Métodos diagnósticos em parasitologia

Exame parasitológico de fezes (EPF)

Grande importância para o diagnóstico de parasitoses intestinais, causadas por helmintos e protozoários

EPF não é o nome de uma técnica, e sim do pedido para a realização de um exame de fezes em busca de parasitos

Grande desafio do diagnóstico na parasitologia é a baixa sensibilidade das técnicas quando não realizadas corretamente

Falta de conhecimento sobre a coleta da amostra, os fundamentos de conservação e da execução do método, levam frequentemente a resultados falso-negativos!!!

Exame parasitológico de fezes (EPF)

Outro erro indicação de anti-helmínticos sem solicitar EPF para verificar a real necessidade

O profissional responsável por escolher a técnica deve ter claramente delimitado o objetivo do exame

Pacientes assintomáticos técnica capaz de detectar o maior número possível de espécies

Existem técnicas preferenciais para a busca de determinadas estruturas

É fundamental que o médico indique a suspeita clínica e, se possível, a técnica desejada

Exame parasitológico de fezes (EPF)

Tem como objetivo diagnosticar os parasitos intestinais, por meio da pesquisa das diferentes formas parasitárias que são eliminadas nas fezes.

O exame macroscópico permite a verificação da consistência das fezes, do odor, da presença de elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes adultos ou partes deles.

O exame microscópico permite a visualização dos ovos ou larvas de helmintos, cistos, trofozoítos ou oocistos de protozoários. Pode ser quantitativo ou qualitativo.

Exame parasitológico de fezes (EPF)

A grande maioria dos métodos é apenas QUALITATIVO = apenas indica a presença do parasita ou não

Existem métodos QUANTITATIVOS (Kato-Katz) = se faz a contagem dos ovos nas fezes, permitindo, assim, avaliar a intensidade do parasitismo.

Métodos QUALI rotinaMétodos QUANTI pouco utilizados, pois a dose dos

medicamentos antiparasitária não leva em conta a carga parasitária e sim o peso corporal do paciente. Estudos epidemiológicos e/ou controle de cura

Coleta da amostra

Deve ser colhida sem contato com o vaso sanitário

Utilizar recipientes limpos, isentos de água (pode conter microorganismos de vida livre), urina (destrói a mobilidade e os trofozoitas) ou outro material que possa contaminar pinico

Jornais e outros tipos de papéis também devem ser evitados a fim de não contaminar

Transferir a amostra para o frasco coletor cedido pelo laboratório

Coleta da amostra

Identificar o frasco com letra legível, indicando nome do paciente, data e hora da coleta lápis (não borrar com o conservante)

Tempo de entrega do material depende da suspeita clínica Fezes diarreicas – Giardia 30 min – estrongiloidíase com

exame de larvas vivas imediatamente após a emissão das fezes

De preferência – coleta pela manhã no laboratório ou enviada rapidamente

Caso não seja possível enviar imediatamente o material será necessário conservar o material

Conservantes

MIF (mercúrio, iodo e formol) – mais popular

Formol 10% - proibição do mercúrioFormol tamponadoSAF (acetado de sódio, ácido

acético glacial, formol e água destilada) – bom para trofozoítos em fezes diarreicas

Embrulhar em papel e armazenar na geladeira (5-10ºC) ou isopor com gelo – até 48hs

Semanas

Conservantes

Colocar o conservante, a amostra, homogeneizar bem e colocar mais conservante

Quando são feitas várias coletas em dias alternados, elas podem ser misturadas no mesmo recipiente

Cuidados fundamentais

Usar luvasTrabalhar com calma, identificando

corretamenteUsar material descartável evita falso-

positivos

Escolha do método

Não existe um método capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitárias.

Alguns métodos são mais gerais, permitindo o diagnóstico de vários parasitos intestinais, outros são métodos específicos, indicados para um parasito em especial.

Métodos gerais método de Hoffman, Pons e Janer e o os métodos de centrifugação (MIFC, Ritchie e Coprotest).

