Avaliação Laboratorial da Hemostasia
Silmara Montalvão
Farmacêutica Bioquímica
Laboratório de Hemostasia - Hemocentro Unicamp
Sumário
• Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica
• Principais exames na investigação laboratorial e sua interpretação:
- Limitações e considerações dos testes clássicos da avaliação laboratorial da hemostasia
• Laboratório de hemostasia x Hemofilia
Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica
Fontes de erros mais comuns:
1. Não utilizar citrato de sódio como anticoagulante
2. Tubos utilizado em sistema a vácuo incompletos
3. Inadequada homogeneização
4. Estocagem de sangue total em gelo ou ambiente refrigerado
Amostra ideal para teste de hemostasia
1. Coleta não traumática com mínimo tempo de torniquete
2. Tubos com correta proporção de anticoagulante ( > 90%)
3. Transporte em temperatura ambiente
4. Tempo máximo de uma hora entre coleta e processamento da amostra
Causas de rejeição de amostra
1. Amostra não coletada com citrato de sódio como anticoagulante
2. Amostras que contenham coágulo
3. Amostras que não apresentam a proporção de 9:1 (sangue/anticoagulante)
4. Amostras com hematócrito > 55%
5. Amostras hemolizadas
Steve K, Quality in laboratory Hemostasis 2009
Grupo I
• Avaliação do paciente com
história de sangramento
• Avaliação do paciente com
história de trombose
História Clínica
Grupo II
• Avaliação do paciente
assintomático pré
procedimentos (triagem)
• Avaliação do paciente
assintomático após alteração
dos exames de triagem
Modelo Clássico da Investigação Laboratorial
Hemostasia Primária
TS e PFA
Teste de função
plaquetária
Quantidade e função do
FVW
Hemostasia Secundária
Testes de triagem: TP,
TTPA, TT
Fatores da Coagulação
Fibinólise
Dímero D
Lise de euglobulina
Tromboelatometria
TTPa normal e TP prolongado
Repetir com mistura
50:50
Sem correção com mistura
Inibidor de FVII (raro)
Deficiência isolada de fator VII hereditária Deficiência de múltiplos fatores: hepatopatia, uso de Varfarina, deficiência de vitamina K (Fator VII tem a meia-vida mais curta)
Correção com mistura
Teste de triagem
TP normal e TTPa prolongado
Repetir com mistura
50:50
Sem correção do TTPa
Pesquisar inibidores: Inespecíficos (ac. Lúpico) Específicos (FVIII, FIX, FV)
Deficiência de fatores da via intrínseca FVIII, FIX, FXII, FXI, PK, HMWK Deficiência de fator de von Willebrand Pesquisa de inibidor especifico para FVIII
Correção do TTPa
Teste de triagem
Considerações: TTPA incubado a 37ºC/ 2h em pacientes com inibidor adquirido
KICHEN S, WFH 2010
Coagulopatia adquiridas
TP e TTPa normais Contagem de plaquetas normal Paciente com sangramento
Teste de triagem
Deficiência de F XIII Hiperfibrinólise Trombopatia
Ferramentas disponíveis para a investigação ?
Hemostasia Primária
TS e PFA
Teste de função
plaquetária
Quantidade e função do
FVW
Fibinólise
Dímero D
Lise de euglobulina
Tromboelatometria
Hemostasia Secundária
Testes de triagem: TP,
TTPA, TT
Fatores da Coagulação
Doença de von Willebrand
Procedimentos Laboratoriais para o diagnóstico da DvW
•Tempo de sangramento (TS) ou PFA-100 *Dade
•Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)
•Contagem de plaqueta
Testes de triagem
•Atividade de fator VIII (F VIII)
•Antígeno de fator de von Willebrand (FvW:Ag)
•Atividade de co-fator de Ristocetina (FvW: Rco)
•Capacidade de ligação do FvW ao colágeno (FvW:CB)
Testes confirmatórios
• Aglutinação plaquetária induzida pela ristocetina ( RIPA)
• Padrão Multimérico do FvW
•Capacidade de ligação ao FVIII (FvW: FVIIIB) Testes especiais
Avaliação dos distúrbios do FvW
Teste para avaliação da atividade de FVW X Variabilidade de técnicas atualmente disponíveis: Utilizar ou não a ristocetina?
