objetiv
os
AULA2 Princpios de funcionamento dos microscpios eletrnicos
Ao final desta aula, voc dever ser capaz de:
Situar a microscopia eletrnica como instrumento bsico no estudo da clula.
Situar a microscopia eletrnica num contexto histrico.
Reconhecer os componentes bsicos do funcionamento de um microscpio eletrnico.
Discriminar os diferentes tipos de microscpios eletrnicos de transmisso e de varredura.
Correlacionar os equipamentos usados e as informaes contidas nas imagens.
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HISTRICO
O sculo XX conheceu uma verdadeira "febre" a partir da
descoberta dos eltrons, feita por Thompson, em 1897. Tanto os clculos
feitos pelos fsicos tericos, quanto os experimentos feitos nos "tubos de
raios catdicos" vieram a provar a natureza ondulatria dos eltrons.
Esses pioneiros provavelmente no faziam a menor idia aonde aquelas
observaes iriam levar, mas o estudo do comportamento ondulatrio dos
eltrons resultou tanto na inveno dos aparelhos de televiso quanto na
de um dos instrumentos fundamentais no estudo da Biologia Celular: o
microscpio eletrnico. No ano de 1926, Bush provou que era possvel
focalizar um feixe de eltrons utilizando uma lente eletromagntica
circular, estabelecendo assim os fundamentos da ptica eletrnica. Com
base nesses princpios, foi iniciada em 1931 a construo do primeiro
microscpio eletrnico por um grupo liderado por Ruska. Pelo enorme
avano que a microscopia eletrnica trouxe para as cincias, Ruska
recebeu o Prmio Nobel na dcada de 80. Em 1939, a Siemens j construa
o primeiro modelo comercial de microscpio eletrnico.
Os microscpios eletrnicos so instrumentos fundamentais no estudo da clula.
Foram desenvolvidos na primeira metade do sculo XX, sendo contemporneos
da televiso e dos aparelhos de raios-X.
INTRODUO
Quando falamos em microscpio eletrnico, na verdade estamos
nos referindo a uma famlia de instrumentos que utiliza um feixe de
eltrons para produzir uma imagem ampliada de um objeto. Essa famlia
composta por dois tipos de micrscopios: os microscpios eletrnicos
de transmisso e os microscpios eletrnicos de varredura. Os primeiros
se baseiam na capacidade do feixe de eltrons de atravessar a amostra,
enquanto nos segundos o feixe de eltrons percorre a superfcie da amostra
gerando um sinal que ser visualizado num monitor (Figura 2.1).
Figura 2.1: Princpios de funcionamento do microscpio eletrnico de transmisso e do microscpio eletrnico de varredura. No microscpio eletrnico de transmisso (1) o feixe de eletrns atravessa as reas da amostra onde tomos mais leves esto presentes. No microscpio eletrnico de varredura (2) a interao dos eltrons com a superfcie da amostra gera sinais que formam uma imagem num monitor de TV.
ERNST RUSKA (1906-1988)
Fsico alemo nascido em Heidelberg, um dos ganhadores do Prmio Nobel de Fsica (1986) por seu trabalho fundamental em ptica eletrnica e por projetar o primeiro microscpio eletrnico. Pesquisador da Siemens-Reiniger-werke AG (1937-1955), diretor do Fritz-Haber-Institut der Max-Planck-Gesellschaft, Berlim (1955-1972) e professor na Universidade Tcnica de Berlim.
(1) (2)
tela de observao
espcime
monitor
feixe de eltrons
sinal emitido do espcimegerando imagem
espcime
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imagem observadadiretamente
lenteocular
lente objetiva
espcime
lente condensadora
fonte de luz
filamento aquecido(fonte de eltrons)
lenteprojetora
imagem em telafluorescente
Trs sculos de microscopia ptica serviram para acelerar os
progressos na interpretao das imagens da microscopia eletrnica. Ao
microscpio ptico no difcil determinar o formato geral da clula e a
localizao do ncleo, mas no muito fcil identificar estruturas dentro
da clula. Por qu? Veja a resposta ao lado.
