MARIANE CAROLINE MEURER
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO
EXTRATO SECO DE Tagetes erecta L. EM MODELO DE
COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRAN
SULFATO DE SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS
Itajaí (SC)
2018
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
MARIANE CAROLINE MEURER
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO
EXTRATO SECO DE Tagetes erecta L. EM MODELO DE
COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRAN
SULFATO DE SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Prof.ª Drª. Luísa Mota da
Silva.
Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de
Andrade.
Itajaí (SC)
Julho de 2018
“Dedico esse trabalho à minha família,
que nunca mediu esforços para que
todos os meus sonhos se tornassem
realidade.”
“Entregue o seu caminho ao Senhor,
confie nele e Ele agirá.” Salmos 37:5.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar em todos os momentos ao meu lado me mostrando os
caminhos corretos, me levantando em cada tropeço e me dando forças para
seguir sempre em frente.
Aos meus pais, Rosane e Vilmar, que sempre foram dedicados e
companheiros em todas as etapas dessa longa caminhada até aqui. Por todas
as palavras de incentivo, por sempre apoiarem meus sonhos. Obrigada por
acreditarem em mim. Obrigada por toda proteção e amor dedicados a mim.
À minha irmã, por ser amiga e companheira durante essa caminhada. Por
me ajudar a enxergar as coisas de outras formas e por todo amor e carinho
dedicados a mim.
Ao meu namorado, Kalil Mussi, por toda paciência nos incontáveis finais de
semana nos quais precisava me dedicar ao desenvolvimento deste trabalho.
Obrigada por todo amor, carinho, pelos sonhos compartilhados e palavras
de incentivo ao longo dessa caminhada.
À minha família, que mesmo longe sempre tiveram uma palavra de
incentivo e carinho.
À minha orientadora, Profª Luísa Mota da Silva, que acreditou em mim
desde o início e que mesmo entre troca de projeto, de orientador e correrias
sempre transmitia paciência e pedia para que eu confiasse nela, que tudo
daria certo. E deu mesmo, prof! Você tinha razão! Obrigada por todos os
ensinamentos, por todos os puxões de orelha, por toda a paciência e carinho
dedicados a mim.
Ao meu co-orientador, Sérgio Faloni de Andrade, que aceitou me orientar
no início, acreditando em meu potencial e depois me entregou nas ótimas
mãos da profª Luísa. Obrigada por acreditar em mim, prof Sérgio. Obrigada
pelos ensinamentos durante o pouco tempo que estivemos juntos.
Agradeço a doutoranda Luísa Nathália Bolda Mariano, que com toda
paciência do mundo me ensinou tudo, sem medir esforços. Cuidou dos
animais para mim nos dias em que eu não estava presente, dividiu muitas
risadas no laboratório. Obrigada.
À doutoranda Thaise Boeing, que realizou os experimentos com células
para enriquecer ainda mais essa pesquisa e por toda ajuda dedicada no
laboratório, nas análises, e na interpretação dos resultados. Obrigada.
À mestranda, Mariéli Mees, por toda parceria nesses quase dois anos. Por
todas as risadas, confidências e piadas, por toda palavra de apoio e força.
Obrigada por sua amizade.
Ao professor, Luiz Carlos Klein Junior, que realizou a análise química do
extrato e por todo conhecimento dividido nas aulas de Análise fitoquímica.
Ao grupo de Gastro/Cardio, por me acolherem, me ensinarem e me
ajudarem a realizar esse trabalho. Sem vocês não teria sido possível.
Obrigada, de coração.
Aos técnicos dos laboratórios de Farmacologia in vitro, Farmacologia in
vivo e Fitoquímica. Muito obrigada por todo apoio.
À banca, Tania Mari Bellé Bresolin, Márcia Maria de Souza e Geisson
Marcos Nardi, por todas as contribuições para melhorar ainda mais o meu
trabalho.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pela
oportunidade e estrutura para desenvolver as pesquisas em pról da ciência.
À CAPES pelo auxílio financeiro durante esse período.
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO
EXTRATO SECO DE Tagetes erecta L. EM MODELO DE
COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRAN
SULFATO DE SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS
Mariane Caroline Meurer
Agosto de 2018
Orientador: Profª. Drª. Luísa Mota da Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 152
Palavras-chave: Colite. Inflamação Intestinal. Intestino Grosso. Luteína.
Resumo: A Tagetes erecta, conhecida popularmente como Marigold,
calêndula africana ou cravo de defunto, é fonte de inúmeros corantes
naturais e outros produtos bioativos de bastante interesse. A infusão das
flores de T. erecta é popularmente utilizada para tratar doenças
gastrointestinais, incluindo estomatites, dispepsia, cólica e diarreia. As
Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são caracterizadas por inflamação
intestinal crônica em decorrência de uma resposta imunológica exacerbada.
A Colite Ulcerativa (CU) é uma doença inflamatória intestinal difusa, não
específica, de causa desconhecida que afeta continuamente a mucosa
colônica proximal do reto e muitas vezes forma úlceras. O tratamento atual
gera inconvenientes, como: baixo índice de remissão, efeitos adversos
apresentados pelo uso prolongado de anti-inflamatórios esteroidais, além do
custo associado à terapia, tornando evidente a necessidade de pesquisas por
novos tratamentos ou terapias para as DII. O presente estudo teve como
objetivo investigar o potencial do extrato seco de T. erecta, no modelo de
CU induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos.
Inicialmente, foi determinada a quantidade de luteína no extrato através de
espectroscopia por ressonância magnética nuclear e a quantidade de fenóis
totais. A atividade sequestradora de radicais livres foi realizada pelo método
de DPPH, a citotoxicidade em enterócitos murinos (linhagem IEC-6)
através de MTT, bem como os efeitos do extrato na produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs) e óxido nítrico em células IEC-6 expostas ao
LPS foram quantificados in vitro. Nos testes in vivo, a CU foi induzida por
DSS a 5% na água dos camundongos, por 7 dias. Os animais foram tratados
com o extrato seco de T. erecta (ESTE) nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg
via oral. No 10° dia o cólon dos animais foi retirado para posterior análise
histológica (dano histológico e quantificação de mucinas), avaliação de
parâmetros bioquímicos (GSH, LOOH, SOD, CAT, GST, MPO, TNF- α,
IL-6 e proteínas). Em paralelo, os efeitos do extrato (300 mg/kg, v.o) no
trânsito intestinal e na diarreia induzida por óleo de rícino também foram
mensurados em camundongos. A concentração de luteína no ESTE foi de
8,2% e de fenóis totais de 239,3 ± 19,6 mg/g de extrato em termos de ácido
tânico. Entretanto, no teste de DPPH, o ESTE sequestrou o radical apenas a
1000 µg/ml. Nos testes in vitro, a incubação com ESTE não alterou a
viabilidade celular de células epiteliais intestinais murinas, porém reduziu
os níveis de EROs produzidas após estimulo por LPS. Nos ensaios in vivo, a
administração de ESTE (300 mg/kg) atenuou a perda de peso, o índice de
atividade da doença, o encurtamento do cólon e as alterações
histopatológicas promovidas pela CU. Em paralelo, a administração do
ESTE (300 mg/kg) aumentou a marcação para mucinas colônicas e
aumentou níveis de GSH e a atividade de CAT, normalizou os níveis de
SOD e GST, e reduziu os níveis de MPO, TNF e IL-6 no tecido colônico de
animais expostos ao DSS. Apesar da redução da diarreia em animais com
CU, a administração de ESTE (300 mg/kg) não alterou o trânsito intestinal
de camundongos saudáveis e não preveniu a diarreia induzida por óleo de
rícino. Em conclusão, os dados demonstram o potencial anti-inflamatório
intestinal do ESTE atribuído à luteína presente no extrato. Além disso,
ainda que pré-clinicamente, este estudo contribui para a validação do uso
deste extrato como suplemento nutricional para o tratamento adjuvante de
desordens inflamatórias intestinais.
Palavras-chave: Colite. Inflamação Intestinal. Intestino grosso. Luteína
INTESTINAL ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF DRIED
EXTRACT OF Tagetes erecta L. IN A MOUSE MODEL OF
DEXTRAN SODIUM SULFATE (DSS)-INDUCED COLITIS
Mariane Caroline Meurer
August 2018
Advisor: Dr. Luisa Mota da Silva
Co-advisor: Dr Sérgio Faloni de Andrade
Area of concentration: Natural products and bioactive synthetic compounds
Number of pages: 149
Keywords: Colitis. Inflammation Intestinal. Large Intestine. Lutein.
ABSTRACT: Tagetes erecta L, popularly known as Marigold, African
marigold or marigold, is a source of numerous natural dyes and other
bioactive products of considerable interest. The infusion of T. erecta flowers
is popularly used to treat gastrointestinal diseases, including stomatitis,
dyspepsia, stomachache and diarrhea. Inflammatory Bowel Diseases (IBD)
are characterized by chronic intestinal inflammation as a result of an
exacerbated immune response. Ulcerative Colitis (UC) is a non-specific
diffuse inflammatory bowel disease of unknown cause that continually
affects the proximal colonic mucosa of the rectum, often forming lesions
and/or ulcers. Current treatment shows some drawbacks, such as low
remission rates, adverse effects due to prolonged use of steroid anti-
inflammatory drugs, and the cost associated with the therapy, making the
need for research on new treatment options or adjunctive or complementary
therapies for IBD evident. The present study aimed to investigate the
potential of the dry extract of T.erecta in dextran sodium sulfate-induced
ulcerative colitis (DSS) in mice. The amount of lutein in the extract was
determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy, and total phenols,
radical scavenger capability, cytotoxicity and effects on reactive oxygen
species and nitric oxide production were evaluated in vitro. UC was induced
by DSS (a sulfated polysaccharide inducer of intestinal inflammation) at 5%
in the water served to mice for 7 days. The animals were treated with the
dry extract of T. erecta (DETE) at oral doses of 30, 100 and 300 mg/ kg. At
the tenth day, the colon of the animals was removed for histological analysis
(histological damage and quantification of mucins), and measurement of
biochemical parameters (GSH, LOOH, SOD, CAT, GST, MPO, TNF-α, IL-
6). Further, the effects of DETE (300 mg/kg, p.o) on intestinal transit and
diarrhea induced by castor oil in mice were also evaluated. Lutein
concentration in ESTE was 8.2%, with total phenols of 239,3 ± 19,6 mg/g.
However, ESTE sequestered the radical DPPH only at the highest
concentration (1000 µg/mL). In the in vitro trials, the incubation with DETE
did not alter the cell viability of murine intestinal epithelial cells, but
reduced the production of ROS stimulated by LPS. In the in vivo trials,
administration of DETE (300 mg/kg) attenuated weight loss, disease
activity index, colon shortening and histopathological changes promoted by
UC in mice. Concurrently, administration of DETE (300 mg / kg) increased
marking for colonic mucins and increased GSH levels and CAT activity,
regularized SOD and GST levels, and reduced levels of MPO, TNF and IL-
6 in the colonic tissue of animals exposed to DSS. Despite the reduction of
diarrhea in animals with UC, the administration of DETE (300 mg / kg) did
not alter the intestinal transit of healthy mice and did not reduce the diarrhea
induced by castor oil in mice. It can be concluded from the data that DETE
exhibits intestinal anti-inflammatory potential. The levels of lutein present
in the extract may justify such an effect. In addition, although still
preclinical, this study contributes to the validation of the use of this extract
as a nutritional supplement for the adjuvant treatment of inflammatory
bowel disorders.
Keywords: Colitis. Intestinal Inflammation. Large intestine. Lutein.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Localização anatômica de segmentos teciduais na cavidade
abdominal. ................................................................................................... 34 Figura 2 - Representação da organização celular do epitélio intestinal. .... 35 Figura 3 - Ação dos AGCC no sistema imunológico. ................................ 39 Figura 4 - Esquema representativo do envolvimento da microbiota
intestinal na homeostasia intestinal e nas DII. ............................................ 41 Figura 5 - Tagetes erecta L. ....................................................................... 65 Figura 6 – Estrutura química da luteína. .................................................... 66 Figura 7 – Danos causados por DSS no epitélio intestinal de camundongos.
.................................................................................................................... 72 Figura 8 – Desenho experimental do modelo de colite ulcerativa induzida
por DSS. ...................................................................................................... 81 Figura 9 – Efeito do ESTE nos níveis de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH). ....................................................................................................... 90 Figura 10 – Efeito do ESTE na viabilidade celular em células IEC-6. ...... 91 Figura 11 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) no dano celular em células IEC-6.
.................................................................................................................... 92 Figura 12 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) nos níveis de nitrito em células
IEC-6. .......................................................................................................... 93 Figura 13 – Efeito do ESTE na evolução da perda de peso em
camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. .............................. 94 Figura 14 – Efeito do ESTE no IAD em camundongos com colite
ulcerativa induzida por DSS........................................................................ 95 Figura 15 – Efeitos do ESTE no comprimento do cólon de camundongos
com colite ulcerativa induzida por DSS. ..................................................... 96 Figura 16 – Efeito do ESTE no escore histológico associado a colite
ulcerativa induzida por DSS em camundongos. .......................................... 98 Figura 17 – Efeito do ESTE nos níveis de mucina do cólon de
camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. .............................. 99 Figura 18 – Efeito do ESTE nos níveis de MPO no cólon de camundongos
com colite ulcerativa induzida por DSS. ................................................... 101 Figura 19 – Efeito do ESTE nos níveis de TNF no cólon de camundongos
com colite ulcerativa induzida por DSS. ................................................... 102
Figura 20 – Efeito do ESTE sobre os níveis de IL-6 no cólon de
camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. ............................ 103 Figura 21 – Efeito do ESTE no trânsito intestinal de camundongos
saudáveis. .................................................................................................. 104 Figura 22 - Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino em
animais saudáveis. ..................................................................................... 105
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características clínicas e epidemiológicas dos dois principais
subtipos de doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite
ulcerativa. .................................................................................................... 49 Tabela 2 – Evidências clínicas do uso de plantas medicinais na Colite
Ulcerativa. ................................................................................................... 62 Tabela 3 – Teor de luteína nos alimentos. .................................................. 70 Tabela 4 – Escore histológico. ................................................................... 86 Tabela 5 – Quantificação de fenóis totais do ESTE. .................................. 89 Tabela 6 – Efeitos de ESTE sobre o peso do cólon, baço e fígado de
camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. .............................. 97 Tabela 7 – Efeitos do ESTE nos parâmetros oxidativos no colon de
camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. ............................ 100
LISTA DE ABREVIATURAS
5-ASA – ácido 5-aminossalicílico
6-MP – 6-mercaptopurina
6-TNG - 6-tioguanina nucleotídeo
AGCC – Ácidos graxos de cadeia curta
AINEs – Anti-inflamatórios não-esteroidais
ALFAC – 85% álcool etílico 80%, 10% formaldeído e 5% de ácido acético
glacial
AMPK - proteína quinase ativada por adenosina monofosfato
ANVISA – Agência de vigilância sanitária
AZA – Azatioprina
Breg – Células B regulatórias
CAT – catalase
CCK – Colecistocinina
CGRP – peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX-2 – Ciclo-oxigenase 2
CSA – Ciclosporina
CU – Colite Ulcerativa
DC – Células dendríticas
DC – Doença de Crohn
DHA – ácido graxo docosaexaenóico
DII – Doenças Inflamatórias Intestinais
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DPPH – 2,2-difenil-1- picrylhydrazyl
DSS – Dextran sulfato de sódio
E.A.T – equivalente ácido tânico
EGFR – do inglês Epidermal growth factor receptor
EPA – ácido graxo eicosapentaenoico
ERO – Espécies reativas de oxigênio
ESTE – Extrato seco de Tagetes erecta L.
EUA – Estados Unidos da América
FBS – soro fetal de bovino
FDA – do inglês Food and Drug Administration
GAE – equivalente de ácido gálico
GALT – do inglês gut-associated lymphoid tissue
GPx – glutationa peroxidase
GR – Receptor glicocorticoide
GSH – glutationa reduzida
GST – glutationa S-transferase
H2O2 – peróxido de hidrogênio
HFD – do inglês high fat diet
HLA – Antígeno leucocitário humano
HO-1 – heme oxigenase 1
IAD – Índice de atividade da Doença
IEC-6 – epitélio intestinal murinho
IFN-γ – Interferon gama
IFX – Infliximab
IgG – Imunoglobulina G
IKK – IκB quinase
IL-10 – Interleucina 10
IL-11 – Interleucina 11
IL-12 – Interleucina 12
IL-1β – Interleucina-1 beta
IL23r – receptor de interleucina 23
IL-4 – Interleucina 4
IL-6 – Interleucina 6
ILC – Células linfoides inatas
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
JECFA – Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives
LOOH - hidroperóxidos lipídicos
LPS – Lipopolissacarídeo
MAdCAM-1 - Sítio da mucosa na molécula de adesão celular 1
MAIT – do inglês mucosal-associated invariant T
MAPK – Proteínas quinases ativadas
MDP – Muramildipeptidio
MPO – mieloperoxidase
MTX – Metotrexato
NaNO2 – nitrito de sódio
NF-kB – do inglês factor nuclear kappa B
NK – Células natural killers
NOD2 – Domínio de oligomerização de nucleotídeo 2
OCl- – Hipoclorito
OH• – Radical hidroxila
ONO2- – Peroxinitrato
PAR – do inglês protease activated receptors
PAS – periódico de Schiff
PCR – Proteína C reativa
PRR – Receptor de reconhecimento de padrão citosólico
RMN – ressonância magnética nuclear
RXR - Receptor de ácido retinoico
SIRT1 – Sirtuína 1
SNC – Sistema Nervoso Centra
SNE – Sistema Nervoso Entérico
SOD – superóxido dismutase
TGI – Trato Gastrointestinal
Th – do inglês T helpers
TJ – do inglês Tight Junctions
TMAO – do inglês trimethylamine N-oxide
TNBS - Ácido Trinitrobenzeno Sulfônico
TNF – do inglês Tumor Necrosis Factor
Tregs – Células regulatórias do tipo Treg
TRP – Potencial de receptor transitório
VIP – Peptídeo intestinal vasoativo
ZO – do inglês Zonula Occludens
SUMÁRIO
2 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 27
3 OBJETIVOS ........................................................................................... 31
3.1Objetivo geral ................................................................................. 31
3.2 Objetivos específicos ...................................................................... 31
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 33
4.1 Anatomia e fisiologia intestinal .................................................... 33
4.2 Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs): Aspectos Gerais ....... 41
4.2.1 Diagnóstico ............................................................................. 47
4.2.2 Doença de Crohn ................................................................... 47
4.2.3 Colite ulcerativa ..................................................................... 50
4.2.4 Tratamento da Doença Inflamatória Intestinal .................... 51
4.3 Tagetes erecta L. ............................................................................. 63
4.3.1 Luteína ................................................................................... 65
4.4 Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal ......... 71
4.4.1 Colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) ............ 71
4.4.2 Colite induzida por Oxazolona .............................................. 73
4.4.3 Colite induzida por ácido acético ........................................... 74
4.4.4 Colite induzida por Salmonella ............................................. 74
4.4.5 Colite Induzida por Escherichia coli aderente e invasiva ..... 74
4.4.6 Colite Induzida por administração de Ácido Trinitrobenzeno
Sulfônico (TNBS) ....................................................................................... 74
4.4.7 Colite induzida por modificação genética – modelos
knockout..................... ................................................................................ 75
5 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 77
5.1 Obtenção do extrato ...................................................................... 77
5.2 Análise fitoquímica ........................................................................ 77
5.2.1 Determinação de luteína através de espectroscopia por
ressonância magnética nuclear ................................................................. 77
5.2.2 Determinação de fenois totais ................................................ 78
5.3 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-
difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) ............................................................... 78
5.4 Cultura celular ............................................................................... 78
5.4.1 Viabilidade celular ................................................................. 79
5.4.2 Determinação de espécies reativas de oxigênio (EROs) em
células expostas ao LPS ............................................................................. 79
5.4.3 Determinação de nitrito em células expostas ao LPS ........... 79
5.5 Ensaios in vivo ................................................................................ 80
5.5.1 Animais ................................................................................... 80
5.5.2 Grupos experimentais ............................................................ 80
5.5.3 Indução da colite ulcerativa por dextran sulfato de sódio
(DSS) 5%............................. ........................................................................ 80
5.5.4 Avaliação do trânsito intestinal ............................................. 82
5.5.5 Diarreia induzida com óleo de rícino .................................... 83
5.6 Ensaios ex vivo ................................................................................ 83
5.6.1 Quantificação de glutationa reduzida (GSH) no colón ........ 83
5.6.2 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) no
colón.......................... .................................................................................. 84
5.6.3 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD)
no colón....................... ................................................................................ 84
5.6.4 Determinação da atividade da Catalase (CAT) no colón ...... 84
5.6.5 Determinação da atividade da glutationa S-transferase (GST)
no cólon.................... ................................................................................... 84
5.6.6 Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no colón ........ 85
5.6.7 Dosagem de citocinas ............................................................. 85
5.6.8 Dosagem de proteínas ............................................................ 85
5.6.9 Avaliação histológica ............................................................. 86
5.6.10 Quantificação dos níveis de mucinas .................................. 87
5.7 Análise estatistica .......................................................................... 87
6 RESULTADOS ...................................................................................... 89
6.1 Análise fitoquímica ........................................................................ 89
6.1.1 Teor de luteina ....................................................................... 89
6.1.2 Fenois totais ........................................................................... 89
6.2 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-
difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) ............................................................... 89
6.3 Cultura celular ............................................................................... 90
6.3.1 Efeito do ESTE na viabilidade celular de enterócitos murinos
(células IEC-6)........... ................................................................................ 90
6.3.2 Efeito do ESTE na produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs) em células expostas ao LPS .......................................................... 91
6.3.3 Efeito do ESTE nos níveis de nitrito em células expostas ao
LPS.................... ......................................................................................... 93
6.4 Análise in vivo ................................................................................ 93
6.4.1 Efeito sobre a perda de peso .................................................. 93
6.4.2 Efeito sobre o Índice de atividade da doença (IAD) ............. 94
6.4.3 Efeito sobre o encurtamento do cólon ................................... 95
6.4.4 Efeito do ESTE sobre o peso do cólon, do baço e do fígado de
camundongos com colite induzida por DSS .............................................. 97
6.5 Análise ex vivo ................................................................................ 97
6.5.1 Efeito do ESTE sobre o escore histológico ........................... 97
6.5.2 Efeito do ESTE sobre os níveis de mucinas quantificadas
histoquimicamente ..................................................................................... 99
6.5.3 Efeitos do ESTE sobre parâmetros oxidativos .................... 100
6.5.4 Efeitos do ESTE em parâmetros inflamatórios .................. 101
6.6 Efeito do ESTE sobre o trânsito intestinal de camundongos
saudáveis....................................................................................................103
6.6.1 Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino. .... 104
7 DISCUSSÃO ......................................................................................... 107
CONCLUSÃO ......................................................................................... 119
REFERÊNCIAS ...................................................................................... 121
ANEXO A - Aprovação da Comissão de Ética no uso de animais –
CEUA/UNIVALI. .................................................................................... 149
27
2 INTRODUÇÃO
As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são caracterizadas por
inflamação intestinal crônica em decorrência de uma resposta imunológica
exacerbada. Sabe-se que essa resposta imunológica sofre influência de
fatores ambientais e genéticos (ZHANG et al., 2014).