Muitos trabalhos mostram alta correlação entre os resultados entre FVW:Ag por técnica de ELISA e Imunotubidimertria, bem como
alta concordância clínica.
KITCHEN. S, Quality in Laboratory Hemostasis and thrombosis, 2009.
Atividade
Proteína
F V W :A g
M é d ia /D P
U/d
L
E L IS A G r ifo ls IL
-5 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
p = 0 .9 5
Avaliação dos distúrbios do FvW
Montalvão SAL, Hemo 2012
Ferramentas disponíveis para a investigação ?
Hemostasia Primária
TS e PFA
Teste de função
plaquetária
Quantidade e função do
FVW
Fibinólise
Dímero D
Lise de euglobulina
Tromboelatometria
Hemostasia Secundária
Testes de triagem: TP,
TTPA, TT
Fatores da Coagulação
Avaliação dos distúrbios da fibrinólise
Há poucas evidências associado alterações da fibrinólise com quadros hemorrágicos ou trombóticos.
• CIVD grave • Coagulopatia pós-transplante hepático • leucemia promielocítica
D dímero
Tromboelastometria (tPA)
Teste de euglobulina
(baixa sensibilidade)
Avaliação Convencional x Global
Método tradicional da hemostasia compartimentaliza um processo que na prática ocorre simultaneamente, dependendo de plaquetas, endotélio, fatores da coagulação e até mesmo de outros elementos como hemácias e leucócitos Medem a Cinética da formação do coágulo e podem prover a exatidão do estado hemostático in vivo:
São mais efetivos para :
Avaliar a geração de trombina Capacidade hemostática individual Polimerização da fibrina em sangue total Estrutura e estabilidade do coágulo
MEERA CHITLUR, Thrombosis Research. 2012
1. Diagnóstico
2. Quantificação de inibidor
3. Avaliação da Farmacocinética
3 questões laboratoriais que interferem no diagnóstico e tratamento das hemofilias
Favaloro Ej, Soltani S.McDonald J. Potencial Laboratory Misdiagnosis of Hemophilia and von Willebrand Disorder Owing to Cold Activation of Blood Samples for Testing. Am J Clin Pathol
2004; 122: 686-692.
Amostras para o teste de FVIII e FvW em tubo fechado
e conservado entre 18º e 24º devem ser centrifugados
e processados em 4 horas. Estocagem de 2º a 4º pode resultar em baixa atividade
de FVIII e FvW.
FVIII:C
1. Diagnóstico - Condição pré-analítica
• 1/3 pacientes com HA leve causado por mutação missense tem discrepância de resultados entre o ensaio cromogênico e o de coagulação de uma etapa • Normalmente a atividade do ensaio crormogênico é menor em relação ao de uma etapa •17 mutações até agora foram descritas com esta informação de discrepância • A discrepância pode ser parcialmente explicada pelo aumento da instabilidade da molécula que sofreu mutação • A diferença significativa entre os métodos é que o tempo de incubação necessário para o teste cromogênico é maior
1. Diagnóstico – Método
Bethesda Teste Padrão-Ouro: Bethesta Clássico (Kasper.C 1975) e Bethesda Modificado (Verbruggen 1995)-ISTH (2001)
Resultados do método Bethesda modificado apresenta menor CV% quando comparado ao Bethesda Clássico, sendo mais fidedignos em resultados de baixo título de inibidor ( 0 a 3 UB-mL)
2. Quantificação de inibidor
Montalvão SA, dado não publicado, 2013
2. Quantificação de inibidor A presença de FVIII na amostra do paciente viola o princípio do teste de Bethesda, onde a amostra do paciente e o controle devem ser equivalentes antes da incubação da amostra.
