Se for certo que a determinação e defesa dos limites de uma possessão ou
de um Estado se encontram no domínio da alta política ou da alta diplomacia, as
fronteiras pertencem ao domínio dos povos. Enquanto o limite jurídico do território é
uma abstração, gerada e sustentada por ação institucional no sentido de controle
efetivo do Estado territorial, portanto, um instrumento de separação entre unidades
políticas soberanas, a fronteira é lugar de comunicação e troca. Os povos podem se
expandir para além do limite jurídico do Estado, independente da legislação
estabelecida (Machado, 2008).
O contínuo fluxo migratório na fronteira Brasil - Guiana Francesa tem como
ponto de convergência o município de Oiapoque (figura 2), que apresenta um índice
de parasitemia anual considerado como área de alto risco para transmissão de
malária, como demonstra o quadro 1 com a série histórica dos casos de malária no
município de Oiapoque e os casos importados da Guiana Francesa de 2005 a 2011.
19
Quadro 1 - Série histórica dos casos de malária no município de Oiapoque e casos importados da Guiana Francesa de 2005 a 2011.
Ano Município de Oiapoque Casos Importados da
Guiana Francesa IPA/1.000 hab. População N.º de casos
2005 308,9 15.046 4.647 3.260 = (70,1%)
2006 392,8 16.224 6.373 3.806 = (59,7%)
2007 378,4 17.423 6.593 3.704 = (56,3%)
2008 256,8 20.226 5.194 1.957= (37,7%)
2009 224,1 20.966 4.698 1.300 = (27,7%)
2010 259,8 20.509 5.329 1.410 = (26,4%)
2011 245,5 21.094 5.178 1.107 = (21,4%)
Fonte: Sivep-malária, 2005 a 2011.
Andrade (2005) ao estudar a expansão da malária e sua vinculação com o
processo migratório no Estado do Amapá no período de 1990 – 2003; observou que
a situação da malária importada da Guiana Francesa notificada no município de
Oiapoque, no período analisado, influenciou na manutenção e propagação da
doença, visto que, não somente manteve o índice parasitário anual de alto risco de
transmissão, como também contribuiu para o aumento dos casos de infecção.
Oiapoque
Macapá
Pará
Figura 2: Localização do município de Oiapoque. Fonte: Adaptado de Jornal Ceiri, 2013.
20
Ao se considerar o fluxo migratório nas últimas décadas, essa fronteira
internacional vem apresentando trânsito intenso, principalmente de brasileiros em
direção aos garimpos clandestinos ou aos trabalhos em cidades da Guiana
Francesa, onde muitos dos residentes em Oiapoque possuem familiares envolvidos
na extração de ouro ou outro tipo de atividade nos garimpos. Entretanto, como esses
brasileiros migrantes não são registrados por ocasião dos recenseamentos feitos no
Município, não aparecem nos censos populacionais. Estima-se que cerca de 10.000
brasileiros trabalham nos garimpos clandestinos do outro lado da fronteira. Este
grupo se desloca constantemente nos dois sentidos, em particular, vem à procura de
tratamento para repetidas infecções por malária. No entanto, é hábito comum entre
os garimpeiros ingerir medicamentos sem orientação do profissional de saúde, o que
favorece o desenvolvimento da resistência aos antimaláricos oficialmente
recomendados no Brasil. Essa tendência migratória foi observada quando, localizou-
se a rota estabelecida por esses brasileiros com malária, que procede dos garimpos
Siquini e Ipousen, ambos localizados na Guiana Francesa (Andrade, 2005).
1.4 MALÁRIA POR Plasmodium vivax
O P. vivax apesar de poder causar debilidade e anemia severa, interferindo
nas atividades produtivas dos indivíduos afetados, geralmente não leva ao óbito,
pois não têm em sua superfície as estruturas, chamadas knobs, o que sugere a
princípio, a sua incapacidade de se aderir ao endotélio microvascular dando origem
a um processo inflamatório que danifica os tecidos e pode levar à morte e também
gera o fenômeno chamado sequestro – o desaparecimento dos parasitas adultos
durante a segunda metade de seu ciclo de vida, assim, no P. vivax há a circulação
de todos os estágios sanguíneos no sangue periférico, com invasão
preferencialmente dos eritrócitos jovens imaturos, do grupo sanguíneo Duffy positivo
que agem como receptor para o parasito, sendo largamente limitado para
reticulócitos (Miller et al., 2002). Entretanto, no Brasil, Cavasini et al., (2007) e
Carvalho et al., 2012), bem como na África, Ryan et al., (2006); Menard, et al.,
(2010), Mendes et al., (2011); Wurtz et al., (2011) sugerem que indivíduos Duffy
negativo possam ser infectados por este protozoário, provavelmente por meio de
outros receptores envolvidos no reconhecimento do eritrócito.
21
O período de incubação do P. vivax é de aproximadamente 15 dias. As crises
paroxísticas, com febres altas e tremores - devido à lise dos eritrócitos - são de 48
horas recorrentes no terceiro dia, sendo assim denominada terçã benigna. Ressalta-
se que os hipnozoítas podem persistir no fígado e causar relapsos invadindo a
circulação sanguínea, em semanas ou mesmo anos mais tarde, mesmo após a cura
da doença sintomática (Richie & Saul, 2002).
O P. vivax é menos patogênico, comumente não alcança alta densidade
parasitária e não sofre sequestro nos capilares e vênulas (Pukrittayakamee et al.,
2000), embora já tenha sido relatado o roseteamento das hemácias parasitadas
(Chotivanich et al. 1998) e citoaderência relatada in vitro (Kim et al., 2006; Carvalho
et al., 2010). Apresenta evolução clínica com predomínio das formas pouco graves e
baixa letalidade, mas, com elevada morbidade e expressivo número de casos
(Mendis et al., 2001). No estado do Amazonas estudos mostraram a infecção crônica
por Plasmodium vivax em paciente com esplenomegalia e plaquetopenia grave
(Lacerda et al., 2008), assim como, os fatores de risco associados ao
desenvolvimento de anemia em malária por esse plasmódio (Marques et al., 2013)
Nas Américas, os aspectos clínicos da malária por P. vivax são similares aos
de outros continentes. A febre, icterícia e hepatoesplenomegalia geralmente estão
presentes. Outros sintomas inespecíficos são calafrio, astenia, cefaleia, mialgia,
tosse e sintomas gastrintestinais (Ventura, 1997; Alecrim, 2000; Blair et al., 2003).
Nos indivíduos não imunes (primoinfectados), o risco de complicações é
elevado, há relatos de variados níveis de acometimento clínico (Alecrim, 2000;
Pukrittayakamee et al., 2000; Mendis et al., 2001; Andrade et al., 2010).
1.5 ASPECTOS TERAPÊUTICOS DA MALÁRIA VIVAX
O tratamento adequado e oportuno da malária é hoje o principal alicerce para
o controle da doença. Tanto previne a ocorrência de casos graves e,
consequentemente o óbito, quanto elimina fontes de infecção para os mosquitos,
contribuindo para a redução da transmissão da doença (Brasil, 2010).
A quimioterapia da malária tem como objetivos: 1) interromper a esquizogonia
sanguínea, responsável pela patogenia e manifestações clínicas da infecção; 2)
proporcionar a erradicação de formas latentes do parasito (hipnozoítas), das
22
espécies P. vivax e P. ovale, no ciclo tecidual, evitando as recaídas; e 3) reduzir as
fontes de infecção, eliminando as formas sexuadas dos parasitos (Brasil, 2010).
Uma vez confirmado o diagnóstico, a terapêutica apropriada deve ser iniciada
imediatamente, considerando as seguintes informações: (a) gravidade da doença:
quando há necessidade de medicamentos injetáveis e com ação mais rápida sobre
os parasitos, visando reduzir letalidade; (b) espécie de plasmódio: deve ser
diferenciada, em face do perfil variado de resposta do P. falciparum aos
antimaláricos. Caso não seja possível determinar a espécie do parasito, deve-se
optar pelo tratamento do P. falciparum, pelo risco de complicações e evolução grave;
(c) idade do paciente: pelo prognóstico desfavorável na criança e no idoso, os quais
requerem atenção especial; (d) história de episódios anterior da doença: indivíduos
não imunes (primoinfectados) tendem a apresentar formas clínicas mais graves; (e)
susceptibilidade dos parasitos aos antimaláricos comumente utilizados no tratamento
com fármacos sabidamente eficazes para a área de ocorrência do caso, evitando
atraso no efeito terapêutico e consequente agravamento clínico (Brasil, 2010).
1.5.1 Esquema Terapêutico para o P. vivax
No Brasil, o esquema recomendado para o tratamento das infecções por P.
vivax é baseado na associação de cloroquina, em comprimidos contendo 150mg de
cloroquina base, com dose total de 25 mg/kg, dividida em 3 dias, sendo, 10
mg/kg/dia no primeiro dia, 7,5 mg/kg, no 2o e 3o dias, e fosfato de primaquina, em
comprimidos contendo 15mg de substância base, na dose de 0,5 mg/kg/dia e dose
total de 3,0 a 3,5 mg/kg de peso a partir do primeiro dia, por sete dias seguidos ou,
até 12 dias conforme o ajuste da dose e tempo de administração da primaquina para
pacientes com peso igual ou superior a 70 kg, veja figura 3. Para garantir a eficácia
adequada e baixa toxicidade, recomenda-se, sempre que possível, que as doses
sejam ajustadas ao peso do paciente. Quando uma balança para verificação do peso
não estiver disponível, utiliza-se a relação peso/idade apresentada no Guia Prático
de Tratamento da Malária no Brasil, como demonstra a figura 4 (Brasil, 2010).
23
Figura 4: Esquema curto para o tratamento das infecções pelo P. vivax. Fonte: Figura adaptada de Brasil, (2010).
Figura 3: Ajuste da dose e do tempo de administração da primaquina para pacientes com peso igual ou superior a 70 kg no tratamento das infecções pelo P. vivax. Fonte: Figura adaptada de Brasil, (2010).
24
1.5.2 Cloroquina no Tratamento da Malária Vivax
A cloroquina tem um papel central tanto no tratamento como na profilaxia
da malária, pela eficácia, segurança seu baixo custo, (Whitby, 1997). Possui ação
esquizonticida sanguínea rápida contra P. vivax, P. ovale e P. malariae, além de
exercer efeito gametocitocida nestas espécies, porém, não tem ação contra as
formas hepáticas, porém, as sua ação antipirética e anti-inflamatória. (Warrel, 1998;
Brasil, 2001). Mundialmente, poucas cepas de P. falciparum ainda se mantêm
sensíveis à ação da cloroquina (Brasil, 2001).
Dentre os mecanismos responsáveis pela atividade esquizonticida da
cloroquina, se destaca o acúmulo do fármaco nos vacúolos digestivos dos
plasmódios, aumentando o pH lisossômico e interferindo na metabolização e
utilização da hemoglobina pelos parasitos como alimento, (Foley & Tilley, 1997).
Acredita-se que o heme da hemoglobina seja liberado no citosol do parasito e
degradado pela glutationa reduzida, liberando ferro. Este, por sua vez, é utilizado,
armazenado (hemozoína) ou eliminado. A hipótese da inibição da polimerização do
heme, considera que quanto mais heme livre se integra à membrana do vacúolo
digestivo mais permeável esta se torna, resultante da peroxidação dos lipídeos. A
inibição da formação da hemozoína e o consequente consumo da glutationa
reduzida levariam a formação do hidroxiperóxido e outras espécies reativas de
oxigênio, as quais seriam responsáveis pelos danos ao parasito e a membrana
celular (Foley & Tilley, 1997; Tavares, 1999 apud em Homewood et al., 1972).
A cloroquina é eficientemente absorvida quando administrada por via
oral, alcançando-se concentrações máximas no plasma dentro de 3 h (variando
entre 2 a 12 h). A biodisponibilidade por via oral é de 70 a 75%. A concentração
alcançada no plasma dentro de 30 minutos após a administração de uma única dose
de 10 mg/kg é, em geral, bem maior que o nível terapêutico para os parasitos
sensíveis à cloroquina. Liga-se as proteínas plasmáticas em torno de 55%. Tem
elevada capacidade de se ligar aos tecidos (fígado, baço, leucócito e outros),
particularmente tecidos dérmicos e oculares contendo melanina. Concentra-se, de
preferência, em eritrócitos e esta concentração aumenta em eritrócitos parasitados
(Brasil, 2001).
No interior das hemácias a cloroquina atinge concentrações três vezes
superiores aquelas do plasma. Também se concentra nos leucócitos e nas
25
plaquetas. Atravessa a barreira placentária e, em tratamentos prolongados, pode
causar lesão no feto e alcança pequenas concentrações no leite materno. É
biotransformada pelas enzimas do citocromo P450, formando diversos metabólitos,
dentre estes, disetilcloroquina e bisetilcloroquina, que apresentam atividade
antimalárica . (Ducharme & Farinotti, 1996; Warrel, 1998).
A cloroquina é excretada, sobretudo, pela via renal, com meia vida de
eliminação em torno de 30 a 60 dias (WHO, 2006). Parte do fármaco é eliminado
inalterada nas fezes e apenas 10% à 25% da dose administrada é detectada na
urina (Thompson & Werbel, 1972; Warrel, 1998)
1.5.3 Primaquina no Tratamento da Malária Vivax
A primaquina é uma 8-aminoquinolina altamente ativa contra gametócitos de
todas as espécies de malária humana e contra hipnozoítos do P. vivax. A ação
hipnozoiticida da primaquina é função da dose total e não da duração do tratamento.
Tem ação profilática causal, porém, até recentemente, não indicada, devido a
elevada toxicidade ao sistema hematopoiético em uso prolongado. A primaquina
atua também contra as fases assexuadas sanguíneas, mas somente em doses
elevadas, as quais podem aumentar a ocorrência de efeitos adversos (Inchem, 1994;
Malariasite, 2004).
A primaquina é bem tolerada nas doses terapêuticas, mas em doses elevadas
pode causar distúrbios gastrointestinais e metemoglobinemia (Brossi et al., 1987;
Portela et al., 1999), bem como, hemólise em pacientes com deficiência congênita
da glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), enzima presente em elevada
concentração nos reticulócitos envolvidas nos processos redox, cuja função principal
é proteger grupos sulfidrilos da hemoglobina e a membrana eritrocitária, dos efeitos
deletérios dos radicais livres, através do fornecimento intracelular de glutationa
reduzida. Em pessoas com deficiência na G6PD, a oxidação da hemoglobina leva à
sua precipitação dentro da célula, produzindo inclusões características chamadas
corpos de Heinz. O incremento na produção dos radicais livres, por fim, leva a
hemólise (Ethnasios, 2007).
O mecanismo de ação da primaquina não é completamente compreendido,
contudo acredita-se que iniba processos metabólicos na mitocôndria plasmodial,
inibindo a respiração celular do parasita. Outro mecanismo potencial de ação contra
26
os plasmódios é a produção de radicais livres promovendo danos oxidativos
intracelulares aos parasitas (David et al., 2006).
Após administração via oral, a primaquina é completamente absorvida pelo
trato gastrointestinal. Atinge os picos de concentração no plasma entre 1 a 2 horas,
que decai rapidamente, com meia vida de cerca de 3 a 6 horas (Mihaly et al., 1985;
Ward et al., 1985; David et al., 2006).
A primaquina é rapidamente biotransformada por duas vias metabólicas
principais. A primeira leva à formação de dois metabolitos principais, a 5-
hidroxiprimaquina e 5-hidroxi-metilprimaquina, possíveis responsáveis pela ação
antimalárica e efeitos tóxicos ao sistema hematopoiético. A outra via, leva a
formação de carboxiprimaquina, que é o metabolito formado em maior quantidade,
entretanto é considerado inativo. Pequena porção é excretada inalterada na urina, e
grande parte como produtos de biotransformação em 24 horas. (Mihaly et al., 1985;
Ward et al., 1985; David et al., 2006).
