4. ENSAIOS MICROBIOLÓGICOSPARA PRODUTOS NÃO ESTÉREIS
CONTAMINAÇÃO MICROBIANA
Alterações nas propriedades:- físicas e químicas e,- riscos de infecções
ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS
Produtos cosméticos e farmacêuticos tópicos e orais
Contato com áreas com microbiota normal
Admite a presença de carga microbiana
limitada
Carga microbiana presente no produto
Qualitativo ou quantitativo
Não pode comprometer: - Qualidade final do produto e, - Segurança do paciente
Objetivos da análise:
1. Determinar o número de microrganismos viáveis;
2. Comprovar a ausência de microrganismos patogênicos
• Portaria no.6 de 31.01.1995 (MS)
Norma Técnica para Registro de Fitoterápicos
Pesquisa de contaminantes microbiológicos
Farmacopéia Brasileira ou recomendações da Organização Mundial da Saúde.
1. PADRÕES MICROBIANOS
• RDC Nº. 49, DE 23 DE NOVEMBRO DE 2010Aprova a Farmacopeia Brasileira, 5ª edição, v.1, 2010.
4.1. Limites microbianos para produtos não estéreis
produtos sintéticos e biológicos
Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g / mL
Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL
Pesquisa de patógenosem 1 g/mL
Preparação aquosa para uso oral
102 101 Ausência de Escherichia coli
Preparação não aquosa para usooral
103 102 Idem
Preparação para uso retal
103 102 -
Preparação uso tópico (oromucosa,nasal, gengival, cutâneo, auricular)
102 101 Ausência de Staph. Aureus, Pseudomonas aeruginosa
Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g/ mL
Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL
Pesquisa de patógenosem 1 g/mL
Inalatórios 102 101 Ausência de Staph. aureus,Pseudomonas aeruginosa e bactéria Gramnegativa bile tolerantea
Preparação vaginal
102 101 Ausência de Staph. aureus ,Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans
• Produtos de origem vegetal, mineral e/ou animal
Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g/ mL
Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL
Pesquisa de patógenosem 1 g/mL
Preparação para uso oral contendomatéria-prima de origem natural
104 102 Ausência de Esch. coli e Staph.aureus/ 1 g, ou mL. Ausência de Salmonellaem 10 g/mL. Limite máx. de 102 bactérias Gram negativa bile tolerante b
Extrato seco 104 103 Ausência de Salmonella spp e Esch.coli em 10g
Via administração Contagem total de bactérias aeróbicas UFC/g/ mL
Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL
Pesquisa de patógenosem 1 g/mL
Drogas vegetais que serãosubmetidas a processos extrativosa quente
107 104 Limite máximo de 102 Esch.coli em 1 g.Limite máx. de 104 bactérias Gram negativabile tolerante b em 1 g/ mL. Ausência deSalmonella em 10 g
Tintura, Extrato fluido 104 103 -
Cosméticos & Cosmecêuticos
A) COSMÉTICOS=>intuito de limpar, perfumar – boas condições, proteger ou mudar a sua aparência.
B) COSMECÊUTICOS=>ação cosmética e terapêutica
MATÉRIAS PRIMAS UTILIZADASEM COSMETOLOGIA
• ÁGUA
• EXTRATOS BIOLÓGICOS
• CORANTES
• CONSERVANTES
• ÁLCOOIS
• COMPOSTOS LIPÍDICOS
• COMPOSTOS GLICÍDICOS
• COMPOSTOS DE ORIGEM MINERAL
• VITAMINAS
• MATÉRIAS AROMÁTICAS
Produtos cosméticos aquosos
• Shampoos• Condicionadores• Finalizadores• Sabonetes líquidos• Delineadores e• Rímel• Batom líquido
PRODUTOS COSMÉTICOS
Resolução no. 481, de 23.09.1999, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Produtos cosméticos são subdivididos em 2 grupos: Tipo I e Tipo II
Tipo I: - produtos para uso infantil,- para área dos olhos - aqueles que entram em contato com
a mucosa. Tipo II:
- demais produtos susceptíveis à contaminação.