Mesmo assim, grande parte das estruturas intracelulares, as organelas,
j havia sido descrita ao microscpio ptico. Naturalmente, as funes e
a estrutura detalhada dessas organelas s foram esclarecidas mais tarde.
O grande salto conferido Biologia Celular depois da inveno desse instrumento
reside no grande poder de resoluo que suas imagens possuem.
d= 0,61
onde, d = limite de resoluo
= comprimento de onda da radiao, no caso de eltrons, 0,37
= abertura da objetiva em radianos (0,5o= 0,01rad)assim,
d = 2,2 no microscpio eletrnico e
= angstron. Sabe quantos angstrons h em 1 m? 1m = 1010
Isto , no apenas uma questo de aumentar mais as clulas e sim
de permitir que sejam observadas estruturas menores dentro delas.
O microscpio eletrnico de transmisso
O microscpio eletrnico de transmisso idntico ao
microscpio ptico na montagem de seus itens bsicos (Figura 2.2),
apenas maior e invertido.
Figura 2.2: C o m p a r a o e n t r e o m i c r o s c p i o ptico (1) e o microscpio eltrnico de transmisso (2) mostrando a posio relativa e a equivalncia de seus componentes.
Resposta:Porque so pequenas, transparentes, de forma e tamanho varivel
!
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O que os diferencia fundamentalmente :
1 a fonte: luz visvel no microscpio ptico e feixe de eltrons
no microscpio eletrnico de transmisso;
2 o vcuo na coluna do microscpio eletrnico de transmisso;
3 as lentes: de vidro no microscpio ptico e eletromagnetos no
microscpio eletrnico de transmisso;
4 a espessura da amostra: da ordem de micrmetros (m) no
microscpio ptico e de nanmetros (nm) no microscpio eletrnico.
O feixe de eltrons gerado por um filamento de tungstnio que
aquecido; podemos comparar ao que observamos numa lmpada em
que o filamento aquecido emite o feixe luminoso (e eltrons tambm).
O vcuo, que tambm existe dentro do bulbo da lmpada,
necessrio no apenas para impedir a combusto do filamento na
presena de oxignio como tambm para impedir a coliso do feixe de
eltrons com molculas do ar. Por outro lado, esse um dos fatores que
impossibilita a observao de clulas vivas no microscpio eletrnico
de transmisso.
As lentes magnticas desviam e orientam o feixe de eltrons
da mesma forma que as lentes de vidro desviam e orientam o
feixe de luz; lembre-se de que eltrons so uma radiao de carga
negativa, sendo portanto atrados por cargas opostas e repelidos
por cargas semelhantes.
J a amostra precisa ser cortada em fatias muito finas para ser
atravessada pelos eltrons. Mesmo a lmina de vidro mais fina barraria
o feixe de eltrons. Por esse motivo so usadas telas de cobre para servir
de suporte para os cortes ultrafinos (o processamento e o preparo das
amostras para observao sero descritos mais adiante).
A seguir voc v uma foto de um microscpio de transmisso;
note como ele bem maior que os microscpios pticos, a comear
pela coluna por onde passa o feixe de eltrons e onde esto distribudas
as lentes magnticas (Figura 2.3).
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Figura 2.3: Microscpio eletrnico Zeiss 900 instalado no Instituto de Biofsica da UFRJ.
COMO SE FORMA A IMAGEM NUM MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO?