1.5.4 Classificação da Resposta ao Tratamento da Malária Vivax
Os testes in vivo são tradicionalmente o padrão ouro para detecção da
resistência aos fármacos (WHO, 1996). Eles refletem a verdadeira resposta biológica
natural ao tratamento, que envolve a complexa interação entre o parasito o fármaco
e a resposta do hospedeiro, pois os testes in vitro avaliam somente a interação entre
o parasito e o fármaco (Bloland, 2001).
O teste clássico definido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em
termos de eliminação de parasitos em resposta a cloroquina, foi inicialmente usado
interpretando o sistema de classificação padrão, ou seja, S (sensível), RI (resistência
tipo I), RII (resistência tipo II) e RIII (resistência tipo III) (WHO, 1973). Entretanto,
como a reinfecção é difícil de ser excluída em áreas de intensa transmissão, a OMS
introduziu um protocolo modificado, baseado na resposta clínica, classificando-a em
três categorias de respostas terapêuticas, quer sejam RCA (resposta clínica
adequada), FRT (fracasso recorrente do tratamento) FPT (fracasso precoce do
tratamento) e FDT (fracasso direto do tratamento), para áreas com intensa
transmissão onde a presença de parasitemia na ausência de sinais e sintomas
clínicos se apresenta (WHO, 1996, Baird, 2009), de acordo com o quadro 2.
27
Quadro 2 - Classificação da resposta clínica e parasitológica ao tratamento da
malária por P. vivax tratada com cloroquina de acordo com protocolo da OMS.
Classificação da resposta parasitológica
Classificação da resposta clínica
Sensível (S)
Clareamento da parasitemia após tratamento sem reaparecimento subsequente dentro do período de seguimento até o 28 dia.
Resposta clínica adequada (i) Ausência de parasitemia no 14º
dia sem restrição de condição de febre, sem previamente encontrar nenhum dos critérios para fracasso recorrente ou precoce.
(ii) Ausência de febre sem restrição da condição da parasitemia, sem previamente encontrar nenhum dos critérios para fracasso recorrente ou precoce.
Resistência RI com recorrência tardia Clareamento inicial da parasitemia seguida pela recorrência após sete dias
Fracasso recorrente do tratamento (i) Presença de sinais de perigo ou de
malária grave depois do dia 3 (entre os dias 4 e 14 ou 28), com parasitemia da mesma espécie que em D0
(ii) Presença de parasitemia no 7º, 14º, 21º ou 28º dia.
Resistência RII com recorrência precoce
Redução da parasitemia no 2º dia para menos que 25% da parasitemia no dia zero, mas sem completa liberação.
Fracasso precoce do tratamento (i) Durante os três primeiros dias de
seguimento o paciente apresenta sinais de perigo ou malária grave na presença de parasitemia;
(ii) Febre (Temperatura axilar 37.5º C) e a parasitemia em D2 maior que em D0
(iii) Febre e parasitemia no D3.
(iv) Densidade parasitária no D3 a 25% da densidade do D0.
Resistência RIII No 2º dia, não há redução da parasitemia ou há redução para um nível igual ou superior que 25% da parasitemia do dia zero.
Fracasso direto do tratamento
(v) Durante os três primeiros dias de seguimento o paciente apresenta sinais de perigo ou malária grave na presença de parasitemia;
(vi) Febre (Temperatura axilar 37.5º C) e a parasitemia em D2 maior que em D0
(vii) Febre e parasitemia no D3.
Densidade parasitária no D3 a 25% da densidade do D0.
Fonte: Adaptado de WHO 1973, 1996; Baird, 2009.
28
O fracasso direto e precoce no tratamento pode ser definitivamente
classificado com a demonstração da absorção adequada do antimalárico, cujos
teores plasmáticos sejam equivalentes às doses administradas, o que pode ser
alcançado pela supervisão direta das tomadas das doses prescritas (dose assistida)
ou pela medição dos níveis sanguíneos dos fármacos e de seus metabólitos, caso
estes apresentem atividade farmacológica. No caso da cloroquina (CQ) e
desetilcloroquina (DCQ), as concentrações sanguíneas devem ser superiores a
100ng/mL após 28 dias do início do tratamento. Portanto, a classificação definitiva
de fenótipos resistentes deve considerar os teores adequados de CQ e DCQ no
sangue total associados a parasitemia recorrente no período de seguimento clínico-
laboratorial de 28 dias (Baird, 2009).
A classificação dos parasitos isolados em sensíveis ou resistentes à
cloroquina requer cautela. Parasitos que aparecem no dia zero e não reaparecem
após 28 dias de início do tratamento podem ser confiantemente classificados como
sensíveis. O mesmo pode ser dito de falhas direta e precoce no tratamento.
Presença CQ+DCQ superiores a 100 ng/mL no sangue total, no dia da falha no
período de 28 dias, indicam que o parasito não esta respondendo adequadamente
ao medicamento, independente da presença do parasito por recrudescência,
recidiva ou reinfeção (Baird, 1997; Baird, 2004).
Na recrudescência, os parasitos que sobreviveram ao tratamento da infecção
aguda estão em baixa concentração no sangue, não sendo detectáveis pelos
procedimentos de rotina, reaparecendo dias após na circulação periférica. Já a
reinfeção resulta de uma nova exposição ao esporozoíto inoculado em novo repasto
sanguíneo do anofelino. A recaída se caracteriza pelo reaparecimento das
manifestações típicas da infecção malárica e parasitemia, após terapia
esquizonticida sanguínea adequada. Resulta da reativação dos hipnozoítos
tissulares, que após período de tempo variável, por mecanismos ainda
desconhecidos, desencadeiam um novo acesso malárico (Baird, 1997; Baird, 2004).
1.5.5 Resistência do Plasmodium vivax aos Antimaláricos
A resistência àos fármacos antimaláricas foi primeiramente definida por
Wernsdorfer & Payne (1965) e depois pela OMS, (WHO, 1973) Como:
29
“É a capacidade de uma população de parasitos sobreviver e/ou multiplicar-se, apesar da administração e da absorção de uma fámaco dada nas doses iguais ou superiores do que aquelas geralmente recomendadas, porém dentro dos limites de tolerância do individuo”.
A definição de Wernsdorfer & Payne (1965) foi posteriormente ampliada por
Bruce-Chwatt et al., (1986) para especificar que o fármaco em questão além de ser
administrada nas doses adequadas, deve ser absorvida e ter acesso à célula
sanguínea infectada e ao parasito, por intervalo de duração necessário para sua
ação eficaz.
Vários fatores se associam no desenvolvimento da resistência pelos
plasmódios e estão vinculados ào fármaco, ao hospedeiro humano, ao parasito, ao
vetor (Wongsrichanalai et al., 2002; Rigby et al., 2002).
Dentre os principais fatores determinantes para seleção de cepas dos
plasmódios resistentes aos antimaláricos estão: 1) carga parasitária no hospedeiro
humano exposto aos antimaláricos; 2) concentrações dos antimaláricos, as quais, os
parasitos estes estão expostos; 3) propriedades farmacodinâmicas dos
antimaláricos; 4) grau de resistência resultante de alterações genéticas; e 5) nível de
imunidade específica e inespecífica do hospedeiro humano (White, 2004).
A manutenção de concentração plasmática adequada do antimalárico durante
o tempo necessário para a eliminação dos parasitos, quando não respeitada,
também favorece o surgimento de mecanismos de escape do parasito, selecionando
populações de plasmódios menos suscetíveis aos efeitos farmacológicos desejados
(Wongsrichanalai et al., 2002).
O uso indiscriminado e inadequado de antimaláricos em áreas de intensa
transmissão, com base em diagnósticos presuntivos de malária, na maioria das
ocasiões por inexistência de diagnóstico microscópico, relaciona-se diretamente com
o processo seletivo de cepas naturalmente resistentes. Em referência à meia vida de
eliminação terminal dos fármacos, quanto mais prolongada for maior será a chance
de níveis subterapêuticos persistirem no plasma humano. Na ocorrência de
reinfecções, o consequente risco de seleção de cepas de plasmódios mutantes
resistentes e sua disseminação geográfica nas áreas malarígenas são possíveis
tanto em zonas de intensa transmissão (indivíduos com múltiplas infecções/ano) e,
como, em zonas de baixa e média transmissão (altas parasitemias e baixa
efetividade imune) (White, 1998; 2004; Alecrim et al., 1999; Hastings, 2003).
30
A emergência de resistência à cloroquina, o principal fármaco contra o P.
vivax, é uma das preocupações nas estratégias atuais de controle da malária vivax
nos diversos países endêmicos (Baird, 2004). Apesar de cloroquina continuar sendo
o fármaco de escolha tanto para profilaxia como para o tratamento da infecção por
P.vivax, existem relatos de perda de sensibilidade e resistência do parasito à
cloroquina em diferentes lugares (Rieckmann et al.,1989; Baldassarre et al., 1991).
A primeira evidência de que o P.vivax estaria desenvolvendo resistência à
cloroquina foi relatada em Papua, Nova Guiné por Rieckmann et al., em (1989).
Reduções na susceptibilidade à cloroquina também foram relatadas nas Ilhas
Salomão (Whitby et al., 1989), Papua, Nova Guiné (Schuurkamp et al., 1992; Murphy
et al., 1993), e Índia (Garg et al., 1995).
No Brasil a primeira evidência de que o P.vivax estaria desenvolvendo
resistência à cloroquina em monoterapia foi relatada em Manaus no Amazonas por
Alecrim et al., em (1999). Em 2001 Abdon e colaboradores encontraram 5% de falha
terapêutica. No Amapá, os primeiros relatos de que a resposta do P.vivax à
cloroquina em monoterapia estaria resultando em insucesso no tratamento, foi
descrito por Calvosa (2005), onde o P. vivax apresentou respostas não satisfatórias
ao tratamento com a cloroquina em algumas localidades, entre as quais, estão os
pacientes oriundos da região de fronteira Franco-brasileira no município de
Oiapoque com 17,6% de falhas terapêuticas e recaídas consideradas tardias em
D28 (81,4%). Em estudos concluídos em oito localidades sentinelas do projeto
RAVREDA no Brasil, a medição de níveis séricos de CQ confirmou os achados de
níveis importantes de falha terapêutica a este medicamento (até 18%, em pacientes
do município de Careiro - Amazonas). Chama-se atenção para o registro de falhas
tardias (dias 21 – 28) em todos os casos (PAHO, 2006). Outro estudo sistematizado,
realizado no Amazonas entre 2004 a 2005 avaliou a eficácia terapêutica da
cloroquina no tratamento da malária por P. vivax e registrou recrudescência em 19
pacientes, com predomínio no D28. Destes, 11 tiveram confirmado as infecções por
P.vivax cloroquina-resistente pela PCR e mensuradas as concentrações plasmáticas
do antimalárico (356,6±296,1 ng/mL). A taxa de Fracasso Terapêutico foi de 10,1%,
concluindo desta forma, que os parasitos foram resistentes à CQ (Filho-Frankiln, et
al., 2007). Mas recentemente em 2013 Masques e colaboradores encontraram 5,2 %
de falha terapêutica para o P. vivax na cidade de Manaus, quadro 3.
31
Ano Local % de Falha Terapêutica Autores
2001 Belém 5 Abdon et al
2000 Manaus 4,4 Alecrim
2005 Amapá 17,6 Calvosa
2006 Careiro 18,1 RAVREDA
2007 Manaus 10,1 Filho-Frankiln et al
2013 Manaus 5,2 Marques et al
1.5.6 Determinantes da Falha Terapêutica na Malária Vivax
No contexto do insucesso na terapêutica da malária vivax é imperioso
abordar os genes de resistência do Plasmodium vivax aos antimaláricos. Todavia, é
importante esclarecer que, o mecanismo genético de resistência do P. vivax aos
antimaláricos ainda necessita ser elucidado em sua totalidade. Para o P. falciparum
os genes de resistência à cloroquina tem sido associado a determinado ponto de
mutações em genes específicos, tais como pfcrt-o e pfmdr-1 (Fidock et al., 2000;
Duraisingh & Cowman, 2005), este tipo de associação não é muito claro no caso de
P. vivax (Gonçalves et al., 2014).
A principal dificuldade em estudar os mecanismos de resistência do P. vivax à
cloroquina é a ausência de um sistema contínuo de cultura in vitro, estudos
utilizando culturas in vitro em curto prazo são úteis para a investigação de
mecanismos de resistência de droga e a análise de sensibilidade dos agentes
terapêuticos para P. vivax (Kerlin et al., 2012). Devido à ausência de marcadores
moleculares específicos de resistência, a caracterização de marcadores moleculares
gerais de P. vivax não apenas ajudam a identificar parasitas resistentes à cloroquina,
mas também em definir as origens geográficas e disseminação de isolados
resistentes (Arnott et al., 2012).
A diversidade genética de P. vivax tem sido estudada utilizando marcadores
moleculares quase neutros, como microssatélites e repetições em tandem, bem
como com antígenos polimórficos, incluindo PvMSP proteínas membros da família
(MSP-1 e MSP-3α) (De Brito e Ferreira, 2011).
O gene principal investigado dentro do contexto da resistência de cloroquina
em P. vivax é pvcrt, o homólogo transportador da resistência à cloroquina do P.
Quadro 3 - Estudos de avaliação de eficácia de antimaláricos para o P. vivax.
32
falciparum (pfcrt), em que uma substituição de K76T é conhecida por ser um
determinante crucial da resistência à cloroquina. Um estudo da expressão
heteróloga em que pvcrt foi transfectado dentro do P. falciparum e Dictyostelium
discoideum mostrou que a super expressão de pvcrt foi capaz de reduzir a
susceptibilidade de cloroquina em ambos os organismos, sugerindo que pvcrt pode
ser capaz de modular o transporte e acumulação de cloroquina no P. vivax (Sá, et
al., 2006).
Diante da observação de falhas terapêuticas após um tratamento do P.vivax,
existe uma tendência imediatista de se concluir pela emergência de resistência do
parasito ao esquema utilizado. Mas a resistência do parasito não é o único fator
causal do insucesso na terapêutica com antimaláricos. Os fatores potenciais que
podem distorcer a detecção da emergência da resistência parasitária às drogas são
relacionados ao hospedeiro humano, ao parasito e à qualidade e dosagem dos
antimaláricos, correta terapêutica e adesão ao tratamento (Duarte et al., 2003).
Assim, é importante atentar para a necessidade da abordagem dos fatores
determinantes de falhas terapêuticas, quer seja, por serem raramente enfocados na
literatura de forma integralizada, quer seja, para contribuírem na orientação dos
estudos de eficácia terapêutica (Duarte et al., 2003).
A variabilidade da resposta do parasita aos antimaláricos constitui aspecto
limitante do sucesso terapêutico. (Noedl et al., 2003). A falha terapêutica pode ser
associada à resistência de cepas circulantes de P. vivax em determinada região aos
antimaláricos utilizados (Bloland, 2001). No entanto, nas falhas direta e precoce no
tratamento, dada às ambiguidades inerentes das parasitemias recorrentes durante o
período de seguimento, de vinte e oito dias, o fenótipo de resistência aos
antimaláricos dos parasitos no primeiro dia permanece incerto. Os parasitos que
foram detectados no primeiro dia podem ter sido sensíveis à cloroquina, e no caso
dos parasitos que aparecem mais tarde durante o teste diagnóstico, eles podem
representar uma recaída ou reinfecção por outra cepa cloroquina resistente.
Portanto, somente os parasitos que aparecem no dia de recorrência com medição
adequada do fármaco podem ser inequivocamente classificados como sendo
resistentes à cloroquina (Baird, 2004, 2009).
Assim, a resistência do plasmódio aos antimaláricos pode causar falha
terapêutica, mas nem toda falha terapêutica é devido à resistência (Bloland, 2001).
