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Uso do plasma como agente modificador de superfícies biomédicas Sá, J.C a .; Vitoriano, J.O. b ; Ferraz, E.P c .; Rosa, A. L. c ; Alves Jr, C. b a Departamento de Odontologia, Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, Caicó, RN, Brasil. b Departamento de Odontologia, Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil. c Departamento de Engenharia Mecânica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. Resumo O conceito da medicina translacional vem assumindo elevada importância, uma vez que apresenta-se como uma nova ciência que visa unir os conhecimentos de diversas áreas (engenharia, química, física, biomédica e outros) e testar sua validade em pesquisas clínicas. Diante do exposto, pesquisas estão sendo realizadas com implantes de titânio visando modificar as propriedades de sua superfície para melhorar suas propriedades biológicas e poder ser utilizado

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Page 1: Metallum€¦ · Web viewO conceito da medicina translacional vem assumindo elevada importância, uma vez que apresenta-se como uma nova ciência que visa unir os conhecimentos de

Uso do plasma como agente modificador de superfícies biomédicas

Sá, J.Ca.; Vitoriano, J.O.b; Ferraz, E.Pc.; Rosa, A. L.c; Alves Jr, C.b

aDepartamento de Odontologia, Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, Caicó,

RN, Brasil.

b Departamento de Odontologia, Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.

cDepartamento de Engenharia Mecânica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

Natal, RN, Brasil.

Resumo

O conceito da medicina translacional vem assumindo elevada importância, uma vez que

apresenta-se como uma nova ciência que visa unir os conhecimentos de diversas áreas

(engenharia, química, física, biomédica e outros) e testar sua validade em pesquisas

clínicas. Diante do exposto, pesquisas estão sendo realizadas com implantes de titânio

visando modificar as propriedades de sua superfície para melhorar suas propriedades

biológicas e poder ser utilizado com maior êxito na área odontológica. Desta forma,

neste trabalho, discos de titânio foram modificados por plasma através da nitretação por

cátodo oco durante 1hora e 3 horas de tratamento. Uma caracterização das propriedades

químicas da superfície foi realizada através da difração de raios-x e uma análise da

textura e rugosidade foi feita pela microscopia de força atômica. Avaliação do

comportamento biológico foi realizada pela análise da fosfatase alcalina (ALP) e do

vermelho de alizarina. Os resultados indicaram que o plasma foi capaz de modificar a

superfície tanto química quanto topograficamente. Ao se realizar o tratamento por 3

horas obteve-se uma superfície mais rugosa. A ALP indicou que as amostras tratadas

por cátodo oco 3 horas apresentaram uma maior proliferação celular do que as amostras

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tratadas por 1 hora ou não tratadas. O vermelho de Alizarina indicou que a

mineralização foi semelhante entre os três grupos testados. O plasma apresentou-se,

portanto, como uma técnica capaz de modificar a superfície do titânio influenciando na

resposta biológica inicial.

1. Introdução

Os debates sobre a medicina translacional assumindo elevada importância nos

últimos anos. O conceito não trata só de agilizar a transferência dos resultados da

pesquisa de laboratório para aplicação em prevenção, diagnóstico e tratamento das

doenças, mas também de programar pesquisas de laboratório para avançar

conhecimentos inspiradas em problemas clínicos não solucionados (da bancada à clínica

e da clínica à bancada). A idéia é utilizar conhecimentos originados não só em

laboratórios biomédicos como os provenientes de outras disciplinas (engenharia,

química, física etc.) para, em um primeiro bloco de transferência, testar sua validade em

pesquisas clínicas (de fisiopatologia, de testes e de ensaios clínicos etc.). Em um

segundo bloco, transferir o conhecimento obtido na investigação clínica para a prática

médica e a melhoria dos serviços de saúde, programando pesquisas sobre eventos,

eficácia e custo-efetividade.

