Avaliação Quantitativa da Esteatose Hepática

Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda

Trabalho apresentado à Academia Nacional de Medicina para concorrer a membro titular, secção de Ciência Aplicada à Medicina, cadeira número 82, patrono AANNTTOONNIIOO DDIIAASS DDEE BBAARRRROOSS, vaga pela emerência da Acadêmica LLÉÉAA FFEERRRREEIIRRAA CCAAMMIILLLLOO--CCOOUURRAA

Rio de Janeiro, Dezembro de 2010

Avaliação Quantitativa da Esteatose Hepática

Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda

Trabalho apresentado à Academia Nacional de Medicina para concorrer a membro titular, secção de Ciência Aplicada à Medicina, cadeira número 82, patrono AANNTTOONNIIOO DDIIAASS DDEE BBAARRRROOSS, vaga pela emerência da Acadêmica LLÉÉAA FFEERRRREEIIRRAA CCAAMMIILLLLOO--CCOOUURRAA

Rio de Janeiro, Dezembro de 2010

Dedicatória

À filhas:

Maria Elisa (“minha designer”),

Maria Emília (“minha advogada”

e a netinha Maria Eduarda, “minha paixão”)

e Maria Elena (“minha jornalista”),

À minha esposa querida

Marcia Águila (“minha companheira”).

Aos alunos:

(“meus motivos para nunca esmorecer”).

Nesses anos,

vocês todos deram têmpera ao que sou

como pai, esposo,

médico,

professor

e cientista.

Agradecimentos

Este trabalho não seria realizado desta forma sem a ajuda de muitas pessoas.

Destaco a participação da nutricionista Mariana Catta-Preta Caiado Pereira,

que introduziu a técnica de quantificação de triglicérides hepáticos e a coloração

pelo Oil Red O no laboratório que coordeno, auxiliada pelo nutricionista Julio

César Fraulob Aquino e o biólogo Leonardo de Souza Mendonça, que

procederam à análise de imagem.

SUMÁRIO

Página

INTRODUÇÃO 1

Resistência à insulina 3

Alterações hepáticas na resistência à insulina 8

Esteatose hepática 16

Biópsia hepática e métodos quantitativos 16

Objetivos 19

MATERIAL E MÉTODOS 20

Modelo animal 20

Análise do fígado 22

Determinação de triglicérides hepáticos 22

Inclusão em paraplast e coloração com H-E 23

Inclusão em Tissue Tek e coloração com Oil red O 23

Avaliação da esteatose hepática por contagem de pontos 25

Avaliação da esteatose hepática por análise de imagem 27

Análise dos dados 29

RESULTADOS 30

Triglicérides hepáticos 30

Material preparado para observação com H-E 33

Material preparado para observação com Oil Red O 34

Regressões lineares simples 41

DISCUSSÃO 44

CONCLUSÃO 49

Literatura citada 50

Lista de Tabelas

Página

Tabela 1 – Características químicas das dietas experimentais, seguindo recomendação da AIN-93M (NL, dieta normolipídica, HL, dieta hiperlipídica).

21

Tabela 2 - Resultados da densidade de esteatose hepática por dois métodos (análise de imagem [AI] vs. Contagem de pontos [CP]) e com duas colorações (oil red-O [ORO] vs. H-E) em animais submetidos a dois regimes alimentares (dieta normolipídica [NL] vs. Dieta hiperlipídica [HL]). NS é não significativo (P>0,05).

36

Tabela 3 – Coeficientes de correlação de Pearson (R) entre os valores dos triglicérides hepáticos e a densidade de volume de esteatose hepática avaliada por diferentes métodos: análise de imagem (AI), contagem de pontos (CP), e diferentes colorações: oil red-O (ORO) e H-E. Abreviações: NS, não significativo (P>0,05); P, probabilidade.

43

Lista de Figuras

Página

Figura 1 – Fotomicrografia do tecido hepático corado pelo H-E com o sistema-teste de 36 pontos sobreposto.

26

Figura 2 – Execução da técnica de “análise de imagens” para a avaliação da esteatose hepática. Em (a) observa-se a fotomicrografia do tecido hepático colorado com ORO já incorporada ao programa Image Pro Plus (em vermelho veem-se os vesículas de gordura; em (b) foi feita a segmentação da imagem em puro “preto-e-branco” e se atribuiu a cor branca às vesículas de gordura e a cor preta ao restante do tecido hepático.

28

Figura 3 – Gráfico em barras do teor de triglicérides hepáticos nos camundongos alimentados com dois regimes alimentares diferentes: normolipídico e hiperlipídico.

31

Figura 4 – Fotomicrografias do tecido hepático (mesmo aumento) preparado com inclusão em parafina e coloração pela H-E (a, b), e seccionado em criostato e corado com ORO (c, d). Os animais alimentados com dieta normolipídica são (a) e (c), enquanto (b) e (d) representam os animais alimentados com dieta hiperlipídica.

32

Figura 5 – Diferenças na densidade de volume da esteatose hepática comparando os grupos alimentados com dieta hiperlipídica e normolipídica, avaliados em lâminas coradas pela hematoxilina e eosina e quantificados por contagem de pontos.

37

Figura 6 - Diferenças na densidade de volume da esteatose hepática comparando os grupos alimentados com dieta hiperlipídica e normolipídica, avaliados em lâminas coradas pelo “oil red O” e quantificados por contagem de pontos.

38

Figura 7 - As diferenças na densidade de volume da esteatose hepática obtidas pelas técnicas de CP e AI nos animais alimentados com dieta normolipídica não foram significativas (todas as colorações juntas).

39

Figura 8 - As diferenças na densidade de volume da esteatose hepática obtidas pelas técnicas de CP e AI nos animais alimentados com dieta hiperlipídica não foram significativas (todas as colorações juntas).

40

Figura 9 – Regressões lineares simples da densidade de volume da esteatose hepática (eixo Y) e os níveis de triglicérides hepáticos (eixo X). Cada reta representa a análise dos dados obtidos por uma técnica de coloração ou método de avaliação quantitativo: “oil red O” (ORO), hematoxilina e eosina (H-E), análise de imagem (AI), contagem de pontos (CP). Como indicado na Tabela 3 não há diferença significativa comparando as diferentes inclinações (slopes). Entretanto o coeficiente de correlação de Pearson foi maior com ORO AI (R= 0,95) do que com ORO CP (R= 0,88) e H-E CP (R= 0,82).

42

RESUMO

AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA ESTEATOSE HEPÁTICA. Trabalho apresentado à Academia Nacional de Medicina para concorrer a vaga de membro titular, secção de Ciência Aplicada à Medicina, cadeira número 82, patrono AANNTTOONNIIOO DDIIAASS DDEE

BBAARRRROOSS.. RRIIOO DDEE JJAANNEEIIRROO,, RRJJ,, 22001100..

Neste estudo dois grupos de dez camundongos C57BL/6 machos com três meses de idade foram usados (n=10 para cada grupo). Um grupo foi alimentado com ração padrão para roedores contendo 10% de lipídios (dieta normolipídica, NL) de acordo com a AIN93M. Outro grupo foi alimentado com ração contendo 60% de lipídios (dieta hiperlipídica, HL), que é um modelo já testado em nosso laboratório para induzir a esteatose hepática. Ao final das 16 semanas de experimentação os fígados foram rapidamente retirados e preparados para as diferentes técnicas. Diversos fragmentos do fígado de cada animal foram congelados a -80°C para posterior análise bioquímica. Alguns fragmentos do fígado de cada animal foram fixados e incluídos em Paraplast plus, seccionado com 5 μm de espessura e corado com H-E. Outros fragmentos foram incluídos em Tissue-Tek, congelados rapidamente, seccionados com 10 µm de espessura em criostato e corados com solução de Oil Red-O (ORO). A densidade de volume da esteatose hepática (Vv[esteatose]) foi estimada por contagem de pontos (CP) e por análise de imagem (AI). O conteúdo hepático de triglicérides foi significativamente aumentado no grupo de animais alimentados com dieta hiperlipídica (+104%, P=0,0004) do que no grupo alimentado com dieta normolipídica. Usando contagem de pontos (CP), com parafina e H-E a Vv[esteatose] foi 4,8 ± 0,7 % no grupo normolipídico e 33,5 ± 2,2 % no grupo hiperlipídico (+ 600%, P<0,0001). Usando CP em corte congelado e ORO, Vv[esteatose] foi 4,2 ± 0,6 % no grupo normolipídico e 22,4 ± 1,0 % no grupo hiperlipídico (+ 433%, P<0,0001). Usando AI em corte congelado e ORO obteve-se 3,9 ± 1,1% no grupo normolipídico e 24,7 ± 0,4 % no grupo hiperlipídico (+533%, P<0,0001). Comparando as duas técnicas de avaliação por CP (ORO e H-E), vemos que com a técnica H-E houve superestimação de 14,3 % da densidade de volume da esteatose no grupo normolipídico e superestimação de 50,0% no grupo hiperlipídico em comparação com a técnica CP ORO. Comparando as duas técnicas de avaliação, CP e AI com coloração ORO, vemos que com a técnica CP houve superestimação de 7,7% da densidade de volume da esteatose no grupo normolipídico e subestimação de 9,3% no grupo hiperlipídico em comparação com a técnica AI, mas estas diferenças não foram significativas. Em conclusão, a mensuração da esteatose hepática foi possível com todas as técnicas, mas resultados mais acurados e correlacionados com a medida de triglicérides hepáticos são obtidos usando coloração específica para gordura, não importando muito se a análise será feita por contagem de pontos ou análise de imagem.

