Vol. 21(/2), 2013 27 Revista Nordestina de Biologia 21(2 ... · Revista Nordestina de Biologia...

Vol. 21(/2), 2013 27

FILOGEOGRAFIA DE POPULAÇÕES BRASILEIRAS DE MARMOSA (MARMOSA) MURINA (DIDELPHIMORPHIA, DIDELPHIDAE)

Michel Barros Faria1,2

[email protected]ão Alves de Oliveira3

[email protected] Rodrigues Bonvicino2,4

[email protected]

1 Departamento de Genética, (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

2 Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Reservatórios Silvestres, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

3 Departamento de Vertebrados, Museu Nacional, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.4 Divisão de Genética, Instituto Nacional de Câncer. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

RESUMO

Filogeografia de Populações Brasileiras de Marmosa (Marmosa) Murina (Didelphimorphia, Didelphidae). Marmosa, um gênero de marsupial sul-americano, tem 17 espécies distribuídas nos subgêneros Marmosa e Micoureus. Visando detectar padrões filogeográficos em M. (Marmosa) murina, foram analisados o gene mitocondrial Citocromo b e o éxon 28 do gene nuclear Fator de Von Willebrand. Análises de máxima verossimilhança e Bayesiana corroboraram a monofilia de Marmosa (incluindo Micoureus), e revelaram a monofilia de M. murina. Esta espécie aparece distribuída em três clados, um ao norte do rio Amazonas, outro entre os rios Tapajós e Araguaia, e o terceiro no sudeste do Brasil. O clado do sudeste do Brasil foi a primeira linhagem a se diferenciar, seguido dos outros dois clados, mais relacionados entre si. As análises mostraram estruturação, com populações do lado leste do rio Araguaia separadas das do lado oeste. A formação deste rio é posterior ao aparecimento da linhagem do clado Tapajós - Araguaia. A separação do clado norte do rio Amazonas dos demais sugere o rio Amazonas como barreira. Esse rio já existia antes da diferenciação de M. murina, estimada em 1,5 Ma, mas mudanças climáticas durante o Pleistoceno produziram expansões e contrações de ambientes áridos e úmidos, alterando o volume de água do rio e possibilitando a colonização das duas margens. A partir do Holoceno o rio Amazonas tornou-se barreira efetiva. Palavras chave: Marmosa, Didelphidae, mt-Cytb, e28-vWF, filogeografia.

ABSTRACT

Phylogeography of Marmosa (Marmosa) murina Brazilian populations (Didelphimorphia, Didelphidae). Marmosa, a genus of South American marsupial, includes 17 species distributed in the subgenera Marmosa and Micoureus. In search of phylogeographic patterns in M. (Marmosa) murina we analyzed the mitochondrial gene Cytochrome b and the exon 28 of the nuclear gene von Willebrand Factor. Maximum

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28 Rev. Nordestina Biol.

Likelihood and Bayesian analyses corroborate the monophyly of Marmosa (including Micoureus) and revealed the monophyly of M. murina, which was divided into three clades, one north of the Amazon River, one between the rivers Tapajós and Araguaia, and one in southeastern Brazil. The clade from southeastern Brazil was the first lineage to diverge, followed by the other two clades, that form a sister group. Analyses showed populations from the east of the Araguaia river separated from those of the west of that river. The Araguaia river, was formed after the appearance of the Tapajós-Araguaia lineage. Separation of the north of Amazon clade from the other clades suggests the Amazon river as a barrier. This river already existed before the differentiation of the M. murina lineage, which was estimated to have occurred ca. 1.5 Ma bp,., but climate changes during the Pleistocene produced expansions and contractions of arid and humid environments, changing the river water volume, and allowing colonization of the two banks. From the Holocene on, the Amazon river became an effective barrier.Key words: Marmosa, mt-Cytb, e28-vWF, phylogeography