O fracasso terapêutico observado também pode ser devido às alterações na
33
biotransformação dos fármacos ou a presença de infecções latentes de outra
espécie de plasmódio (Talisuna et al., 2004). Entretanto, outros fatores inerentes ao
hospedeiro e ao parasita e suas interações também podem contribuir para a falha
terapêutica. Dentre estes, a adesão ao tratamento (Duarte & Györkös, 2003; Pereira
et al., 2011), a dose total e ajuste das doses de primaquina em função do peso
corpóreo do paciente que modificam as concentrações sanguíneas dos antimaláricos
(Ventura, 2007; Santos et al., 2010), a precisão na identificação exata da espécie de
Plasmodium (Mckenzie et al., 2003), a má absorção resultante de diarreias e vômitos
ou, da qualidade intrínseca dos antimaláricos distribuídos, em especial as condições
de armazenamento (Talisuna et al., 2004; Baird, 2009; Duarte et al., 2003; Evans et
al., 2012).
Destaca-se que a adesão ao tratamento é fator importante na determinação
da resposta terapêutica aos fármacos antimaláricos, uma vez que o não
cumprimento do tratamento como prescrito compromete a melhora e a cura do
paciente, aumenta o risco de transmissão da doença, favorece o desenvolvimento
de resistência, bem como, constitui perda econômica substancial (Reiners et al.,
2013). No Brasil, grande número de tratamentos ocorre sem supervisão médica.
Assim, a baixa adesão ao tratamento da malária explica, provavelmente, o grande
número de recaídas da infecção por P. vivax observadas nos últimos anos (Pereira
et al., 2011). Este fato é mais significativo em áreas com população instável, uma
vez que se torna difícil acompanhar os pacientes durante o tratamento, confirmando
assim, as observações de Duarte & Györkös (2003), as quais enfatizaram a baixa
adesão ao tratamento como fator importante na predição de episódios subsequentes
de malária no mesmo indivíduo.
Vários fatores são responsáveis pela baixa adesão ao tratamento, dentre
estes, as instruções ao paciente quando são mal orientadas ou pela não
compreensão das instruções de tratamento, esquecimento do paciente de tomar a
medicação, desintegração ou perda dos comprimidos, ocorrência de reações
adversas (Gomes et al., 1998), e em alguns casos, o uso concomitante de álcool,
principalmente nos acampamentos, assentamentos e nas áreas de mineração. No
caso de medicamentos que levam a rápida melhora clínica e com poucos efeitos
adversos, como a cloroquina, o desaparecimento dos sintomas também é referido
como importante razão para suspensão da continuação do tratamento com
primaquina (Grietens et al., 2010). Prescrição inadequada e distribuição de
34
antimaláricos por profissionais que não possuem adequada formação em saúde são
reconhecidas como causas importantes da baixa adesão ao tratamento antimalárico
(Fungladda et al., 1998). O tempo de tratamento também é fundamental, a utilização
de esquemas terapêuticos de longa duração tem maior probabilidade de baixa
adesão, daí preferir-se os esquemas terapêuticos de curta duração, como exemplo
da primaquina em sete dias aumentando-se a dose diária, que pode proporcionar
melhor adesão ao tratamento, desde que, sejam garantidas além da eficácia, a
tolerância e a segurança do fármaco e, minimizado os efeitos adversos (Pinto et al.,
1998; Villalobos-Salcedo et al., 2000; Abdon et al., 2001).
A garantia da qualidade dos medicamentos contra a malária é fundamental
para o controle da malária e eventual eliminação (Pribluda et al., 2012). A qualidade
dos medicamentos é um problema global e uma das principais preocupações nos
países onde a malária é endêmica. O impacto que isso pode ter sobre
medicamentos utilizados para o tratamento da malária pode ser grave. A má
qualidade de medicamentos tem um efeito negativo sobre a vida dos pacientes,
fazendo com que eles permaneçam mais tempo doentes. Isto também prejudica o
sistema de saúde de um país, e despende mais recursos financeiros e humanos, e
agrava os problemas de saúde, particularmente o desenvolvimento de resistência
(Pribluda et al., 2012). Vários relatos atestam a importância deste problema para
medicamentos contra a malária na África e na Ásia (Basco et al., 2004; USP 2013).
Por outro lado, estudos acerca da qualidade dos antimaláricos nas Américas são
escassos (Petralanda, 1995, Nogueira et al., 2011).
Outro aspecto relacionado com a qualidade do antimalárico é a politica de
distribuição em cada país. Na África e na Ásia esses medicamentos são vendidos, e
muitas vezes são falsificados e de baixa qualidade (Bate et al., 2008; Nayyar et al.,
2012; Phanouvong et al.,2013). Mas no Brasil, os antimaláricos são disponibilizados
gratuitamente pelo Ministério da Saúde em todo o território nacional, e são
adquiridos segundos requisitos legais que incluem certificado de análise emitido pelo
laboratório produtor (Brasil, 2010). Contudo, nem sempre, os critérios de
armazenamento do medicamento são atendidos como constam na embalagem pelos
postos de notificação da malária (Nogueira et al., 2011; Pribluda et al., 2012).
A identificação precisa da espécie de Plasmodium infectante em humanos é
fundamental para o tratamento adequado do doente. Falhas no diagnóstico podem
levar a um tratamento medicamentoso inadequado ou à administração
35
desnecessária de um determinado fármaco (Mckenzie et al., 2003). O diagnóstico
laboratorial da malária, pelo método da gota espessa, é considerado o padrão ouro
para identificação da espécie de plasmódio, e consiste na identificação dos parasitos
no sangue periférico do doente por meio da microscopia óptica. A boa coloração,
desemoglobinização correta e microscopista bem treinado, proporciona a detecção
de até 5-10 parasitos/μL de sangue e permite a identificação da espécie do parasito
e quantificação da parasitemia, bem como, fornece informações sobre o estágio de
desenvolvimento do plasmódio (WHO, 2000). O diagnóstico correto e preciso da
espécie de Plasmodium, portanto, faz-se importante tanto para a identificação inicial
da malária e administração da terapêutica adequada, como para o acompanhamento
clínico durante o tratamento.
O ajuste da dose da primaquina em função do peso dos pacientes,
modificando a dose diária e o tempo de administração, certamente contribuiu para o
aumento da taxa de cura da infecção em vinte e oito dias, pois é notória a
associação entre a eficácia hipnozoiticida e a dose total de primaquina ajustadas ao
peso corporal (Schwartz et al., 2000; Libonati & Ventura, 2007; Santos et al., 2010;
Fernando et al., 2011). Contudo, no Brasil, nos postos de notificação de malária que
não possuem balanças antropométricas, é recomendado utilizar as doses de
antimaláricos em função da relação peso/idade por grupos de faixa etária conforme
apresentadas nas tabelas em substituição ao peso corpóreo real do paciente (Brasil,
2010). Porém, isto pode acarretar a absorção de quantidade inadequada de
antimaláricos, levando as recidivas clínicas que podem ser erroneamente
confundidas com resistência ou reinfecção (Santos et al., 2010).
1.6 PROTEINA CIRCUNSPOROZOÍTA E OS GENÓTIPOS DA CS DO P. vivax
O esporozoíto é a forma infectante do Plasmodium, inoculado a partir da
glândula salivar do vetor durante o repasto sanguíneo. A estrutura da principal
proteína que recobre a superfície do esporozoíto do P. falciparum foi caracterizada
em 1984. Por recobrir sua superfície, recebeu o nome genérico de “proteína
circunsporozoíta” ou CS (Dame et al., 1984). No ano seguinte, pesquisas
evidenciaram a existência de antígenos específicos para a CS capazes de distinguir
as diferentes espécies de plasmódios (Nussenzweig et al., 1985). Foi observado
36
ainda, que esta proteína é estágio-específica com epítopos repetitivos
imunodominantes (Zavala et al., 1986), ocorrendo variações de sequência na porção
central do gene CS (Gopinath et al., 1994).
A CS pode estar envolvida na motilidade e invasão dos esporozoítos durante
a sua entrada no hepatócito (Kappe et al., 2004; Mota & Rodriguez, 2004; Good,
2005). A CS tem uma região central imunodominante, consistindo de curtas
sequências de aminoácidos repetidas in tandem que contêm múltiplas cópias do
epítopo imunodominante de células B (Arnot et al., 1985). Vários estudos em
populações onde a malária é endêmica apontam que a proteína CS recobre o
esporozoíto, sendo um dos principais alvos de reconhecimento do sistema imune
humoral, servindo também para estimular a produção de uma quantidade
significativa de IFN-y, a partir de macrófagos e células T-CD4+, sendo um dos
antígenos envolvidos no desenvolvimento de vacinas contra a malária (Kester et al.,
2009; Dodoo et al, 2011; Lumsden et al., 2011).
Muitos pesquisadores tem se esforçado para caracterizar a proteína CS do P.
vivax para testar o potencial de proteção de uma vacina à base de diferentes
peptídeos da CS (Herrera et al., 2007). Estudos com uma proteína recombinante de
CS de P. vivax expressa em levedura no final de 1980 induziram um limitado grau de
imunidade em macacos e pouquíssimas respostas imunes em seres humanos (Barr
et al., 1987; Collins et al., 1989; Herrington et al., 1991). As forças de condução
seletiva que leva a evolução de repetições da proteína CS e os mecanismos
moleculares que medeiam este processo não são bem compreendidas (Arnot et al.,
1988). Essencialmente todos os polimorfismos até agora encontrados no gene CS
de P. vivax estão associados com as unidades repetidas na porção central do gene
e as sequências que flanqueiam imediatamente esta região (De La Cruz et al.,
1987). Em todas as espécies de Plasmodium, uma única cópia do gene codifica para
uma proteína CS, com um domínio central de sequências repetidas em tandem
flanqueada por sequências predominantemente não repetidas. Esta única cópia que
codifica o antígeno de superfície altamente imunogênica da CS expressa no estágio
esporozoíto do parasito tem provado ser um importante marcador para a definição
da relação filogenética das espécies de Plasmodium (Ozaki et al., 1983; McCutchan,
1996).
37
1.6.1 Genótipos da CS do P. vivax
O P. vivax apresenta variações na porção repetitiva do domínio central de seu
gene (Rosenberg et al., 1989; Qari et al., 1992) determinando três genótipos nesta
espécie de plasmódio. A primeira forma caracterizada apresenta o nonapeptídeo
GDRA(A/D)GQPA e foi denominada VK210; considerada a sua forma clássica (Arnot
et al., 1985). Em isolados da Tailândia, Rosenberg e colaboradores (1989)
observaram variações neste nonapeptídeo e denominou-o como VK247.
Posteriormente, em Papua Nova Guiné, foi descrita a existência de outro genótipo
denominado P. vivax-like, cuja sequência da porção repetitiva da CS possui
homologia com a do Plasmodium simiovale, um parasito da malária de macacos,
originalmente encontrado em macaca sinica, no Sri Lanka (Qari et al., 1993a).
Vários estudos avaliaram a distribuição global da VK247, a qual foi detectada
em áreas endêmicas da Tailândia (Wirtz et al., 1990, Kain et al., 1992), América do
Sul, África (Kain et al., 1991), México, Afeganistão e Papua Nova Guiné (Kain et al.,
1992). Esta variante foi encontrada inicialmente como infecção mista com o genótipo
VK210 (Cochrane et al., 1990; Wirtz et al., 1990; Curado et al., 1995; Arruda et
al.,1998). No entanto, no Afeganistão, na Tailândia, na Papua Nova Guiné e no
México (Qari et al., 1992; Kain et al., 1992) observa-se também infecções simples,
fato comumente notado na Ásia do que na América do Sul (Kain et al., 1992; Qari et
al., 1992). Estudos revelaram uma ampla distribuição da P.vivax-like em diferentes
regiões do mundo (Qari et al. 1993b), como Papua Nova Guiné, Brasil, Madagascar,
Indonésia, Leste da África (Kimbi et al., 2005) e Guiana (Bonilla et al., 2006).
A partir da descrição dos genótipos da proteína CS de P. vivax das variantes
VK210, VK247 e P. vivax-like, vários estudos têm proposto a existência de outros
fatores que possam ir além das variações na porção repetitiva da proteína, tal como
a distribuição geográfica, a intensidade de transmissão, a competência vetorial, a
competência imune e respostas de tratamento e resistência aos antimaláricos, além
de outra questão: se a região repetida da CS de P. vivax é limitada (Qari et al,
1993b; Marrelli et al., 1998; Machado & Póvoa, 2000; Machado et al., 2003; Silva et
al., 2006). No Brasil, estudos sorológicos identificaram as três variantes em amostras
do Estado de São Paulo (Curado et al., 1995) e de comunidades indígenas da região
Amazônica (Arruda et al., 1998). Posteriormente, Machado & Póvoa (2000)
confirmaram, por diagnóstico molecular, a presença desses tipos variantes nos
Estados de Rondônia, Amapá e Pará, descrevendo a ocorrência da VK210 em
38
infecções puras, enquanto que a VK247 e P. vivax-like foram evidenciadas apenas
em infecções mistas. Em 2003, Machado e colaboradores realizaram novo inquérito
molecular no município de Belém, Estado do Pará, e observaram que sua
distribuição não havia mudado após quatro anos de investigação. Observaram
ainda, nenhuma associação entre os sinais e sintomas dos pacientes e os genótipos
encontrados. No entanto, verificaram diferenças na resposta terapêutica para as três
variantes, confirmando dados prévios no México com a VK210 e a VK247 (Kain et
al., 1993). Em 2004, estudo sorológico realizado no Estado de Rondônia verificou
uma maior frequência de resposta para a variante VK210, seguida pelo P.vivax-like,
e VK247, respectivamente (Oliveira-Ferreira et al., 2004). Entretanto, outra
investigação realizada em áreas endêmicas da Amazônia brasileira, observou uma
maior frequência de anticorpos contra a VK247 nos Estados de Rondônia, Pará e
Mato Grosso, quando comparada a P.vivax-like. Adicionalmente, no Estado do
Amazonas a prevalência de anticorpos para ambas as variantes foi baixa (Arruda et
al., 2007).
A distribuição das variantes foi reavaliada em cinco áreas endêmicas do
Brasil, recentemente e foi observado que o genótipo VK210 continua sendo o mais
prevalente. Entretanto, também foi demonstrada uma mudança na dinâmica da
distribuição da VK247 e da P. vivax-like, visto que ambos os genótipos foram
observados como infecções simples. Além disso, a P. vivax-like parece estar mais
bem adaptada que a VK247, sugerindo uma introdução tardia desta última nos
Estados de Rondônia, Amapá, Acre e Mato Grosso, uma vez que foi observada
como infecção simples somente em Novo Repartimento, Estado do Pará (Storti-Melo
et al., 2009).
A variação observada na região repetitiva da CSP é o que diferencia as três
variantes de P. vivax (VK210, VK247 e P. vivax-like). No entanto, foi observado que
as variações na porção central repetitiva de CSP não proporcionam diferenças
significativas na resposta de anticorpos contra antígenos do merozoíto do P. vivax,
bem como peptídeos em regiões conservadas de esporozoítos. Por outro lado, os
autores defendem que para a utilização da molécula CSP devem considerar a
influência desta variação na modulação da epidemiologia e considerar a utilização
de construções quiméricas, incluindo as sequências dos diferentes genótipos de CS
de modo a obter uma vacina protetora (Souza-Neiras, et al, 2010).
39
1.7 JUSTIFICATIVA
A malária é uma doença endêmica no Estado do Amapá, com alta incidência
em alguns munícipios deste Estado, com destaque para o Oiapoque, localizado na
região de fronteira do Brasil com a Guiana Francesa, o qual em 2010 apresentou
índice parasitário anual (IPA) de 260 casos por cada mil habitantes, classificando-o
como área de alto risco para transmissão de malária, com 3469 casos de P. vivax
nesse mesmo ano, o que representou o maior número de casos no Estado.