ABSTRACT

QUANTITATIVE EVALUATION OF THE LIVER STEATOSIS. Work submitted to the National Academy of Medicine to apply for the post of member, Section of Science Applied to Medicine, seat number 82, Patron ANTONIO DIAS DE BARROS. RIO DE JANEIRO, RJ, 2010.

Two groups of ten C57BL/6 mice with three months of age were used (n = 10 for each group). One group was fed standard rodent chow containing 10% fat (normal fat diet, NL) according to AIN93M. Another group was fed a diet containing 60% lipids (high fat diet, HL), which is a model already tested in our laboratory to induce hepatic steatosis. At the end of 16 weeks of experiment, the livers were quickly removed and prepared for the different techniques. Several fragments of the liver of each animal were frozen at -80° C for later biochemical analysis. Some fragments of the liver of each animal were fixed and embedded in Paraplast plus, sectioned at 5 µm thick and stained with H-E. Other fragments were embedded in Tissue-Tek, frozen quickly, cut with a 10 µm thick in a cryostat and stained with a solution of Oil Red-O (ORO). The volume density of steatosis (Vv[steatosis]) was estimated by point counting (PC) and by image analysis (IA). The hepatic triglyceride content was significantly increased in the group of animals fed a high fat diet (+104%, P=0.0004) than in the group fed normal fat diet. Using PC with paraffin and H-E the Vv[steatosis] was 4.8 ± 0.7% in normal fat group and 33.5 ± 2.2% in the high fat group (+600%, P<0.0001). Using frozen sections and ORO, Vv[steatosis] estimated by PC was 4.2 ± 0.6% in normal fat group and 22.4 ± 1.0% in the high fat group (+433%, P<0.0001). With ORO and image analysis, we obtained 3.9 ± 1.1% in normal fat group and 24.7 ± 0.4% in the high fat group (+533%, P<0.0001). Comparing the two assessment techniques for point counting (ORO and H-E), we see that H-E technique overestimated the Vv[steatosis] by 14.3% in the normal fat group and overestimated the Vv[steatosis] by 50.0% in the high fat group in comparison to ORO plus PC technique. Comparing the two assessment techniques, IA and PC with ORO staining, we see that PC overestimated Vv[steatosis] by 7.7% in the normal fat group and underestimated by 9.3% in the high fat group in comparison to IA technique, but these differences were not significant. In conclusion, the measurement of hepatic steatosis was possible with all techniques, but more accurate results and correlation with the levels of liver triglycerides were obtained by using specific staining for fat. No matter if the analysis will be done by point counting or image analysis.

-1-

Introdução

As maiores disponibilidades de alimentos de alta densidade energética, assim co-

mo hábitos de vida sedentários, introduziram uma nova ameaça à sobrevivência

humana: a obesidade e suas comorbidades. Entre essas, destacam-se a obesidade

centrípeta e a resistência à insulina (Grundy, 2008). O armazenamento anormal de

gordura na região abdominal encontra-se diretamente relacionado ao acúmulo

ectópico de gordura em órgãos chave do metabolismo, tais como o fígado e o

pâncreas. A resistência à insulina age em sinergismo com o excesso de tecido adi-

poso no desencadeamento da desequilíbrio do eixo adipoinsular, predispondo ao

desenvolvimento de outros distúrbios metabólicos, o que caracteriza a síndrome

metabólica, cuja prevalência é crescente em todo o mundo (Eckel et al., 2005;

Despres e Lemieux, 2006).

A síndrome metabólica inclui aumento da circunferência abdominal, hipertensão

arterial sistêmica, dislipidemia e resistência à insulina ou intolerância à glicose ou

diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (Eckel et al., 2005). A comunidade científica vem

-2-

buscando formas de tratamento dos seus diversos componentes visando melhorar

a qualidade de vida dos seus portadores e reduzir o risco de mortalidade inerente

à síndrome metabólica (Carpentier et al., 2006; Pershadsingh, 2006).

A doença não alcoólica do fígado gorduroso (nonalcoholic fatty liver disease ou

NAFLD) é considerada hoje o componente hepático da síndrome metabólica. Ela

engloba um aumento do ‘input’ de ácidos graxos livres concomitantemente a um

decréscimo da beta-oxidação, levando a maior suscetibilidade à fibrose hepática

(Marchesini et al., 2001). Recentemente, a doença não alcoólica do pâncreas gor-

duroso (NAFPD) também foi descrita e a lipotoxicidade nesse órgão prejudica a

secreção de insulina estimulada por glicose, provocando disfunção das células be-

ta e progressão mais rápida para o DM2 (Pitt, 2007). A NAFLD e a NAFPD exibem a

resistência à insulina como rota comum. Essa observação enfatiza a urgência para

encontrar estratégias não somente para o controle da obesidade como também

para aumentar a sensibilidade à insulina e consequentemente, melhorar a função

das células beta-pancreáticas e dos hepatócitos (Duvnjak et al., 2007).

A perda ponderal é benéfica no tratamento da síndrome metabólica. Esta se

fundamenta numa ingestão energética limitada, caracterizada pela diminuição do

aporte lipídico e menor metabolização de nutrientes, tendo como pilar a mudança

de estilo de vida (McNeel e Mersmann, 2005; Vasselli et al., 2005). Camundongos

da linhagem C57BL/6 alimentados com dietas hiperlipídicas, que mimetizam a die-

ta das populações ocidentais, manifestam antecipadamente e de forma intensa os

-3-

sintomas da síndrome metabólica (Black et al., 1998; Collins et al., 2004) e, por isso,

representam um bom modelo para o estudo da síndrome metabólica humana

(Fraulob et al., 2010).

Resistência à insulina

A insulina é o maior hormônio anabólico, cuja ação é importante para o desenvol-

vimento e crescimento dos tecidos e homeostase da glicose. Por definição, resis-

tência à insulina é um estado de reduzida resposta a níveis normais de insulina. Ela

aparece como um fator central e determinante da associação da obesidade com o

DM2, configurando a síndrome metabólica (Reaven, 1988). A insulina é secretada

pelas células beta-pancreáticas em resposta ao aumento dos níveis de glicose e

aminoácidos circulantes, o que ocorre principalmente no período pós-prandial

(Chen et al., 1987). A insulina normalmente controla a homeostase da glicose em

diferentes sítios, reduzindo a produção hepática de glicose (promovendo menores

taxas de glicogenólise e gliconeogênese), estimulando a captação de glicose nos

tecidos periféricos, aumentando a síntese hepática de lipídios e suprimindo a libe-

ração de ácidos graxos do tecido adiposo (DeFronzo, 1988; Shulman, 2000). Defei-

tos na secreção e ação da insulina conduzem a múltiplas alterações metabólicas

tais como hiperglicemia, aumento da produção hepática de glicose e dislipidemia

(Muoio e Newgard, 2008).

-4-

A literatura documenta que a resistência à insulina pode ter início anos antes do

diagnóstico de DM2 (Harris e Eastman, 2000). A hipertrofia das ilhotas e hiperse-

creção de insulina surge na tentativa de compensar o estado de resistência e pro-

mover valores normais de glicemia num primeiro momento. Entretanto, esse tra-

balho exaustivo promove deterioração progressiva das ilhotas de maneira que

50% da função das ilhotas pancreáticas já estão perdidas no momento do diag-

nóstico de hiperglicemia, quando a intolerância oral à glicose já está instalada

(Taylor, 1999; Yoon et al., 2003).