INTRODUÇÃO

Os Didelphidae, ordem Didelphimorphia, representam a mais diversificada família de marsupiais viventes do Novo Mundo, ocorrendo do sul do Canadá à Patagônia Argentina (VOSS e JANSA, 2009; WILSON e REEDER, 2005). Essa família é representada por 18 gêneros e 96 espécies, 55 das quais ocorrem no Brasil (VOSS e JANSA, 2009; PAGLIA et al., 2012). O gênero Marmosa, como atualmente considerado (VOSS e JANSA, 2009), corresponde aos grupos murina e cinerea de TATE (1933). Esses grupos foram tratados como gêneros distintos por GARDNER e CREIGTON (1989). Estudos recentes, com base em marcadores moleculares, reuniram Micoureus e Marmosa como subgêneros de Marmosa (VOSS e JANSA, 2009; GUTIERREZ et al., 2010). O número de espécies consideradas no gênero Marmosa não é consensual, sendo que alguns autores consideram 15 espécies, nove do subgênero Marmosa Gray 1821 e seis do subgênero Micoureus, Lesson 1842 (VOSS e JANSA, 2009), enquanto outros consideram M. macrotarsus e M. waterhousei como espécies válidas (GUTIERREZ et al., 2010; Rossi et al., 2010), aumentando para 17 o número de espécies no gênero. Marmosa (Marmosa) murina é uma das espécies mais amplamente distribuídas do gênero, ocorrendo na Colômbia, Venezuela, Trinidad e Tobago, Guianas, Brasil, Leste do Equador, Peru e Bolívia (GARDNER e CREIGTON, 2008).

Diversos estudos filogenéticos vêm sendo realizados sobre o gênero Marmosa (e.g., VOSS e JANSA, 2009; GUTIERREZ et al., 2010), porém estudos filogeográficos com marsupiais são escassos, com alguns trabalhos sobre Thylamys (PALMA, 1995; BRAUN et al., 2005; PALMA et al., 2002), Marmosops (MUSTRANGI e PATTON, 1997), e diferentes espécies de didelfídeos (PATTON e COSTA, 2003). COSTA (2003) examinou pequenos mamíferos não voadores distribuídos na Mata Atlântica e Amazônia e, com base na variação de sequências parciais do gene Citocromo b, fez inferências genealógicas e geográficas,

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detectando estruturação geográfica em M. (Marmosa) murina e apontando a necessidade de um estudo filogeográfico mais detalhado deste táxon.

Os objetivos do presente trabalho foram analisar as relações filogeográficas de M. (Marmosa) murina e sua relação filogenética com outras espécies de Marmosa a partir de análises filogenéticas com base no gene mitocondrial mt-Cytb e no gene nuclear e28-vWF, no sentido de evidenciar possíveis barreiras geográficas ao longo de sua área de distribuição.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados dois marcadores, um mitocondrial e um nuclear. Nas análises com o gene mitocondrial Citocromo b (mt-Cytb) foram utilizadas 52 amostras de Marmosa de localidades em diferentes domínios morfoclimáticos da América do Sul e em áreas de transição entre eles (Figura 1; Tabela 1). As espécies analisadas foram: M. (Marmosa) murina (n=24), M. (Marmosa) waterhousei (n=5), M. (Marmosa) simonsi (n=2), M. (Marmosa) lepida (n=2), M. (Marmosa) mexicana (n=2), M. (Marmosa) isthmica (n=2), M. (Marmosa) xerophila (n=2), M. (Marmosa) robinsoni (n=2), M. (Marmosa) tyleriana (n=4) e M. (Marmosa) rubra (n=2), M. (Micoureus) demerarae (n=1), M. (Micoureus) paraguayanus (n=1), M. (Micoureus) constantiae (n=1), M. (Micoureus) regina (n=1) e M. (Micoureus) alstoni (n=1). Para as análises filogenéticas com o éxon nuclear 28 do fator de Von Willebrand (e28-vWF) foram utilizadas 18 amostras de Marmosa de localidades em diferentes domínios morfoclimáticos da América do Sul, e áreas de transição entre eles (Figura 1; Tabela 1). As espécies analisadas foram M. (Marmosa) murina (n=11), M. (Marmosa) lepida (n=1), M. (Marmosa) mexicana (n=1), M. (Marmosa) robinsoni (n=1), M. (Marmosa) rubra (n=1), M. (Micoureus) demerarae (n=1), M. (Micoureus) paraguayana (n=1), M. (Micoureus) regina (n=1). Para constituir o grupo externo nas análises de ambos marcadores, foram sequenciadas uma amostra de Gracilinanus agilis e uma de Cryptonanus agricolai, e foram obtidas no GenBank uma sequência de Caluromys lanatus e outra de Thylamys venustus (Tabela 1).

