Yvana Cristina Jorge

Profª. Drª. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira

Elementos de Microscopia e Microanálise

Técnica de Hibridização in situ

Permite a detecção de sequências de DNA e RNA em

preparações citológicas e cortes histológicos

Usada pela 1ª vez no mapeamento físico de genes

Gall e Pardue (1969): sondas de RNA ribossomal

ISHAs sondas são sequências de nucleotídeos

complementares desenvolvidas a partir de

segmentos conhecidos do DNA ou RNA que

se deseja identificar 

As sondas podem estar associadas a

moléculas radioativas, fluorescentes

ou biotiniladas

Tipos de hibridização

In vitro Suporte sólido, em soluções

Southern blotting – DNA

Northern blotting - RNA

In situ Tecidos e preparações citológicas

Princípios

Sensibilidade: depende do acesso da sonda ao material-alvo.

Resolução: depende do diâmetro celular e do método usado para

marcação e detecção da sonda.

Especificidade: depende da estringência da lavagem e da

extensão similar entre a sonda e a sequência-alvo.

Segurança: sondas não-radioativas são mais seguras que as

radioativas.

Etapas da Hibridização in situ

1. Preparação da sonda

• Sondas de DNA dupla cadeia: podem ser sintetizadas por nick

translation, random priming ou PCR na presença de nt

marcados.

• Sondas de DNA cadeia única: sintetizadas por PCR.

• Sondas de oligonucleotídeos: ocorre com a incorporação de nt

marcados.

• Sondas de RNA: uso de RNA polimerase purificada que

transcreve determinadas sequências a partir de um sítio de

iniciação. Geralmente essa sonda é clonada usando-se um

plasmídeo.

1. Preparação da sonda

Comprimento da sonda: Sondas muito longas podem formar

sinais fracos devido a baixa taxa de penetração. 50 a 150 pb

resultam, geralmente, em bons sinais.

Marcação da sonda:

Marcação radioativa: eficiência da síntese pode ser

monitorada; radioisótopos são facilmente

incorporados durante a síntese (H3, P32 e S35).

Marcação não radioativa: rapidez na visualização, alta

estabilidade da sonda, segurança, melhor preservação

da morfologia do tecido, facilidade de execução,

menor custo e desperdício.

Interação entre biotina-avidina ou com algum

anticorpo, sendo que alguns fluorocromos

(Fluoresceína ou rodamina) podem ser usados para

identificar sítios de hibridização.

2.Preparação do material: essa etapa é variável porque depende

da natureza do material e do tamanho e tipo de sonda a ser

utilizada.

• Cultura de tecidos: as células devem crescer diretamente

sobre as lâminas ou as células devem ser pingadas.

• Fixação: deve ser suficiente para prevenir a perda do ácido

nucléico (paraformaldeído 4% e glutaraldeído 4%).

• Embebição e seccionamento: o pedaço de tecido pode ser

congelado ou embebido em parafina. Importante para a

preservação do tecido.

3. Pré-tratamento: Essa etapa é necessária para aumentar a

eficiência da hibridização e/ou diminuição da formação de

ligações não-específicas.

Se a sonda for cadeia dupla, ela deve ser denaturada a 70ºC

em formamida.

Pepsina RNAse Ácido acético

4. Hibridização: para cada caso se tem um protocolo.

5. Lavagem pós-hibridização: para remoção do excesso de

sonda.

6. Detecção da sonda: depende do tipo de marcação

incorporada na sonda:

Radioativa Autoradiografia

Não-radioativa Direta Indireta

Direta Indireta

A sequencia é marcada com

biotina que é detectada pela

ligação com a avidina. Depois,

utiliza-se uma enzima ou

fluorocromo para a visualização.

A sonda é marcada com biotina e,

utiliza-se uma anticorpo anti-

biotina. Após, usa-se um anticorpo

secundário.

Fosfatase alcalina ou peroxidase

Fluoresceína ou Rodamina

Policlonal de cabra

IgG conjugada a Fluoresceína

Artefatos da técnica

Background (sondas radioativas): preparação inadequada da emulsão e

o posicionamento da lamínula.

Background (sondas não-radioativas): ligações não específicas.

Hibridização não eficiente: degradação da sequencia-alvo; tamanho e/ou

concentração baixa da sonda; estringência da hibridização ou lavagem;

tipo de tratamento e fixação.

1986 Pinkel et al. Uniram a técnica de hibridização

com imunofluorescência

FISH Usa corantes fluorescentes ligados a sonda

Aplicações Aberrações cromossômicas

Mutagênese

Diagnóstico de câncer

Pré-natal e pré-implantação

3 categorias de sondas:

1. Sondas que hibridizam locus específicos ou sequências únicas:

-Sequências únicas de DNA amplificado por PCR ou vetores

biológicos.

-Resultam em sinais discretos em cromátides irmãs de metáfases e

dois sinais no núcleo interfásico.

2. Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:

-Sondas pericentroméricas específicas ou sequencias repetitivas

alfa-satélite, beta-satélite e sondas de satélites clássicos e, sondas

teloméricas

-Sinal nítido e brilhante

3. Sondas que hibridizam sequências cromossômicas múltiplas:

-Coquetel de sequências únicas homólogas a sequências de DNA

abrangendo o comprimento de uma banda ou cromossomo alvo.

-Seu uso em núcleos interfásicos é limitado pela ausência de um

sinal distinto.

Sondas centroméricas

Sonda de sequência única

FISH aplicado ao diagnóstico

Verde: cr. 17Laranja: Her-2

1q41

1q43

Hibridização in situ Fluorescente Multialvo

oPossibilita a visualização de várias sequências diferentes

simultaneamente em cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos.

oVárias sondas complementares à diferentes sequencias-alvo numa

mesma hibridização.

Aplicações Citogenética do câncer

Determinação sexual

Sonda painting

Hibridização Genômica Comparativa

oIdentificação de anomalias cromossômicas e de sequências

amplificadas e deficientes.

oPermite a análise em todo o genoma de uma só vez.

--Alterações genéticas complexas e aneuploidias em tumores;

--Translocações e inversões específicas em certos tipos de

leucemia.

1. O DNA genômico de interesse e o DNA normal são cortados pelas

mesmas enzimas de restrição e marcados de forma a serem

detectados por fluorocromos diferentes.

2. Numa proporção de 1:1, os DNAs são co-hibridizados sobre uma

lâmina com métafases de tecido normal.

3. A visualização dos diferentes sinais permite a comparação entre os

DNAs em relação às metáfases normais, fornecendo um número

comparativo de aumento ou perda de DNA:

OncogenesGenes

supressores

Metáfase normal DNA teste

DNA controle Hibridização

Marcação 1 ou mais cromossomos inteiros

Vários tipos de

fluorocromos

Detecção de alterações cromossômicas

Rearranjos complexos

Diagnóstico pré-natal

Estudos de evolução comparativa

Metáfase

Cariotipagem espectral

1996 Schrock et al. Cromossomos humanos

Cariotipagem espectral

Permite a identificação de todos os cromossomos inteiros com diferentes

cores.

Necessita de uso combinado da espectroscopia de Fourier, analisador de

imagens e microscópio óptico.

Usa simultaneamente 24 diferentes sondas marcadas com nt conjugados

a 5 tipos de fluorocromos:

Cy2 SG Cy3 TR Cy5

O computador processa uma determinada cor para cada par

cromossômico, facilitando a interpretação.

Aplicações •Identificação de alterações cromossômicas

Rearranjos estruturais

Cromossomos marcadores

Genética Clínica Genética do Câncer

Biologia evolutiva e comparativa