Fase Pré-analítica (60% -70%)◦ Coleta◦ Transporte
Fase analítica (20% - 30%)
Fase pós-analítica (10%)
Realizada do local real da infecção; Obtenção de uma quantidade suficiente de
amostra Utilização de dispositivos apropriados para
a coleta do material Obtenção de cultura antes da administração
de antibióticos Identificação do material
Seringa:◦ Exsudatos frescos ou amostras líquidas:
procedimento válido para amostras enviadas para análise logo após a coleta.
Frascos :◦ Frascos de boca larga com sistema de
fechamento eficiente contra vazamento e contaminação de material
Swab
◦ Algodão estéril◦ Rayon ou Dracon◦ Alginato de cálcio◦ Solução salina, meio de cultura Amie (com ou
sem carvão),Stuart e Clairy Blair.
Amostra recebida em formalina; Coleta de escarro de 24 horas; Único swab para vários fins; Recipiente impróprio, contaminado ou com
vazamento Placas de cultura com crescimento
excessivo ou secas.
Seleção de meios de cultura primários
Transferência e cultura das amostras clinicas
Interpretação das culturas e análise dos resultados.
Destinados para a reprodução, isolamento e análise dos microorganismos de interesse medico.
Compostos por◦ Hidrolisados de proteínas: fonte de C e N◦ Carboidratos: ◦ Tampões◦ Enriquecimento◦ Inibidores◦ Indicadores de pH◦ Ágar: agente solidificante◦ Substratos para ação enzimática
Crescimento:
◦ Ágar chocolate◦ Ágar sangue◦ Ágar Cled◦ Ágar Mueller Hinton
Ágar chocolate: meio nutritivo maioria bactérias, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hematina.
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
Ágar sangue: meio não seletivo, crescimento de bactérias gram – e +
Cled- Ágar cystine lactose eletrolyte deficient: meio que permite o crescimento de gram+ e gram- .
Ágar Mueller-Hinton é um meio de cultura microbiológico que é freqüentemente usado para testes de susceptibilidade antimicrobiana.
Ágar Manitol Ágar Mac Conkey, EMB Ágar Salmomella Shigella Ágar Sabouraud Ágar Bili-Esculina Ágar Dnase Ágar TSI Ágar Lowestein Jensen
Ágar Manitol - Famílias Micrococcaceae
Ágar Mac Conkey, EMB - Crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose
Ágar Salmomella Shigella
Ágar Sabouraud - Identificação de fungos patogênicos e leveduras.
Ágar Bili-Esculina - Isolamento e identificação de estreptococos.
Ágar Dnase - Recomendado para a detecção da atividade desoxiribonuclease de bactérias e fungos. Staphylococcus aureus.
Ágar TSI - Diferenciação de patógenos entéricos (E. coli) pela capacidade de determinar a fermentação do carboidrato.
Ágar Lowestein Jensen - Mycobacterium tuberculosis
Azul de Toluidina
Caldo tetrationato Caldo selenito Caldo nitrato Caldo malonato Caldo triptona e SIM Caldo BHI
Caldo tetrationato Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp.- Cosposto por sais de bile impede o crescimento de bactérias Gram-positivas e o iodo proporciona o impedimento de crescimento de espécies fecais.
Caldo selenito. Diferenciar e identificar vários tipos de bactérias especialmente a família Enterobacteriaceae. Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.
Caldo malonato usado para a diferenciação de bactérias gram-negativas com base na habilidade de utilizar malonato e produzir ácido pirúvico.
Caldo triptona e SIM Metabolizar o triptofano em indol. Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.
Caldo BHI. Caldo infusão de cerebro e coração e um meio altamente nutritivo empregado para a propagação de cocos.
Ágar Nutriente Salina tamponada Clary Blair Meio Stuart Água peptonada
Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população.
Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão.
Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.
Declínio: A maioria das células está em processo de morte
O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo:
N=No.2n, onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações.
n= log(N) - log(No)/0.301
g = t/n , onde g= tempo de geração, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.
Tamanho: diâmetro em milímetros Forma Elevação Margem Cor: branca, amarela, preta, camurça,
laranja... Superfície: brilhante, opaca Densidade: opaca, translúcida, transparente Consistência: viscosa, butirácea,
membranosa
Odores: tênis sujo (citrobacter spp.), pútrido ( Clostridium difficile), pêlo molhado
( Haemophillus spp), chocolate queimado ( Proteus spp)
Mudanças de cor no meio: indicadores de pH
Avaliação das colônias
Avaliação das colônias
Coloração de Gram Coloração ácido resistente Coloração fluorescente (UV) – fluorocromos
(ag/ac) Laranja de acridina Azul de Toluidina – biópsia de pulmão e
secreções respiratórias
Gram Negativa
Gram positiva
Identificação das características bacterianas referente ‘a coloração da parede celular e sua diferenciação em bactérias Gram positivas e Gram negativas;
Verificação da forma, arranjo e tamanho das bactérias .