Dentre as DII pode-se citar a Doença de Crohn (DC) e a Colite
Ulcerativa (CU), as quais diferem pelo segmento intestinal acometido
(ABRAHAM; CHO, 2009). A DC é classificada como doença inflamatória
transmural, o que significa que lesiona todas as camadas em praticamente
toda a extensão do intestino, diferente da colite ulcerativa, cuja lesão se
restringe a algumas regiões do cólon e ocorre apenas na camada mais
superficial denominada mucosa. Os sintomas da colite ulcerativa consistem
em diarreia sanguinolenta, dor abdominal e eliminação de pus e/ou muco
durante as evacuações (VITOR et al., 2009; WEYLANDT et al., 2007).
A inflamação causada pelas DIIs está relacionada às disfunções na
resposta imune, especialmente das células T presentes na mucosa intestinal,
além do desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias, tais como o fator
de necrose tumoral (TNF, do inglês Tumor Necrosis Factor), interleucina-1
beta (IL-1β), IL-6 e IL-12, e citocinas anti-inflamatórias, tais como IL-4,
IL-10, IL-11 e de expressão de proteínas inflamatórias que incluem ciclo-
oxigenase 2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzida (iNOS), os quais
desempenham um papel importante no processo inflamatório
(SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN, 2014).
Em todo o mundo, a CU é mais comum do que a DC, ambas são
doenças características do mundo industrializado atingindo particularmente
a América do Norte e Europa Ocidental, com crescimento na Ásia. A
incidência global gira em torno de 1,2 a 20,3 casos por 100.000 pessoas por
ano, enquanto a prevalência é de 7,6 a 245 casos por 100.000 pessoas por
ano (LOFTUS, 2004; DANESE; FIOCCHI, 2011; FEUERSTEIN;
CHEIFETZ, 2014). As incidências mais elevadas foram notificadas no norte
da Europa (24,3 por 100.000), Canadá (19,2 por 100.000) e Austrália (17,4
por 100.000). Já as taxas de prevalência são mais elevadas na Europa (505
por 100.000), no Canadá (248 por 100.000) e nos EUA (214 por 100.000)
(MOLODECKY et al. 2012).
A estimativa é que nos Estados Unidos são gastos cerca de mais de
US$ 2 bilhões de dólares com hospitalização, medicação e colectomia em
28
decorrência da CU (DULAI; LEVESQUE; FEAGAN et al., 2015; MEHTA,
2016). A idade máxima do início da doença é entre 30 e 40 anos (SHAPIRO
et al., 2016).
O impacto da doença durante os períodos de exacerbação afeta de
forma efetiva a qualidade de vida do indivíduo, como suas atividades
cotidianas, vida social, sexual, a capacidade de trabalhar e sua auto
percepção e imagem corporal (UMANSKIY; FICHERA, 2010; COSNES;
GOWER-ROUSSEAU; SEKSIK, 2011). Isso tudo leva a mudanças
emocionais, cognitivo-comportamentais associados à dor causada pela DII.
A literatura estima que 15% - 20% de indivíduos com DII apresentam
ansiedade e depressão, os quais estão associados a uma maior
intensidade/severidade da dor na fase ativa da doença (NEUENDORF et al.,
2016).
Essa patologia tem seu manejo primariamente medicamentoso embora
10% a 15% dos pacientes necessitem de uma colectomia. Os objetivos
terapêuticos são induzir e manter a remissão, reduzir o risco de
complicações e melhorar a qualidade de vida desses indivíduos
(FEUERSTEIN; CHEIFETZ, 2014).
Considerando, os inconvenientes do tratamento atual, tais como, baixo
índice de remissão quando utilizado aminossalicilatos, efeitos lesivos
apresentados pelo uso ou dependência de anti-inflamatórios esteroides, ou
ainda o custo associado à terapia, torna-se evidente a necessidade de
pesquisas por novos tratamentos ou terapias adjuvantes ou complementares
para as DII (AWAADI; EL-MELIGY; SOLIMAN, 2013).
Existem diferentes tipos de terapias alternativas e/ou complementares
envolvendo plantas medicinais, relevantes para o tratamento da inflamação
intestinal (HILSDEN et al., 2011). Relaciona-se o uso dessas plantas à sua
segurança, além da eficácia comprovada devido à presença de diversos
componentes ativos que atuam em diferentes vias da resposta inflamatória.
Porém, o uso de plantas tem uma base empírica, sendo necessário avaliá-las
adequadamente a fim de considerá-las estratégias apropriadas para o
tratamento da DII (ALGIERI et al., 2015).
Dentre as plantas com uso empírico, as flores da Tagetes erecta L.,
vem sendo usada na medicina popular há muito tempo (BREITHAUPT;
WIRT; BAMEDI, 2002) para distúrbios gastrintestinais (diarreia,
indigestão, cólica, acidez, constipação, inchaço, falta de apetite, dor de
estômago), problemas renais, cicatrização de feridas (redução de
29
sangramento e infecções), diurética, problemas de pele (eczema, acne,
coceira, dermatite, entre outras), sedativo e adstringente (MOLLIK et al.,
2010). Além disso, tem sido cultivada com o propósito de extração de
carotenoides, visto que é uma fonte de luteína de baixo custo
(BREITHAUPT; WIRT; BAMEDI, 2002).
Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo investigar o
potencial uso do extrato seco de T. erecta L., no tratamento da colite
ulcerativa induzida por DSS em camundongos.
31
3 OBJETIVOS
3.1Objetivo geral
Investigar o potencial anti-inflamatório e curativo do extrato seco de
Tagetes erecta, no modelo de colite ulcerativa induzida por dextran sulfato
de sódio (DSS) em camundongos.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar o potencial sequestrador de radicais livres in vitro do
extrato seco de T. erecta;
Quantificar os níveis de fenóis totais e luteína no extrato seco de T.
erecta;
Avaliar os efeitos do extrato seco de T. erecta. na viabilidade
celular de células epiteliais intestinais e na produção de espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio por estas células;
Avaliar no modelo de colite induzida por DSS, a capacidade
curativa do extrato seco de T. erecta, por meio da avaliação da
perda de peso, do índice de atividade da doença e de análises
histopatológicas de amostras colônicas;
Avaliar os parâmetros de estresse oxidativo no efeito anti-
inflamatório do extrato seco de T. erecta no modelo de indução de
colite ulcerativa por DSS;
Avaliar a participação da migração neutrofílica no efeito anti-
inflamatório do extrato seco de T. erecta no modelo de indução de
colite ulcerativa por DSS.
Avaliar efeitos do extrato seco de T. erecta nos níveis de citocinas
inflamatórias (TNF e IL-6) no modelo de indução de colite
ulcerativa por DSS.
Avaliar o efeito do ESTE no trânsito intestinal de animais
saudáveis.
33
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Anatomia e fisiologia intestinal
A principal função do trato gastrointestinal (TGI) é o transporte e
absorção de água, eletrólitos e nutrientes. O TGI sofre desafios intensos
para evitar que agentes patogênicos no lúmen gastrointestinal tenham
acesso aos tecidos internos. Diante disso, as células epiteliais do TGI
formam uma barreira seletivamente permeável rigidamente regulada e
especializada (SHEN, 2009).
O primeiro segmento do intestino (Figura 1) é o duodeno, o qual
regula a digestão e a absorção. Suas células, terminações nervosas quimio e
mecanossensíveis monitoram as características do conteúdo luminal e
coordenam funções distantes do TGI, preparando-as para a chegada da
refeição ou retardando o fluxo de conteúdo vindo do estômago. No duodeno
também ocorre a chegada das secreções advindas do pâncreas exócrino e
bile da vesícula biliar (BARRET, 2015a).
O intestino delgado também é composto pelo jejuno e pelo íleo. No
jejuno ocorre a absorção de nutrientes devido às pregas e vilosidades. O
íleo, mais distante, apresenta menos pregas e vilosidades e atua absorvendo
exclusivamente os ácidos biliares, que são recuperados por transportadores
expressos no íleo terminal (BARRET, 2015a).
O intestino grosso recebe esse nome pelo seu diâmetro ser maior que o
do intestino delgado e, tem função de reservatório de armazenamento de
produtos de degradação e materiais não digeríveis antes de sua eliminação
pelas fezes. É segmentado em colo ascendente, transverso, descendente e
sigmoide, os quais desempenham diferentes funções. Os colos ascendentes
e transversos desempenham o papel de absorção de líquidos que
permaneceram do processo de digestão, bem como ácidos graxos de cadeia
curta produzidos pela fermentação bacteriana. A parte mais distal do colo é
onde o material fecal é lançado. Além disso, no intestino grosso é onde se
localiza a maioria das bactérias intestinais, as quais contribuem de maneira
significativa para a saúde dos indivíduos (BARRET, 2015a).
34
Figura 1 - Localização anatômica de segmentos teciduais na cavidade abdominal.
Fonte: adaptado de Tortora; Derrickson (2017).
A parede do TGI começa no esôfago e termina no ânus e sofre
alterações ao longo das várias regiões do TGI. É composta por quatro
camadas (túnicas) com uma rede de nervos interconectadas. As túnicas são
chamadas de: túnica mucosa, túnica submucosa, túnica muscular e túnica
serosa ou adventícia, constituindo assim o tecido epitelial (SPENCE, 1991). Os tecidos epiteliais são essenciais para o corpo humano, fazendo sua
cobertura e proteção, bem como formando glândulas que desempenham
funções, realizam secreção e absorção de substâncias necessárias e
protegem contra agentes físicos, químicos e patogênicos (VASILEVA et al.,
2017).
No intestino, o epitélio, consiste em uma única camada de diferentes
células especializadas (Figura 2), dentre as quais se destacam: enterócitos,
células caliciformes, células neuroendócrinas, células de Paneth, células de
imunidade, como linfócitos intra epiteliais e células dendríticas
(BISCHOFF et al., 2014; COSKUN, 2014). Todas essas células formam as
conhecidas criptas intestinais, com um único revestimento celular,
organizadas de forma colunar e possuindo “junções fortes ou apertadas”
(TJ, do inglês Tight Junctions), junções de aderência e desmossomos. Os
complexos juncionais promovem uma coesão entre as células, regulam a
35
permeabilidade paracelular de íons e moléculas pequenas além de secretar
muco protetor contra agentes microbianos (ANTONI et al., 2014;
GROSCHWITZ; HOGAN, 2009; RODA et al., 2010). Esse arranjo celular
e estrutural promove a separação dos agentes patogênicos presentes no
lúmen intestinal da lâmina própria sub epitelial (CADER; KASER, 2013;
FLIER; CLEVERS, 2009; GEREMIA et al., 2014; KIM; CHEON, 2017).
Figura 2 - Representação da organização celular do epitélio intestinal.
Fonte: adaptado de Antoni et al., 2014.
As tight junctions, fazem a manutenção e regulação da barreira
intestinal, localizam-se na parte superior das células epiteliais adjacentes
(HERING et al., 2017), são numerosas e organizadas horizontalmente
envolvendo as células epiteliais, e dependem das junções de aderência para
serem montadas (TURNER, 2009), são compostas por proteínas
transmembranares, onde cada uma contribui de forma diferente com a
função de barreira (FURUSE et al., 2002).
36
A barreira intestinal tem sua função estabelecida na membrana
plasmática celular epitelial, a qual é impermeável à substâncias hidrofílicas
na ausência de transportadores específicos. O “selo” entre as células
epiteliais requer as tight junctions, as quais realizam uma adesão
especializada preenchendo o espaço paracelular, tendo como função o
controle do fluxo de íons através do tecido e mantendo a polaridade das
células (FARQUHAR; PALADE, 1963; SCHMITZ et al., 1999). Agentes
irritantes de mucosa ou agentes citotóxicos, como medicamentos, podem
promover danos nas células epiteliais resultando em perda de função de
barreira. Sendo assim, as tight junctions funcionam como uma barreira aos
agentes irritantes protegendo as proteínas da membrana plasmática apical
(CAPALDO; POWELL; KALMAN, 2017).
As junções de aderência e os desmossomas fornecem ligações adesivas
fortes que mantem as células próximas promovendo uma comunicação
intercelular. As junções aderentes são compostas por caderinas, uma família
de proteínas transmembranares que promovem fortes interações celulares
adjacentes (HERMISTON; GORDON, 1995; TURNER, 2009).
As proteínas mais importantes presentes nas tight junctions são as da
família das claudinas, que estabelecem vários aspectos da permeabilidade.
As claudinas são uma família de proteínas de junção apertada que consiste
em moléculas de vedação e poros que facilitam a passagem de água e
eletrólitos. As proteínas de Zonula Occludens (ZO-1, ZO-2 e ZO-3) são
proteínas de junção intracelulares importantes, ligando o citoesqueleto
celular às proteínas de junção apertada transmembranares (BISCHOFF et al,
2014).
Essa proteína é expressa de maneira específica no tecido e a sua
mutação ou remoção pode consequentemente produzir efeitos nas funções
orgânicas. A zona occludens 1 (ZO-1) e zona occludens 2 (ZO-2) e
proteínas da membrana periférica, exercem extrema importância na
manutenção e montagem das tight junctions, por promoverem inúmeras
interações com outras proteínas (claudinas, occludinas e actina). Quando há
um funcionamento inadequado das tight junctions ocorre a passagem de
lipopolissacarídeos (LPs), toxinas, bactérias e outros micro-organismos,
promovendo um fluxo desordenado por entre as células intestinais,
prejudicando a permeabilidade da mucosa (PELASEYED et al., 2014).
Como citado anteriormente, a barreira física inclui um componente
celular constituído pelo endotélio vascular, o revestimento das células
37
epiteliais e a camada de muco. Ao lado desta barreira física, substâncias
químicas também participam da função de barreira. Essas substâncias
consistem em secreções digestivas, moléculas imunes, produtos celulares
como citocinas, mediadores inflamatórios e peptídeos antimicrobianos,
produzidos principalmente por células de Paneth nas criptas do intestino
delgado. A microbiota intestinal está envolvida em processos metabólicos e
modula a barreira, mas não representa uma função de barreira per se.
(BISCHOFF, 2011).
As células caliciformes, distribuídas ao longo do intestino, são
responsáveis pela secreção de glicoproteínas chamadas mucinas que
formam a barreira mucosa intestinal, sendo a principal delas a MUC2
(ZHANG; EICHER; APPLEGATE, 2015). As mucinas são classificadas
como mucinas ligadas a membrana ou secretadas, bem como em como
ácidas ou básicas, sendo a ácida responsável na proteção contra a
translocação bacteriana. A camada de muco possui diferentes espessuras,
sua depleção está associada a infecções entéricas e seu espessamento com
menor desempenho por ocorrer menor disseminação de enzimas digestivas
e nutrientes (WLODARSKA et al., 2011). O muco exerce a função de
absorver as bactérias invasivas e promover sua expulsão através do fluxo
luminal, proporcionar lubrificação e servir como nutrientes para bactérias
comensais. Porém, diversos fatores estão associados com a síntese de
mucina como: dieta e suplementos que podem afetar a interação entre
bactérias intestinais e epitélio intestinal (LILBURN; LOEFFLER, 2015;
BROOM, 2018).
Sluis et al. (2006) avaliando a mucosa de camundongos verificaram
que a deficiência ou perda de MUC2 ocasiona brechas na barreira epitelial,
leva a uma morfologia anormal por um aumento de espessura da mucosa
intestinal, achatamento e ulceração de células epiteliais, perda geral de
arquitetura, aumento de células inflamatórias, da proliferação e
diferenciação celular no cólon. Além disso, mudanças na composição do
muco, causadas pela deficiência de MUC2, levam à inflamação do cólon e
que a deficiência de MUC2 contribui para o início e /ou piora da DII.
O corpo humano é colonizado por bactérias, fungos e vírus
coletivamente, essa colonização é conhecida como microbiota comensal.
Esses micro-organismos estão distribuídos em toda a superfície do corpo,
porém o local de maior variedade é no intestino (QIN et al., 2010).
38
O TGI é adaptado à colonização por bactérias comensais que ajudam
na digestão e influenciam no desenvolvimento do sistema imunológico de
mucosa. Porém, a colonização bacteriana pode ser benéfica ou patogênica
dependendo do tipo de bactéria presente e do comprometimento das células
epiteliais de barreira ou imune (PETERSON; ARTIS, 2014).
Estudos em animais têm feito importantes descobertas sobre o papel
da microbiota no desenvolvimento do tecido linfoide associado ao intestino
(GALT, do inglês gut-associated lymphoid tissue) e na presença de células
imunes na parede intestinal (linfócitos intraepiteliais, neutrófilos da lâmina
própria, células dendríticas, ILC3s, células invariante T associado a mucosa
(MAIT, do inglês mucosal-associated invariant T), células TCR αβ Th17,
células regulatórias do tipo Treg (Tregs), imunoglobulinas A). Além disso,
há a hipótese de que há a necessidade de bactérias para a maturação de
células específicas do hospedeiro, como as ligadas ao desenvolvimento das
células Th17. Outra questão importante é que a microbiota protege o
hospedeiro contra agentes patogênicos, por produzirem bacteriocinas e
ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) que são capazes de inibir o
crescimento de bactérias patogênicas (GONÇALVES; ARAÚJO; SANTO,
2018).
O metabolismo microbiano comensal, produz vitaminas essenciais
(vitaminas do complexo B e K), AGCC e metabolizam compostos como os
ácidos biliares, esteróis e xenobióticos. Além disso, a produção desses
compostos favorece o desenvolvimento das células imunológicas
influenciando na homeostase do organismo, sendo as substâncias de mais
destaque nesse papel os AGCC como acetato, propionato e butirato (Figura
3) (GONÇALVES; ARAÚJO; SANTO, 2018).
39 Figura 3 - Ação dos AGCC no sistema imunológico.
Fonte: adaptado de Gonçalves, Araújo e Santo (2018).
Legenda: HDACi (do inglês, histone deacetylases inhibitor - inibidor de histonas
desacetilases); GPR (do inglês, G-protein-coupled receptor – receptor G de proteína
acoplada); Th (do inglês, T-helper); IL-10 (interleucina 10); IgA (imunoglobulina
A); IL-18 (interleucina 18); Tregs (células regulatórias do tipo T); TGF-β ( do
inglês, transforming growth factor beta - fator de transformação do crescimento
beta).
Indivíduos que possuem DII apresentam disbiose pelo número
reduzido de bactérias produtoras de AGCC, consequentemente com
concentrações de butirato reduzidas no intestino. Esse AGCC promove o
aumento das células anti-inflamatórias (Tregs, Tr1 e Bregs) e diminui os
fatores pró-inflamatórios (células natural killers, macrófagos e outras) no
intestino. Sendo essa uma hipótese de correlação entre disbiose intestinal e
DII (GONÇALVES; ARAÚJO; SANTO, 2018).
40
Outra hipótese da relação entre microbiota e DII é que a microbiota
intestinal desempenha importante papel no desenvolvimento da imunidade
intestinal, por bactérias comensais desenvolverem atividades anti-
inflamatórias. Bactérias patogênicas, que podem favorecer o
desenvolvimento da colite ulcerativa, por exemplo, são suprimidas por
bactérias benéficas, através da indução de uma resposta imunológica
regulatória que envolve as células T regulatórias (Tregs), IL-10 e proteína
3γ regenerada (REGIIIγ). Quando ocorre a DII, uma combinação de fatores
genéticos (mutação no domínio de oligomerização de nucleotídeo 2 –
NOD2, gene 16 relacionado à autofagia (Atg16l1), receptor de interleucina
23 (IL23r)), dieta e estresse podem resultar em um desequilíbrio
microbiano, chamado de disbiose. Esse processo acarreta em uma
inflamação crônica envolvendo as células T helpers (Th1 e Th17), isso pode
desencadear uma translocação bacteriana causando diversas patologias ao
hospedeiro (Figura 4) (KAMADA et al., 2013).
41 Figura 4 - Esquema representativo do envolvimento da microbiota intestinal na
homeostasia intestinal e nas DII.
Fonte: Kamada et al. (2013).
Legenda: GALT (tecido linfoide associado ao intestino, do inglês, gut-associated
lymphoid tissue).
4.2 Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs): Aspectos Gerais
A inflamação crônica é caracterizada pela persistência do agente
inflamatório, exposição prolongada a agentes tóxicos ou aparecimento de
fenômenos autoimunitários, onde o processo se mantém por um tempo
maior. Não existem critérios, mas se considera uma inflamação crônica
aquela que persiste por mais de seis meses (PEREIRA, 2012).
Sabe-se que as células do epitélio intestinal são frequentemente
vulneráveis a proteases. Essas proteases podem ser de origem endógena
(proteases pancreáticas), de bactérias ou de partículas alimentares presentes
no lúmen intestinal. A capacidade proteolítica dessas enzimas pode causar
danos à camada epitelial, ao muco e as proteína de junção, prejudicando a
atividade de barreira, por promoverem a abertura do complexo das tight
junctions alterando a permeabilidade paracelular em decorrência da
proteólise e ativação dos receptores ativados por proteinases (PAR, do
42
inglês protease activated receptors) nas células epiteliais. Quando há o
processo inflamatório, como é o caso das DIIs, citando aqui a colite
ulcerativa, as células imunes conseguem se infiltrar na lâmina própria,
produzindo proteases e citocinas amplificando ainda mais o processo e o
ambiente inflamatório, exacerbando a doença (VAN SPAENDONK et al.,
2017).
Sugere-se que a histologia do tecido intestinal de portadores das DII
apresenta uma característica de influxo de células imunes inatas
(neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e Natural killer) e células
adaptativas (células B e T) na lâmina própria. A resposta imune inata
representa a primeira linha de defesa contra patógenos, não é específica e
não produz células de memória (imunidade duradoura). A reação
inflamatória é consequência de um defeito, provavelmente genético, do
indivíduo na regulação imunológica, promovendo assim uma resposta
imunológica inadequada à microbiota intestinal inócua. Sendo assim, se
forma um ciclo onde a lesão epitelial favorece o acesso de produtos
bacterianos na lâmina própria estimulando ainda mais o sistema
imunológico (BARRET, 2015, p. 125-126b).
Quando ocorre a ativação dessas células imunes, simultaneamente há a
elevação de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e citocinas. Além disso, há a hipótese de
que ocorra uma resposta inata na mucosa, uma sensibilidade microbiana
inata, autofagia e respostas de proteínas desdobradas como uma possível via
no desenvolvimento da DII (GEREMIA et al., 2014).
Ueno e colaboradores (2017) enfatizam que inúmeros fatores como
genética, epigenética e microbiota influenciam o desenvolvimento e
plasticidade das células Th17 no intestino. As células Th17 são uma defesa
do hospedeiro contra agentes patogênicos invasores e permite uma
tolerância simultânea entre comensais e fatores alimentares. Essas múltiplas
funções do Th17 depende de sua flexibilidade e é indispensável para a
homeostase do trato gastrointestinal.
A transdiferenciação do Th17 em Treg, IFN- γ secretor de Th1, IL-22
secretora de células Th22-like em respostas às condições ambientais permite
ajustes da resposta imune tornando as células Th17 importantes para o
equilíbrio imune. Porém, isso parece não acontecer nos pacientes com
doença inflamatória intestinal (UENO et al., 2017).