Na maioria dos pedidos de EPF, a suspeita clínica não é relatada, e o exame é feito por um dos métodos gerais, acima citados.

Quando é solicitada a pesquisa de um parasito que exige a execução de um método específico método específico e método geral devem ser executados o EPF ficará mais completo, pois será feita a pesquisa dos vários parasitos intestinais e não apenas daquele solicitado.

Escolha do método

Execução de vários métodos com cada amostra fecal um método geral um específico para larvas de helmintos um específico para cistos de protozoários.

Procedimento é inviável - quantidade insuficiente de fezes, ou pelo elevado número de exames a serem realizados por dia

Interação médico-laboratório contribuiria para que o EPF fosse o mais exato possível.

Automação – ainda não é uma realidade na parasitologia

Testes imunológicos Testes moleculares

Escolha do método

Imunoenzimáticos - EIA ou ELISA Entamoeba histolytica/ dispar Giardia lamblia Cryptosporidium

Imunofluorescentes-IFAs Cyclospora Isospora

PCR detecção e subtipagem Cryptosporidium

Escolha do método

A fim de obter mais qualidade no EFP, devemos sempre ter em mente que

1. algumas espécies de parasitos só são evidenciadas por técnicas especiais;

2. um exame isolado, onde o resultado é negativo, não deve ser conclusivo, sendo recomendável a sua repetição com outra amostra;

3. a produção de cistos, ovos ou larvas não é uniforme ao longo do dia ou do ciclo do parasito.

Métodos

Exame de fezes direto a frescoTécnicas de concentração - Muitas vezes o número de

formas parasitárias eliminadas com as fezes é pequeno, havendo necessidade de recorrer a processos de enriquecimento para concentrá-las. Espontânea ou por centrifugação Flutuação ou sedimentação

Técnicas para buscas de larvas

Existem diversas técnicas semelhantes, baseadas no mesmo fundamento, com nome diferente

Um método será mais ou menos utilizado na rotina do EPF, quando, além de permitir o diagnóstico de vários parasitos intestinais, é também de fácil execução e pouco dispendioso.

Helmintos - Formas evolutivas eliminadas via anal

OVOS Ascaris lumbricoides Trichuris trichiura Enterobius

vermicularis Ancylostoma

duodenale Necator americanus Taenia solium Taenia saginata Hymenolepis nana Schistosoma mansoni

LARVAS Strongyloides

stercoralis

VERMES ADULTOS Ascaris lumbricoides Taenia sp. (proglotes) Enterobius

vermicularis

Protozoários - Formas evolutivas eliminadas via anal

CISTOS/TROFOZOÍTOS Giardia lamblia Entamoeba histolytica/E. dispar Entamoeba coli Endolimax nana Iodamoeba bütschlii Chilomastix mesnili Blastocystis hominis (apenas cisto)

Método direto

Procedimento simples

Permite visualizar trofozoítos vivos

Obtida diretamente da amostra fecal, sem conservante, pouco material (falso-negativo)

Métodos de concentração são melhores mais amostra, maior sensibilidade

Método direto

Recolhe-se uma porção bem pequena (cabeça do palito de fósforo) e coloca-se sobre a lâmina

Adiciona-se salinaHomogeiniza Coloca lamínulaAnálise em microscópio em 10 e 40X

Processos de concentração

Sedimentação espontânea: método de Hoffman, Pons e Janer, também conhecido como método de Lutz. Permite o encontro de ovos e larvas de helmintos e de cistos de protozoários;

Sedimentação por centrifugação: método de Blagg (também conhecido por método de MIFC), método de Ritchie, Coprotest. Usados para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozoários;

Flutuação espontânea: método de Willis. Indicado para a pesquisa de ovos leves (principalmente ancilostomídeos);

Centrífugo-flutuação: é o teste de Faust. Usado para a pesquisa de cistos e alguns oocistos de protozoários, permitindo, também, o encontro de ovos leves.