Atualmente há um conceito lipocêntrico da resistência à insulina (Robertson,

2009). Nesse contexto, o aumento dos depósitos de tecido adiposo e das taxas

lipólise, somados ao sobrepeso, fazem com que os ácidos graxos livres circulantes

sejam desviados e armazenados em órgãos sensíveis à insulina, tais como o fígado,

o pâncreas e o músculo esquelético (Unger e Orci, 2000). Esse acúmulo ectópico

de lipídios está envolvido na gênese da resistência à insulina e no comprometi-

mento da função das células beta-pancreáticas, efeito conhecido como lipotoxici-

dade (Savage et al., 2005).

Foi observado que os ácidos graxos competem com a glicose como substrato

para oxidação tanto no músculo cardíaco como no músculo liso de roedores, o

que levou à especulação de que a oxidação de ácidos graxos livres é responsável

pela resistência à insulina nos casos de sobrepeso (Randle et al., 1963). Contudo,

recentemente, estudos demonstraram que níveis elevados de ácidos graxos livres

-5-

circulantes reduzem os níveis intramusculares de glicose-6-fosfato. Essa observa-

ção sugere que o aumento das concentrações plasmáticas de ácidos graxos livres

produz resistência à insulina por meio da inibição do transporte de glicose ou da

atividade da hexoquinase II, sendo a redução da produção de glicogênio muscular

e da oxidação da glicose apenas eventos secundários. Devido ao fato de que a gli-

cose intracelular é um metabólito intermediário entre o transporte da glicose e a

ação da hexoquinase II, a redução da glicose intracelular prediz um defeito no

transporte da glicose, ao passo que o acúmulo de glicose intracelular sugere um

defeito da enzima hexoquinase II. Estudos in vivo revelaram em humanos que, na

resistência à insulina induzida por ácidos graxos, ocorre uma redução das concen-

trações intracelulares de glicose na presença de níveis elevados de ácidos graxos

livres na circulação, confirmando um defeito no transporte da glicose (Roden et al.,

1996; Dresner et al., 1999).

Em condições fisiológicas normais, a insulina estimula a translocação do trans-

portador de glicose (GLUT) a partir de um reservatório intracelular para a mem-

brana plasmática. A translocação do GLUT é um processo complexo que envolve a

liberação do GLUT do seu reservatório intracelular, trânsito pelo meio intracelular,

reconhecimento e fusão com a membrana plasmática. Por conseguinte, existem

vários passos que podem estar comprometidos nos estados de resistência à insuli-

na (Petersen e Shulman, 2006b; Sesti, 2006).

-6-

A insulina desempenha suas ações nos órgãos alvos por meio da fosforilação de

um receptor transmembrana, o receptor de insulina (RI). A ligação da insulina à

subunidade alfa (extracelular) do RI ativa resíduos de tirosina presentes na subuni-

dade beta (transmembrana) do mesmo, conduzindo à auto-fosforilação do recep-

tor. Isso resulta na ativação da tirosino-quinase intrínseca, a qual catalisa a fosfori-

lação de tirosinas presentes em substratos do receptor de insulina (SRI), tais como

o SRI-1 e SRI-2. Estes substratos interagem com a PI3K, que estimula o principal

efetor: a proteína quinase B (Akt), uma quinase serina/treonina que estimula a cap-

tação de glicose por meio da translocação do GLUT para a membrana plasmática

(Saltiel e Kahn, 2001; Sesti et al., 2001; Sesti, 2006). Diferentes tecidos expressam

diferentes subtipos de GLUT, o tecido adiposo e a musculatura esquelética expres-

sam o GLUT4, ao passo que o fígado e o pâncreas expressam o GLUT2 (Thorens et

al., 1990).

Na vigência de resistência à insulina pode haver defeitos no RI, manifestados

por alteração na interação da insulina com o seu receptor ou por uma redução do

número de receptores disponíveis. Contudo, são mais frequentes defeitos na sina-

lização da insulina em nível pós-receptor (Sesti et al., 2001; Petersen e Shulman,

2006b). Nesse contexto, a fosforilação inadequada do RI após a ligação da insulina

na sua subunidade extracelular é observada na musculatura esquelética de indiví-

duos obesos com ou sem DM2 e em indivíduos não obesos portadores de DM2

(Goodyear et al., 1995), no tecido adiposo de indivíduos obesos portadores ou não

-7-

de DM2 (Sinha et al., 1987) e no fígado de pacientes obesos e portadores de DM2

(Caro et al., 1986). Em conjunto, essas observações demonstram que defeitos na

fosforilação do RI e do SRI-1 e na ativação da PI3K desempenham papel crucial no

desenvolvimento da resistência à insulina (Sesti et al., 2001; Sesti, 2006).

Concentrações reduzidas de GLUT-4 nos adipócitos é outro defeito na sinaliza-

ção da insulina descrito em indivíduos obesos portadores de DM2 (Shepherd e

Kahn, 1999), mesmo que as concentrações de GLUT-4 na musculatura esquelética

sejam normais (Zierath et al., 1996).

O prejuízo na captação de glicose também pode ser resultante do aumento de

proteínas que inibem a sinalização da insulina. As proteínas tirosina fosfatases (PT-

Pases) agem como reguladores negativos da cascata de sinalização da insulina.

Estudos recentes mostraram que uma das principais funções da PTPase 1B (PTP

1B) é suprimir a ação da insulina. Indivíduos obesos apresentam aumento da ex-

pressão de PTP 1B no tecido adiposo e musculatura esquelética. Todavia, uma

perda ponderal de 10% resulta em aumento da sensibilidade à insulina concomi-

tante à redução da atividade e níveis de PTP 1B (Ahmad et al., 1997a; Ahmad et al.,

1997b).

O perfil pró-inflamatório do indivíduo obeso também apresenta correlação com

a patogenia da resistência à insulina. Quando há tecido adiposo em excesso são

maiores os níveis de citocinas inflamatórias, tais como o fator de necrose tumoral

alfa (TNF-alfa) e a interleucina-6 (IL-6). O aumento dessas adipocinas vem sendo

-8-

relacionado à alteração na fosforilação do SRI-1, caracterizado pelo aumento da

fosforilação dos resíduos de serina em proteínas chaves como Akt, alvo da rapami-

cina em mamíferos (mTOR) e quinase c-Jun-NH2-terminal (JNK), comprometendo

a sinalização adequada da insulina e translocação do GLUT para a membrana

(Hotamisligil et al., 1996; Kern et al., 2001).

Alterações hepáticas na resistência à insulina

A insulina inibe a produção hepática de glicose por meio do bloqueio da glicone-

ogênese e da glicogenólise e estimula o acúmulo do glicogênio, ativando a glico-

gênese. Esta ocorre devido a um aumento da atividade da enzima glicogênio-

sintetase, secundário à inativação da glicogênio sintase quinase-3 (GKS-3) pela Akt

(Cross et al., 1995). A insulina também ativa a proteína fosfatase 1, via PI3K, que

desfosforila a enzima glicogênio sintase (Brady et al., 1997).

A transcrição de alguns genes pode ser influenciada pela insulina. Nesse senti-

do, a via de sinalização da Akt inibe a transcrição de genes que codificam a fosfo-

enolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), enzima chave para a neoglicogênese. O au-

mento da transcrição de genes codificadores de enzimas glicolíticas como a glico-

quinase e a piruvato quinase é também atribuído à ação da insulina (Pilkis e

Granner, 1992; Sutherland et al., 1996).

-9-

A insulina também exerce importante papel na inibição da lipólise no tecido a-

diposo. Contudo, na vigência de resistência à insulina essa propriedade é perdida.

Logo, o excesso de tecido adiposo é acompanhado por incremento das taxas de

lipólise e maior disponibilidade de ácidos graxos livres na veia porta (Despres e

Lemieux, 2006). Em situações normais, o excesso de ácidos graxos livres é canaliza-

do para a mitocôndria onde ocorre a beta-oxidação. Contudo, nos estados de re-

sistência à insulina, a carga excessiva de ácidos graxos livres é direcionada à lipo-

gênese (esterificação), levando ao acúmulo de triglicérides no interior do órgão

que não é destinado a essa função, configurando a condição patológica conhecida

como esteatose hepática (Holness e Sugden, 1999; Festi et al., 2004; Duvnjak et al.,

2007).