A patogênese da DII é complicada e envolve muitos mediadores pró-
inflamatórios, entretanto, é clara a importância do Th17 na indução e
43
manutenção da inflamação intestinal crônica. Pesquisas demonstram que a
redução da inflamação deve ter como alvo estas células, porém é necessária
uma melhor compreensão e sua segmentação para uma terapia efetiva.
Estudos sugerem também uma consideração das células linfoides inatas, as
quais têm alvos terapêuticos comuns com o Th17 e são abundantes em
pacientes com DII (LEE; KWON; CHO, 2018).
A DII é caracterizada como um distúrbio idiopático, onde os processos
envolvidos com essa doença estão sendo investigados. Como já citado,
sabe-se que há uma associação entre a autoimunidade, porém nenhuma das
DII (doença de Crohn ou colite ulcerativa) são caracterizadas como
autoimunes. Nos últimos tempos, houve um esforço da comunidade
científica a fim de compreender a patogênese da DII, e tem havido
progressos. É bem discutido que a DII sofre influência de diversos fatores,
sugerindo uma confluência entre genética, fatores ambientais e alterações na
microbiota, todos esses acarretando em um sistema imune da mucosa
desregulado, o que permeia os achados clínicos e endoscópicos observados
nos indivíduos acometidos com tais patologias (SHOUVAL; RUFO, 2017).
Avanços nos estudos relacionando a genética e sua contribuição na DII
têm ocorrido nas últimas décadas, devido aos avanços tecnológicos em
testes e análises genéticas (GAYA et al., 2006). Estudos têm relacionado
163 locus de genes com a DII, dos quais 110 estão associados a ambas as
doenças, 30 específicos para doença de Crohn e 23 específicos para Colite
ulcerativa (DUERR, 2007; JOSTINS et al., 2012; ZHANG, 2014).
Estudos relacionados a Doença de Crohn detectaram diversos locus
genômicos associados a esta patologia. Além de confirmar a associação
NOD2. O NOD2 é um receptor de reconhecimento de padrão citosólico
(PRR) desempenha um papel chave na imunidade a bactérias intracelulares
e respostas inflamatórias. NOD2 reconhece muramildipeptidio (MDP), um
componente das paredes de células bacterianas, e sua estimulação leva à
indução de autofagia em células humanas (PHILPOTT et al., 2013).
Esses primeiros estudos identificaram quatro locus genéticos em níveis
de significância estatística de todo o genoma. Houve então o estudo de uma
variante protetora no IL23R, que codifica uma proteína receptora
incorporada na membrana celular de muitos tipos diferentes de células
imunes e, após a ligação da IL23, inicia uma cascata de sinalização que
promove a inflamação e coordena uma resposta imune adaptativa. Além
disso, a associação a uma variante de codificação de proteína em ATG16L1,
44
que codifica uma proteína envolvida na via autofagosoma afirma a
importância da autofagia na DC, sendo esta via responsável por processar
bactérias intracelulares contribuindo para a compreensão da disfunção de
barreira na DC (LANGE; BARRETT, 2015).
Na CU os estudos sugerem a participação de três locus genéticos no
seu desenvolvimento como o HNF4A, que codifica um fator de transcrição
que rege a expressão de componentes CDH1 que produz uma glicoproteína
transmembranar importante para as junções de aderência localizadas nas
células intestinais; o LAMB1 que codifica a subunidade b1 de uma
laminina, os principais componentes não colágenos das membranas basais;
e o clássico HLA (antígeno leucocitário humano), que contém genes que
codificam proteína que representam antígenos na superfície da célula e
regulam o sistema imune adaptativo (LANGE; BARRETT, 2015).
Dentre os fatores ambientais que desempenham um importante papel
na patogenia da DII, pode-se citar: tabagismo, dieta, estresse social e
psicológico.
O tabagismo está associado à complicações intestinais mais
frequentes, aumentando o risco de necessidade cirúrgica durante o curso da
doença inflamatória intestinal. O tabagismo nas DII, mais especificamente
na CU, deve ser desencorajado. Pacientes que possuem CU e desejam parar
de fumar devem ser alertados sobre o potencial risco do aumento da
atividade da doença, bem como o fortalecimento do tratamento
medicamentoso o qual se não suprir a necessidade pode ser evoluído para o
uso de imunossupressores ou biológicos (COSNES, 2016).
Estudos sugerem uma relação entre o tabagismo com as proteínas do
potencial de receptor transitório (TRP), os quais promovem a
despolarização da membrana (influxo de Ca2+
). Os canais de TRP da família
akirina e vanilóide são expressos pelos neurônios sensoriais do sistema
nervoso central (SNC) e entérico (SNE) os quais tem sido relacionados ao
contexto da inflamação intestinal. Portanto, o que se tem sugerido é que o
tabagismo pode afetar os TRPs no intestino de forma semelhante ao
pulmão, promovendo uma imunomodulação através da indução de citocinas
como a IL-8. Esta interação pode elucidar o vínculo mecanicista entre
tabagismo e TRP. Estudos adicionais devem ser realizados para maiores
esclarecimentos das diferenças no íleo e cólon a fim de desvendar o papel
dos canais TRP na patogênese da DII (ALLAIS et al., 2016).
45
A dieta ocidental mudou consideravelmente em paralelo ao
surgimento da DII (HOU; ABRAHAM; EL-SERAG, 2011; ANDERSEN et
al., 2012). Nos últimos anos, o padrão dietético dominado pelo alto
consumo de açúcar refinado, frutose, desequilíbrio entre o balanço ômega-
6:ômega-3, aumento do consumo de fast foods (lanches, pizzas, cereais e
bebidas açucaradas), alta ingestão de carne vermelha, margarina
(RICHMAN; RHODES, 2013), gordura trans, diminuição do consumo de
frutas e legumes (fibras), favoreceram consideravelmente a incidência de
DII (CHAPMAN-KIDDELL et al., 2012; HOU; ABRAHAM; EL-SERAG,
2011).
Bibi et al. (2017) investigaram o impacto da dieta alta em gordura
(HFD, do inglês high fat diet) materna na saúde intestinal da prole usando
um modelo em camundongo de colite induzida por dextran sulfato de sódio
(DSS). Os pesquisadores concluíram que a exposição materna à HFD
acelerou o ganho de peso, mas aumentou a perda de peso corporal induzida
por DSS e os sintomas de colite ativando a sinalização de fator nuclear
kappa B (NF-kB) e estimulando a expressão de IL1b, IL-6 e IL-17 bem
como a indução de neutrófilos nos tecidos do cólon. Além disso, a
exposição materna à HFD suprimiu a atividade da proteína quinase ativada
por adenosina monofosfato (AMPK) e regulou negativamente a sirtuína 1
(SIRT1) e a p53, o que agravou ainda mais a colite DSS na prole. Este
estudo sugere que o consumo materno de HFD predispõe camundongos
descendentes à DII e doenças relacionadas. Além disso, estudos que
promoveram a análise do consumo de proteína de origem animal versus
proteína de origem vegetal identificaram que as proteínas de origem vegetal
aumentam o conteúdo de bactérias benéficas ao hospedeiro e reduz as
patogênicas, aumentando consequentemente a produção de ácidos graxos de
cadeia curta (AGCC), melhorando a barreira intestinal, as células
reguladoras tregs do tipo T (TREGs, do inglês Tregs T regulatory cells) e
reduzindo a inflamação intestinal. Já o consumo de proteína de origem
animal aumenta o conteúdo de bactérias patogênicas e reduz os probióticos,
impactando em uma diminuição da produção de AGCC e aumentando a
produção de N-óxido de trimetilamina (TMAO, do inglês trimethylamine N-
oxide) favorecendo o aparecimento de doenças cardiovasculares e doença
inflamatória intestinal (SINGH et al., 2017).
Os pacientes com DII têm uma alta tendência em apresentar uma
diversidade microbiana intestinal menor, refletindo em menores números de
46
bactérias benéficas o que pode gerar redução das concentrações de butirato,
o qual junto com outros AGCC promove um efeito anti-inflamatório
intestinal (LÓPEZ et al., 2016).
A microbiota intestinal, através da fermentação de prebióticos, tem a
capacidade de produzir AGCC como acetato, propionato e butirato.
Pacientes com DII apresentam conteúdos fecais de AGCC reduzidos.
Dentre os benefícios dos AGCC pode-se citar: 1) inibição da adesão de
micro-organismos patogênicos nas células intestinais; 2) favorecimento de
secreção de bacteriocinas (substância antimicrobiana) por células epiteliais
do cólon; 3) favorecer o crescimento de bactérias benéficas; 4) proporciona
efeitos anti-inflamatório para as células epiteliais através da inibição da
ativação de NF-kB e PPARγ e limitando a produção de IL-1β, IL-6 e TNF-
α; 5) aumento da síntese de mucina através do estímulo do fator de
crescimento epidérmico (EGFR, do inglês do inglês Epidermal growth
factor receptor) favorecendo a homeostase intestinal (EOM et al., 2018).
Outro fator achado na literatura é a relação entre a vitamina D e a
incidência de DII, sendo a hipovitaminose D comum entre pacientes
diagnosticados com tal patologia (LESLIE et al., 2008). Em modelos
experimentais de camundongos a deficiência de vitamina D foi associada
com uma susceptibilidade aumentada a CU induzida por dextran sulfato de
sódio (DSS), sendo que a suplementação, promove melhoras na gravidade
da DII (CARTORNA et al., 2000; LAGISHETTY et al., 2010).
Intervenções dietéticas foram estudadas na DII na tentativa de
controlar e manter sua remissão. Algumas opções se mostraram efetivas,
porém, os mecanismos e componentes precisos sobre o que é importante
para cada intervenção dietética não são bem delineados e muitas vezes
sugerem contradições. Portanto, não há uma intervenção dietética padrão
ouro, sendo assim, os profissionais de saúde promovem as que julgam
melhores, baseadas nas evidências científicas disponíveis (HASKEY;
GIBSON, 2017).
O papel da nutrição na prevenção e melhoria dos sintomas das DII é
amplamente demonstrado. Comparado com a dieta ocidental (rica em
alimentos industrializados – refinados, gordura trans, conservantes), há
benefícios claros em dietas ricas em frutas, legumes, óleo de peixe (rico em
ômega-3), grãos integrais e azeite de oliva, que fornecem nutrientes como
vitamina D, ácidos graxos essenciais, vitaminas, minerais e fibras. Estes
47
alimentos mantêm uma microbiota intestinal saudável, bem como promove
a ingesta de nutrientes diversificados (TOMASELLO et al., 2016).
4.2.1 Diagnóstico
Como já citado, a DII resulta em uma resposta inflamatória
imunológica inapropriada à microbiota intestinal normal em indivíduo
suscetível. O principal método de diagnóstico e acompanhamento dos
indivíduos acometidos por essa patologia é a endoscopia digestiva, um
método invasivo, porém seguro, realizado sob sedação consciente a fim de
gerar o menor desconforto. Além disso, testes sorológicos (marcadores
inflamatórios) e exames radiológicos complementam o diagnóstico e o
acompanhamento (CURY, 2015, p. 41).
Entre os exames de imagem sugeridos para o diagnóstico da CU estão
a endoscopia com biópsia a qual é suficiente para confirmar o diagnóstico e
dar início a terapia medicamentosa em pacientes que apresentam a primeira
crise de CU (OSTERMAN; LICHTENSTEIN, 2010, p. 1985).
Já a colonoscopia não é indicada em pacientes com CU ativa, devido
ao risco de perfuração. Porém, quando passada a fase ativa se torna uma
ferramenta interessante para estabelecer a extensão da doença e excluir a
possibilidade de Doença de Crohn ou outras que possam complicar a CU
(OSTERMAN; LICHTENSTEIN, 2010, p. 1985).
4.2.2 Doença de Crohn
Trata-se de uma doença inflamatória crônica de tipo desconhecida,
caracterizada por áreas descontínuas afetadas com inflamação
granulomatosa transmural (que afeta todas as camadas que constituem a
parede da área doente – da mucosa até a serosa) e/ ou fístula. Pode afetar
qualquer região do trato digestivo da boca ao ânus, mas é mais comum o
envolvimento do intestino grosso e delgado e a região perianal
(MATSUOKA et al., 2018).
Com relação ao gênero de prevalência de acometimento, não há uma
distribuição específica. O que se sabe é que o início da doença ocorre na
segunda a quarta década de vida com um pico menor descrito de 50 a 60
anos (MOLODECKY et al., 2012). Acredita-se ser resultado da interação
entre susceptibilidade genética, fatores ambientais e microflora intestinal
resultando em uma resposta imunológica da mucosa anormal e
comprometimento da função de barreira epitelial (TORRES et al., 2017).
48
Em decorrência da inflamação se formam úlceras profundas, fissuras
que chegam a dar origem a trajetos fistulosos, comunicando o intestino ou o
cólon com outros órgãos, vísceras e estruturas, ou até mesmo terminando no
meio exterior na região perianal ou parede abdominal, causando abscessos
intracavitários. Essas úlceras quando cicatrizadas deformam e causam
estenose do segmento doente (MISZPUTEN; CURY, 2015, p. 24).
Há hipótese de susceptibilidade genética e histórico familiar, onde
12% dos pacientes tem histórico de DC na família (MOLLER et al., 2015).
Estudos genéticos tem identificado mais de 200 alelos associados a DII,
sendo 37 específicos para DC (JOSTINS et al., 2012). Os genes associados
a detecção bacteriana e imunidade inata estão relacionados a função celular
de Th17 (NOD2, vias ATG16L1, LRRK2, IRGM, Il23R, HLA, STAT3,
JAK2 e Th17) e mucosa alterada (MUC2), elucidando importantes
mecanismos envolvidos na patogênese desta doença (LIU et al., 2015;
MCGOVERN; KUGATHASAN; CHO, 2015).
Sobre os fatores ambientais, evidências apontam para a exposição ao
tabaco, exposição à antibióticos na infância, contraceptivos orais, anti-
inflamatórios não-esteroidais (AINEs), fatores dietéticos, estão relacionados
com risco aumentado para o desenvolvimento da DC (TORRES et al.,
2017).
Há crescentes evidências de que os fatores dietéticos desempenham
um papel importante nas DII, especialmente na DC. A exposição a
alimentos ricos em gorduras, glúten, emulsionantes e maltodextrina pode
estar associados aos mecanismos envolvidos na DC. Alguns estudos já
mostram que intervenções dietéticas de exclusão podem favorecer o
tratamento e induzir a remissão da DC, porém com níveis de evidências
baixos (SARBAGILI-SHABAT; SIGALL-BONEH; LEVINE, 2015).
As intensidades das lesões inflamatórias nos exames de imagem
possibilitam classificar a gravidade da doença. Indivíduos que apresentam
suspeita de DC devem ser avaliados com endoscopia digestiva mais baixa e
imagens transversais para avaliar a extensão da doença. O íleo terminal é a
porção frequentemente mais afetada, sendo assim o diagnóstico por imagem
deve ser capaz de fornecer imagens precisas de todo o intestino delgado
para uma avaliação coerente e correta da doença, uma vez que a mesma
pode afetar diversas áreas do trato gastrointestinal superior, as quais
possuem implicações prognósticas e terapêuticas (PITA; MAGRO, 2018).
49
A DC e CU compartilham uma série de características clínicas, porém
existem importantes distinções que sugerem diferenças nas vias subjacentes
que direcionam cada doença (Tabela 1) (BAUMGART; SANDBORN,
2007; BERNSTEIN et al., 2010).
Tabela 1 - Características clínicas e epidemiológicas dos dois principais subtipos de
doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa.
Doença de Crohn Colite ulcerativa
Padrões de incidência Sexo
Mais comum em mulheres
do que em homens
Taxas iguais entre homens e
mulheres
Taxas de
prevalência
DC é mais prevalentes do
que a CU em países
desenvolvidos.
CU surgiu antes da DC em
países desenvolvidos e é
mais prevalente em países
ainda em desenvolvimento.
Localização da doença
Áreas afetadas
Todo o trato gastrointestinal
(da boca ao ânus)
Cólon, e uma potencial
ileíte.
Padrões de
inflamação
Pode ocorrer inflamação
desigual, inflamação
descontínua
Inflamação contínua na área
afetada (embora as vezes um
trecho cecal separado).
Histopatologia
Penetrância Inflamação transmural em
toda a parede
gastrointestinal
Inflamação restrita a camada
mucosa e submucosa (exceto
na colite fulminante)
Aparência
Parede de cólon espessada
com granulomas, fissuras
profundas e aparência de
paralelepípedos
Arquitetura de cripta
distorcida, com erosões
superficiais e úlceras;
granulomas, se presente,
apenas em torno de criptas
Marcadores
sorológicos
Anticorpos Anti-
Saccharomyces cerevisiae
Anticorpos citoplasmáticos
anti-neutrófilos
Complicações Fístulas, massa abdominal
(tipicamente quadrante
inferior direito), obstruções
colônicas e do intestino
delgado, estomatite
Hematoquezia, passagem de
muco ou pus, colite
fulminante e megacólon
tóxico
Fonte: adaptado de Lange e Barrett (2015).
50
4.2.3 Colite ulcerativa
A CU é uma doença inflamatória difusa não específica de causa
desconhecida que afeta continuamente a mucosa colônica proximal do reto
e muitas vezes forma erosões e/ ou úlceras. (MATSUOKA et al., 2018).
Ocorrem frequentemente ciclos de recidiva e remissão e podem ser
acompanhados de complicações extra-intestinais. Quando ele afeta
amplamente o intestino grosso durante um longo período de tempo,
aumenta o risco de desenvolver câncer (KORNBLUTH; SACHAR, 2010).
Pode variar dependendo da intensidade com que ocorrem, da extensão
e da fase da doença, podendo acometer o cólon de maneiras diferentes ao
longo de sua extensão, simulando um comprometimento segmentar do
órgão (BARBOSA; RODRIGUES, 2012). Na fase inicial, a mucosa é
hiperêmica, apresenta grânulos, com coloração avermelhada e friável,
sangra com facilidade, pouco muco, pode apresentar pontos hemorrágicos
que se tornam purulentos e posteriormente formam ulcerações. As úlceras
estão alinhadas ao eixo do cólon, ilhas isoladas de mucosa formam
protuberâncias criando pseudopólipos, os quais podem se unir e formar
pontes mucosas (BARBOSA; RODRIGUES, 2012; TURNER, 2010).
Na fase aguda, por exemplo, é possível observar a presença de células
inflamatórias como mastócitos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos dos
tipos CD4+ e CD8+, os quais pela sua citotoxicidade estão relacionados ao
dano de mucosa (NEUMAN, 2007).
Histologicamente a CU pode ser definida como ativa pela
apresentação de um epitélio danificado, aparecimento de abscessos que
se formam a partir de inflação das glândulas anais de Chiari na região da
criptoglandular pela infiltração de neutrófilos (criptite). Sua cronicidade
pode ser definida pela alteração na morfologia das criptas intestinais,
infiltrado linfoplasmocitário basal e metaplasia das células de Paneth no
cólon (DEROCHE et al., 2014).
Sabe-se que o agravamento da doença ou sua cronicidade pode gerar
uma atrofia de mucosa, tornando-a achatada e lisa, o espessamento mural e
as estenoses não ocorrem, a superfície serosa é normal, porém os
mediadores inflamatórios presentes podem danificar a musculatura e
perturbar a função neuromuscular levando à uma dilatação do cólon e ao
megacólon tóxico (TURNER, 2010).
No estágio inicial da doença ocorre congestão, microabscessos nas
criptas e redução das células caliciformes, as quais são substituídas por
51
células imaturas, devido à agressão e aumento da renovação celular. Sendo
assim as criptas se degeneram, os microabscessos se unem e formam as
ulcerações. Nesse tempo formam-se infiltrados de neutrófilos, linfócitos,
plasmócitos, macrófagos, eosinófilos e mastócitos, esses infiltrados
contribuem para o espessamento da mucosa formando abscessos pericólicos
nos casos exacerbados (BARBOSA; RODRIGUES, 2012).
Hipóteses de que pacientes com CU apresentam um aumento na
permeabilidade do epitélio intestinal, consequência das ulcerações, que
levam a uma diminuição da função de barreira já são descritos na literatura.
Essa diminuição da função de barreira somada a inflamação, contribuem
para a patogênese das DII, por permitirem maior exposição à antígenos e
ativação do sistema imunológico (liberação de citocinas pró-inflamatórias,
como TNF, que induz uma disfunção na barreira epitelial por desregular as
junções oclusivas) (EDELBLUM, 2009; HYUN, 2007).
A homeostase intestinal é delicada, e envolve hospedeiro e microbiota.
O hospedeiro possui mecanismos para controlar o microbioma intestinal e
evitar o desenvolvimento inadequado de inflamação, porém, o sistema
imunológico intestinal requer estimulação dessa microbiota para o
desenvolvimento adequado. Por outro lado, enquanto agentes patogênicos
ativam o sistema imune de mucosa do hospedeiro essas respostas impedem
o excesso de crescimento inadequado e translocação de agentes patogênicos
ou até mesmo micro-organismos do próprio do microbioma, além de
impedir o desenvolvimento de inflamações inapropriadas, resultando e um
estado de equilíbrio que favorece o crescimento de micro-organismos
benéficos e impedindo uma inflamação desnecessária (MCDERMOTT;
HUFFNAGLE, 2014).
4.2.4 Tratamento da Doença Inflamatória Intestinal
Sabendo que a colite ulcerativa é uma doença crônica, a abordagem
terapêutica mais favorável é a terapia piramidal, na qual é utilizado como
base o ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) e posteriormente, se necessário,
esteroides e imuno-moduladores, que intensificam a eficácia do tratamento,
tais como o infliximab (IFX), inibidores da calcineurina (ciclosporina A,
tacrolimus) ou procedimentos cirúrgicos, dependendo do grau da doença
(KORNBLUTH; SACHAR, 2010).
O tratamento medicamentoso é focado em induzir a remissão, mantê-
la e favorecer uma nutrição adequada para minimizar as doenças e os efeitos
52
colaterais quem surgem durante o tratamento, a fim de melhorar a qualidade
de vida do paciente. As terapias de manejo tem um enfoque em utilizar a
terapia medicamentosa de forma apropriada otimizando o tempo de cirurgia
(OSTERMAN; LICHTENSTEIN, 2010, p. 1992) (Quadro 1).
Quadro 1 – Terapias medicamentosas na colite ulcerativa conforme o grau da
doença.
Doença grau leve
5-aminosalicilatos
Tópico (colite distal)
Oral (colite distal/ colite extensiva)
Combinação
Doença grau moderado
5-aminosalicilatos
Tópico (colite distal)
Oral (colite distal/ colite extensiva)
Combinação
Glicocorticoides
Tópico (colite distal)
Oral (colite distal/ colite extensiva)
Combinação
Azatioprina ou 6-mercaptopurina
Doença grau severo
Glicocorticoides IV
Ciclosporina IV
Infliximab IV
Legenda: IV – intravenoso.
Fonte: adaptado de Osterman; Lichtenstein, 2010, p. 1992.
Existem duas abordagens terapêuticas diferentes conhecidas como
estratégias step-up ou top-down. A primeira tem como método aumentar a
intensidade do tratamento juntamente com a gravidade da doença. A outra,
na tradução literal “de cima para baixo” inclui o início precoce do
tratamento intensivo com terapias biológicas para evitar complicações
futuras (LEE, 2012).