Solução de cristal violeta◦ Cristal violeta 1g◦ Ácido fênico 2 g◦ Álcool absoluto 10 mL◦ Água destilada 100 mL
Lugol◦ Iodo 1 g◦ Iodeto de potássio 2 g◦ Água destilada 300 mL
Álcool acetona◦ Álcool 800 mL◦ Acetona 200 mL
Fucsina
◦ Fucsina 2,5 g◦ Álccol etílico 100 mL◦ Água destilada 90 mL
Os corantes devem ser armazenados em frasco de vidro âmbar em locais onde as condições do ambiente sejam favoráveis, com temperaturas entre 20 e 25ºC (temperatura ambiente) e sem teor de umidade.
Amostras recebidas em Swab
◦ Rolar delicadamente o swab sobre a superfície de uma lâmina limpa
◦ Se o swab estiver seco, colocar um pequeno volume de solução fisiológica estéril, agitar vigorosamente, comprimindo-o contra a parede do tubo e utilizar essa suspensão para o preparo do esfregaço.
◦ Deixar secar ao ar e fixar ao calor.
◦ Corar pelo método de Gram
As amostras recebidas em seringa devem ser transferidas para um tubo estéril, homogeneizadas para a execução de um esfregaço em lâmina.
Se a amostra for muito espessa, diluir em solução fisiológica estéril antes de fazer o esfregaço.
Para as amostras recebidas em frascos ou tubos estéreis, selecionar a parte mais purulenta e confeccionar o esfregaço em lâmina. Espalhar a amostra em ¾ da lâmina e formar o esfregaço fino.
Deixar secar ao ar e fixar com calor. Corar pelo método de Gram
Colocar uma pequena gota de solução fisiológica sobre a lâmina.
Com a alça bacteriológica, tocar a superfície de uma colônia isolada e emulsionar gentilmente na gota de solução fisiológica colocada sobre a lâmina.
Deixar secar ao ar e fixar no calor
Corar pelo método de Gram.
Após centrifugação (3.000 a 5.000 rpm / 15 min.) remover o sobrenadante e deixar aproximadamente 0,5 mL do sedimento.
Homogeneizar e confeccionar o esfregaço (+/- 50 uL do material – 1 gota)
Deixar secar ao ar e fixar no calor.
Corar pelo método de Gram
Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen;
Flambar a alça de platina até o rubor e esfriá-la.
Tomar o tubo de cultura com a mão esquerda e com os dedos mínimo e anelar da mão direita remover a tampa do tubo;
Flambar a boca do tubo de cultura;
Introduzir a alça de platina, apreendida entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do tubo até tocar o meio de cultura
Flambar novamente a boca do tubo de cultura;
Fechar o tubo e colocá-lo na estante; Tomar uma lâmina (anteriormente
preparada) com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma amostra de suspensão bacteriana;
Espalhar o material com movimentos de rotação da alça de platina, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, secar naturalmente;
Manter o esfregaço nas proximidades da chama.
Fixar o esfregaço, “cortando” lentamente a chama por 3 vezes, a fim de que o material fique bem aderente à lâmina. A fixação é sempre feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano.
Cobrir com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto;
Cobrir com solução de lugol por 1 minuto; Lavar com água tomando cuidado pra que o
jato não incida diretamente no material a ser analisado.
Descorar com álcool acetona;
Lavar com água;
Corar com fucsina fenicada por 30 segundos;
Lavar com água, secar e observar em objetiva de 100 x com óleo de imersão.
Bactéria Gram positiva – roxo escuro
Bactéria Gram negativa – avermelhadas (rosada)
O cristal violeta cora tanto a parede celular das bactérias Gram + quanto Gram -.
O lugol tem ação de fixador, sendo absorvido por ambas, formando assim o complexo cristal violeta-iodo ( CV-I) corando a bactéria de roxo.
O álcool acetona funciona como um solvente
atuando na porção lipídica da parede celular das bactérias Gram -, resultando numa porosidade e permeabilidade aumentada, extraindo desta forma o complexo CV-I, descorando as células.
O álcool acetona, desidratando a espessa camada de peptideoglicano das bactérias Gram +, provoca a contração dos poros, retendo desta forma o CV-I, mantendo as células coradas.
A última etapa do processo é tratamento com o corante fucsina que cora a parede celular das Gram -, tornado-as avermelhadas ou rosa.
Gram positiva
Gram negativa
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