Concentração de larvas de helmintos por migração ativa, devido ao hidrotropismo e termotropismo positivos: método de Baermann-Moraes e método de Rugai. Indicados para a pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

Método de concentraçãoCistos, oocistos, ovos ou larvasProcedimento:

Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel (pode ser substituído por copo plástico descartável), com cerca de 5mL de água, e triturar bem com bastão de vidro (ou "palito de picolé").

Acrescentar mais 20mL de água. Filtrar a suspensão para um cálice cônico de 200 mL de

capacidade, por intermédio de tela metálica ou de náilon com cerca de 80 a 100 malhas por cm2, ou gaze cirúrgica dobrada em quatro; os detritos retidos são lavados com mais 20mL de água, agitando-se constantemente com o bastão de vidro, devendo o líquido da lavagem ser recolhido no mesmo cálice.

Completar o volume do cálice com água.

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

Deixar essa suspensão em repouso durante 2 a 24 horas

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

Existem duas técnicas para se colher o sedimento para exame: a. introduzir uma pipeta obliterada pelo dedo indicador até o

sedimento contido no fundo do cálice, retirar o dedo e deixar subir uma pequena porção do sedimento; recolocar o dedo e retirar a pipeta;

b. desprezar o liquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o sedimento e colher uma gota do mesmo (esse procedimento é melhor, pois a gota colhida é mais representativa do sedimento).

Colocar parte do sedimento numa lâmina com uma gota de lugol e fazer um esfregaço.

O uso de lamínulas é facultativo. Examinar com as objetivas de 10x e 40x. Deve-se examinar, no mínimo, duas lâminas de cada amostra.

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

Método mais utilizadoBaratoSensível para cistos de protozoários, ovos e larvas de

helmintosDesvantagem: demoradoCoprotest – formol 10% - facilita o procedimento –

paciente coleta já com o conservante e homogeiniza por 2 minutos – o laboratorista somente continua o procedimento anterior

Paratest – formol 5% com sistema de filtragem – eficiência reduzida devido a quantidade pequena de amostra

Centrífugo-sedimentação, Método de Ritchie, de Blagg ou “formol-éter”

Baseia-se na sedimentação forçada pela centrifugaçãoOvos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de

protozoáriosProcedimento:

Colher as fezes recém-emitidas em liquido conservador de MIF. Homogeneizar bem. Filtrar a suspensão de fezes em gaze dobrada em quatro ou em filtro

descartável, num copo plástico descartável. Transferir 1 a 2mL do filtrado para um tubo cônico de centrifugação,

com capacidade para 15mL Acrescentar 4 a 5mL de éter sulfúrico e agitar vigorosamente

(importante para desengordurar o material). Centrifugar por um minuto a 1.500rpm. Se formarão 4 camadas – no fundo está o sedimento com os

parasitos

Com o auxílio de um bastão, descolar a camada de detritos da parede do tubo.

Inverter o tubo para desprezar o liquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, até limpar a parede do mesmo, utilizando um bastão de vidro (ou palito de picolé) contendo algodão na extremidade.

Inverter o tubo em uma lâmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para colhê-lo e preparar as lâminas.

Colocar uma gota de lugol Cobrir com lamínula e examinar com as objetivas de

10 e 40X em “zig-zag”

Centrífugo-sedimentação, Método de Ritchie, de Blagg ou “formol-éter”

Método dos mais recomendadosRápidoFácil SensívelDesvantagem: necessita de centrífuga

Centrífugo-sedimentação, Método de Ritchie, de Blagg ou “formol-éter”

Centrífugo-flutuação ou Método de Faust

Indicado para pesquisa de cistos de protozoários; ovos leves de helmintos podem ser detectados algumas vezes

Procedimento Diluir 10g de fezes em 20mL de água filtrada. Homogeneizar bem. Filtrar através de gaze dobrada em quatro, num copo

plástico, e transferir para um tubo de centrífuga. Centrifugar por um minuto a 2.500rpm. Desprezar o líquido sobrenadante e ressuspender o

sedimento em água. Repetir as operações 4 e 5 mais duas ou três vezes, até que o

líquido sobrenadante fique claro.