Ao considerar a incidência de malária pelo P.vivax no estado do Amapá em
2010, particularmente o alto IPA na região de fronteira no Município de Oiapoque, o
percentual de positividade das lâminas de verificação de cura de 13,5% em 2010,
associado às falhas terapêuticas para monoterapia com a cloroquina em 17,6% dos
pacientes participantes de um estudo realizado por Calvosa (2005) entre 2003 a
2005 no Estado, os quais apresentaram recaídas tardias em D28, que apontam para
possibilidade de resistência ou de falha terapêutica, torna-se relevante a
caracterização dos possíveis fatores determinantes das recaídas. Assim sendo, a
verificação da ocorrência da resistência e/ou dos determinantes que influenciam
para a falha terapêutica, a monitorização dos níveis sanguíneos de cloroquina e
primaquina, e a genotipagem das variantes do P. vivax emerge como ferramenta
propícia para o entendimento destes casos. Uma vez que eliminados problemas
associados à biodisponibilidade dos antimaláricos e dos outros fatores responsáveis
pelas falhas terapêuticas, pode-se creditar a recaída a resistência efetiva ou a
reinfecção.
A eficácia do tratamento do P. vivax no Brasil foi avaliada em vários estudos,
contudo, poucos trabalhos avaliaram de forma integrada os determinantes
responsáveis pela falha terapêutica, que não estão diretamente relacionados ao
fenômeno biológico da resistência do parasito ou a resposta imune do hospedeiro,
os quais têm potencial viável para interferir na interpretação dos estudos dessa
natureza. Portanto, neste estudo foram avaliadas as respostas parasitológica e
terapêutica dos pacientes com malária vivax frente ao esquema padrão de
tratamento do Ministério da Saúde do Brasil com a cloroquina e primaquina,
considerando a integralidade dos fatores externos da falha terapêutica, no contexto
socioambiental das interações fronteiriças do Brasil com a Guiana Francesa.
40
1.8 OBJETIVO GERAL
Avaliar a resposta parasitológica e terapêutica dos pacientes com malária
vivax frente ao esquema padrão da cloroquina associada à primaquina no contexto
das interações fronteiriças do Brasil com a Guiana Francesa.
1.8.1 Objetivos Específicos
1. Descrever o perfil sócio-econômico-demográfico dos portadores da malária
vivax no município de Oiapoque;
2. Determinar a densidade parasitária, o tempo de clareamento da parasitemia,
a concentração sanguínea da cloroquina e primaquina, e a classificação e
avaliação da resposta parasitológica e terapêutica dos pacientes com malária
vivax frente ao esquema padrão de tratamento considerando a integralidade
dos seguintes determinantes na eficácia terapêutica: a qualidade, validade e
armazenamento dos antimaláricos, a acurácia do diagnostico do Plasmodium,
o ajuste do peso/dose da primaquina, a orientação ao paciente e, a adesão
integral ao tratamento, no contexto socioambiental das interações fronteiriças
do Brasil com a Guiana Francesa.
3. Descrever a distribuição dos genótipos da CS do P. vivax VK210, VK247 e
Plasmodium vivax-like em amostras coletadas no município de Oiapoque.
41
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 ÁREA DE ESTUDO
O Município de Oiapoque, pertence ao Estado do Amapá, região amazônica,
extremo norte do Brasil. Faz fronteira Internacional com a Guiana Francesa
departamento ultramarino da França, separados pelo Rio Oiapoque, que flui em
direção ao nordeste do município e deságua no Oceano Atlântico. Limita-se ao sul
com os municípios de Calçoene, Serra do Navio e Pedra Branca do Amaparí, ao
leste é banhado pelo Oceano Atlântico. Está situado a 590 km da capital, Macapá,
ligando-se por via terrestre através da BR 156 (GEA, 2013).
O município possui uma sede municipal, Oiapoque, e quatro distritos:
Clevelândia do Norte (área de destacamento militar do exército); Vila Velha (área de
propriedades agro-extrativas); Vila Brasil (serve de apoio aos garimpos infiltrados na
Guiana Francesa); Taparabú (área de apoio aos pescadores da costa marítima).
Ainda fazem parte do município as reservas ambientais: Parque do Cabo Orange e
Parque das Montanhas do Tumucumaque. Além das terras indígenas, com destaque
para as etnias Karipuna, nas aldeias de abrangência do Polo Base Manga; os Galibi
Marworno e Galibi, no Polo Base Kumarumã e os Palikur, residentes nas aldeias do
Polo Base Kumenê. (GEA, 2013).
A área geográfica de Oiapoque é de 22.625 km2. Possui população de 22.986
habitantes, além de uma população flutuante de 10.000 a 12.000 indivíduos (IBGE,
2013). O clima é equatorial, com umidade relativa média de 82%. A precipitação
anual varia entre 2.700 e 3.300 mm. A temperatura média é de 27 º C, variando
entre 26 e 33 ° C. Temperaturas mais altas coincidem com os meses mais secos do
ano de setembro a novembro. (ANA, 2011).
Nesta cidade circulam moradores, visitantes, garimpeiros, militares e índios,
com fluxo populacional intenso em decorrência da fronteira com a cidade de Saint
George (Guiana Francesa), com movimento de canoas que transportam passageiros
de um lado para outro, franceses e brasileiros, em uma relação que envolve
comércio, turismo, vida social etc., mas, que também favorece a disseminação de
doenças transmissíveis como a malária (Andrade, 2005). Em 2010, Oiapoque
apresentou alto índice da doença com 260 casos por 1.000 habitantes, evidenciando
a escolha desta área estratégica de transmissão de malária para o presente estudo.
42
2.2 CASUÍSTICA
2.2.1 Abordagem Epidemiológica
Para as análises epidemiológicas, foram incluídos na pesquisa 103 sujeitos
entre agosto e dezembro de 2011, após concordarem e assinarem o termo de
consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 01). Foi aplicado um formulário
estruturado no momento da inclusão do paciente, e também durante os dias de
seguimento do tratamento (Apêndice 02) que foi baseado no manual de terapia da
malária (Brasil, 2001), bem como, foram compilados os dados do Formulário de
Notificação de Informações do Sistema SIVEP – malária (Anexo 02). Assim, em
relação à variável ocupação, foi considerada a atividade declarada pelo sujeito da
pesquisa, no momento em que este possivelmente contraiu a doença, 15 dias antes
do inicio dos sintomas, para a escolaridade, e para os anos de escolaridade utilizou-
se o critério constante na ficha notificação do paciente do Sistema de Informação
SIVEP-Malária.
2.2.2 Análise Retrospectiva dos Casos de P. vivax versus Precipitação
Os dados de incidência de malária entre os anos de 2006-2011 foram
compilados a partir de dados do Ministério da Saúde, SIVEP - Malária. Os dados de
precipitação foram obtidos no Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do
Estado do Amapá - Núcleo de Hidro meteorologia e Energias Renováveis , e do
Instituto Nacional de Meteorologia (NHMET, 2011; ANA, 2011). A precipitação
acumulada foi calculada para cada mês, a partir de janeiro de 2006 a dezembro de
2011.
2.2.3 Estudo longitudinal
Dos 103 sujeitos inclusos entre agosto e dezembro de 2011, 95 foram
integralmente acompanhados por 28 dias nos dias D0, D1, D3, D7, D14, D21 e D28.
A seleção dos pacientes foi por demanda espontânea, dentre os indivíduos
atendidos na Unidade Mista de Saúde de Oiapoque e nos Centros de Saúde Nova
Esperança e Planalto, com o seguinte critério de inclusão: ambos os sexos, com
idade entre 10 a 60 anos, exame de gota espessa positiva para malária por
Plasmodium vivax, densidade parasitária de 200 a 100.000 parasitos/µL, e somente
43
os pacientes ou os responsáveis que concordaram em assinar o TCLE. Foram
excluídos, os pacientes portadores de malária com doença crônica/infecciosa
concomitante, positivos para malária mista, grave ou complicada, as gestantes,
relatos de história de hipersensibilidade aos medicamentos do esquema terapêutico
(PAHO, 2004) e, aqueles que discordaram em participar do estudo ou não
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice
01).
2.3 TRATAMENTO DA MALÁRIA
2.3.1 Avaliação Clínica
Os casos positivos que não apresentaram sintomas clínicos de malária
complicada foram incluídos no estudo, e foram devidamente tratados e
acompanhados pela equipe técnica composta de quatro agentes notificantes, quatro
microscopistas, dois agentes de endemia, dois farmacêuticos, um biomédico e um
médico, na unidade mista de saúde do Oiapoque e nos Postos de Saúde Nova
Esperança e Planalto. Os indivíduos que apresentavam sintomas: febre, dor de
cabeça e calafrios, entre outros, em adição a positividade microscópica, foram
incluídos na avaliação após o diagnóstico.
Os sinais e sintomas foram definidos como "presente" ou "ausente" pela
equipe técnica de acordo com as medições de temperatura e também por uma
entrevista específica (apêndice 02), na qual foram avaliadas às manifestações
clínicas comuns do acesso malárico e demais achados (BRASIL, 2010). Os
pacientes foram avaliados nos dias: D0, D1, D3, D7, D14, D21 e D28. Para tal, foi
utilizada a ficha de inclusão e acompanhamento do paciente (apêndice 02) e a ficha
do SIVEP-Malária (anexo 02).
2.3.2 Esquema de Tratamento
Todos os pacientes receberam tratamento padrão do Ministério da Saúde do
Brasil; cloroquina em 3 dias e primaquina em 7 dias: 10 mg de cloroquina base/kg de
peso corporal no primeiro dia, seguido por 7,5 mg/kg, no segundo e terceiro dia,
correspondente a uma dose total de 25 mg/kg de peso corporal. A primaquina foi
utilizada em dose de 0,50 mg base/kg por sete dias, na dose total de 3,0 a 3,5 mg/kg
de peso e dose total diária em torno de 0,30mg/dia (Brasil, 2010). Foi esclarecida a
44
importância da reposição da dose na ocorrência de vômito em menos de trinta
minutos após a ingestão do medicamento, assim como, nos casos de diarreias
intensas e prolongadas, para que os pacientes entrassem rapidamente em contato
com a equipe de saúde, e assim, fossem evitadas as subdosagens inerentes destas
situações (Brasil, 2010).
Os pacientes incluídos no estudo que reuniram os critérios para
caracterização de fracasso do tratamento padrão receberam o esquema profilático
com cloroquina semanal em 12 semanas, observando-se a idade o peso e a dose de
5 mg/kg/semana, tendo-se o cuidado de certificar se houve adesão correta do
paciente ao tratamento convencional (Brasil, 2010).
2.3.3 Ajuste da Dose e Tempo de Administração da Primaquina
A Dosagem da primaquina foi ajustada de acordo com o peso do paciente,
como preconizado pelo Ministério da Saúde do Brasil (Brasil, 2010). Foi efetuada a
distribuição de balanças digital, previamente aferidas, em todos os postos de
notificação de malária que incluíram pacientes no estudo, as quais foram utilizadas
para aferir o peso corporal de todos os pacientes inseridos no estudo objetivando
ajustar a dose e tempo de administração da primaquina para pacientes com peso
igual ou superior a 70 kg, conforme quadro 4 (Brasil, 2010). A pesagem de cada
paciente foi realizada no primeiro dia de inclusão no estudo. Ressalta-se que tal
conduta não era realizada anteriormente nos locais deste estudo.
Quadro 4. Ajuste da dose e tempo de administração da primaquina para pacientes
com peso igual ou superior a 70 kg.
Faixa de
peso (kg)
Dose total de
primaquina (mg)
Tempo de administração (dias)
Esquema curto (30 mg/dia)
70-79 240 8
80-89 272 9
90-99 304 10
100-109 336 11
110-120 368 12
Fonte: Ministério da Saúde, Brasil (2010).
45
2.3.4 Avaliação de Adesão ao Tratamento
Todos os pacientes incluídos neste estudo receberam orientações claras e
cuidadosas no momento da entrega dos medicamentos sobre a importância da
adesão ao tratamento, esclarecendo sobre a necessidade de ingerir todas as doses
de primaquina para evitar a recaída pelos hipnozoítas.
A adesão ao tratamento foi avaliada pelo seguimento do tratamento, com
verificação e contagem dos números de comprimidos ingeridos e entrevista de
acompanhamento dos pacientes nos dias D0, D1, D3, D7, D14, D21 e D28 e
confirmada posteriormente pela dosagem sanguínea dos antimaláricos.
2.3.5 Classificação da Resposta Parasitológica e Terapêutica
A resposta parasitológica foi classificada em sensível (S), ou resistente tipo I,
II e III, seguindo os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) para áreas
com intensa transmissão (PAHO, 2004). Adicionalmente, foi realizada a confirmação
do diagnóstico molecular das variantes do P. vivax para todas as amostras positivas
ou recorrentes como descrito por Cassiano et al., (2011).
A cura parasitológica foi considerada como o desaparecimento da parasitemia
assexuada a partir do início da terapêutica específica, até um período de
acompanhamento de no mínimo vinte e oito dias. Os pacientes foram
conscientizados sobre a importância de realizar as lâminas de verificação de cura
nos dias pré-determinados, para confirmar a cura do tratamento.
A caracterização da falha terapêutica ao tratamento foi baseada no achado de
recorrência parasitária ao longo de 28 dias de seguimento. Já a resistência ao
tratamento foi baseada no achado de recorrência parasitária em presença de
concentração efetiva mínima de cloroquina (CQ) e desetilcloroquina (DCQ) de 100
ng/mL no sangue total, no dia da falha, no período de 28 dias, independente das
fontes de recorrências: recrudescências, reinfeções e recaídas (Baird, 2004; 2009).
2.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAS
2.4.1 Amostras Sanguíneas para as Análises Laboratoriais
Para o diagnóstico e parasitemia da malária foram coletadas por punção da
polpa digital com lancetas descartáveis amostras de sangue periférico em volume
46
aproximado de 20μL. A seguir, aplicadas em lâminas de vidro para a confecção da
gota espessa nos diversos dias de estudo (0, 1, 3, 7, 14, 21 e 28) (OPAS, 2004).
Para dosagem de antimaláricos foram coletados um tubos de 3mL de sangue
venoso com anticoagulante EDTA nos dias: 0, 3, 14, 21 e 28, e mantidas a -20o C.
Da amostra em tubo do dia inicial (D0) retirou-se alíquota de 100 a 150 µL de
sangue venoso de portadores do P. vivax para análises moleculares em criotubo
com anticoagulante EDTA, e mantidas a -20o C. Para dosagem dos antimaláricos
uma alíquota aplicados em papel de filtro (Whatman 17Chr,® Pensilvânia, USA)
secas a temperatura ambiente por 24 horas. A seguir, o papel de filtro foi
acondicionado em envelopes de papel comum (PAHO, 2006).
2.4.2 Avaliação da Qualidade Físico-química dos antimaláricos
O difosfato de cloroquina e de primaquina foram produzidos pelo Laboratório
Farmanguinhos – Fundação Oswaldo Cruz/Rio de Janeiro, Brasil e, fornecidos pela
Coordenadoria de Assistência Farmacêuticos do Amapá.
A concentração, o prazo de validade, e lotes, para primaquina 15mg:
30/06/2012V, 10060593L, e para cloroquina 150mg, 30/08/2012V, KWOG13L, foram
observados antes da administração dos fármacos, como também, foi realizado o
controle de qualidade físico-química destes medicamentos, com a determinação do
peso dos comprimidos de acordo com os métodos gerais descritos na Farmacopeia
Brasileira 5ª edição, volume 1 (ANVISA, 2010a). Foi realizado o teste de dissolução
e determinação do teor, conforme descrito na metodologia para comprimidos de
difosfato de cloroquina e para o difosfato de primaquina da Farmacopeia Brasileira
5ª edição, volume 2 (ANVISA, 2010b).
Como parâmetro de aceitabilidade da Farmacopeia Brasileira 5ª edição, os
teores de difosfato de cloroquina nos comprimidos devem estar compreendidos entre
93,0% e 107,0% do valor rotulado. Para o teste de dissolução aceitou-se que 70%
de difosfato de cloroquina e 80% de difosfato de primaquina, proporções relativas à
quantidade declarada no rótulo, se dissolvam em 45 minutos.
2.4.3 Diagnóstico e Tempo de Clareamento da Parasitemia
Para o diagnóstico das lâminas de malária, foi utilizada a gota espessa corada
pelo Giemsa, segundo a técnica de Walker e, examinadas em microscópio óptico
47
(OPAS, 1975). Todas as lâminas positivas foram revisadas pelos microscopistas
revisores do exame da gota espessa em Oiapoque, e também o diagnóstico do P.
vivax foi posteriormente confirmado por técnica molecular (KIMURA et al., 1997).