O fígado normal humano adulto tem até 5% de sua massa como lipídeo locali-

zado em vesículas citoplasmáticas. Do ponto de vista da anatomia patológica a

esteatose pode ter uma de duas formas, dependendo do tamanho das vesículas

de lipídeo: (1) esteatose microvesicular, onde a gordura é armazenada em múlti-

plas pequenas vesículas; (2) esteatose macrovesicular, onde a gordura é armaze-

nada em uma única e grande vesícula. A aparência da esteatose microvesicular é a

do hepatócitos com o citoplasma rico em múltiplas pequenas vesículas com o nú-

cleo central (Burt et al., 1998). As vesículas têm um diâmetro médio de 15µm

(Zaitoun et al., 2001), ou menos que o diâmetro médio do núcleo do hepatócito

(Marsman et al., 2004). Na esteatose macrovesicular uma grande vesicular desloca

-10-

o núcleo do hepatócitos para a periferia da célula, que normalmente apresenta

muitas organelas (mitocôndrias e retículo liso, principalmente) e apresentam um

anel atenuado de citoplasma ao redor da vesícula única (Gramlich et al., 2004;

Oleszczuk et al., 2007).

A esteatose microvesicular resulta na necrose do hepatócitos e pode ter uma

distribuição por zona no fígado, dependendo da etiologia. Não se sabe muito so-

bre a patogênese da esteatose microvesicular, mas, em linhas gerais, tem pior

prognóstico que a macrovesicular (Sherlock, 1995).

O manejo da esteatose hepática, por causa de seu potencial para evoluir para

doenças mais graves (principalmente a "esteatohepatite não alcoólica", ou non

alcoholic steatohepatitis - NASH), requer um diagnóstico acurado. Normalmente é

usado um sistema de avaliação semiquantitativo que é simples e rápido para avali-

ar a extensão da esteatose, mas é impreciso e depende da subjetividade e treina-

mento do patologista. Técnicas simples e factíveis para a avaliação da fibrose e

esteatose são a estereologia e a morfometria. Estereologia é usada para obter in-

formação quantitativa sobre diferentes densidades no tecido hepático, como den-

sidade de volume da esteatose e a densidade numérica de hepatócitos. A conta-

gem de pontos é usada para quantificar o grau de esteatose hepática (Zaitoun et

al., 2001; Aguila et al., 2003). A vantagem dessa técnica é que diferentes estruturas

no fígado podem ser identificadas imediatamente e podem ser incluídas ou exclu-

ídas da contagem. A técnica de contagem de pontos tem sido considerada repro-

-11-

dutível e adequada para a estimação acurada de diferentes graus de esteatose he-

pática (Franzen et al., 2005). Além disso, tanto a micro- como a macroesteatose

podem ser identificadas separadamente e quantificadas.

A NAFLD é a doença hepática mais comum nos países ocidentais (Erickson,

2009), acometendo 25% da população dos países onde a obesidade é mais preva-

lente (Marchesini et al., 2001). Embora inicialmente tenha característica benigna,

ela representa o ponto de partida de doenças mais graves como a NASH, cirrose

hepática e hepatocarcinoma (Brunt et al., 1999). O diagnóstico da esteatose hepá-

tica se baseia no acometimento de mais de 5-10% do peso do tecido, ou percen-

tual de hepatócitos afetados em estudos de biópsia hepática. Seus principais fato-

res de risco incluem obesidade central e resistência à insulina, além do DM2, disli-

pidemia e utilização de determinados fármacos.

Entre as causas mais frequentes do aumento do “input” figuram: o consumo de

dietas hiperlipídicas, o aumento da lipogênese “de novo” e da esterificação de áci-

dos graxos. Por outro lado, a redução do “output” ocorre por meio da menor se-

creção de VLDL e/ou da beta-oxidação.

As repercussões da esteatose são sistêmicas, visto que a oxidação de ácidos

graxos nas mitocôndrias de hepatócitos resulta em uma gama de substratos ener-

géticos essenciais ao metabolismo e esta via metabólica se encontra reduzida na

esteatose (Koteish e Diehl, 2001; Diehl, 2005).

-12-

Os fatores que provocam a progressão da NAFLD, esteatose isolada, para a NA-

SH, caracterizada pela presença de fibrose e necrose, continuam obscuros (Kirsch

et al., 2003). Baseado na teoria dos dois passos, o primeiro passo consiste no de-

senvolvimento da esteatose hepática, que uma vez estabelecida promove adapta-

ções de rotas sinalizadoras celulares frente aos níveis elevados de estresse oxidati-

vo. Dessa forma a célula sobrevive nesse meio adverso, mas fica mais propensa ao

desenvolvimento do segundo passo que a partir de apoptose e/ou necrose aliada

à inflamação conduz à NASH (Brunt et al., 1999; Festi et al., 2004).

O desenvolvimento da esteatose (primeiro passo) encontra-se intimamente re-

lacionado à obesidade centrípeta, pois 76% dos portadores são obesos (Marceau

et al., 1999; Akbar e Kawther, 2006). A literatura demonstra que o tecido adiposo

abdominal é a maior fonte de ácidos graxos livres. Animais com sobrepeso induzi-

do por dieta hiperlipídica cursam com resistência à insulina, com efeitos distintos

no tecido adiposo e no fígado. No tecido adiposo a resistência à insulina estimula

a lipólise, com consequente aumento do transporte de ácidos graxos livres para o

fígado pela veia porta e aumento do “input” de ácidos graxos. No fígado a hiperin-

sulinemia inibe a beta-oxidação, reduzindo o “output”. Ambas as ações favorecem

o acúmulo de gordura nos hepatócitos, condição que promove resistência hepáti-

ca à ação da insulina. A perda da capacidade da insulina em suprimir a produção

hepática de glicose agrava a resistência global à insulina e exacerba a manifesta-

ção dos componentes da síndrome metabólica como obesidade, dislipidemia e

-13-

hipertensão arterial sistêmica (Festi et al., 2004; Adams e Angulo, 2005; Brunt,

2005).

Outro mecanismo proposto considera o aumento da liberação de TNF-alfa pelo

excesso de tecido adiposo visceral. Esta adipocina promove redução da expressão

do receptor ativador de proliferação peroxissomal (PPAR)-alfa, receptor nuclear

que ativa a transcrição de genes implicados na formação de enzimas ligadas a oxi-

dação lipídica. A redução da atividade do PPAR-alfa, além de reduzir a oxidação

lipídica, ativa a apoptose e aumenta o estresse oxidativo, ambos apontados como

cruciais para a progressão para a NASH (Koteish e Diehl, 2001; Schiffrin et al., 2003;

Svegliati-Baroni et al., 2006). Outra adipocina que sofre alteração na presença de

obesidade e resistência à insulina é a adiponectina. Há hipoadiponectinemia em

estados de resistência à insulina, que se correlaciona diretamente à redução da

beta-oxidação (Jarrar et al., 2008). O tratamento de camundongos ob/ob com adi-

ponectina aumenta a oxidação hepática de ácidos graxos livres, uma vez que o res-

tabelecimento da adiponectinemia normal promove redução das concentrações de

TNF-alfa por meio da inibição da expressão e secreção desta citocina inflamatória

(Xu et al., 2003; Polyzos et al., 2009).

Um fator que também deve ser considerado e que indica uma tentativa frustra-

da de regeneração hepática frente aos danos causados pela NAFLD é o aumento

das taxas de binucleação de hepatócitos. Esta foi constatada em roedores alimen-

tados com dieta hiperlipídica (Souza-Mello et al., 2007). A grande ingestão de áci-

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dos graxos pode atuar como o segundo passo, acelerando a progressão da NAFLD

para NASH à medida que promove aumento da lesão hepática, ativação de células

estreladas hepáticas, ativação da caspase 3 (efetora) e fibrose periportal (Moriwaki

et al., 1988; Carmiel-Haggai et al., 2005). A NASH cursa com alteração da composi-

ção da matriz extracelular caracterizada pelo aumento da síntese em detrimento à

degradação desta. As células estreladas hepáticas são as mais importantes no teci-

do hepático para a síntese de matriz extracelular e são ativadas por dietas hiperli-

pídicas, espécies reativas de oxigênio, triglicérides, VLDL e citocinas inflamatórias.