Desprezar a água sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma solução de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18g/mL.

Centrifugar novamente por um minuto a 2.500rpm. Os cistos e alguns oocistos de protozoários e os ovos leves,

presentes na amostra fecal, estarão na película superficial. Recolher a película com alça de platina, colocar numa lâmina, acrescentar uma gota de lugol e cobrir com lamínula.

Examinar com as objetivas de 10x e 40 x.

Observação: O material deve ser examinado imediatamente, pois o contato com a solução de sulfato de zinco pode deformar as formas parasitárias, especialmente os cistos de protozoários.

Centrífugo-flutuação ou Método de Faust

Flutuação espontânea ou Método de Willis

Bom para pesquisa de ovos leves como de ancilostomídeos

Procedimento: Colocar 10g de fezes em um frasco Borrel (pode ser usado o

próprio frasco no qual as fezes foram enviadas). Diluir as mesmas em solução saturada de açúcar ou sal (NaCl).

Completar o volume até a borda do frasco. Colocar na boca do frasco uma lâmina, que deverá estar em

contato com o líquido. Deixar em repouso por cinco minutos. Findo esse tempo, retirar rapidamente a lâmina, voltando a

parte molhada para cima. Levar ao microscópio e examinar com objetiva de 1ox e 40x.

Método para demonstração de larvas de helminto

Avaliação de larvas de helmintosBaseado no hidrotropismo e termotropismo

das larvasNecessidade de fezes frescas e sem uso de

conservantesImportante redobrar os cuidados a fim de

evitar contaminação no laboratório.

Necessário ter preparado o aparelho de Baermann –suporte de madeira com orifícios para os funis que serão utilizados

Procedimento Utilizar 8 a 10g de fezes. Colocar numa gaze dobrada em quatro ou em uma peneira. Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro, contendo um

tubo de borracha conectado a extremidade inferior de sua haste. Obliterar o tubo de borracha com uma pinça de Hoffhan e adicionar, ao

funil, água aquecida (45°C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes.

Deixar uma hora em repouso. Findo esse tempo, colher 5 a 7mL da água, em um tubo de centrífuga,

abrindo-se a pinça. Centrifugar a 1.000rpm por um minuto. Colher o sedimento, sem desprezar o liquido sobrenadante e examinar ao

microscópio (10x). Caso se detecte a presença de larvas, essas deverão ser coradas com lugol e observadas com a objetiva de 40x, para identificação

Método de Baermann-Moraes

Método de Baermann-Moraes

Método de Rugai

Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvê-lo em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena "trouxa".

Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num cálice de sedimentação, contendo água aquecida (45°C), em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes.

Deixar uma hora em repouso.Retirar cuidadosamente a trouxaColher o sedimento no fundo do cálice, com a ajuda de uma

pipeta.Examinar no microscópio, com a objetiva de 10x.Corar as larvas com o lugol e observá-las com o maior

aumento, para identificação.

Método de Rugai

Método quantitativo – Kato-Katz

Preparar uma solução de verde malaquita (essa solução tem a finalidade de conservar as fezes e clarificar as formas parasitárias), de acordo com a seguinte fórmula: Glicerina 100mL, Água destilada 100mL, Verde-malaquita a 3% 1 mL

Cortar papel celofane semipermeável em pedaços de 24mm por 30mm e deixá-los mergulhados na solução de verde malaquita por pelo menos 24 horas.

Colocar, sobre um papel higiênico, uma porção da amostra de fezes frescas sem conservantes.

Comprimir as fezes com um pedaço de tela meiálica (marca IBRAS - São Bemardo do Campo - no 120 – fios, urdume e trama: 0,091nm) ou similar de náilon. Nesta malha passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles.

Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com o auxílio de um palito, para o orificio (6mm de diâmetro) de um cartão retangular de plástico, colocado sobre uma lâmina de microscopia.