A parasitemia foi determinada pela contagem de parasitos em 100 campos
microscópicos (750 vezes), sendo este valor multiplicado por cinco, e o resultado
expresso em parasitos por milímetro cúbico de sangue. Foi considerada negativa
quando, ao examinar, no mínimo 200 campos da gota espessa, não se visualizaram
formas assexuadas do P. vivax (OPAS, 1975). A gota espessa foi realizada em D0,
D1, D3, D7, D14, D21 e D28.
A parasitemia foi classificada em: baixa, até 15.000 parasitos por mm3 de
sangue; média, de 15.001 a 60.000 parasitos por mm3 de sangue, e alta com
resultado igual ou maior que 60.001 parasitos por mm3 de sangue (Alecrim, 1981).
O tempo de clareamento da parasitemia (TCP) dos pacientes nas lâminas de
gota espessa foi verificado a cada 24 horas nos dias D1, D2, D3, D5 e D7, os
valores expressos em horas.
2.4.4 Teor Sanguíneo de Difosfato de Cloroquina e Primaquina
As concentrações sanguíneas dos antimaláricos foram quantificadas pelo
método da cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa.
A execução do procedimento analítico para determinação dos teores
sanguíneos do difosfato de primaquina e difosfato de cloroquina e a validação dos
métodos foram realizados no laboratório de toxicologia de Universidade Federal do
Pará (UFPA), com a supervisão do Professor Doutor José Luís Fernandez Vieira.
A quantificação de primaquina foi realizada após extração do plasma de
acordo com Dua e colaboradores (1996) e Ferreira (2010). As condições
cromatográficas para determinação de primaquina foram: Detector UV(254nm, Fluxo
1mL/min, Coluna RP-8,15cm, 5μm e 4,6 mm de diâmetro interno (Waters, Saint
Quentin-en-Y velines, France), Fase Móvel Acetonitrila:Metanol:Água (30:26:95,v/v),
pH=5, Volume de Injeção 50μL.
Em 100µL de amostra de plasma foi adicionado 100 µL de quinidina (padrão
interno) na concentração de 10,5µg/mL, agitou-se em vórtex por 30 segundos,
adicionou-se 100 µL de NaOH 2M, agitou-se novamente por 30 segundos,
adicionou-se 1mL de Diclorometano:Éter-metil-terc-butílico (3,5:1,v/v), agitou-se
48
durante 20 minutos. Após centrifugação a 2000 rpm por 10 minutos, removeu-se a
fase orgânica da porção superior do tubo, descartou-se a porção inferior. A fase
orgânica foi evaporada em banho maria a 62º C e depois ressuspendeu-se o
precipitado com 100 µL de fase móvel, agitou-se em vórtex. Injetou-se 50 µL no
cromatógrafo líquido de alta eficiência. O tempo médio de retenção da primaquina foi
de 8.8 minutos e da quinidina (padrão interno) foi de 7.0 minutos.
O procedimento analítico validado para determinação de primaquina
demonstrou que o método foi linear de 10 a 900ng/mL. O coeficientes de variação
médios intra e inter dias foram 8.3% e 12.1%, respectivamente. O limite de detecção
foi 5ng/mL e o limite de quantificação de 10ng/mL. A recuperação média de
primaquina foi 90.3%. A estabilidade de amostras adicionadas de primaquina foi 120
dias nas condições descritas acima (Dua e colaboradores 1996).
A quantificação de cloroquina foi realizada em sangue total após prévia
extração do papel de filtro, adaptado de Patchen e colaboradores (1983) e Lejeune e
colaboradores (2007). As condições cromatográficas foram: coluna C-8, x-terra
tamanho 4,6 x 150mm, partículas de 5µm, em fase reversa RP18, pré-coluna: x-
terra, RP18 3,9 x 20mm, partículas 5µm, fase móvel: 40% acetonitrila, 60%
(trietilamina a 1% em água), pH 10.5 fluxo: 1,2 mL/min, detecção UV: 333nm,
excitação: 330nm, temperatura 25 0C, volume de injeção 50µL.
Transferiu-se o papel de filtro contendo sangue total para tubo de
centrifugação de 15mL, adicionou-se 1,5 mL de ácido clorídrico 0.1 M e 100L de
quinidina 10,5µg/mL (padrão interno). A amostra foi centrifugada a 60 rpm por 20
minutos, e submetida a ultra som por uma hora. Removeu-se cuidadosamente o
papel de filtro. Ao tubo foi adicionado 0,5 mL de hidróxido de sódio 2 M e 6 mL de
Éter-metil-terc-butílico. Colocou-se no agitador de tubos por 15 minutos, centrifugou-
se a 2000 rpm por 10 minutos e removeu-se a fase orgânica da porção superior do
tubo, a água foi evaporada e o resíduo ressuspendido com 100 µL de fase móvel,
com agitamento em vórtex, e após injetou-se 50 µL no cromatógrafo líquido de alta
eficiência, o tempo médio de retenção da cloroquina foi de 20.0 minutos e da quinina
(padrão interno) foi de 6.0 minutos.
O método de extração da cloroquina previamente validado nas condições
laboratoriais apresentou limite de detecção de 25ng/mL e o limite de quantificação
de 38ng/mL. O método foi linear de 38 a 250ng/mL. A recuperação média foi 87%.
49
Os coeficientes de variação intra e inter dias foram 10,5% e 13%. A estabilidade de
amostras adicionadas de cloroquina foi 90 dias.
2.4.5 Diagnóstico Molecular do Genótipo da CS do P. vivax
Um total de 91 indivíduos foi avaliado nesta etapa do estudo, e foram
divididos por local de infecção no município de Oiapoque ou na Guiana Francesa. As
análises moleculares foram realizadas em parceria com o Centro de Investigação de
Microrganismos da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, Estado de
São Paulo, com a supervisão do Professor Doutor Ricardo Luiz Dantas Machado.
Para o diagnóstico molecular dos genótipos da CS do P.vivax (VK210, VK247,
e P. vivax-like) foi utilizada a técnica de PCR/RFLP descrita por Cassiano et., al.
(2011).
2.4.5.1 Reação em Cadeia da Polimerase
O DNA foi extraído pela técnica do Kit de extração Easy-DNA™ (Invitrogen,
California/USA). O protocolo de PCR/RFLP foi realizado como descrito por Cassiano
et al., (2011). O PCR foi realizado com 100 ng de DNA, o tampão (10 mmol/LTris-
HCl, PH 8,3, 50 mmol/L KCl), 1,5 mmol/L de MgCl2, 1,0 μmol/L de cada
oligonucleotídeo iniciador: PR1 (5'-TGAAAATAAGCTGAA ACAACCAG-3'), e PR2 (5
'-GGTTACACTGCATGGAGTCC AT-3'), 200 μ mol/L desoxirribonucleotideo trifosfato
(dNTPs), 2,5 U ampli-Taq DNA polimerase, 1% Betaína volume total de reação 25 μL.
Foram realizados 25 ciclos de amplificação em um termociclador, após
desnaturação inicial do DNA a 94 °C durante 5 minutos. Cada ciclo consistiu de um
passo de desnaturação de 93 °C durante 60 s, um passo de anelamento em 41 °C
durante 90 s, e um passo de extensão a 72 ºC durante 2 minutos, com uma
extensão final a 72 ºC por 10 minutos. Após o último ciclo, os produtos da PCR foram
analisados por eletroforese utilizando géis e 1,5% de agarose corados com brometo
de etídio.
As sequências dos genótipos da CS utilizadas estão disponíveis no banco de
dados do GenBank (VK210 - M11926; VK247 - M69061; P. vivax-like - L13724). A
especificidade foi alcançada utilizando o programa BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Todos os oligonucleotídeos iniciadores foram
sintetizados pelo IDT - Integrated DNA Technologies (USA). As enzimas foram
50
selecionadas contendo no mínimo um sítio de clivagem nos produtos de
amplificação, com o auxílio do programa NEBcutter V 2.0, disponível no site
http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php, resultando em fragmentos de DNA
facilmente visíveis em gel de poliacrilamida.
2.4.5.2 Digestão dos Produtos da PCR
A digestão foi realizada com 10 μL de produto da PCR e 1 U da enzima AluI
(Promega, San Diego, CA), e incubadas por 1 h a 37 ° C. Os fragmentos da restrição
foram separados por eletroforese em gel poliacrilamida 12,5%. Os géis foram
corados com brometo de etídio e analisados em um transiluminador. Para distinguir
entre os três genótipos da CS do P. vivax, foi utilizado a análise do RFLP com a
enzima AluI para identificação dos fragmentos de 54, 106, e 135 pb para VK210 e
10, 38, e 673 pb para VK247, enquanto P.vivax-like mostrou um único fragmento de
10 e 726 pb.
2.5 Tamanho amostral
Considerando o protocolo da Organização Mundial da Saúde para o estudo
nas Américas da eficiência dos antimaláricos, mais especificamente em sua
abordagem sobre a eficácia da cloroquina para o tratamento da malária pelo
Plasmodium vivax. O tamanho da amostra foi determinado considerando a
proporção de fracassos de P. vivax ao tratamento com cloroquina de não mais de
5% nas Américas, com uma população de tamanho infinito, e um nível de
significância de 5%, e uma precisão de +5%, assim sendo, seriam necessário incluir
no estudo um mínimo de 73 indivíduos. Assumindo uma taxa de abandono de 15%
durante os 28 dias de seguimento, seriam necessários no mínimo 81 indivíduos
(OPAS, 2004). Extrapolando esse quantitativo foram incluídos no estudo 96
indivíduos.
2.6 Análises estatísticas
Para elaboração dos gráficos foi utilizado o programa Microsoft Office Excel
2007 e, o programa BioEstat 5.0 para as análises estatísticas. Para o nível de
significância foi considerado o valor de p<0,05. As variáveis foram descritas como
amplitude, mediana, média, desvio-padrão, variância. As proporções comparações e
51
associações foram realizadas pelos testes: Exato de Fischer, Qui-quadrado (x2),
Mann-Whitney (U) e de Williams (G). A análise de dependência foi aplicada para
avaliar o clareamento da parasitemia (tempo de clareamento versus densidade
parasitária). (Ayres et al., 2007). A análise de correlação de Pearson determinou a
associação entre a incidência de malária por P. vivax e precipitação, utilizando as
taxas de incidência da doença e as médias mensais de precipitação acumulada no
período de janeiro de 2006 a dezembro de 2011. Para análises dos genótipos da CS
do P. Vivax foi usando a versão 2.4.1 do software estatístico R (Fundação para R
Statistical Computing, Viena, Áustria [http://www.r-project.org]). A análise da
dependência foi usada entre a distribuição das variantes P. vivax CSP e as duas
áreas estudadas. Para obter a independência entre as proporções, o teste exato de
Fisher foi aplicado, e o teste Qui-Quadrado.
2.7 Considerações Éticas
Esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade SEAMA sob o número de protocolo CEP/SEAMA Nº. 079/08 de
27/11/2008 como parte integrante do projeto principal intitulado: “Avaliação da
resposta terapêutica e medição dos níveis séricos da cloroquina e primaquina em
pacientes com malária vivax em correlação com as variantes da proteína
circumsporozoítica do Plasmodium vivax no município de Oiapoque área de fronteira
Amazônica”. (Anexo 01).
Este projeto teve o auxílio financeiro por meio do Programa de Pesquisa para
o SUS - PPSUS, sob o número de processo N0 30.000.162/2009. Convênio
CNPq/DPT/CGSAU/Registro N0 00077/2008/MCT/CNPq/SETEC-AMAPÁ. No valor
global de R$ 31.747,22 (trinta e um mil setecentos e quarenta e sete reais e vinte e
dois centavos) (anexo 03).
52
RESULTADOS
3.1. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA VIVAX NA FRONTEIRA DO
BRASIL COM A GUIANA FRANCESA
Para as análises epidemiológicas foram consideradas as variáveis: gênero e
faixa etária, ocupação, escolaridade, local de origem, e local de provável infecção,
em 103 (cento e três) pacientes portadores de malária por P. vivax não complicada
diagnosticada no município de Oiapoque.
3.1.1. Gênero e Faixa Etária
O gênero masculino predominou na amostra estudada (x2 = 7.674; p =
0,0076), correspondendo a 67% (69/103), na proporção de 2:1 do gênero masculino
em relação ao feminino.
A faixa etária mais atingida foi entre 20 a 29 anos, em seguida a de 30 a 39
anos, e a menor faixa foi de 10 a 14 anos, para ambos os gêneros, conforme
demonstra a figura 5, com predominância de casos no gênero masculino em todas
as faixas etárias (G=34.6904; p < 0.0004).
A idade média dos indivíduos foi 30 (±12 desvio-padrão) anos, e a amplitude
variou de 10 a 60 anos. As várias faixas etárias apresentaram distribuições similares
de ocorrência de malária em relação ao gênero, (U= 6; p = 0,1745).
Figura 5: Distribuição por gêneros e faixas etárias dos pacientes com malária vivax em Oiapoque. Fonte primária. com malária vivax em Oiapoque.
53
3.1.2. Ocupação
Em relação às atividades exercidas pelos indivíduos nos 15 dias prévio ao
início dos sintomas, a garimpagem ilegal foi a mais relatada, compreendendo 30,1%
(31/103) dos casos (G = 54.7548 p < 0.0001), seguida de outras atividades, como
consta na figura 6. Não houve relato para mineração legal.
3.1.3. Escolaridade
A distribuição da educação por nível de escolaridade (figura 7) demonstrou
que o maior percentual 21,4% (22/103) de pessoas com malária correspondeu à 5ª a
8ª série incompleta (G = 38.2319; p < 0.0001). O percentual por anos de estudos
demonstrou que 53,0% dos indivíduos desta pesquisa, estudaram 8 anos ou menos,
o que representa escolaridade abaixo da conclusão do ensino fundamental, a qual,
no Brasil é de 9 anos. Por outro lado, o menor percentual (16,8%) foi dos indivíduos
que declararam até doze anos de estudos, correspondendo ao 2º grau completo.
Figura 6: Distribuição das atividades exercidas pelos pacientes com malária nos 15 dias prévios aos sintomas. Fonte primária.
Figura 7: Distribuição percentual do nível de escolaridade dos pacientes com malária vivax em Oiapoque. Fonte primária.
54
3.1.4. Local de Origem dos Pacientes
Em relação ao lugar de origem (nascimento) dos pacientes do estudo, foram
referidos três Estados como demonstra a figura 8, sendo o Amapá (44,55%) o local
de maior procedência, os quais foram subdividido em pessoas nascidas no próprio
município de Oiapoque (23,76%) e em outros municípios desse Estado (20,79%),
seguido dos Estados do Pará (30,70%) e do Maranhão (24,75%), que totalizaram
55.45% dos pacientes que migraram para essa fronteira (x2 = 6.193; p = 0.045).
3.1.5. Local Provável de Infecção na Fronteira Franco-brasileira
Foram relatados 71 casos autóctones de malária por P. vivax originários do
Oiapoque, e 32 de casos importados da Guiana Francesa, na proporção de 2:1, (x2
= 14.44; p = 0.0002). Dos casos importados, vários garimpos clandestinos foram
relatados como local provável de infecção, com o maior percentual oriundo do
garimpo do Sikini com 21,9% dos casos (G = 36.2417; p < 0.0001), (figura 9).
Figura 8: Proporção de pacientes com malária vivax em Oiapoque por local de origem.
Figura 9: Casos de malária por P. vivax segundo local provável de infecção, e importados dos garimpos clandestinos da Guiana Francesa para Oiapoque. Figura adaptada de Amapá Oiapoque SVG e French Guiana Political Map 1992.