O uso de terapia medicamentosa tem como objetivo atuar no bloqueio
ou ativação de diferentes células, receptores e mediadores que participam da
reação inflamatória, a fim de interromper a inflamação ou até mesmo
manter a remissão da doença, podendo ser usadas as estratégias step-up ou
top-down citadas anteriormente. Seis classes distintas de medicamentos
estão disponíveis para o tratamento das DII: aminossalicilatos, antibióticos,
53
corticoides, tiopurinas, antagonistas do ácido fólico como o metotrexato e
imunobiológicos (SALES-CAMPOS et al., 2015).
Entre os medicamentos mais utilizados estão os aminosalicilatos, mais
conhecidos como ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) são utilizados no
tratamento da colite ulcerativa leve a moderada. Inicialmente foi
desenvolvido como terapêutica para a artrite reumatoide e posteriormente
foi descoberta a melhora clínica de pacientes com UC (ABRAHAM;
AHMED; ALI, 2017).
A segurança e eficácia clínica do 5-ASA já são bem conhecidas,
porém seus mecanismos de ação não foram completamente elucidados. A
literatura propõe várias ações anti-inflamatórias dessa classe de
medicamentos, dentre elas a inibição do fator nuclear kappa B (NF-kB) e
redução da biossíntese de prostaglandinas e leucotrienos, além de apresentar
propriedades semelhantes aos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs).
Alguns autores discutem os efeitos anti-inflamatórios do 5-ASA através da
ativação do receptor-γ ativado por proliferador de peroxisoma do receptor
nuclear (PPARγ), já que este quando expresso em níveis elevados no
epitélio intestinal favorece a manutenção da integridade da mucosa e regula
a resposta inflamatória epitelial (SHIMADA et al., 2004; WANG et al.,
2018).
Devido ao aparecimento de efeitos colaterais (alergias, náuseas entre
outros) foram aperfeiçoados os sistemas de liberação, para liberação do
fármaco e atuação em diferentes áreas do TGI (Quadro 2) (ABRAHAM;
AHMED; ALI, 2017).
54
Quadro 2 – Formulações de administração oral de derivados do Ácido 5-
aminosalicílico
Nome
genérico
Nome
comercial
Formulação Local de
ação
Mesalazina Mezavant® Sistema multi-matriz (MMX)
(liberação a pH ≥ 7.0)
Cólon
Mesalazina Asacol® Comprimidos revestidos com
Eudragit-S (liberação a pH ≥ 7,0)
Íleo terminal,
cólon
Mesalazina Salofalk® Comprimidos revestidos com
Eudragit-S (liberação a pH ≥ 6,0)
Íleo distal,
cólon
Mesalazina Pentasa® Microgrânulos revestidos com
etilcelulose (liberação dependente
do tempo)
Duodeno,
jejuno, íleo,
cólon
Mesalazina Rowasa® Enema Cólon distal
Mesalazina Canasa® Supositório Reto
Mesalazina Pentasa® Microgrânulos revestidos com
etilcelulose de liberação
controlada.
Duodeno ao
cólon
Mesalazina Lialda® Sensível ao pH, revestido com
matriz múltipla e polimetacrilato;
com liberação prolongada.
Íleo distal e
cólon
Olsalazina Dipentum® Dímero de 5-ASA ligado por
ligação azo
Cólon
Sulfasalazina Salazopyrin® 5-ASA ligado a sulfapiridina por
ligação azo
Cólon
Balsalazida - 4-aminobenzoyl β-alanina + 5-
ASA
Cólon
Legenda: 5-ASA – ácido 5-aminosalicílico.
Fonte: adaptado de HAUSO; MARTINSEN; WALDUM, 2015; OSTERMAN;
LICHTENSTEIN, 2010.
Aproximadamente 90% da Sulfasalazina atinge o cólon, e apenas uma
pequena quantidade é absorvida no intestino delgado. Quando atinge o
cólon, a enzima azoredutase, a qual é produzida pelas bactérias colônicas,
quebram a ligação azo para liberar a porção do constituinte ativo 5-ASA.
Quando este é absorvido pelo cólon, 20% do composto passam por uma
acetilação hepática, formando N-acetil 5-ASA e é excretado pela urina. A
sulfasalazina é considerada a primeira linha de terapia por induzir remissão
em pacientes com colite ulcerativa grau leve a moderado (OSTERMAN;
LICHTENSTEIN, 2010).
Porém, o tratamento com a sulfasalazina apresenta efeitos adversos em
cerca de 20% dos indivíduos provocados pelo componente sulfamídico da
molécula. Entre esses efeitos pode-se citar: rash cutâneo, cefaleia, febre,
55
intolerância gástrica, náuseas, hepatotoxicidade, hemólise, agranulocitose,
metahemoglobulinemia, azospermia e deficiência de folato. Alguns desses
efeitos são logo diagnosticados, porém outros necessitam de observação
laboratorial, como é o caso do desenvolvimento de anemia por deficiência
de folato, por exemplo (MISZPUTEN, 2006. p. 125).
Como a sulfassalazina trazia consigo efeitos adversos, os
pesquisadores buscaram nova alternativa de tratamento e criaram um
medicamento somente a base de 5-ASA (mesalazina), porém sua absorção
quase total no intestino delgado proximal obrigou o encapsulamento
acidorresistente que permitisse a chegada ao íleo e cólon. A mesalazina,
assim com a sulfassalazina alcança sua atividade máxima 3 a 4 semanas
após o início do tratamento e também está disponível para uso tópico por
meio de supositórios que fazem com que a substância entre em contato
diretamente com a mucosa auxiliando na inflamação local. Em alguns
pacientes com queixas de grande número de evacuações de muco e/ou
sangue há a indicação de terapia combinada de mesalazina oral e tópica
(MISZPUTEN, 2006. p. 112 e 113).
Os glicocorticoides são divididos em primeira e segunda geração. Na
primeira geração há a prednisona, metilprednisolona e hidrocortisona, que
foram usados para induzir uma remissão inicial na DII. Porém, efeitos
adversos associados a essa classe foram ocorrendo e levaram ao
desenvolvimento da segunda geração de glicocorticoides como a
budesonida, budesonida MMX, dipropionato de beclometasona (DUBOIS-
CAMACHO et al., 2017).
Seu modo de ação é estabelecido por sua capacidade de modular a
resposta imune, isso ocorre pela interação com receptores de
glicocorticoides no núcleo celular inibindo assim a expressão de moléculas
de adesão e a migração de células inflamatórias para o intestino (FORD;
BERNSTEIN, KHAN, 2011).
Os corticóides exógenos são lipofílicos, aumentando assim sua
biodisponibilidade. São ligados à globulina de ligação aos corticosteroides
ou à albumina (em menor grau) e transportados pela corrente sanguínea,
tem a capacidade de se difundir passivamente através das membranas
celulares e interagir com o receptor glicocorticoide (GR). Quando ocorre a
interação com o receptor, o corticosteroide promove sua ação de inibição de
proteínas pró-inflamatórias (NF-kB), regulando a expressão de citocinas e
quimiocinas pró-inflamatórias (IL1-α, IL-1β e IL-8), além de promover a
56
regulação de citocinas suprimem a expressão de mediadores inflamatórios
como TGF-β e IL-10, aumentando a função anti-inflamatória. Além de
inibir a proliferação de linfócitos T e B e promover o perfil de macrófagos
tolerantes (M2) (DUBOIS-CAMACHO et al., 2017).
Já é bem elucidado que uso de corticoides continuamente, mesmo
em baixas doses, causa efeitos adversos como: osteoporose, síndrome
metabólica, doença cardiovascular e aumento de susceptibilidade para
infecções (FORD et al., 2011).
Os imunomoduladores incluem tiopurinas [6-mercaptopurina (6-
MP) e azatioprina (AZA), metotrexato (MTX) e ciclosporina (CSA)]. Há
hipóteses de que essa classe de medicamentos atue inibindo a proliferação
de linfócitos através da agregação de fármacos ativos em nucleotídeos
celulares, resultando em um efeito anti-inflamatório pela supressão das
células T e atividade das células natural killers (REGUEIRO, 2000;
SAHASRANAMAN; HOWARD; ROY, 2008).
As tiopurinas como 6-MP e AZA são fármacos utilizados para manter
a remissão da DC e CU. O AZA é um pró-fármaco de 6-MP, pois é
metabolizado em 6-MP. Ambos são fármacos análogos da tiopurina e
funcionam através do metabolito ativo de 6-tioguanina nucleotídeo (6-
TNG), o qual causa inibição da síntese de DNA e RNA e apoptose das
células T (FREI, 2013). Efeitos colaterais são causados por esses fármacos,
como náuseas, vômitos e dor abdominal, febre, erupção cutânea e artralgia,
sendo o mais severo a supressão da medula óssea (ABRAHAM; AHMED;
ALI, 2017).
O MTX funciona através da inibição de enzimas envolvidas na via
metabólica do ácido fólico. Acredita-se que os efeitos do MTX se dá devido
à inibição da enzima diidrofolato redutase importante na síntese de purinas
e pirimidinas. As doses de MTX utilizada na DII é baixa, resultando na
inibição de vias folato dependentes e independentes causando
imunomodulação e efeitos anti-inflamatório na DII, como o bloqueio na
produção de IL-1, IL-2, IL-6 e IL-8 (VAN DIEREN et al., 2006).
Como efeito colateral o consumo de MTX inclui náusea, vômito,
fadiga, diarreia, leucopenia, fibrose hepática, pneumonia por
hipersensibilidade e teratogenicidade. A suplementação diária de ácido
fólico (1mg/dia) auxilia na redução dos efeitos colaterais. Além disso, é
importante o monitoramento das funções hepáticas durante o tratamento,
bem como rastreamento para hepatite B e C, contagem sanguínea completa,
57
radiografia do tórax, antes do início do tratamento (ABRAHAM; AHMED;
ALI, 2017).
Já a terapia biológica é utilizada em pacientes com doença grave-
moderada que não respondem mais às outras terapias convencionais
(aminossalicilatos, corticosteroides de imunomoduladores) (RUTGEERTS,
et al., 2005; FEAGAN et al., 2013).
O TNF-α é produzido por linfócitos T e macrófagos. A ligação do
TNF-α ao seu receptor leva ao aumento da expressão de citocinas pró-
inflamatórias (OLESEN et al., 2016). Mecanismos como a neutralização
dos anti-TNFs circulante, inibição do TNF ao seu receptor e sinalização
reversa estão envolvidos na eficácia do tratamento com anti-TNF (agentes
biológicos) (BEN-HORIN et al., 2016).
O uso de fármacos que bloqueiam essas citocinas melhorou o
tratamento dessas patologias. Quatro tipos de fármacos anti-TNF-α estão
disponíveis para o tratamento da DII, sendo eles: infliximab, adalimumab e
certolizumab, na DC e infliximab, adalimumab e golimumab, na CU. Com
exceção do certolizumab, os outros são moléculas de imunoglobulina G
(IgG) que se ligam ao TNF- α solúvel e ligado. Já o certolizumab é um
fragmento Fab da imunoglobulina (que se liga ao TNF- α) ligado a uma
molécula de PEG que melhora sua meia-vida (ABRAHAM; AHMED; ALI,
2017).
O TNF-α tem papel fundamental na morte de patógenos intracelulares,
e está associado ao risco de ativação de tuberculose, histoplasmose e
patógenos similares, por tanto são contraindicados em infecções
importantes como pneumonia. Além disso, o nível de clearance dessa classe
de medicamentos se dá a nível reticuloendotelial e sofre influência de
fatores que aumentam o clearance como sexo, índice de massa corporal
(IMC) e a gravidade da inflamação (que pode ser mensurada pelos níveis de
TNF no sangue e no tecido, proteína C reativa (PCR) e calprotectina fecal),
concentrações de albumina, esteroides e imunossupressores concomitantes e
a presença de anticorpos antidroga (MOULD, 2015).
O infliximab (IFX) demonstra benefícios no tratamento da CU,
especialmente quando refratária a terapias convencionais. A utilização de
IFX é feita como terapia de terceira linha ou terapia de resgate
(RUTGEERTS et al., 2005; SANDBORN et al., 2009). É seguro e
tolerável, mas deve-se analisar o risco-benefício devido ao potencial risco
de sérias complicações, entre elas o desenvolvimento de infecções como
58
tuberculose. Sua administração é via intravenosa na dose de indução de 5 –
10mg/kg (semana 0, 2 e 6), passando para 5 – 10 mg/kg (sempre 4 – 8
semanas) na fase de manutenção (CHANG; HANAUER, 2017).
Thorlund e colaboradores (2014), usando uma meta-análise de
comparação de tratamento indireto, compararam a eficácia do adalimumab e
infliximab e concluíram que o infliximab é estatisticamente mais eficaz que
o adalimumab na indução de remissão, resposta e cicatrização da mucosa às
8 semanas de tratamento, o infliximab e o adalimumab são comparáveis em
eficácia às 52 semanas de tratamento de manutenção.
O adalimumab é um anticorpo monoclonal IgG1 recombinante
humano, que quando administrado se liga ao TNF-α solúvel ligado à
membrana. Quando o adalimumab se liga ao TNF- α solúvel e ligado a
membrana ocorre uma citotoxicidade mediada por células anti-dependente,
fixa o complemento e induz apoptose de células T, ocorrendo então melhora
na inflamação envolvida na DII (BILLMEIER et al., 2016; SPARROW,
2017). Administrado subcutâneo com dose de indução de 160 mg na
semana zero e 80 mg na semana 2 e 40 mg na fase de manunteção (sempre
7 – 14 semanas) (CHANG; HANAUER, 2017).
Estudos randomizados controlados colocam que o adalimumab é um
fármaco eficaz na CU, por induzir a remissão e cicatrização da mucosa
(DANESE, 2013). É bem tolerado, mesmo em pacientes que apresentaram
reações de hipersensibilidade ou reações tardias de hipersensibilidade com o
infliximab. A literatura também relata alguns efeitos adversos como
dermatite fúngica e erupção cutânea leve (PEYRIN-BIROULET et al.,
2007).
O golimumab também é um anticorpo monoclonal IgG1 humano. É
utilizado/indicado em casos de CU moderada a severa ativa em pacientes
que não responderam ou tiveram uma resposta inadequada à terapia
convencional (corticosteroides, 6-mercaptopurina ou azatioprina), ou que
são intolerantes ou possuem contraindicações médicas para tais terapias
(FLAMANT; PAUL; ROBLIN, 2017). Esse fármaco é administrado via
subcutâneo, na fase de indução utiliza-se doses de 200 mg na semana zero,
100 mg na semana 2 e 100 mg na fase de manunteção após 4 semanas
(CHANG; HANAUER, 2017).
O tratamento com golimumab é seguro e bem tolerado, o efeito
adverso frequentemente relatado é o eritema no local da aplicação. Outros
como infecções oportunistas, tuberculose, adenocarcinomas do reto, tireoide
59
e pulmão foram relatados na literatura e precisam de maiores investigações
(SANDBORN et al., 2014).
Kawalec e Pilc (2016) realizam uma revisão sistemática da literatura
de comparação do infliximab com adalimumab ou golimumab e relataram
que infliximab e golimumab tiveram eficácias semelhantes e até mesmo
foram mais eficaz que o adalimumab na fase de indução, mas na fase de
manutenção não se observou diferença significativa entre esses três
fármacos anti-TNF-α.
Um ponto importante para se levar em consideração na terapia
biológica é seu custo. Há a necessidade de se verificar a relação custo-
benefício dessa terapia em comparação a uma terapia convencional
(DANESE, 2013).
Além disso, a escolha do tratamento deve ser feita junto com o
paciente, pois pode depender da via de administração e sua preferência. É
importante um monitoramento do indivíduo, através de exames sanguíneos
prévios para se determinar a terapia mais adequada, já que uma grande
parcela não se beneficia de alguns fármacos envolvidos na terapia da DII,
podendo então se beneficiar de terapias novas como as anti-integrinas
(FLAMANT; PAUL; ROBLIN, 2017).
As DII como já bem elucidado, envolvem o recrutamento persistentes
de leucócitos no tecido intestinal, bem como uma ativação desregulada da
função das células imunes. As integrinas (a4) são moléculas que medeiam a
infiltração do TGI pelas células T de memória, que se ligam no sítio da
mucosa na molécula de adesão celular 1 (MAdCAM-1) nas células
endoteliais. Sendo assim, o bloqueio dessa via parece promissor na
diminuição da inflamação intestinal, tornando-se assim um alvo terapêutico
para a DII (XAVIER; PODOLSKY, 2007). Essa classe é utilizada em
pacientes que não responderam as terapias anteriores de imunomoduladores
ou anti-TNF-α, por intolerância, não resposta ou perda de resposta a terapia
(ABRAHAM; AHMED; ALI, 2017).
Dentre as anti-integrinas estão o Natalizumab e o Vedolizumab, sendo
diferentes em modo de ação. O natalizumab é um anticorpo monoclonal
IgG4 humano que bloqueia a adesão e migração de leucócitos para o
intestino pela ligação da integrina a4 (SOLER et al., 2009). Os efeitos
colaterais envolvidos incluem cefaléias, náuseas, dor abdominal,
nasofaringite, tonturas e fadiga (TARGAN et al., 2007).
60
O Vedolizumab é um anticorpo monoclonal humano IgG. Ele faz a
ligação com a integrina α4β7, bloqueando sua interação com a molécula de
adesão celular-1 da mucosa (MAdCAM-1), ao inibir essa ligação o fármaco
bloqueia a migração de um subgrupo de linfócitos T gut-homing de
memória para o intestino inflamado (SOLER et al., 2009; ABRAHAM;
AHMED; ALI, 2017). Entre os efeitos colaterais desenvolvidos no uso de
Vedolizumab estão nasofaringite, artralgia, cefaleia, febre, náusea, dor
abdominal, infecções do trato respiratório superior e fadiga (WANG et al.,
2014).
Por outro lado, a utilização de plantas para fins terapêuticos é antiga, e
por muitos anos os produtos minerais oriundo de plantas e animais foram a
base do tratamento para diversas enfermidades. Historicamente, as plantas
medicinais são importantes na descoberta de novos fármacos (BRASIL,
2012).
O termo fitoterapia foi utilizado para caracterizar a prática de uso de
medicamentos cujos consitutuíntes ativos são plantas ou derivados vegetais
e tem como base o conhecimento popular (DE PASQUALE, 1984;
BRASIL, 2012).
No Brasil, a utilização de plantas para fins medicinais iniciou com os
povos indígenas e foi influenciada pelas culturas portuguesas e africanas
tornando-se assim uma cultura popular. Com isso, houve a necessidade de
regulamentação do uso de plantas medicinais e fitoterápicos (TEIXEIRA et
al., 2018).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) criou o Programa de
Medicina Tradicional nos anos 70, a fim de incentivar políticas públicas
nacionais e internacionais no uso da Medicina Tradicional e Medicina
Complementar e Alternativa (MT/MCA). No Brasil, em acordo com as
recomendações da OMS, foi aprovada em 2006, a Política Nacional de
Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS)
(PNPIC), a qual define diretriz e responsabilidades institucionais para
implantar/adequar as ações e serviços de medicina tradicional
chinesa/acupuntura, homeopatia, plantas medicinais e fitoterapia, entre
outras terapias, sendo que o uso de plantas medicinais e fitoterapia são as
práticas mais presentes no SUS (BRASIL, 2012).
Nesse processo, a indústria farmacêutica foi beneficiada pelo
conhecimento e uso popular de plantas, elaborando diversos tipos de
produtos, como os medicamentos fitoterápicos e os produtos tradicionais
61
fitoterápicos. Os medicamentos fitoterápicos (MF) são obtidos empregando
exclusivamente matérias-primas ativas vegetais, onde sua eficácia e riscos
de seu uso são conhecidos e pela constância de sua qualidade. Não se
considera MF aquele que inclui substâncias ativas isoladas na sua
composição e nem associação destas com extratos vegetais. É considerado
produto tradicional fitoterápico (PTF), aquele que emprega exclusivamente
matérias-primas vegetais, e que sua segurança e efetividade esteja baseada
no longo histórico de utilização demonstrado em documentação técnico-
científica, sem evidências conhecidas ou informadas de risco à saúde e que
seja caracterizado pela constância de sua qualidade (BRASIL, 2014).
A identificação de substâncias que podem promover a resolução de
inflamação, por exemplo, que seja eficiente e bem tolerada pelo organismo
é de fundamental importância. Medicinas tradicionais, como a Ayurveda e a
Medicina Tradicional Chinesa utilizam há séculos extratos medicinais, os
quais fornecem um excelente potencial terapêutico para a indústria
farmacêutica. O uso de plantas medicinais para tratar doenças crônicas,
como a DII, está em ascensão, pois as plantas são fontes de produtos
bioativos, fácil acesso e baixo custo (BALUNAS; KINGHORN, 2005;
RECIO; ANDÚJAR; RÍOS, 2012).
Estudos demonstraram os efeitos benéficos de vários compostos com
propriedades antioxidantes presentes em alimentos e plantas medicinais em
modelos experimentais de colite, incluindo flavonoides como a quercetina,
rutosídeo, silimarina, morina, diosmina, hesperidina, além do tempol e da
vitamina E (CRESPO et al, 1999; GÁLVEZ et al, 2001; GONZÁLEZ et al,
2001; SANCHEZ et al, 2002).
A atividade antioxidante destes produtos se dá devido à sua
capacidade de eliminar os radicais livres, tais como o hidroxil e superóxido,
e quelar os íons metálicos (BAZYLKO et al., 2014). As propriedades
antioxidantes de alimentos e bebidas têm atraído intensa pesquisa e
interesse comercial devido à importância amplamente aceita de
antioxidantes dietéticos no repertório de defesa contra dano oxidativo
tecidual e celular, juntamente com complexos mecanismos de defesa
enzimática (CASTRO; FREEMAN, 2001).
Considerando, os inconvenientes do tratamento da DII atualmente, tais
como, baixo índice de remissão quando utilizado aminossalicilatos e efeitos
lesivos apresentados pelo uso ou dependência de esteroides, torna-se
evidente a necessidade de pesquisa por novos tratamentos para as DII, mais
62
efetivos e apresentando menos efeitos colaterais (AWAADI; EL-MELIGY;
SOLIMAN, 2013).
Estudos clínicos, envolvendo plantas medicinais como Aloe vera,
Artemisia absinthium e Triticum aestivum, revelaram remissão e melhora
clínica em pacientes com DII, com redução no índice de atividade da
doença e escores histológicos (Tabela 2).
Tabela 2 - Evidências clínicas do uso de plantas medicinais na Colite Ulcerativa.
Planta Parte
utilizada
Número
de
pacientes
Resultados Referências
Aloe vera Gel 44 Remissão clínica, índice
de atividade da doença e
escore histológico.
Langmead et
al. 2004.
Angelica
sinensis Extrato 64 Ativação plaquetária,
alívio da lesão de
células endoteliais
vasculares, melhora da
microcirculação em
comparação com a
terapia de rotina.
Dong et al.
2004.
Triticum
aestivum Suco da
grama
23 Redução significativa
do índice de atividade
da doença, redução da
severidade do
sangramento retal, sem
efeitos colaterais.
Ben-Arye et
al., 2002.
Boswellia
serrata Goma-
resina
30 Eficácia comparada
com a sulfasalazina na
taxa de remissão,
melhora da qualidade
das fezes e
histopatologia.