Método quantitativo – Kato-Katz

Após encher completamente o orificio, retirar o cartão, cuidadosamente, deixando sobre a lâmina de vidro.

Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane embebida na solução de verde malaquita, inverter a lâmina, sobre uma folha de papel absorvente e comprimi-la.

Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscópio, contando todos os ovos presentes na preparação.

O número de ovos encontrados no esfregaço fecal, multiplicado por 23, corresponderá ao número de ovos por grama de fezes (OPG).

Situação atual do diagnóstico parasitológico

Médico – às vezes pouco capacitado na indicação do exame, na orientação à coleta de material e na interpretação dos resultados. Pouca confiança no resultado do laboratório. Tratamento prévio.

Paciente – Coleta incorreta, atribui pouca importância à infecção parasitária, questões culturais. Auto-medicação.

Laboratório – exame trabalhoso, pouco padronizado, não automatizado, variabilidade intra e interobservadores, profissional pouco valorizado, qualificação profissional insuficiente, pouco compromisso/envolvimento, sobrecarga, métodos adaptados (não originais)

Informações Importantes na Solicitação

Dados sócio-demográficos (sexo,idade, escolaridade, ocupação, procedência)

Indicação clínica: sintomatologia, investigação diagnóstica, acompanhamento do tratamento, controle de cura, tratamento prévio ao diagnóstico, rotina pré-natal/ pré-operatória.

Questionamentos Importantes na entrega do material

Ingestão prévia de medicação, compostos químicos na semana anterior ao exame

Forma de coleta, tempo de coleta, preservação do material, intercorrências na coleta.

Sensibilidade X Especificidade

SENSIBILIDADEUm teste é sensível quando seu resultado é positivo

em indivíduos doentes. Pouco falso-negativo

ESPECIFICIDADEUm teste é específico quando seu resultado é negativo

em indivíduos não doentes. Pouco falso-positivo

EPF - BAIXA SENSIBILIDADE (muitos falsos negativos) e ALTA ESPECIFICIDADE (poucos falsos positivos)

Causas de negatividade no exame parasitológico

EVITÁVEIS – PROFISSIONAIS TreinamentoEscolha do método (sensibilidade)Inadequação do métodoLeitura parcial da lâminaSobrecarga de trabalho

INEVITÁVEIS - BIOLÓGICASA) Protozoários - períodos de

negatividadeB) Helmintos

infecção unissexual por espécimes machos fêmeas sexualmente imaturas após eliminação do verme adulto carga parasitária leve irregularidade na postura/eliminação

Causas de negatividade no exame parasitológico

Controle de qualidade

Treinamento dos profissionaisControle externo de qualidade:

CONTROL- LAB – SBPC/ML PNCQ – SBAC INTERLABORATORIAIS INTERNACIONAIS: CAP

Controle interno de qualidade Amostra cega – amostra já processada no dia Pool de amostras positivas ( COCOTECA® ) Amostras conservadas com parasita único Lâminas com coloração permanente Lâminas da rotina.

Laudo final

Reportar todos os parasitas encontrados Sempre com os nomes científicos: grifados, ou em itálico, ou

em negrito Colocar o estágio de diagnóstico identificado

Exemplo:Foram encontrados:

Ovos de Hymenolepis nana Ovos de Hymenolepis nana Ovos de Hymenolepis nana

Larvas de Strongyloides stercoralis Larvas de Strongyloides stercoralis Larvas de Strongyloides stercoralis

Laudo final

Para ausência de parasitos, reportar:Exemplo “Negativo - Não foram visualizadas formas

diagnósticas de parasitas”Ou “Negativo - Não foram visualizadas formas

diagnósticas de parasitas, na amostra enviada”

Laudo final

Reportar o(s) método(s) utilizado(s).

Reportar número de amostras analisadas:Ex. “resultado positivo ou negativo e na Obs. o

nº de amostras”

Reportar parasitas que não foram diferenciados

Ex. cistos de Entamoeba histolytica /dispar