55
3.1.6. Variação Pluviométrica e a Incidência de Malária por P. vivax
Ao considerar precipitações médias mensais nos anos de janeiro de 2006 a
dezembro de 2011, percebeu-se que os meses de março, abril e maio apresentaram
as maiores precipitações pluviométricas médias (385 mm, 449 mm e 429 mm
respectivamente), as quais reduziram nos meses subsequentes até alcançar as
menores médias mensais de precipitações (49 mm, 58 mm, 75mm) que
corresponderam aos meses de setembro, outubro e novembro, começando a
aumentar novamente a partir do mês de dezembro. Ao comparar a variabilidade
intra-anual da taxa de incidência, considerando a média mensal da incidência de
malária no período de janeiro de 2006 a dezembro de 2011, um platô foi observado
para o P. vivax: em outubro e novembro (meses mais secos), (Figura 10). Houve
forte correlação negativa entre a taxa de incidência mensal da malária vivax e a
precipitação pluviométrica mensal acumulada (p = 0.0026), nos anos de janeiro de
2006 a dezembro de 2011, no trimestre mais chuvoso houve menor incidência de
casos e no mais seco maior incidência da doença. Porém, observou-se pelo
coeficiente de correlação de Pearson (r Pearson - 0.78) que, somente 78% da
incidência da doença está associada de forma inversa a precipitação pluviométrica.
Figura 10: taxas intra-anual de incidência de malária versus chuvas mensais acumuladas em Oiapoque no período (2006-2011). As taxas de incidência foram calculadas a cada mês para P. vivax. Fonte primaria.
56
3.2 RESPOSTA PARASITOLÓGICA E TERAPÊUTICA PARA MALÁRIA VIVAX E
O CONTROLE DOS DETERMINANTES DA FALHA TERAPÊUTICA
De agosto a dezembro de 2011, 103 (cento e três) pacientes portadores de
malária por P. vivax não complicada diagnosticada no município de Oiapoque foram
inicialmente incluídos no estudo. Destes, 95 (noventa e cinco) casos foram
integralmente acompanhados e seu progresso foi avaliado por vinte e oito dias.
3.2.1 Determinação da Densidade Parasitária dos Pacientes
A parasitemia dos 95 participantes determinada no dia inicial do tratamento
em D0 variou de 200 a 36.000 parasitos/mm3. A contagem das formas assexuadas
foi de 1168 (± 3,32) parasitos/mm3 (média ± desvio padrão), o perfil da parasitemia
apresentou um pico em D0, com posterior declínio a partir de D2, até zerar
completamente em D28, tabela 1, com exceção de um paciente que apresentou 400
parasitos/mm3 em D28. Foi observada concordância do diagnóstico da espécie de
plasmódio de 100%, quando comparados os resultados dos microscopistas com os
microscopistas revisores de Oiapoque, bem como, houve 100% de concordância
com o diagnóstico do P. vivax por técnica molecular.
A classificação da densidade parasitária dos pacientes no dia inicial (D0)
revelou baixa parasitemia (nº parasitos/mm3 < 15.000) em 94,7% dos pacientes,
média parasitemia (nº parasitos/mm3 15.001–60.000) em 5,3% pacientes e ausência
de altas parasitemias (nº parasitos/mm3 > 60.000), (x2=169,88 p < 0.0001).
Tabela 1 – Densidade parasitária dos pacientes com malária vivax no município de
Oiapoque, Estado do Amapá.
Parasitos: forma assexuada Dias de seguimento
D0 D3 D7 D14 D21 D28
Média geométrica (V/mm3) 1167,86 40,33 0 0 0 0
Desvio padrão geométrico ± 3,32 ± 4,07 0 0 0 0
Mínimo (parasitos/mm3) 200 5 0 0 0 0
Máximo (parasitos/mm3) 36000 350 0 0 0 0
Paciente com recaída (parasitos/mm3) 3000 350 0 0 0 400
No de pacientes 95 19* 0 0 0 01**
* Pacientes que apresentaram parasitemia positiva em D3. Fonte: Dados primários, 2013.
* * Paciente que apresentou parasitemia positiva em D28
57
3.2.2 Sinais e Sintomas
Os principais sintomas foram febre (88%), calafrios e cefaleia (86%),
sudorese (83%), mialgia (43%) e náuseas (56%). Febre foi à manifestação clínica
inicial mais frequente presente em 88% dos casos, mas em 12% dos casos, a febre
não foi à queixa inicial, outros sintomas foram citados tais como: cefaleia, mialgia e
náuseas. A tríade malárica clássica (febre, calafrio e cefaleia) ocorreu em 46,7% dos
casos. Houve correlação entre a parasitemia e os sinais e sintomas (Pearson =
0.9532; p< 0.0001). Quanto mais elevada a densidade parasitária, houve mais
evidências de sinais e mais relatos de sintomas os quais foram quantificados em
leve = 1, moderado = 2 e intenso = 3.
3.2.3 Tempo de Clareamento da Parasitemia dos Pacientes com P. vivax
O tempo de clareamento da parasitemia (TCP) iniciando em D0 foi expresso
como média e desvio padrão, com intervalo de 48 a 120 horas, o clareamento da
parasitemia ocorreu na primeira semana de tratamento. A maioria dos pacientes
apresentou clareamento da parasitemia assexuada em D3, em torno de 72 horas
após o início do tratamento, porém, 20% dos pacientes ainda apresentaram
parasitemia positiva neste intervalo de tempo. Contudo, todos tiveram a negativação
da parasitemia confirmada em D7, em torno de 168 horas após o início do
tratamento, (figura 11). Houve diferença estatística entre o tempo de clareamento e
a média da parasitemia dos indivíduos, uma vez que, pacientes com média de
parasitemia mais alta, apresentaram clareamento após o D3 (Test Z; p=0.0284).
Figura 11: Tempo de clareamento da parasitemia em horas dos pacientes com P. vivax em Oiapoque. Fonte: dados primários.
58
3.2.4 Números de Episódios Prévios de Malária
O maior relato foi de quatro ou mais episódios anteriores da doença,
representando 46% do total. Já os primoinfectados corresponderam a 19% (figura
12). Houve diferença significativa entre o tempo de clareamento da parasitemia e a
ocorrência ou não de episódios anteriores de malária (Teste X2, p < 0.0001), sendo
que, 33,3% (6/18) dos primoinfectados apresentaram clareamento posterior ao
terceiro dia, enquanto que, somente 15,6% (12/77) daqueles com relatos de
episódios anteriores da doença tiveram clareamento posterior ao terceiro dia.
3.2.5 Classificação da Resposta e Adesão ao Tratamento
Dos 103 pacientes incluídos no estudo, 95 aderiram integralmente ao
esquema de tratamento da cloroquina por 03 dias e primaquina por 07 a 10 dias. Ao
longo da pesquisa, oito pacientes foram excluídos, seis por perdas no seguimento
do tratamento e dois por terem sido reinfectados por Plasmodium falciparum.
Noventa e quatro (99,0%) participantes acompanhados no estudo tiveram
resposta clínica adequada (RCA) ao tratamento, com o completo desaparecimento
dos sinais e sintomas, e completo clareamento dos parasitos, sendo classificados
parasitologicamente como sensíveis (S). Um participante (1,0%) apresentou
fracasso tardio do tratamento (FTT), com a resposta parasitológica classificada no
padrão de resistência tipo RI, tabela 2. Este paciente recebeu tratamento com
esquema profilático de cloroquina semanal por 12 semanas, na dose de 5
mg/kg/semana.
O Perfil parasitológico do único paciente (1,0%) que apresentou Lâmina de
verificação de Cura (LCV) positiva para o P. vivax em D28 encontra-se demonstrado
na figura 13.
Figura 12: Distribuição dos pacientes quanto ao número de infecções maláricas. Fonte: Dados primária.
59
Tabela 2 – Classificação da Resposta Parasitológica e Terapêutica
Resposta clínica RCA FTT FPT
Resposta parasitológica S RI RII RIII Total
Esquema
Cloroquina + Primaquina
Nº % Nº % Nº % Nº %
94 99.0 01 1.0 -- -- -- -- 95
Legenda: RCA = Resposta clínica adequada, FTT = Fracasso tardio do tratamento,
FPT = Fracasso precoce de tratamento, S = Sensível, RI = Resistência tipo I,
RII = Resistência tipo II, RIII = Resistência tipo III, Nº = Número absoluto. Fonte primária.
3.2.6 Ajuste Peso/Dose/Tempo de Administração da Primaquina
Apenas um terço dos pacientes (32.6%) apresentou peso igual ou superior a
70 kg e recebeu ajuste da dose e do tempo de administração da primaquina de
acordo com esquema curto do Ministério da Saúde. Dois terços dos pacientes
(67,4%) com peso menor que 70 kg não necessitaram deste ajuste. Ressalta-se que,
o paciente com recaída não necessitou de ajuste de dose da primaquina, visto que,
seu peso foi de 45,000 kg. A distribuição por peso dos dois grupos está descrita na
tabela 3.
O tempo de tratamento do esquema curto foi ampliado variado de oito a dez
dias para alcançar a dose total de primaquina nos pacientes com peso corporal
superior a 70kg. As doses foram ajustadas com administração de 2 comprimidos de
15mg para cada dia, em torno de 0,30mg/dia. A dose total de primaquina variou de
240mg até 304mg naqueles pacientes que necessitaram de ajuste das doses em
Figura 13: Perfil parasitológico do paciente com fracasso tardio ao tratamento da malária por P.vivax. Fonte primaria.
60
função do peso. Contudo, as concentrações plasmáticas de primaquina foram
semelhantes entre os pacientes com peso inferior a 70 kg e aqueles com peso igual
ou superior a 70 kg (Teste Z = 1.5195; p= 0.0643), nos quais o ajuste de doses foi
realizado.
Tabela 3 – Descrição dos pacientes em relação ao peso.
Descrição Peso < 70 kg Peso = ou > 70kg
Tamanho da amostra 64 31
Mínimo 31,000 70,100
Máximo 68,800 92,000
Média Aritmética 56,341 77,842
Desvio Padrão 9,130 5,346
Paciente com recaída 45,000 -
Fonte: Dados primários.
3.2.7 Qualidade Físico-química dos Antimaláricos
O peso médio dos comprimidos para o difosfato de cloroquina foi de 412 mg,
com variação unitária de -2,50% a 3,30% e para o difosfato de primaquina o peso
médio foi de 128 mg, com os variação unitária de -5,30% a 4,25%. Nenhuma
unidade de comprimidos estava acima ou abaixo do dobro das porcentagens de
peso recomendado pela Farmacopeia Brasileira, e todas estavam dentro dos limites
(-7,5% a 7,5%) de aceitação de comprimidos no teste de determinação de peso em
formas farmacêuticas.
O teste de dissolução dos comprimidos de difosfato de cloroquina apresentou
valor de cedência de 78% (± 2,4 I.C) em 45 minutos, superiores ao valor de
tolerância mínima de 70%. Os comprimidos de difosfato de primaquina
apresentaram valor de cedência de 85% (± 3,2 I.C) em 45 minutos, superiores ao
valor de tolerância mínima de 80%, e assim, aprovados no referido teste.
O teste de teor para os comprimidos de difosfato de cloroquina apresentou
valores entre 96,33% a 103,45%, do valor rotulado com média de 98,31% e desvio
padrão relativo de 2,11%. Já os comprimidos de difosfato de primaquina
apresentaram valores entre 98,12% a 101,13%, do valor rotulado com média de
99,87% e desvio padrão relativo de 2,28%. Portanto, os comprimidos de ambos os
61
fármacos se encontraram na faixa de aceitabilidade de 93,0% a 107,0% do valor
rotulado, segundo recomendações da Farmacopeia Brasileira.
3.2.8 Dosagem Sanguínea do Teor dos Antimaláricos
As determinações das concentrações plasmáticas do difosfato de cloroquina
encontram-se descritas na tabela 4. Os valores encontrados nos dias D0 (antes do
início do tratamento), D1, D3, e D28 (para o paciente com recaída) foram expressos
como média e desvio padrão.
Destaca-se que, as concentrações no sangue total de cloroquina de todos os
pacientes foram superiores a 100ng/mL (Baird et al., 2004), inclusive do paciente
que apresentou recaída com parasitemia positiva no 28º dia de seguimento. Tais
achados caracterizaram a absorção adequada do medicamento.
As concentrações plasmáticas do difosfato de primaquina nos dias D0 (antes
do tratamento), D1, D3, e D28 foram expressas como média e desvio padrão (tabela
4). Após administração por via oral da primaquina, todos os pacientes alcançaram
níveis de concentrações plasmáticas superiores a 13.1 ng/mL, valor de base para
adequada absorção em D3 (Bathia et al., 1986).
Tabela 4 – Concentração sanguínea de difosfato de cloroquina e de primaquina.
DESCRIÇÃO
DIFOSFATO DE CLOROQUINA
EM ng/mL
DIFOSFATO DE PRIMAQUINA
Em ng/mL
Dias de seguimento
D0 D1 D3 D28
D0 D1 D3 D28
No de pacientes
95 95 95 1
95 95 95 1
Teor Médio
ND 461.1 119.6 -
ND 32.47 50.8 -
Desvio Padrão
ND 224.9 495.9 -
ND 17.63 22.1 -
Teor Mínimo
ND 209 286 -
ND 13.6 18.0 -
Teor Máximo
ND 992 2213 -
ND 99.5 98.3 -
Paciente com recaída
ND 324 1120 210
ND 58.9 26.2 ND
Fonte: Dados Primários. ND: Não detectado.
62
3.3 GENÓTIPOS DA CS DO P. vivax NA FRONTEIRA FRANCO-BRASILEIRA
As frequências genotípicas da CS do P. vivax de amostras sanguíneas de 91
pacientes estão demonstradas na figura 14. Nas infecções simples o genótipo
VK210 foi o mais comum, seguido pelo P. Vivax-like e VK247. Foram detectados
todos os três genótipos CS em infecções mistas. O VK210 com VK247 e o VK210
com P. vivax-like, no entanto, a distribuição do genótipo VK247 pareceu ser mais
homogênea que P. vivax-like na área de estudo, prevalecendo em 26.4% das
amostras (análise de dependência, p = 0,030). Os genótipos P. Vivax-like e VK247
foram mais freqüentemente encontradas em associação com um dos outros dois
genótipos do que em infecções simples. No geral o genótipo menos frequentemente
encontrado tanto em infecções simples, quanto em associação com um dos outros
dois genótipos foi o P. vivax-like. A amostragem dos parasitos realizada em
Oiapoque seguiu um padrão similar de genótipos da CS do P. vivax observadas em
outras áreas da região amazônica brasileira em que os três genótipos foram
encontrados como infecção simples e mista, sendo o VK 210 e VK247 mais
associado com uma das infecções mistas (Machado & Póvoa, 2000).
A distribuição das variantes dos genótipos da CS do P. vivax por provável
local de infecção P. vivax diagnosticado em Oiapoque, no Brasil, na fronteira com a
Guiana Francesa, estão descritas na tabela 5. O mesmo genótipo nas infecções
simples o VK210 foi o mais prevalente, tanto em Oiapoque, quanto nos garimpos da
Guiana Francesa. Os mesmos genótipos nas infecções mistas o VK210 + VK247,
Figura 14: frequência em percentual dos genótipos da CS do P. vivax nas amostras sanguíneas em Oiapoque. Fonte primaria.
63
também foram os mais prevalentes para os ambos locais de infecção. Não houve
diferenças estatisticamente significativas para os genótipos da CS e o provável local
de infecção entre as amostras de sangue infectadas com P. vivax coletadas dos
pacientes oriundos dos garimpos da Guiana Francesa, e as amostras coletadas dos
pacientes residentes no município de Oiapoque (Teste Qui-Quadrado, p = 0.1963 >
0.05).
Tabela 5. Distribuição das variantes do P. vivax por local de infecção, de moradores
de Oiapoque e infectados nos garimpos da Guiana Francesa.
Fonte: Dados primários.
A figura 15 demonstra os três genótipos da CS do P. vivax, pela análise do
RFLP com a enzima AluI para identificação dos fragmentos das respectivas
variantes: VK210 fragmentos de 54, 106, e 135 pb; VK247 fragmentos de 10, 38, e
673 pb; P.vivax-like mostrou um único fragmento de 10 e 726 pb.