Ao interagir com a amostra, os eltrons do feixe podem (Figura 2.4):
1 passar entre os tomos sem colidir com eles;
2 ser barrados por um tomo desviando-se num grande ngulo
(desvio elstico);
3 ser levemente desviados de sua rota por um tomo (desvio
inelstico);
Figura 2.4: Possveis desvios na trajetria de um eltron ao interagir com um tomo.
filamento
posio das lentes magnticas
Lupa
para observao da imagem na tela
fluorescente
local onde colocada a amostra
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PREPARO DE AMOSTRAS PARA OBSERVAO AO MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO
O ambiente no interior da coluna do microscpio eletrnico
vcuo, feixe de eltrons no nem um pouco favorvel preservao
da estrutura celular. Alm disso, a composio qumica das clulas,
basicamente tomos leves como C, H, O e N, tambm no propcia
formao de imagens no MET. Por esses motivos, assim como o
microscpio foi-se aperfeioando desde sua inveno, paralelamente
toda uma metodologia de preparao de amostras para observao ao
microscpio eletrnico de transmisso foi sendo desenvolvida.
Destas trs possibilidades de interao resultar a imagem no
microscpio eletrnico de transmisso: os eltrons barrados ou desviados
(2) sero excludos da imagem final, resultando em pontos escuros,
enquanto os eltrons que atravessarem a amostra (1 e 3) iro colidir
com uma tela fluorescente, dando origem a pontos claros (Figura 2.5).
Figura 2.5: Formao da imagem no microscpio eletrnico de transmisso.
telafluorescente
eltrons barrados
eltrons transmitidos
abertura da objetiva
espcime
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No incio era assim:
A micrografia ao lado foi obtida em 1945 com microscpio
de transmisso utilizando espcime biolgico (um fibroblasto de
embrio de pinto). Repare que uma clula inteira e que a imagem
lembra muito o que observamos em microscopia ptica.
Cortesia de www.rockfeller.edu/rucal/journey/journey.html
O uso de substncias para preservar as estruturas
celulares, chamadas fixadores, tornou o microscpio muito
mais til. Veja na figura ao lado a imagem de uma clula vegetal
fixada com uma soluo de KMnO4. O citoplasma aparece
vazio, mas muitas estruturas j so reconhecveis. Veja no
final da aula, se voc identificou corretamente as organelas.
O uso mais recente do
glutaraldedo, do OsO4 e de
solues tampo, que mantm o
pH e a osmolaridade adequadas
boa preservao celular,
resulta em imagens como esta,
em que a estrutura da celula
pode ser observada em toda a
sua complexidade.
Kei
th P
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As etapas desse processo esto esquematizadas na Figura 2.6 e
so as seguintes:
1 Fixao: Em geral feita mergulhando as clulas ou tecidos em solues
que estabilizam as membranas e os constituintes celulares na forma o mais
prxima possvel da in vivo. Os mais utilizados so o formaldedo (sim, o
formol, tambm utilizado na preservao de cadveres) e o glutaraldedo,
superior ao formol e por isso mais utilizado do que este. Essas substncias,
chamadas fixadores, so empregadas diludas em tampes, que ajudam
a manter o pH e a osmolaridade da soluo fixadora o mais prximas
possvel das condies vitais. Dessa maneira evita-se a deformao ou o
rompimento das estruturas celulares.
2 Ps-fixao e contrastao: Como os seres vivos so compostos
basicamente por tomos leves que desviam pouco ou nada a passagem
do feixe de eltrons, so utilizadas solues de sais de metais pesados
(Fe, Os, Ur, Pb), que, alm de melhorarem a preservao das clulas,
aumentam o contraste das amostras quando observadas ao microscpio
eletrnico de transmisso. Esses sais se impregnam seletivamente nas
membranas (caso do smio e do chumbo), no DNA (caso do urnio)
ou em outros componentes celulares, facilitando a visualizao dessas
estruturas. O tetrxido de smio (OsO4) impregna-se nas membranas
funcionando como um fixador e conferindo simultneamente maior
contraste s mesmas. Por ser utilizado depois do glutaraldedo, um
ps-fixador. J os sais de chumbo e urnio geralmente so utilizados na
ltima etapa de preparao da amostra, logo antes da observao ao
microscpio eletrnico.