Com o desenvolvimento da cirrose há aumento do número de células estreladas

no fígado, as quais, na presença de lesão hepática, apresentam ativação de meca-

nismos pré e pós-transcripcionais que promovem a deposição de colágeno tipo I e

fibrose (Lu et al., 1998; Lieber et al., 2004; Tessari et al., 2009).

Alterações funcionais e estruturais de mitocôndrias hepáticas foram relatadas

em animais portadores de esteatose microvesicular, comprometendo a beta-

oxidação dos ácidos graxos nas mitocôndrias, aumento da peroxidação lipídica em

peroxissomos e microssomos e o consequente aumento do estresse oxidativo. A

redução das taxas de beta-oxidação favorece o acúmulo de ácidos graxos e a o-

corrência de esteatose hepática, ao passo que o aumento da produção de espécies

reativas de oxigênio favorece a progressão da NAFLD para NASH (Angulo e Lindor,

2001; Caldwell et al., 2004; Wei et al., 2008).

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Além da redução da beta-oxidação, evidenciada pelas alterações mitocondriais

inerentes à NAFLD, ocorre um aumento paralelo da lipogênese hepática. O au-

mento da expressão da proteína de ligação ao elemento regulador do esterol (S-

REBP-1c) nos estados de resistência à insulina promove incremento da transcrição

de genes de enzimas envolvidas na síntese de ácido graxo, entre elas a acetil CoA

carboxilase, que converte a acetil CoA em malonil CoA e a ácido graxo sintetase,

que converte a malonil CoA em palmitato (Shimomura et al., 2000; Sakakura et al.,

2001).

Alguns estudos associam a esteatose hepática resultante da resistência à insuli-

na com o aumento dos níveis de SREBP-1 em resposta à hiperinsulinemia. Em indi-

víduos sensíveis à insulina, ela estimula a produção de SREBP-1c em períodos pós-

prandiais, quando há excesso de carboidrato circulante e níveis maiores de insuli-

nemia (Brown e Goldstein, 1997; Sakakura et al., 2001). Na resistência à insulina a

maioria das ações desse hormônio está comprometida, mas a resistência à sua

ação é seletiva e a capacidade da insulina em aumentar a produção de SREBP-1c é

mantida. Logo, a expressão de SREBP-1c é proporcional à insulinemia, sendo maior

nos casos de resistência à insulina, os quais vêm sendo associados ao aumento da

lipogênese hepática, além da redução da oxidação mitocondrial de ácidos graxos

(Shimomura et al., 1999; Shimomura et al., 2000).

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Esteatose hepática

Como dissemos anteriormente, a esteatose hepática é um diagnóstico frequente

em biópsias hepáticas (Turlin et al., 2009; Lee et al., 2010b). A NAFLD afeta aproxi-

madamente 30% da população dos Estados Unidos da América e 75 a 100% de

indivíduos obesos e obesos mórbidos (Bellentani et al., 2000; Browning et al., 2004;

Farrell e Larter, 2006).

O método considerado mais acurado para avaliar e quantificar a esteatose he-

pática no indivíduo vivo é a Ressonância Magnética com dois gradientes, melhor

que a Tomografia Computadorizada, a Ressonância Magnética por emissão de

prótons e a ultrassonografia (Lee et al., 2010b).

Biópsia hepática e métodos quantitativos

A biópsia hepática serve para estabelecer ou confirmar o diagnóstico de um tipo

particular de doença hepática, assim como estadiar a gravidade da doença. Nume-

rosos sistemas foram propostos para estadiar a NAFLD, baseados geralmente nas

alterações do hepatócitos (degeneração com balonamento, degeneração acidófila

/apoptose, necrose confluente, corpos de Mallory, esteatose, depósito de ferro,

estase biliar), inflamação (portal, periportal, lobular, intravascular, hipertrofia das

células de Kupffer, granulomas), e mudanças biliares (lesão do ducto biliar, reação

-17-

ductal, ductopenia). Embora a biópsia hepática seja considerada o “padrão ouro”

para avaliar a esteatose hepática e a esteatohepatite, há dificuldades práticas e

controvérsias (Das e Kar, 2005). Por outro lado, a tentativa é muito válida, pois dará

informação quanto ao prognóstico da doença e terá impacto na manutenção clíni-

ca (Adams e Angulo, 2007).

Os métodos de coloração de rotina para a microscopia hepática incluem: hema-

toxilina e eosina; métodos tricrômicos que são muito úteis na avaliação da fibrose

hepática; reticulina (ou um equivalente) para avaliação da arquitetura hepática;

ácido periódico de Schiff com diastase para avaliação de glicogênio, membrana

basal e parede de vasos e; coloração para ferro. A desvantagem dessas técnicas de

coloração é a perda das gotículas de lipídeos durante o processamento para inclu-

são em parafina. Então, o que vemos na lâmina histológica após a coloração com

H-E são os espaços antes ocupados pela gordura. Para complicar, há espaços nos

hepatócitos nos locais antes ocupados pelo glicogênio. Então, nem todos os espa-

ços observados com a coloração de H-E são, inequivocamente, restos de vacúolos

de esteatose hepática (Ahishali et al., 2010; Straub e Schirmacher, 2010). Então,

entende-se que há dificuldades na detecção de microvacúolos lipídicos em cortes

de parafina, o que pode influenciar não apenas na subestimação do grau de alte-

ração gordurosa, mas também o diagnóstico do fígado “normal” que, de fato, con-

tenham alto grau de microesteatose (Garcia Urena et al., 1998). O uso regular de

colorações especiais como “oil red O” e “Sudan III”, deveria ser frequente para co-

-18-

rar a gordura do fígado. Entretanto, esses métodos necessitam de cortes congela-

dos, que normalmente não são feitos na rotina dos laboratórios.

A determinação semiquantitativa é caracterizada pelo uso de uma escala subje-

tiva multigraduada com base na área proporcional ocupada por gordura nos he-

patócitos ou a percentagem de hepatócitos numa determinada biópsia (Brunt et

al., 1999). A histologia do fígado é graduada de acordo com um número de fatores

histológicos, geralmente avaliados pelo histopatologista, ainda que haja pouca

consistência na escala usada (Brunt et al., 1999; Turlin et al., 2001). Geralmente as

escalas têm quatro ou cinco graus, com diferentes limites entre os graus. A estea-

tose classificada com a escala de 4-graus pode ser: zero, leve, moderado e intensa,

então, empiricamente, podemos aceitar que 0 significa nenhuma esteatose, 1 é até

33%, 2 é entre 33–66% e 3 é >66% (Brunt et al., 1999). Tal sistema de gradação é

recomendado pela Associação Gastroenterológica Americana (American Gastroen-

terological Association) para avaliar NAFLD (Sanyal, 2002). Mais recentemente um

novo sistema foi proposto para avaliar a esteatose hepática usando uma escala de

5-graus: grau 0, sem ou esteatose mínima (<5%); grau 1, ≥5% mas <25%; grau 2,

≥25% mas <50%; grau 3, ≥50% mas <75%; e graus 4, ≥75% (Turlin et al., 2009).

Entretanto, estimativas semiquantitativas sempre dependem muito da experiên-

cia do observador e, por isso, incluem um viés de medida, assim como são pouco

reprodutíveis. Já foi constatado em estudo anterior que o sistema semiquantitativo

de avaliação da esteatose hepática, quando comparado ao sistema de "contagem

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de pontos" que é usado na estereologia, superestima os valores da esteatose nas

biópsias hepáticas e leva a prognósticos errados (Franzen et al., 2005).

Mais recentemente foi proposta a avaliação da esteatose hepática usando "aná-

lise de imagens" com o auxílio de videomicroscopia e programas específicos de

computador. Isto poderia ser uma alternativa adequada, pois os resultados, em

princípio, se mostraram relativamente compatíveis com as estimativas feitas com a

escala semiquantitativa (Turlin et al., 2009).

Objetivos

Este trabalho tem o objetivo de quantificar a esteatose hepática e de comparar

dois métodos de coloração e dois métodos de avaliação quantitativa. Os métodos

de coloração estudados serão a hematoxilina e eosina (por ser rotina nos laborató-

rios) e “oil red O” em cortes congelados. Os métodos de avaliação quantitativa

estudados serão a “contagem de pontos” e a “análise de imagem” computadoriza-

da.

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Material e Métodos

Modelo animal

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as normas convencio-

nais para experimentação em animais (Publicação Nº. 85-23 do NIH, revisada em

1996). Os cuidados com os animais também seguiram as normas impostas pela

Universidade do Estado do Rio de Janeiro, sendo aprovado pelo Comitê de Ética

local.