Isolamento de DNA, amplificação, purificação, e sequenciamento. O DNA das amostras de fígado preservado em etanol 100% foi isolado pelo método de fenol-clorofórmio (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). O mt-Cytb completo (1149 pb) e o e28-vWF (940 pb) foram amplificados por PCR usando iniciadores e ciclagens apropriadas (Tabela 2). Os produtos amplificados foram purificados com o conjunto de reagentes de purificação “GFXTM PCR DNA e Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare), seguindo a recomendação do fabricante. Os produtos purificados foram submetidos à eletroforese em tampão NaOH (10mM de NaOH e 45 mM de ácido bórico) em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (concentração final de 0,3 µg/mL), e observado em um transiluminador com luz ultravioleta.


Figura 1 - Mapa mostrando as localidades de origem das amostras analisadas. Os números correspondem às localidades da Tabela 1. Círculos cheios= localidades de M. (Marmosa) murina; Quadrados= localidade das demais espécies de Marmosa; Áreas hachuradas= principais clados de M. murina recuperados pelas análises e indicados com numeros romanos, I= inclui amostras localizadas ao norte do rio Amazonas; II,. Amostras provenientes da região entre os rios Tapajós e Araguaia; III amostras do leste do Brasil.

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As reações de sequenciamento foram preparadas com o conjunto de reagentes “Big Dye @ Teminator v3.1 Cycle Sequencing kit” (Applied Biossystems) seguindo as recomendações do fabricante e processadas em um sequenciador automático ABI3130xl (Tóquio, Japão). Os eletroferogramas foram editados com os programas Chromas versão 1.45 (MACCARTHY, 1998) e Chromas PRO versão 1.41 (Technelysium Pty Ltd), e as sequências alinhadas manualmente utilizando o programa MEGA na versão 5 (TAMURA et al., 2007).

Análises filogenéticas e estimativas de distância genética. Os haplótipos foram verificados com o programa DNASP versão 5.10.01 (LIBRADO e ROZAS, 2009), e os testes de saturação para comparar a taxa de transição (s) e transversão (v) do mt-Cytb, e do e28-vWF foram realizados com o programa DAMBE 5.2.57 (XIA et al., 2003; XIA e LEMEY, 2009).

As estimativas de distância genética com o algoritmo de distância Kimura-2-parâmetros (K2p) (KIMURA, 1980) foram realizadas com programa MEGA 5. O modelo K2p foi escolhido por ser eficiente para avaliar a divergência genética entre grupos intimamente ligados (TAMURA e KUMAR, 2002), e para facilitar comparações com outros estudos com marsupiais (COSTA, 2003; PATTON e COSTA, 2003; SOLARI, 2010; CARAMASCHI et al., 2011; CARVALHO et al., 2011).

O modelo de evolução foi escolhido para cada conjunto de dados pelo teste AIC [Critério de Informação de Akaike (“Akaike information criterion”), Akaike 1973], com modificações (POSADA e CRANDALL, 2001), usando o programa ModelGenerator 0.85 (KEANE et al., 2006). As análises de máxima verossimilhança (MV) e de inferência Bayesiana (BI) com o mt-Cytb foram realizadas usando o modelo evolutivo HKY (HASEGAWA et al., 1985) com proporção de sítios invariáveis e taxa de distribuição de substituição gama (HKY+I+G). Para o e28-vWF o modelo mais adequado para MV foi o K80 (KIMURA, 1980) com a distribuição gama (K80+G), e para a análise Bayesiana foi o modelo HKY+I+G.