3 Desidratao, incluso e microtomia: A fixao confere preservao s
clulas; entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas
para que o feixe de eltrons possa atravess-las tambm um obstculo
a ser superado. Para isso as amostras tm toda sua gua substituda,
inicialmente por um solvente orgnico como lcool etlico ou acetona, e
em seguida por uma resina que, inicialmente, lquida, mas nas condies
adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as amostras
sejam cortadas em fatias finas o suficiente para que os eltrons possam
passar nas reas em que no se impregnaram os metais pesados.
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Figura 2.6: Preparo de amostra para microscpio eletrnico de transmisso.
planta animal
fragmentode amostra
1 fixao:glutaraldedo
clulas isoladas,bactrias, etc.
centrifugao
lavagem
ps-fixao:OsO4
lavagem
desidratao:acetona
25% 50% 75% 95% 100% 25% 50% 75% 95% 100%resina
lavagem
inclusopolimerizao
(a 60C a resina endurece)ultramicrotomia(O tecido cortadoem fatias ultrafinas)
As sees ultrafinasso coletadas da superfcie
da gua com telas de cobre.
contrastaoAntes de ser levada ao microscpio
eletrnico a amostra, j sobre a grade, passada por solues de acetato de uranila
e citrato de chumbo, que aumentamo contraste das clulas.
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Figura 2.7: Corte ultrafino de um hemcito de caramujo como o visto na Figura 1.8D. Ao mi-croscpio eletrnico de transmisso podemos observar que o ncleo no compacto e que di-versas organelas esto dispersas no citoplasma. (Foto Marco Antonio Vasconcelos Santos)
!D uma paradinha!
Eltrons, ftons, fixadores e microtomia... quanta novidade, no? Neste ponto sugerimos que voc interrompa a leitura e reveja os muitos conceitos aqui apresentados, antes de iniciar a leitura do texto sobre microscopia eletrnica de varredura. Questes de auto-avaliao sobre este tema voc encontrar junto com as de microscopia eletrnica de varredura. No plo voc encontrar material em vdeo sobre o assunto.
As imagens das amostras observadas ao microscpio eletrnico
de transmisso podem ser fotografadas ou gravadas digitalmente para
registro e estudo posterior (Figura 2.7).
Uma idia mais clara sobre a preparao de amostra para microscopia
eletrnica voc ter consultado a plataforma Cederj.
A microscopia eletrnica de transmisso permite a observao
do interior da clula e de suas estruturas e organelas. Infelizmente,
como a observao em geral feita em fatias muito finas das clulas,
temos sempre imagens bidimensionais de objetos que, na realidade, so
tridimensionais. Essa dificuldade foi, ao menos parcialmente contornada
pela microscopia eletrnica de varredura, onde a resoluo de detalhes da
clula se combina observao da sua estrutura tridimensional.
O MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA
No incio deste texto voc pde observar um esquema muito
simplificado, comparando as imagens obtidas num microscpio
de transmisso com o de varredura (Figura 2.1). A Figura 2.8
compara os componentes do microscpio eletrnico de varredura
com o de transmisso. No microscpio de varredura (Figura 2.8)
um filamento de tungstnio aquecido gera um feixe de eltrons,
que tambm incide sobre a amostra, mas ao invs de atravess-
la varre a superfcie ponto a ponto; porm, nesse caso, ao invs
de atravess-la, interage com a amostra, extraindo da superfcie
desta outros eltrons (chamados eltrons secundrios) que geram
um sinal luminoso que convertido numa imagem (Figura 2.9).
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Como acabamos de comentar, o feixe de eltrons passeia sobre a
amostra, como o feixe de laser sobre o CD que voc ouve. Assim
como de cada ponto do CD extrado um sinal sonoro diferente (a
msica!), cada ponto da amostra interage de modo diferente com
o feixe de eltrons e dessas diferenas so gerados pontos mais ou
menos brilhantes que formaro a imagem. Essa imagem observada
num monitor de TV e pode ser registrada em fotografia ou num
computador. Veja tambm um modelo de microscpio eletrnico de
varredura na Figura 2.10.
Figura 2.8: Filamento aquecido (fonte de eltrons) do MET, apontar a lente objetiva do MEV.