PADRÃO MICROBIOLÓGICO
• Tipo I: > 102 UFC/g(mL) de microrganismos
totais aeróbicos;
Ausência de: - Pseudomonas aeruginosa, -
Staphylococcus aureus, Coliformes totais e fecais em 1g(mL)
• Tipo II:
> 103 UFC/g(mL) de microrganismos totais aeróbicos;
Ausência de: - Pseudomonas aeruginosa, -
Staphylococcus aureus, - Coliformes totais e fecais em 1g(mL)
PRODUTOS FARMACÊUTICOS DE USO ORAL E TÓPICO
Cápsulas, comprimidos, suspensões, cremes, adesivos, etc.
Não têm como requerimento serem estéreis
Controle de contaminação microbiana
4.2. MÉTODOS DE ANÁLISE
MEDICAMENTOS NÃO ESTÉREIS E COSMÉTICOS
4 etapas
Amostragem, Coleta e transporte, Quantidade a ser analisada, Preparação da amostra
4.2.1. Amostragem:- Obter frações da parte inferior,
mediana e superior da embalagem
4.2.2. Coleta e transporte
- Recipientes, espátulas ou pipetas esterilizados;
- Recipientes de boca larga com capacidade para 100g(mL)
- Transporte em condições adequadas de temperatura
4.2.3. Quantidade a ser analisada
Recomendação das farmacopéias
10 g(mL)
4.2.4. Preparação da amostra
Verificar a atividade antimicrobiana do produto (conservantes na fórmula)
Inativar
Inativantes específicos para agentes antimicrobianos de fórmulas farmacêuticas e
cosméticos
Antimicrobiano InativanteFormaldeído O,1% de histidina no diluente inicial
Clorados 0,5% de tiossulfato de sódio
Sais de amônio quaternário 3,0% de polissorbato + 0,3% de
lecitina
Continuação:
Fenóis e derivados 1,0% de polissorbato 80 no diluente inicial
Tensoativos anfóteros 3,0% de polissorbato 80 + 0,3% de lecitina
Metais pesados, orgânicos ou ionizados (As, Pb)Cd, Hg, Cr, Mn) 0,1% de cisteína
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
1. Produtos hidrossolúveis:
10 g ou 10 mL da amostra
+ 90mL de solução tampão fosfato - pH 7,2
+ Preparar diluições decimais com o mesmo diluente
2. Produtos de natureza não lipídica insolúveis em água
Preparar suspensão de 10 g ou 10 mL da amostra +
Solução tampão fosfato pH 7,0 +
Polissorbato 80 (na concentração de 1 g/L (agente tensoativo, se necessário)
Preparar diluições decimais com o mesmo diluente
3. Produtos de natureza lipídica
3.1. Método de filtração por membrana
3.1.1. Preparo do diluente - 100 mL de miristato de isopropila
(esterilizado por filtração em membrana)
Dissolver 1 g ou 1 mL da amostra +
100mL do diluente+
polissorbato 80 estéril ou outro agente tensoativo não inibitório (optativo)
Aquecer a 40 – 45ºC
3.2. Método de contagem em placa
Frasco contendo 5 g de polissorbato 20 ou 80 estéril ou outro agente tensoativo não inibitório
+ 10 g ou 10 mL da amostra
Aquecer a temperatura entre 40 - 45°C (Manter aquecido)
1. Adicionar diluente previamente aquecido – proporção 1:10;
2. Misturar, cuidadosamente, mantendo a temperatura máxima de 40 - 45 °C durante o tempo necessário para a formação de uma emulsão, em qualquer caso não mais que 30 minutos;
3. Preparar diluições decimais sucessivas com o mesmo diluente acrescido de polissorbato 20 ou 80.
Cremes e pomadas insolúveis em miristato de isopropila
10 g da amostra +
90 mL caldo caseína-soja contendo 0,1g detetradecilsulfato de sódio (aquecido a 40 - 45 °C)
Agitar até mistura homogênea
Preparar diluições decimais sucessivas com o mesmo diluente acrescido de
0,1% de tetradecilsulfato de sódio.