As topologias de MV (FELSENSTEIN, 1981) foram obtidas com o programa PhyML, versão 3.0 (GUINDON e GASCUEL, 2003), com os parâmetros: equilíbrio de sequências otimizado, proporção de sítios variáveis estimado, α estimado, árvore inicial BioNj, topologia de tamanho de ramos otimizados, valores de suporte de aLRT obtidos com base em 1.000 réplicas (ANISIMOVA e GASCUEL, 2006; GUINDON et al., 2010).

As análises Bayesianas foram realizadas com o programa Mr.Bayes 3.1.2 (HUELSENBECK e RONQUIST, 2001; RONQUIST e HUELSENBECK, 2003) com a cadeia de Markov Monte Carlo conjugada ao algoritmo de Metropolis (MCMCMC). Foram executadas duas cadeias por 1.000.000 de gerações, e uma árvore foi coletada a cada 100 gerações. A qualidade das corridas foi avaliada pela convergência entre as corridas independentes usando o programa TRACER versão 1.5 (RAMBAUT e DRUMMOND, 2007), e os 10% iniciais da corrida foram descartados (burn-in). Posteriormente, a melhor topologia foi obtida através de

Vol. 21(/2), 2013 37

consenso estrito.Para avaliar a estrutura e os padrões de distribuição geográfica das

subpopulações de M. (Marmosa) murina foi realizada uma análise de rede com o programa Network (www.fluxusengineering.com) pelo método de Median-Joining (MJ; BANDELT et al., 1999). Nesta análise foram utilizados os sítios variáveis das sequências de mt-Cytb.

O programa ARLEQUIN foi usado para calcular a distribuição par-a-par (mismatch distribution) (SLATKIN e HUDSON, 1991; ROGERS e HARPENDING, 1992). Intervalos de confiança foram baseados em 1000 repetições de bootstrap com nível de significância de 0,05 (SCHNEIDER e EXCOFFIER, 1999). O modelo de expansão demográfica foi testado usando valores de bootstrap e a soma dos desvios quadrados (SSD) entre a distribuição par-a-par (mismatch) observada e simulada (test of goodness-of-fit) (SCHNEIDER e EXCOFFIER, 1999; EXCOFFIER, 2004).

A hipótese de isolamento das populações de M. (Marmosa) murina por distância foi testada por meio do teste de Mantel (programa IBD versão 3.23) (BOHONAK, 2002; JENSEN et al., 2005). Amostras foram divididas em três subgrupos de acordo com as análises filogenéticas e de rede, clados I, II e III (Figura 1). As distâncias geográficas foram calculadas usando a localidade mais distante (Guiana Francesa para o clado I, Dourados para o clado II, e Vitória para o clado III) e mais próxima de cada clado (Monte Alegre para o clado I, Araguatins para o clado II, e Santa Tereza para o clado III). Distâncias genéticas entre subpopulações e entre sequências foram calculadas utilizando o PhiST e Kimura-2 parâmetros, respectivamente, com 10.000 permutações.

O tempo de divergência entre as linhagens foi estimado através de análises Bayesianas com o programa BEAST, versão 1.7.0 (DRUMMOND e RAMBAUT, 2007), usando o mt-Cytb e dois pontos de calibração baseados em registro fóssil: (i) o tempo de separação entre Didelphinae e Caluromyinae (15,9 a 16,3 Ma; MARSHALL, 1976), e (ii) a idade mínima de 6,8 Ma para a separação de Didelphinae e Marmosinae (KIRSCH e PALMA, 1995).

Para estimar o tempo de divergência foi utilizado um prior de relógio molecular relaxado não correlacionado (DRUMMOND et al., 2006), com o modelo evolutivo “HKY e coalescência”, para possibilitar taxas de evolução diferentes nos diversos ramos; essas taxas podem ser calculadas independentemente através de uma distribuição dos valores de taxa de substituição de nucleotídeos. Foi utilizada uma árvore filogenética amostrada por MCMC para calibrar o tempo de divergência usando a distribuição normal e uniforme para os pontos de calibração. As estimativas da probabilidade posterior foram obtidas por amostragem MCMCMC a cada 5.000 passos ao longo de um total de 50.000.000 passos. Para verificar se o logaritmo da árvore gerada a posteriori conjunta se tornou estacionário, foi usado o programa Tracer (RAMBAUT e DRUMMOND, 2007); os 10% das árvores iniciais foram removidas e a topologia mais suportada foi indicada usando o programa TreeAnnotator do pacote BEAST 1.7.0 (DRUMMOND e RAMBAUT, 2007).