Gupta et al.
2001.
Plantago
ovata Sementes 105 Tão eficaz quanto a
mesalazina na
manutenção da
remissão.
Fernandez-
banares et al.
1999.
Oenothera
biennis Óleo 43 Melhora na consistência
das fezes, mas não na
frequência, sangramento
retal, recidiva da
doença, aparência
sigmoidoscópica ou
histologia retal.
Greenfield et
al., 1993.
Fonte: adaptado de Rahimi, Mozaffari e Abdollahi (2008).
63
Mundialmente, as terapias alternativas como as plantas medicinais são
conhecidas e seu uso bem aceito. Os benefícios potenciais dos
medicamentos fitoterápicos envolvem a sua eficácia, segurança e baixo
custo. As evidências que sugerem benefícios do uso de fitoterápicos no
manejo das DII, em especial a CU, ainda são parciais. Primeiramente deve-
se conhecer muito bem a composição da planta, compostos ativos que
conferem propriedades, efeitos colaterais e toxicidade. Outro ponto
importante é a colheita da planta correta, qualidade e processamento para
garantir a preservação de tais compostos. Há também a necessidade de
ensaios clínicos controlados, com um número de indivíduos maior para se
avaliar eficácia e toxicidade do fitoterápico a ser estudado (ALGIERI et al.,
2015).
Com relação à planta desta pesquisa, a OMS aponta no relatório de
avaliação de certos aditivos alimentares que o extrato de T. erecta apresenta
baixa toxicidade em estudos em animais, os ésteres de luteína presentes no
extrato não apresentam atividade mutagênica ou genotóxicas em ensaios
celulares, e não apresentou efeitos adversos em humanos (OMS, 2014).
4.3 Tagetes erecta L.
O gênero Tagetes pertence à família Compositae, conhecido como
Asteraceae, e compreende cerca de trinta espécies de plantas anuais ou
perenes fortemente perfumadas. Tagetes são nativas do Arizona e Novo
México até a Argentina. Os gêneros cultivados incluem T. erecta, conhecida
por calêndula africana, T. patula, popularmente conhecida por calêndula
francesa, T. erecta×patula, comumente conhecida como calêndula
triplóides, e T. tenuifolia também conhecido como T. signata ou calêndula
sinete (HAUPTMANN; WINNER; BLOWERS, 2001), já no Brasil é
conhecida como cravo de defunto.
Essas plantas podem chegar até 180 cm de altura, glabra, com caule e
galhos angulares para arredondados. A inflorescência tem uma cabeça
terminal solitária, 2-12 cm em diâmetros, com pedúnculo 3-12 cm de
comprimento, ápice mais ou menos inchado, oco. Em alguns locais a T.
erecta e a T. patula são sinônimos, porém são espécies distintas
(SETSHOGO, 2005) (Figura 5).
64
A T. erecta é muito usada como planta ornamental mundialmente,
sendo fonte de inúmeros corantes naturais e outros produtos bioativos de
bastante interesse (PICCAGLIA; MAROTTI; GRANDI, 1998).
Na medicina popular, algumas espécies de Tagetes tem sido
amplamente usadas em infusões e unguentos de suas pétalas devido à
atividades terapêuticas como anti-mutagênica, anti-inflamatória, antiviral e
imunoestimulante (GONZALES DE MEJIA; LOARCA-PINA; RAMOS-
GOMEZ, 1997; HAMBURGUER et al., 2003). Mollik et al. (2010)
levantaram o uso de diversas plantas medicinais no distrito de Bargerhat em
Bangladesh e citam o uso popular da T. erecta L. para distúrbios
gastrintestinais (diarreia, indigestão, cólica, acidez, constipação, inchaço,
falta de apetite, dor de estômago), problemas renais, cicatrização de feridas
(redução de sangramento e infecções), diurética, problemas de pele
(eczema, acne, coceira, dermatite, entre outras), sedativo e adstringente.
De fato, a planta inteira de T. erecta tem sido considerada
medicinal devido ao uso popular relatado em literatura como anti-
helmíntica, digestiva, diurética e sedativa. Desta forma a infusão da planta é
indicada para tratar, indigestão, cólica, constipação severa e desinterias.
Além disso, em países como a África as raízes são consumidas com outra
planta, conhecida como Telfairia pedata (Sm, ex Sims) Hook.), para alívio
de dores no órgãos sexuais. Nas Ilhas Maurícios a decocção das flores é
utilizada contra icterícia (SETSHOGO, 2005).
Um estudo pré-clinico relatou as propriedades antioxidantes (in vitro)
e analgésicas (in vivo) do extrato bruto comercialmente disponível de flores
de T. erecta, e concluíram que há uma atividade antioxidante significativa
em vários sistemas oxidativos in vitro. Vários mecanismos antioxidantes
podem ser atribuídos, como a inibição de produção de radicais livres, a
capacidade redutora e a forte capacidade de doação de hidrogênio. O estudo
também reforça o uso da planta como analgésico (BASHIR; GILANI,
2008).
Com relação aos aspectos fitoquímicos das espécies de Tagetes, a
literatura cita classes de metabólitos secundárias como flavonoides, esteróis,
carotenoides, saponinas, álcoois triterpenos, polissacarídeos, princípios
amargos, mucilagem e resina (JACOBS et al., 1994; PICCAGLIY;
MAROTTI; GRANDI, 1998).
65
Suas pétalas são ricas em luteína e ésteres de luteína, sendo usada
como aditivos alimentares devido à sua capacidade de pigmentação
(PICCAGLIA; MAROTTI; GRANDI, 1998).
Figura 5 - Tagetes erecta L.
Fonte: adaptado de Jardim de Calateia. <http://jardimdecalateia.com.br/acervo-
botanico/tagetes-erecta-cravo-de-defunto/>. Acesso em: 27/03/2018.
Os carotenoides, como a luteína e zeaxantina, são os compostos de
interesse no extrato da flor de T. erecta L. Os ésteres de luteína do extrato
seco de T. erecta são eficientemente absorvidos de forma sistêmica
desempenhando importantes funções biológicas (HADDEN et al., 1999).
Sobre patentes, a T. erecta possui um pequeno número de patentes
relacionadas, sendo que os Estados Unidos e o México detêm o maior
número de patentes publicadas e o Brasil apenas três. Isso traz uma boa
relevância na inovação tecnológica na aplicação dessa planta para saúde
(EVANGELISTA et al., 2015).
4.3.1 Luteína
A luteína é um dihidroxi carotenoide, ou também xantofila. Sua
estrutura é composta por uma longa cadeia de carbonos, com ligações
simples e duplas entre carbonos alternados e com grupos metis laterais. Nas
extremidades do esqueleto de carbono a molécula contem estruturas cíclicas
de hexenos com um grupo hidroxil ligado. Sua fórmula molecular é
C40H52O2. Esse sistema conjugado de dupla ligação determina as
propriedades fotoquímicas e a reatividade química que dão as funções
66
biológicas básicas dos carotenoides, como atividades antioxidantes
(BRITTON, 1995; KIJLSTRA et al., 2012) (Figura 6).
Figura 6 – Estrutura química da luteína.
OH
OH
17'
Fonte: o autor.
O poder antioxidante da luteína é atribuído à dupla ligação de
carbonos conjugados, a qual permite a eliminação de radicais livres, como o
oxigênio singlete. A reação transfere energia, ou seja, a energia liberada do
oxigênio singlete é absorvida pela cadeia de carotenoides o que resulta na
formação do estado triplete de carotenoides, o qual pode retornar para seu
estado fundamental estável liberando o excesso de energia proveniente do
oxigênio singlete na forma de calor (SUN et al., 2015).
A síntese de xantofilas só ocorre em plantas, algas, bactérias e certos
fungos. Os seres humanos não conseguem sintetizá-las e sua absorção
depende do consumo via alimento (frutas, vegetais, ovos) (CALVO, 2005).
Esses compostos tem chamado atenção da ciência devida sua atividade
antimutagênica, efeito sobre a degeneração macular, a qual causa cegueira
irreversível em idosos, e também por sua função no aumento da imunidade
(TSAO, 2004).
Há muitos anos os estudos elucidam os diferentes tipos de alimentos e
seus potenciais antioxidantes. Esses antioxidantes dietéticos desempenham
ações importantes no corpo humano, combatendo o estresse oxidativo e
auxiliando na prevenção de doenças crônicas. Muitas dessas substâncias
foram descobertas e isoladas a partir de ervas, especiarias e vegetais. O
tecido das plantas contém diferentes tipos de compostos antioxidantes
(tocoferóis, carotenoides e compostos fenólicos) (CÖMERT; GÖKMEN,
2018). Os antioxidantes foram agrupados como vitaminas (ácido ascórbico,
tocoferóis), carotenoides (taninos condensados, xantofilas e carotenos),
flavonoides (flavonas, isoflavonas, flavonóis, flavanois, flavanonas), ácidos
67
fenólicos (ácido hidroxil-benzoixo e hidroxil-ácido cinâmico), álcoois
fenólicos, stilbenos, lignanas, taninos, antioxidantes contendo enxofre e
compostos neoformados (melanoidinas) (CÖMERT; GÖKMEN, 2018).
Os carotenoides são responsáveis pelas cores amarelo e laranja em
plantas, animais, bactérias e fungos. A biossíntese desses carotenoides tem
sido amplamente estudada (BENÍTEZ-GARCÍA et al., 2014), por
exercerem diversas funções biológicas. São componentes essenciais para a
fotossíntese, proteção e produção de fito hormônios. Nos animais
promovem a saúde em função da sua atividade antioxidante, anti-
inflamatória e melhora da resposta imunológica (RAO; RAO, 2007; RUIZ-
SOLA; RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2012; WOODSIDE et al., 2015).
No organismo, após sua ingestão, os carotenoides são incorporados
nas micelas e absorvidas prontamente pelas células da mucosa do intestino
delgado. Na mucosa intestinal o β-caroteno e outros carotenoides pró-
vitamina A são parcialmente convertidas em vitamina A e parcialmente
como ésteres retinílicos. Após, ambos são “embalados” em quilomícrons
para alcançarem o sistema linfático e serem transportado para a corrente
sanguínea para desempenhar seu papel anti-inflamatório e antioxidante
(PARKER, 1996; WOODSIDE et al., 2015).
A inflamação, sob condições normais, é um mecanismo tecidual de
proteção contra danos endógenos e exógenos. Durante esse processo,
diversas células do sistema imunológico são recrutadas (macrófagos e
leucócitos), isso resulta em uma produção exacerbada de espécies reativas
de oxigênio (EROS ou ROS, do inglês Reactive Oxygen Species), gerando
um estresse oxidativo e dano de biomoléculas importantes (proteínas,
DNA). Esse processo gera também mediadores como citocinas, quimiocinas
e metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas) que recrutam ainda
mais macrófagos que são importantes componentes na ativação de cascatas
de transdução de sinal e fatores de transcrição como NF-kB ou Nrf2. Essa
ativação resulta em respostas ao estresse celular, e como consequência a
produção de ciclooxigenase 2 (COX-2), óxido nítrico sintase induzível
(iNOS), quimiocinas e citocinas (KAULMANN; BOHN, 2014).
Estudos demonstram que os carotenoides podem influenciar vias
envolvidas no processo inflamatório, através da interação com resíduos de
cisteína das subunidades IKK ou NF-kB e inativar a via NF-κB; interagir
com Keap1 ao mudar suas propriedades físicas; e ainda não bem
68
esclarecidos com a vias das proteínas quinases ativadas (MAPK)
(KAULMANN; BOHN, 2014).
Por esse motivo, há um interesse da indústria farmacêutica para seu
uso não apenas como corantes alimentares naturais, mas em prol da nutrição
e melhora da saúde humana, sendo sua ingestão associada à menor
incidência de câncer e doenças cardiovasculares, as quais tem a inflamação
crônica como fator importante (BENÍTEZ-GARCÍA et al., 2014).
Além de ser encontrada em frutas e vegetais a luteína está presente
também em flores, sendo as flores da Marigold a fonte natural mais
abundante de luteína comercial. Porém a forma de apresentação da luteína
nessa espécie é esterificada com metade do peso correspondente a ácidos
graxos (CAMPO; GARCÍA-GONZÁLEZ; GUERRERO, 2007) e, portanto,
a saponificação química é necessária no processo de extração. Nas pétalas
de Marigold, os ésteres de ácidos graxos se acumulam em concentrações de
3 – 6 mg/ g (PICCAGLIA; MAROTTI; GRANDI, 1998).
A extração de luteína para a comercialização envolve quatro etapas:
cultivo, pré-tratamento, processamento e processamento fino das flores de
T. erecta anualmente de julho a outubro, e varia de acordo com a região. As
flores frescas, que são matérias-primas para luteína, são colhidas e enviadas
para fábricas de processamento. O método de ensilagem (fermentação
anaeróbica) foi aplicado pela primeira vez para preservar as flores frescas
por um ano inteiro. Após a ensilagem, as flores são desidratadas, secas e
trituradas para fazer grânulos de calêndula, que é o primeiro produto bruto
de luteína. Os grânulos de marigold são então extraídos para produzir um
segundo produto: oleoresina de marigold ou oleoresina de luteína.
Finalmente, a luteína com pureza requerida é obtida por meio de
saponificação e purificação de oleoresina de marigold (LIN; LEE; CHANG,
2015).
O pó de óleoresina ou os extratos das flores são usados como
alimentação de frangos para melhoramento da cor da gema dos ovos
(TYCZKOWSKI; HAMILTON, 1986), mas também são utilizados como
nutracêuticos (SANDMANN, 2014). Além disso, a extração a partir da
Marigold torna-se cara, por ser limitada as estações do ano, área de plantio
e mão de obra de alto custo (TSAO, 2004; SUN et al., 2015).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) define
alimento funcional como alimentos ou ingredientes que produzem efeitos
benéficos à saúde, além de suas funções nutricionais básicas (ANVISA,
69
2018). É importante ressaltar que alimentos funcionais não curam doenças,
mas sim auxiliam no tratamento e na prevenção, sendo de extrema
importância a inclusão dos mesmos na rotina alimentar diária (VIDAL et
al., 2012).
Dentre os alimentos funcionais, destacam-se os ácidos graxos ômega –
3 (ácido graxo eicosapentaenóico (EPA) e docosaexaenóico (DHA), fibras
alimentares (beta glucana, dextrina resistente, frutooligossacarídeos, goma
guar, inulina, lactulose, polidextrose, psyllium, quitosana), fitoesterois,
poliois, probióticos, proteína da soja e os carotenoides (luteína e
zeaxantina). A luteína é considerada um alimento funcional por ter ação
antioxidante que protege as células contra os radicais livres, sendo que seu
consumo deve estar associado a uma alimentação equilibrada e hábitos de
vida saudáveis (ANVISA, 2018) (Quadro 16).
Quadro 3 - Luteína com alegação de propriedade funcional.
Fonte: ANVISA. Disponível em: < goo.gl/AtV5P6>. Acesso em: 28/03/2018.
Há sessenta e seis registros no site da ANVISA (2018), todos
registrados como alimento com alegação de propriedade funcional, sempre
combinados com outros componentes (vitaminas, minerais, óleo de peixe) e
apresentados na forma de cápsulas, comprimidos e pós.
70
Como já citado, essa xantofila é encontrada em frutas e vegetais de
coloração alaranjados, amarelados e esverdeados como couve, espinafre,
brócolis, ervilha, alface e também na gema do ovo (Quadro 17). Esta última
é considerada a melhor fonte de luteína, em comparação com os vegetais,
devido a sua melhor biodisponibilidade pelo alto teor de gordura presente
nos ovos. É encontrada na forma esterificada com quantidades mínimas de
licopeno e β-caroteno (ABDEL-AAL et al., 2013).
Tabela 3 – Teor de luteína nos alimentos.
Alimento Luteína (mg.100g-1
)
Couve 15,0
Salsa 10,82
Espinafre 9,20
Abóbora 2,40
Brócolis 1,50
Gema de ovo 1,274 – 2,478
Ervilha 0,72
Vagem 0,42
Laranja 0,35
Alface 0,17
Tangerina 0,07
Milho 0,02
Nectarina 0,02
Papaia 0,02
Pêssego 0,02 Fonte: adaptado de Stringheta et al. (2006) e Schlatterer e Breithaupt (2006).
A absorção dos carotenoides via alimentação depende de alguns
fatores como: a natureza da matriz alimentar (se é in natura, cozido ou em
forma de suplemento); a quantidade e qualidade da gordura dietética (que
vai auxiliar na solubilização de carotenoides); os fosfolipídios; presença de
fibra alimentar. Além disso, a absorção do carotenoide liberado do alimento
inclui etapas como emulsão gástrica a ser incorporado em gotículas
lipídicas; transferência para micelas mistas envolvendo sais biliares,
fosfolipídios biliares, lipídios dietéticos e outros. Os carotenóides
solubilizados são então absorvidos pela célula intestinal para serem
transportados para a corrente sanguínea. Estas etapas podem incluir difusão
simples, captação por micelas e receptor mediada e outro transportador. A
maior concentração de carotenóides nas micelas (ou seja, solubilização),
71
corresponde a maior absorção e transporte para o plasma (ABDEL-AAL et
al., 2013).
Nos alimentos in natura, como frutas e hortaliças, a estrutura celular e
a complexação com proteínas conferem a luteína e outros carotenoides
alguma estabilidade. Já quando esses alimentos sofrem algum tipo de
processamento essa estrutura pode ser rompida e então a luteína é exposta
aos produtos da peroxidação lipídica e as lipoxigenases, podendo ocorrer
rápida perda de coloração e função biológica (STRINGHETA et al. 2006).
A degradação de carotenoides em frutas e vegetais é uma questão
importante devido à perda. Mais atenção deve ser dada ao controle da
degradação dos isômeros da geometria dos carotenoides, e para melhorar a
qualidade dos mesmos da dieta. As mudanças de cor durante a isomerização
geométrica dos carotenoides, o processamento térmico e até mesmo o
amadurecimento dos frutos têm sido amplamente estudados. No entanto,
ainda há falta de informação sobre as rotas químicas e cinéticas das
mudanças de cor durante a degradação e isomerização dos carotenoides.
(KHOO et al., 2011). Sendo assim, o consumo de carotenoides deve ser
diário, fazendo parte de uma dieta saudável e prática regular de atividade
física.
4.4 Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal
Modelos experimentais animais são ferramentas indispensáveis para
elucidar os mecanismos envolvidos na patogênese das DII. Além disso, as
pesquisas em animais auxiliam em buscas de novas estratégias terapêuticas,
bem como a definição de segurança e eficácia de novos fármacos e
compostos bioativos. Existem diversos modelos experimentais, cada um
possui vantagens e desvantagens, elucidam questões diferentes e podem ser
usados em diferentes estudos conforme os objetivos buscados
(MIZOGUCHI; NGUYEN; LOW, 2013).
4.4.1 Colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS)
O DSS é um polissacarídeo sulfatado com carga negativa, solúvel em
água, com um peso molecular altamente variável variando de 5 a 1400 kDa.
A colite, em camundongos, mais grave, que se parece mais à UC humana,
resulta da administração de DSS 40-50 kDa em água. O mecanismo pelo
qual o DSS induz inflamação intestinal não é claro, mas provavelmente é o
resultado de danos à camada monoclonal epitelial que reveste o intestino
72
grosso, permitindo a disseminação de conteúdos intestinais pró-
inflamatórios (por exemplo, bactérias e seus produtos) no tecido subjacente
(Figura 7). O modelo de colite DSS é muito popular na pesquisa de DII
devido à sua rapidez, simplicidade, reprodutibilidade e controle. Modelos
agudos, crônicos e recidivantes de inflamação intestinal podem ser
alcançados modificando a concentração de DSS e a frequência de
administração (CHASSAING et al., 2014).
Figura 7 – Danos causados por DSS no epitélio intestinal de camundongos.
Fonte: adaptado de Chassaing et al. (2014).
73
Após o primeiro dia de tratamento com o DSS, já há a indução de
sinais clínicos de doença por alterações na expressão de proteínas de junção
apertada e aumento na expressão de citocinas pró-inflamatórias. Com o
passar dos dias, segue-se sintomas mais graves como aumento da
permeabilidade intestinal, sangramento intestinal e até óbito (CHASSAING
et al., 2014).
Por possuir carga altamente negativa, contribuída por grupos de
sulfato, gera toxicidade para o epitélio colônico e induz erosões que
comprometem a integridade da barreira resultando, consequentemente, em
aumento da permeabilidade epitelial do cólon. Por também possui
propriedade anticoagulante agrava o sangramento intestinal. O mecanismo
pelo qual o DSS passa através das células epiteliais da mucosa permanece
obscuro, mas sugere-se que o DSS induz colite em camundongos formando
nano-lipocomplexos com ácidos graxos de cadeia média no cólon
(LAROUI et al., 2012). A especificidade do DSS para o cólon pode ser uma
função da absorção de água e eletrólitos na presença de numerosas bactérias
(CHASSAING et al., 2014).
A migração transepitelial de neutrófilos (criptite) e a migração
extensiva de neutrófilos através do epitélio da mucosa e no lúmen da cripta
são comumente associadas à DII humana, mas ocasionalmente relatadas em
patologia induzida por DSS. A colite DSS crônica resulta em infiltração de
leucócitos mononucleares, desordem da arquitetura cripta e um alargamento
do fosso entre a base da cripta e muscular com linfocitose mucosa profunda
também sendo comumente associada. (CHASSAING et al., 2014).
4.4.2 Colite induzida por Oxazolona
A administração via retal de oxazolona com etanol em animais resulta
em colite aguda. A condição é caracterizada por uma resposta imune T-
helper2 (Th2) com aumento da produção de interleucina 4 (IL-4) e
interleucina 5 (IL-5), bem como células natural killer (NK) e suas citocinas,
principalmente a IL-13. Esse processo acompanha perda de peso corporal,
diarreia, úlceras e perda de células epiteliais no intestino grosso
(MIZOGUCHI; NGUYEN; LOW, 2013).
As células NK são ativadas por glicolipídios, e medeiam a toxicidade
por meio da atividade citotóxica dirigida a células epiteliais que são alvos e
portadoras de antígeno glicolipídico. Em uma via alternativa, as NL mediam
o dano tecidual pela produção de IL-13, a qual afeta as tight junctions e
74
consequentemente causando danos na barreira epitelial (KIESLER; FUSS;
STROBER, 2015).
4.4.3 Colite induzida por ácido acético
A indução de colite ulcerativa por ácido acético tem por objetivo criar
um dano químico ao epitélio da mucosa, induzindo um fenótipo transitório
mimetizando a DII, através de ulceração do cólon distal e criptas anormais.
É feita por meio de enemas com concentração de ácido acético em torno de
4% por 15 a 30 segundos de exposição, após isso é realizada a lavagem com
solução salina três vezes. Suas vantagens estão o baixo custo e facilidade de
administração (MACPHERSON; PFEIFFER, 1978; ELSON et al., 1995).
4.4.4 Colite induzida por Salmonella
A Salmonella typhimurium e a Salmonella dublin são bactérias gram-
negativas, consideradas patógenos bacterianos entéricos, tem origem
alimentar e podem causar doenças intestinais. Esses patógenos, causam uma
inflamação inicial com características histopatológicas semelhantes à CU
humana, incluindo perda de cripta epitelial, erosão e infiltração neutrofílica.