São inúmeras as pesquisas que estão avançando nesta área de inovação

tecnológica com aplicabilidade clínica. Dentre elas destaca-se a técnica de modificação

do implantes de titânio para uso biomédico. Antigamente, era regra aguardar de 3 a 6

meses após a colocação do implante dentário para que ocorresse uma formação óssea ao

redor do implante que possibilitasse aplicar cargas sobre esta região. Todavia, os

protocolos cirúrgicos propostos por Branemark sofreram alterações [1]. Atualmente,

existem protocolos no qual pode ser aplicada carga imediata ao implante (instalação e

ativação da prótese em 48 horas). Essa mudança no protocolo foi possível devido aos

maiores cuidados tomados durante o procedimento cirúrgico, ao desenvolvimento dos

conhecimentos sobre a biomecânica do implante, à modificação da forma do implante

além do aprimoramento das técnicas de modificação da superfície do titânio [2]. A

modificação da superfície desse material abre as portas para uma nova odontologia,

onde se espera diminuir o período não funcional do implante, aumentar a sua

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aplicabilidade em ossos alveolares com pouca qualidade, causar o mínimo desconforto

para o paciente além de minimizar os índices de insucessos [3, 4, 5, 6].

Na busca por superfícies que supram essa necessidade de obter uma rápida

formação óssea, várias pesquisas têm sido desenvolvidas. Dentre os diferentes métodos

existentes, aqueles que utilizam o plasma como fonte energética são os que mais

avançaram nos últimos anos, devido, principalmente, a sua versatilidade. O tratamento

por plasma oferece a oportunidade de se variar amplamente as propriedades superficiais

dos materiais com simples ajuste dos parâmetros experimentais, como a densidade

eletrônica, energia e distribuição das funções. Ele é bastante utilizado para aumentar a

energia de superfície e limpar a superfície dos biomateriais. Constitui uma técnica

simples, realizada a seco, não agride o meio ambiente, é de baixo custo e não

compromete as propriedades intrínsecas do biomaterial, afetando apenas a sua

superfície [7]. O objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades superficiais do

titânio após o tratamento por plasma através da configuração em cátodo oco por 1 h e

3h, visando aplicações biomédicas.

2. Materiais e Métodos

2.1 Preparação metalográfica das amostras

Foram utilizados discos de Ti cp (grau II), medindo 15 mm de diâmetro e 1,5

mm de espessura. As amostras foram lixadas e polidas até atingir rugosidade média de

0,002 µm.

2.2 Tratamento por plasma

Depois do polimento, os discos de titânio foram divididos em três grupos

(Tabela 1). No primeiro grupo (ST), as amostras não sofreram tratamento por plasma.

No segundo grupo (CO1) as amostras foram submetidas ao tratamento por plasma

através da nitretação em cátodo oco por 1 hora e no terceiro grupo (CO3) as amostras

foram submetidas ao tratamento por plasma através da nitretação em cátodo oco por 3

horas.

Tabela 1 - Condições de tratamento superficial dos discos de titânio.

  Sem tratamento

por plasma

Nitretação

por cátodo

Nitretação por

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(ST) oco

(CO1)

cátodo oco

(CO3)

Gases - 20 % N2

80% H2

20 % N2

80% H2

Temperatura - 450°C 450°C

Tempo - 1 h 3 h

Pressão - 1,5 mbar 1,5 mbar

Após o polimento, as amostras foram colocadas em uma câmara de aço

inoxidável (reator), com 400 mm de diâmetro e 400 mm de comprimento,

hermeticamente fechada para receber o tratamento de superfície. O sistema utilizado

para o tratamento a plasma consiste em uma fonte de alta voltagem (Potenciômetro);

uma câmara de aço; um sistema de controle de gás (Fluxímetro), uma bomba de vácuo,

além de medidores de temperatura (termopar) e pressão (Figura 1). O plasma foi gerado

quando aplicando-se uma diferença de potencial entre dois eletrodos (cátodo e o ânodo).

O cátodo foi o próprio porta amostras e consiste em um eletrodo circular (A=254cm2)

coberto de titânio. A distância entre os dois eletrodos foi de 22 cm. Antes de cada

tratamento, atingiu-se uma pressão de 0.1 mbar e utilizou-se N2 e H2. A voltagem

aplicada foi de 550 V e realizou-se um aumento da pressão até 1,5 mbar. A temperatura

utilizada foi de 450°C por 1h (CO1) e 3 horas (CO3). Depois do tratamento, o plasma

foi desligado e as amostras foram deixadas na câmara para que o resfriamento fosse

realizado lentamente.