Neste estudo dois grupos de dez camundongos C57BL/6 machos com três me-

ses de idade foram usados (n=10 para cada grupo). Um grupo foi alimentado com

ração padrão para roedores contendo 10% de lipídios (dieta normolipídica, NL) de

acordo com a AIN93M (Reeves et al., 1993). Outro grupo foi alimentado com ração

contendo 60% de lipídios (dieta hiperlipídica, HL), que é um modelo já testado em

nosso laboratório para induzir a esteatose hepática (Fraulob et al., 2010). As rações

foram confeccionadas especialmente para este estudo por PragSoluções

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(www.pragsolucoes.com.br) e oferecida aos animais por 16 semanas. Mais detalhes

sobre a composição das dietas estão mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 – Características químicas das dietas experimentais, seguindo reco-mendação da AIN-93M (Reeves et al., 1993). *Mistura de Vitaminas: 10,0mg, **Mistura de Minerais: 35,0 mg (NL, dieta normolipídica, HL, dieta hiperlipídica).

Composição das dietas Grupos Alimentares

NL HL

Ingredientes Caseína 140,0 190,0 L-cisteína 1,8 1,8

Amido de milho 620,7 250,7 Sacarose 100,0 100,0 Fibras 50,0 50,0

Óleo de soja 40,0 40,0 Banha de porco -- 320,0 Mix de vitaminas* 10,0 10,0

Mix de minerais** 35,0 35,0 Colina 2,5 2,5 Antioxidante 0,008 0,008

Energia Kcal/g 3,57 5,40 Proteínas 14,0 14,0

Lipídios 10,0 60,0 Carboidratos 76,0 26,0

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Análise do fígado

Ao final das 16 semanas de experimentação os animais foram profundamente a-

nestesiados (pentobarbital sódico intraperitoneal, 150 mg/kg), os fígados foram

rapidamente retirados e preparados para as diferentes técnicas.

Determinação de triglicérides hepáticos

Diversos fragmentos do fígado de cada animal foram congelados a -80°C para

posterior análise bioquímica. Esta determinação foi importante para comparar com

os resultados da histopatologia quantitativa. Os níveis de triglicérides hepáticos

foram medidos de acordo com protocolo previamente publicado (Vieira et al.,

2009). Em resumo, 50 mg de tecido hepático congelado a -80°C no momento da

eutanásia foram colocados no processador ultrassônico com 1 mL de isopropanol.

O homogenado foi centrifugado a 2000 xg e 5µl de sobrenadante foi usado com o

kit para triglicérides em analisador semiautomático de bioquímica (K55, Bioclin,

Belo Horizonte, Brasil).

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Inclusão em paraplast, coloração com Hematoxilina e

Eosina

Alguns fragmentos do fígado de cada animal foram fixados em formalina de Mil-

long durante 48h em temperatura ambiente. Fragmentos aleatórios foram desidra-

tados em alcoóis de concentração crescente até alcançar o álcool absoluto, diafa-

nizados em xilol e incluídos em Paraplast plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

O material foi seccionado com 5μm de espessura e, então, os cortes foram corados

com hematoxilina e eosina (H-E). Vários cortes foram obtidos de cada fragmento

do órgão e cinco campos aleatórios foram analisados ao microscópio, configuran-

do um estudo completamente cego.

Inclusão em Tissue-Tek, coloração com Oil Red-O

Outros fragmentos do fígado de cada animal com cerca de 1 cm3 foram incluídos

em Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japão) em moldes de alumínio,

congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados em freezer –80°C

até a microtomia. Cortes congelados com 10µm de espessura foram obtidos em

criostato (SLEE MEV cryostat, Mainz, Alemanha), desidratados em temperatura

ambiente por 60 min e fixados em formol 10% congelado por 10 min e novamente

desidratados por mais 60 min. Depois os cortes foram colocados em propileno

glicol absoluto por 3 min, corados com solução de Oil Red-O (ORO) pré-aquecida

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por 8 min a 60°C, diferenciado em propileno glicol a 85% por 3 min e lavado em

água corrente por outros 3 min e montados com glicerina.

A intensidade da esteatose hepática foi estudada nas lâminas histológicas pre-

paradas como foi descrito. Havia, portanto, dois conjuntos de lâminas:

a. lâminas coradas em H-E (de material incluído em paraplast),

b. lâminas coradas em ORO (de material incluído em Tissue Tek O.C.T.)

Com estas lâminas fizemos duas análises:

1. avaliação da esteatose hepática usando técnica estereológica por “contagem

de pontos” (CP),

2. avaliação da esteatose hepática usando técnica de “análise de imagens” (AI).

Vale a pena ressaltar que com as lâminas coradas em H-E só foi possível usar a

técnica de "contagem de pontos", enquanto com as lâminas coradas em ORO pu-

demos usar as duas técnicas "contagem de pontos" e "análise de imagem".

Dez imagens digitais aleatórias e não consecutivas foram obtidas por animal u-

sando o microscópio BX51, com objetiva planacromática x100 e câmera DP71

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(Olympus Co, Tokyo, Japão). As imagens foram capturadas no formato TIFF, com

profundidade de 36-bit, e resolução de 1280x1024 pixels. As imagens digitais das

lâminas coradas com H-E e das lâminas coradas com ORO foram usadas nas análi-

ses que descreveremos, projetadas em monitor LCD de tela plana de alta resolu-

ção (LG Eletronics, Seul, Coréia do Sul) com computador HP com processador Intel

QuadCore com 6 Gb de memória RAM na plataforma Windows 7.

Avaliação de esteatose por Contagem de Pontos

Sobre o ecran do monitor foi montado um sistema-teste contendo 36 pontos-

teste (Aguila et al., 2003). A densidade de volume de esteatose hepática

(Vv[esteatose]) foi estimada como a relação entre os pontos que tocaram os vesí-

culas de gordura (Pp) e o número de pontos totais (PT, neste caso 36 pontos)

(Mandarim-de-Lacerda, 2003):

Vv[esteatose]= PP[esteatose] /PT

Com esta técnica pudemos avaliar a esteatose hepática nas lâminas coradas em

H-E e nas lâminas coradas com ORO. Na Figura 1 vemos o exemplo em uma ima-

gem do tecido hepático corado pela H-E.

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Figura 1 – Fotomicrografia do tecido hepático corado pelo H-E com o sistema-teste de 36 pontos sobreposto.

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Avaliação da esteatose por Análise de Imagem

As imagens digitais foram estudadas com o programa Image Pro Plus, versão 7.01

para Windows (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, EUA). As imagens necessita-

ram preparação prévia que consistiu do seguinte (Mandarim-de-Lacerda et al.,

2010):

a. o tecido hepático foi “segmentado” em uma imagem pura “preto-e-branco”

usando a ferramenta adequada a este fim do programa de "análise de ima-

gem";

b. os vesículas de gordura da esteatose foram selecionados e foi atribuído a

eles a cor branca;

c. o restante do tecido hepático foi selecionado e foi atribuído a ele a cor pre-

ta;

d. O percentual de área ocupado pela cor branca (esteatose) na imagem toda

foi quantificado usando a ferramenta de histograma do programa de análi-

se de imagens.

A Figura 2 exemplifica a realização desta técnica para avaliar a esteatose hepática.

-28-

Figura 2 – Execução da técnica de “análise de imagens” para a avaliação da es-teatose hepática. Em (a) observa-se a fotomicrografia do tecido hepático corado com ORO já incorporada ao programa Image Pro Plus (em vermelho veem-se os vesículas de gordura; em (b) foi feita a segmentação da imagem em puro “preto-e-branco” e se atribuiu a cor branca às vesículas de gordura e a cor preta ao res-tante do tecido hepático.

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Análise dos dados

A normalidade dos dados foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Sendo

considerados com “distribuição normal”, as diferenças entre os grupos foram exa-

minadas com o teste-t de Student. O valor P≤0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

Foi feito um estudo de correlação e regressão linear, colocando os níveis de tri-

glicérides hepáticos na abscissa (eixo X) e as densidades de volume da esteatose

hepática na ordenada (eixo Y). Além da estimativa das equações de primeiro grau

que correspondiam às regressões lineares ajustadas pelo método dos mínimos

quadrados, as inclinações (slopes) calculadas usando a densidade de volume esti-

mada por "contagem de pontos" + H-E, "contagem de pontos" + ORO e "análise

de imagem" + ORO foram comparadas (teste de slopes) (GraphPad Prism versão

5.03 para Windows, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

-30-

Resultados

Triglicérides hepáticos

O conteúdo hepático de triglicérides foi significativamente aumentado no grupo

de animais alimentados com dieta hiperlipídica (+104%, P=0,0004) do que no gru-

po alimentado com dieta normolipídica (Fig. 3).