Figura 2.9: Imagens de microscopia de varredura: A: Clulas na fase final da diviso. B: Detalhe da regio anterior do inseto Oncopeltus fasciatus. A sensao de profundidade e relevo so as principais caractersticas dessa modalidade de microscopia eletrnica.
foto
: M
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Figura 2.10: Foto de mi-croscpio eletrnico de varredura Jeol 5310 em operao no Instituto de Biofsica da UFRJ.
PREPARO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA DE VARREDURA
Como, em geral, o objetivo do pesquisador ao utilizar o
microscpio eletrnico de varredura obter informaes sobre a forma
externa das amostras (sejam elas clulas, folhas, insetos, dentes, plos
etc.), estas no so cortadas em fatias. O processamento para observao
no microscpio eletrnico de varredura envolve, aps o tratamento com
solues fixadoras, a secagem do material (para remover toda a gua, j
que esse microscpio tambm opera sob vcuo) e seu revestimento com
ouro ou outro elemento condutor, para gerao do sinal (Figura 2.11).
Para maiores detalhes, consulte a plataforma Cederj.
foto
: M
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Figura 2.11: Esquema das principais etapas do processamento de amostras para microscopia eletrnica de varredura.
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Outras imagens obtidas com o microscpio de varredura podem
ser observadas nos seguintes endereos da Internet:
http://www.ou.edu/research/eletctron/www-vl/-_links para muitas
colees de imagens, tanto de microscopia ptica quanto eletrnica.
http://www.uq.edu.au/nanoworld/images_1.html
http://www.prbc.hawaii.edu/nanoworld/~kunkel
http://www2.uerj.br/~micron/- laboratrio de microscopia e
processamento de imagens
http://www2.uerj.br/~micron/
Voc tambm pode localizar outros endereos interessantes nos
sites de busca como o:
www.google.com
www.yahoo.com
Compartilhe os resultados de sua busca com seu tutor e com os
colegas do plo.
OUTROS MICROSCPIOS ELETRNICOS
Como comentamos no incio da aula, os
microscpios eletrnicos formam uma verdadeira
famlia. De acordo com os acessrios de que so
dotados ou ainda conforme as amostras sejam
preparadas, diferentes tipos de imagem e de
informao so obtidos.
O MICROSCPIO ELETRNICO DE ALTA VOLTAGEM
Enquanto no microscpio eletrnico de
transmisso convencional o feixe de eltrons
acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observao
de amostras at 100-150 nm de espessura, no
microscpio eletrnico de transmisso de alta
voltagem a acelerao do feixe de at 1.000
KV. Isso permite a observao de amostras bem
mais espessas (at 2 m!). A maioria das clulas
mais espessa do que isso (5-20 m), mas mesmo
assim aspectos importantes das clulas foram
observados nesse microscpio eletrnico de
transmisso (Figura 2.12)
Figura 2.12: Microscpio eletrnico de alta voltagem (1.000 KV) instalado na Universidade do Colorado em Boulder. (Imagem retirada do site http://bio3d.colordo.edu/m.html).
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MICROANLISE
De acordo com a natureza dos tomos presentes na amostra, a
coliso com os eltrons do feixe gera raios-X e outras radiaes que
podem ser captadas por detectores especiais, dando informaes sobre
a composio qumica da amostra. Esses detectores so acessrios que
podem ser adaptados ao microscpio eletrnico de transmisso ou ao
microscpio eletrnico de varredura.
VARREDURA DE ALTA RESOLUO
Nesse microscpio (Figura 2.13) o feixe emitido muito fino,
varrendo reas muito menores da amostra. Assim, detalhes que passam
despercebidos na varredura convencional podem ser resolvidos. Organelas
e filamentos do citoesqueleto (Figura 2.14), que normalmente no so
visveis ao microscpio eletrnico de varredura, podem ser vistas aqui.
Figura 2.13: Microscpio de varredura de alta resoluo Jeol.