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Figura 1. Representação esquemática dos equipamentos envolvidos no tratamento a

plasma

Sobre o porta amostra foi colocada uma chapa de titânio circular com quatro

pernas nas laterais dando o formato de mesa para poder realizar a configuração em

cátodo oco (Figura 2). Fixou-se a distância entre a superfície da amostra e a tampa

superior, aqui denominada distância cátodo/cátodo (dcc), em 9 mm.

Figura 2 – Representação esquemática da configuração do cátodo oco.

2.3 Difração de raios-X

Para análise das fases foi utilizado um difratômetro de raios-X, Shimadzu modelo

XRD-600. Utilizou-se a configuração geométricas para a incidência de raios-X rasante

com incidência de feixe de 0,5o. Uilizou-se a radiação CuKα e ângulos de varredura

entre 30ºe 50º, passos de 0,02ºe tempo de 0,6 segundos por passo numa velocidade de

2º/min.

A identificação das fases foi realizada com auxílio do programa PMGR, do

pacote de programas da Shimadzu XRD-6000 V4.1 (for NT/98), com base na

composição nominal fornecido pelo fabricante, nas fichas cristalográficas existentes na

literatura para ligas metálicas e nas variáveis do processo.

2.4 Topografia da superfície e rugosidade

Para análise da topografia da superfície e obtenção de valores de rugosidade foi

utilizado Microscópio de Força Atômica (AFM), modelo SPM 9600 da Shimadzu. A

AFM forneceu a topografia da superfície (em 2D). Em cada fotografia em 2D foram

obtidas linhas para determinação dos perfis de rugosidade.

2.5 Medida de atividade de ALP

A atividade de ALP foi medida aos 10 e 14 dias, em quintuplicata, através da

liberação de timolftaleína pela hidrólise do substrato de timolftaleína monofosfato,

utilizando um kit comercial (Labtest, BH, MG, Brasil). Foram utilizados tubos de

ensaio branco, padrão e testes. Em todos os tubos foi adicionado 50mL de substrato e

dcc = 9mm

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500mL de tampão. No tubo padrão foram acrescentados 50mL da solução padrão. Os

tubos foram mantidos em banho maria a 37º C por 2 min. Em seguida, foi adicionado,

em cada tubo teste, 50mL da suspensão com lauril sulfato de sódio dos mesmos poços

utilizados para medida da proteína total. Os tubos foram mantidos em banho maria, a

37º C por 10 min. Após esse período foi adicionado em cada tubo, branco, padrão e

testes, 2 mL do reagente de cor. Alíquotas de 150 μL da solução de cada poço foram

transferidas para placas de 96 poços para posterior quantificação. A densidade óptica foi

lida em comprimento de onda de 590 nm em espectrofotômetro e os dados expressos

como absorbância. A atividade de ALP, expressa em mmoL de timolftaleína/h/mg, foi

calculada a partir da medida do tubo padrão e normalizada pela quantidade de proteína

total.

2.6 Detecção e quantificação da formação de nódulos de matriz mineralizada

Ao final de 14 dias, o meio de cultura das subculturas com células derivadas das

calvárias de ratos foi removido, os poços com os discos lavados três vezes com PBS

aquecido a 37° C e preenchidos com paraformaldeído a 4% por 24 horas. Em seguida,

os poços foram desidratados em série crescente de álcoois e as culturas processadas para

coloração com vermelho de Alizarina (Sigma), que cora, em vermelho, áreas de

mineralização ricas em cálcio. Os discos foram removidos dos poços e fotografados. As

imagens adquiridas foram processadas utilizando o software Adobe Photoshop. Esse

ensaio foi realizado em quintuplicata. A quantificação da mineralização foi realizada de

acordo com o método descrito por Gregory et al. (2004). A cada poço foram

adicionados 280 µL de ácido acético a 10% e mantidos à temperatura ambiente por 30

min sob agitação. Após esse período, a solução de cada poço foi homogeneizada e

transferida para tubos de 1,5 mL. Os tubos foram incubados a 85° C por 10 min e

transferidos para recipiente contendo gelo picado, onde permaneceram por mais 5 min.