Isto é facilmente entendível quando vemos fotomicrografias do tecido hepático

de amostras dos dois grupos de animais, preparadas com as duas técnicas de co-

loração (Fig. 4). Em ambos os grupos é patente que a dieta HL induz a formação

de vesículas de gordura intra-hepáticos muito mais desenvolvidos que os que são

produzidos pela dieta NL.

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Figura 3 – Gráfico em barras do teor de triglicérides hepáticos nos camundongos alimentados com dois regimes alimentares diferentes: normolipídico e hiperlipídi-co.

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Figura 4 – Fotomicrografias do tecido hepático (mesmo aumento) preparado com inclusão em parafina e coloração pela H-E (a, b), e seccionado em criostato e co-rado com ORO (c, d). Os animais alimentados com dieta normolipídica são (a) e (c), enquanto (b) e (d) representam os animais alimentados com dieta hiperlipídi-ca.

H-E

ORO

Dieta Dieta Normolipídica Hiperlipídica

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Material preparado para observação com H-E

Por “contagem de pontos”

Nas lâminas de tecido hepático coradas por H-E não foi difícil identificar a esteato-

se hepática, mas de antemão sabíamos que nem todos os espaços visualizados

correspondiam a regiões antes ocupadas por gordura. Os resultados estão mos-

trados na Tabela 2 e Fig. 5. A densidade de volume da esteatose hepática foi 4,8 ±

0,7 % no grupo normolipídico e 33,5 ± 2,2 % no grupo hiperlipídico (+ 600%,

P<0,0001).

Comparando as duas técnicas de avaliação por "contagem de pontos" (ORO e

H-E), vemos que com a técnica H-E houve superestimação de 14,3 % da densidade

de volume da esteatose no grupo normolipídico e superestimação de 50,0% no

grupo hiperlipídico em comparação com a técnica "contagem de pontos" ORO.

Por “análise de Imagem”

Como foi dito anteriormente esta técnica de preparação do tecido não é adequada

para o estudo por "análise de imagem", motivo pelo qual não foi realizada aqui.

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Material preparado para observação com ORO

Por “contagem de pontos”

A coloração com ORO teve boa intensidade e muita acurácia em marcar as vesí-

culas de gordura intra-hepáticas. Isto facilitou a execução da técnica de "contagem

de pontos" para estimar a densidade de volume da esteatose hepática em ambos

os grupos. Os resultados estão discriminados na Tabela 2 e Fig. 6. Considerando

média e erro padrão da média, a densidade de volume da esteatose hepática foi

4,2 ± 0,6 % no grupo normolipídico e 22,4 ± 1,0 % no grupo hiperlipídico (+ 433%,

P<0,0001).

Por “análise de imagem”

Usando o mesmo material da avaliação acima, realizamos o protocolo de estudo

por "análise de imagem" para avaliar a esteatose hepática em ambos os grupos. A

coloração pelo ORO facilitou também esta análise devido ao bom contraste entre

os vesículas com gordura e o restante do tecido hepático. Os resultados dessa

análise também estão discriminados na Tabela 2. A densidade de volume da estea-

tose hepática foi 3,9 ± 1,1 % no grupo normolipídico e 24,7 ± 0,4 % no grupo hi-

perlipídico (+ 533%, P<0,0001).

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Comparando as duas técnicas de avaliação, "contagem de pontos" e "análise de

imagem", vemos que com a técnica "contagem de pontos" houve superestimação

de 7,7% da densidade de volume da esteatose no grupo normolipídico e subesti-

mação de 9,3% no grupo hiperlipídico em comparação com a técnica "análise de

imagem", mas estas diferenças não foram significativas. As Figs. 7 e 8 representam

as diferenças na densidade da esteatose hepática avaliada por "contagem de pon-

tos" e "análise de imagem" considerando as duas colorações juntas

-36-

Tabela 2 - Resultados da densidade de esteatose hepática por dois métodos (a-nálise de imagem [AI] vs. Contagem de pontos [CP]) e com duas colorações (oil red-O [ORO] vs. H-E) em animais submetidos a dois regimes alimentares (dieta normolipídica [NL] vs. Dieta hiperlipídica [HL]). NS é não significativo (P>0,05).

Técnicas AI vs. CP

ORO AI (%) CP (%)

NL 3,9 ± 1,1 4,2 ± 0,6 NS

HL 24,7 ± 0,4 22,4 ± 1,0 NS

NL vs. HL P<0,0001 P<0,0001

H-E AI (%) CP (%)

NL ___ 4,8 ± 0,7

HL ___ 33,5 ± 2,2

NL vs. HL ___ P<0,0001

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Figura 5 – Diferenças na densidade de volume da esteatose hepática comparan-do os grupos alimentados com dieta hiperlipídica e normolipídica, avaliados em lâminas coradas pela hematoxilina e eosina e quantificados por contagem de pon-tos.

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Figura 6 - Diferenças na densidade de volume da esteatose hepática comparan-do os grupos alimentados com dieta hiperlipídica e normolipídica, avaliados em lâminas coradas pelo “oil red O” e quantificados por contagem de pontos.

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Figura 7 - As diferenças na densidade de volume da esteatose hepática obtidas pelas técnicas de contagem de pontos e análise de imagem nos animais alimen-tados com dieta normolipídica não foram significativas (todas as colorações jun-tas).

-40-

Figura 8 - As diferenças na densidade de volume da esteatose hepática obtidas pelas técnicas de contagem de pontos e análise de imagem nos animais alimen-tados com dieta hiperlipídica não foram significativas (todas as colorações juntas).

-41-

Regressões lineares simples: comparação de inclinações

A Fig. 9 e a Tabela 3 apresentam os resultados da comparação das inclinações das

regressões lineares simples da densidade de volume da esteatose hepática (eixo Y)

e os níveis de triglicérides hepáticos (eixo X). Cada reta representa a análise dos

dados obtidos por uma técnica de coloração ou método de avaliação quantitativo.

Como indicado na Tabela 3 não há diferença significativa comparando as dife-

rentes inclinações (slopes). Entretanto o coeficiente de correlação de Pearson foi

maior com "análise de imagem" + ORO (R= 0,95) do que com "contagem de pon-

tos" + ORO (R= 0,88) e "contagem de pontos" + H-E (R= 0,82). Isto quer dizer que

há correlação mais forte dos níveis de triglicérides hepáticos com a densidade de

volume da esteatose hepática avaliada por ORO "análise de imagem" do que pelos

demais métodos.

-42-

Figura 9 – Regressões lineares simples da densidade de volume da esteatose hepática (eixo Y) e os níveis de triglicérides hepáticos (eixo X). Cada reta repre-senta a análise dos dados obtidos por uma técnica de coloração ou método de avaliação quantitativo: “oil red O” (ORO), hematoxilina e eosina (H-E), análise de imagem (AI), contagem de pontos (CP). Como indicado na Tabela 3 não há dife-rença significativa comparando as diferentes inclinações (slopes). Entretanto o coeficiente de correlação de Pearson foi maior com ORO AI (R= 0,95) do que com ORO CP (R= 0,88) e H-E CP (R= 0,82).

-43-

Tabela 3 – Coeficientes de correlação de Pearson (R) entre os valores dos trigli-cérides hepáticos e a densidade de volume de esteatose hepática avaliada por diferentes métodos: análise de imagem (AI), contagem de pontos (CP), e diferen-tes colorações: oil red-O (ORO) e H-E. Abreviações: NS, não significativo (P>0,05); P, probabilidade.

Técnicas

Coloração

ORO HE

R P R P

AI 0,95 <0,0001 __ __

CP 0,88 0,0009 0,82 0,004

ORO CP vs.

ORO AI ORO CP vs.

H-E CP ORO AI vs.