Figura 15: Restrições e digestão por PCR-RFLP com a enzima AluI para identificação dos fragmentos das variantes do P. vivax VK210, VK247 e P.vivax-like. Fonte primária.
64
As características básicas dos indivíduos com malária de acordo com o
Genótipo da CS do P. vivax na fronteira do Brasil com a Guiana Francesa, estão
descritas na tabela 6. As médias geométricas da parasitemia foram de 1.323
parasitos/mm3 (1001-1750) para o VK210, 1205 parasitos/mm3 (744-1951) para o
VK 210 + VK247 e 750 parasitos/mm3 (295 - 1890) para infecções do VK210 + P.
vivax-like.
Tabela 6. Características básicas e a parasitemia por Genótipo da CS do P. vivax.
Variantes circunsporozoíta do P. vivax
VK210 VK210 + VK247 VK210 +P. vivax-like
n
57
24
7
Gênero, % 63.1 75.0 85.7 Idade* 26 (21.6 – 29) 28 (21 – 34.8) 19 (15.4 – 25.2) Parasitos/ µLǂ 1323 (1001 – 1750) 1205 (744 – 1951) 750 (295 – 1890) * Media (IQR);
ǂ Média Geométrica (95% CI); Fonte: Dados primários.
Apenas um caso de recidiva foi observado, e nestas duas amostras (D0 e
D28) foi encontrado o VK210. No entanto, os produtos de PCR foram purificados e
submetidos para a reação de sequenciamento. Nucleotídeos das sequências
genéticas CS encontradas foram comparadas com as sequências disponíveis no
banco de dados GenBank (VK 210, número de acesso 11926; VK247, número de
acesso M69061; P. vivax-like, número de acesso L13724). Embora, o mesmo
genótipo da CS do P. vivax tenha sido encontrado nas duas amostras, os dois
seguimentos gênicos da CS produzidos diferiram em relação ao número de
repetições, e em algumas alterações de nucleotídeos na região de repetição central.
65
4 DISCUSSÃO
4.1 Abordagem Epidemiológicos da Malária na Fronteira Franco-Brasileira
As características socioeconômicas e culturais, bem como, as interferências
do homem sobre o ambiente influenciam significativamente o adoecimento por
malária, uma vez que podem favorecer o contato do homem com o vetor e
consequentemente com o agente etiológico (Marques et al., 1982).
No presente estudo, apesar dos casos de malária por P. vivax ocorrerem em
ambos os gêneros, houve predominância em adultos do gênero masculino. As faixas
etárias de maior incidência da doença, para ambos os gêneros, correspondem ao
segmento principal da população economicamente ativa (IPEA, 2012). Estes
resultados corroboram estudos realizados em outros Estados da Amazônia
brasileira, os quais relacionaram a malária com o gênero, a idade, e a faixa-etária
(Calvosa, 2005; Barbosa et al., 2006; Teixeira, 2011). Entretanto, o fato da doença
acometer aos homens em maior proporção, permite estabelecer relação com um dos
principais motivos de atração da população migrante masculina para essa área de
fronteira do Brasil, que são os garimpos clandestinos, situados em áreas de elevada
incidência de malária na Guiana Francesa.
Parte da relação entre atividade ocupacional e a situação de saúde do
indivíduo pode ser atribuída aos diferentes fatores de riscos nas condições de
trabalho e a um menor suporte social nas classes menos favorecidas (Schrijvers et
al., 1998). No presente estudo, a garimpagem ilegal foi a principal atividade
ocupacional relatada. Partindo dessa premissa, há de se considerar o panorama da
ocupação, nos garimpos clandestinos localizados na Guiana Francesa, os quais
estão situados em locais de difícil acesso, no interior da floresta amazônica, com
precárias condições de moradia e saneamento básico, com muitos casos de malária
e grande risco de exposição ao vetor transmissor, somada a ausência de assistência
à saúde. ou seja, a atividade ocupacional exercida por esses indivíduos em
condições desfavoráveis, está atuando como fator de risco para manutenção e
transmissão da malária nessa região.
O nível de escolaridade é qualificado como um elemento fundamental a ser
considerado tanto na análise dos determinantes da saúde quanto na abordagem da
população para execução de práticas de promoção e recuperação da saúde
(Batistella, 2007). Nos resultados deste estudo, observa-se a predominância de
66
indivíduos com baixo nível de ensino. Nesta perspectiva, a baixa escolaridade dos
indivíduos tem contribuído como importante preditor social na incidência da doença
na região, visto que, limita a procura por emprego formal no mercado de trabalho,
levando-os a buscar alternativas econômicas comuns nessa região de fronteira,
como os garimpos clandestinos, contribuindo assim, para a manutenção da
enfermidade.
No contexto da migração e saúde, existe uma tendência consensual para
considerar que a migração populacional pode ou não representar fator de risco à
saúde (Dias & Gonçalves, 2007; Carballo, 2007). No caso da malária, a mobilidade
populacional se revela como um processo social determinante que influencia a
densidade demográfica em determinadas áreas e que favorece a transmissão da
doença (Souza et al., 1986; Costa, 2982).
Os resultados encontrados demonstram primeiramente um considerável
fluxo migratório para essa área de fronteira, constituído pela parcela significativa da
população flutuante em constante deslocamento (76,24%), vindo de outros
municípios do próprio Estado do Amapá ou dos Estados do Pará e Maranhão.
Destacam-se também, os casos de malária importada da Guiana Francesa que
corresponderam a 31% da casuística e corroboram com os dados informados pelo
Sistema de Informação para Malária do Ministério da Saúde do Brasil, segundo o
qual, em 2010, ocorreram 5.329 casos de malária em Oiapoque, destes 1.410
(26,5%) foram importados da Guiana Francesa (Brasil, 2012). Revelando assim, o
papel da migração transfronteiriça na transmissão e manutenção da doença.
Particularmente, quando se observa a disseminação de garimpos clandestinos na
Guiana Francesa em locais de florestas densas, favoráveis à proliferação do vetor e
da doença. Além disso, não há disponibilidade de tratamento gratuito e adequado,
nesses assentamentos ilegais, fazendo com que as pessoas com sinais e sintomas
de malária, retornem ao Oiapoque (Brasil) em busca de tratamento. Adicionalmente,
este fluxo contribui para transmissão e propagação da doença entre os moradores
do município, sugerindo um processo de automanutenção da malária nessa região.
Os achados do presente estudo corroboram com Andrade (2005) e Peiter et. al.
(2008) em referência a associação positiva entre os efeitos da migração sobre a
distribuição e a incidência de malária na fronteira Franco-brasileira.
Alguns estudos no Estado do Amapá e na Amazônia investigaram a relação
entre precipitação e incidência de malária, e mostraram variada associação entre
67
número de casos de malária e precipitação pluviométrica (Andrade Filho et. al.,
2008; Parente, 2008; Amanajás, et. al., 2011; Omena et al., 2011). Em Oiapoque, a
incidência de casos aumentou quando ocorreu a diminuição da precipitação das
chuvas intensas, e alcançou pico nos meses mais secos, sugerindo que esse
aumento de incidência após período de chuvas intensas propicia o aumento da
transmissão do parasito. Provavelmente pelo surgimento de criadouros propícios,
que favorecem o aumento da biomassa de mosquitos vetores da doença.
Em Oiapoque, o pico de malária vivax ocorreu em outubro e novembro, com
padrões de transmissão similares aqueles observados no município francês de
Saint-Georges, na margem oposta do rio Oiapoque, enquanto que em Camopi, na
Guiana Francesa, um grupo rural de aldeias indígenas ao longo do Rio Oiapoque,
situada a 92,5 km do município do Oiapoque, esses meses corresponderam ao
período de menor incidência (Stefani, et al., 2011). Apesar da característica urbana
de Oiapoque e rural de Camopi, e a população de estudo em Oiapoque ter sido
constituída por adultos enquanto que em Camopi por crianças (Stefani, et al., 2011),
os ambientes são geograficamente próximos e com características semelhantes,
esperando-se que os padrões sazonais fossem similares. Uma hipótese para
justificar tal discrepância seria fundamentada no fato de que as migrações sazonais
dos garimpeiros influenciam a distribuição epidemiológica da malária em Oiapoque,
criando assim, uma diferença sazonal entre os dois locais. Outra possibilidade seria
a possível diversidade de ecologia e comportamento das populações de vetores.
Em Oiapoque, os locais de reprodução dos vetores dependem das chuvas.
Há muitas várzeas e áreas úmidas na cidade e seus arredores, em Camopi, os
locais de reprodução estão ligados aos rios e riachos (Stefani, et al., 2011; Girod, et
al., 2011). As diferenças geográficas entre o rural e os sítios urbanos também
contribuem para este quadro. Contudo, os padrões migratórios sazonais de
pacientes com malária devem ser investigados associados a estudos entomológicos
e ambientais nesta área de fronteira, e carecem de avaliação mais detalhada. Além
do que, estudos posteriores mostraram relações significativas entre o risco de
transmissão da malária e a cobertura do solo e/ou seu uso na região (Stefani, et al.,
2013). Diferenças de cobertura e formas de uso do solo podem modificar a dinâmica
de transmissão. Um maior tempo de estudo e de acompanhamento seria necessário
para compreender a dinâmica de transmissão da malária nesses dois ambientes.
68
4.2 A Eficácia da Terapêutica na Malária Vivax
No que se refere à densidade parasitária, a maioria dos pacientes apresentou
baixa parasitemia, com média geométrica de 1.168 (± 3,32) parasitos/mm3,
evidenciando a eficácia da rede de diagnóstico e a rápida procura do paciente pelo
diagnóstico e tratamento. Não houve casos de hiperparasitemia, visto que, esta é um
achado laboratorial de malária grave, e foi considerado critério de exclusão no
presente estudo.
A cura parasitológica é avaliada convencionalmente pelo clareamento da
parasitemia no esfregaço de sangue periférico (White & Krishna, 1989). O tempo de
clareamento da parasitemia (TCP) observado neste estudo evidenciou a
manutenção da sensibilidade do P. vivax à cloroquina, visto que, foi observado o
clareamento em D3 para maioria (80%) dos pacientes, e todos (100%) apresentaram
clareamento até D7.
Na região Amazônica brasileira, vários estudos e relatos têm abordado a
avaliação da eficácia de tratamento para a malária por P. vivax (Da Silva et al., 1989;
Garavelli; Corti, 1992; Ventura, 1997; Alecrim; Alecrim; Macêdo 1999; Alecrim, 2000;
Villalobos-Salcedo et al., 2000; Abdon et al., 2001; Soto et al., 2001; Castillo et al.,
2002; Calvosa, 2005; Filho-Franklin et al., 2007). Entretanto as diferenças nos
critérios metodológicos dificultam as comparações com os dados deste estudo, tanto
pelos diferentes esquemas terapêuticos utilizados, quanto pela ausência de relatos
dos níveis plasmáticos ou sanguíneos dos antimaláricos.
No Estado Amapá, Couto e colaboradores (1993) avaliaram a evolução
temporal da resistência in vitro do Plasmodium falciparum a antimaláricos em área
de prospecção de ouro entre 1983 e 1990, e depois Couto, (2001) estudou a
evolução temporal da resistência in vitro do Plasmodium falciparum aos
antimaláricos cloroquina, amodiaquina, quinino e mefloquina no Lourenço-AP.
Posteriormente, Calvosa (2005), analisou no período de 2001 a 2005, a resistência e
eficácia ao tratamento da malária vivax usando a cloroquina como monoterapia,
avaliando os aspectos clínicos, parasitológicos e terapêuticos. Entretanto, este é o
primeiro estudo no Estado, que avaliou a resposta parasitológica e terapêutica dos
pacientes com malária por P. vivax usando esquema padrão de cloroquina e
primaquina, conforme recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil,
considerando a integralidade dos determinantes externos da falha terapêutica, no
contexto das interações transfronteiriças do Brasil com a Guiana Francesa.
69
No Presente estudo 99,0% dos pacientes apresentaram resposta
parasitológica adequada ao final do seguimento clínico laboratorial, demonstrando a
eficácia da associação primaquina e cloroquina nesta região fronteiriça Franco-
Brasileira. Dado similar foi obtido por Teixeira (2011) em pacientes oriundos da
Cidade de Belém-PA, ao empregar esquema terapêutico semelhante e comprovar
adesão mediante o atendimento das concentrações sanguíneas adequadas de
cloroquina e primaquina, no qual, obteve taxa de cura de 100%. Entretanto,
discordam dos registros epidemiológicos do SIVEP-Malária/MS de Oiapoque, visto
que, no ano de 2009, foi observado 14,2% de positividade das lâminas de
verificação de cura (LVC) e 13,5% em 2010. Deve-se considerar o tempo de
realização da LCV, que neste estudo foi de 28 dias, em contraponto aos 60 dias
preconizados pelo Ministério da Saúde após tratamento de P.vivax. Neste sentido,
os dados deste estudo indicam alta efetividade da cloroquina contra os estágios
sanguíneos do P. vivax, não assegurando, entretanto, a cura radical, visto que a
recaída com o tratamento no Brasil pode ocorrer até seis meses após o término do
tratamento. Contudo, o ajuste da dose, em função do peso dos pacientes,
modificando a dose diária e o tempo de administração, certamente contribuiu para
cura da infecção em até vinte e oito dias, pois é notória a associação entre a eficácia
hipnozoiticida e as doses de primaquina ajustadas ao peso Corporal (Schwartz, et
al., 2000; Libonati & Ventura, 2007; Santos, et al., 2010; Fernando, et al., 2011).
O controle de outros fatores responsáveis pela falha terapêutica, não
diretamente relacionada à resistência do parasito, também pode ter contribuído
positivamente para resposta adequada ao tratamento. A qualidade intrínseca do
medicamento fora dos padrões ideias para consumo humano ou o
acondicionamento inadequado são relevantes em algumas áreas endêmicas no
mundo (Nogueira, 2011; Pribluda et al., 2012, Evans et al., 2012). No entanto, neste
estudo os antimaláricos receberam cuidadosa observação do prazo de validade,
concentração e definição de lotes específicos. Ademais, o prévio controle de
qualidade físico-química apresentou concentração dos princípios ativo que
asseguraram sua qualidade.
A adesão é fundamental para o sucesso terapêutico. A orientação quanto a
quantidade e horário da administração dos antimaláricos são indispensáveis (Fogg
et al., 2004; Conteh, et al., 2007, Pereira, et al., 2011). Como estratégia para
melhorar a capacidade de compreensão dos pacientes e, por conseguinte aumentar
70
a adesão ao tratamento foram utilizadas figuras simplificadas do ciclo biológico do P.
vivax, e os respectivos sítios de ação de cada fármaco, para contornar a dificuldade
do entendimento, devido ao baixo nível de escolaridade percebido durante as
entrevistas de inclusão dos participantes. Dar a certeza aos pacientes de que eles
seriam acompanhados até o termino do seu tratamento, foi o principal argumento
utilizado para convencê-los. A adesão ao tratamento também foi confirmada por
seguimento do tratamento, com verificação e contagem dos números de
comprimidos ingeridos e entrevista de acompanhamento dos pacientes nos dias D0,
D1, D3, D7, D14, D21 e D28 e posteriormente pela e dosagem sanguínea de teor
adequada dos antimaláricos.
As concentrações sanguíneas de cloroquina podem ser utilizadas como
métricas nos estudos de adesão no tratamento de malária por P. vivax, auxiliando na
interpretação das falhas terapêuticas. As concentrações de cloroquina determinadas
neste estudo corroboram achados prévios em outros grupos populacionais (Filho-
Frankiln et al., 2007; Teixeira, 2011, Marques et al., 2013). Na avaliação da resposta
terapêutica à cloroquina no tratamento de malária por P. vivax tem especial
importância à medição dos níveis sanguíneos do medicamento para confirmação
dos casos de falha terapêutica ou resistência do parasito (Baird, 2004; 2009)
Baseando-se nos critérios para a classificação da resposta terapêutica da malária
por P. vivax em sensíveis ou resistentes, percebe-se que o paciente com recaída em
D28 apresentou concentração sanguínea de cloroquina superior a 100 ng/mL,
comprovando a adequada absorção do medicamento, indicando provável resistência
desta cepa à cloroquina. As concentrações sanguíneas de primaquina observadas
no decorrer do tratamento, se assemelham àquelas previamente reportadas em
Indianos com malária vivax. (Bathia et al, 1986).