Figura 2.14: Os microtbulos que formam o citoesqueleto desse protozorio (Herpetomonas megaseliae) no seriam visveis no microscpio de varredura convencional.
Foto
: C
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R E S U M O
O poder de resoluo da microscopia eletrnica muito maior do que os dos
microscpios pticos porque o comprimento de onda dos eltrons muito
menor do que o da luz visvel. Os princpios da microscopia eletrnica foram
estabelecidos por Ruska no incio do sculo XX. Os microscpios eletrnicos
podem ser divididos em de transmisso e de varredura. Nos primeiros, as imagens
so de cortes ultrafinos ou mostram a regio interna da clula com a estrutura
de membrana, as organelas, como mitocndrias e retculo endoplasmtico etc.
No microscpio de varredura a imagem formada quando o feixe percorre a
superfcie da amostra, arrancando de sua superfcie eltrons que iro formar
uma imagem da superfcie externa que estiver sendo "varrida".
VARREDURA DE PRESSO VARIVEL (AMBIENTAL)
Nesse modelo de microscpio eletrnico de varredura, a presso
na coluna varivel, sendo possvel observar amostra frescas, isto , sem
nenhum tratamento qumico e sem o processo de secagem. Potencialmente,
podem ser observadas amostras vivas nesse microscpio, mas o poder de
resoluo ainda bastante limitado.
Links de interesse:
http://www.mos.org/sln/SEM/works/slideshow/semmov.html
- animao sobre o funcionamento do MEV.
http://www.denniskunkel.com/ - imagens de microscopia ptica
e eletrnica artificialmente coloridas. Muito bonito!
http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/
Zeisslist2.html - Maravilhosas imagens de fluorescncia obtidas em
microscpio de fluorescncia confocal.
http://mgasun.bch.umontreal.ca/protists/gallery.html - imagens de
protistas em microscopia ptica de contraste interferencial e de fase. Links
para imagens desses mesmos organismos em microscopia eletrnica,
mostrando como vrios mtodos de observao deve ser conjugados na
anlise de um organismo.
http://www.msa.microscopy.com/ProjectMicro/Books4.html
- coleo de CD-roms selecionados com comentrios.
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EXERCCIOS
1. Defina, em suas prprias palavras, o que o poder de resoluo.
2. Se uma determinada estrutura mede 100nm de dimetro, quanto medir se
observada ao microscpio eletrnico com 10.000X de aumento?
3. Se a rea de observao na tela do microscpio eletrnico mede 9x9 cm e uma
clula mede cerca de 30 m de dimetro, qual o maior aumento com o qual poderemos observar toda sua circunferncia?
4. Faa uma tabela comparando o poder de resoluo, a natureza das lentes
e o tipo de emisso do filamento do microscpio eletrnico de transmisso
em relao ao microscpio ptico.
5. A formao da imagem no microscpio de transmisso se d sobre uma tela
fluorescente. Nos pontos em que os eltrons foram barrados pelos tomos da
amostra, a imagem ____________________, enquanto os eltrons no barrados
incidem sobre a tela e fornecem _______________. tomos de elementos mais leves
tendem a ________________ mais eltrons e elementos mais pesados tendem a
____________________mais eltrons.
6. Por que necessrio que a coluna dos microscpicos eletrnicos permanea
sob vcuo?
7. As clulas so hidratadas e, mesmo sendo formadas por elementos leves
(C, H, N, O), so muito espessas para permitir a passagem de um feixe de eltrons.
Quais os principais processos a que precisam ser submetidas antes da observao
ao microscpio de transmisso?
8. No microscpio eletrnico de varredura as imagens so _______________.
O feixe de eltrons _______________ a superfcie da amostra gerando um sinal
para um monitor de TV.
9. So bons exemplos de estrutura mais bem visualizadas no microscpio de
transmisso: ______________________________________________________________
___________________________________________________________________________
10. So bons exemplos de estrutura mais bem visualizadas no microscpio de
varredura:__________________________________________________________________
___________________________________________________________________________