Essa metodologia geralmente resulta em infecção sistêmica dentro de 5 a 7
dias após a infecção, sendo um modelo interessante para estudar a fase
aguda, mas não crônica, da colite ulcerativa (MIZOGUCHI; NGUYEN;
LOW, 2013).
4.4.5 Colite Induzida por Escherichia coli aderente e invasiva
A bactéria comensal Escherichia coli aderente-invasiva, pode se aderir
tanto nas células epiteliais do intestino delgado quanto do grosso. A indução
utilizando essa metodologia requer danos epiteliais leves, com o uso de DSS
em doses baixas, durante todo o curso da infecção. A mimetização da CU
humana se dá pela perda de peso corporal, presença de sangue nas fezes e
infiltração neutrofílica no cólon (BOUDEAU et al., 1999; MIZOGUCHI ,
2006; JENSEN et al., 2011; LOW et al., 2013; NAGATANI; WANG;
LLADO, 2012).
4.4.6 Colite Induzida por administração de Ácido Trinitrobenzeno
Sulfônico (TNBS)
A administração intrarretal de TNBS induz colite causada por resposta
imune mediada por Th1 e por infiltração na lâmina própria por células T
75
CD4+, neutrófilos e macrófagos, isso ocorre devido ao TNBS tornar as
proteínas colônicas imunogênica ao sistema imune do hospedeiro. Mimetiza
a DII por desencadear sintomas como perda de peso, diarreia grave e
prolapso retal (KIESLER; FUSS; STROBER, 2015; NEURATH et al.,
1995).
4.4.7 Colite induzida por modificação genética – modelos knockout
A colite ulcerativa induzida em modelos konckout se deu pela
importância de vários fatores genéticos na patogênese da doença. O modelo
mais estudado é o da deficiência da IL-10, devido à importância anti-
inflamatória dessa citocina. Com o avanço das pesquisas, pode-se
identificar que polimorfismos genéticos no locus IL-10 aumentam o risco
do desenvolvimento de CU. Camundongos knockout em IL-10 (IL-10-/-
)
desenvolvem uma inflamação espontânea no cólon caracterizada pela
presença de linfócitos, macrófagos e neutrófilos. Inicialmente, essa
inflamação é causada uma resposta pró-inflamatórias de células como Th1
(KIESLER; FUSS; STROBER, 2015).
77
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Obtenção do extrato
O extrato seco de T. erecta. (ESTE) foi obtido comercialmente da
empresa fornecedora de insumos farmacêuticos Pharmanostra (Lote n0
16E10-B019-005810).
5.2 Análise fitoquímica
5.2.1 Determinação de luteína através de espectroscopia por ressonância
magnética nuclear
O extrato hidroetanólico de T. erecta (50 mg) foi submetido à
microextração assistida por um banho de ultrassom, utilizando-se CDCl3 -
TMS (2,2 µmol/ml) como solvente (4 x 250 µl, 5 min cada). Todos os
extratos foram combinados e filtrados através de um filtro de membrana de
0,22 µm para um tubo de RMN de 5 mm. O espectro de 1H RMN foi
adquirido num espectro Brucker AC 300 a 25 °C, operando a 300 MHz. Os
dados foram processados usando o software BRUKER TopSpin 2.1. O
espectro foi manualmente defasado e corrigido na linha de base. TMS
(tetrametilsilano) foi usado como padrão interno. No total, 32 varreduras
foram acumuladas com pulso de 90°, usando um tempo de relaxamento de
300 s. As análises de extração e RMN foram realizadas em triplicata.
Para a estimativa da luteína, o sinal em δ 0,99 (3H) foi selecionado,
correspondendo aos hidrogênios de metila na posição 17 'da luteína
(PUTZBACH et al., 2005; MAULIDIANI et al., 2018). Sua integral foi
determinada manualmente e comparada ao sinal TMS em δ 0,00,
correspondendo a 12H. A concentração de luteína foi estimada pela
seguinte equação:
[𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛] = [𝑇𝑀𝑆]𝑥 (𝐼𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛𝐼𝑇𝑀𝑆
𝑥𝑁𝑇𝑀𝑆
𝑁𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛
)
onde [luteína] e [TMS] são a concentração de luteína e TMS (µmol/mL),
Iluteína e ITMS são a integral da luteína e TMS, e NTMS e Nluteína são o número
de hidrogênios de cada sinal.
78
5.2.2 Determinação de fenois totais
O conteúdo fenólico total foi verificado pelo reagente de Folin-
Ciocalteu, de acordo com o método descrito por Arnous, Makris, e Kefalas
(2001). O ESTE padronizado a 10% de luteína (50, 100, 150 e 200 μg/ml)
foi misturado com 0,5 mL de água destilada e 2,5 ml de reagente de Folin-
Ciocalteu (diluição 1: 10) e 2,0 ml de carbonato de sódio (7,5%) foram
adicionados nos tubos. Além disso, os tubos foram incubados a 45 °C
durante 15 min. A absorbância foi determinada a 760 nm em
espectrofotômetro. A concentração total de polifenol foi calculada a partir
de uma curva de calibração, utilizando o ácido tânico como padrão em
intervalo de (10 - 1000 µg/ml). Os resultados foram expressos como
equivalentes de ácido tânico (TAE) em μg ou mg/g de extrato.
5.3 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH)
A capacidade de eliminação de radicais livres do ESTE foi avaliada
pela diminuição da absorbância do DPPH, conforme descrito por Blois
(1958) e Chen, Wu e Chen (2004), com algumas modificações. Amostras do
ESTE (1, 10, 100 e 1000 µg/ml) foram solubilizadas em metanol e após
foram misturadas com solução metanólica de DPPH (40 µg/ml). Utilizou-se
ácido ascórbico (50 µg/ml) como controle positivo e água destilada como
controle negativo. As soluções foram misturadas e incubadas durante 5 min
à temperatura ambiente e a absorbância foi lida a 520 nm. Os valores
individuais foram interpolados para uma curva padrão do DPPH (0-60 mM)
e expressos como μM de DPPH. Todas as mensurações foram realizadas em
triplicata.
5.4 Cultura celular
A linhagem celular de epitélio intestinal murino (IEC-6) foi comprada
do banco de células do Rio de Janeiro. As células foram cultivadas em meio
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 20% de
soro fetal de bovino (FBS) em 5% de CO2, com atmosfera umidificada, a 37
°C. Os experimentos foram realizados quando o as células atingiram cerca
de 90% da confluência.
79
5.4.1 Viabilidade celular
Células IEC-6 (5 ×104) foram cultivadas em placas de 96 poços (em
triplicatas) na presença de um veículo (meio de cultura com 0,1% de
DMSO), 10% de DMSO ou ESTE a 10% de luteína (1, 10 e 100 µg/ml) a
37 °C durante 24 h. 21h após o tratamento foi adicionado 10 µl de MTT (5
mg/ml) às células, as quais foram incubadas por 3h a 37 °C, após a
solubilização de cristais de formazan reduzidos com DMSO puro (CHEN;
WANG; ZHANG, 2003) e a absorbância foi analisada a 570 nm. A
porcentagem de viabilidade celular foi calculada como a relação (Abs do
tratamento x 100/ média do basal).
5.4.2 Determinação de espécies reativas de oxigênio (EROs) em células
expostas ao LPS
O dano celular foi induzida com LPS para avaliar o efeito protetor da
luteína in vitro. Resumidamente, células (1 x 106) foram semeadas em
placas de 12 poços, 8 horas antes da estimulação, o DMEM foi substituído
por meio DMEM livre de soro para sincronizar as células. Os tratamentos
(300 μl), incluindo basal (DMEM + DMSO 0,1%), LPS (10 μg/ml), ESTE
(100 μg/ml) ou ESTE + LPS foram incubados por 24 h, após o sobrenadante
foi obtido para quantificar EROS incubando 250 µl de amostras com 30 µl
de diacetato de 2',7'-Diclorodidrofluoresceína (DCFH-DA) por 40 min. A
fluorescência foi lida a um comprimento de onda de 480 nm e a uma
emissão de 530 nm. Os experimentos foram realizados em triplicata, cada
vez contendo no mínimo quatro pontos por grupo.
5.4.3 Determinação de nitrito em células expostas ao LPS
O restante das células foram lavadas com PBS e separadas com
tripsina. A suspensão obtida foi centrifugada (5 min a 5.000 RPM a 4 °C), o
sobrenadante foi eliminado e o sedimento foi lisado com 100 µl de tampão
de lise. Após 30 min no gelo, as amostras foram novamente centrifugadas
(30 min a 13.000 RPM sob 4 °C) e o sobrenadante foi usado para medir os
níveis de nitrito usando a reação de Griess (TSIKAS, 2007). Para isso, o
sobrenadante foi desproteinizado e 100 µl foram incubados com 500 µl de
reagente de Griess (HCl a 0,5 M, sulfanilamida a 2% e N-1-
naftaliletilenodiamida a 0,2%) por 24 h. A absorbância foi medida a 570 nm
usando um espectrofotômetro. As concentrações de nitrito foram
interpoladas em uma curva padrão variando de 0 - 100 µM de nitrito de
80
sódio (NaNO2). Os experimentos foram realizados três vezes, cada vez
contendo no mínimo quatro pontos por grupo.
5.5 Ensaios in vivo
5.5.1 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss (30 a 40 g
aproximadamente), provenientes do biotério da UNIVALI, aclimatados às
condições do mesmo por pelo menos sete dias antes da manipulação
experimental, sob a temperatura de aproximadamente 23°C e ciclo claro
escuro de 12 horas controlado. Os animais foram alimentados com ração e
água ad libitum. Todos os experimentos obedeceram a protocolos
experimentais previamente aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa
da Universidade do Vale do Itajaí, sob o parecer nº 054/17 (Anexo A).
5.5.2 Grupos experimentais
Foram utilizados 36 camundongos, os animais foram alimentados com
ração e água ad libitum e distribuídos randomicamente em 5 grupos
contendo 6 animais cada.
Grupo 1: Naive - formado por animais que não receberam DSS
diluído em água;
Grupo 2: Veículo - formado por animais que receberam DSS
diluído em água e foram tratados com veículo (10 ml/kg, água +
Tween 80 1%);
Grupo 3: 5-ASA: formado por animais que receberam DSS
diluído em água e foram tratados com 5-ASA na dose de 100
mg/kg (10 ml/kg);
Grupo 4 à 6: ESTE - formado por animais que recebram DSS
diluído em água e foram tratados com doses de 30, 100 ou 300
mg/kg/dia de extrato em um volume de 10 ml/kg.
5.5.3 Indução da colite ulcerativa por dextran sulfato de sódio (DSS) 5%
Após aclimatização dos animais, a indução da colite foi feita por DSS
5% em água ad libitum por 7 dias, como descrito por Chassaing et al.
(2014). Os animais foram tratados 1 vez ao dia, durante 9 dias, por via oral
com veículo (água, 10 mL/kg, v.o), ESTE (30, 100 e 300 mg/kg, v.o) e
ácido 5-aminossalicílico (5-ASA na dose de 100 mg/kg (v.o). Os
81
tratamentos foram realizados simultaneamente com a adição do DSS na
água conforme observado na Figura 8.
Durante todo o período experimental, os animais foram pesados
diariamente e a presença de sangue retal e da consistência das fezes foram
analisadas individualmente. Para tais parâmetros foi atribuído uma
pontuação de acordo os critérios previamente propostos por Utrilla, Peinado
e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e Rodríguez-Cabezas (2004) para
mensuração do índice de atividade da doença (IAD) (Quadro 4).
Os animais foram eutanasiados no décimo dia, o cólon foi
imediatamente extraído para mensuração do comprimento (cm) e peso. Um
segmento de 0,5 cm foi retirado e fixados em solução de ALFAC (composta
de: 85% álcool etílico 80%, 10% formaldeído e 5% de ácido acético glacial)
para fazer análise histológica. Além disso, o fígado e o baço também foram
pesados.
Figura 8 – Desenho experimental do modelo de colite ulcerativa induzida por DSS.
Fonte: a autora.
82
Quadro 4 - Itens que compõem o índice de atividade da doença (IAD).
Pontuação Perda de peso Consistência das
fezes
Sangramento Retal
0 Nenhuma Normal Normal
1 1-5% --- ---
2 5-10% Fezes amolecidas ---
3 10-20% --- ---
4 >20% Diarreia Sangramento severo
O valor do índice de atividade da doença é composto pela soma da pontuação
da perda de peso, consistência das fezes e sangramento retal. O escore máximo
é 12.
Legenda: --- = nulo.
Fonte: Utrilla, Peinado e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e Rodríguez-
Cabezas (2004).
5.5.4 Avaliação do trânsito intestinal
O trânsito intestinal dos animais saudáveis foi avaliado como descrito
por da Silva et al. (2016a). Os camundongos foram divididos
randomicamente em três grupos (n=6). O grupo controle negativo recebeu
água destilada (10 mL/kg) e o grupo controle positivo recebeu loperamida
(4 mg/kg), a qual diminui a motilidade intestinal. Enquanto o outro grupo
foi tratado oralmente com ESTE na dose de 300 mg/kg. Após 30 minutos
receberam 0,2 ml de vermelho de fenol. Transcorridos 20 minutos, todos os
animais foram eutanasiados e os intestinos foram removidos para a
quantificação do marcador. A porcentagem de trânsito intestinal foi
determinada utilizando a equação 1:
Ti = 𝑿
𝒀 . 100 (1)
83
Onde: X é o comprimento percorrido pelo marcador vermelho de fenol
e Y é o comprimento total do intestino.
5.5.5 Diarreia induzida com óleo de rícino
Em outro experimento a administração do óleo de rícino via oral foi
administrado para induzir diarreia nos animais como previamente descrito
por Banji et al. (2010). Animais foram distribuídos randomicamente em três
grupos, com 6 por grupo. O grupo controle negativo foi tratado com água
destilada (10 ml/kg). O grupo de controle positivo foi tratado com
loperamida (4 mg/kg) e o terceiro grupo recebeu o ESTE (300 mg/kg).
Trinta minutos mais tarde foi administrado oralmente óleo de rícino (20
ml/kg a cada animal. Em seguida, cada camundongo foi alojado em uma
gaiola individual com o chão revestido com papel absorvente. As grades de
arame foram colocadas a 3 cm do fundo da caixa para separar os animais do
papel absorvente. Posteriormente, foram observados durante 4 horas para os
seguintes parâmetros: tempo até às fezes semissólidas iniciais, número de
fezes sólidas, semissólidas e líquidas. A pontuação numérica foi atribuída
da seguinte forma: fezes sólidas = 1, fezes semissólidas = 2 e fezes líquidas
= 3. O índice de evacuação (EI) será utilizado para avaliar a gravidade da
diarreia como indicado na equação 2:
EI = fezes sólidas × 1 + fezes semissólidas × 2 + fezes líquidas × 3
(2)
5.6 Ensaios ex vivo
Os intestinos (cólon) foram homogeneizados com tampão fosfato de
potássio 200 mM (pH 6,5). O homogeneizado foi usado para determinar a
glutationa redutase (GSH) e depois centrifugado a 9000 g por 20 min. O
sobrenadante foi utilizado para determinar a atividade das enzimas:
glutationa S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD) e catalase
(CAT), além dos níveis de algumas citocinas; o precipitado foi usado para
determinar a atividade da mieloperoxidase (MPO).
5.6.1 Quantificação de glutationa reduzida (GSH) no colón
Foi adicionado 50 µl do homogenato e mais 40 µl de ácido
tricloroacético (ATC) 12% em um tubo de eppendorf, em seguida o tubo foi
homogeneizado em vórtex e centrifugado por 15 min a 4000 rpm na
temperatura de 4 ºC. Em uma placa de 96 poços foram adicionados10ul do
84
sobrenadante, 290 µl de tampão TRIS 0,4M (pH 8,9) e 5 µl de solução 3,96
mg/mL de 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzoico (DTNB) em metanol. As
amostras foram incubadas por 15 minutos pra a reação e foi realizada a
leitura espectrofotométrica em 420 nm (SEDLAK; LINDSAY, 1968).
5.6.2 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) no colón
Em um tubo de eppendorf foi adicionado 10ul de metanol e 100 µl do
homogenato, em seguida agitado em vórtex e centrifugar a 9000 g por 20
minutos na temperatura de 4 ºC. Em uma placa de 96 poços foi colocado 30
µl do sobrenadante e 140 µl de meio reacional (Xilenol laranja, Ferro II,
hidroxitoluenobutilado solubilizados em metanol) após, incubado por 30
minutos em temperatura ambiente. Ao fim da incubação realizou-se a
leitura em espectrofotômetro a 560 nm (JIANG et al., 1992).
5.6.3 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD) no
colón
A atividade da SOD foi medida com base na capacidade da enzima de
inibir o processo de autoxidação do pirogalol, de acordo com Marklund e
Marklund (1974) e Gao et al. (1998). Alíquotas de sobrenadante foram
adicionadas à solução tampão (200 mM Tris HCl-EDTA, pH 8,5) e
pirogalol (1 mM), e depois misturadas por 1min. A reação foi incubada
durante 20 min à temperatura ambiente, interrompida. A absorbância do
sobrenadante resultante foi medida a 405 nm. A quantidade de SOD que
inibiu a oxidação do pirogalol em 50%, em relação ao controle, foi definida
como uma unidade de atividade da SOD. A atividade da SOD foi expressa
em U/ mg de proteína.
5.6.4 Determinação da atividade da Catalase (CAT) no colón
Em uma cubeta de quartzo, 10 μl de homogenato da mucosa gástrica
foi diluída com 990 μl de solução reativa 20 mM (Tampão Tris/ EDTA 5
mM, pH 8,0 + peróxido de hidrogênio 30% + água miliQ). A absorbância
foi medida em comprimento de onda de 240 nm (AEBI, 1984).
5.6.5 Determinação da atividade da glutationa S-transferase (GST) no
cólon
A atividade total da GST foi determinada conforme descrito por
Habig, Pabst e Jakoby (1974). Resumidamente, para as reações foi utilizado
85
o sobrenadante, 1 mM 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), 1 Mm de GSH
e 100 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6,5) a temperatura
ambiente. A reação do CDNB com GSH foi monitorada a 340 nm por 90 s.
A atividade específica foi calculada usando um coeficiente de extinção de
9,6/mM/cm para GSH, e os resultados foram expressos em mmol/ min/ mg
de proteína.
5.6.6 Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no colón
O tecido do colón foi pesado e imerso em tampão fosfato (pH 6,2
contendo 0,5% de brometo de hexadecil-trimetilamônio e 5 mM EDTA) na
concentração de 3 ml/g de tecido. A seguir, as amostras foram
homogeneizadas duas vezes consecutivas, por período de 30 segundos cada.
Os homogenatos resultantes foram centrifugados a 17.500 rpm durante 15
min à temperatura de 4 ºC e o sobrenadante foi utilizado para determinação
da atividade de MPO. A atividade da MPO colônica foi medida de acordo
com Silva et al. (2016a). O precipitado do homogeneizado reparado como
descrito acima foi misturado em tampão de fosfato de potássio 80 mM (pH
5,4) contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamónio (HTAB) e
centrifugado (12000 rpm durante 20 min a 4 °C). A atividade da MPO foi
determinada a 620 nm no sobrenadante na presença de H2O2 e 3,3’, 5,5'-
tetrametilbenzidina (TMB). A atividade da MPO foi expressa como
unidades de milli densidade óptica (mO.D)/mg de proteína.
5.6.7 Dosagem de citocinas
Homogeneizados colônicos foram usados para estimar os níveis de
TNF-α, IL-6, usando kits de ensaio imunoenzimáticos (ELISA) para
citocinas de camundongos da BD Biosciences (Franklin Lakes, Nova
Jersey, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância foi
medida a 450 e 550 nm e os resultados foram expressos em pg/mL.
5.6.8 Dosagem de proteínas
As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de
Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), utilizando albumina de soro
bovino (0,125 a 1,0mg/ml) como padrão, de acordo com as instruções do
fabricante.
86
5.6.9 Avaliação histológica
Após a eutanásia as amostras do cólon dos animais foram fixadas em
ALFAC por 24 horas foram desidratadas em séries alcoólicas crescentes,
diafanizadas em xilol, para posteriormente serem incluídas em parafina e
preparadas para a microtomia. Os cortes, com aproximadamente 5 μm de
espessura, foram desparafinizados e reidratados utilizando série alcoólica
etílica decrescente. Em seguida, as amostras foram submetidas à coloração
em eosina-hematoxilina para a análise morfológica das lesões. Todos os
procedimentos de preparo de amostra para avaliação histopatológica foi
realizado pela empresa Histocell (São Paulo, Brasil).
O dano histológico foi avaliado segundo os critérios previamente
descritos por Utrilla, Peinado e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e
Rodríguez-Cabezas (2004), com poucas modificações, levando em
consideração a presença de perda epitelial, infiltração celular, edema e
condição das criptas e células caliciformes. O tecido colônico foi avaliado
com foco nas características anteriores e um escore variando de 0 (tecido
saudável) a 3 ou 4 (dano grave), dependendo do item, foi atribuído a cada
um (Tabela 4). A soma dá a pontuação total para cada amostra.
Tabela 4 – Escore histológico.
Características Score Critério
Epitélio de mucosa 0
1
2
3
Sem inflamação de mucosa
Perda de <5% da superfície epitelial
Perda de 5 – 10% da superfície epitelial
Perda de >10% da superfície epitelial
Integridade das criptas 0
1
2
3
Criptas intactas
Perda <10% das criptas
Perda <10 - 20% das criptas
Perda >20% das criptas
Infiltrado celular e edema 0
1
2
3
Nenhum
Brando
Moderado
Severo
Depleção das células de
goblet
0
1
Ausente
Presente
Fonte: Utrilla, Peinado e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e Rodríguez-Cabezas
(2004).
87
5.6.10 Quantificação dos níveis de mucinas
A análise histoquímica para mucina foi realizada nos cortes
histológicos obtidos, os quais foram oxidados em ácido periódico 0,5% por
5 min, lavados em água destilada, corados com reativo de Schiff por 20 min
e lavados em água sulfurosa e em água corrente. As lâminas foram contra
coradas com hematoxilina por 20 s, desidratadas em uma série ascendente
de álcoois, diafanizadas em xilol e montadas entre lâmina e lamínula. As
lâminas foram observadas em microscópio óptico em aumento de 400 × e
fotografadas. As glicoproteínas (mucinas) coradas pelo ácido periódico de
Schiff (PAS) foram quantificados com o programa ImageJ® de acordo com
descrito por Silva et al. (2016a).
5.7 Análise estatística
Os resultados expressos serão apresentados em média ± erro padrão. A
análise estatística foi efetuada utilizando análise de uma ou duas vias da
variância (ANOVA), quando aplicável, seguida pelo post teste de
Bonferroni e Dunnet. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliação
dos testes não-paramétricos, seguido pelo post teste de Dunns As análises
foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 5.0 (San Diego,
EUA). Valores de p<0,05 foram considerados significativos.
89
6 RESULTADOS
6.1 Análise fitoquímica
6.1.1 Teor de luteína
Pela quantificação de RMN 1H, utilizando TMS como padrão, foi
possível estimar uma concentração de 8,2 ± 0,3% (m/m) para a luteína no
ESTE.