Em relação ao paciente que apresentou insucesso no tratamento, verificou-se
que este não foi em decorrência da falta de controle sobre os fatores não biológicos
(adesão e dosagem adequada), mas provavelmente, pela presença de cepas do P.
vivax geneticamente diferentes, caracterizadas pelos genótipos da proteína
circumsporozoítica e por microssatélites. Este fato deve ser mais bem investigado
pela busca de marcadores genéticos de resistência e pela caracterização de que
diferentes genótipos parasitários circulam na região (Souza-Neiras et al., 2010).
71
4.3 As Variantes do Gene CS do P. vivax na Fronteira Franco-Brasileira
Abordagens epidemiológicas e genéticas que abrangem áreas endêmicas de
malária de fronteira no Brasil podem promover o conhecimento da transmissão do
parasito e da dispersão. A diversidade genética do gene CS tem sido útil em
estudos epidemiológicos moleculares, para compreender a transmissão, nas
dinâmicas e nas relações evolutivas (Souza-Neiras et al., 2010). Além disso, as
características biológicas e genéticas do parasito, a imunidade do hospedeiro e dos
vetores locais pode ser capaz de influenciar os diferentes padrões de expansão
demográfica, que também é modulada pela condição eco-epidemiológica (Gonzales-
Ceron et al, 2013; Stefani et al, 2013).
A amostragem dos parasitos realizada em Oiapoque seguiu um padrão similar
de genótipos da CS do P. vivax observados em outras áreas da região Amazônica
brasileira. Os três genótipos foram encontrados como infecção simples e mista, com
VK 210 e VK247 mais associado com uma das infecções mistas (Machado & Póvoa,
2000). Curiosamente, na Guiana Francesa, Volney e colaboradores (2002)
observaram em um estudo soro-epidemiológico de reações positivas de malária para
todos os peptídeos da CS do P. vivax em pacientes com malária, foram verificadas
áreas costeiras da região do Rio Maroni e Oiapoque. Os anticorpos foram dirigidos
contra o VK210, o VK247 e P. vivax -like. Adicionalmente, não houve diferenças
estatisticamente significativas para os genótipos da CS e o provável local de
infecção entre as amostras de sangue infectadas com P. vivax coletadas dos
pacientes oriundos dos garimpos da Guiana Francesa, e as amostras coletadas dos
pacientes residentes no município de Oiapoque. Nossos resultados sugerem que
esta pode ser uma característica comum de malária de fronteira. Em outras palavras,
os mesmos genótipos da CS do P. vivax VK210, VK247 e P. vivax-like, circulantes
nos garimpos da Guiana Francesa são encontrados no município de Oiapoque, no
Brasil. Estes resultados indicam a possível ocorrência da dispersão das populações
de parasitos entre os dois países. Provavelmente, essa distribuição está associada a
padrões de transmissão prolongados e/ou mais complexas destes genótipos no
Brasil, na fronteira com a Guiana Francesa. Isto também corrobora com os aspectos
epidemiológicos da malária vivax encontrados nesta fronteira Franco-Brasileira, a
qual tem como principal característica a intensa mobilidade da população em fluxo
contínuo para ambos os lados.
72
Outro ponto que deve ser considerado é a detecção de subtipos VK210 que
circulam no município do Oiapoque. Nossos resultados demonstraram gene CS com
diferentes repetições e alteração do nucleotídeo na região de repetição central.
Recentemente, seis subtipos diferentes (VK210a, VK210b, VK210c, VK210d,
VK210e o VK210f) foram identificados em cepas de P. vivax isoladas na Nicarágua e
México. O subtipo VK210a foi detectado em ambos os países e foi o mais frequente
e VK210f, menos frequente, foi encontrado apenas na Nicarágua (Gonzalez - Ceron
et al., 2013). De fato, estudos anteriores demonstram que a migração das
populações humanas entre os países da América Latina é muito ativa. Isto pode
facilitar a introdução de novas cepas do parasito em diferentes regiões (Souza-
Neiras et al., 2010). Estes resultados podem sugerir que a dispersão das populações
do parasito ocorre entre os dois países. Provavelmente, essa distribuição está
associada a padrões de transmissão prolongados e/ou mais complexas destes
genótipos em Oiapoque, Estado do Amapá. Esta hipótese pode ser confirmada com
análise de genética de população do P. vivax recolhidos em ambos os países, para
proporcionar uma melhor compreensão da transmissão do parasito e dispersão
nessa região.
Este padrão de distribuição de genótipos CS na fronteira entre o Brasil e a
Guiana Francesa pode ter sérias implicações no desenho de estratégias para o
controle efetivo da malária. Em primeiro lugar, cerca de 40% dos casos de malária P.
vivax detectado em Oiapoque são da Guiana Francesa (Brasil, 2012). Outro ponto
de vista a ser avaliado é que a prescrição do tratamento P. vivax utilizado no Brasil
não é a mesma aplicada na Guiana Francesa. No Brasil, os tratamentos padrões
recomendados pelo Ministério da Saúde brasileiro são cloroquina 25 mg/kg durante
3 dias ( 10 mg/kg no dia 1 e 75 mg/kg nos dias 2 e 3 ), mais primaquina 0,50 mg/kg
durante 7 dias.
Na Guiana Francesa, quando o diagnóstico é confirmado, o paciente recebe
um tratamento de três dias de cloroquina (25 mg/Kg). Para prescrição da
primaquina, o indivíduo requer um teste de deficiência de glicose 6-fosfato
desidrogenase (G6PD) realizado em Caiena e uma autorização de uso temporário
nominativo do fármaco pelas autoridades competentes e, portanto, este
procedimento provoca atraso na administração de primaquina, consequentemente,
cerca de metade da população infectada por P. vivax tem recaídas (Nacher et al.,
2013).
73
Além disso, os relatos anteriores sugerem que em infecções mistas, uma
espécie de Plasmodium pode suprimir a densidade do sangue de outro estágio
(Scopel et al., 2004; Lorenzetti et al., 2008). Por isso, algumas interações entre
espécies são tais que se pode afetar até mesmo por pequenas diferenças a
manifestação clínica de outra, mais investigações são necessárias, a fim de
esclarecer o papel das infecções mistas na severidade da doença e também nesta
dinâmica de transmissão do parasito, que ocorre na Guiana Francesa e que podem
influenciar na transmissão e disseminação do protozoário no lado brasileiro.
74
5 CONCLUSÕES
O perfil sócio-econômico-demográfico dos pacientes constitui determinante
importante na epidemiologia e dinâmica da malária por P. vivax no município de
Oiapoque. A baixa escolaridade dos indivíduos acometidos, a predominância de
casos em adultos do sexo masculino na faixa etária economicamente produtiva, com
destaque, para a garimpagem ilegal como principal ocupação, tem relevante
contribuição causal, tendo em vista, a elevada vulnerabilidade social da população
envolvida, favorecendo assim, a sustentação e transmissão da doença. Ademais, as
migrações populacionais interestaduais e transfronteiriça relacionadas com a
mineração ilegal de ouro na Guiana Francesa foram evidenciadas como um
importante propulsor da malária no contexto da fronteira Franco-Brasileira.
A precipitação pluviométrica influencia a incidência de malária no município
de Oiapoque. No trimestre de chuvas intensas de março a maio há menor incidência
de casos, e nos meses mais secos, com pouca chuva, isto é, de setembro a
novembro há maior incidência da doença, provavelmente pelo surgimento de
criadouros propícios, que favorecem o aumento da biomassa de mosquitos vetores
da doença. Esta tendência sazonal da malária é semelhante a do município francês
de Saint-Georges, na margem oposta do Rio Oiapoque. No entanto, foram
observadas diferenças significativas na sazonalidade dos casos, quando comparado
com Camopi na Guiana Francesa, uma aldeia indígena localizada a margem do Rio
Oiapoque, a 92,5 km da cidade de Oiapoque.
No município do Oiapoque, desde que seja observado: a boa qualidade e
armazenamento adequado dos medicamentos antimaláricos utilizados; o diagnostico
correto e preciso do Plasmodium; as doses proporcionais da primaquina ao peso
corporal do paciente; a adesão ao tratamento com a devida orientação e
acompanhamento do paciente, e a adequada absorção sanguínea dos antimaláricos,
o esquema terapêutico de primeira escolha preconizado pelo Ministério da Saúde do
Brasil, para tratar malária causada por P. vivax utilizando difosfato de cloroquina em
três dias com difosfato de primaquina em regime curto de sete a dez dias, a
depender do peso, mantem-se altamente eficaz. O controle sobre os principais
fatores de falha terapêutica, não diretamente relacionada ao fenômeno biológico da
resistência do parasito, mostrou-se importante para a eficácia do tratamento da
malária vivax em Oiapoque, no Brasil, fronteira com a Guiana Francesa.
75
Os mesmos genótipos da CS do P. vivax VK210, VK247 e P. vivax-like,
circulantes nos garimpos da Guiana Francesa são encontrados no município de
Oiapoque, no Brasil. Estes resultados indicam a possível ocorrência da dispersão
das populações de parasitos entre os dois países.
Os isolados de Plasmodium vivax circulantes nesta área de fronteira do Brasil,
não apresentaram perfil significativo de resistência à terapêutica atualmente
preconizada pelo Ministério da Saúde do Brasil;
As conclusões aqui apresentadas sobre a malária na fronteira Brasil / Guiana
Francesa se destinam a contribuir na compreensão do processo de transmissão da
doença nesta região.
76
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APÊNDICES
Apêndice 01: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;
Apêndice 02: Ficha de inclusão e acompanhamento do projeto;
99
APÊNDICE - 01
TERMO DE ESCLARECIMENTO
Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário, em uma pesquisa. Após ser
esclarecido (a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine
ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador
responsável. Em caso de recusa você não será penalizado (a) de forma alguma. Em caso de
dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade SEAMA pelo telefone
(96) 3223-7393.
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA:
Título do Projeto: “Avaliação da resposta terapêutica e medição dos níveis sanguíneos da
cloroquina e primaquina em pacientes com malária vivax em correlação com as
variantes da proteína circumsporozoítica do Plasmodium vivax no município de Oiapoque
área de fronteira amazônica”.
Pesquisador Responsável: Margarete do Socorro Mendonça Gomes
Telefone para contato (inclusive ligações a cobrar): (096) 3222-1643 / 9974- 8383
Pesquisadores participantes: Álvaro Augusto R. D'Almeida Couto, José Luís Fernandez Vieira, Ricardo Luiz Dantas Machado e Jânio de Jesus Gonçalves Junior. Telefones para contato: 3212-6175 / 3222-1643 / 9974- 8383
DESCRIÇÃO DA PESQUISA
Você tem um tipo de doença denominada Malária e está sendo convidado a participar do
estudo nomeado “Avaliação da resposta terapêutica e medição dos níveis séricos da
cloroquina e primaquina em pacientes com malária vivax em correlação com as variantes da
proteína circumsporozoítica do Plasmodium vivax no município de Oiapoque área de fronteira
amazônica”. Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por isso a
sua participação é importante.
O objetivo deste estudo é quantificar os níveis sanguíneos dos fármacos antimaláricos
cloroquina e primaquina por cromatografia líquida de alta eficiência, correlacionando-os com a
negativação da parasitemia, e caso você participe, será necessário fazer exames de sangue,
consultas médicas semanais, fazer perguntas sobre seu estado de saúde.
Você, ou a pessoa pela qual é responsável será tratada para malária com o mesmo
medicamento que está sendo usado pelo serviço de saúde do seu município para o tratamento
desta doença, seguindo o esquema terapêutico recomendado pelo Ministério da Saúde do
Brasil. Com a sua autorização iniciaremos um acompanhamento do tratamento nos dias 0, 1, 3,
7, 14, 21, 28 após você ter recebido a primeira dose do medicamento.
As visitas de acompanhamento serão feitas por um profissional da equipe, o qual ira pedir
informações sobre o seu estado de saúde e coletará sangue da ponta do dedo e do seu braço
para fazer exames de laboratório. Será coletado 5ml de sangue da veia no 0, 3º, 14º, 21º e 28º
dias. Você poderá ter algum desconforto quando receber uma picada para colher o sangue do
seu braço, poderá ficar uma mancha roxa que desaparecerá em um curto espaço de tempo.
Depois que os resultados dos exames estiverem prontos, você poderá ver estes resultados.
Você poderá ter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa ou retirar
seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento.
Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro, mas terá a
garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não serão de
sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer momento do estudo, pois você
será identificado com um número.
100
CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Eu, li e/ou ouvi o esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual
procedimento a que serei submetido. A explicação que recebi esclarece os riscos e
benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre para interromper minha participação a
qualquer momento, sem justificar minha decisão e que isso não afetará meu tratamento.
Sei que meu nome não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro
por participar do estudo.
Eu, _____________________________________, RG/ CPF/ n.ºde prontuário/ n.ºde
matrícula ______________________________, abaixo assinado, concordo em participar do
estudo “Avaliação da resposta terapêutica e medição dos níveis séricos da
cloroquina e primaquina em pacientes com malária vivax em correlação com
as variantes da proteína circumsporozoítica do Plasmodium vivax no
município de Oiapoque área de fronteira amazônica” como sujeito.
Macapá, ............./ ................../................ Nº. do Prontuário
Assinatura do voluntário (ou responsável legal):
-----------------------------------------------------------------------
Número do RG / CPF
Assinatura do pesquisador responsável:
-----------------------------------------------------------------------
Telefone de contato
(96) 3222-1643 / (96) 9974-
8383
Em caso de dúvida em relação a esse documento, você pode entrar em contato com o
pesquisador responsável pelas informações contidas neste consentimento livre e
esclarecido, cujo número de telefone encontra-se junto a sua assinatura.
Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a pesquisa e aceite do sujeito
em participar.
Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):
Nome: ________________________________ Assinatura: _________________________
Nome: ________________________________ Assinatura: _________________________
101
APÊNDICE – 02
FORMULÁRIO DE INCLUSÃO E ACOMPANHAMENTO DE PACIENTE NO PROJETO:
Avaliação da resposta terapêutica e da concentração sanguínea de antimaláricos para o
Plasmodium vivax no contexto das interações fronteiriças do Brasil com a Guiana francesa
Nome completo
N0 Registro:
Sexo:
Idade:
Estado civil:
Se mulher, está grávida?
Endereço completo (com referência):
Local de nascimento:
Local de procedência (local provável infecção):
Quantas malárias já teve?
Quando foi a última malária?
Medicamento usado na última malária?
Há quantos dias iniciaram os sintomas?
Sintomas antes do início deste tratamento
( ) febre ( ) dor de cabeça ( ) calafrio ( ) vômito ( ) Dor no corpo/ articular ( ) diarreia
( ) suor intenso ( ) olhos amarelados ( ) outros ______________________ PESO:_______
Resultado exame: ( ) Plasmodium vivax
Parasitemia inicial:
Data do início do tratamento _____/______/_______
Esquema de tratamento
Acompanhamento do Tratamento
Dia Data Parasitemia Espécie
de plasmódio
Tomou o medicamento corretamente
Contagem de medicamentos
ingeridos
Algum sintoma novo?
Caso sim, qual?
0
1
3
7
14
21
28
102
ANEXOS
Anexo 01: Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade SEAMA sob o número
de protocolo CEP/SEAMA Nº. 079/08 de 27 de novembro de 2008, Macapá;
Anexo 02: Ficha do SIVEP- Malária;
Anexo 03: Financiamento do projeto pelo Edital/CNPq/PPSUS.
103
ANEXO – 01
104
ANEXO – 02
105
ANEXO - 03