Os tubos foram centrifugados a 13000 rpm por 20 min e 100 µL do sobrenadante de

cada tubo transferidos para placa de 96 poços. Foram adicionados 40 µL de hidróxido

de amônio em cada poço para neutralizar o ácido. Em seguida a absorbância foi medida

em espectrofotômetro, utilizando-se o comprimento de onda de 405 nm.

3. Resultados e discussão

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A análise da difração de raios-x possibilitou a visualização das fases presentes

(Figura 3).

Figura 3 - Análise da difração de raios-x (em 0,5° de incidência rasante) das amostras

polidas e tratadas.

A principal fase encontrada foi o Tiα. Picos de TiO2 também foram encontrados.

Nas amostras nitretadas observou-se a presença de nitretos de titânio em 36,8º e 41,2º.

Na nitretação em cátodo oco por 3 horas encontrou-se um novo pico de TiN em 42,9º.

A figura 4 representa a topografia de superfície em 2D (área de 5 µm), assim

como os perfis de rugosidade das amostras de titânio.

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ST

CO1

CO3

Figura 4 – Topografia da superfície do titânio (2D) e perfil de rugosidade.

O grupo ST apresentou uma superfície lisa com pico máximo de 15,72 nm sem

evidência de direcionamento de sulcos e cristas decorrentes do lixamento e polimento.

Através do perfil de rugosidade pode-se observar picos e vales de pequena intensidade e

regularmente distribuídos revelando o aspecto liso e uniforme da superfície. Nos grupos

CO 1 e CO3 observou-se um perfil de rugosidade que mostrou picos e vales intensos.

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Tal fato ocorre porque, na nitretação em cátodo oco consegue-se uma alta ionização,

uma vez que os elétrons no plasma são obrigados a refletirem sucessivamente entre duas

superfícies catódicas [8] Elétrons são repelidos pelo cátodo central (que pode ser a peça

que se deseja tratar) em direção aos cátodos externos. Ao se aproximarem destes, são

também repelidos realizando, assim, um movimento de zig-zag que aumentará a taxa de

ionização da região em questão. Uma alta densidade de íons significará maior

bombardeamento na superfície, produzindo-se defeitos na superfície mais abundantes

do que na nitretação planar [9]. Picos máximos de 488,53 nm foram encontrados ao se

realizar a nitretação em cátodo oco por 3 horas e 431,65 nm ao se realizar a nitretação

em cátodo oco por 1hora. Pode-se observar, portanto, que, na nitretação por cátodo oco

3 horas (CO3), produziu-se maiores defeitos de superfícies quando comparada com a

nitretação em 1 hora (CO1).

A análise da ALP foi maior nas amostras sem tratamento quando analisada após

10 dias. Após 14 dias, a ALP foi maior na nitretação em cátodo oco por 3 horas (Figura

5).

Figura 5. Análise da ALP após 10 e 14 dias.

A análise da mineralização não mostrou diferença entre as amostras (Figura 6).

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Figura 6. Mineralização após 14 dias.

Conclusão

A nitretação por plasma foi capaz de modificar a superfície da amostra de titânio

tanto química quanto topograficamente. Na nitretação em cátodo oco por 3 horas

produziu-se uma superfície capaz de influenciar na atividade da fosfatase alcalina após

14 dias de cultivo. Não se observou diferença entre as amostras ao se analisar a

mineralização.

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Norte; 2005.

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8. Alves Jr C, Guerra Neto C L B, Morais G H S, Silva C F, Hajek V. Nitriding

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9. Guerra Neto, C.L. Novas superfícies para implantes dentais [Dissertação].

Natal: Universidade Federal do Rio Grande do Norte; 2001.

Agradecimentos

Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.