Cápsulas vazias:
10 g de cápsulas vazias+
90 mL de solução tampão fosfato pH 7,2 aquecido a 40 - 45 °C
+ Agitar no máximo durante 30 minutos
Completar o volume para 100 mL (diluição 5:10)
Preparar diluições decimais sucessivas com o mesmo diluente
Gelatinas
10 g da amostra +
90 mL água estéril aquecida a 40 - 45 °C +
deixar em repouso durante uma hora (diluição 1:10).
Banho-maria a 45 °C
Agitar
Preparar diluições decimais sucessivas em água estéril
4.3. Contagem do número total demicroorganismos mesofílicos
Determinar o número total
Bactérias mesófilas e fungos
Produtos e matérias-primas não estéreis
Satisfaz às exigências microbiológicas farmacopeicas
4.3.1. MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
4.3.1.1. Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (“pour plate”):
a. Agar caseína-soja ou agar nutriente - bactérias;b. Agar Sabouraud dextrose ou agar batata - fungosc. Fazer diluições decimais do produto
d. alíquotas de 1 a 2 mL de cada diluição
Placas de Petri
Meio de Cultura (~20 mL)
Homogeneizar
Incubar a 30º - 35ºC/2-5dias - bactérias 20º - 25ºC/5-7 dias - bolores e leveduras
1. Fazer contagem das colônias;
1. Considerar a diluição;
1. Resultado: UFC/g (mL)
4.3.1.2. Em meio sólido, com semeadura da amostra em superfície
Placas de Petri contendo meio de cultura apropriado
0,1 a 0,5 mL de cada diluição da amostra
Semear com alça de Drigalsky.
4.3.1.3. Membrana filtrante
Filtrar 10mL do produto sob a forma líquidaou suas diluições em membranasapropriadas (0,45μm ou 0,20 μm de poro)
Depositar na mesma posição, sobre placasde Petri contendo meio de cultura apropriado.
4.3.1.4. NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
• Método utilizado apenas quando outros métodos mais precisos não puderem ser utilizados
4.4. PESQUISA DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS
- Pseudomonas aeruginosa – nas preparações tópicas, particularmente naquelas envolvendo regiões próximas aos olhos;
- Staphylococcus aureus – nas preparações tópicas em geral;
- Escherichia coli – nas preparações orais;
- Salmonella sp. – nas preparações orais
1. Meios de enriquecimento
1. Enriquecimento não seletivo de E. coli e Salmonella sp.
10g(mL) da amostra + 100 mL de caldo lactosado
Incubar a 36+/-1ºC/24 a 48 horas
Após o enriquecimento
Semear em ágar SS OU ágar EMB e/ou ágar MacConkey
Incubar 36-37ºC/24-48 h
Identificação bioquímica
Agar MacConkey
Colônias vermelho-tijolo a púrpura com halo de precipitação de bile
.
COLÔNIAS LACTOSE POSITIVA E LACTOSE NEGATIVA
Escherichia coli Agar eosina-azul de metileno
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Colônias com brilho m
etálico esverdeado e centro
escuro
SALMONELLA SP
- Meios de enriquecimento: a. Caldo selenito-cistina; b. Caldo tetrationato
- Meios de isolamento- seletivo-indicador:
a. Agar verde brilhante (coloração transparente);
b. Agar sulfito de bismuto (colônia preta ou esverdeada).
ÁGAR SULFITO DE BISMUTOCOLÔNIA PRETA OU ESVERDEADA
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» Quinto nível
SALMO
NELL
A
ÁGAR VERDE BRILHANTESALMONELLA
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» Quinto nível
E.COLISALMONELLA
Staphylococcus aureus
a. Agar Baird-Parker
Meio específico para estafilococos coagulase-positivos (S. aureus)
Colônias pretas, halo transparente
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
b. Agar Vogel-Johnson Colônias pretas, halo amarelo
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STAPHYLOCOCCUS AUREUS
c. Ágar manitol salgado Colônias amarelas, halo amarelo
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Pseudomonas aeruginosaa. Agar cetrimida
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