RESULTADOS

As estimativas de distância genética interespecíficas de Marmosa variam para o mt-Cytb de 9,37% entre M. (Marmosa) tyleriana e M. (Marmosa) waterhousei, a 23,42% entre M. (Marmosa) alstoni e M. (Marmosa) tyleriana. Para o e28-vWF as estimativas de distância genética variaram de 0,81% entre M. (Micoureus) paraguayana e M. (Micoureus) demerarae, a 5,98% entre M. (Marmosa) mexicana e M. (Marmosa) rubra. As distâncias interespecíficas para Marmosa, e intraespecífica para M. (Marmosa) murina, para os dois marcadores variaram entre os clados recuperados pelas análises MV, BY e MJ, assim como as taxas de transições e transversões, e valores de diversidade nucleotídica e genética (Tabela 3).

As sequências de mt-Cytb de Marmosa (n=52) mostraram 51 haplótipos, um compartilhado por 2 espécimes (H11) de M. (Marmosa) murina da mesma localidade (Araguatins, TO). As demais amostras não compartilharam haplótipos (Tabela 1). As sequências do e28-vWF de Marmosa (n=18) mostraram 14 haplótipos, cinco compartilhados por amostras de M. (Marmosa) murina (MT e TO, n=5; Tabela 1). Para ambos os marcadores, houve sinal filogenético e predominância de transições, com o mt-Cytb apresentando indícios de saturação, e o e28-vWF não tendo saturação (Figura 2).

As topologias de máxima verossimilhança e Bayesiana obtidas com o mt-Cytb revelaram o monofiletismo de Marmosa (aLRT=100 e PP=1), com o gênero dividido em dois grupos com alto suporte nodal (Figura 3). As espécies M. (Marmosa) mexicana, M. (Marmosa) isthmica, M. (Marmosa) robinsoni, M. (Marmosa) xerophila, M. (Marmosa) simonsi, e M. (Marmosa) rubra (aLRT=88 e PP=0,99), agruparam-se isoladas do clado que contém o restante das amostras. Este último (aLRT=68 e PP= 0,87) se divide em várias linhagens, uma contendo M. (Marmosa) lepida (aLRT=100 e PP=1), outra (aLRT=60 e pp=0,68) contendo os haplótipos de Micoureus (aLRT=100 e PP=1), e outra linhagem com o restante das amostras (aLRT=100 e PP=1). Este último clado também se divide em dois, um com M. (Marmosa) waterhousei e M. (Marmosa) tyleriana (aLRT=98 e PP=0,96), e outro com M. (Marmosa) murina e M. (Marmosa) macrotarsus, com suporte baixo (aLRT=69 e PP=0,75; Figura 3).

As topologias de máxima verossimilhança e Bayesiana obtidas com o e28-vWF (Figura 4) também mostraram Marmosa monofilética, com alto valor de suporte (aLRT=99 e PP=1), e M. (Marmosa) murina estruturada, mas como era esperado, tiveram menor resolução para resolver algumas relações interespecíficas.

As análises com os dois marcadores revelaram as amostras de M. (Marmosa) murina monofiléticas e geograficamente estruturadas para os marcadores mt-Cytb e e28-vWF (Figuras 3 e 4). A análise de rede com mt-Cytb recuperou a estruturação em três grupos encontrada na MV e BY com vários vetores médios dentro e entre os grupos (Figura 5).