3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII e FIX na prática
clínica
Parâmetros farmacocinéticos (PK) pode ser útil para:
(1) Profilaxia: calcular a dose mínima necessária para manter o pacientes > 1 UI/dL de fator
(2) Protocolo de ITI: critério de avaliação de sucesso
(1) Profilaxia: Dose mínima x Farmacocinética
Profilaxia: o aumento do nível mínimo de fator VIII e IX > 1 UI/dL, com o objetivo de transformar um paciente com hemofilia A ou B grave para moderado, melhorando a condição clínica do paciente
Dose escalonada x Uso de parâmetros farmacocinéticos:
Vantagens da utilização de PK Considera o padrão de sangramento individual do paciente, ou seja, o uso racional do concentrado de fator Com a dose ajustada corretamente o paciente apresenta menor risco de sangramento Desvantagens da utilização de PK Disponibilidade da apresentação dos frascos Quantidade de amostras requeridas (pediátricos)
3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII e FIX na prática
clínica
O sucesso da ITI é considerado levando-se em conta quatro parâmetros
• Título de inibidor negativo (< 0,6 UB/mL)
• Teste normal de recuperação in vivo (IVR) de FVIII:C (> 66%)
• Vida-média de FVIII normal (> 6 horas após 72h com ausência de fator exógeno)
• Ausência de resposta anamnésica em futura reexposição do fator
DI MICHELE et. al , Haemophilia2007
(2) Avaliação do sucesso de ITI: Farmacocinética
3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII na prática clínica
Amostras necessárias para avaliação da farmacocinética
Parâmetros da
farmacocinética
Método
convencional
ISTH (2001)
Método
utilizado no
Brasil
MS (2011)
Método em
avaliação
ISTH (2012)
Amostragem 8 6 5
Teste de
recuperação in
vivo
15 minutos 15 minutos 15 minutos
30 minutos 30 minutos 30 minutos
3 horas 1 hora 4 horas
Teste de vida -
média
6 horas 3 horas 24 horas
9 horas 6 horas 48 horas
24 horas 24 horas
28 horas
32 horas
Conclusão
A condição pré-analítica deve ser observada no momento da análise, pois 70% dos casos de erros no laboratório de hemostasia acontecem nesta etapa
Embora os principais testes que avaliam a hemostasia no modelo convencional esteja bem padronizados. Deve-se considerar as suas limitações para uma adequada interpretação dos resultados
A utilização dos parâmetros da farmacocinética do FVIII e FIX na pratica clinica são relevantes, sobreduto para o seguimento da profilaxia e na avaliação de sucesso do protocolo de ITI
Referências
1. FAVALORO, E.J. Diagnosis and classification of von Willebrand disease: a review of the differential utility of various functional von Willebrand factor assays. Blood Coagul. Fibrinolysis, London, v. 22, n. 7, p. 553-564, 2011 2. HAY, C. R. et al. The diagnosis and management of factor VIII and IX inhibitors: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization. Br. j. haematol., Oxford, v. 111, n. 1, p. 78-90, 2006 3. KITCHEN, S. ; MCCRAW, A.; ECHENAGUCIA, M. Diagnosis of hemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual. 2. ed. Montreal: WFH, 2010. 4. BRASIL. Ministerio da Saude. Manual de diagnóstico e tratamento da doença de von Willebrand. Brasilia, Ministerio da Saude, 2006. 5. BRASIL. Ministerio da Saude. Hemofilia congênita e inibidor, manual de diagnóstico e tratamento de eventos hemorrágicos. Brasilia: Ministerio da Saude, 2009 6. VERBRUGGEN, B. et al. The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors: improved specificity and reliability. Thrombosis and haemostasis, Sttutgart, v. 73, n. 2, p. 247-251, 1995
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