6.1.2 Fenois totais
A quantificação dos fenóis totais presentes no extrato está descrito na
tabela 5 e pode ser quantificada em 239,3 ± 19,5 mg/g de extrato.
Tabela 5 – Quantificação de fenóis totais do ESTE.
ESTE (µg/ml) E.A.T ± EPM
150 33,6 ± 2,4
100 21,6 ± 1,0
50 13,9 ± 0,6
E.A.T: equivalentes de ácido tânico em µg .
A concentração de 200 µg/ml ficou fora da linearidade.
6.2 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH)
Como descrito na figura 9, o extrato sequestrou o radical livre estável
DPPH em 29% somente na maior concentração testada. Como esperado, a
incubação com ácido ascórbico reduziu o radical em 66%.
90
Figura 9 – Efeito do ESTE nos níveis de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH).
VEI – veículo (25% metanol); AA – ácido ascórbico (50 µg/ml); ESTE – extrato
seco de Tagetes erecta L. Os dados estão representados como média ± E.P.M (n=3).
Experimento feito em triplicata. Anova de uma via seguido pelo teste de Dunnett,
*p<0,05;**p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo veículo.
6.3 Cultura celular
6.3.1 Efeito do ESTE na viabilidade celular de enterócitos murinos
(células IEC-6)
Como é possível verificar na figura 10, a incubação de enterócitos
murinos da linhagem IEC-6 com DMSO 10% reduziu a viabilidade celular
em 52,48%. De forma interessante, o tratamento com ESTE (1µg/ml) não
alterou a viabilidade das células, porém é possível que nas concentrações de
10 e 100 µg/ml favoreça a proliferação celular.
91 Figura 10 – Efeito do ESTE na viabilidade celular em células IEC-6.
As células foram tratadas com veículo (meio de cultura com 0,1% de DMSO),
DMSO (10%) e ESTE (1; 10 e 100 µg/ml). Após a incubação por 24h o ensaio de
MTT foi realizado. Os dados estão representados como média ± E.P.M (n=3).
Experimento feito em triplicata. Anova de uma via seguido pelo teste de Dunnett,
**p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo basal.
6.3.2 Efeito do ESTE na produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs) em células expostas ao LPS
Quando as células foram estimuladas com LPS (10 µg/ml), a
quantidade de EROs detectadas com DCFH-DA aumentou em 48% em
relação ao grupo basal, porém a incubação com ESTE (100 μg/ml) reverteu
este aumento induzido por LPS (figura 11).
92
Figura 11 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) no dano celular em células IEC-6.
LPS – lipopolissacarídeos; ESTE – Extrato seco de Tagetes erecta L. As células
foram tratadas com veículo (meio de cultura com 0,1% de DMSO), LPS (10 µg/ml),
ESTE (100 µg/ml) e ESTE com LPS (100 µg/ml e 10 µg/ml, respectivamente).
Após o sobrenadante foi obtido para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS)
incubando 250 µl de amostras com 30 µl de diacetato de 2',7'-
diclorodidrofluoresceína (DCFH-DA) por 40 min. #p<0,05 quando comparado ao
grupo basal, **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo LPS.
93
6.3.3 Efeito do ESTE nos níveis de nitrito em células expostas ao LPS
Os níveis intracelulares de nitrito também foram aumentados após
incubação com LPS; entretanto a incubação das células com ESTE (100
μg/ml) não reverteu esse efeito (Figura 12).
Figura 12 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) nos níveis de nitrito em células IEC-6.
LPS – lipopolissacarídeos; ESTE – Extrato seco de Tagetes erecta L. #p<0,05
quando comparado ao grupo basal. O sobrenadante celular foi usado para medir os
níveis de nitrito usando a reação de Griess. As concentrações de nitrito foram
interpoladas em uma curva padrão variando de 0 - 100 µM de nitrito de sódio
(NaNO2).
6.4 Análise in vivo
Na análise do efeito anti-inflamatório intestinal do ESTE foi utilizado
o modelo de colite ulcerativa induzida por DSS conforme descrito por Silva
et al. (2016a), a qual assemelha-se a colite ulcerativa aguda desenvolvida
em humanos. Sinais clínicos foram verificados e quantificados conforme
sistema de escore como o índice de atividade da doença (IAD), perda de
peso, peso dos órgãos (baço fígado e cólon).
6.4.1 Efeito sobre a perda de peso
94
A figura 13 demonstra a evolução da variação do peso corporal dos
animais. O grupo colítico tratado com veículo demonstrou uma perda de
peso de 19% em relação ao primeiro dia do experimento. Em contrapartida,
o grupo colítico tratado ESTE 300 mg/kg v.o, uma vez ao dia, durante sete
dias, apresentou uma perda de peso de 11% em relação ao primeiro dia
experimental.
Figura 13 – Efeito do ESTE na evolução da perda de peso em camundongos com
colite ulcerativa induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com
veículo (10 ml/kg, água + Tween 80 1%, colítico-veículo) e colítico tratado com
ESTE (300mg/kg, colítico-ESTE). Anova de duas vias seguida pelo teste
Bonferroni. *p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001 quando comparado ao grupo
colítico-veículo. ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L.
6.4.2 Efeito sobre o Índice de atividade da doença (IAD)
O índice de atividade da doença é medido através de escores, os quais
são: perda de peso, consistência das fezes (normal, fezes amolecidas e
95
diarreia) e presença de sangue retal. A figura 14 apresenta que o grupo
colítico tratado com o veículo atingiu um escore de 10,0 ± 0,7
(correspondente à diarreia grave com sangramento anal). Já o grupo tratado
com o ESTE 300 mg/kg (v.o) apresentou uma diminuição nesse escore
alcançando níveis iguais a 5,0 ± 0,9.
Figura 14 – Efeito do ESTE no IAD em camundongos com colite ulcerativa
induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com
veículo (10 ml/kg, água + Tween 80 1%, colítico-veículo) e colítico tratado com
ESTE (300mg/kg, colítico-ESTE). Anova de duas vias seguida pelo teste
Bonferroni. ** p<0,01 e *** p<0,001 quando comparado ao grupo colítico-veículo.
ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L.
6.4.3 Efeito sobre o encurtamento do cólon
Como esperado, o consumo de DSS reduziu em 32% o comprimento
do cólon dos camundongos do grupo veículo em relação ao grupo não-
colítico (10,72 ± 0,26 cm), Por outro lado, como é possível verificar na
figura 15, a administração oral do ESTE na dose de 300 mg/Kg evitou a
96
redução do comprimento do cólon dos animais expostos ao DSS quando
comparado ao grupo colítico tratado com veículo em 16%.
Figura 15 – Efeitos do ESTE no comprimento do cólon de camundongos com colite
ulcerativa induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com
veículo (10 ml/kg, água + Tween 80 1%, colítico-veículo) e colítico tratado com
ESTE (300mg/kg, colítico-ESTE). Painel A: Resultados são expressos como média
97 ± E.P.M. Anova de uma via seguida pelo teste Bonferroni. ** p<0,01 quando
comparado ao grupo colítico-veículo e ### p<0,001 quando comparado ao grupo
não-colítico (naive). Painel B: imagens representativas do aspecto macroscópico do
cólon dos diferentes grupos experimentais.
6.4.4 Efeito do ESTE sobre o peso do cólon, do baço e do fígado de
camundongos com colite induzida por DSS
Como observado na tabela 6, o peso do cólon, fígado e baço não
apresentou diferença estatística significativa entre os grupos experimentais.
Tabela 6 – Efeitos de ESTE sobre o peso do cólon, baço e fígado de camundongos
com colite ulcerativa induzida por DSS.
Tratamento Peso do cólon
(g/100g)
Peso do fígado
(g/100g)
Peso do baço
(g/100g)
Não-colítico Veículo 0,08 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,03 ± 0,01
Colítico Veiculo 0,09 ± 0,01 0,45 ± 0,02 0,03 ± 0,01
Colítico 5-ASA 0,08 ± 0,01 0,38 ± 0,03 0,04 ± 0,01
Colítico ESTE 0,10 ± 0,01 0,41 ± 0,03 0,04 ± 0,01
Veículo - 10 ml/kg, água + Tween 80 1%, 5-ASA – ácido 5-aminosalicílico (100
mg/kg, v.o); ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L (300 mg/kg, v.o).
6.5 Análise ex vivo
6.5.1 Efeito do ESTE sobre o escore histológico
A organização histológica do cólon dos camundongos foi analisada
nos cortes histológicos corados pela técnica HE e, recebeu as pontuações de
escore conforme Utrilla, Peinado e Ruiz (2015).
Como observado na figura 16A as alterações patológicas do cólon
foram atenuadas com o tratamento do ESTE (300 mg/kg v.o), como
demonstra o escore histológico em relação ao grupo colítico tratado com
veículo.
A figura 16B reforça esse resultado, pois o grupo colítico tratado com
ESTE apresentou as estruturas da parede do cólon, submucosa e criptas
muito próximas da normalidade, ou seja, do grupo não colítico.
98
Figura 16 – Efeito do ESTE no escore histológico associado a colite ulcerativa
induzida por DSS em camundongos.
Painel A: Valores são expressos como mediana ± intervalo interquartil do valor de
escore das alterações histológicas. Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-
Wallis seguido pelo pós teste de Dunns, ** p<0,01 quando comparado ao grupo
colítico-veículo; Painel B: Imagem representativa do aspecto histológico do cólon de
animais dos diferentes grupos experimentais.
99
6.5.2 Efeito do ESTE sobre os níveis de mucinas quantificadas
histoquimicamente
A coloração histoquímica PAS é utilizada na detecção da presença de
glicoproteínas, com a mucina, que desempenha papel protetor da mucosa
intestinal. Analisando a figura 17 a coloração PAS no grupo colítico tratado
com veículo apresentou 92% de redução quando comparado ao grupo naive
(não-colítico, 14,27 ± 1,5). O grupo colítico tratado com ESTE (300mg/kg)
apresentou aumento de 311% na marcação para mucinas, quando
comparado com o grupo colítico tratado com veículo.
Figura 17 – Efeito do ESTE nos níveis de mucina do cólon de camundongos com
colite ulcerativa induzida por DSS.
Painel A: Quantificação nos níveis de mucina. Resultados foram expressos como
média ± E.P.M. Anova de uma via seguida pelo teste Bonferroni. * p<0,05 quando
comparado ao grupo colítico-veículo e ### p<0,001 quando comparado ao grupo
não-colítico (naive). Painel B: imagens representativas dos níveis de mucina do
cólon dos diferentes grupos experimentais. Setas indicam mucinas coradas em rosa
pink. ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L. (300 mg/kg, v.o).
100
6.5.3 Efeitos do ESTE sobre parâmetros oxidativos
Como descrito na tabela 7 pode-se perceber que os níveis de GSH no
grupo colítico-veículo foram reduzidos em 24,9% quando comparado com o
grupo não-colítico (662,1 ± 34,14 µg/mg de tecido). Já o grupo colítico-
ESTE apresentou um aumento em 22,37% no GSH quando comparado ao
grupo colítico-veículo. Além disso, de forma não esperada, a análise dos
níveis de LOOH não apresentou diferença estatística significativa entre os
grupos experimentais.
Na análise da atividade da SOD, o grupo colítico tratado com veículo
apresentou uma redução de 56% neste parâmetro, quando comparado ao
grupo não-colítico. Por outro lado, os níveis de atividade da SOD foram
mantidos semelhantes aos basais no grupo colítico tratado com ESTE,
quando comparado ao grupo não-colítico (p>0,05).
Como esperado a atividade da enzima catalase foi reduzida em 63% no
grupo colítico tratado somente com veículo, quando comparado ao grupo
não colítico tratado com veículo (96,9 ± 7,6 µmol H2O2/min)). Entretanto,
surpreendentemente, a atividade de CAT no grupo colítico tratado com o
ESTE aumentou consideravelmente para níveis com média de 785,1 ± 65,0
mmol H2O2/min/mg de proteína). Por fim, a avaliação da atividade da
enzima detoxificante GST nos diferentes grupos experimentais revelou que
o grupo colítico-veículo apresentou uma atividade reduzida em 59,58%,
quando comparado ao grupo não-colítico (2175 ± 419 mmol de GSH/mg de
tecido). Em contra partida, o grupo colítico-ESTE apresentou níveis de
atividade de GST similares aos encontrados no grupo não-colítico (p>0,05).
Tabela 7 – Efeitos do ESTE nos parâmetros oxidativos no cólon de camundongos
com colite ulcerativa induzida por DSS.
Parâmetro Não-colítico Colítico-veículo Colítico-ESTE
GSH 662,1 ± 34,1 496,6 ± 27,7b 607,7 ± 30,9c
LOOH 5,0 ± 0,2 4,7 ± 0,2 3,5 ± 0,7
SOD 7,53 ± 1,11 3,30 ± 1,06a 8,40 ± 0,50d
CAT 96,9 ± 7,6 36,0 ± 6,7 785,1 ± 65,0e
GST 2175 ± 419 880 ± 145b 2432 ± 280d
GSH – Glutationa (µg/g tecido); LOOH - hidroperóxidos lipídicos (mmol
hidroperóxidos/mg de tecido; SOD – Superóxido dismutase (U/mg de proteína);
CAT – Catalase (µmol H2O2/min); GST - Glutationa S-transferase (mmol de
101 GSH/mg de tecido); ESTE - Extrato Seco de Tagetes erecta.. A análise estatística
foi realizada utilizando Anova de uma via seguida pelo teste Bonferroni. ap<0,01 e bp<0,001 quando comparado ao grupo não-colítico (naive).cp<0,05, dp<0,01 e ep<0,001 quando comparado ao grupo colítico-veículo.
6.5.4 Efeitos do ESTE em parâmetros inflamatórios
Na análise de MPO, demonstrada na figura 18, o grupo colítico tratado
com o ESTE reduziu em 82,35% a atividade desta enzima, quando
comparado o grupo colítico tratado com o veículo (17,59 ± 2,2 m D.O/ mg
de proteína).
Figura 18 – Efeito do ESTE nos níveis de MPO no cólon de camundongos com
colite ulcerativa induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com
veículo (Vei, 10 ml/kg, água + Tween 80 1%) e colítico tratado com ESTE
(300mg/kg). A análise estatística foi realizada utilizando Anova de uma via seguida
pelo teste Bonferroni. Sendo *** p<0,001 quando comparado ao grupo colítico-
veículo e ### p<0,001 quando comparado ao grupo não colítico (naive).
102
Observando a figura 19, pode-se perceber que o grupo veículo
apresentou um aumento de 52% nos níveis de TNF, quando comparado ao
grupo naive (296,3 ± 41,2 pg/ml). Porém, quando se observa o grupo ESTE
é possível perceber uma diminuição em 26% nos níveis desta citocina,
quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo.
Figura 19 – Efeito do ESTE nos níveis de TNF no cólon de camundongos com
colite ulcerativa induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com
veículo (Vei, 10 ml/kg, água + Tween 80 1%) e colítico tratado com ESTE
(300mg/kg). A análise estatística foi realizada utilizando Anova de uma via seguida
pelo teste Bonferroni.Sendo ** p<0,01 quando comparado ao grupo colítico-veículo
e ## p<0,01 quando comparado ao grupo não colítico (naive).
Como demonstrado na figura 20, o grupo veículo apresentou uma
elevação de 465% nos níveis de IL-6 no cólon, quando comparado ao grupo
naive (269,5 ± 11,4 pg/mL). Por outro lado, o tratamento oral com ESTE
teve a capacidade de reduzir em 26% os níveis desta citocina quando
comparado ao grupo colítico tratado com veículo.
103 Figura 20 – Efeito do ESTE sobre os níveis de IL-6 no cólon de camundongos com
colite ulcerativa induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com
veículo (Vei, 10 ml/kg, água + Tween 80 1%) e colítico tratado com ESTE
(300mg/kg). A análise estatística foi realizada utilizando Anova de uma via seguida
pelo teste Bonferroni. Sendo * p<0,05 quando comparado ao grupo colítico-veículo
e ### p<0,001 quando comparado ao grupo não colítico (naive).
6.6 Efeito do ESTE sobre o trânsito intestinal de camundongos
saudáveis
Como mostra a figura 21 o grupo tratado com loperamida (4 mg/kg)
teve uma redução no trânsito intestinal em 49% em comparação ao grupo
veículo (40,5 ± 3,8%). Já o grupo tratado com ESTE não apresentou
alteração significativa no trânsito intestinal quando comparado ao veículo
(p>0,05).
104
Figura 21 – Efeito do ESTE no trânsito intestinal de camundongos saudáveis.
VEI LOP ESTE0
10
20
30
40
50
#
300 mg/kg
Trâ
nsit
o I
nte
sti
nal
(%)
Os animais foram divididos em grupo controle negativo (água destilada 10 mL/kg),
grupo controle positivo recebeu loperamida (4 mg/kg) e grupo ESTE (300 mg/kg).
Os resultados foram expressos como média ± EPM. A análise estatística foi
realizada utilizando Anova de uma via seguida pelo teste Dunnett. #p<0,05 quando
comparado ao grupo veículo.
6.6.1 Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino.
Como mostra a figura 22 o grupo tratado com loperamida (4 mg/kg)
teve uma redução no score de diarreia em comparação ao grupo veículo
(p<0,01). Já o grupo tratado com ESTE não apresentou alteração
significativa no trânsito intestinal quando comparado ao veículo (p>0,05).
105 Figura 22 - Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino em animais
saudáveis.
Os animais foram divididos em grupo controle negativo (água destilada 10 mL/kg),
grupo controle positivo recebeu loperamida (4 mg/kg) e grupo ESTE (300 mg/kg).
Os resultados foram expressos como mediana ± intervalo interquartis. A análise
estatística foi realizada utilizando Kruskal-wallis seguida pelo teste Dunns. **p<0,01
quando comparado ao grupo veículo.
107
7 DISCUSSÃO
A prevenção ou atenuação das doenças inflamatórias intestinais por
terapias alternativas e/ou adjuvantes, em especial fitoterápicos ou
nutracêuticos, com menos efeitos colaterais e mais economicamente
acessíveis nos dias atuais é desejável. O extrato seco de T. erecta L. (ESTE)
é prescrito como suplemento alimentar pelo teor de luteína, um carotenoide
com variado potencial biológico. Por conseguinte, este estudo descreveu o
efeito do ESTE no modelo de colite ulcerativa induzida por DSS em
camundongos para contribuir com evidências experimentais acerca da
aplicabilidade desse extrato no tratamento de DII.
Os efeitos biológicos de carotenoides como a luteína tem se tornado
objeto de investigação e agências regulatórias como United States Food and
Drug Administration (U.S FDA) e Joint FAO/ WHO Expert Committee on
Food Additives (JECFA) os quais revisaram a segurança do uso dessa
substância como um suplemento fitoterápico ou dietético
(RAVIKRISHNAN et al., 2011).
Dado as limitações, em grande escala, nos procedimentos de
isolamento e purificação de carotenoides a partir de extratos vegetais, e o
impacto deste custo na comercialização, o ESTE padronizado em 10% de
luteína tem sido prescrito, em especial por nutricionistas, com o intuito de
suplementação de luteína como antioxidante, fotoprotetor oral, redução da
degeneração macular.
Nesse interim, o extrato empregado neste estudo foi obtido
comercialmente pela empresa fornecedora de insumos farmacêuticos
Pharmanostra (Lote n0 16E10-B019-005810). Após avaliação quantitativa
por RMN foi possível confirmar a presença de luteína no ESTE na
concentração de 8,2%. Corroborando, Hadden et al. (1999) apresentaram
evidências de que extratos comerciais de flores de T. erecta contêm trans-
luteína como o principal componente carotenoide com vários isômeros cis-
luteínicos como componentes menores.
Popularmente as flores de T. erecta são utilizadas como adstringente, e
para o tratamento de distúrbios gastrointestinais como desinteria, diarreia,
cólica, constipação, dores estomacais. Além disso, podem ser sedativa, para
tratar desordens de pele (acne e eczema, por exemplo), diurética, problemas
renais, infecções e cicatrização de feridas (MOLLIK et al., 2010). Como
reportado por Gong et al. (2011), a diversidade de efeitos biológicos
108
descritos para preparações de T. erecta pode ser devido à presença de
compostos antioxidantes, como ésteres de luteína e tocoferol (GONG et al.,
2011).
Na literatura há relatos de que a suplementação com antioxidantes
apresenta diferentes ações em modelos animais de colite, através de alguns
mecanismos, sendo eles: redução do estresse oxidativo, bloqueio de sinais
inflamatórios e supressão da resposta imune. Assim, os tratamentos
baseados em fitoquímicos e outros compostos antioxidantes podem ser uma
estratégia terapêutica interessante e eficaz para a CU, já que essa doença é
caracterizada por infiltrado inflamatório na lesão da mucosa, onde espécies
reativas de oxigênio como o superóxido, peróxido de hidrogênio e óxido
nítrico são liberados de leucócitos ativados causando a lesão tecidual
(SETHURAMAN et al., 2015). Sendo assim, seu início e progresso podem
ser controlados por fatores dietéticos, onde a modulação nutricional
adequada pode não apenas prevenir o aparecimento ou a recaída da doença
como também manter o período de sua remissão (SUNG, 2013).
Já se sabe que as pétalas de plantas do gênero Tagetes contêm várias
classes de metabólitos secundários, além dos carotenoides como a luteína,
tais como os compostos fenólicos, flavonídeos, triterpenos, álcoois, esteróis,
saponinas, taninos, polissacarídeos e resinas, os quais são conhecidos por
mediar seus efeitos farmacológicos. Especificamente as flores de T. erecta
L. possuem ácido cafeico, sinápico, ferúlico, m-cumárico e quercetina
(AYUB et al., 2017).
No presente estudo, a quantificação de fenois totais no ESTE foi
realizada demonstrando a presença de 239,3 ± 19,6 mg/g de extrato em
termos de ácido tânico. Corroborando com o achado, Gong et al. (2012)
quantificaram fenois totais em extratos hidroetanólicos de T. erecta L. em
diferentes proporções e identificaram que no extrato na proporção de
etanol:água de 5:5 havia 46,36 ± 0,26 mg GAE/g e na proporção 7:3
62.33±1.81 mg GAE/g. Outro achado interessante foi o de Ayub et al.
(2017) em que o extrato metanólico de T. erecta L. apresentou 35,6 ± 1.4
mg/g de fenóis totais, em pétalas secas, também mensurados como
equivalente de ácido gálico (GAE).
Além disso, no ensaio de sequestro do radical estável DPPH, a
incubação com ESTE na maior concentração (1000 µg/ml) reduziu os níveis
radicalares em 29%. Gong et al. (2012) verificaram que o extrato
hidroetanólico desengordurado de T. erecta L. (preparado com solução
109
extrativa de etanol e água na proporção de 7:3) incubado por 20 segundos
com DPPH na concentração de 0,0017 mmol/l, apresentou maior ação
sequestrante do radical livre estável. Esses dados contrastam com os
achados deste estudo, porém é possível que diferenças metodológicas para
determinar o potencial antioxidante de extratos vegetais, incluindo o tempo
de reação e a complexidade cinética da reação possa justificar o resultado
aqui obtido.