Os grupos são: o clado I, com amostras localizadas ao norte do rio Amazonas no bioma Amazônia do Peru, Brasil e das Guianas; o clado II, com

Vol. 21(/2), 2013 39

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Vol. 21(/2), 2013 41

Figura 2 - Gráfico das taxas de transição e transversão (s e v) versus distância genética K2p de mt-Cytb (a) e do e28-vWF (b), para testar o sinal filogenético dos marcadores estudados. Eixo x= taxas de transição. Eixo y= distância genética.

amostras localizadas no extremo Leste do bioma Amazônia e no extremo oeste do bioma cerrado, entre os rios Tapajós e Araguaia; o clado III, com amostras do sudeste do Brasil, obtidas no bioma Mata Atlântica.

Não foram analisadas amostras do clado III do Sudeste do Brasil com o e28-vWF; por isso nessa análise encontramos M. (Marmosa) murina estruturada em dois clados, um ao norte do rio Amazonas (clado I) e outro ao sul desse rio (clado II) .

Os padrões de distribuição propostos pela análise de Mismatch Distribution para inferir a história demográfica das populações usando o mt-Cytb resultaram em curvas multimodais para os clados I, II e III, sugerindo equilíbrio demográfico (Figura 6).

O teste de Mantel realizado com dados do mt-Cytb não revelou associação significativa entre as distâncias genéticas e geográficas.

A análise Bayesiana com mt-Cytb estimou um tempo de 1,55 Ma para o surgimento da linhagem de M. (Marmosa) murina, no Pleistoceno. As idades para todas as espécies analisadas, assim como para os principais clados de Marmosa estão representadas na Figura 7.


Figura 3 - Topologias de máxima verossimilhança e Bayesiana com mt-Cytb mostrando as relações filogenéticas de Marmosa. Os números próximos aos nós representam valores de aLRT (acima) e probabilidade posterior (abaixo).

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DISCUSSÃO

As análises suportam o monofiletismo de Marmosa, a posição de Micoureus como subgênero de Marmosa, e a posição de M. (Marmosa) murina como grupo irmão de M. (Marmosa) macrotarsus. Esses resultados corroboram estudos moleculares recentes que revelaram esse arranjo filogenético (GUTIERREZ et al., 2010), e vão contra a opinião de VOSS e JANSA (2009) que consideram M. (Marmosa) macrotarsus sinônimo júnior de M. (Marmosa) murina. As análises com os marcadores mt-Cytb e e28-vWF mostraram estruturação em M. (Marmosa) murina, sugerindo o rio Amazonas como uma possível barreira geográfica. Os resultados aqui encontrados com mt-Cytb estão de acordo com os encontrados por COSTA (2003) que, usando o mesmo marcador, encontrou M. (Marmosa) murina estruturada em quatro clados, um no sudeste do Brasil, um no extremo oeste da Amazônia ao sul do rio Amazonas, um terceiro ao norte

Figura 4 - Topologia de máxima verossimilhança e Bayesiana com e28-vWF mostrando as relações filogenéticas de Marmosa. Os números próximos aos nós representam valores de aLRT (acima) e probabilidade posterior (abaixo).


do rio Amazonas e um quarto na região central do Brasil (CA), que inclui as localidades de nossas amostras do clado II. Porém, as relações filogenéticas entre os clados foram diferentes das encontradas por COSTA (2003). Naquele trabalho as amostras do sudeste do Brasil formam um grupo irmão do clado Central do Brasil (nosso clado II), com ambos clados separados daqueles ao norte e ao sul oeste do rio Amazonas. No presente trabalho, o clado II de Tapajós-Araguaia é grupo irmão do clado I do norte do rio Amazonas ambos formando um grupo irmão do clado III do sudeste do Brasil. Esse resultado pode ser consequência do tamanho das sequências analisadas, uma vez que COSTA (2003) utilizou parte do mt-Cyb, com sequências de tamanho variável, com até no máximo 801 pares de base, e analisou amostras de localidades diferentes, que não incluíam localidades à oeste do rio Negro e ao norte do rio Amazonas, enquanto um terço das amostras aqui analisadas são dessa região.