H-E CP

Comparação

entre Regres-sões

NS NS NS

-44-

Discussão

A dieta hiperlipídica causa obesidade e suas comorbidades, tais como dislipi-

demia e resistência à insulina em camundongos C57BL/6 e animais não tratados

apresentam aumento das massas hepáticas e pancreáticas, juntamente com NA-

FLD e NAFPD (Fraulob et al., 2010). Outros achados marcantes em camundongos

C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídica são a hipertrofia de adipócitos, hiper-

trofia das ilhotas pancreáticas concomitante com hiperinsulinemia e aumento da

imunodensidade para insulina e glucagon e redução da expressão de GLUT-2 nas

ilhotas, indicando remodelamento morfológico adverso e função prejudicada do

tecido pancreático (Souza-Mello et al., 2010).

A resistência à insulina é fator chave na associação entre a obesidade e outros

componentes da síndrome metabólica como NAFLD e NAFPD (Festi et al., 2004;

Mathur et al., 2007). Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídica

apresentaram esteatose hepática macro e microvesicular. Em outro estudo vimos

-45-

que tais animais apresentam células estreladas ativadas (Souza-Mello et al., 2010).

Uma célula estrelada ativa é repleta de gotículas de vitamina A, possuem retículo

endoplasmático rugoso extenso e dilatado e complexo de Golgi proeminente

(Geerts, 2001). Esse achado é relevante, visto que a ativação das células estreladas

resulta no acúmulo de matriz (cicatriz), causando alargamento do espaço de Disse

e perda da fenestra endotelial. Por conseguinte, o transporte através da parede

sinusoidal fica reduzido, causando progressiva deterioração da função hepática

(Hui e Friedman, 2003). A ativação de células estreladas quiescentes para um fenó-

tipo proliferativo, fibrogênico e contrátil é o evento dominante na fibrogênese

(Friedman, 2008). Dessa forma, as células estreladas são marcadores da progressão

da lesão hepática.

A resistência à insulina se desenvolve quando um defeito no receptor da insuli-

na ou pós-receptor alteram a sinalização para a translocação do GLUT para a

membrana a fim de permitir a internalização e utilização glicose por células da pe-

riferia (Petersen e Shulman, 2006a). Como resultado, as ilhotas hipertrofiam e hi-

persecretam insulina numa tentativa de compensar a reduzida captação de glicose

e normalizar a glicemia até que ocorra a exaustão pancreática (Bonora, 2008).

Mas nesse estudo estivemos interessados na indução de esteatose hepática pa-

ra proceder a sua quantificação. A mensuração de triglicérides hepáticos foi uma

medida importante que constatou que os animais alimentados com dieta hiperli-

pídica efetivamente aumentaram os triglicérides hepáticos, e foram os animais que

-46-

apresentação características histopatológicas de esteatose hepática. Então, o pri-

meiro item do trabalho que era induzir a esteatose hepática foi conseguido ine-

quivocamente o que concorda com estudos prévios de nosso grupo (Neves et al.,

2006; Neves et al., 2007; Souza-Mello et al., 2007; Gregorio et al., 2010; Marques et

al., 2010; Nascimento et al., 2010; Souza-Mello et al., 2010).

O método de contagem de pontos é muito utilizado para estimar densidades

de volume em um conjunto de imagens aleatórias. Inúmeros sistemas-teste foram

propostos nos últimos anos para essa finalidade, alguns contendo mais pontos-

teste, outros menos (Weibel, 1972, 1979, 1989; Cruz-Orive e Weibel, 1990). Para

estimar a esteatose hepática temos proposto uma adaptação do método de con-

tagem de pontos (Aguila et al., 2003), o que tem sido considerado, inclusive, me-

lhor do que a avaliação semiquantitativa por escores (Franzen et al., 2005).

Na literatura especializada recente há a demanda por método reprodutível e

mais acurado para estimar a esteatose hepática em biópsias (Lee et al., 2010a; Lee

et al., 2010b). Qualquer que seja a técnica usada, semiquantitativa, contagem de

pontos, análise de imagens, o problema parece ser o método de coloração do te-

cido hepático. É usual preparar o material com inclusão em parafina e coloração

com H-E ou outro método simples. Mas nenhum desses métodos é capaz de corar

a gordura presente nos vesículas da esteatose hepática. Então, normalmente, faz-

se o diagnóstico quantitativo com base em imagens “negativas” da gordura, ou

-47-

seja, espaços que deveriam ter sido ocupados por gordura que foi eliminada du-

rante o processamento do material.

Sempre que possível devemos substituir métodos “baseados na experiência” do

observador por outros mais reprodutíveis (Mandarim-de-Lacerda, 1999). Nesse

aspecto, a estereologia é um poderoso aliado fornecendo resultados quantitativos

sem viés e reprodutíveis (Mandarim-de-Lacerda, 1995, 2003). A questão é que,

normalmente são técnicas com pouca automação, que exigem a elaboração de um

protocolo de aleatoriedade e isotropia do tecido a ser estudado, o que nem sem-

pre é possível com fragmentos tão pequenos como os obtidos por biópsia.

Em 2002 o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais dos Es-

tados Unidos (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease) pa-

trocinou o Comitê de Patologia da Rede de Pesquisa Clínica sobe NASH (NASH

Clinical Research Network) a desenvolver um sistema de escores que abarcasse o

espectro inteiro da NAFLD. O sistema foi desenvolvido e validado por nove dife-

rentes patologistas do grupo após dois ensaios duplo cegos de 32 biópsias de a-

dultos e 18 biópsias pediátricas. Neste sistema de escores os componentes da es-

teatose, inflamação lobular e balonamento hepatocelular são semiquantificados

(Kleiner et al., 2005). Na verdade, foi uma modificação do sistema já existente de

“Brunt” para fibrose, adicionando um escore para o estádio 1 que agora pode ser:

1a para fibrose leve, 1b para fibrose densa e 1c para fibrose perisinusoidal. Nos

escores acima de 5 esta classificação sugere o diagnóstico de “NASH instalado”,

-48-

enquanto nos escores entre 0-2 estão os diagnósticos de “definitivamente não

NASH” (Wieckowska e Feldstein, 2008).

Estudos experimentais tentaram quantificar a fibrose hepática com base no nú-

mero e tamanho das lesões: (-) não detectado; (±) raro; (+) leve; (++) moderado e

(+++) intenso (Nakano et al., 2008). Além disso, o uso de programas de computa-

dor para determinar valores de fibrose hepática foi usado em lâminas coradas pelo

picro sirius-red de modo a realçar as fibras colágenas. Então, imagens digitais fo-

ram adquiridas e a quantidade de tecido corado pelo picro sirius red pode ser au-

tomaticamente quantificada (DeLeve et al., 2008).

No presente estudo comparamos três técnicas de avaliação da esteatose hepá-

tica: material incluído em parafina e corado com H-E e analisado por contagem de

pontos, material incluído em Tissue Tek e corado com “oil red O” e analisado com

contagem de pontos e análise de imagem. Com todas as técnicas fomos capazes

de detectar um conteúdo muito maior (>400%) de esteatose no fígado dos ani-

mais alimentados com dieta hiperlipídica do que no fígado dos animais alimenta-

dos com dieta normolipídica. Então, desse ponto de vista, todas as técnicas foram

adequadas.

Com material preparado para cortes em criostato, e corados com “oil red O”, as

pequenas diferenças observadas na avaliação da esteatose hepática quer por con-

tagem de pontos quer por análise de imagem foram insignificantes. No material

incluído em parafina e corado pela H-E e analisado por contagem de pontos hou-

-49-

ve leve superestimação nos dois grupos de animais, em relação ao material corado

pelo “oil red O”. Entretanto, esta técnica tem a vantagem de estar disseminada na

rotina da grande maioria dos laboratórios de histopatologia, não necessitando de

nenhuma atenção especial.

A técnica do “oil red O” + análise de imagens foi a que apresentou o melhor

coeficiente de correlação com os níveis de triglicérides hepáticos, seguida do “oil

red O” + contagem de pontos e de H-E + contagem de pontos. Qualquer uma

dessas três técnicas é reprodutível e melhor do que a avaliação da esteatose hepá-

tica por escores.

Conclusão

Os resultados desta pesquisa permitem concluir que a dieta hiperlipídica induz a

formação de esteatose hepática experimental. Analisando as técnicas utilizadas de

coloração e de quantificação concluímos que a mensuração da esteatose hepática

foi possível com todas as técnicas de modo adequado, mas resultados mais acura-

dos e correlacionados com a medida de triglicérides hepáticos são obtidos usando

coloração específica para gordura, não importando muito se a análise será feita

por estereologia (contagem de pontos) ou análise de imagem computadorizada.

-50-

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