O tratamento da CU tem vários objetivos importantes além da
remissão. A cicatrização da mucosa é um deles e pode prevenir ou reduzir o
risco de câncer colorretal. Além disso, a qualidade de vida do paciente deve
ser melhorada, como a possibilidade de cessação de sintomas como
sangramento retal (PROBERT et al., 2014). A cicatrização da mucosa
intestinal está intimamente associada à proliferação e integridade das
células epiteliais intestinais. Por conseguinte, o efeito do ESTE na
viabilidade de células IEC-6 foi mensurado, e a incubação com o extrato
(1µg/ml) não alterou a viabilidade destas células. É provável, que a
incubação com ESTE nas concentrações de 10 e 100 µg/ml favoreça a
proliferação celular in vitro, porém novos experimentos são necessários
para verificar a veracidade dessa hipótese.
Similarmente, Chang et al. (2013) incubaram 0,1 a 10 µM de luteína
em IEC-6 e também não observaram efeitos deletérios sobre a viabilidade
dessas células. Vale a pena ressaltar, que as concentrações de 10 e 100
µg/ml de ESTE empregadas nos testes de cultivo celular deste estudo
equivalem a 1,44 µM e 14,41 µM de luteína, respectivamente, calculadas a
partir do teor deste carotenoide no extrato, reforçando e estendendo os
dados descritos por Chang et al. (2013).
O epitélio intestinal é de extrema importância, pois desempenha uma
barreira física entre o lúmen e o meio interno do organismo, e sua
manutenção é regulada criteriosamente por proliferação e morte celular
epitelial, além de diferenciação celular e resposta equilibrada aos antígenos
luminais. O epitélio colônico protege o intestino de inflamações, pelo fato
de suas células se organizarem e se conectarem através das junções
firmemente aderidas, assegurando a permeabilidade celular e também
promoverem a produção de muco, impedindo a aderência de bactérias à
superfície do mesmo. Uma disfunção epitelial pode promover aumento da
permeabilidade da barreira à micro-organismos e outros antígenos
110
provocando uma resposta inflamatória nas células subjacentes da mucosa e
consequentemente promovendo a DII (SEIDELIN, 2015).
O estresse oxidativo, entre outros fatores, é citado como um dos
principais mecanismos envolvidos na fisiopatologia da DII. A inflamação
intestinal crônica está associada à produção exacerbada de espécies reativas
de oxigênio (EROS), sugerindo um desequilíbrio entre oxidantes e
mecanismos antioxidantes. As EROS interagem com complexos
moleculares induzindo dano celular (BALMUS et al., 2016).
O lipopolissacarídeo (LPS) é importante na monocamada externa da
membrana externa da maioria das bactérias Gram-negativas, como forma de
proteção. O LPS atua induzindo células a produzir enzimas pró-
inflamatórias, como TNF-α, a ciclooxigenase-2 (COX-2), interleucinas,
NOS-2. O TGI humano é colonizado por um grande número de bactérias
comensais e esta susceptível a ação do LPS. Indivíduos com DII apresentam
um aumento de bactérias gram-negativas no intestino e consequentemente
de LPS, produzindo aumento e perpetuação da inflamação (RHEE, 2014
O óxido nítrico (ON) exerce múltiplos efeitos moduladores sobre a
inflamação e desempenha um papel fundamental na regulação das respostas
imunes, afetando praticamente todas as etapas do desenvolvimento da
inflamação, podendo inibir a expressão de moléculas de adesão, síntese de
citocinas e quimiocinas e adesão e transmigração de leucócitos. Grandes
quantidades de ON, geradas principalmente pela iNOS, podem ser tóxicas e
pró-inflamatórias (GUZIK; KOBUT; ADAMEK-GUZIK, 2003).
A incubação de ESTE na concentração de 100 µg/ml em células IEC-6
reduziu a produção de EROs induzidos por LPS, porém não reduziu os
níveis de nitrito. Corroborando com o achado, Chang et al. (2013)
verificaram que o tratamento das células IEC-6 com metotrexato (MTX)
(utilizado no tratamento do câncer e doenças autoimunes) exacerba a
geração de EROS e que esse parâmetro é suprimido pela pré-incubação com
luteína. Estes achados sugerem que a luteína pode atuar na mucosite
intestinal, que é um efeito adverso do uso de quimioterápicos, e também em
uma possível disbiose, a qual eleva os níveis de LPS intestinal, ocasionada
pelo desequilíbrio no balanço de bactérias gram-positivas e gram-negativas.
Assim, tais achados também reforçam a hipótese do efeito benéfico de
ESTE em doenças inflamatórias intestinais.
A colite ulcerativa induzida por DSS nos animais mimetiza a colite
humana em fase aguda, pois o dextran sulfato de sódio, que é administrado
111
na água dos animais provoca uma inflamação colônica dependendo da dose
e tempo de exposição. Em camundongos, a administração de DSS é
caracterizada por sangramento intenso presente nas fezes, diarreia e perda
de peso, especialmente após a administração cíclica, compreendendo
geralmente de 5 a 7 dias. A patologia estabelecida no cólon dos animais é
semelhante à observada na colite ulcerativa humana, consistindo em
ulcerações, erosão da barreira epitelial e infiltração extensiva de linfócitos e
granulócitos (OKAYASU et al., 1990; COOPER et al., 1993).
De fato, no presente estudo, o consumo de DSS na água de beber dos
animais experimentais promoveu alterações fenotípicas características à
instalação de inflamação colônica, incluindo a perda de peso, diarreia e a
presença de sangue nas fezes. Por outro lado, a administração de ESTE (300
mg/kg, v.o) por sete dias reduziu significativamente esses sinais. Para
demonstrar o mecanismo envolvido nos efeitos observados, também foi
avaliada a atividade do extrato em parâmetros oxidativos e inflamatórios.
Considerando a utilização de aminosalicilatos, como o 5-ASA, na
farmacoterapia da CU, este fármaco foi utilizado como controle positivo
nos experimentos deste estudo. Entretanto, similarmente a estudos prévios
(SILVA et al., 2016a; SILVA et al., 2016b; BOEING et al., 2018;
MARIANO et al., 2018), o efeito observado foi insuficiente e não
minimizou os sinais da inflamação colônica. Esse efeito pode ser justificado
pela diferença na forma de administração utilizada em relação à clínica, o
qual é administrado na forma de comprimidos revestidos, enemas e
supositórios.
A migração transepitelial de neutrófilos (criptite) e a migração
extensiva de neutrófilos através do epitélio da mucosa e no lúmen da cripta
são comumente associadas à DII humana, mas ocasionalmente relatadas em
patologia induzida experimentalmente por DSS. Como descrito por
Chassaing et al. (2014), a colite induzida por DSS resulta em infiltração de
leucócitos mononucleares, desordem da arquitetura cripta e um alargamento
do fosso entre a base da cripta e camada muscular com linfocitose mucosa
profunda comumente associada. De fato, nesse estudo severas alterações
estruturais nas criptas também foram observadas nos animais expostos ao
DSS e tratados com veículo.
Em concordância com os achados macroscópicos, a administração do
ESTE (300 mg/kg), uma vez ao dia durante sete dias, reduziu as alterações
patológicas do cólon, com base no escore histológico em relação ao grupo
112
colítico tratado com veículo. Os resultados demonstraram que o grupo
colítico tratado com ESTE apresentou as estruturas da parede do cólon,
submucosa e criptas muito próximas da normalidade, ou seja, do grupo não
colítico tratado com veículo.
O muco do cólon é composto por duas camadas, a de muco interno
formada pelas células de Goblet (caliciformes) e uma camada externa onde
as bactérias comensais podem se fixar e usufruir dos glicanos fornecidos
pelas mucinas. Em paralelo à melhora na organização histológica, os
animais tratados com ESTE apresentaram um aumento na marcação para
mucinas quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo. No
modelo de colite ulcerativa induzida por DSS há um desequilíbrio na
camada mucosa composta por mucinas, em decorrência da depleção de
células de Goblet, o que favorece a penetração de bactérias e seus produtos
em túnicas como a lâmina própria colônica (JOHANSSON; HANSSON,
2013). Desta forma, ainda que parcialmente, é possível sugerir que a
preservação dos níveis de mucina na mucosa colônica seja um evento
primário no mecanismo de ação do ESTE.
Como descrito por Johansson e Hansson (2013), a infiltração de
células imunes é observada a partir do terceiro dia de consumo de DSS, e
uma inflamação severa é verificada a partir do quinto dia. Sendo assim, há
uma exposição suficientemente grande de bactérias ao epitélio sendo que o
sistema imunológico subjacente desencadeará uma forte reação imunológica
e inflamatória. Durante reações inflamatórias os leucócitos geram EROs a
fim de combater os patógenos, e por outro lado, atacando os ácidos graxos
poli-insaturados de membranas biológicas do hospedeiro. Antioxidantes,
como os carotenoides, possuem uma importante interação no combate as
EROs pois são componentes das membranas celulares (SELVARAJ;
SHANMUGASUNDARAM; KLASING, 2010). Assim a atividade
antioxidante da luteína também é interessante no combate a produção de
EROs advindas de leucócitos recrutados durante a reação inflamatória
promovida pelo DSS no cólon.
Em contrapartida à produção de EROs, os tecidos possuem um sistema
antioxidante que conta com enzimas que catalisam, após uma reação em
cadeia, a transformação das mesmas em produtos menos reativos, dentre
tais enzimas encontram-se a superóxido dismutase (SOD) e a catalase
(CAT).
113
A SOD é uma enzima que promove um papel importante na
metabolização do O2 • -
a fim de evitar reações oxidantes que podem causar
danos e formação de EROs, incluindo peróxido de hidrogênio (H2O2),
hipoclorito (OCL-), peroxinitrato (ONO2
-) e radical hidroxila (OH
•)
(MILLER, 2011). A enzima CAT promove o controle da concentração de
H2O2 e outros radicais, sendo um fator importante na inflamação (GOYAL;
BASAK, 2010).
De forma interessante, a administração de ESTE normalizou a
atividade da SOD em níveis próximos aos basais, porém aumentou
significativamente a atividade da CAT. A regulação da expressão de CAT é
feita nos níveis de transcrição, pós-transcrição e pós-tradução, sendo
regulada pelo PPARγ que controla a expressão do gene CAT pela ligação a
um elemento de resposta PPARγ distal (PPRE) (KODYDKOVÁ et al.,
2014). A luteína, presente no ESTE, pode estra interagindo na transdução de
sinal através do PPAR e do receptor de ácido retinoico (RXR) modificando
assim as respostas inflamatórias (SELVARAJ;
SHANMUGASUNDARAM; KLASING, 2010). Assim, é possível que a
ativação de receptores PPAR por carotenoides presentes no ESTE possa
justificar, através da ativação de peroxissomos, o aumento significativo da
atividade da CAT descrita nesta pesquisa. Entretanto, experimentos
adicionais ainda são necessários para confirmar tal hipótese.
A enzima glutationa-S-transferase (GST) desempenha um importante
papel na detoxificação de inúmero xenobióticos como carcinógenos,
poluentes ambientais e quimioterápicos (SHEEHAN et al., 2001).
Desenvolve importante papel também a nível celular, removendo as EROS,
induzindo a apoptose, promovendo a síntese de esteroides e prostaglandinas
e o catabolismo da tirosina. Estudos tem demonstrado que níveis
diminuídos de GST estão associados a tumores, principalmente o carcinoma
colorretal (BEYERLE et al., 2015).
Indivíduos que apresentam a CU são grandes candidatos a
desenvolverem carcinoma colorretal. O processo inflamatório associado às
EROS e alguns radicais livres são causadores de danos genéticos ao epitélio
colônico (YASHIRO, 2014). As enzimas de biotransformação na mucosa
colônica são geralmente baixas e, em combinação com exposição crônica a
compostos carcinogênicos aumentam as chances de risco de câncer
colorretal. A atividade alta de GST no cólon de indivíduos saudáveis está
relacionada com uma maior capacidade de detoxificar carcinógenos e
114
favorecer uma proteção contra danos citogenéticos, porém se a atividade
aumentada da GST contribui ou não para a prevenção do câncer não foi
demonstrada em humanos, e necessita de mais pesquisas (BEYERLE et al.,
2015). O presente estudo demonstrou que a administração de ESTE (300
mg/kg v.o) normalizou os níveis de GST quando comparada ao grupo não-
colítico, indicando que o favorecimento do arsenal enzimático detoxificante
também faz parte dos efeitos benéficos da administração do extrato, o que
poderá ser promissor na prevenção do aparecimento de lesões neoplásicas à
partir da inflamação colônica.
Além das defesas enzimáticas, antioxidantes não enzimáticos como o
GSH, um tiol não proteico abundante composto pelos aminoácidos
glutamina, cisteína e glicina, também são fundamentais para a defesa
colônica frente ao estresse oxidativo. Esse tripeptídeo pode ser encontrado
na forma oxidada (GSSH) ou na forma reduzida (GSH). Tem como função
principal a regulação através de alguns mecanismos, como: GSH não
enzimaticamente reage com O2• e •OH; é cofator para algumas enzimas
como a GPx; modula uma variedades de funções proteicas via S-
glutationilação; serve como armazenamento de cisteína. Em condições
saudáveis é importante haver um balanço ideal entre GSH/GSSH
intracelular (PATLEVIč et al., 2016).
Rana et al. (2014) avaliaram o papel do estresse oxidativo e dos níveis
de antioxidantes em eritrócitos de pacientes com CU do norte da Índia. Os
autores concluíram que os pacientes com CU apresentam um aumento do
estresse oxidativo e diminuição dos níveis de GSH e sugerem, que os
mesmos podem ser tratados com antioxidantes além da terapia
medicamentosa tradicional. Corroborando com o dados discutidos até aqui,
a administração do ESTE (300 mg/kg v.o) promoveu aumento na
disponibilidade de GSH quando comparado ao grupo colítico-veículo, o que
indica preservação de agentes redutores endógenos e por conseguinte reflete
redução da produção ou sequestro de EROs.
Bashir e Gilani (2008) demonstraram em estudo in vitro que o extrato
de Tagetes erecta possui uma atividade antioxidante significativa em vários
sistemas oxidativos, os quais podem ser atribuídos à inibição dos radicais
livres e a capacidade redutora e de doação de hidrogênio. Esse achado
corrobora com o resultado obtido da administração de ESTE em evitar a
depleção de GSH, pois se há sequestro de radicais livres por ação de
fitoconstituintes, o GSH será menos degradado e ficará mais disponível.
115
Rajendran et al. (2014) explicam que no processo inflamatório, as
ERRO são produzidas através da ativação de neutrófilos e macrófagos e é
dosada pelos níveis de lipoperoxidação (LOOH). Trata-se de um processo
ocorrente quando a cadeia de ácidos graxos poli-insaturados dos
fosfolipídeos da membrana celular é agredida por EROS degradando a
membrana. A fosfolipase A2 ativada pelas EROS desintegra os
fosfolipídeos, liberando os ácidos graxos não saturados ocasionando em
diversos fatores lesivos. Surpreendentemente, a análise dos níveis de
LOOH, no presente estudo, não apresentou diferença estatística significativa
entre os grupos experimentais.
A mieloperoxidase (MPO) faz parte das enzimas heme peroxidase,
presente principalmente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos, os quais
são células fagocíticas móveis e constituem o tipo de célula efetoras
primárias do sistema imune inato, que tem como papel principal encontrar,
ingerir e destruir uma ampla gama de patógenos invasores. Por muito
tempo, a enzima MPO foi considerada uma enzima bactericida, tendo como
função principal gerar EROs para favorecer a morte de patógenos. Ela está
intimamente ligada na homeostase celular e é um fator importante no início
e progressão de várias doenças inflamatórias, tendo um interesse em várias
doenças inflamatórias crônicas, desempenhando um papel importante tanto
na saúde quanto na doença. Especificamente na saúde ela é um componente
importante dos neutrófilos e monócitos necessários para matar e digerir
patógenos fagocitados. Em doenças inflamatórias, a MPO participa de
eventos que contribuem para a iniciação e propagação da resposta
inflamatória (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009).
Em pacientes com DII é comum o acúmulo de neutrófilos em conjunto
com o aumento da atividade da MPO observado nas lesões da mucosa
intestinal. Resultados obtidos em modelos animais reforçam a suposição
que os neutrófilos contribuem para a lesão tecidual na DII. A administração
oral de DSS em animais, como a realizada no presente trabalho, está
associada a uma abundante infiltração de neutrófilos, indicando um papel
importante na inflamação mediada por neutrófilos no desenvolvimento da
colite, reforçando a importância da pesquisa de antioxidantes que atuem
nesse mecanismo, reduzindo a infiltração neutrofílica e consequentemente
os níveis de MPO (NATSUI et al., 1997; ROBINSON et al., 1997;
KRUIDENIER et al., 2003; MOROHOSHI et al., 2006; NAITO; TAKAGI;
YOSHIKAWA, 2007). Comprovando redução do processo inflamatório, a
116
administração do ESTE na dose de 300 mg/kg (v.o) reduziu a atividade da
MPO.
Ainda relacionando os marcadores inflamatórios da DII, temos o
TNF-α o qual é uma citocina pró-inflamatória e imunorreguladora que
aumenta a migração de leucócitos, promove a transcrição de vários genes
inflamatórios e causa apoptose de células epiteliais intestinais, envolvida no
metabolismo ósseo e no desenvolvimento de órgãos linfoides. Trata-se da
citocina mais importante da cascata inflamatória do trato gastro intestinal e
está aumentada no soro, cólon e fezes de pacientes com CU (AFZALI;
FAUSEL, 2015; PARK; JEEN, 2015). Reforçando o efeito anti-
inflamatório intestinal do ESTE (300 mg/kg v.o), os níveis de TNF colônico
foram reduzidos em animais tratados com o extrato.
A IL-6, é uma citocina que desempenha diferentes papéis regulatórios
da resposta imune adaptativa na inflamação crônica, como é o caso da DII.
Tem importância central na regulação e equilíbrio de células T pró-
inflamatórias como Th1, Th17 e Tregs imunossupressoras. A IL-6 tem sido
considerada importante na correlação entre inflamação e desenvolvimento
de câncer. A inibição ou atenuação dessa citocina parece ser uma opção de
tratamento para patologias envolvidas na inflamação, como é o caso da CU
(WALDNER; NEURATH, 2014). De forma interessante, o tratamento com
ESTE (300 mg/kg v.o) também foi capaz de reduzir os níveis de IL-6,
reforçando ainda mais seu potencial anti-inflamatória na CU.
Corroborando com os resultados de TNF- α e de IL-6 nos tecidos
colônicos de animais tratados com ESTE, Trivedi e Jena (2014) verificaram
que o tratamento com β-caroteno reduziu significativamente os níveis de
marcadores inflamatórios como IL-6 e TNF- α no cólon de camundongos
com CU, confirmando as propriedades anti-inflamatória de carotenoides.
A motilidade gastrointestinal é regulada através de ação hormonal,
tanto de forma circulante quanto local, além de neurotransmissores,
principalmente do sistema nervoso entérico. A liberação dessas substâncias
é regulada pelo sistema nervoso central (SNC), onde os hormônios
intestino-cérebro como colecistocinina (CCK), peptídeo intestinal vasoativo
(VIP) e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) são
mediadores na regulação gastrointestinal. Estresse (trauma, frio e dor, por
exemplo) podem induzir a liberação desses peptídeos do SNC e desregular a
motilidade intestinal (PEUHKURI, 2010).
117
Um dos principais sintomas da CU é a diarreia sanguinolenta. Desta
forma, o número de evacuações e a composição diária das fezes são
parâmetros importantes na avaliação da atividade da doença por meio de
diferentes classificações (ou escores) clínicos (HAASE et al., 2016). A
citocinas envolvidas na inflamação intestinal podem promover um aumento
da permeabilidade intestinal, além de afetar a contratilidade das células
musculares lisas intestinais aumentando a dismotilidade gastrointestinal e
possivelmente afetando o trânsito gastrointestinal. Adicionalmente, em
pacientes que apresentam CU se observa anormalidades estruturais no
sistema nervoso entérico, as quais podem, provavelmente, afetar a
motilidade gastrointestinal e o padrão de trânsito intestinal, não somente
restrito ao local da inflamação e, consequentemente, a inflamação pode
causar dismotilidade do trato gastrointestinal dentro e fora das regiões
inflamadas (VILLANACCI et al., 2008; AKIHO et al. 2011; BASSOTTI,
2014; HAASE et al., 2016).
Em animais saudáveis a administração de ESTE (300 mg/kg v.o) não
alterou o trânsito intestinal quando comprado ao grupo veículo. Também
não houve alteração no índice de diarreia nos animais que receberam óleo
de rícino. Porém, observando os animais colíticos tratados com o ESTE
durante o experimento, foi possível observar redução da diarreia nos
mesmos, fato este observado nos resultados de índice de atividade da
doença (IAD).
Porém, Ventura-martínez et al. (2018) relatam que o extrato aquoso
das flores de T. erecta exibiu uma atividade espasmolítica, possivelmente
envolvendo a participação dos canais de cálcio, corroborando com os
achados de uso popular da infusão das flores para aliviar cólicas
abdominais. Contraditoriamente, o extrato aquoso pode induzir contrações
abdominais, como um efeito adverso, quando utilizado para outras queixas
como anti-helmíntico, diurético, tranquilizante, hipoglicemiante,
hipolipidêmico ou antitussígeno (VENTURA-MARTÍNEZ et al., 2018).
Diferentemente, o ESTE é um extrato hidroetanolico, e sua ação na
motilidade intestinal, ou seja, em reduzir a diarreia de animais colíticos, mas
não de reduzir o transito intestinal de animais saudáveis, possivelmente, se
dê pelo fato de propriedades anti-inflamatórias e não por possuir
propriedades inibitórias da motilidade intestinal.
Os dados demonstram o potencial anti-inflamatório intestinal do ESTE
na atenuação das alterações patológicas decorrentes da colite ulcerativa
118
induzida por DSS em camundongos. Vale ressaltar, que os níveis de luteína
presentes no extrato podem justificar tal efeito, dado que o potencial
farmacológico deste carotenoide em desordens inflamatórias e oxidativas
têm sido descrito. Por conseguinte, ainda que pré-clinicamente, este estudo
contribui para a validação do uso deste extrato como suplemento nutricional
para o tratamento adjuvante de desordens inflamatórias intestinais. Assim,
os dados obtidos indicam que a melhora nos parâmetros de estresse
oxidativo e a atenuação de secreção de citocinas inflamatórias participam do
modo de ação do ESTE em reduzir a CU.
Entretanto, vale ressaltar que outros fitoconstituintes do ESTE também
podem participar dos efeitos obtidos, assim a complexidade do extrato em
detrimento à suplementação de luteína pura, pode ser um recurso
interessante em se tratando da diversidade de moléculas e mecanismos
bioativos.
119
CONCLUSÃO
Há um potencial anti-inflamatório intestinal do ESTE na atenuação
das alterações patológicas decorrentes da colite ulcerativa;
Os níveis de luteína presentes no extrato podem justificar tal efeito;
Pré-clinicamente, este estudo contribui para a validação do uso
deste extrato como suplemento nutricional para o tratamento
adjuvante de desordens inflamatórias intestinais;
A melhora nos parâmetros de estresse oxidativo e a atenuação de
secreção de citocinas inflamatórias participam do modo de ação do
ESTE em reduzir a CU;
Outros fitoconstituintes do ESTE também podem participar dos
efeitos obtidos.
121
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