As análises com o marcador e28-vWF também evidenciaram o papel do rio Amazonas na estruturação encontrada, separando o grupo ao norte do rio Amazonas do grupo ao sul deste rio. O médio/baixo rio Amazonas atua como barreira para a distribuição de duas outras espécies de marsupiais didelfídeos, Marmosops bishopi e Monodelphis emiliae restritas ao sul do rio Amazonas (GARDNER e CREIGHTON, 2008; ROSSI et al., 2010). Esse rio também atua como barreira geográfica para outros grupos de mamíferos, como os roedores

Figura 5 - Rede de haplótipos de M. (Marmosa) murina com o mt-Cytb obtida pelo método de Median-Joining (BANDELT et al., 1999), utilizando os sítios variáveis das sequências de mt-Cytb. Pontos negros representam haplótipos e seus diâmetros são proporcionais ao número de amostras que compartilham cada haplótipo. Pontos cinza representam vetores médios. Números nas linhas ligando os haplótipos ou vetores médios representam o número de substituições. Os números de haplótipos (H) são os mesmos listados na Tabela 1.

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Figura 6 - Distribuição par-a-par das curvas observadas e simuladas para Marmosa murina com o mt-Cytb para (a) todos os clados, (b) clado I ao norte do rio Amazonas, e (c) clado II Tapajós - Araguaia. O clado III sudeste do Brasil não foi analisado devido ao número restrito de amostras. Barras brancas= distribuição observada; linhas sólidas= distribuição em modelo de expansão simulada; linhas tracejadas= porcentagens respectivas de 95% e 5%; SSDSvd e SSDSpa= soma dos desvios quadrados de acordo com um modelo de expansão populacional súbita (Svd) e espacial (Spa).

sigmodontíneos do gênero Zygodontomys, restrito ao norte desse rio, e do gênero Oxymycterus restrito ao sul. O mesmo se observa para os gêneros Oecomys e Oligoryzomys, com as espécies Oecomys trinitatis, Oecomys concolor e Oligoryzomys fulvescens restritas à margem esquerda do rio Amazonas, e Oecomys bicolor, Oecomys roberti e Oligoryzomys microtis, restritas à margem direita (BONVICINO et al., 2008). O rio Amazonas também é barreira para a distribuição de roedores Echimyidae como espécies do gênero Proechimys, com P. quadruplicatus, P. arapubu, P. guyannensis e P. goeldi restritas à margem


esquerda, e P. kulinae, P. simonsi, P. pattoni, P. gardneri e P. steerei restritas à margem direita (BONVICINO et al., 2008). O papel do rio Amazonas como barreira para primatas é evidente, com táxons restritos à margem esquerda (Saguinus midas, S. nigricollis, Cebus olivaceus, Aotus trivirgatus, Aotus vociferans, Alouatta seniculus, Ateles paniscus, Logothrix lagotricha, Callicebus torquatus, Chiropotes chiropotes, Pithecia pithecia) e táxons restritos à margem direita (Mico acariensis, M. emiliae, M. intermedius, M. maniicorensis, M. mauesi, M. nigripes, Saguinus imperador, S. melanoleucus, Saimiri boliviensis, Saimiri ustus, Alouatta nigerrima, Ateles marginatus, Logothrix cana, Callicebus moloch, Chiropotes albinasus, Pithecia irrorata) (GREGORIN et al., 2010).

O marcador mitocondrial mostrou estruturação no clado II da região Tapajós-Araguaia, separando os haplótipos do lado leste do médio e baixo rio Araguaia dos haplótipos a oeste desse rio, enquanto o e28-vWF não mostrou essa estruturação. Uma possível explicação seria a origem recente desse rio, no Holoceno (LANTRUBESS et al., 2005), posterior à diferenciação da linhagem de M. (Marmosa) murina, e muito recente para possibilitar diferenciação no marcador nuclear e28-vWF, que tem taxas de mutação mais lentas que o marcador mitocondrial (BROWN et al., 1979). O médio/baixo rio Araguaia atua

Figura 7 - Topologia da análise Bayesiana com mt-Cytb e pontos de calibração baseados na separação de Caluromyidae de Didelphidae e na separação de Marmosa dos demais gêneros.

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como barreira para os roedores Rhipidomys macconnelli na margem esquerda e R. macrurus na margem direita (BONVICINO et al., 2008), e para espécies de primatas, com Callithrix penicillata e Chiropotes utahickae, restritos à margem direita do rio, e Cebus cay, restrito à margem esquerda no médio rio Araguaia (GREGORIN et al., 2010).

A análise de rede com o mt-Cytb recuperou a topologia das análises de máxima verossimilhança e Bayesiana, com três clados para M. (Marmosa) murina, e vários vetores médios ligando esses clados e os haplótipos em cada um deles, que podem ser interpretados como haplótipos não amostrados ou extintos (BANDELT et al., 1999). Esses clados apresentaram maior número de mutações entre eles do que dentro de cada um. Apesar dessa estruturação, as estimativas de distância genética inter clados foram menores que as estimativas de distância entre as espécies de Marmosa (Tabela 3), sugerindo que os clados pertencem a uma única espécie. Os valores de variância baixos, e as curvas multimodais observados na análise par-a-par das populações de M. (Marmosa) murina indicam que essa espécie está em expansão (SLATKIN e HUDSON, 1991; ROGERS e HARPENDING, 1992). A idade estimada para o surgimento de M. (Marmosa) murina foi de aproximadamente 1,55 Ma, durante a metade inicial do Pleistoceno. Neste período o rio Amazonas já estava formado (10,5 Ma, Mioceno; LOURENS et al., 2004; RAFFI et al., 2006), com grande volume de água e com o mesmo curso atual (LATRUBESSE et al., 2005). A colonização de M. (Marmosa) murina de uma margem para a outra do rio deve ter sido possibilitada pelas alternâncias glaciares ao longo do Pleistoceno (POSADAS e ORTIZ-JAUREGUIZAR, 2010), que produziram expansões e contrações de ambientes áridos e úmidos levando a mudanças no volume de água do rio Amazonas. Durante o Holoceno o rio Amazonas se tornou uma barreira ainda mais efetiva devido às mudanças do volume de água em sua bacia (LATRUBESSE et al., 2005), que levaram a transformação de rio com alta taxa de acréscimo vertical para rio de maior atividade lateral. Nossas análises mostram que as populações de M. (Marmosa) murina de margens diferentes do rio Amazonas estão isoladas uma das outras, e são monofiléticas com relação às populações da margem oposta, preenchendo os requisitos necessários para considerar o rio Amazonas como barreira geográfica (PATTON e DA SILVA, 1998; BONVICINO e WEKSLER, 2012). O mesmo se aplica às populações de lados opostos do rio Araguaia, apesar da idade do rio Araguaia ser mais recente, datada para o Holoceno (BAYER, 2002; LATRUBESSE e STEVAUX, 2002).

Assim, pode-se concluir que a estruturação atual de M. (Marmosa) murina resulta de um extenso e dinâmico processo histórico, marcado por mudanças nas condições climáticas e ambientais durante o Quaternário, que possibilitaram longos períodos de isolamento entre populações, resultando nas atuais condições biogeográficas evidenciadas por M. (Marmosa) murina, onde os rios tem um papel importante na estruturação populacional.


AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Heitor Herrera (Fazenda Alegria), Conservation Internacional (Fazenda Rio Negro), Ana Flávia B. de Andrade (Fazenda Cadoz), Scott M. Lindbergh (Fazenda Vão dos Bois) e Theodoro de Hungria Machado (Fazenda São Francisco da Trijunção) pela permissão para realizar coletas de amostras para este estudo. Agradecemos também aos colaboradores da equipe de campo do Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Reservatórios Silvestres, IOC, FIOCRUZ. O SISBIO concedeu as licenças de coleta. Somos gratos a Dra. F. Caramaschi pelas sugestões de uma versão anterior deste manuscrito, e ao Dr. H. Seuánez pela correção do abstract. Marcelo Weksler gentilmente revisou a ultima versão do manuscrito. Apoio financeiro foi recebido do CNPq e FAPERJ para CRB, e CNPq para JAO e MBF.

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